WO2003100056A1

WO2003100056A1 - Nouvelle enzyme polyphosphate :amp phosphotransferase

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Publication number: WO2003100056A1
Application number: PCT/JP2003/006646
Authority: WO
Inventors: Toshikazu Shiba; Toshitada Noguchi
Original assignee: Yamasa Corporation
Priority date: 2002-05-29
Filing date: 2003-05-28
Publication date: 2003-12-04
Also published as: ATE468393T1; CA2499885C; EP1514927A1; DE60332623D1; KR20050004855A; US7329522B2; JPWO2003100056A1; ES2344552T3; CA2499885A1; AU2003241818A1; US20080108111A1; JP4256341B2; CN100562573C; EP1514927B1; KR100864901B1; EP1514927A4; CN1656219A; JP2009050264A; US20060088918A1

Description

明細書新規なポリリン酸： AM Pリン酸転移酵素技術分野

本発明は、新規なポリリン酸： AM Pリン酸転移酵素（Po lyphosphat e : AMP Phosphot rans ferase) 、当該酵素をコードする遺伝子及びそれらの利用に関するものである。背景技術

近年の遺伝子操作技術の進展により、さまざまな酵素の安価な大量調製が可能となり、従来、微生物菌体を用いた微生物変換あるいは発酵生産もしくはィ匕学合成法により合成されてきた有用な生理活性物質が、酵素反応により安価に製造することが可能となってきている。

ところで、リン酸ィ匕反応、アミノ化反応などの高エネルギーを必要とする酵素反応には、アデノシン 5 ' —トリリン酸 (ATP) がエネルギー供与体あるいはリン酸供与体として必要である。従来の微生物変換あるいは発酵生産においては、 AT Pは用いた微生物の生体内より供給されるが、酵素法においては A T Pを反応系に添加したり、効率的な A T Pの再生系を開発することが不可欠である。しかしながら、 AT Pの安価な合成法は現時点で確立されておらず、市販されている AT Pは極めて高価である。また、 AT Pの再生系としてはホスホクレアチンとホスホクレアチンキナーゼとの組み合わせ、あるいはァセチルリン酸とァセテートキナーゼとの組み合わせなどが一般的に利用されるが、基質、酵素とも極めて高価であるため、その利用は実験室レベルでの利用に限定され、実用的なものではない。

また、 A T Pが高価であるのに対し、アデノシン 5 ' —モノリン酸（AMP) は比較的安価に製造されうる。現在、 ATPは、化学合成法あるいは微生物もしくは酵母菌体を用いて AMPもしくはアデニンから合成されている。そのため、 A TPを使用する酵素反応系において、高価な AT Pを添加するのではなく、安価な AMPから AT Pを酵素的に生成し、且つ消費された AT Pを効率的に再生する方法の開発が切望されていた。

実用的な AT Pの生成 ·再生系を構築する上で、使用するリン酸供与体も重要であり、安価かつ安定なリン酸供与体としてポリリン酸がその第 1候補と考えられている。一方、ポリリン酸代謝に関連し、アデノシン系ヌクレオチドにも作用する酵素としては、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸： AMPリン酸転移酵素

(以後「PAP」と略記する）が知られている。

PAPは、ポリリン酸をリン酸ドナ一として AMPをリン酸ィ匕して ADPを生成する酵素である (J.Bacteriol., 173, 6484-6488(1991)) 。 Zenhderらは、 Aci netobacter johnsoni iから該酵素を部分精製し、アデ二レートキナーゼと併用することで、 AMPとポリリン酸を基質とする AT P生成 ·再生系が機能しうることを報告している (Appl. Environ. Microbiol., 66, 2045-2051 (2000)) 。また、亀田らは、 AT Pを消費して AMPを生成する酵素反応系において、 Myxoco ecus xanthus由来の PAPと大腸菌ポリリン酸キナーゼを組み合わせにより、ポリリン酸をリン酸ドナーとした AMPからの AT Pの再生系が効率的に機能することを報告している (J. Biosci. Bioeng. 91, 557-563 (2001)) 。

しかしながら、 Acinetobacter johnsoniiの菌体内における PAPの存在量は極めて少なく、また反応に菌体抽出液などの粗精製酵素を使用すると、反応に関与する物質（AMP、 ADP, ATP, 反応基質及び Z又は反応生成物）を分解する酵素の混入も多くなり、結果として反応効率が低下するという問題が指摘されていた。この問題の解決策として、粗精製酵素ではなく、高度に精製された PAPを使用すればよいが、当該酵素は不安定であるとともに、その精製手順は極めて煩雑であり、到底実用化に耐えられるものではなかった。 JP03/06646 本発明者らは、上記問題を解決すべく Ac inetobac ier j ohnsoni iの P A Pを組換え D N A手法で大量に生産させるで上記問題を解決できるのではと考えた。しかしながら、該酵素のアミノ酸配列及び当該酵素の遺伝子に関しては、まったく報告されていない。発明の開示

