JP2021048849A - タンパク質へのノルロイシン誤取り込みを防ぐための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】細菌における組換えタンパク質の産生の間にタンパク質へのノルロイシンの取り込みを防止するための方法を提供する。【解決手段】タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、該方法は微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含み、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する変異微生物である、方法とする。【選択図】図11
Description
関連出願
本出願は、2013年3月12日に出願された米国仮出願第61/777700号、及び2012年9月19日に出願された米国仮出願第61/703142号の利益を主張し、その両方とも参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
本出願は、2013年3月12日に出願された米国仮出願第61/777700号、及び2012年9月19日に出願された米国仮出願第61/703142号の利益を主張し、その両方とも参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
配列表
本出願は、EFS−Web経由でASCIIフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が本明細書中で参照することにより援用される。2013年7月11日に作成された前記ASCIIコピーはP4967R1−WO_SL.txtと命名され、大きさは45847バイトである。
本出願は、EFS−Web経由でASCIIフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が本明細書中で参照することにより援用される。2013年7月11日に作成された前記ASCIIコピーはP4967R1−WO_SL.txtと命名され、大きさは45847バイトである。
本発明は、細菌における組換えタンパク質の産生の間にタンパク質へのノルロイシン誤取り込みを防止するための方法及び組成物に関する。本発明はまた、本明細書において提供される方法及び組成物と共に使用するための微生物宿主細胞及び核酸分子を提供する。
アミノ酸のメチオニンの類似体である、ノルロイシンは、メチオニン残基の代わりにタンパク質中に組み込むことができる。大腸菌(E. coli)で発現される場合、多くの異種タンパク質は、メチオニン残基が現れるはずの場所に誤って組み込まれたノルロイシンを有する。タンパク質、特に組換え手段により生成された異種タンパク質におけるノルロイシン誤取り込みは、結果として生じる、望ましくない特性を有する改変されたタンパク質の生成に一部起因して、一般的に望ましくないと考えられている。
大腸菌における組換えタンパク質の生成の間のメチオニン位置でのノルロイシン誤取り込みは、50年以上にわたって観察されている。(例えば、Munier and Cohen (1959) Biochim Biophys Acta 31:378-391; Cohen and Munier (1956) Biochim Biophys Acta 21:592-593; Cohen and Munier (1959) Biochim Biophys Acta 31:347-356;及びCowie et al., (1959) Biochim Biophys Acta 34:39-46を参照)。例えば、メチオニルウシソマトトロピン(MBS)におけるメチオニン残基の約14%は、大腸菌におけるこのタンパク質の組換え生成の最中にノルロイシン誤取り込みを示し、天然型大腸菌タンパク質中のメチオニン残基の約6%もノルロイシンで置換された。(Bogosian et al., (1989) J Biol Chem 264:531-9を参照)。別の例において、最少培地の大腸菌発酵におけるインターロイキン2の生成は、組換えタンパク質中のメチオニン残基の約19%がノルロイシンで置換される結果となった。(Tsai et al., (1988) Biochem Biophys Res Commun 156:733-739)。他の研究では、タンパク質へのノルロイシン残基の誤取り込みは、内部のメチオニン残基とアミノ末端のメチオニン残基の両方で生じる可能性があることを示した。(Brown (1973) Biochim Biophys Acta 294:527-529;及びBarker and Bruton (1979) J Mol Biol 133:217-231を参照)。
ノルロイシンは、酵素メチオニルtRNA合成酵素(MetG)の乱雑な性質に起因して、タンパク質への組み込みについてメチオニンと競合する。(Trupin et al., (1966) Biochem Biophys Res Commun 24:50-55;及びFersht and Dingwall (1979) Biochemistry 18:1250-1256を参照)。大腸菌MetG酵素での速度論的研究は、MetGのアシル化は、約ノルロイシンによるものと比較してメチオニンで約4倍多いことを示した。(van Hest et al., (2000) Am Chem Soc 122:1282-1288を参照)。MetGの緩和された基質特異性に起因して、ノルロイシンは、アシル化反応でメチオニンの代わりとなることができ、メチオニンの代わりにタンパク質へのノルロイシン誤取り込みをもたらす。
組換えタンパク質の生成におけるメチオニン残基に対するノルロイシン残基の誤取り込みは、一般的に望ましくないと考えられる。誤って取り込まれたノルロイシン残基を含む組換えタンパク質又はポリペプチドは、例えば、タンパク質分解に対する感受性の変化、生物学的活性の低下、又は免疫原性の増加など、改変された構造的及び機能的特徴を示し得る。
組換えタンパク質の生成中にノルロイシン誤取り込みを低下させる又は防止するために様々な戦略が開発されている。例えば、発酵プロセスの最中に(メチオニンの持続又はボーラス供給/添加により)メチオニンを含む細胞培地を補充することは、過剰のメチオニンが細胞に利用可能であり、従ってノルロイシンによるメチオニルtRNAの誤った荷電の可能性を減少させることを確実にするために使用されている。(例えば、米国特許第5599690を参照)。メチオニンの持続又はボーラス供給/添加は、組換えタンパク質におけるノルロイシン誤取り込みの程度を低下させたが、発酵プロセスの操作の複雑さとコストは増加し得る。更に、発酵の最中のメチオニンの持続又はボーラス供給/添加は、発酵槽の内容物の望ましくない希釈につながり、細胞密度の低下及び生成物収率の低下もたらす可能性がある。
ノルロイシン生合成経路に関与する遺伝子を除去すること、例えば、ロイシンオペロン(leuA、leuB、leuC、及びeuD)の遺伝子を除去すること、又はlvE又はtyrBなどのトランスアミナーゼをコードする遺伝子を除去することが、タンパク質へのノルロイシン誤取り込みを減少させるために使用されている。(Bogosian et al., (1989) J Biol Chem 264:531-539; Tsai et al., (1989) Biochem Biophys Res Commun 156:733-739;及びRandhawa et al., (1994) Biochemistry 33:4352-4362を参照)。ノルロイシン生合成に関与する多くの遺伝子はまた、分岐鎖アミノ酸の生合成に関与しているので、ノルロイシン誤取り込みを防止するための、生合成経路遺伝子の除去は、しかしながら、発酵の間、培地に他のアミノ酸(例えばロイシン又はイソロイシンなど)の添加を必要とし得る。(Bogosian et al., (1989) J Biol Chem 264:531-539を参照;本明細書の図8を参照)。
ノルロイシン誤取り込みを防ぐために使用される別の戦略は、例えば、アミノ酸脱水素酵素及びアミノ酸オキシダーゼを含む、ノルロイシンを分解する酵素の共発現を含んでいた。しかしながら、このアプローチは、組換えタンパク質生成中には所望されず、組換えタンパク質の収率低下をもたらし得る、これらの酵素の過剰発現を必要とした。(例えば、米国特許出願公開番号US2007/0009995を参照)。更に、これらの酵素の過剰発現は、発酵プロセス中に他の類似のアミノ酸の分解をもたらし得る。メチオニンコドンを他のコドンと置換することによる、発現されるポリペプチドの一次アミノ酸配列の改変が、ノルロイシン誤取り込みを防ぐために行われた。(例えば、米国特許第5698418号を参照)。しかし、このような置換は、バイオテクノロジー産業における組換えタンパク質産生のために非常に望ましくない結果である、得られたタンパク質の活性の低下又は構造変化をもたらし得る。
上述したように、微生物における組換えタンパク質産生の間にノルロイシン誤取り込みを防止するために使用される現在の方法は、様々な欠点に関連しており;従って、特に、大腸菌などの微生物における組換えタンパク質生成の間に、タンパク質へのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させために有用な新規な方法に対する必要性が存在する。
本発明は、微生物、例えば、細菌などにおける組換えタンパク質生成の間のノルロイシン誤取り込みを防ぐのに効果的である、操作された微生物宿主細胞を提供することによって、この必要性を満たす。本発明は、とりわけ、タンパク質及びポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを低減する又は防止するのに十分な程度又は量に微生物によるメチオニンの生成を生じる、変異したmetA及びmetK対立遺伝子(すなわち、改変されたmetA及びmetKの核酸配列)を含む大腸菌宿主細胞を提供する。このような宿主細胞を利用した、生成される組換えタンパク質の分析は、メチオニン残基の代わりにノルロイシン残基の誤取り込みが解消されることを示した。本発明は更に、宿主細胞の増殖、及びそのような大腸菌宿主細胞を利用した組換えタンパク質生成物の力価を含む、大腸菌宿主細胞を使用した発酵プロセスのパフォーマンスは、対照宿主細胞において観察されたものと同等であったことを示している。
本発明は、一つには、タンパク質及びポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させための方法及び組成物を提供する。本発明の方法及び組成物は、微生物、例えば細菌(例えば、大腸菌)により発現される、異種性(例えば、組換え)タンパク質及びポリペプチドにおいて、ノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに有用である。
幾つかの実施態様において、本発明は、微生物により発現される、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する方法を提供する。幾つかの実施態様において、微生物は、フィードバック耐性又はフィードバック非感受性ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの微生物である。他の実施態様において、微生物は、変異metA対立遺伝子、変異metK対立遺伝子、又は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む微生物である。
幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、ここで、変異metA対立遺伝子は、アミノ酸位置27でのアルギニンのシステインへの置換、アミノ酸位置64でのグルタミンのグルタミン酸への置換、アミノ酸位置294でのチロシンのシステインへの置換、アミノ酸位置296でのイソロイシンのセリンへの置換、及びアミノ酸位置298でのプロリンのロイシンへの置換からなる群から選択されるMetAにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、アミノ酸位置296でのイソロイシンのセリンへの置換、及びアミノ酸位置298でのプロリンのロイシンへの置換を含む、MetAにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。本明細書において本明細書に記載されるMetAアミノ酸の位置は、図7A及び配列番号29に示されるように野生型MetAアミノ酸配列を参照する。
他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metA対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25、及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含む。
上記のように、本発明は、微生物により発現される、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する方法を提供する。他の実施態様において、本発明は、微生物により発現されるタンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、メチオニン生成について抑制解除された(de-repressed)微生物である。幾つかの実施態様において、微生物は、S−アデノシルメチオニン合成酵素の部分的な機能喪失に起因してメチオニン生成について抑制解除される。他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metA対立遺伝子を含む。幾つかの実施態様において、変異MetK対立遺伝子は、MetKの部分的な機能喪失を生じる。
幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metK対立遺伝子を含み、変異metK対立遺伝子は、アミノ酸位置185でのバリンのグルタミン酸への置換を含む、MetKにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metK対立遺伝子を含み、変異metK対立遺伝子は、metK対立遺伝子の核酸残基位置1132でシトシン塩基の欠失を含む核酸配列を含む。本明細書に記載されるMetKアミノ酸の位置は、図8A及び配列番号30に示されるように野生型MetKアミノ酸配列を参照する。本明細書に記載されるmetK核酸の位置は、図8B及び配列番号32に示されるように野生型metK核酸配列を参照する。
幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物においてタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metK対立遺伝子を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。
他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物においてタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は変異metA対立遺伝子及びmetK対立遺伝子を含む。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、MetAのアミノ酸位置294でのチロシンのシステインへの置換をコードする核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は、MetKのアミノ酸位置185でのバリンのグルタミン酸への置換をコードする核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metA対立遺伝子及びmetK対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は、metAのアミノ酸位置294でのチロシンのシステインへの置換をコードする核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は、metK対立遺伝子の核酸残基位置1132でシトシン塩基の欠失を含む核酸配列を含む。
他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は、配列番号24の核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号27の核酸配列を含む。更に他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は、配列番号24の核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号28の核酸配列を含む。
本発明は更に、微生物宿主細胞によって発現されるタンパク質及びポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるために有用な微生物宿主細胞を提供する。本発明はまた、微生物宿主細胞によるタンパク質又はポリペプチドにおいて使用のための微生物宿主細胞を提供し、発現されたタンパク質又はポリペプチドはノルロイシン誤取り込みを含まない。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。
