ES2290504T3 - Homoserina - transsuccinilasas resistentes a la retroalimentacion. - Google Patents
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Abstract
Homoserina - transsucinilasa, que en comparación con una enzima homoserina - transsuccinilasa de tipo salvaje tiene por lo menos una mutación y manifiesta una sensibilidad reducida en comparación con la enzima de tipo salvaje, frente a L-metionina o SAM, poseyendo la enzima de tipo salvaje una secuencia de aminoácidos, que comprende una secuencia parcial AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro situada entre las posiciones 90 y 115 y una secuencia parcial TyrGlnXaaThrPro situada entre las posiciones 285 y 310, siendo la metionina inicial la posición 1 de la secuencia de aminoácidos, caracterizada porque la mutación es un intercambio de aminoácido del aspartato en la secuencia parcial AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro.
Description
Homoserina - transsuccinilasas resistentes a la
retroalimentación.
El presente invento se refiere a homoserina -
transsuccinilasas resistentes a la retroalimentación, a cepas de
microorganismos que contienen estas enzimas, así como a su
utilización para la preparación de L-metionina o
S-adenosil-metionina.
La metionina es un aminoácido esencial para los
seres humanos y para muchos animales. Ella se produce sobre todo
para el mercado de los piensos y se añade en forma de racemato al
pienso. La síntesis se efectúa por vía química a partir de
acroleína y metanotiol pasando por
3-(metiltio)-propionaldehído, que se transforma con
ácido cianhídrico, amoniaco y dióxido de carbono, pasando por una
hidantoína, en D,L-metionina. Una separación del
racemato se puede efectuar químicamente.
La
S-adenosil-metionina (SAM) es el más
importante donante de grupos metilo en el metabolismo y encuentra
utilización en el sector farmacéutico en el caso del tratamiento de
depresiones, enfermedades del hígado y artritis. Los procedimientos
descritos para la utilización de la SAM comprenden sobre todo la
cultivación de levaduras (véase la cita de Schlenk F. y DePalma
R.E., J. Biol. Chem. 1.037-1.050 (1957), Shiozaki S.
y colaboradores, Agric. Biol. Chem. 53, 3.269-3.274
(1989)) en presencia del compuesto precursor
L-metionina y la purificación por cromatografía
después de una autolisis.
La síntesis microbiana de metionina se investigó
de una manera especialmente intensa en la bacteria E. coli
(véase la cita de Greene, R.C., Biosynthesis of Methionine
(Biosínstesis de metionina) en: Neidhart F.C., Escherichia
coli and Salmonella typhimurium, Cellular and molecular
biology (Escherichia coli y Salmonella typhimurium,
biología celular y molecular), segunda edición, ASM Press,
Washington DC (1996), páginas 542-560 y las
referencias contenidas en ésta). Ella se compone de una serie de
reacciones catalizadas por enzimas y está regulada estrictamente.
Las primeras etapas de la síntesis partiendo de aspartato hasta
llegar a la homoserina se desarrollan paralelamente para la
formación de los aminoácidos treonina, leucina, isoleucina y
valina. La primera etapa, específica para la síntesis de metionina,
es la formación de
O-succinil-homoserina a partir de
succinil-CoA y homoserina mediando disociación de la
coenzima A. Esta reacción es catalizada por la enzima homoserina -
succiniltransferasa (homoserina -
O-transsuccinilasa, MetA, EC 2.3.1.46). La síntesis
de SAM se efectúa en una etapa a partir de
L-metionina y ATP.
La actividad de la homoserina - transsuccinilasa
es inhibida en presencia de L-metionina y/o de SAM
(véase la cita de Lee L.-W. y colaboradores, J. Biol. Chem. 241,
5.479-5.480 (1966)). Esta inhibición por el producto
final impide, por una parte, en la bacteria una síntesis excesiva,
que consume energía, de metionina y SAM, pero por otra parte se
opone también a una producción microbiana de estas dos sustancias a
una escala industrial. El gen que codifica la homoserina -
transsuccinilasa se compone de 930 pares de bases (inclusive el
codón de detención), y la proteína codificada por éste se compone
de 309 aminoácidos. Hasta ahora no se ha esclarecido la estructura
de la homoserina - transsuccinilasa y, por tanto, tampoco es posible
una identificación de los aminoácidos que participan en una
inhibición por el producto final.
Un método conocido para reforzar la síntesis de
productos finales del metabolismo, consiste en la utilización de
enzimas modificadas, cuya actividad ya no puede ser inhibida por el
producto final de su vía metabólica (mutantes resistentes a la
retroalimentación). Así, por ejemplo, se prepararon mutantes
resistentes a la retroalimentación de la ácido
3-desoxi-D-arabino-heptulónico-7-fosfato
sintasa para el aumento de la síntesis de
L-triptófano y L-fenilalanina
(véase el documento de solicitud de patente europea EP 07455671A2) y
mutantes resistentes a la retroalimentación de la corismato mutasa
/ prefenato deshidratasa para el aumento de la producción de
fenilalanina (véase el documento de patente de los EE.UU. US
5120837).