本発明者らは、 P A Pの活性による遺伝子クローニングのためのスクリーニング系を構築し、そのスクリーニング系を用いることで、 P A Pをコードする遺伝子をクローニングし、大腸菌において該酵素を大量生産することに成功した。そして、生産された組換え P A Pに関して解析を進めたところ、該酵素は非常に高い比活性を有しており、また、アデ二レートキナーゼと組み合わせることで、効率的な AT P生成 ·再生系の構築が可能であることを見出した。

さらに驚くべき事に、この組換え P A Pは、従来の Acinetobacter j ohnsoni i 由来の P A Pと異なり、 AM Pや GM P以外のヌクレオシドモノリン酸であつてもポリリン酸をリン酸ドナ一としてリン酸を転移させヌクレオシドジリン酸を生成する活性を有することを見出した。

一般に、ヌクレオシドジリン酸は、医薬あるいは化成品として使用されているポリヌクレオチドの酵素合成のための原料として有用であるものの、これを合成することは決して容易なことではない。すなわち、微生物変換法ではジリン酸体でリン酸化反応を停止させることはできないため、現状では化学的リン酸化に頼らざるを得ない。しかしながら、化学的リン酸化では、副反応も同時に進行するため、副産物も生成し、目的のヌクレオシドジリン酸を反応液から単離精製することが極めて煩雑であるという問題があった。そのため、ヌクレオシドモノリン酸の酵素的なリン酸化によるヌクレオシドジリン酸の効率的な合成法の開発が望まれており、酵素合成法に使用する酵素としては P A Pも候補として考えられていた。しかしながら、 Zehnderらにより、 Acinetobacter johnsonii由来の P APは、 AMPに特異的で、 GMPへは若干のリン酸転移が認められ、他のヌクレオチド (CMP、 UMP、 IMP) へのリン酸転移は全く認められなかった.と報告されていることから (Appl. Environ. Microbiol., 66, 2045-2051 (2000)) 、ヌクレオシドモノリン酸の酵素的なリン酸化によるヌクレオシドジリン酸の合成に P A Pは利用できないと思われていた。

本発明者らは、上記新知見を基にさらに研究を重ね、本発明を完成させた。したがって、本発明は、下記の理化学的性質を有する PAP (本発明の PAP) に関するものである。

(A) 作用：下記の 2つの反応を触媒する。

NMP+ P o 1 y P_(n) → NDP + Po l yP_(n__n

dNMP+ P o 1 y P_(n) → dNDP + Po I yP_(n—

(式中、 NMPはヌクレオシドモノリン酸、 NDPはヌクレオシドジリン酸、 d NMPはデォキシヌクレオシドモノリン酸、 dNDPはデォキシヌクレオシドジリン酸、 nはポリリン酸の重合度を示し、 100以下の整数である。）

(B) 基質特異性： AMP、 GMP、 I MP, dAMP、 dGMPに特異的で、 CMP、 UMP、 d CMP, TMPにも作用する。

(C) 分子量：約 55〜56Kd (キロダルトン）である。

(D) 比活性：酵素蛋白 Img当たり、 70単位（ユニット）以上である。また、本発明は、配列番号 1に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する P A Pに関するものである。

さらに、本発明は、配列番号 1に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする P AP遺伝子に関するものである。

さらにまた、本発明は、配列番号 2に示す塩基配列又は該塩基配列の一若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する PAP遺伝子に関するものである。

また、本発明は、上記遺伝子とストリンジ工ン卜な条件下で八イブリダィズし、かつ P A P活性を有するポリペプチドをコードする D N A断片に関するものである。

さらに、本発明は、ヌクレオシドモノリン酸からヌクレオシドジリン酸を酵素的に製造する方法であって、酵素として上記本発明の P A Pを使用し、リン酸ドナ一としてポリリン酸を使用する、ヌクレオシドジリン酸の製造法に関するものである。

さらにまた、本発明は、 AMPから ATPを酵素的に製造する方法であって、酵素として上記本発明の P A Pとアデ二レートキナーゼの二種の酵素を使用し、リン酸ドナ一としてポリリン酸を使用する、 ATPの製造法に関するものである。