本発明は、微生物(例えば、微生物宿主細胞)を提供し、微生物は、微生物により発現されるタンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する。幾つかの実施態様において、本発明は、微生物を提供し、微生物は、フィードバック耐性又はフィードバック非感受性ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの微生物である。他の実施態様において、本発明は、変異metA対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、変異metA対立遺伝子を含む微生物を提供し、ここで、変異metA対立遺伝子は、アミノ酸位置27でのアルギニンのシステインへの置換、アミノ酸位置64でのグルタミンのグルタミン酸への置換、アミノ酸位置294でのチロシンのシステインへの置換、アミノ酸位置296でのイソロイシンのセリンへの置換、及びアミノ酸位置298でのプロリンのロイシンへの置換からなる群から選択されるMetAにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。
幾つかの実施態様において、本発明は、変異metA対立遺伝子が、MetAにおける一以上のアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む、変異metA対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、MetAにおけるアミノ酸位置296でのイソロイシンのセリンへの置換、及びMetAにおけるアミノ酸位置298でのプロリンのロイシンへの置換をコードする核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。
幾つかの実施態様において、本発明は、微生物を提供し、ここで微生物は、変異metA対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25、及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。
本発明は、微生物(例えば、微生物宿主細胞)を提供し、微生物は、微生物により発現されるタンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する。幾つかの実施態様において、本発明は、微生物を提供し、微生物は、メチオニン生成について抑制解除された微生物である。幾つかの実施態様において、メチオニン生成について抑制解除された微生物は、S−アデノシルメチオニン合成酵素の部分的な機能喪失によって生じる。他の実施態様において、本発明は、変異metK対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、変異metK対立遺伝子を含む微生物を提供し、変異metK対立遺伝子は、アミノ酸位置185でのバリンのグルタミン酸への置換を含むMetKにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明は、変異metK対立遺伝子を含む微生物を提供し、変異metK対立遺伝子は、metK対立遺伝子において核酸残基位置1132にてシトシン塩基の欠失を含む核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。
幾つかの実施態様において、本発明は、微生物を提供し、微生物は、変異metK対立遺伝子を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。
本発明はまた、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子の様々な組み合わせを含む微生物宿主細胞を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む微生物を提供し、変異metA対立遺伝子は、アミノ酸位置294でのチロシンのシステインへの置換を含むMetAにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は、アミノ酸位置185でのバリンのグルタミン酸への置換を含むMetKにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む微生物を提供し、変異metA対立遺伝子は、アミノ酸位置294でのチロシンのシステインへの置換を含むMetAにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は、metK対立遺伝子の核酸残基位置1132で核酸シトシンの欠失を含む。幾つかの実施態様において、本発明は微生物を提供し、微生物は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は、配列番号24の核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号27の核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明は微生物を提供し、微生物は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は、配列番号24の核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号28の核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。
本発明はまた、本方法における使用のための単離された核酸分子を提供する。幾つかの態様において、本発明は、単離されたmetA核酸分子(すなわち、MetAをコードする単離された核酸分子)を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、単離されたmetA核酸分子を提供し、ここで、metA核酸分子は、アミノ酸位置27でのアルギニンのシステインへの置換、アミノ酸位置64でのグルタミンのグルタミン酸への置換、アミノ酸位置294でのチロシンのシステインへの置換、アミノ酸位置296でのイソロイシンのセリンへの置換、及びアミノ酸位置298でのプロリンのロイシンへの置換からなる群から選択されるMetAにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明により提供される単離されたmetA核酸分子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25、及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含む。タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させることに使用のための、微生物の生成のための、これらの単離されたmetA核酸分子及びその配列の使用が、本発明により本明細書に具体的に与えられる。
本発明はまた、単離されたmetK核酸分子(すなわち、MetKをコードする単離された核酸分子)を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、metK核酸分子を提供し、metK核酸分子は、アミノ酸位置185でのバリンのグルタミン酸への置換を含むMetKにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明は、metK核酸分子を提供し、metK核酸分子は、metK対立遺伝子の核酸残基1132にて核酸シトシンの欠失を含む。他の実施態様において、本発明により提供されるmetK核酸分子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させることにおける使用のための微生物の生成のための、これらの単離されたmetK核酸分子及びその配列の使用が、本発明により本明細書に具体的に与えられる。
本発明は変異metA対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異metA対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号46のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号47のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、配列番号46のアミノ酸配列をコードする核酸は、配列番号33の核酸配列である。幾つかの実施態様において、配列番号47のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号34の核酸配列である。幾つかの実施態様において、本発明は変異metA対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号33に対応する核酸配列を有する核酸及び配列番号34に対応する核酸配列を有する核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25、及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。
本発明は変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号46のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号47のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、配列番号46のアミノ酸配列をコードする核酸は、配列番号33の核酸配列である。幾つかの実施態様において、配列番号47のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号34の核酸配列である。幾つかの実施態様において、本発明は変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号33に対応する核酸配列を有する核酸及び配列番号34に対応する核酸配列を有する核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。
本発明は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号46のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号47のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、配列番号46のアミノ酸配列をコードする核酸は、配列番号33の核酸配列である。幾つかの実施態様において、配列番号47のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号34の核酸配列である。幾つかの実施態様において、本発明は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号33に対応する核酸配列を有する核酸及び配列番号34に対応する核酸配列を有する核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。
本発明は変異metA対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗D因子抗体又は抗D因子抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異metA対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号48のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号49のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。
本発明は変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗D因子抗体又は抗D因子抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号48のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号49のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。
本発明は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗D因子抗体又は抗D因子抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号48のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号49のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。
本発明は変異metA対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗MET抗体又は抗MET抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異metA対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号50のアミノ酸配列をコードする核酸、配列番号51のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号52のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。
本発明は変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗MET抗体又は抗MET抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号50のアミノ酸配列をコードする核酸、配列番号51のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号52のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。
本発明は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗MET抗体又は抗MET抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号50のアミノ酸配列をコードする核酸、配列番号51のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号52のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。
本発明は、ノルロイシン誤取り込みを含まないタンパク質又はポリペプチドを微生物宿主細胞内で生成するための方法であって、タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含む方法を更に提供し、細菌宿主細胞は、変異metA対立遺伝子、変異metK対立遺伝子、又は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、それによってノルロイシン誤取り込みを含まないタンパク質又はポリペプチドを生成する。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。
本発明はまた、微生物宿主細胞内で抗体又は抗体断片を生成するための方法であって、抗体又は抗体断片がノルロイシン誤取り込みを含まない方法を提供し、方法は抗体又は抗体断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含み、細菌宿主細胞は、変異metA対立遺伝子、変異metK対立遺伝子、又は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、それによってノルロイシン誤取り込みを含まない抗体又は抗体断片を生成する。一態様において、本発明に従って、ノルロイシン誤取り込みを含まずに、細菌宿主細胞内で抗体又は抗体断片を生成するための方法は、細菌宿主細胞内で抗体重鎖ポリペプチドをコードする核酸及び抗体軽鎖ポリペプチドをコードする核酸を発現させることを含む。幾つかの態様において、抗体重鎖ポリペプチドは、抗体Fab断片重鎖ポリペプチドであり、抗体軽鎖ポリペプチドは、抗体Fab断片軽鎖ポリペプチドである。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様において、本発明は、微生物宿主細胞内で抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片を生成するための方法であって、抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片がノルロイシン誤取り込みを含まない方法を提供し、方法は抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含み、細菌宿主細胞は、変異metA対立遺伝子、変異metK対立遺伝子、又は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、それによってノルロイシン誤取り込みを含まない抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片を生成する。幾つかの実施態様において、方法は、抗VEGF抗体重鎖ポリペプチド又は抗VEGF抗体断片の重鎖ポリペプチド又はその断片をコードする核酸、及び抗VEGF抗体軽鎖ポリペプチド又は抗VEGF抗体断片の軽鎖ポリペプチド又はその断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含む。幾つかの態様において、抗VEGF抗体重鎖及び抗VEGF抗体軽鎖は、完全長重鎖及び軽鎖抗VEGF抗体ポリペプチドである。他の態様において、抗VEGF抗体重鎖は、抗体Fab断片重鎖ポリペプチドであり、抗VEGF抗体軽鎖は、抗体Fab断片軽鎖ポリペプチドである。幾つかの実施態様において、抗VEGF抗体重鎖は、配列番号47のアミノ酸配列を含み、抗VEGF抗体軽鎖は、配列番号46のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様において、配列番号47のアミノ酸配列をコードする核酸は、配列番号34の核酸配列である。幾つかの実施態様において、配列番号46のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号33の核酸配列である。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。