Hace poco tiempo se modificó la enzima
homoserina - transsuccinilasa procedente de E. coli mediante
mutación de la secuencia de ADN que la codifica, en el sentido de
que las proteínas resultantes tienen una capacidad manifiestamente
reducida de que su actividad sea inhibida en presencia de
L-metionina 1 mM o de SAM 1 mM (véase el documento
de solicitud de patente japonesa JP 2000139471A). En este caso se
trata de los siguientes intercambios de aminoácidos: la arginina en
la posición 27 se reemplazó por cisteína, la isoleucina en la
posición 296 se reemplazó por serina y la prolina en la posición
298 se reemplazó por leucina. Las homoserina - transsuccinilasas
modificadas mostraron en presencia de L-metionina 1
mM unas actividades restantes comprendidas entre 44 y 89%, y en
presencia de SAM 1 mM unas actividades restantes comprendidas entre
10 y 73%. Las cepas de bacterias, que contienen estas proteínas
modificadas, muestran una producción aumentada de
L-metionina. Sin embargo, estas homoserina -
transsuccinilasas modificadas tienen, en ausencia de
L-metionina y de SAM, una actividad disminuida
manifiestamente en comparación con las del tipo salvaje. A partir de
la base de datos Database WPI Section Ch, Week 200103 Derwent
Publications Ltd., Londres, Gran Bretaña; de la clase B05, AN
2001-018703 XP002273153, y del documento JP 2000
139471 A (de AJINOMOTO KK) del 23 de mayo del 2000
(2000-05-23) se conoce un ADN, que
tiene las siguientes mutaciones en la secuencia que comprende 309
aminoácidos: Arg27 -> Cys; Ile296 -> Ser; Pro298 -> Leu;
Arg27 -> Cys e Ile296 -> Ser; Ile296 -> Ser y Pro298 ->
Leu; Pro298 -> Leu y Arg27 -> Cys; ó Arg27 -> Cys, Ile296
-> Ser y Pro298 -> Leu. Es deseable tener a disposición un
número lo más alto que sea posible de variantes de la homoserina
-
transsuccinilasa, que se diferencien en el grado de su actividad y en el grado de su capacidad para ser inhibidas por L-metionina y/o SAM, puesto que la biosíntesis microbiana de L-metionina y SAM es sumamente compleja en lo que se refiere a su transcurso y su regulación y, además de esto, está interconectada de manera compleja con diversas vías adicionales del metabolismo en la célula. Por lo tanto, no se puede realizar de antemano ninguna predicción acerca de con qué variante se pueda alcanzar qué efecto sobre el crecimiento de una cepa de microorganismo, sobre el balance de sus transcursos metabólicos importantes para la vida y sobre la producción de L-metionina y SAM.
transsuccinilasa, que se diferencien en el grado de su actividad y en el grado de su capacidad para ser inhibidas por L-metionina y/o SAM, puesto que la biosíntesis microbiana de L-metionina y SAM es sumamente compleja en lo que se refiere a su transcurso y su regulación y, además de esto, está interconectada de manera compleja con diversas vías adicionales del metabolismo en la célula. Por lo tanto, no se puede realizar de antemano ninguna predicción acerca de con qué variante se pueda alcanzar qué efecto sobre el crecimiento de una cepa de microorganismo, sobre el balance de sus transcursos metabólicos importantes para la vida y sobre la producción de L-metionina y SAM.
Una misión del presente invento consiste en
poner a disposición un amplio espectro de nuevas variantes de la
homoserina - transsuccinilasa (proteína MetA), que posean una
resistencia a la retroalimentación aumentada en comparación con la
enzima de tipo salvaje (WT, de Wild Type) en lo que respecta a
L-metionina y SAM.
El problema planteado por esta misión se
resuelve por medio de una homoserina - transsuccinilasa que, en
comparación con una enzima de tipo salvaje homoserina -
transsuccinilasa, tiene por lo menos una mutación y muestra una
sensibilidad reducida en comparación con la enzima de tipo salvaje,
frente a L-metionina o SAM, poseyendo la enzima de
tipo salvaje una secuencia de aminoácidos, que comprende una
secuencia parcial AspGlyXaaXaaXaaThr
GlyAlaPro entre las posiciones 90 y 115, y una secuencia parcial TyrGlnXaaThrPro entre las posiciones 285 y 310, siendo la metionina inicial la posición 1 de la secuencia de aminoácidos, caracterizada porque la mutación consiste en un intercambio de aminoácido del aspartato en la secuencia parcial AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro.
GlyAlaPro entre las posiciones 90 y 115, y una secuencia parcial TyrGlnXaaThrPro entre las posiciones 285 y 310, siendo la metionina inicial la posición 1 de la secuencia de aminoácidos, caracterizada porque la mutación consiste en un intercambio de aminoácido del aspartato en la secuencia parcial AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro.
El Asp en la secuencia parcial
AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro está conservado al realizar una
comparación entre homoserina - transsuccinilasas de diferentes
microorganismos. La región de la secuencia
AspGlyXaaXaaXaaThrGly
AlaPro que contiene el aspartato conservado Asp, se encuentra, en la proteína MetA procedente de E. coli, entre las posiciones 101 y 109 de la SEQ ID No. 2. Éste, en otras proteínas MetA, se encuentra en la región comprendida entre las posiciones 90 y 115. Xaa significa un aminoácido natural arbitrario.
AlaPro que contiene el aspartato conservado Asp, se encuentra, en la proteína MetA procedente de E. coli, entre las posiciones 101 y 109 de la SEQ ID No. 2. Éste, en otras proteínas MetA, se encuentra en la región comprendida entre las posiciones 90 y 115. Xaa significa un aminoácido natural arbitrario.
