KR101123966B1 - 스트렙토마이세스 그리세우스 변이주 및 이를 이용한 트립신 함량이 높은 프로네이즈 생산방법 - Google Patents

스트렙토마이세스 그리세우스 변이주 및 이를 이용한 트립신 함량이 높은 프로네이즈 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 그리세우스 변이주 및 이를 이용한 트립신 함량이 높은 프로네이즈 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)로부터 돌연변이 처리를 통해 트립신 함량이 높은 프로네이즈의 생산성이 우수한 변이주를 제조하고, 상기 변이주의 최적의 균체 증식, 프로네이즈 및 트립신 활성 증가 조건 등을 확립하여 이로부터 프로네이즈 또는 트립신을 대량 생산할 수 있는 스트렙토마이세스 그리세우스 변이주 및 이를 이용한 트립신 함량이 높은 프로네이즈 생산방법에 관한 것이다.
스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 프로네이즈(Pronase), 트립신(Trypsin), 돌연변이, 발효조 회분배양

Description

스트렙토마이세스 그리세우스 변이주 및 이를 이용한 트립신 함량이 높은 프로네이즈 생산방법{Streptomyces griseus mutants and method for producing pronase with high content trypsin by using the same}
본 발명은 스트렙토마이세스 그리세우스 변이주 및 이를 이용한 트립신 함량이 높은 프로네이즈 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)로부터 돌연변이 처리를 통해 트립신 함량이 높은 프로네이즈의 생산성이 우수한 변이주를 제조하고, 상기 변이주의 최적의 균체 증식, 프로네이즈 및 트립신 활성 증가 조건 등을 확립하여 이로부터 프로네이즈 또는 트립신을 대량 생산할 수 있는 스트렙토마이세스 그리세우스 변이주 및 이를 이용한 트립신 함량이 높은 프로네이즈 생산방법에 관한 것이다.
토양 미생물인 방선균 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)는 인체에 무해한 항생물질인 스트렙토마이신을 생산하며, 그람 양성균으로 균사체로 증식을 하다가 환경에 따라 포자를 형성한다.
스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)가 상업적으로 생산하는 단백질 가수분해 효소는 세린 프로테아제(serine protease), 알칼라인 프로테아제(alkaline protease), 아미노펩티다아제(aminopeptidase) 및 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase) 등 총 11종의 프로테아제(protease)로 구성되어 있는 복합체(Narahashi, Y. et al. J. Biochem. 1968. vol. 64, pp 427-437)로서 소염제, 소화제 등의 의약품, 제빵, 치즈, 고기연화제 등의 식품산업, 세제 및 공업용 등으로 다양하게 사용되고 있다.
스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)로부터 산업화 효소를 생산하기 위한 균주 개량방법으로 단세포 분리법, UV 및 X선 조사, 및 돌연변이 유도물질에 의한 고 생산능 변이주의 획득법 등이 널리 이용되고 있다. 실제로 일본 Kaken Chomical Co.에서는 이들 방법을 이용하여 프로네이즈(pronase) 고 생산능 변이주를 생산하였으며, 현재 산업적으로 중요한 미생물로 상업화되어 있다(Vosbeck., T. et al. 1996. J. Mol . Microbiol. vol. 169. pp 91-95).
프로네이즈는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)가 생산하는 여러 개의 아미노펩티다아제(aminopeptidase), 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase), 엔도펩티다아제(endopeptidase) 등의 6개의 단백분해효소의 복합체를 이루고 있으며, 분자량이 약 16-27 kDa의 비-특이적 세린 프로테아제(non-specific serine protease)이다. 또한 프로네이즈는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)가 생산하는 단백분해효소의 대표적인 상품명으로, 단백분해 작용 및 항염증 작용을 가지고 있어, 각종 염증성 질환에 수반되는 부종, 종차의 완해 및 염증소에 생산된 점조성 농액, 변성 단백의 융해제거, 청정화 촉진 등의 작용을 한다. 뿐만 아니라 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)의 프로네이즈로부터 세린 타입의 엔도프로테아제(serine-type endoprotease)인 트립신(trypsin)을 분리하였다(M. Trop and Y. Birk. 1968. Biochem. J. vol.109. pp475-476).