また、本発明は、 AMP、ポリリン酸、 PAP及びアデ二レートキナ一ゼから成る ATPの生成 ·再生系において、 PAPとして上記本発明の PAPを使用する ATPの生成 ·再生系に関するものである。

最後に、本発明は、 AT Pを消費する酵素反応を利用した化合物の製造法において、生成した AMPを、ポリリン酸、 PAP及びアデ二レートキナーゼカゝら成る AT Pの再生する系を利用して再生する際、 P APとして本発明の P A Pを使用する、 AMPから ATPに再生しなから当該酵素反応を行うことを特徴とする当該化合物の製造法に関するものである。図面の簡単な説明

図 1は、取得された Acinetobacter Johnsonii 210 A株の PAP遺伝子を含有する約 10Kbの DNA断片の制限酵素地図を示す。 PAP遺伝子は、 Sacl H pal DNA断片中に含まれる。図 2は、 PAP遺伝子を含む 2. 5 k b D N A断片の塩基配列及び P A Pのアミノ酸配列を示す（その 1) 。

図 3は、 PAP遺伝子を含む 2. 5 kb DN A断片の塩基配列及び P APのアミノ酸配列を示す（その 2) 。

図 4は、本発明 PAPの pH安定性の結果を示す。

図 5は、本発明 PAPの至適 pHの結果を示す。

図 6は、本発明 PAPの熱安定性の結果を示す。

図 7は、本発明 P A Pの至適温度の結果を示す。

図 8は、ポリリン酸をリン酸ドナーとした PAPとアデ二レートキナーゼによる AMPからの ADP及び AT Pの合成を示す。発明を実施するための最良の形態

(1) 本発明の PAP

本発明の PAPは、下記の理化学的性質を有するものである（後述の実施例参照）。

(A) 作用：下記の 2つの反応を触媒する。

NMP+ P o 1 y P_(n) → NDP + Po l yP_(n—

dNMP+ P o 1 y P_(n) → dNDP + P o 1 yP -D

(式中、 NMPはヌクレオシドモノリン酸、 NDPはヌクレオシドジリン酸、 d N M Pはデォキシヌクレオシドモノリン酸、 dNDPはデォキシヌクレオシドジリン酸、 nはポリリン酸の重合度を示し、 100以下の整数である。）

(B) 基質特異性： AMP、 GMP、 I MP, dAMP、 dGMPに特異的で、 CMP、 UMP、 dCMP、 TMPにも作用する。

(C) 分子量：約 55〜56Kd (キロダルトン）である。

(D) 比活性：酵素蛋白 Img当たり、 70単位（ユニット）以上である。

(E) 至適 pH： 8. 5付近

6 3/06646

(F) 至適温度： 50 付近

(E) pH安定性： 7〜9付近

(F) 熱安定性： 5 O :付近まで安定

ただし、ここで言う 1単位（ユニット）とは、 37°Cで 1分間に 1 ^mo 1 e の AD Pを生成する活性を意味し、以下の条件で測定したものである。

<測定条件 >

2 OmM塩化マグネシウム、 1 OmM AMP, 及びポリリン酸（無機リン酸として 30mM) を含有する 5 OmMトリス塩酸緩衝液（pH7.8) に酵素標品を添加して、 37 °Cで保温することで反応を行い、 100°C、 1分間の熱処理により反応を停止させ、高速液体クロマトグラフィー（HPLC) を用いて反応液中の ADP を定量する。

本発明の PAPは、配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有する。特に、組換え DNA法で調製された組換え PAPは、酵素活性的に実質的に純粋で、 AMP のリン酸化に不利な AMP分解活性を保有していない。

また、該アミノ酸配列は、上記反応を触媒する活性を維持する限りにおいて、 1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾又は付加されていてもよい。上記のアミノ酸配列の欠失、置換、修飾又は付加は、出願前周知技術である部位特異的突然変異誘発法（例えば、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4662-5666 (1984) 、 Nucleic Acid Res. 10, 6487-6500(1982)； ature 316, 601-605(198 5)など）などにより実施することができる。また、本発明の PAPには、上記反応を触媒する活性を維持する限りにおいて、配列番号 1に示すアミノ酸配列と 9 0%以上、より好ましくは 95%以上の相同性を有する酵素も含まれる。

本発明の PAPは、 Acinetobacter jotmsoniiから配列番号 1に示すアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子、具体的には配列番号 2に示す塩基配列からなる PAP遺伝子をクローニングし、これを使用して調製する。たとえば、 Ac inetobacier johnsonii由来の遺伝子を具体例として挙げて説明すれば、図 2及び 3は図 1に示す制限酵素地図中の S a c I及び Hp a Iで切断される DN A断片の塩基配列を解析した結果を示したものであり、図 2及び 3の塩基番号 604 〜 2031番目に示す配列が P A Pの構造遺伝子に相当し、上記配列番号 2に示す塩基配列と同一のものである。