Hasta ahora no se ha esclarecido la estructura
espacial de la homoserina - transsuccinilasa. Por lo tanto, no se
posibilita realizar la asignación a determinados aminoácidos de
diferentes funciones tales como la actividad enzimática y la
capacidad para inhibirla por L-metionina y/o SAM.
Puesto que el plegamiento de proteínas es un proceso extremadamente
complejo, a partir de la secuencia primaria de proteínas no se
pueden sacar conclusiones acerca de su estructura espacial y no
pocas veces sucede que unos aminoácidos, que están situados muy
alejados en la secuencia primaria, en la proteína plegada están
situados en una proximidad inmediata y viceversa. Sorprendentemente,
se encontró que el intercambio de aminoácidos conforme al invento
en la posición 101 de la proteína conduce a una disminución de la
capacidad para inhibirse por retroalimentación tanto frente a
L-metionina como también frente a SAM.
Una homoserina - transsuccinilasa conforme al
invento tiene, en comparación con la enzima de tipo salvaje, una
resistencia mejorada (por lo tanto, una Ki aumentada) frente a los
inhibidores SAM y/o L-metionina. De manera
preferida, ella tiene, en comparación con la enzima de tipo salvaje,
una resistencia aumentada por lo menos en 2 veces frente a
metionina y/o SAM. De manera especialmente preferida, una homoserina
- transsuccinilasa conforme al invento tiene una resistencia
aumentada en 10 veces, en comparación con la enzima de tipo salvaje,
se prefiere en particular una resistencia aumentada en 50 veces
frente a metionina y/o SAM, de manera muy especialmente preferida
una resistencia aumentada en comparación con los mutantes de MetA
mencionados en el documento JP2000139471A.
De manera especialmente preferida, la secuencia
proteínica de una homoserina - transsuccinilasa conforme al invento
comprende una de las mutaciones enumeradas en la Tabla 1 o una
combinación de las mutaciones expuestas.
Una homoserina - transsuccinilasa conforme al
invento es obtenible, por ejemplo, mediante expresión de una
secuencia de ADN, que codifica una homoserina - transsuccinilasa
conforme al invento.
El presente invento se refiere, por
consiguiente, también a una secuencia de ADN, que codifica una
homoserina - transsuccinilasa conforme al invento.
Una secuencia de ADN de este tipo se puede
obtener mediante una mutación de una base en uno o varios codones
de un gen de metA, caracterizada porque en el codón para el
aspartato conservado, que se encuentra en la posición 101 en la
enzima de tipo salvaje de E. coli, está presente por lo menos
una mutación, comenzando el codón 1 con la primera base de la
secuencia SEQ ID No. 1.
Una secuencia de ADN conforme al invento es un
gen de metA, en el que se ha modificado el codón para el aspartato
Asp en la secuencia AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro, estando situada
esta secuencia en la proteína MetA entre las posiciones 90 y
115.
En lo sucesivo, una secuencia de ADN conforme al
invento se designa como un alelo de metA resistente a la
retroalimentación.
Dentro del marco del presente invento, como
alelos de metA se han de considerar también los genes que, al
realizar un análisis con el algoritmo BESTFIT (GCG Wisconsin
Package, Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin),
manifiestan una identidad entre secuencias mayor que un 50% con
respecto al gen WT de metA procedente de E. coli. Asimismo,
unas proteínas con una identidad entre secuencias mayor que un 50%
con relación a la homoserina -
transsuccinilasa de tipo salvaje de E. coli (algoritmo BESTFIT, GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin), que poseen una actividad de homoserina - transsuccinilasa, se han de considerar como homoserina - transsuccinilasas.
transsuccinilasa de tipo salvaje de E. coli (algoritmo BESTFIT, GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin), que poseen una actividad de homoserina - transsuccinilasa, se han de considerar como homoserina - transsuccinilasas.
De manera preferida, un alelo de metA conforme
al invento comprende una mutación enumerada en la Tabla 1, columna
2 o respectivamente 4, o una combinación de las mutaciones
expuestas.
Unos alelos de metA conformes al invento se
pueden preparar, por ejemplo, mediante una mutagénesis inespecífica
o mediante una mutagénesis deliberada a partir del material de
partida descrito a continuación. Unas mutaciones inespecíficas
situadas dentro de la citada región de ADN se pueden producir, por
ejemplo, por medio de agentes químicos (p.ej.
1-metil-3-nitro-1-nitroso-guanidina,
ácido etil-metano-sulfónico, entre
otros) y/o por medio de métodos físicos y/o por medio de reacciones
de PCR (reacciones en cadena de polimerasa) llevadas a cabo en
determinadas condiciones y/o mediante amplificación del ADN en cepas
mutadoras (p.ej. la XL1-Red). Se conocen ciertos
métodos para la introducción de mutaciones en posiciones específicas
dentro de un fragmento de ADN. Otra posibilidad para la producción
de alelos de metA resistentes a la retroalimentación consiste en la
combinación de diferentes mutaciones, que conducen a una
resistencia a la retroalimentación, para dar múltiples mutantes con
propiedades nuevas.
Como material de partida para la mutagénesis
sirve de manera preferida el ADN de un gen de metA de tipo salvaje.