트립신은 소, 사람, 돼지, 양, 칠면조, 돔발상어, 폐어, 새우, 누에나방 및 2종의 스트렙토마이세스 속에서 분리되었다. 또한 트립신은 많은 기질에 대하여 정확한 부위를 인식하고 효소반응을 매개하며 소염제 및 소화제와 같은 산업적 분야는 물론 프로테오믹스(proteomics) 등의 연구용으로도 활용되고 있다(Trop, M., and Y. Birk. 1970. J. Biochem. vol. 116. pp 19-25). 트립신은 엔도펩티다아제(endopeptidase)이며 활성중심에 세릴(seryl) 잔기를 가지고 있는 세린 프로테아제(serine protease)로서 췌장에서 분비되는 중요한 단백분해효소 중의 하나이다. 트립신은 생체 내에서 비활성 상태인 트립시노겐(trypsinogen)으로 분비되며, 산이나 펩신(pepsin)에 의해서는 활성화되지 않고 트립신, 엔테로펩티다아제(enteropeptidase) 및 미생물 프로테아제(microbial protease)에 의해 활성화된다. 활성화될 때 트립시노겐의 N-말단에서 헥사펩타이드(hexapeptide)가 떨어져 나가 트립신으로 전환된다. 지금까지 알려진 단백분해효소 중에서 트립신은 보바인 인슐린(bovine insulin)의 β-체인의 절단부위가 2개(Arg-Gly, Lys-Ala)로 가장 적은 절단부위를 가진 효소이다(Malcolm, D. and Edwin, C. W. 1979. Enzymes. 3rd ed. Longman Group Limited, London; Gerald, R. 1975. Enzymes in food processing. 2nd ed. Academic Press, New York; Belitz, H. D. and Grosch, W. 1987. Food chemistry. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg). 또한 분자생물학적 지식을 근거로 한 유전자 재조합기술로 스트렙토마이세스 그리세우스의 트립신(SGT; Streptomyces griseus trypsin)을 코딩하는 유전자 sprT 및 sprU 유전자를 클로닝하고 이들 유전자의 대량 발현 연구도 수행되었다(Chi, W.J. et al . 2005. Kor. J. Microbiol vol.41. pp 255-261; Yang, H. Y. et al. 2005. J. Microbiol . Biotechnol. vol. 14. pp 1125-1129). 이러한 유전자의 발현은 미생물 호르몬으로 불리는 A-factor(2-isocapryloyl-3-R-hydroxy-methyl-a-butyrolactone)에 의해 포지티브(positive)하게 조절되어 AdpA(A-factor dependent activator protein A)에 의해 전사가 유도되는 AdpA regulon을 구성하고 있음이 밝혀졌다(Kato, J. et al . 2005. J. Bacteriol . vol. 187. pp 286-295). A- factor는 아주 낮은 농도에서 AdpA의 발현을 유도하고, 발현된 AdpA 단백질이 다양한 목표 유전자의 프로모터에 결합하여 전사를 유도함으로써, 방선균의 형태분화, 포자형성, 항생물이나 색소형성과 같은 이차대사를 조절하는 것으로 알려져 있다(Hong, S. K. et al . 1993. Mol. Gen . Gent. vol. 236. pp 347-354; Horinouchi, S. 2002. Front Biosci . vol 7. pp 2045-2057).
소, 돼지, 양 등 다양한 동물에서 분리되는 트립신은 변형 프리온(prion) 단백질 감염에 의한 신경세포의 공포변성과 중추신경의 해면상의 변화로 인간에게 전염성해면상뇌증(TSE; Transmissible Spongiform Encephalopathy) 질병을 유발할 수 있으며, 동물세포에서 분리되는 트립신은 동물세포 배양 시 다양한 질병을 유발하 는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 또는 파보바이러스(Parvovirus)의 오염을 일으킬 수 있다(Method of isolation and purification of trypsin from pronase protease and use thereof. 2004. Baxter Healthcare S.A. US 6,830,917 B2). 또한 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)에서 생산되는 트립신은 X-ray crystallogryphy를 이용한 3차원 분석에서 다른 박테리아에서 생산하는 단백분해효소 보다 포유동물 유래의 단백분해효소와 더 유사하다는 보고도 있다(R.J. Read et al. 1984. Biochemistry. vol.23. pp 6570-6575; R.J. Read and M.N.G. James. 1988. J. Mol. vol 200. pp 523-551).