本発明は更に、本明細書中に記載の任意の方法によって生成される抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片を提供し、抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片は、ノルロイシン誤取り込みを含まない。
幾つかの実施態様において、本発明は、微生物宿主細胞内で抗D因子抗体又は抗D因子抗体断片を生成するための方法であって、抗D因子抗体又は抗D因子抗体断片がノルロイシン誤取り込みを含まない方法を提供し、方法は抗D因子抗体又は抗D因子抗体断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含み、細菌宿主細胞は、変異metA対立遺伝子、変異metK対立遺伝子、又は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、それによってノルロイシン誤取り込みを含まない抗D因子抗体又は抗D因子抗体断片を生成する。幾つかの実施態様において、方法は、抗D因子抗体重鎖ポリペプチド又は抗D因子抗体断片の重鎖ポリペプチド又はその断片をコードする核酸、及び抗D因子抗体軽鎖ポリペプチド又は抗D因子抗体断片の軽鎖ポリペプチド又はその断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含む。幾つかの態様において、抗D因子抗体重鎖及び抗D因子抗体軽鎖は、完全長重鎖及び軽鎖抗D因子抗体ポリペプチドである。他の態様において、抗D因子抗体重鎖は、抗体Fab断片重鎖ポリペプチドであり、抗D因子抗体軽鎖は、抗体Fab断片軽鎖ポリペプチドである。幾つかの実施態様において、抗D因子抗体重鎖は、配列番号49のアミノ酸配列を含み、抗D因子抗体軽鎖は、配列番号48のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。
本発明は更に、本明細書中に記載の任意の方法によって生成される抗D因子抗体又は抗D因子抗体断片を提供し、抗D因子抗体又は抗D因子抗体断片は、ノルロイシン誤取り込みを含まない。
幾つかの実施態様において、本発明は、微生物宿主細胞内で抗MET抗体又は抗MET抗体断片を生成するための方法であって、抗MET抗体又は抗MET抗体断片がノルロイシン誤取り込みを含まない方法を提供し、方法は抗MET抗体又は抗MET抗体断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含み、細菌宿主細胞は、変異metA対立遺伝子、変異metK対立遺伝子、又は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、それによってノルロイシン誤取り込みを含まない抗MET抗体又は抗MET抗体断片を生成する。幾つかの実施態様において、方法は、抗MET抗体重鎖ポリペプチド又は抗MET抗体断片の重鎖ポリペプチド又はその断片をコードする核酸、及び抗MET抗体軽鎖ポリペプチド又は抗MET抗体断片の軽鎖ポリペプチド又はその断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含む。幾つかの態様において、抗MET抗体重鎖及び抗MET抗体軽鎖は、完全長重鎖及び軽鎖抗MET抗体ポリペプチドである。他の態様において、抗MET抗体重鎖は、抗体Fab断片重鎖ポリペプチドであり、抗MET抗体軽鎖は、抗体Fab断片軽鎖ポリペプチドである。幾つかの実施態様において、抗MET抗体重鎖は、配列番号51のアミノ酸配列を含み、抗MET抗体重鎖断片は、配列番号52のアミノ酸配列を含み、及び抗MET抗体軽鎖は、配列番号50のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様において、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。
本発明は更に、本明細書中に記載の任意の方法によって生成される抗MET抗体又は抗MET抗体断片を提供し、抗MET抗体又は抗MET抗体断片は、ノルロイシン誤取り込みを含まない。
様々な態様において、本発明によって提供される核酸配列の何れか一以上を含む変異微生物は細菌であり;他の態様では、微生物は大腸菌である。本発明は、異種性(例えば、組換え)ポリペプチド及び異種性(例えば、組換え)タンパク質の生成のための、本明細書に記載の変異微生物の使用を具体的に提供し、ここで異種性ポリペプチド及び異種性タンパク質へのノルロイシン誤取り込みは減少され、実質的に減少され、実質的に解消され又は防止される。
発明の詳細な説明
本発明は、とりわけ、細菌における組換えタンパク質の産生の間にタンパク質及びポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する方法及び組成物を提供する。本発明はまた、本発明の方法において使用のための微生物宿主細胞及び核酸分子を提供する。
本発明は、とりわけ、細菌における組換えタンパク質の産生の間にタンパク質及びポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する方法及び組成物を提供する。本発明はまた、本発明の方法において使用のための微生物宿主細胞及び核酸分子を提供する。
一般的な方法
本発明の実行は、特に明記しない限り、周知であり当業者に利用可能である細胞生物学の従来の技術、細胞培養、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、生化学、及び免疫学を用いるであろう。そのような技術は、Molecular Cloning: A laboratory Manual, third edition (Sambrook et al., 2001) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (P. Herdewijn, ed., 2004); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991);及びShort Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)などの文献に記載されている。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現は、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、及び第5,840,523号に記載されている(また、大腸菌における抗体断片の発現を記述している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003)、頁245−254も参照)。
本発明の実行は、特に明記しない限り、周知であり当業者に利用可能である細胞生物学の従来の技術、細胞培養、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、生化学、及び免疫学を用いるであろう。そのような技術は、Molecular Cloning: A laboratory Manual, third edition (Sambrook et al., 2001) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (P. Herdewijn, ed., 2004); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991);及びShort Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)などの文献に記載されている。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現は、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、及び第5,840,523号に記載されている(また、大腸菌における抗体断片の発現を記述している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003)、頁245−254も参照)。
別に定義しない限り、一般的に、本発明が属する当業者によって理解されるように、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は同じ意味を持つ。
定義
用語「異種タンパク質」又は「異種ポリペプチド」は、天然に合成されないか又は目的の細胞若しくは生物(例えば、微生物)によって生成されないタンパク質又はポリペプチドを指す。例えば、大腸菌細胞は、ヒトタンパク質又はヒトポリペプチドを生成することができ、そのように生成されるヒトタンパク質又はヒトポリペプチドは、異種タンパク質又は異種ポリペプチドである。本発明の文脈において特に興味深いのは、メチオニンを含むそれらの異種タンパク質又は異種ポリペプチドである。本明細書で用いられる異種タンパク質又は異種ポリペプチドはまた、組換えタンパク質又は組換えポリペプチドを指す。
用語「異種タンパク質」又は「異種ポリペプチド」は、天然に合成されないか又は目的の細胞若しくは生物(例えば、微生物)によって生成されないタンパク質又はポリペプチドを指す。例えば、大腸菌細胞は、ヒトタンパク質又はヒトポリペプチドを生成することができ、そのように生成されるヒトタンパク質又はヒトポリペプチドは、異種タンパク質又は異種ポリペプチドである。本発明の文脈において特に興味深いのは、メチオニンを含むそれらの異種タンパク質又は異種ポリペプチドである。本明細書で用いられる異種タンパク質又は異種ポリペプチドはまた、組換えタンパク質又は組換えポリペプチドを指す。
用語「ノルロイシン誤取り込み」は、メチオニン残基がタンパク質又はポリペプチドをコードする対応する核酸によってコードされるタンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン残基の取り込みを指す。
用語「変異対立遺伝子」又は「変異型対立遺伝子」とは、野生型対立遺伝子の(すなわち、目的の細胞又は微生物内で自然に見出されるような)核酸配列とは異なるか又は改変されている核酸配列を有する対立遺伝子を指す。
用語「変異微生物」又は「変異型微生物」は、一以上の変異対立遺伝子又は変異型対立遺伝子を含む微生物を指す。
本明細書で用いる「実質的に減少した」又は「実質的に異なる」という句は、当業者が、2つの値の間の差異が、その値(例えばタンパク質又はポリペプチド中のノルロイシンの含量)によって測定される生物学的特性という文脈の中で、統計学的に有意であると考慮するであろうほどに、2つの数値(一般には、一つは分子に関連するもの、他方は参照/比較分子に関連するもの)の間の十分に高度な違いを指す。
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
「単離されたmetA核酸分子」又は「単離されたmetK核酸分子」は、MetA又はMetKをそれぞれコードする一以上の核酸分子を指し、単一ベクター又は別々のベクター中のそのような核酸分子及び宿主細胞中の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。「単離されたmetA核酸分子」又は「単離されたmetK核酸分子」はまた、変異metA対立遺伝子又は変異metK対立遺伝子を指す。
「ノルロイシン誤取り込みの無いタンパク質又はポリペプチド」なる句は、検出可能なレベルのノルロイシン残基を含まないタンパク質又はポリペプチドを指す。
本明細書で使用される単数形の「a」、「an」、及び「the」は、特に指示がない限り、複数の言及が含まれる。
本明細書において「約」の値又はパラメーターへの言及は、この技術分野における当業者に容易に知られるそれぞれの値についての通常の誤差範囲を指す。本明細書において「約」の値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体を対象にする態様を含む(及び記載する)。例えば、「約X」に言及する記述は「X」の記述が含まれる。
ノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させる方法
本発明は、とりわけ細菌における組換えタンパク質の産生の間にタンパク質及びポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるために有用な方法及び組成物に関する。
本発明は、とりわけ細菌における組換えタンパク質の産生の間にタンパク質及びポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるために有用な方法及び組成物に関する。
大腸菌における組換えタンパク質生成の間の、メチオニン残基の代わりにノルロイシン残基の誤取り込みは以前に記載されている。ノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるために現在使用される一つのアプローチは、発酵プロセスの間における培地へのメチオニンの持続的又はボーラス供給によるものである。この戦略はノルロイシン誤取り込みを減少させることにおいて有効であるが、幾つかの操作上の不都合は、発酵プロセスの間のメチオニンの持続的若しくはボーラス供給又は添加することに関連している。例えば、培養物への持続的又はボーラス供給は、発酵プロセスの操作上の複雑さと全体的なコストを増加させる。加えて、メチオニンの供給は、低い細胞密度及び恐らくは低い生成物収率をもたらす発酵培地の望ましくない希釈につながる。
これらの不都合を克服するために、本発明者らは、異種タンパク質又はポリペプチドの生成におけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるために持続的又はボーラスメチオニン供給の代替を提供している。特に、本発明は、高い宿主細胞密度で行われる組換えタンパク質の生成を含む、組換えタンパク質生成の間に、ノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成するように操作された微生物(例えば、大腸菌)宿主細胞を提供する。
大規模なメチオニン生成に有用な大腸菌宿主細胞の変異体は、以前に報告されている。(例えば、Chattopadhyay et al., (1991) J Gen Microbiol 137:685-691; Nakamori et al., (1999) Appl Microbiol Biotechnol 52:179-185; Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234;国際特許出願公開番号WO2005/111202 2005;及び米国特許出願公開番号US2009/0298135を参照)。これらの変異大腸菌株の多くは、メチオニン生合成の調節に関連する3つの遺伝子:metJ、metA、及びmetKに変異を含んでいた。
大腸菌におけるメチオニン生合成の転写調節は、酵素のMetJ(metJ遺伝子産物)を含む。MetJは、そのコリプレッサーのSアデノシルメチオニン(SAM)に結合した場合、メチオニンレギュロンにおける遺伝子の転写を抑制し、従って、細胞におけるメチオニンのレベルを調節する転写リプレッサーである。(例えば、Marincs (2006) et al., Biochem J 396:227-234を参照)。以前に報告されたように、大腸菌の化学的突然変異誘発と続くエチオニン(毒性メチオニン類似体)に対する増殖に関する選択は、メチオニン生合成酵素の抑制解除とメチオニン生成の増加をもたらす、MetJのアミノ酸位置54(S54N)でセリンのアスパラギンへの変異の単離へと導いた。(Nakamori et al., (1999) Appl Microbiol Biotechnol 52:179-185を参照)。metJ遺伝子の完全な破壊はまた、メチオニン生合成経路及びメチオニン過剰産生に関与する酵素の抑制解除をもたらした。(Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234を参照)。
大腸菌におけるメチオニン生合成はまた、メチオニン生合成の最初のステップに関与する酵素であるホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ(metA遺伝子産物)のフィードバック阻害により(メチオニンとSAMにより)調節される。(例えば、Born and Blanchard (1999) Biochemistry 38:14416-14423を参照)。メチオニン生合成の調節解除につながる大腸菌でのフィードバック耐性MetA(metAの遺伝子産物)変異体は、毒性メチオニン類似体であるαメチルメチオニンに対する増殖に関して選択することにより以前に単離されていた。(Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234;及び国際特許出願公開番号WO2005/111202を参照)。
