CN1324131C - 反馈抗性高丝氨酸转琥珀酰酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高丝氨酸转琥珀酰酶，其与野生型高丝氨酸转琥珀酰酶相比有至少一个突变和与野生型酶相比有对L-甲硫氨酸或SAM的降低的敏感性。后者包含一段氨基酸序列，包括在第90位至115位的部分的AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro序列和在第285位至310位的部分的TyrGlnXaaThrPro序列，氨基酸序列的第1位对应于起始甲硫氨酸。本发明的特征在于该突变是在部分的AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro序列中的天冬氨酸的置换或部分的TyrGlnXaaThrPro序列中的酪氨酸的置换。

Description

反馈抗性高丝氨酸转琥珀酰酶
发明说明
本发明涉及具有反馈抗性的高丝氨酸转琥珀酰酶，含有这些酶的微生物菌株及其用于制备L-甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的用途。
甲硫氨酸是人类和许多动物的必需氨基酸。特别是，其被制备用于饲料市场及作为消旋物被添加到动物饲料中。它由丙烯醛和甲硫醇经过3-(甲硫基)丙醛化学合成，该3-(甲硫基)丙醛用氰化氢、氨和二氧化碳经过乙内酰脲转变成D，L-甲硫氨酸。消旋物可用酶解析。
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是代谢中最重要的甲基供体，在医药领域，用于治疗抑郁、肝病和关节炎。已经被描述用于制备SAM的方法，特别包括在前体L-甲硫氨酸存在的情况下培养酵母(Schlenk F.和DePalma R.E.，J.Bilo.Chem.1037-1050(1957)，Shiozaki S.等人，Agric.Biol.Chem.53，3269-3274(1989))及在自溶后层析纯化。
甲硫氨酸的微生物合成，在大肠杆菌中研究得尤其深入(Greene，R.C.，在Neidhardt F.C.，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中甲硫氨酸的生物合成，细胞与分子生物学，第二版，ASM出版社，华盛顿市(1996)542-560页及其中所含的文献)。由许多酶催化的反应组成并被严格控制。合成的第一步，从天冬氨酸到高丝氨酸，与合成苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸同时进行。合成的第一步对甲硫氨酸的合成是特异性的，它是从琥珀酰基-CoA和高丝氨酸生成O-琥珀酰基高丝氨酸，并除去辅酶A。该反应由高丝氨酸琥珀酰基转移酶(高丝氨酸O-转琥珀酰酶，MetA，EC 2.3.1.46)所催化。SAM用L-甲硫氨酸和ATP一步合成。
高丝氨酸转琥珀酰酶的活性在L-甲硫氨酸和/或SAM存在的情况下被抑制(Lee L.-W.等人，J.Biol.Chem.241，5479-5480(1966))。该终产物抑制一方面防止细菌中过度耗能合成甲硫氨酸和SAM，另一方面还同时阻碍以工业规模用微生物生产这两种物质。编码高丝氨酸转琥珀酰酶的基因由930个碱基对组成(包括终止密码子)，而由该基因编码的蛋白质由309个氨基酸组成。高丝氨酸转琥珀酰酶的结构迄今还未被阐明，因此也还不能鉴定参与终产物抑制的氨基酸。
增加代谢终产物合成的已知方法是使用其活性不再被其代谢途径的终产物所抑制的经修饰的酶(反馈抗性突变体)。因此，例如3-去氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶反馈抗性突变体已经被制备用于增加L-色氨酸和L-苯丙氨酸的合成(EP0745671 A2)，及分枝酸变位酶/预苯酸脱水酶的反馈抗性突变体已经被制成用于增加苯丙氨酸的产生(US5120837)。
大肠杆菌高丝氨酸转琥珀酰酶最近通过突变编码它的DNA序列被修饰，使得生成蛋白质的活性在1mmol L-甲硫氨酸或1mmol SAM存在的情况下较不易被抑制(JP2000139471A)。突变包含以下的氨基酸置换：第27位的精氨酸用半胱氨酸置换，第296位的异亮氨酸用丝氨酸置换及第298位的脯氨酸用亮氨酸置换。经修饰的高丝氨酸转琥珀酰酶在1mmol L-甲硫氨酸存在的情况下显示出44-89％间的残留活性及在1mmol SAM存在的情况下为10-73％。含有这些被修饰的蛋白质的细菌菌株增加了L-甲硫氨酸的生产。然而，在没有L-甲硫氨酸和SAM的情况下，这些被修饰的高丝氨酸转琥珀酰酶的活性比在野生型中所见的更低。期望获得尽可能多的高丝氨酸转琥珀酰酶变异体，它们在活性程度上及可被L-甲硫氨酸和/或SAM抑制的程度上不同，因为L-甲硫氨酸和SAM的微生物生物合成在过程和调节上非常复杂，而且还以多种不同的方式把细胞中多种其他代谢途径连结起来。因此不可能事先预测可以获得怎样的能影响微生物菌株生长、平衡其生命代谢过程及L-甲硫氨酸和SAM生产的变异体。
本发明的目的是提供广泛的高丝氨酸转琥珀酰酶(MetA蛋白质)新的变异体，在与野生型(WT)酶比较下显示出对L-甲硫氨酸和SAM的反馈抗性被提高。
本发明的高丝氨酸转琥珀酰酶与高丝氨酸转琥珀酰酶野生型酶相比有至少一个突变，且与野生型酶相比显示出对L-甲硫氨酸和SAM的敏感性降低，野生型酶有一段氨基酸序列，包括在第90位至115位间的成分序列AapGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro和第285位至310位间的成分序列TyrGlnXaaThrPro，而氨基酸序列第1位为起始甲硫氨酸，其特征在于突变是成分序列AapGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro中天冬氨酸被置换或成分序列TyrGlnXaaThrPro中酪氨酸被置换。