El gen de metA que se ha de mutar puede ser codificado cromosómica o
extracomosómicamente. Mediante aplicación de los métodos de
mutagénesis antes mencionados, se modifican uno o varios nucleótidos
de la secuencia de ADN, de tal manera que la proteína ahora
codificada por el gen tiene una mutación del aspartato conservado,
que se encuentra en la posición 101 en la enzima de tipo salvaje de
E. coli, siendo la metionina inicial la posición 1 de la SEQ
ID NO. 2.
Con las técnicas descritas se pueden introducir
en un gen arbitrario de metA una o varias mutaciones en la región
mencionada del ADN. Estas mutaciones dan lugar a que la homoserina -
transsuccinilasa codificada posea una secuencia de aminoácidos que
conduzca a una resistencia a la retroalimentación frente a SAM y/o
L-metionina.
A continuación de la mutagénesis, llevada a cabo
por ejemplo tal como se ha descrito, se efectúa la selección de los
mutantes con el fenotipo deseado, por ejemplo mediante determinación
de la magnitud de la sensibilidad frente a
L-metionina y/o SAM de las homoserina -
transsuccinilasas mutadas.
Para la determinación de la sensibilidad frente
a L-metionina y/o SAM de las homoserina -
transsuccinilasas, se puede utilizar cualquier método que permita
determinar la actividad de la enzima en presencia de
L-metionina o SAM. Por ejemplo, la determinación de
la actividad de las homoserina - transsuccinilasas se puede efectuar
apoyándose en el método descrito por Kredich y Tomkins para la
determinación de la actividad de serina-acetil
transferasas (véase la cita de Kredich N.M. y Tomkins G.M., J. Biol.
Chem. 241, 4.955-4.965 (1966)). La actividad
enzimática se mide en una tanda, que contiene homoserina y
succinil-CoA. La reacción se inicia mediante adición
de la enzima y se vigila en un fotómetro espectral a través de la
disminución de la extinción a 232 nm, que es provocada por
disociación del enlace tioéster en la
succinil-coenzima A. El ensayo descrito se adecua
para la determinación de la sensibilidad frente a
L-metionina de las homoserina - transsuccinilasas.
La inhibición de la actividad de las homoserina - transsuccinilasas
se ensaya en presencia de diferentes concentraciones de
L-metionina en la tanda de reacción. La actividad
catalítica de las diferentes homoserina - transsuccinilasas se
determina en presencia y ausencia de L-metionina, y
a partir de ella se determina la constante de inhibición Ki, que
describe la concentración del inhibidor con la que la actividad es
solamente de un 50% de la que se puede medir en ausencia del
inhibidor.
Para la determinación de la sensibilidad frente
a SAM de la actividad de las diferentes homoserina -
transsuccinilasas se puede efectuar, por ejemplo, un ensayo de la
actividad como el que se describe en la cita de Lee L.W. y
colaboradores, Biol. Chem. 241, 5.479-5.480 (1966).
En este caso, el extracto enzimático se incuba con homoserina y
succinil-CoA. Después de diferentes momentos se
interrumpe una parte de la tanda de ensayo mediante adición a una
mezcla de etanol, agua y ácido
5,5'-ditiobis(2-nitro-benzoico).
La absorción se determina fotométricamente a 412 nm. El ensayo
descrito se adecua, por ejemplo, para la determinación de la
sensibilidad frente a SAM de las homoserina - transsuccinilasas. La
inhibición de la actividad de las homoserina - transsuccinilasas se
ensaya en presencia de diferentes concentraciones de SAM en la tanda
de reacción. La actividad catalítica de las diferentes homoserina
-
transsuccinilasas se determina en presencia y en ausencia de SAM, y a partir de esto se determina la constante de inhibición Ki.
transsuccinilasas se determina en presencia y en ausencia de SAM, y a partir de esto se determina la constante de inhibición Ki.
Por regla general, se prefiere una homoserina -
transsuccinilasa con una sensibilidad disminuida frente a
L-metionina y/o SAM con una actividad catalítica
simultáneamente inalterada. Para otros propósitos puede ser digno
de pretenderse una reducción simultánea de la sensibilidad frente a
L-metionina y/o SAM y de la actividad
catalítica.
Un objeto adicional del invento son cepas de
microorganismos, que contienen alelos de metA conformes al invento,
que son resistentes a la retroalimentación. Tales cepas de
microorganismos están caracterizadas porque poseen un metabolismo
de L-metionina o respectivamente SAM, desregulado
por lo menos por un alelo de metA, que es resistente a la
retroalimentación. Puesto que en los casos de todos los
microorganismos este metabolismo se desarrolla a través de la misma
ruta que es en sí conocida, y las técnicas que se han de aplicar
para la producción de las cepas conformes al invento, se conocen
por regla general p.ej. a partir de libros de texto clásicos y se
pueden aplicar a todos los microorganismos, se pueden producir cepas
conformes al invento a partir de microorganismos arbitrarios. De
manera preferida, para la producción de una cepa conforme al invento
se adecuan bacterias. Se adecuan de manera especialmente preferida
bacterias gram-negativas, en particular E.
coli.
\newpage
Un objeto adicional del invento es la
preparación de L-metionina o SAM mediante
cultivación de microorganismos conformes al invento, además la
utilización de microorganismos conformes al invento para la
preparación de productos que contienen metionina (tales como, por
ejemplo, péptidos que contienen metionina) o que en el metabolismo
de los microorganismos se derivan de L-metionina o
SAM (tales como, por ejemplo, poliaminas, ácido lipónico, biotina y
quinonas). Por lo demás, los microorganismos conformes al invento,
que producen SAM en una medida reforzada en comparación con el tipo
salvaje, se pueden utilizar para preparar unos productos que
resultan mediante transferencia del grupo metilo de SAM.