본 발명의 목적은 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 모균주에 대한 돌연변이 처리를 통해 얻은 트립신 함량이 높은 프로네이즈 고 생산 변이주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이주를 이용하여 트립신 함량이 높은 프로네이즈 또는 트립신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 모균주를 NTG(N-methyl-N'-nitro- N-nitrsoguanidine) 및 자외선으로 1회 이상 변이시켜 얻고, 2% 이상의 라이신 고농도에서 증식이 가능하며, 트립신 함량이 모균주에 비해 높은 프로네이즈를 고 농도로 생산하는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 변이주를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 변이주를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 트립신 함량이 높은 프로네이즈의 생산방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 변이주의 배양물로부터 트립신 함량이 높은 프로네이즈를 분리 정제하는 단계; 및
상기 프로네이즈로부터 트립신을 정제하는 단계를 포함하는 트립신의 생산방법을 제공한다.
본 발명은 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 모균주에 대한 돌연변이 처리를 통해 트립신 함량이 높은 프로네이즈 고 생산 변이주를 제공하는 효과가 있다.
또한, 상기 변이주의 최적 배양을 통해 최적 생산조건 및 정제조건을 확립함으로써 트립신 함량이 높은 프로네이즈 또는 이로부터 트립신을 대량생산할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 모균주를 NTG(N-methyl-N'-nitro- N-nitrsoguanidine) 및 자외선으로 1회 이상 변이시켜 얻고, 2% 이상의 라이신 고농도에서 증식이 가능하며, 트립신 함량이 모균주에 비해 높은 프로네이즈를 고 농도로 생산하는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 변이주에 관한 것이다.
본 발명에서 "스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 변이주" 란 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 균주가 생산하는 프로네이즈를 고 농도로 생산하는 균주를 말하는 것이다. 따라서, "트립신 함량이 높은 프로네이즈"란 용어는 프로네이즈의 함량이 증가함에 따라 트립신의 함량 역시 증가하게 되고 이로 인해 트립신의 활성이 높아진다는 것을 의미한다. 즉, 명세서 전반에 걸쳐 트립신의 함량과 활성은 동일한 의미로 혼용될 수 있다.
본 발명의 변이주는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 바람직하게는, KCTC 1018BP를 모균주로 하여 돌연변이 처리, 바람직하게는 NTG(N-methyl-N'-nitro- N-nitrsoguanidine) 및 자외선으로 1회 이상 처리하여 사멸율이 99% 이상일 때 생존한 콜로니로부터 얻을 수 있다.
상기 변이주의 선별방법은 특별히 제한하지는 않으나, 일차적으로 기질이 포함된 한천평판 배지에서 프로네이즈 활성을 투명환으로 선별하고, 선별된 우수 균주를 플라스크에서 배양하여 생산된 프로네이즈를 정량 분석을 통하여 프로네이즈의 트립신 함량이 높은 우수 돌연변이주를 분리하는 것이 바람직하다.
상기 기질은 특별히 제한하지는 않으나, 카제인(casein), 또는 탈지유(skim milk) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 변이주는 트립신 함량이 높은 프로네이즈를 고 농도로 생산하는 균주로, 상기 트립신의 함량은 특별히 제한하지는 않으나, 모균주에 비해 1.5 내지 5배 높은 것이 바람직하다.
본 발명의 변이주는 돌연변이 처리방법 및 횟수에 따라 트립신 함량이 다른 프로네이즈를 생산할 수 있어 특별히 제한하지는 않으나, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) Ace03 KCTC 11362BP인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 변이주를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 트립신 함량이 높은 프로네이즈의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 변이주로부터 트립신 함량이 높은 프로네이즈를 대량 생산하기 위한 배양 배지는 포도당, 녹말, 호정, 또는 글리세린 등의 탄소원을 1종 이상 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 포도당이 좋다.
상기 탄소원은 배지 100 중량부에 대하여 3 내지 10 중량부로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 함량 범위 내일 경우, 배양 시 균주의 탄소원 소비 활성이 높아 균체 증식과 프로네이즈 및 트립신 활성이 높기 때문이다.
또한, 상기 배양 배지는 질소원으로 특별히 제한하지는 않으나, 대두박 및 효모추출물을 포함하는 것이 바람직하다.
질소원으로 대두박은 배지 100 중량부에 대하여 0.5 내지 1 중량부, 효모추출물은 2 내지 3 중량부로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 함량 내일 경우, 배양 시 균주의 질소원 소비 활성이 높아 균체 증식과 프로네이즈 및 트립신 활성이 높기 때문이다.