本発明においては、本発明の P A Pを生産することができる限りにおいて、配列番号 2で示される塩基配列中の 1個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された遺伝子、又はそれらの遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする遺伝子、さらに配列番号 2で示される塩基配列と 90%以上、より好ましくは 95 %以上の相同性を有する遺伝子も利用することができる。なお、 1個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された遺伝子とは、上述のアミノ酸配列と同様に、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により欠失、置換、修飾又は付加できる程度の数の塩基が欠失、置換、修飾又は付加されることを意味する。また、ストリンジエンドな条件下とは、 5XSSC

(1 XSSCは塩化ナトリウム 8.76g、クェン酸ナトリウム 4.41gを 1リツトルの水に溶かしたもの）、 0. 1 %w/v N—ラウロイルザルコシン 'ナトリウム塩、 0. 02% wZv SDS、 0. 5% wZvブロッキング試薬を含む溶液を用い、 60°Cで 20時間程度反応温度条件下でハイブリダィゼーシヨン反応を行なうことを意味する。

さらに、本発明では、 PAPをコードする遺伝子の上流にさらに SD配列（Shi ne-Dalgarno Sequence)を含んでなる遺伝子も利用することができ、このような遺伝子を利用することで、酵素の生産量を著しく増加させることができる点で好適である。

このような遺伝子のクロ一エング、クローン化した DNA断片を用いた発現べクタ一の調製、発現ベクターを用いた PAPの調製などは、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、具体的には、例えば「Molecular C1 oningj (Maniatisら編、 Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harb PC翻襄 646 or、 New York(1982)) に記載の方法に従って行うことができる。

たとえば、 Ac i ne t obac t er属に属する微生物から精製した P A Pの N—末端、 C一末端などのアミノ酸配列の一部を既知の方法で決定し、それに相当するオリゴヌクレオチドを合成する。合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして Acin etobacter属に属する菌体の染色体 DNAより P APをコードする遺伝子を含有する DNA断片をクローニングすればよい。また、適当な制限酵素で染色体 DN Aを切断し、得られた D N A断片を用いて常法によりゲノムライブラリ一を作成し、作成したゲノムライブラリーの中から、 PAP活性を基にスクリーニングすることで、目的とする遺伝子をクローニングすることができる。

なお、 PAPは高度に精製すると失活する可能性が高いので、 PAP活性を利用したスクリーニング系を使用することが望ましい。そして、スクリーニングに利用する P A P活性としては、より高感度に検出可能とするため、 PAPとポリリン酸キナーゼ（P P K) を組み合わせた AMPから AT Pの生成活性を利用するのが好ましい。具体的には、 PAPと PPKを用い、放射性同位元素で標識したポリリン酸をリン酸ドナ一として、 AMPを基質として AT Pを生成させ、放射標識された AT Pの生成を検出すればよい。

クローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及び簡便性から大腸菌を宿主とするのが適当である。

クローン化した遺伝子の高発現系を構築するためには、たとえばマキザムーギルバ一トの方法 (Methods in Enzymology, 65, 499 (1980) ) もしくはダイデォキシチェ一ンターミネ一夕一法 (Methods in Enzymology, 101, 20(1983)) などを応用してクローン化した DNA断片の塩基配列を解析して該遺伝子のコーディング領域を特定し、宿主微生物に応じて該遺伝子が微生物菌体中で自発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。

PAPを異種微生物内で大量に産生させるために使用する発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、 PAPの生産量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。このような転写開始シグナルとしては、宿主として大腸菌を用いる場合には、 l a cプロモー夕 ―、 t r pプロモーター、 t a cプロモータ一（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 80, 21 (1983) 、 Gene, 20, 231 (1982)) 、 t r cプロモ一夕一（J. Biol. Che m., 260, 3539 (1985)) などを例示することができる。

ベクタ一としては、種々のプラスミドベクター、ファージベクターなどが使用可能であるが、微生物菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクタ一を使用するのが望ましい。具体的に大腸菌を宿主とする場合には、 PBR 322 (Gen e, 2， 95(1975))、 pUC18, pUC19(Gene、 33, 103 (1985)) などを例示することができる。

作製した組換えべクタ一を用いて微生物を形質転換する。宿主となる微生物としては安全性が高く取扱いやすいものであれば特に限定されない。例えば、大腸菌、酵母など DN A組換え操作に常用されている微生物を使用することができる。その中でも、大腸菌が有利であり、例えば組換え DNA実験に使用される K 12株、 C 600菌、 J Ml 05菌、 JM 109菌（Gene, 33, 103-119 (1985)) などが使用可能である。