Los alelos de metA resistentes a la
retroalimentación, son transformados para la expresión de la enzima
homoseri-
na - transsuccinilasa modificada mediante procedimientos usuales en el seno de una cepa anfitriona.
na - transsuccinilasa modificada mediante procedimientos usuales en el seno de una cepa anfitriona.
La expresión de un alelo de metA resistente a la
retroalimentación se puede efectuar bajo el control del promotor
propio, localizado delante del gen de metA, o mediante utilización
de otros sistemas de promotores apropiados, que son conocidos para
un experto en la especialidad. En este caso, el gen correspondiente
se puede encontrar, bajo el control de un promotor de este tipo, o
bien en una o varias copias en el cromosoma del organismo anfitrión
o en un vector, de manera preferida en un plásmido. El invento se
refiere, por lo tanto, también a un plásmido, que está
caracterizado porque contiene un alelo de metA conforme al invento,
que es resistente a la retroalimentación, con un promotor.
Para la clonación se pueden utilizar vectores,
que ya contienen elementos genéticos (p.ej. promotores
constitutivos o regulables, terminadores), que o bien hacen posible
una expresión duradera o inducible controlada, del gen que codifica
una homoserina - transsuccinilasa. Además, en un vector de expresión
se encuentran de manera preferida otros elementos reguladores tales
como sitios de fijación ribosómicos y secuencias de terminación,
así como unas secuencias, que codifican marcadores selectivos y/o
genes reporteros. La expresión de tales marcadores de selección
facilita la identificación de transformantes. Como marcadores de
selección se adecuan unos genes, que codifican una resistencia
frente a p.ej. ampicilina, tetraciclina, cloramfenicol, kanamicina
u otros antibióticos. Cuando el alelo de metA conforme al invento se
debe de replicar extracromosómicamente, el vector plasmídico
debería contener preferiblemente un sitio de origen de la
replicación. Se prefieren especialmente unos vectores plasmídicos
tales como, por ejemplo, los vectores de E. coli pACYC184,
pUC18, pBR322, pSC101 y sus derivados. Como promotores inducibles
se adecuan, por ejemplo, el promotor lac, tac, trc, lambda PL, ara
o tet, o secuencias derivadas de ellos. Se prefiere la expresión
constitutiva realizada por un promotor de la GAPDH. En una forma de
realización especialmente preferida del presente invento, los genes
que codifican la homoserina - transsuccinilasa se encuentran bajo
el control del promotor de la GAPDH en un plásmido derivado de
pACYC184. Las estrategias para la integración de genes en el
cromosoma constituyen un estado de la técnica.
Una cepa anfitriona apropiada se transforma con
un vector de expresión, que contiene la unidad de transcripción que
codifica una homoserina - transsuccinilasa insensible frente a
L-metionina y/o SAM. Como cepas anfitrionas se
utilizan unas cepas que contienen proteínas sensibles frente a
L-metionina y/o SAM, tales como, por ejemplo,
bacterias.
Como cepa anfitriona se utiliza, de manera
preferida, una cepa de E. coli de tipo salvaje, o una cepa,
en la que está desactivado el gen endógeno de metA, tal como p.ej.
la cepa DL41 de E. coli, colección de cepas de CGSC nº
7.177. Tales cepas son complementadas por un gen de metA conforme al
invento. La capacidad de una cepa conforme al invento para la
producción microbiana de L-metionina o SAM se puede
reforzar por medio de ciertas medidas adicionales. Por ejemplo,
para esta finalidad se pueden utilizar unas cepas, en las que ya no
es expresado el gen de metJ, que codifica un represor de los genes
del metabolismo de la metionina (véase el documento
JP2000139471A).
La producción de L-metionina o
SAM se efectúa de manera preferida mediante cultivación de una cepa
de microorganismo conforme al invento. Para esto, la cepa de
microorganismo se cultiva, por ejemplo, dentro de un fermentador en
un medio nutricio, que contiene una fuente adecuada de carbono, y
una fuente de energía adecuada, así como otras sustancias
adicionales.
Las sustancias que se han formado durante la
fermentación, tales como, por ejemplo, L-metionina o
SAM, se pueden purificar a continuación.
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar
adicionalmente el invento. Todos los procedimientos empleados de
biología molecular, tales como una reacción en cadena de la
polimerasa, un aislamiento y una purificación de un ADN, una
modificación de un ADN por medio de enzimas de restricción, del
fragmento de Klenow y de una ligasa, la transformación, etc., se
llevaron a cabo de la manera conocida para un experto en la
especialidad, descrita en la bibliografía o recomendada por el
respectivo fabricante.
\newpage
El gen de metA procedente de E. coli se
amplificó mediante una reacción en cadena de la polimerasa mediando
utilización de los oligonucleótidos fosforilados en el extremo
5'
| metAfw, que tiene la secuencia | |
| 5'-GATCCCATGGCTCCTTTTAGTCATTCTTAT-3', | (SEQ ID No. 3), y |
| metArev, que tiene la secuencia | |
| 5'-GATCGAGCTCAGTACTATTAATCCAGCGTTGGATTC-3', | (SEQ ID No. 4), |
como cebadores y de un ADN
cromosómico procedente de la cepa W3110 de E. coli (ATCC
27325) como substrato. El producto con una longitud de 1,1 kb se
aisló por electroforesis y se purificó mediante un estuche QIAquick
Gel Extraction Kit (de Qiagen). Después de esto, éste se introdujo
en el plásmido pBr322 (de MBI Fermentas), que se había tratado con
la enzima de restricción EcoRI y con el fragmento de Klenow (de
Roche), por medio de una ligasa de ADN de T4. El resultante plásmido
pKP438 se empleó para la
mutagénesis.