不同微生物中高丝氨酸转琥珀酰酶的比较显示成分序列AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro中的Asp和成分序列TyrGlnXaaThrPro中的Tyr是保守的。在大肠杆菌MetA蛋白质中，含有保守天冬氨酸Asp的序列区域AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro位于SEQ ID No.2的第101位至109位之间，在其他MetA蛋白质中，其位于第90位至115位之间。在大肠杆菌MetA蛋白中，含有保守酪氨酸Tyr的序列区域TyrGlnXaaThrPro位于SEQ ID No.2的第294位至298位之间，在其他MetA蛋白质中，其位于第285位至310位之间。Xaa表示任意的天然氨基酸。
高丝氨酸转琥珀酰酶的立体结构迄今还没有被阐明。因此不可能确定不同的功能，如酶活性和通过L-甲硫酸酸和/或SAM对特定氨基酸的抑制性。因为蛋白质的折叠是一个极其复杂的过程，所以不可能由蛋白质的初级序列得到其立体结构的结论，在初级序列中彼此分开得很远的氨基酸在折叠的蛋白质中紧邻不是不常见的，反之亦然。已经惊奇地发现在蛋白质第101位或294位上的根据本发明的氨基酸置换导致对L-甲硫氨酸和对SAM的反馈抑制性降低。
本发明的高丝氨酸转琥珀酰酶对抑制剂SAM和/或L-甲硫氨酸呈现抗性(即增加Ki)，其优于野生型酶。优选呈现对甲硫氨酸和/或SAM的抗性至少是野生型酶的2倍。更优选本发明的高丝氨酸转琥珀酰酶对甲硫氨酸和/或SAM的抗性是野生型酶的10倍，优选抗性被增加50倍，最优选抗性高于JP2000139471A中所描述的MetA突变体。
优选地，本发明高丝氨酸转琥珀酰酶的蛋白质序列含有表1所列突变之一或优选所列突变的组合。
本发明的高丝氨酸转琥珀酰酶可例如通过表达编码本发明的高丝氨酸转琥珀酰酶DNA序列而获得。
本发明因此还涉及编码本发明的高丝氨酸转琥珀酰酶的DNA序列。
这样的DNA序列可以通过突变MetA基因的密码子的一个碱基而获得，其特征是定位于大肠杆菌野生型酶第101位的天冬氨酸的密码子或定位于大肠杆菌野生型酶的第294位的保守酪氨酸的密码子发生至少一个突变，而密码子1以序列SEQ ID No.1的第一个碱基开始。
本发明的DNA序列为MetA基因，其中位于MetA蛋白质的第90位至115位之间的序列AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro中的天冬氨酸Asp的密码子，和/或位于MetA蛋白质的第285位至310位之间的序列TyrGlnXaaThrPro中的保守酪氨酸Tyr的密码子被修饰。
本发明的DNA序列在以下被称为具有反馈抗性的MetA等位基因。
在本发明说明书中，在使用BESTFIT算法(GCG WisconsinPackage，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin)的分析中，那些与大肠杆菌WT metA基因有超过50％的序列相同性的基因也被理解成是metA等位基因。以完全相同的方式，与大肠杆菌野生型高丝氨酸转琥珀酰酶有超过50％的序列相同性(BESTFIT算法，GCG Wisconsin Package，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin)并拥有高丝氨酸转琥珀酰酶活性的蛋白质也被理解成是高丝氨酸转琥珀酰酶。
本发明的metA等位基因优选含有表1中第2或4行所列突变之一或优选所列突变的组合。
本发明的metA等位基因例如可以用下述的原料通过非特异性诱变或定向诱变来制备。上述DNA区城内的非特异性突变可以通过例如化学试剂(例如1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍，甲磺酸乙酯及类似物)和/或通过物理方法和/或通过在规定条件下进行的聚合酶链式反应和/或通过在突变株(例如XL1red)中扩增DNA制得。在DNA片段内的特定位置导入突变的方法是已知的。另一种生成具有反馈抗性的metA等位基因的可能性在于组合不同的反馈抗性诱导突变以得到具有新特性的多重突变体。
优选用野生型metA基因的DNA作为诱变原料。要被突变的metA基因可以被染色体编码或在染色体外被编码。上述的诱变方法用以修饰DNA序列的一个或多个核苷酸，使得由其所编码的蛋白质拥有定位于大肠杆菌野生型酶的第101位的保守天冬氨酸的突变或定位于大肠杆菌野生型酶中第294位的保守酪氨酸的突变，位置1是来自SEQ ID No.2起始的甲硫氨酸。
已经被描述的技术可用以在任意metA基因中的所述DNA区域导入一个或多个突变。这些突变导致所编码的高丝氨酸转琥珀酰酶拥有了导致对SAM和/或L-甲硫氨酸具反馈抗性的氨基酸序列。
在如所述地进行诱变后，拥有期望表型的突变体被选择，例如通过测定突变的高丝氨酸转琥珀酰酶对L-甲硫氨酸和/或SAM的敏感性程度而进行选择。
在L-甲硫氨酸或SAM存在的情况下能使酶活性被测定的任何方法，都可用于测定高丝氨酸转琥珀酰酶对L-甲硫氨酸和/或SAM的敏感性。例如，高丝氨酸转琥珀酰酶活性可由以下Kredich和Tomkins所述用于测定丝氨酸乙酰基转移酶活性的方法测定(Kredich N.M.和Tomlins G.M.，J.Biol.Chem.241，4955-4965(1966))。在含有高丝氨酸和琥珀酰基-CoA的分析样品中测量酶活性。反应由加入酶开始并用分光光度计根据由琥珀酰基-辅酶A中硫酯键的裂解所致的在232nm处消光的降低来监测。上述试验适合高丝氨酸转琥珀酰酶对甲硫氨酸的敏感性的测定。高丝氨酸转琥珀酰酶活性的抑制在不同浓度的L-甲硫氨酸存在的情况下，在反应混合液中检测。不同高丝氨酸转琥珀酰酶的催化活性在有或无L-甲硫氨酸的情况下测定，而这些数据被用以计算抑制常数Ki，它描述了活性仅为在无抑制剂的情况下可测定活性的50％的抑制剂浓度。
为测定不同高丝氨酸转琥珀酰酶活性对SAM的敏感性，有可能例如，进行如Lee L.W.等人，J.Biol.Chem.241，5479-5480(1966)所述的活性试验。在该方法中，酶萃取物与高丝氨酸和琥珀酰基-CoA一起培养。在不同的时间，一部份试验分析样品通过将其加入到乙醇、水和5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)的混合液中被终止。吸收在412nm处用分光光度计测定。上述试验，适合例如用于测定高丝氨酸转琥珀酰酶对SAM敏感性。高丝氨酸转琥珀酰酶活性的抑制在不同浓度的SAM存在的情况下在反应混合液中测试。不同的高丝氨酸转琥珀酰酶的催化活性在有或无SAM的情况下测定，抑制常数Ki则用这些数据计算。