또한, 상기 배양 배지는 본 발명의 트립신 함량이 높은 프로네이즈를 효율적으로 생산하기 위하여 무기염류로 제이인산칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 또는 탄산칼슘 등을 단독 또는 2종 이상 더 포함할 수 있다.
상기 무기염류는 균체의 증식, 프로네이즈 및 트립신의 활성 증가를 위해 배지 100 중량부에 대하여 제이인산칼륨 0.01～0.14 중량부, 황산마그네슘 0.01～0.14 중량부, 염화나트륨 0.1～0.4 중량부 및 탄산칼슘 0.5～0.7 중량부로 포함되는 것이 바람직하다.
상기 변이주는 균체의 증식, 프로네이즈 및 트립신의 활성 증가를 위해 배양 배지 100 중량부에 대하여 종균 접종량이 0.05 내지 4 중량부인 것이 바람직하다. 이때, 종균의 균체 농도는 OD600에서 8 내지 25, 보다 바람직하게는 13 내지 20인 것이 좋다.
또한, 배양 시간은 24 내지 48시간, 배양 온도는 24 내지 35℃, 보다 바람직하게는 26 내지 30℃, 배양 배지의 pH는 5.5 내지 7.5, 보다 바람직하게는 6.0 내지 7.0인 것이 바람직한데, 이는 상기 배양 조건에서 균체의 증식, 프로네이즈 및 트립신의 활성이 증가하기 때문이다.
본 발명은 또한
본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 변이주의 배양물로부터 트립신 함량이 높은 프로네이즈를 분리 정제하는 단계; 및
상기 프로네이즈로부터 트립신을 정제하는 단계를 포함하는 트립신의 생산방 법에 관한 것이다.
상기 트립신 함량이 높은 프로네이즈의 분리 정제과정은 특별히 제한하지는 않으나, 균주 배양액에 대해 필터프레스, VMF 및 한외여과를 순차적으로 실시하되, 여과 시 필터의 pH를 6.5 내지 8.0, 보다 바람직하게는 7.0 내지 7.5으로 유지하여 정제하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 여과를 거쳐 농축된 트립신 함량이 높은 프로네이즈는 알코올에서 결정화한 후 동결건조하고, 상기 동결건조 분말을 분쇄기로 분쇄 후 분채기로 분채하여 일정량의 부용제를 첨가하여 본 발명의 트립신 함량이 높은 프로네이즈를 정제하는 과정을 추가로 거칠 수 있다.
또한, 상기 프로네이즈로부터 트립신을 분리 정제할 수 있는데, 트립신은 정제된 프로네이즈로부터 아르기닌 농도구배를 이용하여 트립신을 용출하여 얻을 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 상기로부터 용출된 트립신은 크로마토그래피 또는 전기영동 등의 통상의 방법을 통해 추가로 정제과정을 거칠 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 프로네이즈 효소 단백질 생산능력이 우수한 돌연변이주의 선별
기질이 첨가된 고체 한천 평판배지 상에서 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)가 생산하는 프로네이즈의 활성을 투명환으로 나타나게 하기 위하여 카제인(casein)과 탈지유(skim milk)를 기질로 사용하여 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)의 배양여액을 배지에 점적하여 그 활성을 알아보았다. 사용된 기질 중 탈지유(도 1b 참조)가 카제인(도 1a 참조)보다 프로네이즈의 활성을 나타내는 투명환의 크기를 비교하는데 있어 더 효과적이었다. 따라서, 프로네이즈의 생산성이 향상된 우수 변이주는 기질로 탈지유가 함유된 배지를 이용하여 선별하였다.
<실시예 2> 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 균주의 돌연변이 처리를 통한 트립신 함량이 높은 프로네이즈 우수 생산 균주 확보
상기 실시예 1을 통하여 개발한 프로네이즈 고 생산 균주 선별방법을 이용하여 프로네이즈를 생산하는 균주로 알려진 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) KCTC 1018BP에 NTG(N-methyl-N'-nitro-nitosoguanidine) 처리 및 자외선 조사 등의 돌연변이 유발법을 이용하여 프로네이즈 우수 생산 균주를 선별하였다.
