JP2006516092A - フィードバック耐性のホモセリン−スクシニル転移酵素 - Google Patents
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Abstract
Description
metA構造遺伝子の非部位特異的な突然変異誘発によるフィードバック耐性のホモセリン−スクシニル転移酵素の製造
大腸菌由来の遺伝子metAを、配列5′−GATCCCATGGCTCCTTTTAGTCATTCTTAT−3′(配列番号3)を有する5′末端のリン酸化されたオリゴヌクレオチドmetAfw及び配列5′−GATCGAGCTCAGTACTATTAATCCAGCGTTGGATTC−3′(配列番号4)を有するmetArevをプライマーとして使用し、かつ大腸菌株W3110(ATCC27325)由来の染色体DNAを基体として使用してポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させた。1.1キロ塩基長の産物が電気泳動により単離され、これをQIAquickゲル抽出キット(キアゲン社)によって精製した。次いで前記産物を、制限酵素EcoRI及びクレノウ断片(ロシェ社)により処理されているプラスミドpBR322(MBIファーメンタス社)中にT4−DNAリガーゼにより導入した。生じたプラスミドpKP438を突然変異誘発のために使用した。
metA構造遺伝子中の意図的な塩基交換によるフィードバック耐性のホモセリン−スクシニル転移酵素の製造
実施例1においては、塩基交換とそれに伴う位置101もしくは位置294でのアミノ酸改変に基づいてL−メチオニン及び/又はSAMに対してフィードバック耐性のホモセリン−スクシニル転移酵素をコードするmetAアレルを製造した(実施例3及び実施例4を参照)。従って位置特異的突然変異誘発によって、ホモセリン−スクシニル転移酵素をコードし、位置101のアミノ酸アスパラギン酸又は位置294のアミノ酸チロシンのいずれかが種々の別のアミノ酸によって交換されており、そしてそれによりL−メチオニン及びSAMによるその活性の阻害に関する改変された特性を有する遺伝子を構築した。
ホモセリン−スクシニル転移酵素の突然変異体の活性及びL−メチオニンに対するフィードバック耐性
種々のホモセリン−スクシニル転移酵素の活性及びL−メチオニンによる活性に対する影響を、各タンパク質が産生されている細胞抽出物での酵素試験によって調査した。このために、改変されたホモセリン−スクシニル転移酵素をコードする相応のプラスミドを形質転換により当業者に公知の方法に従って大腸菌株W3110(ATCC27325)中に導入した。形質転換バッチを、LB−テトラサイクリン−寒天平板(10g/lのトリプトン、5g/lの酵母エキス、5g/lのNaCl、15g/lの寒天、15mg/lのテトラサイクリン)上に塗布し、そして37℃で一晩インキュベートした。得られた形質転換体をSM1培地(1lの培地に関して:CaCl2×2H2O 0.0147g、MgSO4×7H2O 0.3g、Na2MoO4×2H2O 0.15mg、H3BO3 2.5mg、CoCl2×6H2O 0.7mg、CuSO4×5H2O 0.25mg、MnCl2×4H2O 1.6mg、ZnSO4×7H2O 0.3mg、KH2PO4 3.0g、K2HPO4 12.0g、(NH4)2SO4 5g、NaCl 0.6g、FeSO4×7H2O 0.002g、Na3クエン酸×2H2O 1g、グルコース 5g、トリプトン 1g、酵母エキス 0.5g)中で培養し、600nmで約0.8の吸光度になるまで遠心分離し、50mMのトリス、pH7.5中で洗浄し、そして再び遠心分離した。これらの細胞を50mMのトリス塩酸(pH7.5)、2mMのジチオトレイトール、0.5mMのフェニルメチルスルホン酸フッ化物中に再懸濁し、そしてフレンチプレス中で該細胞を破砕した。更なる遠心分離の上清を酵素抽出物として試験において使用した。酵素活性を、50mMのトリス塩酸(pH7.6)、1mMのホモセリン及び0.1mMのスクシニルCoAを有する混合物中で測定するが、その際、該反応で生ずる補酵素Aは232nmでの吸光度の低減を介して、Kredich及びTomkinsによって記載された、セリン−アセチル転移酵素の活性測定法(Kredich N. M.及びTomkins G. M.、J. Biol. Chem. 241, 4955-4965 (1966))に従って測光的に定量した。添加されるべきL−メチオニンによる活性に対する影響を調査し、そして阻害性をKiとして定量した。Kiとして、ホモセリン−スクシニル転移酵素の活性がL−メチオニンの不在下の活性の50%だけであるL−メチオニンの濃度を規定している。
全てのホモセリン−スクシニル転移酵素の突然変異体は、野生型と比較して高められたL−メチオニンに対するフィードバック耐性を示す。第2表は結果のまとめを示している。
ホモセリン−スクシニル転移酵素のSAMに対するフィードバック耐性
種々のホモセリン−スクシニル転移酵素の活性に対するSAMの影響を種々のSAM濃度(Cl塩、シグマ社)の存在下での活性を定量することによって調査した。培養及び細胞抽出物の調製は、実施例3に記載されるのと同様に実施した。活性試験は、Lee L. W.ら、J. Biol. Chem. 241, 5479-5480 (1966)に記載されるように実施し、その際、酵素抽出物と一緒に50mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)、3mMのホモセリン及び0.3mMのスクシニルCoAをインキュベートした。種々の時点で、100μlの試験混合物を400μlのエタノール、400μlの水及び100μlの5,5′−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)からなる混合物に添加することによって停止させた。該バッチを室温で5分間インキュベートした後に、412nmでの吸光度を測光測定した。タンパク質濃度を測定した後に、吸光係数を用いて酵素活性を計算した。SAMによる活性の阻害についての尺度としてKiを調べた。
Claims (8)
- ホモセリン−スクシニル転移酵素の野生型酵素と比較して少なくとも1つの突然変異を有し、そして野生型の酵素と比較して低減されたL−メチオニン又はSAMに対する感受性を示し、その際、野生型酵素は、位置90〜115に部分配列AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaProを、かつ位置285〜310に部分配列TyrGlnXaaThrProを有し、アミノ酸配列の位置1は開始メチオニンであるアミノ酸配列を有するホモセリン−スクシニル転移酵素であって、突然変異が、部分配列AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro中のアスパラギン酸のアミノ酸交換又は部分配列TyrGlnXaaThrPro中のチロシンのアミノ酸交換であることを特徴とするホモセリン−スクシニル転移酵素。
- 野生型と比較して2倍高められたSAM又はL−メチオニンに対する耐性(高められたKi)を有する、請求項1記載のホモセリン−スクシニル転移酵素。
- 第1表に列記された突然変異の1つを有する、請求項1又は2記載のホモセリン−スクシニル転移酵素。
- 請求項1から3までのいずれか1項記載のホモセリン−スクシニル転移酵素をコードするmetAアレル。
- プラスミドであって、請求項4記載のmetAアレルと一緒にプロモーターを有することを特徴とするプラスミド。
- 微生物株であって、請求項4に記載のフィードバック耐性metAアレルを有することを特徴とする微生物株。
- 微生物株がグラム陰性細菌株、有利には大腸菌である、請求項6記載の微生物株。
- 請求項6又は7記載の微生物株の培養によるL−メチオニン又はSAMの製造方法。
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