metK遺伝子は、メチオニンをS−アデノシルメチオニンに変換する酵素S−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする。(Markham et al., (1980) J Biol Chem 255:9082-9092を参照)。低レベルのSAM、よってメチオニン生合成酵素の抑制解除を生じるMetK変異体の部分的な機能喪失は(SAMはMetJのコリプレッサーである)、毒性メチオニン類似体、ノルロイシン及びエチオニンに対する増殖に関して選択することにより以前に単離されている。(Chattopadhyay et al., (1991) Gen Microbiol 137:685-691; Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234;及び国際特許出願公開番号WO2005/111202を参照)。
本発明において、野生型metA遺伝子において特定の核酸残基が変異され、MetAの以下のアミノ酸置換をもたらす(図7A及び野生型MetAアミノ酸配列に対する配列番号29を参照):アミノ酸位置27でのアルギニンのシステインへの置換(R27C);アミノ酸位置64でのグルタミンのグルタミン酸への置換(Q64E);アミノ酸位置294でのチロシンのシステインへの置換(Y294C);アミノ酸位置296でのイソロイシンのセリンへの置換(I296S);及びアミノ酸位置298でのプロリンのロイシンへの置換(P298L)。これらのMetAアミノ酸置換の一以上を含む大腸菌宿主細胞は、発現された異種タンパク質におけるノルロイシン誤取り込みの防止をもたらすのに十分な程度又は量にメチオニンを生成した。
幾つかの実施態様において、本発明は、(野生型MetAアミノ酸配列;図7及び配列番号29と比較して)MetAにおけるアミノ酸置換、R27C、Q64E、Y294C、I296S、及びP298Lをコードする様々な変異metA対立遺伝子を提供する。このような変異metA対立遺伝子は、フィードバック耐性のMetA酵素をもたらした。変異metA対立遺伝子は、対立遺伝子交換法を用いて大腸菌宿主細胞(60E4)に導入され(下記の材料と方法を参照)、変異大腸菌宿主細胞株66H6(60E4 metA(R27C))、66H8(60E4 metA(Y294C))、67B8(60E4 metA(Q64E))、及び67B9(60E4 metA(I296S P298L))を得た。得られた変異大腸菌宿主細胞は、持続的メチオニン供給無しで実行された組換えタンパク質の生成中のノルロイシン誤取り込みについて評価された。(以下の実施例4を参照)。
MetAにおけるアミノ酸位置に対する全ての参照は、配列番号29及び配列番号31に対応する図7A及び7Bに示す大腸菌のmetA遺伝子によってコードされるホモセリンスクシニルトランスフェラーゼに基づいている。アミノ酸位置への参照は、アミノ酸位置番号1として数える最初のアミノ酸のメチオニンにより行われる。他の生物由来のホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ酵素における対応する領域の相対的な位置は、例えば、単純な配列アラインメントによって、当業者によって同定することができる。
本発明では、野生型metK遺伝子において核酸が変異され、MetKにおいてアミノ酸位置185におけるバリンのグルタミン酸へのアミノ酸置換をもたらす。(野生型MetKアミノ酸配列については図8A及び配列番号30を参照)。加えて、metK遺伝子中のシトシン塩基位置1132で特定の核酸が欠失されていた(c1132del)。これらの変異metK対立遺伝子の一以上を含む大腸菌宿主細胞は、発現された異種タンパク質におけるノルロイシン誤取り込みの防止をもたらすのに十分な程度又は量にメチオニンを生成した。
幾つかの実施態様において、本発明はまた、metK対立遺伝子において、アミノ酸置換V185E又は位置1132におけるシトシン塩基の欠失をコードする種々な変異metK対立遺伝子を提供する。このような変異metK対立遺伝子は、MetK酵素の部分的な機能喪失をもたらす。変異metK対立遺伝子は、対立遺伝子交換法(下記の材料と方法を参照)を用いて様々な大腸菌宿主細胞に導入され(66H8;60E4 metA(Y294C)、上記参照)、それぞれ大腸菌宿主細胞株67C2(66H8 metK(V185E))及び67C3(66H8 metK(c1132del))を得た。得られた変異大腸菌宿主細胞は、持続的メチオニン供給無しで実行された組換えタンパク質の生成中のノルロイシン誤取り込みについて評価された。(以下の実施例4を参照)。
MetKにおけるアミノ酸位置に対する全ての参照は、配列番号30及び配列番号32に対応する図8A及び8Bに示す大腸菌のmetA遺伝子によってコードされるS−アデノシルメチオニン合成酵素に基づいている。アミノ酸位置への参照は、アミノ酸位置番号1として数える最初のアミノ酸のメチオニンにより行われる。他の生物由来のSアデノシルメチオニン合成酵素における対応する領域の相対的な位置は、例えば、単純な配列アラインメントによって、当業者によって同定することができる。
metA及びmetKの核酸分子
一例として、本発明は、野生型metA及びmetKの核酸配列とは異なるmetA及びmetKの核酸配列を含む単離された核酸分子を使用する。本発明によって提供されるmetA及びmetKの核酸配列は、野生型metAによってコードされるもの(システインで置換されたアミノ酸位置27のアルギニン(R27C);グルタミン酸で置換されたアミノ酸位置64のグルタミン(Q64E);システインで置換されたアミノ酸位置294のチロシン(Y294C);セリンで置換されたアミノ酸位置296のイソロイシン(I296S);ロイシンで置換されたアミノ酸位置298のプロリン(P298L);セリンで置換されたアミノ酸位置296のイソロイシン(I296S);ロイシンで置換されたアミノ酸位置298のプロリン(P298L));及び野生型metKによってコードされるもの(グルタミン酸で置換されたアミノ酸位置185のバリン(V185E)及び位置1132でシトシン塩基の欠失を含む核酸配列(cdel1132del))への種々のアミノ酸置換をコードする。これらのアミノ酸置換をもたらす、metA対立遺伝子又はmetK対立遺伝子をコードする任意の核酸配列の使用が、本発明の方法における使用のために本明細書中で具体的に意図される。
一例として、本発明は、野生型metA及びmetKの核酸配列とは異なるmetA及びmetKの核酸配列を含む単離された核酸分子を使用する。本発明によって提供されるmetA及びmetKの核酸配列は、野生型metAによってコードされるもの(システインで置換されたアミノ酸位置27のアルギニン(R27C);グルタミン酸で置換されたアミノ酸位置64のグルタミン(Q64E);システインで置換されたアミノ酸位置294のチロシン(Y294C);セリンで置換されたアミノ酸位置296のイソロイシン(I296S);ロイシンで置換されたアミノ酸位置298のプロリン(P298L);セリンで置換されたアミノ酸位置296のイソロイシン(I296S);ロイシンで置換されたアミノ酸位置298のプロリン(P298L));及び野生型metKによってコードされるもの(グルタミン酸で置換されたアミノ酸位置185のバリン(V185E)及び位置1132でシトシン塩基の欠失を含む核酸配列(cdel1132del))への種々のアミノ酸置換をコードする。これらのアミノ酸置換をもたらす、metA対立遺伝子又はmetK対立遺伝子をコードする任意の核酸配列の使用が、本発明の方法における使用のために本明細書中で具体的に意図される。
本発明はまた、様々な改変されたMetA酵素をコードする(即ち、様々な変異ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードする)単離されたmetA核酸分子を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は単離された核酸分子を提供し、ここで核酸分子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25、及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含む。
本発明はまた、様々な改変されたMetK酵素をコードする(即ち、様々な変異S−アデノシルメチオニン酵素をコードする)単離されたmetK核酸分子を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は単離された核酸分子を提供し、ここで核酸分子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。
また、本発明は、一例として、変異metA対立遺伝子と、MetAにおいて以下のアミノ酸置換:システインで置換されたアミノ酸位置27のアルギニン(R27C);グルタミン酸で置換されたアミノ酸位置64のグルタミン(Q64E);システインで置換されたアミノ酸位置294のチロシン(Y294C);セリンで置換されたアミノ酸位置296のイソロイシン(I296S);ロイシンで置換されたアミノ酸位置298のプロリン(P298L);セリンで置換されたアミノ酸位置296のイソロイシン(I296S);ロイシンで置換されたアミノ酸位置298のプロリン(P298L)をコードする核酸配列を含む対応する単離された核酸分子との種々の組合せを提供する。幾つかの態様において、本発明によって提供される変異metA対立遺伝子は、フィードバック耐性(即ち、フィードバック非感受性)MetA酵素を生じる。アミノ酸の位置は、図7A及び配列番号29に示されるように野生型MetAアミノ酸配列を参照する。
また、本発明によって提供されるのは、一例として、変異metK対立遺伝子と、metKにおいて次のアミノ酸置換:アミノ酸位置185のバリンのグルタミン酸による置換(V185E)をコードする核酸配列を含む対応する単離された核酸分子との様々な組み合わせである。本発明はまた、metK対立遺伝子の位置1132におけるシトシン塩基の欠失を含む核酸配列(c1132del)を提供する。幾つかの態様において、本発明によって提供される変異metK対立遺伝子は、MetK酵素の部分的な機能喪失をもたらす。アミノ酸の位置は、図8A及び配列番号30に示されるように野生型MetKアミノ酸配列を参照する。
本発明の方法で使用するための微生物
例として本明細書中に記載されるように、大腸菌宿主細胞は、高い宿主細胞密度で行われる組換えタンパク質の生成を含む、組換えタンパク質生成の間に、ノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する細菌として操作された。従って、本明細書で提供されるいくつかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させるのに十分な程度又は量に(例えば、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させるのに十分な程度又は量に、又は異種タンパク質又は異種ポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させるのに十分な程度又は量に)メチオニンを生成する、変異微生物菌株(即ち、変異微生物宿主細胞)を提供する。
例として本明細書中に記載されるように、大腸菌宿主細胞は、高い宿主細胞密度で行われる組換えタンパク質の生成を含む、組換えタンパク質生成の間に、ノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する細菌として操作された。従って、本明細書で提供されるいくつかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させるのに十分な程度又は量に(例えば、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させるのに十分な程度又は量に、又は異種タンパク質又は異種ポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させるのに十分な程度又は量に)メチオニンを生成する、変異微生物菌株(即ち、変異微生物宿主細胞)を提供する。
本明細書で提供される方法における使用に適した開始の大腸菌宿主細胞としては、例えば、(限定されるものではないが)大腸菌W3110、大腸菌294、大腸菌X1776などが含まれる。大腸菌宿主細胞のこれらの例は限定ではなく例示である。大腸菌株W3110は、組換えDNA産物発酵のための一般的な宿主株である。上述した大腸菌宿主細胞株の何れかの変異大腸菌宿主細胞は、その後、本明細書に記載される変異したmetA及び/又はmetK対立遺伝子を含むように更に改変される出発宿主細胞として用いることができる。
本発明は、種々の変異対立遺伝子、及び組換えタンパク質生成におけるmetA及びmetKの変異対立遺伝子の組み合わせを含む大腸菌宿主細胞の使用は、発現された組換えタンパク質へのノルロイシン誤取り込みを防止するのに有効であったことを示している。(以下の実施例4を参照)。
本発明は、微生物を提供し、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する。幾つかの態様において、本発明は、微生物を提供し、微生物は、フィードバック耐性又はフィードバック非感受性ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの微生物である。幾つかの実施態様において、本発明は、変異metA対立遺伝子を含む微生物を提供する。他の実施態様において、本発明は、変異metA対立遺伝子を含む微生物を提供し、変異metA対立遺伝子は、MetAにおけるR27Cアミノ酸置換、MetAにおけるQ64Eアミノ酸置換、MetAにおけるY294Cアミノ酸置換、MetAにおけるI296Sアミノ酸置換、又はMetAにおけるP298Lアミノ酸置換をコードする。幾つかの実施態様において、本発明は、例えば、MetAにおけるI296Sアミノ酸置換及びP298Lアミノ酸置換をコードする変異metA対立遺伝子を含む、上述される一以上のアミノ酸置換をコードする変異metA対立遺伝子を含む微生物を提供する。様々な態様において、本発明によって提供される核酸配列の何れか一以上を含む微生物は細菌であり;他の態様では、微生物は大腸菌である。本発明は、異種性(例えば、組換え)ポリペプチド及び異種性(例えば、組換え)タンパク質の生成のための、本明細書に記載の微生物の使用を具体的に提供し、ここで異種性ポリペプチド及び異種性タンパク質へのノルロイシン誤取り込みは減少され又は防止される。
上述したように、本発明は、一以上の変異metA対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、MetAにおいてR27Cアミノ酸置換をコードする、MetAにおいてQ64Eアミノ酸置換をコードする、MetAにおいてY294Cアミノ酸置換をコードする、又はMetAにおいてI296Sアミノ酸置換及びP298Lアミノ酸置換をコードする変異metA対立遺伝子は、それぞれ、配列番号23(R27C)、配列番号26(Q64E)、配列番号24(Y294C)、又は配列番号25(I296S及びP298L)を含む核酸配列によりコードされる。他の実施態様において、本発明により提供される微生物は、配列番号23(R27C)、配列番号26(Q64E)、配列番号24(Y294C)、又は配列番号25(I296S及びP298L)を含む核酸配列によりコードされる。様々な態様において、本発明によって提供される核酸配列の何れか一以上を含む微生物は細菌であり;他の態様では、微生物は大腸菌である。本発明は、異種性(例えば、組換え)ポリペプチド及び異種性(例えば、組換え)タンパク質の生成のための、本明細書に記載の微生物の使用を具体的に提供し、ここで異種性ポリペプチド及び異種性タンパク質へのノルロイシン誤取り込みは減少され又は防止される。
上記のように、本発明は、微生物により発現される、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法を提供し、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する微生物である。幾つかの態様において、本発明は、微生物を提供し、微生物は、メチオニン生成について抑制解除された微生物である。幾つかの実施態様において、本発明は、変異metK対立遺伝子を含む微生物を提供する。他の実施態様において、本発明は、変異metK対立遺伝子が、MetKにおけるV185E酸置換をコードする、変異metK対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、変異metK対立遺伝子を含む微生物を提供し、変異metK対立遺伝子は、metK対立遺伝子の核酸残基1132にて核酸シトシンの欠失を含む。様々な態様において、本発明によって提供される核酸配列の何れか一以上を含む微生物は細菌であり;他の態様では微生物は大腸菌である。本発明は、異種性(例えば、組換え)ポリペプチド及び異種性(例えば、組換え)タンパク質の生成のための、本明細書に記載の微生物の使用を具体的に提供し、ここで異種性ポリペプチド及び異種性タンパク質へのノルロイシン誤取り込みは減少され又は防止される。
上述したように、本発明は、一以上の変異metK対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、MetKにおけるV185E酸置換をコードする又はmetK対立遺伝子において核酸残基1132にて核酸シトシンの欠失を含む変異metK対立遺伝子は、配列番号27を含む核酸配列(V185E)又は配列番号28を含む核酸配列(c1132del)をそれぞれ含む核酸配列によりコードされる。他の実施態様において、本発明により提供される微生物は、配列番号27(V185E)又は配列番号28(c1132del)を含む核酸配列によりコードされる。様々な態様において、本発明によって提供される核酸配列の何れか一以上を含む微生物は細菌であり;他の態様では、微生物は大腸菌である。本発明は、異種性(例えば、組換え)ポリペプチド及び異種性(例えば、組換え)タンパク質の生成のための、本明細書に記載の任意の微生物の使用を具体的に提供し、ここで異種性ポリペプチド及び異種性タンパク質へのノルロイシン誤取り込みは減少され又は防止される。