먼저, 모균주에 NTG(2mg/mL)를 처리하여 탈지유를 함유한 프로네이즈 활성 선별 평판배지에 도말하여 사멸률이 약 99% 이상일 때 나온 7000 내지 8000개의 콜로니 중 활성이 우수한 콜로니 7개를 선별하여 이를 플라스크 배양(배지 조성: 3% 포도당, 1.0% 효모추출물, 0.3% 염화나트륨, 0.15% 탄산칼슘)하여 활성이 높은 균주를 1차 선별하고 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) N2라 명명하였다(도 2a 참조).
프로네이즈 활성을 측정하기 위해, 기질로는 유제카제인을 사용하였고, 인산완충용액(pH 7.4)에서 40℃의 온도 조건에서 반응 후 폴린 시약을 넣고 발색시켜 티로신(Tyrosine) 표준액과 비교하여 활성을 측정하였다.
트립신 활성을 측정하기 위해, 기질로 BAEE(Nα-Benzoly-L-Arginine Ethyl Ester)를 사용하였고, 인산완충용액(pH 7.6)에서 25℃의 온도 조건에서 반응 후 트립신 활성을 측정하였다.
표 1에 나타난 바와 같이, 상기 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) N2 균주는 모균주 보다 약 2.3배 높은 프로네이즈 활성을 보였으며, 이때의 트립신 활성도 모균주 보다 약 1.7배 증가하였다.
다음으로, 상기 변이주 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) N2에 자외선 조사를 통한 돌연변이를 유발시켰다.
10W 램프를 30cm 거리에서 1분간 조사하여 사멸률이 99.9%로 하고, 상기와 같은 방법으로 평판배지(도 2b 참조) 및 플라스크 배양하여 2차 선별하고 이 변이주를 "스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) N2U6"라 명명하였다.
표 1에 나타난 바와 같이, 상기 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) N2U6변이주는 모균주 보다 약 3배 높은 프로네이즈 활성을 나타내고, 트 립신 활성은 모균주 보다 약 2.2배 증가하였다.
다음으로, 2차 선별한 변이주 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) N2U6에 다시 NTG를 처리하여 프로네이즈 활성 선별 평판배지에서 활성이 높은 균주를 선별하고 이를 2% 라이신(lysine)이 첨가된 액체배지에 플라스크 배양하였다.
표 1에 나타난 바와 같이, 라이신 2% 이상의 농도에서는 대부분의 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)가 증식을 잘 못하지만, 돌연변이된 균주는 라이신 고농도에서 증식하는 내성균주로 변이되고, 프로네이즈 활성도 모균주 보다 약 4.6배 증가된 활성을 보였으며, 트립신 활성은 모균주 보다 3.4배 증가하였다.
상기 트립신 함량이 높은 프로네이즈 우수 생산 균주를 "스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) Ace03"라 명명하고, 2008년 7월 11일자로 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11362BP을 부여받았다.
본 발명의 트립신 함량이 높은 프로네이즈 우수 생산 균주를 선별하기 위한 돌연변이 공정은 도 3에 나타내었으며, 모균주와 돌연변이 유발법에 의해 선별된 우수 생산 균주들을 플라스크 배양에서 프로네이즈의 생산성을 비교한 결과는 표 1에 나타내었다.
Figure 112008063055179-pat00001
<실시예 3> 프로네이즈 효소 단백질 내의 트립신 함량을 높이기 위한 최적 배양 조건의 확립
1. 종균 접종량 및 배양 시간
스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) Ace03 균주 배양시 종균의 접종량과 종균 배양 시간에 따라 효소 단백질의 생산성에 영향을 줄 수 있다. 접종량이 부족할 경우 균체 증식에 있어 lag-phase가 발생하여 배양시간이 길어지거나 균체의 대사활성이 둔화되어 생산성이 감소될 수 있고, 접종량이 많을 경우 생산현장에서 종균 배양단계가 많아지기 때문에 전체 배양시간이 길어지거나 생산비용이 증가할 수 있다.
따라서, 종균 접종량과 종균 배양 시간에 따른 트립신 함량이 높은 프로네이즈 생산성의 영향을 비교하기 위해 플라스크 배양(3% 포도당, 1.0% 효모추출물, 0.3% 염화나트륨, 0.15% 탄산칼슘)을 수행하였다. 접종량은 0.1%, 1%, 5%, 10%일 때의 프로네이즈 및 트립신 활성을, 종균 배양 시간은 1차, 2차 배양시간이 24시간, 48시간 간격일 때 프로네이즈 및 트립신 활성을 분석하여 비교하였다(표 2 참조).