优选的是通常对L-甲硫氨酸和/或SAM具有降低敏感性又同时拥有未改变的催化活性的高丝氨酸转琥珀酰酶。为其它目的，L-甲硫氨酸和/或SAM的敏感性和催化活性同时被降低也是我们所期望的。
本发明还涉及含有本发明的具有反馈抗性的metA等位基因的微生物菌株。这些微生物菌株的特征在于它们具有至少由具有反馈抗性的metA等位基因去调节(deregulated)的L-甲硫氨酸代谢或SAM代谢。因为已知此代谢在所有微生物中由本质上相同的途径进行，并且用于产生本发明的菌株的技术为本领域技术人员所熟知，例如，从标准教科书得知，并可用于所有的微生物，因此本发明的菌株可用任意的微生物制备。优选及合适的是用细菌生产本发明的菌株。革兰氏阴性菌，特别是大肠杆菌，特别适合。
本发明还进一步涉及通过培养本发明的微生物制备的L-甲硫氨酸或SAM，还涉及本发明的微生物用于制备含有甲硫氨酸(如含甲硫氨酸多肽)或在微生物代谢中衍生自L-甲硫氨酸或SAM(如多胺类、硫辛酸、生物素或醌类)的产物。此外，较野生型产生更大量SAM的本发明的微生物可用于制备通过从SAM转移甲基形成的产物。
为表达经修饰的高丝氨酸转琥珀酰酶，具有反馈抗性的metA等位基因经常规方法转化到宿主菌株中。
具有反馈抗性的metA等位基因可在位于metA基因上游的自身启动子的控制下表达，或使用本领域技术人员所熟知的其它合适的启动子系统。因此，对应的基因可在这样的启动子的控制下以一个或多个拷贝存在于宿主生物的染色体上或载体上，优选质粒。本发明因此还涉及质粒，其特征是其中含有本发明的具有反馈抗性的metA等位基因及启动子。
对于克隆，可使用已含有遗传元件(例如组成型或调节型启动子、终止子)的载体，这些元件使编码高丝氨酸转琥珀酰酶的基因能以可连续表达或以受控制的可诱导的方式表达。此外，在表达载体上还有其它调节元件如核糖体结合位点和终止序列，以及编码选择标记和/或报道基因的序列。这些选择标记的表达促进转化体的鉴定。合适的选择标记为例如编码对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那微素和其它抗生素的抗性的基因。若本发明的metA等位基因要在染色体外复制时，则质粒载体优选含有复制起点。尤其优选质粒载体如大肠杆菌载体pACYC184、pUC18，pBR322和pSC101及其衍生物。合适的可诱导的启动子的实例为lac、tac、trc、lambda PL、ara和tet启动子或自其衍生的序列。优选GAPDH启动子的组成型表达。在本发明的一个优选实施例中，编码高丝氨酸转琥珀酰酶的基因在衍生自pACYC184的质粒中的GAPDH启动子的控制下。将基因整合入染色体的策略是现有技术。
合适宿主菌株用含有编码对L-甲硫氨酸不敏感和/或对SAM不敏感的高丝氨酸转琥珀酰酶的转录单元的载体转化。含有对L-甲硫氨酸敏感和/或对SAM敏感的蛋白质的菌株，例如细菌，被用作宿主菌株。
优选使用的宿主菌株为大肠杆菌野生型菌株或其中内源metA基因失活的菌株，如大肠杆菌菌株DL41，CGSC菌株收藏号7177。这些菌株用本发明的metA基因互补。附加的措施可用以增加本发明的菌株生产L-甲硫氨酸或SAM的能力。例如，为此目的，可使用其中不再表达编码甲硫氨酸代谢基因抑制子的metJ基因的菌株(JP2000139471A)。
优选通过培养本发明的微生物菌株来产生L-甲硫氨酸或SAM。为此目的，微生物菌株，例如，在发酵罐中在合适的碳源和合适的能源以及其它添加剂的营养培养基中培养为佳。
在发酵期间形成的物质，如L-甲硫氨酸或SAM，之后可被纯化。
以下实施例用以进一步说明本发明。所有采用的分子生物学方法，如聚合酶链反应，DNA的分离和纯化，用限制酶、Klenow片段和连接酶修饰DNA，转化等是采用本领域技术人员所熟知的方式，文献中的所描述的方式或以各厂商所建议的方式实施。
实施例1：
使用metA结构基因的间接诱变来生成具有反馈抗性的高丝氨酸转琥珀酰酶
大肠杆菌metA基因由聚合酶链反应扩增，使用具有以下的序列的5’-端磷酸化寡核苷酸metAfw
5’-GATCCCATGGCTCCTTTTAGTCATTCTTAT-3’
(SEQ ID No.3)，
和具有以下的序列的meCArev
5’-GATCGAGCTCAGTACTATTAATCCAGCGTTGGATTC-3’
(SEQ ID No.4)，
作为引物及用得自大肠杆菌株W3110(ATCC 27325)的染色体DNA作为模板。1.1kb长的产物经电泳分离并用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。其后，用T4 DNA连接酶将其插入已用限制性酶EcoRI和Klenow片段(Roche)处理过的质粒pBR322(MBI Fermentas)中。生成的质粒，也就是pKP438，被用于诱变。
质粒pKP438通过转化作用导入大肠杆菌菌株XL1-red(Stratagene)，通过依照厂商说明书培养菌株将突变插入质粒pKP438中。诱变在临界浓度的甲硫氨酸类似物存在的情况下完成，如Lawrence D.A.和Smith D.A.，遗传学58：473-492(1968)中所述。该方法用于选择过量生产甲硫氨酸的突变株。大多数这样的突变株可归因于在质粒pKR438上编码的经修饰的高丝氨酸转琥珀酰酶。
来自两种突变株的质粒被分离并测定metA基因的DNA序列。发现与野生型比较，这两种基因各含有一个碱基取代，而这些碱基取代导致各自所编码的高丝氨酸转琥珀酰酶的一个氨基酸被改变。pBR1的metA的第301位碱基为A，而非野生型基因中的为G，导致天冬酰胺而非天冬氨酸加入所编码的蛋白质的第101位。pBR3的第881位碱基为G，而非野生型基因中为A，导致在所编码的蛋白质中的第294位是半胱氨酸而非酪氨酸。
实施例2：
在metA结构基因中使用特异性碱基置换以生成具有反馈抗性的高丝氨酸转琥珀酰酶
由分别在第101位和294位(见实施例3和4)的碱基置换及伴随的氨基酸改变所引起的编码对L-甲硫氨酸和/或SAM具有反馈抗性的高丝氨酸转琥珀酰酶的metA等位基因在实施例1中制备。因此用位点特异性诱变构建编码高丝氨酸转琥珀酰酶的基因，其中在第101位上的天冬氨酸或第294位上的酪氨酸用多种其他氨基酸置换，结果表现出在L-甲硫氨酸和SAM对其活性的抑制方面发生改变的特性。