本明細書に記載されるアミノ酸置換をもたらす、metA又はmetK対立遺伝子をコードする任意の核酸配列の使用が、本発明の方法における使用のために本明細書中で具体的に意図される。
他の実施態様において、本発明は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明により提供される微生物は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む微生物であり、変異metA対立遺伝子は、MetAにおけるY294Cアミノ酸置換をコードし、変異metK対立遺伝子はMetKにおけるV185Eアミノ酸置換をコードする。幾つかの実施態様において、本発明により提供される微生物は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む微生物であり、変異metA対立遺伝子は、MetAにおけるY294Cアミノ酸置換をコードし、変異metK対立遺伝子は、metK対立遺伝子の核酸残基1132で核酸シトシンの欠失を含む。様々な態様において、本発明によって提供される核酸配列の何れか一以上を含む微生物は細菌であり;他の態様では微生物は大腸菌である。本発明は、異種性(例えば、組換え)ポリペプチド及び異種性(例えば、組換え)タンパク質の生成のための、本明細書に記載の任意の微生物の使用を具体的に提供し、ここで異種性ポリペプチド及び異種性タンパク質へのノルロイシン誤取り込みは減少され又は防止される。
微生物株の生成
本発明は微生物(例えば、微生物宿主細胞)を生成するための方法を提供し、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する。一例として、当技術分野で公知であり、先に説明したような対立遺伝子交換方法を使用して変異metA対立遺伝子及び/又は変異metK対立遺伝子を含む大腸菌宿主細胞が作成された。(Metcalf et al., (1994) Gene 138:1-7; and Bass et al., (1996) J Bacteriol 178: 1154-61を参照;本明細書の材料及び方法の項を参照.。)本発明は、それによって変異metA対立遺伝子及び変異体metK対立遺伝子を含む大腸菌宿主細胞が産生される手段に限定されるものではない。変異対立遺伝子を導入するため又は別の方法で変異対立遺伝子を含む微生物株(例えば、細菌、大腸菌)を生成するための様々な方法は当業者に周知である。
本発明は微生物(例えば、微生物宿主細胞)を生成するための方法を提供し、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する。一例として、当技術分野で公知であり、先に説明したような対立遺伝子交換方法を使用して変異metA対立遺伝子及び/又は変異metK対立遺伝子を含む大腸菌宿主細胞が作成された。(Metcalf et al., (1994) Gene 138:1-7; and Bass et al., (1996) J Bacteriol 178: 1154-61を参照;本明細書の材料及び方法の項を参照.。)本発明は、それによって変異metA対立遺伝子及び変異体metK対立遺伝子を含む大腸菌宿主細胞が産生される手段に限定されるものではない。変異対立遺伝子を導入するため又は別の方法で変異対立遺伝子を含む微生物株(例えば、細菌、大腸菌)を生成するための様々な方法は当業者に周知である。
ノルロイシン誤取り込みの防止又は低減
本発明の方法及び組成物は、異種又は組換えタンパク質若しくはポリペプチドの生成に適用することができ、大小両方の規模のタンパク質又はポリペプチドの生成に使用することができる。本発明の方法及び組成物は、組換えタンパク質及びポリペプチドの生成のために、微生物、例えば、大腸菌宿主細胞の高密度発酵のために特に有用である。本発明によって提供される方法及び組成物は、組換えタンパク質及びポリペプチドの組換え生成のために、特に、例えば、種々な研究及び治療用途における使用のための組換えタンパク質及びポリペプチドにおいて、ノルロイシン誤取り込みが所望されない、タンパク質及びポリペプチドの組換え生成のために有用である。
本発明の方法及び組成物は、異種又は組換えタンパク質若しくはポリペプチドの生成に適用することができ、大小両方の規模のタンパク質又はポリペプチドの生成に使用することができる。本発明の方法及び組成物は、組換えタンパク質及びポリペプチドの生成のために、微生物、例えば、大腸菌宿主細胞の高密度発酵のために特に有用である。本発明によって提供される方法及び組成物は、組換えタンパク質及びポリペプチドの組換え生成のために、特に、例えば、種々な研究及び治療用途における使用のための組換えタンパク質及びポリペプチドにおいて、ノルロイシン誤取り込みが所望されない、タンパク質及びポリペプチドの組換え生成のために有用である。
幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物においてタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物はフィードバック耐性又はフィードバック非感受性ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの微生物である。他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、メチオニン生成について抑制解除された(de-repressed)微生物である。幾つかの実施態様において、フィードバック耐性又はフィードバック非感受性ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの微生物は、変異metA対立遺伝子を含む微生物である。幾つかの実施態様において、メチオニン生成について抑制解除された微生物は、変異metK対立遺伝子を含む微生物である。他の実施態様において、ノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させることに使用のための微生物は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む。
幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metA対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号26、及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metA対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は、MetAをコードする核酸配列を含み、核酸配列はR27C、Q64E、Y294C、I296S、及びP298Lからなる群から選択されるMetAにおけるアミノ酸置換をコードする。他の実施態様において、核酸配列は、I296S及びP298Lの両方からなるMetAにおけるアミノ酸置換をコードする。アミノ酸の位置は、図7A及び配列番号29に示されるように野生型MetAアミノ酸配列を参照する。
幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物においてタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metK対立遺伝子を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物においてタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metK対立遺伝子を含み、変異metK対立遺伝子は、MetKをコードする核酸配列を含み、核酸配列はMetKにおけるアミノ酸置換V185Eをコードする。他の実施態様において、核酸配列は、MetK対立遺伝子における核酸残基位置1132でシトシン塩基の欠失を含む。アミノ酸の位置は、図8A及び配列番号30に示されるように野生型MetKアミノ酸配列を参照する。
幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、更に、変異metA対立遺伝子は配列番号24の核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は配列番号27の核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は配列番号24の核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子は配列番号28の核酸配列を含む。
幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子はMetAにおけるアミノ酸置換Y294Cをコードする核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子はMetKにおけるアミノ酸置換V185Eをコードする核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子はMetAにおけるアミノ酸置換Y294Cをコードする核酸配列を含み、変異metK対立遺伝子はmetK対立遺伝子における核酸残基位置1132でシトシン塩基の欠失を含む核酸配列を含む。アミノ酸の位置は、図7A及び配列番号29に示されるように野生型MetAアミノ酸配列を参照し、図8A及び配列番号30に示されるように野生型MetKアミノ酸配列を参照する。
本明細書において提供される微生物によるタンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法の幾つかの態様において、微生物は細菌、特に大腸菌である。他の態様において、タンパク質又はポリペプチドは異種タンパク質若しくは異種ポリペプチド、又は組換えタンパク質若しくは組換えポリペプチドである。例えば、微生物は、微生物に対して異種性であるタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸を含むことができ;例えば、微生物は、微生物に対して異種性であるタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸(例えば、組換え発現ベクターの使用による場合の、DNA(例えば、cDNA又はゲノムDNA)とすることができる)で形質転換される。他の態様において、本方法は、タンパク質又はポリペプチドを発現するために適した条件下で微生物を培養することを更に含む。幾つかの実施態様において、微生物は、培地が低濃度のメチオニンを含有する培地中で増殖される。タンパク質又はポリペプチドは、次いで、回収され、精製することができ;その回収は、例えば、微生物のペリプラズム又は培地からのものであってもよい。幾つかの態様において、培養は、例えば、高細胞密度発酵の条件下での培養など、発酵槽内で行われる。
異種タンパク質又はポリペプチドをコードする異種核酸は、適切なプロモーターの制御下で、微生物中での発現のために複製可能なベクター中へ適切に挿入される。多くのベクターが、この目的のために利用可能であり、適切なベクターの選別は、例えば、ベクターに挿入される核酸の大きさ、又はそのベクターで形質転換される特定の微生物宿主細胞に依存するであろう。適切なベクターは、当業者に周知である。
本発明によって提供される方法及び組成物は、例えば、種々な治療、医療、研究、及び診断用途における使用のための組換えタンパク質及びポリペプチドにおいて、ノルロイシン誤取り込みが所望されない、組換えタンパク質及びポリペプチドの生成のために特に有用である。例えば、本発明の方法及び組成物は、例えば、医療及び薬学的用途のためのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体など、治療用抗体の組換え生成のために適用される。医療及び薬学的用途のためのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の例としては、限定されないが、抗VEGF抗体、抗D因子抗体、抗肝細胞増殖因子受容体抗体(例えば、抗MET抗体)等を含む。
本発明の方法及び組成物はまた、抗体断片の生成のために有用である。抗体断片の例としては、限定されないが、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2;ダイアボディ;直鎖状抗体;単鎖抗体分子(例えばscFv);及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。本方法、組成物及び微生物によって提供されるような組換え抗体の生成は、上述される微生物(例えば、細菌宿主細胞、大腸菌)内における、抗体の重鎖ポリペプチドをコードする核酸の発現及び抗体軽鎖ポリペプチドをコードする核酸の発現によって行うことができる。幾つかの態様において、抗体重鎖及び抗体軽鎖は、完全長重鎖及び軽鎖抗体ポリペプチドである。他の態様において、抗体重鎖は、抗体Fab断片重鎖であり、抗体軽鎖は、抗体Fab断片軽鎖である。
本発明の方法及び組成物はまた、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体の生成のために有用である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。典型的な多重特異性抗体は、タンパク質の2つの異なるエピトープに結合し得るか、又は2つの異なるタンパク質の2つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製することができる。多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983));国際出願公開番号WO93/08829号;Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照)及び「ノブ・イン・ホール(knob-in-hole)」エンジニアリング(例えば、米国特許第5,731,168号を参照)を含む。
更に、本発明の方法及び組成物は、治療及び研究用途のための他の生体分子、例えば、ヒト成長ホルモン(ソマトロピン)、インスリン等の生成に有用である。
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
材料と方法
細菌株、プラスミド及び増殖条件
本明細書に記載される実施例において使用される細菌株は、大腸菌株W3110の誘導体である。(Bachmann (1972) Bacteriol Rev 36:525-557を参照)。抗生物質の選択は、以下の濃度:カルベニシリン(プラスミド又は染色体)、50μg/ml;カナマイシン(染色体)、30μg/ml;テトラサイクリン(プラスミド又は染色体)、10μg/mlで全てのマーカーにおいて維持された。
細菌株、プラスミド及び増殖条件
本明細書に記載される実施例において使用される細菌株は、大腸菌株W3110の誘導体である。(Bachmann (1972) Bacteriol Rev 36:525-557を参照)。抗生物質の選択は、以下の濃度:カルベニシリン(プラスミド又は染色体)、50μg/ml;カナマイシン(染色体)、30μg/ml;テトラサイクリン(プラスミド又は染色体)、10μg/mlで全てのマーカーにおいて維持された。
菌株及びプラスミドの構築
プラスミド及び細菌株(即ち、大腸菌)の構築に用いたオリゴヌクレオチドは以下の表1に記載される。標準的な技術が、クローニング、DNA分析、PCR増幅、形質転換、電気穿孔、及びP1形質導入のために使用された。染色体対立遺伝子は、P1形質導入によって移動された。metJ::KanR対立遺伝子は、大腸菌遺伝子ストックセンター(CGSC、エール大学)から入手した細菌株JW3909−1から由来した。全ての対立遺伝子の置換は、PCR分析によって確認した。
プラスミド及び細菌株(即ち、大腸菌)の構築に用いたオリゴヌクレオチドは以下の表1に記載される。標準的な技術が、クローニング、DNA分析、PCR増幅、形質転換、電気穿孔、及びP1形質導入のために使用された。染色体対立遺伝子は、P1形質導入によって移動された。metJ::KanR対立遺伝子は、大腸菌遺伝子ストックセンター(CGSC、エール大学)から入手した細菌株JW3909−1から由来した。全ての対立遺伝子の置換は、PCR分析によって確認した。
metA遺伝子は、プライマーのSacI−metAflank−F及びSalI−metAflank−Rを用いて細菌株W3110(Bachmann (1972) Bacteriol Rev 36:525-557)からPCR増幅され、SacI及びSalIにより消化され、SacI及びSalIで消化されたプラスミドpS1080に連結され、プラスミドpS1080−metAflankを得た。プラスミドpS1080−metAflank(R27C)、pS1080−metAflank(Q64E)、pS1080−metAflank(Y294C)、及びpS1080−metAflank(I296SP298L)は、QuikChangeキット(Stratagene)及び以下のプライマーの組:(QC−metAR27C−F;QC−metAR27C−R)、(QC−metAQ64E−F;QC−metAQ64E−R)、(QC−metAY294C−F;QC−metAY294C−R)及び(QC−metAI296SP298L−F;QC−metAI296SP298L−R)をそれぞれ使用してpS1080−metAflankを変異誘発することによって構築された。