표 2에 나타난 바와 같이, 접종량은 적을수록 프로네이즈 및 트립신 활성이 높게 나오는 경향을 보였으며, 종균 배양 시간은 24시간일 때보다는 48시간일 때 활성이 더 높게 나오는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 종균 접종량은 1%, 종균 배양 시간은 48시간씩 두 차례 계대 배양하는 것이 바람직하다.
Figure 112008063055179-pat00002
2. 배지 내 탄소원의 종류
생산배지의 최적화에 있어서 균체 증식과 트립신 함량이 높은 프로네이즈 생산에 영향을 줄 것으로 생각되는 탄소원에 대한 실험을 수행하였다. 이용 가능한 탄소원으로 포도당(glucose), 녹말(starch), 호정(dextrin), 글리세린(glycerin), 자당(sucrose)을 각각 3%씩 1.0% 효모추출물, 0.3% 염화나트륨, 0.6% 탄산칼슘이 포함된 배지에 넣고 96시간 동안 배양하여 균체 증식과 프로네이즈 및 트립신 활성을 비교하였다.
표 3에 나타난 바와 같이, 자당은 균주가 거의 이용하지 못했으며, 탄소원 중 녹말이 가장 높은 활성을 보였다. 하지만 녹말은 고농도로 용해했을 경우 점성이 높아 대량으로 사용시 어려움이 많아 원료의 가격이나 사용상의 편의를 고려하여 이용 가능한 탄소원으로 포도당과 호정을 선정하였다.
Figure 112008063055179-pat00003
3. 유기질소원의 종류
상기의 탄소원의 영향 실험에서 선정한 포도당과 호정 중 최종 탄소원 선별을 위하여 유기질소원으로 성장인자가 포함된 효모추출물과 프로테이즈 생산을 유도하는 대두박을 질소원으로 사용하여 농도에 따른 프로네이즈 및 트립신 활성을 비교하였다. 탄소원인 포도당과 호정은 3%로 고정시키고, 질소원인 효모추출물과 대두박은 각각 0, 0.1, 0.3, 0.5, 1%의 농도로 플라스크 배양하여 72시간 및 96시간 때 샘플을 채취하여 프로네이즈 및 트립신 활성을 비교하였다.
표 4에 나타난 바와 같이, 탄소원은 질소원과 혼합 시 포도당이 호정에 비해 더 높은 프로네이즈 및 트립신 활성을 나타내었으며, 질소원에서는 1% 효모추출물, 0.5% 대두박 조합이 가장 높은 활성을 나타내었다. 따라서, 탄소원으로는 3% 포도당, 질소원으로는 1% 효모추출물 및 0.5% 대두박으로 최종 선정하였다.
Figure 112008070230420-pat00013
4. 무기염류( 제이인산칼륨 , 황산마그네슘 )의 농도
균주의 특성에 따라 칼륨과 인산 이온의 영향이 다양하기 때문에 제이인산칼륨 농도를 각각 0, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30%로 배지에 첨가하여 제이인산칼륨이 효소 단백질 생산에 미치는 영향을 플라스크 배양을 통해 확인해 보았다.
또한, 황산마그네슘이 프로네이즈 및 트립신 생산에 미치는 영향도 함께 조사하였다. 이때, 황산마그네슘의 농도는 0.1, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30%로 플라스크 배양을 수행하였다.
플라스크 배양의 기본배지 조성은 3% 포도당, 1% 효모추출물, 0.5% 대두박, 0.3% 염화나트륨, 0.6% 탄산칼슘을 사용하고, 각각 72시간 및 96시간 배양 후 샘플을 채취하여 프로네이즈 및 트립신 활성을 비교하였다.
표 5에 나타난 바와 같이, 제이인산칼륨과 황산마그네슘의 농도는 0.1% 이하일 때 가장 높은 프로네이즈 및 트립신 활성을 나타내었기 때문에 배양실험에 제이인산칼륨과 황산마그네슘을 각각 0.1% 농도로 정하였다.