El plásmido pKP438 se introdujo mediante
transformación en la cepa XL1-Red de E. coli
(de Stratagene), y mediante cultivación según las instrucciones del
fabricante se introdujeron mutaciones en el plásmido pKP438. La
mutagénesis se efectuó en presencia de concentraciones críticas de
compuestos análogos a metionina tal como se describe en la cita de
Lawrence D.A. y Smith D.A., Genetics 58: 473-492
(1968). Mediante este procedimiento se seleccionan unos mutantes,
que manifiestan una sobreproducción de metionina. La mayoría de
estos mutantes se han de atribuir a homoserina - transsuccinilasas
modificadas, codificadas en el plásmido pKP438.
El plásmido procedente de un mutante se aisló y
se determinó la secuencia de ADN del gen de metA. Se mostró que el
gen tiene en cada caso, en comparación con el del tipo salvaje, un
intercambio de bases, que conduce a un aminoácido modificado en la
homoserina - transsuccinilasa codificada. La metA en pBR1 contiene
como base 301 una A en lugar de la G que se presenta en el gen de
tipo salvaje, con lo cual en la proteína codificada se introduce en
la posición 101 asparagina en lugar de aspartato.
En el Ejemplo 1 se produjeron alelos de metA
que, debido al intercambio de bases y a una modificación de
aminoácido en la posición 101, que lo acompaña, codifican
homoserina - transsuccinilasas que son resistentes a la
retroalimentación frente a L-metionina y/o SAM
(véanse los Ejemplos 3 y 4). Por medio de una mutagénesis específica
para un sitio se construyeron, por consiguiente, unos genes, que
codifican unas homoserina - transsuccinilasas, en las que el
aminoácido aspartato en la posición 101 está reemplazado por otros
aminoácidos diferentes, y que tienen unas propiedades modificadas
de este modo en lo que se refiere a la inhibición de su actividad
por L-metionina y SAM.
Como plásmido de base para la construcción de
los plásmidos conformes al invento, se utilizó el plásmido
pACYC184-LH derivado de pACYC184, que está depositado bajo el número DSM 10172 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen) en Braunschweig. En este plásmido se introdujo la secuencia del promotor de la GAPDH y adicionalmente, delante de ésta, un sitio de corte con NdeI mediante el siguiente modo de proceder: El promotor de la GAPDH se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa según las reglas conocidas para un experto en la especialidad, sirviendo los oligonucleótidos
pACYC184-LH derivado de pACYC184, que está depositado bajo el número DSM 10172 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen) en Braunschweig. En este plásmido se introdujo la secuencia del promotor de la GAPDH y adicionalmente, delante de ésta, un sitio de corte con NdeI mediante el siguiente modo de proceder: El promotor de la GAPDH se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa según las reglas conocidas para un experto en la especialidad, sirviendo los oligonucleótidos
| GAPDHfw, que tiene la secuencia | |
| 5'-GTCGACGCGTGAGGCGAGTCAGTCGCGTAATGC-3' | (SEQ ID No. 5), y |
| GAPDHrevII, que tiene la secuencia | |
| 5'-GACCTTAATTAAGATCTCATATGTTCCACCAGCTATTTGTTA-3' | (SEQ ID No. 6) |
como cebadores y un ADN cromosómico
procedente de la cepa W3110 de E. coli (ATCC 27325) como
substrato. El producto se aisló por electroforesis, se purificó con
ayuda de un estuche QIAquick Extraction Kit (de Qiagen) y se trató
con las enzimas de restricción MluI y PacI según las instrucciones
del fabricante. A continuación de esto, éste se introdujo en el
vector pACYCI84-LH tratado con las mismas enzimas,
con ayuda de la ligasa de ADN de T4, con lo que resultó el plásmido
pKP290.
El gen de metA procedente de E. coli se
amplificó por medio de una reacción en cadena de la polimerasa
mediando utilización de los oligonucleótidos
| metAfw2, que tiene la secuencia | |
| 5'-CATGGCTCCTTTTAGTCATTCTTATATTCTAACGTAG-3' | (SEQ ID No. 7), y |
| metArev2, que tiene la secuencia | |
| 5'-ACGCGTATGCATCCAGAGCTCAGTACTATTAATCCAGCGTTGGATTC-3' | (SEQ ID No. 8) |
como cebadores y un ADN cromosómico
de la cepa W3110 de E. coli (ATCC 27325) como substrato. El
producto con una longitud de 1,1 kb se separó por electroforesis y
se purificó con ayuda de un estuche QIAquick Gel Extraction Kit (de
Qiagen). Después de esto, el producto se ligó en el vector pKP290
que se había preparado previamente de la siguiente manera:
Tratamiento con la enzima de restricción NdeI, con la enzima de
Klenow, con la enzima de restricción BglII y con la nucleasa de
haba de mung (de Roche). El resultante plásmido pKP413GAP se
representa en la Fig. 1 y se ha depositado bajo el número DSM 15221
en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares en
Braunschweig. Éste contiene el gen de metA procedente de E.
coli bajo el control del promotor de la GAPDH y sirve como
plásmido de partida para la preparación de los alelos de metA
resistentes a la
retroalimentación.