衍生自pACYC184并以保藏号DSM10172保藏于德国不伦瑞克的德国微生物保藏中心的质粒pACYC184-LH被用作基础质粒来构建本发明的质粒。使用如下方法将GAPDH启动子序列以及其上游NdeI酶切位点插入到该质粒中：GAPDH启动子应用本领域技术人员所熟知的法则，通过聚合酶链反应被扩增，其中具有以下的序列的寡核苷酸GAPDHfw
5’-GTCGACGCGTGAGGCGAGTCAGTCGCGTAATGC-3’
(SEQ ID No.5)，
及具有以下的序列的GAPDHrevII，
5’-GACCTTAATTAAGATCTCATATGTTCCACCAGCTATTTGTTA-3’
(SEQ ID No.6)，
作为引物并用大肠杆菌株W3110(ATCC27325)的染色体DNA作为模板。电泳分离产物并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化，并依照厂商的用法说明书用限制酶MluI和PaeI处理。其后，用T4连接酶将其插入到已用相同酶处理过的pACYC184-LH载体中，结果形成质粒pKP290。
大肠杆菌metA基因通过聚合酶链反应扩增，使用具有以下的序列的寡核苷酸metAfw2
5’-CATGGCTCCTTTTAGTCATTCTTATATTCTAACGTAG-3’
(SEQ ID No.7)
及具有以下的序列的metArev2
5’-ACGCGTATGC ATCCAGAGCTCAGTACTATTAATCCAGCGTTGGATTC-3’
(SEQ ID No.8)
作为引物并用大肠杆菌株W3110(ATCC 27325)的染色体DNA作为模板。1.1kb长的产物经电泳分离并用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。其后，依照以下方式将该产物连接至载体pKP290中：以限制性酶NdeI、Klenow酶，限制酶BglII和绿豆核酸酶(Roche)处理。生成的质粒，也就是pKP413GAP由图1详示并以编号DSM15221保藏于德国不伦瑞克的德国微生物和细胞保藏中心。它含有在GAPDH启动子控制下的大肠杆菌metA基因并用作制备具有反馈抗性的metA等位基因的起始质粒。
将质粒pKP413GAP进行metA结构基因密码子294的位点特异性诱变。为此目的，依照本领域技术人员所熟知的方法进行Pfu聚合酶(Promega)的反向聚合酶链反应。所使用的引物为5’-端磷酸化寡核苷酸metAmutfw1，其具有以下的序列
5’-NNNCAGATCACGCCATACGATCTAC-3’
(SEQ ID No.9)，
其中在合成中A、T、C和G的1∶1∶1∶1的混合物被用作N；及metAmutrev1，其具有以下的序列
5’-GACGTAATAGTTGAGCCAGTTGG-3’
(SEQ ID No.10)。
约4.3kb大小的产物依照厂商说明书内容电泳分离并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。其后，使用T4 DNA连接酶依照厂商的说明书内容进行分子内连接。大肠杆菌株DH5α的细胞以本领域技术人员所熟知的方式通过CaCl2法转化。转化混合液被平铺在LB-四环素琼脂板上(10克蛋白胨/升，5克酵母萃取物/升，10克NaCl/升，15克琼脂/升，15毫克四环素/升)，并在37℃下培养过夜。接着使用QIAprep spin miniprep kit(Qiagen)进行质粒分离，期望的转化体通过限制酶分析被鉴定。含有metA结构基因密码子294的Esp3I至ScaI酶切位点间的区域依照本领域技术人员所熟知的方法被测序和分离并被插入已用相同酶处理过的pKP413GAP质粒中。
对密码子101的定向诱变的方法是类似的，但是聚合醇链反应所用的引物为具有以下的序列的寡核苷酸metAmutfw2
5’-NNNGGTTTGATTGTAACTGGTGCG-3’
(SEQ ID No.11)，
其中在合成中A、T、C和G的1∶1∶1∶1的混合物被用作N；及具有以下的序列的metAmutrev2
5’-AAAGTTCTGATCCTGAATATC-3’
(SEQ ID No.12)。
与野生型metA相比较，在密码子101上被改变的质粒，在Esp3I至PvuII酶切位点间的区域被测序，分离并被插入已用相同酶处理的pXP413GAP质粒中。
已用这种方式构建的质粒含有与野生型序列相比较分别在密码子294位或101位发生改变的序列的完整metA基因，因而可用它们来产生不同的高丝氨酸转琥珀酰酶变体(表1)。
表1：起始质粒和含有分别拥有改变的密码子101或294的metA
                      变体的质粒
  质粒  密码子101  氨基酸101  密码子294  氨基酸294
  pKP413GAP   GAC   Asp   TAC   Tyr
  pKP446   GAC   Asp   TGC   Cys
  pSLmetA*L   GAC   Asp   CTC   Leu
  pSLmetA*A   GAC   Asp   GCC   Ala
  pSLmetA*P   GAC   Asp   CCT   Pro
  pSLmetA*Q   GAC   Asp   CAG   Gln
  pSLmetA*K   GAC   Asp   AAG   Lys
  pSLmetA*O   GAC   Asp   ---*)   -**)
  pSLmetAN   AAC   Asn   TAC   Tyr
  pSLmetAH   CAC   His   TAC   Tyr
  pSLmetAC   TGT   Cys   TAC   Tyr
  pSLmetAS   AGC   Ser   TAC   Tyr
  pSLmetAY   TAC   Tyr   TAC   Tyr
  pSLmetAA   GCG   Ala   TAC   Tyr
  pSLmetAI   ATC   Ile   TAC   Tyr
*)：294位氨基酸在metA序列中消失
**)：294位氨基酸被删除
实施例3：
高丝氨酸转琥珀酰酶突变体的活性及对L-甲硫氨酸的反馈抗性