Figure 112008063055179-pat00005
5. 최적 배양 온도 및 배양 pH
선별한 변이주의 프로네이즈 효소 단백질 생산을 위한 최적의 배양 온도 및 pH를 조사하였다. 배양 배지는 상기 결과로부터 3% 포도당, 1.0% 효모추출물, 0.5% 대두박, 0.1% 제이인산칼륨, 0.3% 염화나트륨, 0.1% 황산마그네슘, 0.6% 탄산칼슘이 첨가된 배지를 이용하여 플라스크에서 각각의 온도 24℃, 28℃, 35℃ 및 배양 온도 28℃에서 pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0에서 96시간 동안 배양하였다.
표 6에 나타난 바와 같이, 배양 온도가 28℃일 때 가장 높은 프로네이즈 트립신 활성을 보였다. 배양 pH는 6.5일 때 가장 높은 프로네이즈 및 트립신 활성을 보였으며, 중성 부근의 pH에서는 유사한 활성을 나타내었다.
Figure 112008063055179-pat00006
상기 결과로부터, 트립신 함량이 높은 프로네이즈 효소 단백질을 생산하기 위한 최적의 배양 조성 및 배지 조건으로, 탄소원은 3% 포도당, 질소원은 1% 효모추출물 및 0.5% 대두박, 무기염류로는 0.1% 제이인산칼륨, 0.3% 염화나트륨, 0.1% 황산마그네슘, 0.6% 탄산칼슘을 선택하고, 배양 온도는 28℃, 배양 pH는 6.5으로 최종 선정하였다.
<실시예 4> 본 발명 변이주로부터 트립신 함량이 높은 프로네이즈 대량 생산을 위한 발효조 회분배양
상기 실시예 3에서 최적화한 배지 및 배양조건을 바탕으로 트립신 함량이 높은 프로네이즈 생산을 위한 회분식 배양을 5리터 발효조에서 배양온도 28℃, 교반속도 100-700rpm, 통기량 1vvm 조건으로 120시간 동안 배양하였다. 이때 사용한 균주는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) Ace03이고, 발효배지 조성은 10% 포도당, 2.5% 효모추출물, 0.5% 대두박, 0.1% 제이인산칼륨, 0.3% 염화나트륨, 0.1% 황산마그네슘, 0.6% 탄산칼슘을 사용하였다. 포도당과 효모추출물의 농도를 증가한 이유는 플라스크에서 선정한 농도 포도당 3% 및 효모추출물 1.0%는 플라스크 배양에서는 충분한 농도였으나, 배양시간이 더 긴 발효조 배양에서는 균체 농도 및 효소 단백질 생산이 증가하는 추세에서 탄소원 및 질소원 부족으로 저해를 받는 양상을 나타내어 탄소원 및 질소원이 부족하지 않게 공급하기 위함이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 균체 증식은 배양 60시간 후부터 감소되었지만 균체의 대사 활성 및 효소 단백질의 생성능력은 발효말기까지 유지되어 120시간에 균체 농도(OD600) 약 50과 3000U/mL의 프로네이즈 활성 및 11,000U/mL의 트립신 활성을 나타내었다.
탄소원의 소비속도와 프로네이즈 및 트립신 생산속도는 일정하게 배양말기까지 유지되어 안정적으로 프로네이즈 및 트립신이 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 5> 트립신 함량이 높은 프로네이즈의 정제
방선균의 일종인 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)는 다양한 이차대사산물 및 포자, 균사 등 다양한 부산물이 있어 이들이 필터를 막아 필터를 주로 사용하는 대량 정제에 많은 어려움이 있다. 이를 해결하기 위해 먼저 필터프레스(filter press)에 규조토를 전착하여 트립신 함량이 높은 프로네이즈 효소 단백질이 포함된 배양액을 1차 여과 후 VMF(vibration membrane filter)를 사용하여 필터를 막지 않게 진동을 주면서 2차 여과하여 균체 및 다양한 부산물을 제거하였다. 트립신 함량이 높은 프로네이즈 효소 단백질이 포함된 배양액을 농축하기 전에 농축 효율을 높이기 위해 0.2㎛ 필터를 사용하여 3차 여과 후 한외여과(Ultra filtration, 10 kDa)를 사용하여 효소 단백질이 포함된 배양액을 농축하였다. 트립신 함량이 높은 프로네이즈 효소 단백질이 포함된 농축액에 약 2배의 에탄올을 첨가하여 결정화 후 동결건조 하였다. 트립신 함량이 높은 프로네이즈 효소 단백질이 포함된 동결건조 분말을 분쇄기로 분쇄 후 분채기로 분채하여 일정량의 부용제를 첨한 후 트립신 함량이 높은 프로네이즈 최종제품을 제조하였다.