El plásmido pKP413GAP se sometió a una
mutagénesis dirigida específica para un sitio, concerniente al codón
101 del gen estructural de metA. A este fin, se llevó a cabo una
reacción en cadena de la polimerasa inversa con una polimerasa de
Pfu (de Promega) de acuerdo con las reglas conocidas para un experto
en la especialidad. Como cebadores sirvieron los oligonucleótidos
fosforilados en el extremo 5'
| metAmutfw2 que tiene la secuencia | |
| 5-NNNGGTTTGATTGTAACTGGTGCG-3' | (SEQ ID No. 9), |
| habiéndose empleado en la síntesis para N una mezcla 1:1:1:1 de A, T, C y G, y | |
| metAmutrev2 que tiene la secuencia | |
| 5-AAAGTTCTGATCCTGAATATC-3' | (SEQ ID No. 10). |
El producto con un tamaño de aproximadamente 4,3
kb se aisló por electroforesis y se purificó con ayuda de un
estuche QIAquick Gel Extraction Kit (de Qiagen) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Después de esto, se efectuó una
ligación intramolecular con una ligasa de ADN de T4 de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. La transformación de células de
E. coli de la cepa DH5\alpha se efectuó según el método
con CaCl_{2} de un modo conocido para un experto en la
especialidad. La tanda de transformación se esparció sobre placas
de agar LB con tetraciclina (10 g/l de triptona, 5 g/l de un
extracto de levadura, 10 g/l de NaCl, 15 g/l de un agar, 15 mg/l de
tetraciclina) y se incubó durante una noche a 37ºC. Los
transformantes deseados se identificaron, después de un aislamiento
de los plásmidos con ayuda de un estuche QIAprep Spin Miniprep Kit
(de Qiagen) mediante un análisis por restricción. La región situada
entre los sitios de corte con Esp3I y ScaI, que contiene el codón
294 del gen estructural de metA, se secuenció, se aisló y se
introdujo en un plásmido pKP413GAP tratado con las mismas enzimas,
mediante métodos conocidos para un experto en la especialidad.
Para la mutagénesis dirigida concerniente al
codón 101 se procedió análogamente, pero como cebadores para la
reacción en cadena de la polimerasa se emplearon los
oligonucleótidos
| metAmutfw2, que tiene la secuencia | |
| 5'-NNNGGTTTGATTGTAACTGGTGCG-3' | (SEQ ID No. 11), |
| empleándose en la síntesis para N una mezcla 1:1:1:1 de A, T, C, G, y | |
| metAmutrev2, que tiene la secuencia | |
| 5'-AAAGTTCTGATCCTGAATATC-3' | (SEQ ID No. 12). |
Los plásmidos con una posición en el codón 101,
modificada en comparación con el tipo salvaje de metA, se
secuenciaron en la región situada entre los sitios de corte con
Esp3I y PvuII, se aislaron y se introdujeron en un plásmido
pKP413GAP tratado con las mismas enzimas.
Los plásmidos construidos de esta manera
contienen el gen de metA completo, en cada caso con una secuencia
modificada en el codón 101 en comparación con la secuencia del tipo
salvaje, con lo que ellos se pueden emplear para la producción de
diferentes variantes de homoserina - transsuccinilasas (véase la
Tabla 1).
La actividad y la influencia de
L-metionina sobre la actividad de las diferentes
homoserina - transsuccinilasas se determinó mediante un ensayo
enzimático con extractos de células, en los que se habían producido
las respectivas proteínas. Para esto, se introdujeron los
correspondientes plásmidos, que codifican homoserina -
transsuccinilasas modificadas, mediante una transformación según
métodos conocidos para un experto en la especialidad, en la cepa
W3110 de E. coli (ATCC 27325). La tanda de transformación se
esparció sobre placas de agar LB con tetraciclina (10 g/l de
triptona, 5 g/l de un extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 15 g/l de
un agar, 15 mg/l de tetraciclina) y se incubó durante una noche a
37ºC. Los transformantes obtenidos se cultivaron en un medio SM1
(para 1 l de medio: CaCl_{2} x 2 H_{2}O 0,0147 g, MgSO_{4} x
7 H_{2}O 0,3 g, Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O 0,15 mg,
H_{3}BO_{3} 2,5 mg, CoCl_{2} x 6 H_{2}O 0,7 mg, CuSO_{4} x
5 H_{2}O 0,25 mg, MnCl_{2} x 4 H_{2}O 1,6 mg, ZnSO_{4} x 7
H_{2}O 0,3 mg, KH_{2}PO_{4} 3,0 g, K_{2}HPO_{4} 12,0 g,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 5 g, NaCl 0,6 g, FeSO_{4} x 7
H_{2}O 0,002 g, Na_{3}-citrato x 2 H_{2}O 1 g,
glucosa 5 g, triptona 1 g, extracto de levadura 0,5 g), se
separaron por centrifugación con una absorción de aproximadamente
0,8 a 600 nm, se lavaron en Tris 50 mM de pH 7,5 y se separaron por
centrifugación de nuevo. Las células se resuspendieron en Tris/Cl
50 mM de pH 7,5, ditiotreitol 2 mM, fluoruro de ácido
fenil-metil-sulfónico 0,5 mM, y se
rompieron en una prensa de French. El material sobrenadante de otra
centrifugación se empleó como extracto enzimático en el ensayo. La
actividad enzimática se determinó en una tanda con Tris/Cl 50 mM de
pH 7,6, homoserina 1 mM y succinil-CoA 0,1 mM,
siendo cuantificada fotométricamente la coenzima A resultante en la
reacción a través de la disminución de la extinción a 232 nm,
apoyándose en el método descrito por Kredich y Tomkins para la
determinación de la actividad de serina - acetiltransferasas (véase
la cita de Kredich N.M. y Tomkins G.M., J. Biol. Chem. 241,
4.955-4.965 (1966). Se determinó la repercusión de
la L-metionina añadida sobre la actividad y se
cuantificó como Ki la capacidad de inhibirla. Como Ki se determina
la concentración de L-metionina, con la que la
actividad de la homoserina - transsuccinilasa es solamente de un 50%
de la actividad en ausencia de L-metionina.