metK遺伝子は、プライマーのSacI−metKflank−F及びSalI−metKflank−Rを用いて細菌株W3110からPCR増幅され、SacI及びSalIにより消化され、そしてSacI及びSalIで消化されたプラスミドpS1080に連結され、プラスミドpS1080−metKflankを得た。プラスミドpS1080−metKflank(V185E)及びpS1080−metKflank(c1132del)はQuikChangeキット(Stratagene)及び以下のプライマーの組:(QC−metKV185E−F;QC−metKV185E−R)、及び(QC−metKc1132del−F;QC−metKc1132del−R)をそれぞれ使用して、プラスミドpS1080−metKflankを変異誘発することによって構築された。
対立遺伝子交換は、前述の方法を用いて行われた。(Metcalf et al., (1994) Gene 138:1-7;及びBass et al., (1996) J Bacteriol 178: 1154-61を参照)。
上述したように、Metcalfら(上掲)により記載され、Bassら(上掲)により改変されたプロトコールを使用して行われた。共組換え体は、60E4宿主細胞バックグラウンド又は66H8宿主細胞バックグラウンドへ移された。スクロース対抗選択に続いて、スクロース耐性コロニーは、LB寒天プレート及びカルベニシリンを含有するLB寒天プレート上において複製画線することによりカルベニシリン感受性についてスクリーニングされた。続いて、カルベニシリン感受性のコロニーを単離し、対立遺伝子交換は、metA又はmetKリーディングフレーム全体のPCR増幅と続くDNA配列決定により確認された。自滅プラスミドベクターpS1080は、コンディショナルR6Kγ起点及びカルベニシリン耐性選択可能マーカー、並びにスクロース感受性を付与する対抗選択可能sacB遺伝子を含む。
本明細書に記載の実験で使用される細菌株及びプラスミドは以下の表2に記載される。
発酵
大腸菌宿主株60E4は、抗VEGF抗体抗原結合(Fab)断片の軽鎖及び重鎖(それぞれ配列番号33及び配列番号34)をコードするポリ核酸を含むpBR322に基づく発現プラスミドで形質転換した。(国際出願公開番号WO1998/45331;国際出願公開番号WO2002/40697(抗VEGF抗体Y0317の発酵を記述する実施例2);及びChen et al., (1999) J Mol Biol 293:865-881、抗VEGF抗体Y0317を参照。これらの各々は参照によりその全体が本明細書に援用される)。
大腸菌宿主株60E4は、抗VEGF抗体抗原結合(Fab)断片の軽鎖及び重鎖(それぞれ配列番号33及び配列番号34)をコードするポリ核酸を含むpBR322に基づく発現プラスミドで形質転換した。(国際出願公開番号WO1998/45331;国際出願公開番号WO2002/40697(抗VEGF抗体Y0317の発酵を記述する実施例2);及びChen et al., (1999) J Mol Biol 293:865-881、抗VEGF抗体Y0317を参照。これらの各々は参照によりその全体が本明細書に援用される)。
大腸菌宿主株60E4は、抗D因子抗体抗原結合(Fab)断片の軽鎖及び重鎖(それぞれ配列番号48及び配列番号49に対応する)をコードするポリ核酸を含む発現プラスミドで形質転換した。(国際出願公開番号WO2009/134711の抗D因子抗体番号238−1及び国際出願公開番号WO2008/055206の抗D因子抗体番号111を参照、それらの各々は参照によりその全体が本明細書に援用される)。
大腸菌宿主株64B4は、抗MET抗体の軽鎖、重鎖及び重鎖断片(それぞれ配列番号50、配列番号51及び配列番号52に対応する)をコードするポリ核酸を含む発現プラスミドで形質転換した。
組換え重鎖及び軽鎖Fab断片ポリペプチドの発現は、培地中の無機リン酸の枯渇時に生じる誘導によるphoAプロモーターにより制御された。(Laird et al., (2005) Protein Expr Purif 39:237-246を参照)。重鎖及び軽鎖Fab断片ポリペプチドは、STIIシグナル配列による、生成物が構築される大腸菌ペリプラズムへの移出に対して向けられた。前述のように、10Lの作業容量(WV)で高細胞密度発酵が実施された。(Simmons et al., (2002) J Immunol Methods 263:133-147を参照)。約200OD550の細胞密度で、持続的な3%メチオニン又は水の供給が開始され、発酵プロセスの残りの部分にわたり供給された。
三つの異なる発酵プロセスは、宿主細胞60E4(発酵プロセスのAF1)、宿主細胞66F8(発酵プロセスのAF2)、及び宿主細胞64B4(発酵プロセスAF3)を用いて検討された。(実施例5及び下記の表4を参照)
精製
発酵が完了した後、全細胞ブロスを発酵槽中で<15℃に冷却し、冷却されたブロスはタンパク質精製用に処理された。冷却ブロスの1容量を硫酸マグネシウムの0.06容量と混合し(60mMの最終濃度)、クエン酸(1M)でpH3.8に滴定した。次いで、細胞を約12,000psiでマイクロフルイダイザーを用いて破壊し(Microfluidics, Redwood Shores, CA)、破壊された細胞は、連続的に振盪しながら3時間35℃でインキュベートした。ホモジネートを冷精製水で3倍に希釈し、希釈したホモジネートを20分間4℃で固定角ローターを用いて6,000×gで遠心分離した。上清を0.22μmのフィルターを用いて濾過し、1.5Mトリス塩基によりpH7.5に滴定した。
発酵が完了した後、全細胞ブロスを発酵槽中で<15℃に冷却し、冷却されたブロスはタンパク質精製用に処理された。冷却ブロスの1容量を硫酸マグネシウムの0.06容量と混合し(60mMの最終濃度)、クエン酸(1M)でpH3.8に滴定した。次いで、細胞を約12,000psiでマイクロフルイダイザーを用いて破壊し(Microfluidics, Redwood Shores, CA)、破壊された細胞は、連続的に振盪しながら3時間35℃でインキュベートした。ホモジネートを冷精製水で3倍に希釈し、希釈したホモジネートを20分間4℃で固定角ローターを用いて6,000×gで遠心分離した。上清を0.22μmのフィルターを用いて濾過し、1.5Mトリス塩基によりpH7.5に滴定した。
組換えFabタンパク質は、以下のように、プロテインGアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。ポリプレップクロマトグラフィーカラム(Bio Rad)を、プロテインGセファロース4ファストフロー樹脂(GE Healthcare)で充填し、PBSの少なくとも5カラム体積、pH7.2で平衡化した。濾過した上清は、プロテインGを充填したカラムにロードし、PBSで2回洗浄し、50mMのクエン酸で溶出した。最終のFabタンパク質プールは1.5Mトリス塩基でpH7に滴定され、下記のようにノルロイシン含有量について分析された。これは、発酵プロセスのAF1のための精製に対応する。
発酵プロセスAF1(宿主細胞60E4用)、AF2(宿主細胞66F8用)、又はAF3(宿主細胞64B4用)に各々特異的である、三つの異なる組換えタンパク質生成物の精製プロセスが使用された。(実施例7及び下記の表6を参照)。
アミノ酸分析
細胞内のメチオニンレベルを決定するために、87.6×109細胞を含む全細胞ブロスサンプルを、4℃で5分間、17000×gでペレット化し、PBSで1回洗浄し、その後、抽出緩衝液(10mMのトリス、5mMのEDTA、5mMのヨードアセトアミド(IAM)、0.2mg/mlリゾチーム、pH6.8)に再懸濁した。次いで、細胞は2サイクルの超音波処理によって溶解され、次いで、細胞破片を除去するために、13,500rpmで20分間遠心分離した。上清を0.2μmマイクロ遠心チューブフィルター(Bio Rad)に移し、4℃で5分間、17000×gで遠心分離した。濾液を希釈し、アミノ酸は前述のように分析した(Feeney et al., (2013) Biotechnology and Bioengineering, 110:1087-1097)。細胞外のメチオニンレベルを決定するために、14,000×rpmで3分間遠心分離後に、発酵中に収集された全細胞ブロスから調製された上清サンプルは、希釈され、下記のようにアミノ酸分析された。(Feeney et al., (2013) Biotechnology and Bioengineering, 110:1087-1097を参照)。
細胞内のメチオニンレベルを決定するために、87.6×109細胞を含む全細胞ブロスサンプルを、4℃で5分間、17000×gでペレット化し、PBSで1回洗浄し、その後、抽出緩衝液(10mMのトリス、5mMのEDTA、5mMのヨードアセトアミド(IAM)、0.2mg/mlリゾチーム、pH6.8)に再懸濁した。次いで、細胞は2サイクルの超音波処理によって溶解され、次いで、細胞破片を除去するために、13,500rpmで20分間遠心分離した。上清を0.2μmマイクロ遠心チューブフィルター(Bio Rad)に移し、4℃で5分間、17000×gで遠心分離した。濾液を希釈し、アミノ酸は前述のように分析した(Feeney et al., (2013) Biotechnology and Bioengineering, 110:1087-1097)。細胞外のメチオニンレベルを決定するために、14,000×rpmで3分間遠心分離後に、発酵中に収集された全細胞ブロスから調製された上清サンプルは、希釈され、下記のようにアミノ酸分析された。(Feeney et al., (2013) Biotechnology and Bioengineering, 110:1087-1097を参照)。
アミノ酸濃度は、逆相HPLC法を用いて分析された。アミノ酸を含有するサンプルは、6−アミノキノリル−N−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートで処理し、非常に蛍光性の誘導体を生成した。(Cohen and Michaud (1993) Anal Biochem 211:279-287を参照。)使用したHPLCアッセイは0.01mMの検出限界で以下のアミノ酸を検出した:ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、アルギニン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、プロリン、オルニチン、システイン、リジン、チロシン、メチオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン及びトリプトファン。
リン酸レベル
リン酸レベルは、以前に公開された方法に従ってCOBASインテグラ400(Roche Diagnostics)を用いて測定した。(Taussky and Shorr (1953) J Biol Chem 202:675-685を参照)。
リン酸レベルは、以前に公開された方法に従ってCOBASインテグラ400(Roche Diagnostics)を用いて測定した。(Taussky and Shorr (1953) J Biol Chem 202:675-685を参照)。
力価測定
全細胞ブロスサンプルは、抽出緩衝液(10mMのトリス、5mMのEDTA、5mMのIAM、0.2mg/mlリゾチーム、pH6.8)で6倍に希釈し、氷上で10分間インキュベートした。2ラウンドの超音波処理の後、サンプルは4℃で20分間17000×gで遠心分離した。生成物の力価はHPLCを使用して上清から決定した。
全細胞ブロスサンプルは、抽出緩衝液(10mMのトリス、5mMのEDTA、5mMのIAM、0.2mg/mlリゾチーム、pH6.8)で6倍に希釈し、氷上で10分間インキュベートした。2ラウンドの超音波処理の後、サンプルは4℃で20分間17000×gで遠心分離した。生成物の力価はHPLCを使用して上清から決定した。
積分されたOD550の測定
積分されたOD550は、以下の式を用いた台形積分を使用して決定された:
ここで
j=培養時間の24時間の時点又はその後に行われた最初の測定のインデックス;行われたOD550測定の総数;ti=測定iにおける経過培養時間;OD550i=測定iにおけるOD550。
積分されたOD550は、以下の式を用いた台形積分を使用して決定された:
ここで
j=培養時間の24時間の時点又はその後に行われた最初の測定のインデックス;行われたOD550測定の総数;ti=測定iにおける経過培養時間;OD550i=測定iにおけるOD550。
ノルロイシン分析
ノルロイシン含有量の分析のために、精製された組換えタンパク質サンプルは、以前に記載された方法に基づいて、トリプシン消化に供された。(Yu et al., (2009) Anal Chem 81:9282-9290を参照)。ペプチドマップの分析は、前述のように、逆相HPLC及びオンライン液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC/MS)を用いて行った。(Yu et al., (2009) Anal Chem 81:9282-9290;及びYu et al., (2011) Anal Chem 83:5912-5919を参照。)高分解能質量決定は、m/z 400で60000に設定された分解能を持つ完全MSサーベイスキャン、続いて目的のイオンのイオントラップMS2スキャンを用いてLTQ−オービトラップXL機器(Thermo Scientific, San Jose, US)により行った。ポリペプチド内のノルロイシンの相対レベルを決定するために、抽出されたイオンクロマトグラムは、モノアイソトピックm/zが±10ppmの抽出ウインドウによる最も豊富な荷電状態を使用してメチオニン含有ペプチド及びノルロイシン含有ペプチドの双方に対して生成された。メチオニン含有種に対するノルロイシン含有種の相対量は、それぞれ積分されたピーク面積を用いて計算した。
ノルロイシン含有量の分析のために、精製された組換えタンパク質サンプルは、以前に記載された方法に基づいて、トリプシン消化に供された。(Yu et al., (2009) Anal Chem 81:9282-9290を参照)。ペプチドマップの分析は、前述のように、逆相HPLC及びオンライン液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC/MS)を用いて行った。(Yu et al., (2009) Anal Chem 81:9282-9290;及びYu et al., (2011) Anal Chem 83:5912-5919を参照。)高分解能質量決定は、m/z 400で60000に設定された分解能を持つ完全MSサーベイスキャン、続いて目的のイオンのイオントラップMS2スキャンを用いてLTQ−オービトラップXL機器(Thermo Scientific, San Jose, US)により行った。ポリペプチド内のノルロイシンの相対レベルを決定するために、抽出されたイオンクロマトグラムは、モノアイソトピックm/zが±10ppmの抽出ウインドウによる最も豊富な荷電状態を使用してメチオニン含有ペプチド及びノルロイシン含有ペプチドの双方に対して生成された。メチオニン含有種に対するノルロイシン含有種の相対量は、それぞれ積分されたピーク面積を用いて計算した。
ウェスタンブロット
発酵中に得られた全細胞ブロスサンプルは、抽出緩衝液(10mMのトリス、5mMのEDTA、5mMのIAM、0.2mg/mlのリゾチーム、pH6.8)で6倍に希釈し、氷上で10分間インキュベートした。2ラウンドの超音波処理の後、サンプルは4℃で25分間17000×gで遠心分離した。サンプルは、非還元条件下で4〜12%のトリス−グリシンゲル上にロードした。タンパク質はiBlotブロッティングシステム(Invitrogen)を用いてニトロセルロース膜に移した。膜をNET緩衝液(150mMのNaCl、5mMのEDTA、50mMのトリス、0.05%トリトンX−100)中の0.5%ゼラチンで30分間ブロックし、ブロッキング緩衝液中のヒトIgGのFab(MP Biomedical)に対して1:300,000希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギIgG画分中でインキュベートした。NET緩衝液で3回洗浄した後、ブロットを、5秒の曝露後にウェスタンライトニングECL基質(PerkinElmer)を用いてX線フィルム上で可視化した。
発酵中に得られた全細胞ブロスサンプルは、抽出緩衝液(10mMのトリス、5mMのEDTA、5mMのIAM、0.2mg/mlのリゾチーム、pH6.8)で6倍に希釈し、氷上で10分間インキュベートした。2ラウンドの超音波処理の後、サンプルは4℃で25分間17000×gで遠心分離した。サンプルは、非還元条件下で4〜12%のトリス−グリシンゲル上にロードした。タンパク質はiBlotブロッティングシステム(Invitrogen)を用いてニトロセルロース膜に移した。膜をNET緩衝液(150mMのNaCl、5mMのEDTA、50mMのトリス、0.05%トリトンX−100)中の0.5%ゼラチンで30分間ブロックし、ブロッキング緩衝液中のヒトIgGのFab(MP Biomedical)に対して1:300,000希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギIgG画分中でインキュベートした。NET緩衝液で3回洗浄した後、ブロットを、5秒の曝露後にウェスタンライトニングECL基質(PerkinElmer)を用いてX線フィルム上で可視化した。
実施例1.大腸菌発酵中のノルロイシン誤取り込み
上述したように、ノルロイシン誤取り込みは、多くの場合、大腸菌における組換えタンパク質生成の間に生じる。組換えタンパク質生成中のノルロイシン誤取り込みの程度は、例えば、組換えタンパク質の性質、使用した発酵プロセス、及び発酵培地の内容物など幾つかの要因に依存する。(例えば、Bogosian et al., (1989) Biol Chem 264:531-539を参照)。