不同高丝氨酸转琥珀酰酶的活性及L-甲硫氨酸对活性的影响通过使用已产生各蛋白质的细胞提取物的酶试验测定。为此目的，编码改变的高丝氨酸转琥珀酰酶的相应质粒使用本领域技术人员所熟知的方法通过转化被导入大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27325)。转化混合液被平铺在LB-四环素琼脂板上(10克蛋白胨/升，5克酵母萃取物/升，5克Nacl/升，15克琼脂/升，15毫克四环素/升)并在37℃下培养过夜。生成的转化体在SM1培养基中生长(1升培养基：CaCl2×2H2O 0.0147克，MgSO4×7H2O 0.3克，Na2MoO4×2H2O 0.15毫克，H3BO3 2.5毫克，CoCl2×6H2O 0.7毫克，CuSO4×5H2O 0.25毫克，MnCl2×4H2O 1.6毫克，ZnSO4×7H2O 0.3毫克，KH2PO4 3.0克，K2HPO4 12.0克，(NH4)2SO4 5克，NaCl 0.6克，FeSO4×7H2O0.002克，Na3-柠檬酸×2H2O 1克，葡萄糖5克，蛋白胨1克，酵母萃取物0.5克)，在600nm约0.8的吸收值时离心沉淀，在50mmolTris pH 7.5中清洗并再离心沉淀。细胞被重悬于50mmol Tris/Cl，pH 7.5，2mmol二硫苏糖醇，0.5mmol苯基申磺酰氯中并在法式压滤器中破裂。来自进一步离心的上清在检测中被用做酶提取物。在含有50mmol Tris/Cl，pH 7.6，1mmol高丝氨酸和0.1mmol琥珀酰基-CoA的混合液中，依照由Kradich和Tomkins所述的用于测定丝氨酸乙酰基转移酶的方法(Kredieh N.M.和Tomkins G.M.，J.Biol.Chom，241，4955-4965(1966))经测定232nm处的消光降低而用光度计测定反应中形成的辅酶A来确定酶活性。测定添加的L-甲硫氨酸对活性的影响，并将可抑制性量化为Ki值。所测定的Ki为这样的L-甲硫氨酸浓度，在此浓度下高丝氨酸转琥珀酰酶的活性仅为在无L-甲硫氨酸的情况下活性的50％。
所有高丝氨酸转琥珀酰酶突变体，与野生型比较，均呈现出对L-甲硫氨酸反馈抗性的升高。表2简要列出结果。
表2：野生型酶和高丝氨酸转琥珀酰酶突变体的活性及对L-甲硫氨酸
                      的反馈抗性
  质粒   活性(单位/毫克)   在1mmol L-甲硫氨酸存在下的活性(％)*   L-甲硫氨酸Ki(mmol)
  pKP413GAP   0.155   2   0.05
  pKP446   0.133   96   11
  pSLmetA*L   0.070   89   6.5
  pSLmetA*A   0.063   94   7.5
  pSLmetA*P   0.020   91   6
  pSLmetA*Q   0.065   95   11
  pSLmetA*K   0.048   92   12.5
  pSLmetA*O   0.085   98   14.5
  pSLmetAN   0.050   86   8
  pSLmetAH   0.045   90   12
  pSLmetAC   0.084   92   5
  pSLmetAS   0.027   89   7.5
  pSLmetAY   0.094   93   10
  pSLmetAA   0.031   96   6
  pSLmetAI   0.107   95   9.5
*在无L-甲硫氨酸存在的情况下活性相当于100％。
实施例4：
高丝氨酸转琥珀酰酶对SAM的反馈抗性
SAM对不同高丝氨酸转琥珀酰酶活性的影响，通过在不同浓度的SAM(Cl盐，Sigma)存在下定量化活性来测定。细胞提取物如实施例3所述进行培养和制备。活性试验如Lee L.W.等人，于J.Biol.Chem.241，5479-5480(1966)中所述的方法进行，将酶提取物与50mmol磷酸钾缓冲液，pH 7.5，3mmol丝氨酸和0.3mmol琥珀酰基-CoA培养。多次后，100ul体积的试验混合液在各例子中通过将它们添加到到400ul乙醇，400ul水和100ul 10mmol 5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)的混合物中而终止。生成的混合物在室温下培养5分钟后，在412nm处的吸收用分光光度计测定。在蛋白质浓度测定后，酶活性用消光系数计算。算出的Ki为SAM抑制活性能力的测定值。
表3：高丝氨酸转琥珀酰酶突变体的活性及对SAM的反馈抗性
  质粒   活性(单位/毫克)  在1mmol SAM存在下的活性(％)*   SAM Ki(mmol)
  pKP413GAP   0.62   0.5   0.2
  pKP446   0.49   92   10
  pSLmetA*L   0.29   80   7
  pSLmetA*A   0.26   95   10
  pSLmetA*P   0.15   98   18
  pSLmetA*Q   0.21   87   6
  pSLmetA*K   0.14   90   5
  pSLmetA*O   0.33   96   10
  pSLmetAN   0.30   91   13
  pSLmetAH   0.27   93   16
  pSLmetAC   0.51   91   7
  pSLmetAS   0.15   89   10
  pSLmetAY   0.61   95   14
  pSLmetAA   0.20   90   8
  pSLmetAI   0.687   93   12
*在无SAM存在的情况下活性相当于100％。
                                序列表
<110>电化学工业有限公司(国际)
<120>反馈抗性的高丝氨酸转琥珀酰酶
<130>CO-10217
<140>
<141>
<160>12
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>930
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(930)
<300>
<301>Blattner，F.R.
<302>The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.
<303>Science
<304>277
<305>5331
<306>1453-1474
<307>1997
<400>1
atg ccg att cgt gtg ccg gac gag cta ccc gcc gtc aat ttc ttg cgt    48
Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg
  1               5                  10                  15
gaa gaa aac gtc ttt gtg atg aca act tct cgt gcg tct ggt cag gaa    96
Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu
             20                  25                  30
att cgt cca ctt aag gtt ctg atc ctt aac ctg atg ccg aag aag att    144
Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile
         35                  40                  45
gaa act gaa aat cag ttt ctg cgc ctg ctt tca aac tca cct ttg cag    192
Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln
     50                  55                  60
gtc gat att cag ctg ttg cgc atc gat tcc cgt gaa tcg cgc aac acg    240
Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr
 65                  70                  75                  80
ccc gca gag cat ctg aac aac ttc tac tgt aac ttt gaa gat att cag    288
Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln
                 85                  90                  95
gat cag aac ttt gac ggt ttg att gta act ggt gcg ccg ctg ggc ctg    336
Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu
            100                 105                 110
gtg gag ttt aat gat gtc gct tac tgg ccg cag atc aaa cag gtg ctg    384
Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu
        115                 120                 125
gag tgg tcg aaa gat cac gtc acc tcg acg ctg ttt gtc tgc tgg gcg    432
Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala
    130                 135                 140
gta cag gcc gcg ctc aat atc ctc tac ggc att cct aag caa act cgc    480
Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg
145                 150                 155                 160
acc gaa aaa ctc tct ggc gtt tac gag cat cat att ctc cat cct cat    528
Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His
                165                 170                 175
gcg ctt ctg acg cgt ggc ttt gat gat tca ttc ctg gca ccg cat tcg    576
Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser
            180                 185                 190
cgc tat gct gac ttt ccg gca gcg ttg att cgt gat tac acc gat ctg    624
Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu
        195                 200                 205
gaa att ctg gca gag acg gaa gaa ggg gat gca tat ctg ttt gcc agt    672
Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser
    210                 215                 220
aaa gat aag cgc att gcc ttt gtg acg ggc cat ccc gaa tat gat gcg    720
Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala
225                 230                 235                 240
caa acg ctg gcg cag gaa ttt ttc cgc gat gtg gaa gcc gga cta gac    768
Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp
                245                 250                 255
ccg gat gta ccg tat aac tat ttc ccg cac aat gat ccg caa aat aca    816
Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr
            260                 265                 270
ccg cga gcg agc tgg cgt agt cac ggt aat tta ctg ttt acc aac tgg    864
Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp
        275                 280                 285
ctc aac tat tac gtc tac cag atc acg cca tac gat cta cgg cac atg    912
Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met
    290                 295                 300
aat cca acg ctg gat taa                                            930
Asn Pro Thr Leu Asp
305                 310
<210>2
<211>309
<212>PRT
<213>Escherichia coli
<400>2
Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg
  1               5                  10                  15
Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu
             20                  25                  30
Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile
         35                  40                  45
Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln
     50                  55                  60
Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr
 65                  70                  75                  80
Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln
                 85                  90                  95
Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu
            100                 105                 110
Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu
        115                 120                 125
Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala
    130                 135                 140
Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg
145                 150                 155                 160
Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His
                165                 170                 175
Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser
            180                 185                 190
Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu
        195                 200                 205
Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser
    210                 215                 220
Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala
225                 230                 235                 240
Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp
                245                 250                 255
Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr
            260                 265                 270
Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp
        275                 280                 285
Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met
    290                 295                 300
Asn Pro Thr Leu Asp
305
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：
     Oligonukleotid metAfw
<400>3
gatcccatgg ctccttttag tcattcttat                                       30
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Oligonukleotid
     metArev
<400>4
gatcgagctc agtactatta atccagcgtt ggattc                                36
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Oligonukleotid
     GAPDHfw
<400>5
gtcgacgcgt gaggcgagtc agtcgcgtaa tgc                                   33
<210>6
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Oligonukleotid
     GAPDHrevII
<400>6
gaccttaatt aagatctcat atgttccacc agctatttgt ta                         42
<210>7
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Oligonukleotid
     metAfw2
<400>7
catggctcct tttagtcatt cttatattct aacgtag                               37
<210>8
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Oigonukleotid
     metArev2
<400>8
acgcgtatgc atccagagct cagtactatt aatccagcgt tggattc                    47
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Oligonukleotid
     metAmutfwl
<400>9
nnncagatca cgccatacga tctac                                            25
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Oligonukleotid
     metAmutrevl
<400>10
gacgtaatag ttgagccagt tgg                                              23
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Oligonukleotid
     metAmutfw2
<400>11
nnnggtttga ttgtaactgg tgcg                                             24
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Oligonukleotid
     metAmutrev2
<400>12
aaagttctga tcctgaatat c                                                21

Claims (9)

1、一种高丝氨酸转琥珀酰酶，其与高丝氨酸转琥珀酰酶野生型酶相比，有至少一个突变，并与野生型酶相比呈现出对L-甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的降低的敏感性，野生型酶拥有一段氨基酸序列，包括在第90位至115位的成分序列AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro和在第285位至310位的成分序列TyrGlnXaaThrPro，氨基酸序列的第1位为起始甲硫氨酸，其特征在于该突变是在成分序列AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro中的天冬氨酸的氨基酸置换或成分序列TyrGlnXaaThrPro中的酪氨酸的氨基酸置换。
2、如权利要求1的高丝氨酸转琥珀酰酶，其特征在于与野生型相比较，其呈现出对S-腺苷甲硫氨酸或L-甲硫氨酸的抗性增加至少2倍。
3、如权利要求1或2的高丝氨酸转琥珀酰酶，其特征在于其含有下述突变之一：天冬氨酸被突变为Asn、His、Cys、Ser、Tyr、Ala或Ile，或者酪氨酸被突变为Cys、Leu、Ala、Pro、Gln、Lys或被删除。
4、一种分离的metA等位基因，其编码如权利要求1、2或3中任一项的高丝氨酸转琥珀酰酶。
5、一种质粒，其特征在于含有与启动子一起的如权利要求4的metA等位基因。
6、一种微生物菌株，其特征在于其含有如权利要求4的metA等位基因。
7、如权利要求6的微生物菌株，其特征在于其是革兰氏阴性菌株。
8、如权利要求7的微生物菌株，其中所述革兰氏阴性菌株为大肠杆菌。
9、一种通过培养如权利要求6-8任一项的微生物菌株来制备L-甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的方法。
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