Todos los mutantes de las homoserina -
transsuccinilasas muestran una resistencia a la retroalimentación,
aumentada en comparación con el tipo salvaje, en lo concerniente a
L-metionina. La Tabla 2 muestra una recopilación de
los resultados.
La influencia de SAM sobre la actividad de las
diferentes homoserina - transsuccinilasas se determinó mediante
cuantificación de la actividad en presencia de diferentes
concentraciones de SAM (sal de Cl, de Sigma). La cultivación y la
preparación de los extractos celulares se efectuaron como se ha
descrito en el Ejemplo 3. El ensayo de la actividad se efectuó como
se ha descrito en la cita de Lee L.W. y colaboradores, J. Biol.
Chem. 241, 5.479-5.480 (1966), siendo incubado el
extracto enzimático con un tampón de fosfato de potasio 50 mM, de
pH 7,5, homoserina 3 mM y succinil-CoA 0,3 mM. En
diferentes momentos se interrumpieron 100 \mul de la tanda de
ensayo mediante adición a una mezcla de 400 \mul de etanol, 400
\mul de agua y 100 \mul de ácido
5,5'-ditiobis(2-nitro-benzoico)
10 mM. Después de que se hubo incubado la tanda durante 5 minutos a
la temperatura ambiente, se determinó por fotometría la absorción a
412 nm. Después de haberse determinado la concentración proteínica,
se calculó la actividad enzimática mediando utilización de los
coeficientes de extinción. Como medida para la capacidad de inhibir
la actividad por medio de SAM se determinó la Ki.
<110> Consortium fuer elektrochemische
Industrie GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Homoserina transsucinilasas
resistentes a la retroalimentación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> CO10217
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 930
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (930)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Blattner, F. R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> La secuencia genómica completa de
Escherichia coli K-12.
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Science
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<305> 5331
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 1.453-1.474
\vskip0.400000\baselineskip
<307> 1997
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 309
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido metAfw
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcccatgg ctccttttag tcattcttat
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido metArev
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcgagctc agtactatta atccagcgtt ggattc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido GAPDHfw
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgacgcgt gaggcgagtc agtcgcgtaa tgc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido GAPDHrevII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccttaatt aagatctcat atgttccacc agctatttgt ta
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido metAfw2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatggctcct tttagtcatt cttatattct aacgtag
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido metArev2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgcgtatgc atccagagct cagtactatt aatccagcgt tggattc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido metAmutfw2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnnnggtttga ttgtaactgg tgcg
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido metAmutrev2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagttctga tcctgaatat c
\hfill
Claims (8)
1. Homoserina - transsucinilasa, que en
comparación con una enzima homoserina - transsuccinilasa de tipo
salvaje tiene por lo menos una mutación y manifiesta una
sensibilidad reducida en comparación con la enzima de tipo salvaje,
frente a L-metionina o SAM, poseyendo la enzima de
tipo salvaje una secuencia de aminoácidos, que comprende una
secuencia parcial AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro situada entre las
posiciones 90 y 115 y una secuencia parcial TyrGlnXaaThrPro situada
entre las posiciones 285 y 310, siendo la metionina inicial la
posición 1 de la secuencia de aminoácidos, caracterizada
porque la mutación es un intercambio de aminoácido del aspartato en
la secuencia parcial AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro.
2. Homoserina - transsuccinilasa de acuerdo con
la reivindicación 1, caracterizada porque tiene una
resistencia aumentada por lo menos en 2 veces (Ki aumentado) en
comparación con el tipo salvaje, frente a SAM o
L-metionina.
3. Homoserina - transsuccinilasa de acuerdo con
la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque contiene una
de las mutaciones enumeradas en la Tabla 1.
4. Alelo de metA que codifica una homoserina -
transsuccinilasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a
3.
5. Plásmido, caracterizado porque
contiene un alelo de metA de acuerdo con la reivindicación 4 con un
promotor.
6. Cepa de microorganismo, caracterizada
porque contiene un alelo de metA resistente a la retroalimentación
de acuerdo con la reivindicación 4.
7. Cepa de microorganismo, de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizada porque se trata de una cepa
de bacteria gram-negativa, de manera preferida de
E. coli.
8. Procedimiento para la preparación de
L-metionina o SAM mediante cultivación de una cepa
de microorganismo de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7.
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