上述したように、ノルロイシン誤取り込みは、多くの場合、大腸菌における組換えタンパク質生成の間に生じる。組換えタンパク質生成中のノルロイシン誤取り込みの程度は、例えば、組換えタンパク質の性質、使用した発酵プロセス、及び発酵培地の内容物など幾つかの要因に依存する。(例えば、Bogosian et al., (1989) Biol Chem 264:531-539を参照)。
組換えタンパク質発現の発酵プロセスにおけるノルロイシン誤取り込みを調べるために、以下の研究を実施した。大腸菌宿主株60E4は、Fab抗体断片の軽鎖及び重鎖をコードする核酸配列(それぞれ配列番号31及び配列番号32)を含むプラスミドで形質転換し、上記の方法に従って、水供給又はメチオニン供給を用いた以下の発酵研究に使用した。次いで、発現された組換えタンパク質を、上記の方法を用いて、ノルロイシン含量について分析した。
以下の表3に示されるように、連続的メチオニン供給が無い場合(即ち、水供給)、大腸菌宿主細胞60E4で発現された組換えポリペプチドのそれぞれで、約5〜10%のノルロイシン誤取り込みが観察された。予想されるように、連続的なメチオニン供給のもとで、ノルロイシンは、発現された組換えポリペプチドの何れにおいても検出されなかった(ND)。
これらの結果は、ノルロイシン誤取り込みが、メチオニン供給の非存在下で細菌において組換えタンパク質生成で発生したことを確認した。
実施例2.メチオニン生合成経路の変異大腸菌宿主細胞の構築
上述のように、組換えタンパク質発酵の最中のメチオニンの連続的供給は、多くの場合、ノルロイシン誤取り込みを防止するために使用される。上記実施例1に示されるように、連続的なメチオニンの供給は、十分なメチオニンが宿主細胞のために利用可能であり、従って組換えタンパク質生成の間のノルロイシンの誤取り込みを防止することができることを確実にした。連続的メチオニン供給を用いる代わりに、変異metA及び/又はmetK対立遺伝子を含む大腸菌宿主細胞を使用することの、ノルロイシン誤取り込みに与える影響を調べるために、以下の研究を行った。
上述のように、組換えタンパク質発酵の最中のメチオニンの連続的供給は、多くの場合、ノルロイシン誤取り込みを防止するために使用される。上記実施例1に示されるように、連続的なメチオニンの供給は、十分なメチオニンが宿主細胞のために利用可能であり、従って組換えタンパク質生成の間のノルロイシンの誤取り込みを防止することができることを確実にした。連続的メチオニン供給を用いる代わりに、変異metA及び/又はmetK対立遺伝子を含む大腸菌宿主細胞を使用することの、ノルロイシン誤取り込みに与える影響を調べるために、以下の研究を行った。
本研究では、フィードバック耐性metAをもたらす変異R27C、Q64E、Y294C、I296S、及びP298Lを含むmetA対立遺伝子が対立遺伝子交換法を用いて60E4宿主細胞に導入され(上記の材料および方法を参照)、それぞれ、細菌宿主細胞株66H6(60E4 metA(R27C))、66H8(60E4 metA(Y294C))、67B8(60E4 metA(Q64E))及び67B9(60E4 metA(I296S P298L))を得た(上記の表2及び3を参照)。
MetK酵素の部分的機能喪失をもたらす、変異V185E及びc1132del(metK遺伝子内の位置1132におけるシトシン塩基の欠失)を含むmetK対立遺伝子が、対立遺伝子交換法を用いて、66H8(60E4 metA(Y294C))宿主細胞へ導入され(上記の材料及び方法を参照)、それぞれ細菌宿主細胞株67C2(66H8 metK(V185E))及び67C3(66H8 metK(c1132del))を得た。(上記の表2及び表3を参照)。
これらの大腸菌宿主細胞は、持続的メチオニン供給無しで実行された培養プロセスにおける組換えタンパク質の生成中のノルロイシン誤取り込みについて評価された。(以下の実施例3を参照)。
実施例3.発酵の結果
連続的メチオニン供給の無い小規模な発酵(10L)が、本研究で構築したメチオニン生合成経路の変異細菌株を利用して実行された。(表1を参照)。水の供給又は全く供給無しのどちらかと置き換えられたメチオニンの供給が、これらの実験において、発酵プロセスの間に使用された。対照宿主細胞株60E4を使用して、3つの10L発酵が以下のように実施された:1)連続的メチオニン供給、2)連続的水供給及び3)全く供給無し。
連続的メチオニン供給の無い小規模な発酵(10L)が、本研究で構築したメチオニン生合成経路の変異細菌株を利用して実行された。(表1を参照)。水の供給又は全く供給無しのどちらかと置き換えられたメチオニンの供給が、これらの実験において、発酵プロセスの間に使用された。対照宿主細胞株60E4を使用して、3つの10L発酵が以下のように実施された:1)連続的メチオニン供給、2)連続的水供給及び3)全く供給無し。
OD550でモニターされる細胞増殖の発酵傾向が図12Aに示される。供給物の性質(メチオニン、水、又は全く供給無し)に関わらず、メチオニン生合成経路変異細菌宿主細胞60E4 metA(R27C)、60E4 metA(Y294C)、60E4 metA(Y294C)metK(V185E)、及び60E4 metA(Y294C)metK(c1132del)の増殖は、発酵増殖期の間(5〜28時間)に対照宿主細胞で観察されたものと同等であった。しかし、二重変異宿主細胞の60E4 metA(Y294C)metK(V185E)、及び60E4 metA(Y294C)metK(c1132del)は、対照宿主細胞発酵で観察されるものと比較してより低いiOD550(24時間から発酵の終了時までの増殖曲線下の面積)を有していた。(図12Bを参照)。宿主細胞60E4及び60E4 metA(Y294C)を使用して水の供給と共に実行された発酵は、メチオニン供給と共に実行された対照宿主細胞発酵及び全く供給無しで実行された60E4 metA(Y294C)宿主細胞において観察されたものと比較して若干高いiOD550を有していた。変異細胞60E4 ΔmetJ::kanR及び60E4 metA(I296S P298L)は長い適応期を持っており、その結果、対照宿主細胞発酵で観察されたものに比べて低いiOD550を有していた。(図12A及び12Bを参照)。変異体宿主細胞の60E4 metA(Q64E)は、発酵槽では増殖は不十分であり、最大OD550は150に達し、それは他の変異宿主細胞を用いた発酵において観測された最大OD550と比較して約30−40%低い。(図12Aを参照)。20時間後、変異宿主細胞60E4 metA(Q64E)の増殖はが飽和状態に達し、その結果、この変異宿主細胞を用いた発酵は、最低のiOD550を有していた。(図12A及び12Bを参照)。
発酵中のメチオニンの供給の有無は、60E4宿主細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。(図12Cを参照)。
メチオニン生合成経路の変異体を用いた発酵は、対照宿主細胞発酵で観察されるものと比較して、インビボ(即ち、細胞内)及び細胞外培地の両方で、より高いレベルのメチオニンを蓄積した。(図13A、13B、14A、及び14Bを参照)。発酵プロセスの開始時には、発酵培地中に過剰のメチオニン(>3mM)がある。細胞が成長し始めると、それらは、タンパク質合成、メチル供与体の役割とその他の機能のためにメチオニンを取り込む。結果として、細胞が成長し続けるにつれて細胞外のメチオニン濃度が徐々に低下し、そして細胞外メチオニンレベルは約16時間で検出可能なレベル未満(<10μM)に達する。(図13A及び14Aを参照)。
16時間で、異なる宿主間で細胞内のメチオニン濃度は0.5−2.5mM(濃度は、細胞の容量に基づく)で変化する。(図13B及び14Bを参照)。このような高い細胞内メチオニン濃度では、野生型MetAは強く抑制されることになるが;しかし、フィードバック耐性MetA変異体は弱く阻害されるだけであり、従って、変異宿主細胞が生合成経路を介してメチオニンを生成することを可能とする。(Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234を参照)。しかし、細胞内のメチオニンレベルは、約28時間まで減少し続け、その時点では、細胞の増殖はかなり速度を落としていた。発酵の細菌の増殖期(5−28時間)の間に、メチオニンがタンパク質合成及び他の細胞機能のために利用される割合は、メチオニンが生体内で合成される割合を超え得ることが可能である。このことは、増殖期の終了までの細胞内のメチオニンレベルの緩やかな減少を説明することができる。
発酵の組換えタンパク質の生成期の間(発酵の終了時までの28時間)メチオニン過剰産生宿主細胞は、インビボでメチオニンを合成し続け、細胞内のメチオニンレベルは、発酵プロセスのこの段階の間に増加し続けた。(図13B及び14Bを参照)。これらの結果は、発酵の組換えタンパク質生成期の間に、メチオニン生合成の割合は、メチオニンが種々の細胞内機能のために利用される割合を超えたことを示唆している。
連続的な水の供給と共に行われた宿主細胞の発酵の間に、細胞外及び細胞内のメチオニンレベルは減少し続け、細胞外メチオニンについては約16時間で、細胞内のメチオニンについては約24時間でアッセイの検出限界未満のレベル(10μM)に到達した。連続的メチオニン供給と共に行われる対照宿主発酵の場合、その供給は、供給が開始される時点で、約26時間後に細胞中に過剰のメチオニンが存在することを保証している。発酵の生成期の間に、二重変異宿主細胞60E4 metA(Y294C)metK(V185E)は、連続的メチオニン供給と共に行われる宿主細胞発酵で観察されるものと比較して、より多くの細胞内メチオニンを蓄積した。
対照宿主細胞内で観察されたものと比較して、宿主細胞60E4 metA(I296S P298L)及び60E4 ΔmetJ::kanRの長い適応期並びに宿主細胞60E4 metA(Q64E)の成長不良は、潜在的にはホメチオニン生合成経路における毒性中間体である、高レベルのホモシステインに起因する可能性がある。(Roe et al., (2002) Microbiology 148:2215-2222を参照;図12Aを参照)。ホモシステインは、イソロイシン生合成経路の最初のステップに関与する酵素である、スレオニンデアミナーゼを阻害し、成長阻害を引き起こすことが以前に実証されている。(Tuite et al., (2005) J Bacteriol 187:4362-4371を参照)。これは、変異宿主細胞において細胞内イソロイシンレベルを測定することにより調べられた。分析は、細胞内のイソロイシンのレベルは、発酵中に対照宿主細胞において観察されたものとは同等であることを示した(データ非表示)。細胞増殖に対する他の毒性作用を有するホモシステインの可能性を完全に除外することはできない。この時、しかし、変異体間の増殖におけるこれらの違いは、完全には理解されていない。
タンパク質生成物の力価の時間経過及びウェスタンブロットデータは、図16A、図16B、及び図17に示される。宿主細胞60E4 metA(Q64E)から植菌された発酵は、他の宿主細胞において観察されるものより少ない生成物を生成した。45〜50時間の間の短時間を除いて、リン酸レベルは、60E4 metA(Q64E)宿主の発酵の間に枯渇することは無く(図15);従って、組換えタンパク質の合成は少なかった。変異宿主細胞60E4 metA(I296S P298L)及び60E4 ΔmetJ::kanRの拡張した適応期は、通常観察されるよりも約12時間遅い40時間後にリン酸の欠乏をもたらし;従って、これらの宿主細胞を用いた発酵は、以前のリン酸を枯渇した他の変異宿主細胞において観察されたものと比較してより低いタンパク質生成物の力価を有していた。(図12A、図15及び図16Aを参照)。宿主細胞60E4 metA(R27C)及び60E4 metA(Y294C)を用いた発酵は、試験した全ての変異宿主細胞の中で最も高いタンパク質生成物の力価を生じた。
metA metK二重変異宿主細胞の60E4 metA(Y294C)metK(V185E)及び60E4 metA(Y294C)metK(c1132del)を用いた発酵は、対照宿主細胞に対して同等の増殖を有するにもかかわらず、やや低いタンパク質生成物の力価を生じた。これらの二重変異宿主細胞は、MetKの部分的機能喪失をもたらすmetK遺伝子に変異を有している。metKの生成物は、細菌細胞中で多くの反応についてメチル供与体である、s−アデノシルメチオニン(SAM)である。しかしながら、なぜはSAMのレベルの減少がタンパク質生成物の力価に影響を与えるのか知られていない。発酵プロセスの最中の連続的供給は、恐らくより低い細胞密度及び恐らくより低い生成物力価をもたらし得る培地の希釈をもたらし得るであろう。いかなる供給も無い宿主細胞60E4 metA(Y294C)の発酵の増殖及び力価は、同じ宿主細胞を使用して連続的な水の供給と共に行われる発酵において観察されたものに匹敵した。
実施例4.ノルロイシン誤取り込み
上述したように、細胞内のメチオニンのレベルに起因するタンパク質中のノルロイシン誤取り込みは十分低いので、タンパク質合成中のメチオニルtRNAの荷電において、ノルロイシンはメチオニン残基を競合することができる。実施例1に示すように、メチオニン供給無しで実行された対照宿主細胞の発酵は、組換えタンパク質において高レベルのノルロイシン誤取り込みをもたらした。メチオニン供給無しで実行された対照宿主細胞の発酵の生成期の間の低い細胞内メチオニンのレベルは、ノルロイシン残基は、組換えタンパク質中のメチオニン残基を競合することができることを示していた。しかしながら、細胞外及び細胞内の高レベルのメチオニンが、変異宿主細胞の発酵の生成期の間に観察された。(図13B及び14Bを参照)。細胞内のメチオニンレベルの上昇の結果として、ノルロイシン誤取り込みは、そのような宿主細胞の発酵を使用して最小限になるか又は排除することが期待される。
上述したように、細胞内のメチオニンのレベルに起因するタンパク質中のノルロイシン誤取り込みは十分低いので、タンパク質合成中のメチオニルtRNAの荷電において、ノルロイシンはメチオニン残基を競合することができる。実施例1に示すように、メチオニン供給無しで実行された対照宿主細胞の発酵は、組換えタンパク質において高レベルのノルロイシン誤取り込みをもたらした。メチオニン供給無しで実行された対照宿主細胞の発酵の生成期の間の低い細胞内メチオニンのレベルは、ノルロイシン残基は、組換えタンパク質中のメチオニン残基を競合することができることを示していた。しかしながら、細胞外及び細胞内の高レベルのメチオニンが、変異宿主細胞の発酵の生成期の間に観察された。(図13B及び14Bを参照)。細胞内のメチオニンレベルの上昇の結果として、ノルロイシン誤取り込みは、そのような宿主細胞の発酵を使用して最小限になるか又は排除することが期待される。
組換えタンパク質のトリプシン消化は2つのメチオニン含有ペプチド:ペプチド1:LSCAASGYDFTHYGM34NWVR(配列番号35);及びペプチド2:STAYLQM83NSLR(配列番号36)を得た。ペプチドマップの分析では、変異宿主細胞の発酵から精製された組換えタンパク質のプールは、検出可能なレベル未満のノルロイシン誤取り込みを含んでいたが、一方、メチオニン供給無しで実行された宿主細胞発酵は、メチオニンを含む両方のペプチドにおいて、高レベルのノルロイシンを蓄積することを示していた。(表3を参照)。これらの結果は、本発明の大腸菌宿主細胞株の使用は、異種(例えば、組換え)ポリペプチドへのノルロイシンの取り込みの低減又は防止をもたらすことを示した。
実施例5.更なる細菌宿主細胞
宿主細胞60E4又は宿主細胞60E4に由来する宿主細胞を用いて行われた実験に加えて、二つの他の細菌宿主細胞が開発され、以下のように、増殖、ノルロイシン誤取り込み、及び組換えタンパク質の生成について調べられた。
宿主細胞60E4又は宿主細胞60E4に由来する宿主細胞を用いて行われた実験に加えて、二つの他の細菌宿主細胞が開発され、以下のように、増殖、ノルロイシン誤取り込み、及び組換えタンパク質の生成について調べられた。
細菌宿主細胞66F8及び64B4(並びに細菌宿主細胞60E4)が表2に説明される。表2に示すように、宿主細胞66F8及び64B4(類似の遺伝子型を共有する)と比較して、宿主細胞60E4の遺伝子型にはいくつかの違いがある。
三つの異なる発酵プロセスは、宿主細胞60E4(発酵プロセスのAF1)、宿主細胞66F8(発酵プロセスのAF2)、及び宿主細胞64B4(発酵プロセスAF3)を用いて検討された。以下の表4は、検討された発酵プロセス(AF1、AF2、およびAF3)の各々の種々の発酵パラメーター(pH、攪拌、培養時間、及び供給開始時間)の違いを示す。
metA(Y294C)対立遺伝子は、宿主細胞60E4について実施例1で上述したような方法を使用して宿主細胞66F8及び64B4に導入された。発酵プロセスAF2及びAF3をそれぞれ用いて、66F8 metA(Y294C)及び64B4 metA(Y294C)を用いて行った発酵は、それらの親宿主細胞で観察されたものに匹敵する、宿主細胞の増殖を示した。(図19A及び19B;及び以下の表5を参照)
実施例6.大腸菌宿主細胞の増殖速度及び組換えタンパク質生成物の収率の比較
増殖速度及び組換えタンパク質生成物の収率は、発酵プロセスAF1、AF2、AF3をそれぞれ用いて、大腸菌宿主株60E4 metA(Y294C)、66F8 metA(Y294C)及び64B4 metA(Y294C)の各々で調べられた。各発酵プロセスについて上記表4に概説される発酵プロセスの改変を用いて、60E4株の宿主細胞について実施例3に上述したように、10Lの発酵が行われた。
増殖速度及び組換えタンパク質生成物の収率は、発酵プロセスAF1、AF2、AF3をそれぞれ用いて、大腸菌宿主株60E4 metA(Y294C)、66F8 metA(Y294C)及び64B4 metA(Y294C)の各々で調べられた。各発酵プロセスについて上記表4に概説される発酵プロセスの改変を用いて、60E4株の宿主細胞について実施例3に上述したように、10Lの発酵が行われた。