트립신 함량이 높은 프로네이즈의 정제 공정 중 필터 여과 시 pH가 낮아지는 경향을 나타내는데 이는 효소 단백질의 정제 수율에 영향을 미친다. 따라서 정제 공정 중 pH에 따른 정제 수율을 조사하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, pH가 산성일수록 필터 여과가 잘 안되었으며 수율도 떨어졌고, pH 7.0 부근이 가장 높은 트립신 함량이 높은 프로네이즈 정제 수율을 얻을 수 있었다.
<실시예 6> 프로네이즈로부터 트립신의 순수 정제
상기 실시예 5에서 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) Ace03 균주로부터 대량 정제한 프로네이즈로부터 트립신을 순수 정제하였다. 정제방법은 Hitrap Benzamidine chromatography(General Electric Company)로 50mM 인산완충액과 0.5M 염화나트륨 완충액(pH 7.0)을 사용하여 아르기닌을 농도구배로 용출하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 0.2M 아르기닌에서는 용출되지 않았으며(레인 4), 0.5M 아르기닌(레인 5)에서 트립신이 용출되기 시작하여 0.8M 아르기닌(레인 6)에서는 완전히 트립신이 용출되었다. 트립신 표준물질(레인 7))과 비교하여 약 28 kDa 부근에서 트립신 단백질을 확인할 수 있었다.
도 1은 프로네이즈 생산능력이 우수한 돌연변이 균주의 효과적인 선별을 위해 각각 카제인(a) 및 탈지유(b)를 이용하여 프로네이즈 생산 균주 선별방법을 보여주는 사진도이다.
도 2는 프로네이즈 생산성이 우수한 균주를 선별하기 위해 각각 모균주에 NTG를 처리하여 얻은 변이주(a)와, 상기 변이주에 다시 자외선을 처리하여 얻은 변이주(b)를 탈지유가 첨가된 고체 평판배지에서 배양하여 얻은 사진도이다.
도 3은 본 발명의 트립신 함량이 높은 프로네이즈 우수 생산 균주를 선별하기 위한 돌연변이 공정을 나타낸 도표이다.
도 4는 본 발명의 변이주를 일 실시예에 따른 최적 배양 배지 및 배양 조건에 따라 발효조 회분배양 후 프로네이즈 및 트립신 활성을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 변이주로부터 트립신 함량이 높은 프로네이즈를 정제하는 과정에서 필터 여과 시 pH에 따른 정제 수율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 변이주에서 분리 정제한 트립신 함량이 높은 프로네이즈로부터 트립신을 순수 정제하여 단백질 전기영동한 젤 사진도이다.

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) Ace03 KCTC 11362BP.
  5. 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) Ace03 KCTC 11362BP를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 트립신 함량이 모균주에 비해 1.5 내지 5배 높은 프로네이즈의 생산방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) Ace03 KCTC 11362BP는 배양 배지 100 중량부에 대하여 종균 접종량이 0.05 내지 4 중량부이고, 배양 시간은 24 내지 48시간, 배양 온도는 24 내지 35℃이고, 배양 배지의 pH는 5.5 내지 7.5인 배양 조건에서 배양되는 것을 특징으로 하는 트립신 함량이 모균주에 비해 1.5 내지 5배 높은 프로네이즈의 생산방법.
  7. 제6항에 있어서,
    종균의 균체 농도는 OD600에서 8 내지 25인 것을 특징으로 하는 트립신 함량이 모균주에 비해 1.5 내지 5배 높은 프로네이즈의 생산방법.
  8. 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) Ace03 KCTC 11362BP의 배양물로부터 트립신 함량이 모균주에 비해 1.5 내지 5배 높은 프로네이즈를 분리 정제하는 단계; 및
    상기 프로네이즈로부터 트립신을 정제하는 단계를 포함하는 트립신의 생산방법.
  9. 제8항에 있어서,
    트립신 함량이 모균주에 비해 1.5 내지 5배 높은 프로네이즈는 균주 배양액에 대해 필터프레스, VMF 및 한외여과를 순차적으로 실시하되, 여과 시 필터의 pH를 6.5 내지 8.0으로 유지하여 정제하는 것을 특징으로 하는 트립신의 생산방법.
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