60E4株の様々な宿主細胞について観察された増殖速度と組換えタンパク質生成物の収率は、上記実施例3に詳細に説明される。
図20A、20B、及び20Cに示されるように、宿主株60E4 metA(Y294C)、66F8 metA(Y294C)及び64B4 metA(Y294C)を用いて得られた組換えタンパク質生成物の収率は、宿主株60E4、66F8及び64B4を用いて観察されたものに匹敵した。(以下の表5も参照)。メチオニン供給の有無は、60E4宿主細胞発酵から得られた組換えタンパク質の収率に影響を与えなかった。
実施例7.ノルロイシン誤取り込みの比較
発酵プロセスAF1(宿主細胞60E4用)、AF2(宿主細胞66F8用)、及びAF3(宿主細胞64B4用)に各々特異的である、三つの異なる組換えタンパク質生成物の精製プロセスが使用された。下の表6は、調べられた発酵プロセス(即ち、AF1は、AF2及びAF3)の各々において使用された種々の精製プロセスの違いを示す。
発酵プロセスAF1(宿主細胞60E4用)、AF2(宿主細胞66F8用)、及びAF3(宿主細胞64B4用)に各々特異的である、三つの異なる組換えタンパク質生成物の精製プロセスが使用された。下の表6は、調べられた発酵プロセス(即ち、AF1は、AF2及びAF3)の各々において使用された種々の精製プロセスの違いを示す。
ノルロイシンの定量化は、上述のように組換えタンパク質生成物の各々のトリプシンペプチドのLC−MS分析を用いて行われた。
60E4宿主によって生成された組換えタンパク質のトリプシン消化は、2つのメチオニン含有ペプチドを生じた(表7)。66F8宿主によって生成された組換えタンパク質のトリプシン消化は、3つのメチオニン含有ペプチドを生じた(表8)。64B4宿主によって生成された組換えタンパク質のトリプシン消化は、6つのメチオニン含有ペプチドを生じた(表9)。
60E4宿主を使用して、メチオニン供給無しで行われたAF1発酵プロセスから精製された組換えタンパク質は、タンパク質中の2つのメチオニン残基で5.1%及び10%ノルロイシンを蓄積した(表7)。宿主60E4 metA(Y294C)(表7)、60E4 metA(R27C)、60E4 metA(Y294C)metK(V185E)、及び60E4 metA(Y294C)metK(c1132del)を用いて、メチオニン供給無しで行われたAF1発酵から精製された組換えタンパク質においてノルロイシンは検出されなかった(データ非表示)。
60E4 metA(Y294C)宿主の発酵は、発酵培地中にノルロイシンを添加した場合には(0.15mMの最終濃度)、組換えタンパク質中でノルロイシンは観察されず、本発明の細菌宿主細胞は、組換えタンパク質の合成中にノルロイシン誤取り込みを防止するために細胞内に十分なメチオニンを作ることを示している。
約2.7%、0.7%、及び1%のノルロイシン誤取り込みが、66F8宿主を使用して、メチオニン供給無しで行われたAF2発酵プロセスを用いて生成された組換えタンパク質から得られた3つのメチオニン含有トリプシンペプチドで観察された。(表8を参照)。同様に、64B4宿主を使用してmet供給無しで行われたAF3プロセスを用いて生成された組換えタンパク質から得られた6つのメチオニン含有トリプシンペプチドにおいて、約1.3%、1.3%、2.4%、2.2%、1.5%、及び1.3%のノルロイシン誤取り込みが存在した。(表9を参照)。しかし、66F8 metA(Y294C)宿主及び64B4 metA(Y294C)宿主をそれぞれ使用した、AF2及びAF3発酵プロセスから精製された組換えタンパク質ではノルロイシンは検出されなかった。(上記の表8及び表9を参照)。
トリプシンペプチドマップの分析では、変異宿主細胞の発酵から精製された組換えタンパク質のプールは、検出可能なレベル未満のノルロイシン誤取り込みを含んでいたが、一方、メチオニン供給無しで実行された宿主細胞発酵は、メチオニン含有ペプチドにおいて、高レベルのノルロイシンを蓄積することを示していた。これらの結果は、本発明の大腸菌宿主細胞株の使用は、異種(例えば、組換え)ポリペプチドへのノルロイシンの取り込みの低減又は防止をもたらすことを示した。
前述の発明は、理解を明確にする目的のために、例示と実施例によりある程度詳細に記載してきたが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示内容は、参照によりその全体が援用される。
Claims (36)
- タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、該方法は微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含み、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する変異微生物である、方法。
- 微生物は、細菌である、請求項1に記載の方法。
- 微生物は、大腸菌である、請求項1に記載の方法。
- 微生物は、フィードバック耐性又はフィードバック非感受性ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの微生物である、請求項1に記載の方法。
- 微生物は、メチオニン生成について抑制解除される、請求項1に記載の方法。
- 微生物は、変異metA対立遺伝子、変異metK対立遺伝子、又は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む、請求項1に記載の方法。
- 微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることは、培地に外因的に添加されたメチオニンの非存在下で又はメチオニン供給無しで行われる、請求項1に記載の方法。
- 変異metA対立遺伝子、変異metK対立遺伝子、又は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含む微生物。
- 微生物は変異metA対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は、アミノ酸位置27でのアルギニンのシステインへの置換、アミノ酸位置64でのグルタミンのグルタミン酸への置換、アミノ酸位置294でのチロシンのシステインへの置換、アミノ酸位置296でのイソロイシンのセリンへの置換、アミノ酸位置298でのプロリンのロイシンへの置換、及びアミノ酸位置296でのイソロイシンのセリンへの置換及びアミノ酸位置298でのプロリンのロイシンへの置換からなる群から選択されるMetAにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む、請求項8に記載の微生物。
- 微生物は、変異metA対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25、及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項9に記載の微生物。
- 変異metK対立遺伝子は、アミノ酸位置185でのバリンのグルタミン酸への置換を含むMetKにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列、又はmetK対立遺伝子の核酸残基位置1132でのシトシン塩基の欠失を含む核酸配列を含む、請求項8に記載の微生物。
- 微生物は、変異metK対立遺伝子を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項11に記載の微生物。
- 微生物は、変異metA対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は、アミノ酸位置27でのアルギニンのシステインへの置換、アミノ酸位置64でのグルタミンのグルタミン酸への置換、アミノ酸位置294でのチロシンのシステインへの置換、アミノ酸位置296でのイソロイシンのセリンへの置換、アミノ酸位置298でのプロリンのロイシンへの置換、及びアミノ酸位置296でのイソロイシンのセリンへの置換及びアミノ酸位置298でのプロリンのロイシンへの置換からなる群から選択されるMetAにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含み、更に、変異metK対立遺伝子は、アミノ酸位置185でのバリンのグルタミン酸への置換を含むMetKにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列、又はmetK対立遺伝子の核酸残基位置1132でのシトシン塩基の欠失を含む核酸配列を含む、請求項8に記載の微生物。
- 微生物は、変異metA対立遺伝子を含み、変異metA対立遺伝子は、配列番号23、配列番号24、配列番号25及び配列番号26からなる群から選択される核酸配列を含み、更に、微生物は、変異metK対立遺伝子を含み、変異metK対立遺伝子は、配列番号27及び配列番号28からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項13に記載の微生物。
- 抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片をコードする核酸を更に含む、請求項8に記載の微生物。
- 抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片をコードする核酸は、配列番号46のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号47のアミノ酸配列をコードする核酸である、請求項15に記載の微生物。
- 抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片をコードする核酸は、配列番号33を含む核酸配列及び配列番号34を含む核酸配列からなる群から選択される、請求項15に記載の微生物。
- 抗D因子抗体又は抗D因子抗体断片をコードする核酸を更に含む、請求項8に記載の微生物。
- 抗D因子抗体又は抗D因子抗体断片をコードする核酸は、配列番号48のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号49のアミノ酸配列をコードする核酸である、請求項18に記載の微生物。
- 抗MET抗体又は抗MET抗体断片をコードする核酸を更に含む、請求項8に記載の微生物。
- 抗MET抗体又は抗MET抗体断片をコードする核酸は、配列番号50のアミノ酸配列をコードする核酸、配列番号51のアミノ酸配列をコードする核酸、及び配列番号52のアミノ酸配列をコードする核酸からなる群から選択される、請求項20に記載の微生物。
- 細菌宿主細胞内でタンパク質又はポリペプチドを生成するための方法であって、タンパク質又はポリペプチドはノルロイシン誤取り込みを含まず、方法は、タンパク質又はポリペプチドを発現するために適した培養条件下で、タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含み、細菌宿主細胞は、変異metA対立遺伝子、変異metK対立遺伝子、又は変異metA対立遺伝子及び変異metK対立遺伝子を含み、それによってノルロイシン誤取り込みを含まないタンパク質又はポリペプチドを生成する、方法。
- 細菌宿主細胞は、請求項9に記載の微生物、請求項10に記載の微生物、請求項11に記載の微生物、請求項12に記載の微生物、請求項13に記載の微生物、及び請求項14に記載の微生物からなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- タンパク質又はポリペプチドは抗体又は抗体断片である、請求項22に記載の方法。
- タンパク質又はポリペプチドは抗体又は抗体断片である、請求項23に記載の方法。
- 抗体又は抗体断片は抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片である、請求項24に記載の方法。
- 抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片をコードする核酸は、配列番号46のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号47のアミノ酸配列をコードする核酸である、請求項26に記載の方法。
- 抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片をコードする核酸は、配列番号33を含む核酸配列及び配列番号34を含む核酸配列からなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 抗体又は抗体断片は抗因子D抗体又は抗因子D抗体断片である、請求項24に記載の方法。
- 抗D因子抗体又は抗D因子抗体断片をコードする核酸は、配列番号48のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号49のアミノ酸配列をコードする核酸である、請求項29に記載の方法。
- 抗体又は抗体断片は抗MET抗体又は抗MET抗体断片である、請求項24に記載の方法。
- 抗MET抗体又は抗MET抗体断片をコードする核酸は、配列番号50のアミノ酸配列をコードする核酸、配列番号51のアミノ酸配列をコードする核酸、及び配列番号52のアミノ酸配列をコードする核酸からなる群から選択される、請求項31に記載の方法。
- 細菌宿主細胞中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることは、培地に外因的に添加されたメチオニンの非存在下で又はメチオニン供給無しで行われる、請求項22に記載の方法。
- 請求項26、請求項27、又は請求項28に記載の方法に従って生成される抗VEGF抗体又は抗VEGF抗体断片。
- 請求項29又は請求項30に記載の方法に従って生成される抗因子D抗体又は抗因子D抗体断片。
- 請求項31又は請求項32に記載の方法に従って生成される抗MET抗体又は抗MET抗体断片。
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Citations (7)
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JPH03502758A (ja) * | 1988-02-17 | 1991-06-27 | ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー | ポリペプチド類においてノルロイシン含有量を制御するための発酵培地および方法 |
JP2000139471A (ja) * | 1998-11-17 | 2000-05-23 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるl−メチオニンの製造法 |
JP2006516092A (ja) * | 2002-10-11 | 2006-06-22 | コンゾルテイウム フユール エレクトロケミツシエ インヅストリー ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング | フィードバック耐性のホモセリン−スクシニル転移酵素 |
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US20100322931A1 (en) * | 2009-06-17 | 2010-12-23 | Harding Fiona A | Anti-vegf antibodies and their uses |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPH03502758A (ja) * | 1988-02-17 | 1991-06-27 | ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー | ポリペプチド類においてノルロイシン含有量を制御するための発酵培地および方法 |
JP2000139471A (ja) * | 1998-11-17 | 2000-05-23 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるl−メチオニンの製造法 |
JP2006516092A (ja) * | 2002-10-11 | 2006-06-22 | コンゾルテイウム フユール エレクトロケミツシエ インヅストリー ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング | フィードバック耐性のホモセリン−スクシニル転移酵素 |
JP2007536921A (ja) * | 2004-05-12 | 2007-12-20 | メタボリック エクスプローラ | フィードバック感受性が変化した組み換え酵素 |
US20090269338A1 (en) * | 2008-04-28 | 2009-10-29 | Genentech, Inc. | Humanized anti-factor d antibodies and uses thereof |
US20100322931A1 (en) * | 2009-06-17 | 2010-12-23 | Harding Fiona A | Anti-vegf antibodies and their uses |
WO2011143665A1 (en) * | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Genentech, Inc. | Treatment methods |
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