微生物を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、宿主として使用する微生物に応じて適宜選択すればよい。例えば大腸菌を宿主として使用する場合、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法

(J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) により大腸菌を形質転換することができる。得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化した PAP遺伝子の発現を誘導して菌体内に当該酵素が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、大腸菌を宿主として使用する場合、培地として 2xYT培地（Methods in Enzymolog y, 100, 20 (1983)) 、 LB培地、 M9CA培地 (Molecular Cloning, 前述）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、 20〜40°Cの培養温度で必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。

培養中に PAP遺伝子の発現を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。例えば、 1 acプロモ一ターや t a cプロモ一夕一を使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル— jS— D—チォガラクトピラノシド（以下、 IPTGと略称する）を適当量添加する。

このようにして調製した培養物から膜分離あるいは遠心分離処理などにより菌体を回収する。回収した菌体は、菌体それ自体を PAPとして利用することも可能であるが、回収した菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより物理的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチーム処理など酵素的に溶菌させ、菌体残さを遠心分離により除去して無細胞抽出液を調製し、この無細胞抽出液を P A Pとして利用する方が好適である。この無細胞抽出液内には PAPが過剰に存在しているため、特に精製処理を施さなくとも酵素源として利用可能であるが、さらに、熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、又は数種組み合わせて得られる粗精製物又は精製物を PAPとして利用してもかまわない。

(2) 本発明の PAPの利用

このようにして調製した本発明の P A Pは、ヌクレオシドジリン酸又はデォキシヌクレオシドジリン酸の合成、 AT Pの合成もしくは再生等に利用可能である。

まず、ヌクレオシド 5 ' ージリン酸 (■) 又はデォキシヌクレオシド 5 ' 一ジリン酸（dNDP) の合成に使用するヌクレオシド 5' —モノリン酸（丽 P) 又はデォキシヌクレオシド 5' —モノリン酸（d丽 P) は、市販のものが使用できる。使用濃度としては、例えば 1〜20 OmM、好ましくは 10〜10 OmMの範囲から適宜設定することができる。

また、使用するポリリン酸も市販のものが使用できる。使用濃度としては、無機リン酸に換算して 1〜100 OmM、好ましくは 10〜20 OmMの範囲から適宜設定することができる。また、ポリリン酸の重合度（n) としては、 100 以下、好ましくは 10〜50程度の重合度のものが好ましい。

NDP又はdNDPの合成反応は、 pH4〜9の範囲の適当な緩衝液中に NM P又は dNDPとポリリン酸を添加し、さらに 0. 001ユニット /m 1以上、好ましくは 0. 001〜10ユニット Zmlの本発明の PAPを添加し、 20°C 以上、好ましくは 30〜40°Cで 1〜50時間程、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。

生成した NDP又は dNDPの単離精製は、各種クロマトグラフィ一処理など公知の方法により行うことができる。

次に、 AT Pの合成は、ポリリン酸の存在下、本発明の P A Pとアデ二レートキナ一ゼを併用し、 AMPを AD P続けて AT Pに変換することで実施することができる。

反応液に添加する AMPは、市販のものが使用できる。使用濃度としては、例えば 1〜 200 mM、好ましくは 10〜 100 mMの範囲から適宜設定することができる。

また、添加するポリリン酸も市販のものが使用できる。使用濃度としては、無機リン酸に換算して:！〜 100 OmM、好ましくは 10〜20 OmMの範囲から適宜設定することができる。また、ポリリン酸の重合度（n) としては、 100 以下、好ましくは 10〜50程度の重合度のものが好ましい。

ATPの合成反応は、 pH4〜 9の範囲の適当な緩衝液中に、 AMP及びポリリン酸を添加し、さらに 0. 001ユニット/ ml以上、好ましくは 0. 001 〜10ユニット/ m 1の本発明の PAP、及び 0. 01ユニット Zml以上、好ましくは 0. 01〜100ュニット Zml以上のアデ二レートキナーゼを添加し、 20 °C以上、好ましくは 30〜 40 °Cで 1〜 50時間程、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。

生成した A T Pの単離精製は、各種クロマトグラフィ一処理など公知の方法により行うことができる。

なお、アデ二レートキナーゼ活性の単位（ユニット）は次の方法で測定、算出する。すなわち、 1 OmM塩化マグネシウム、 1 OmM AMP、及び 1 OmM ATPを含有する 50 mM トリス塩酸緩衝液（pH7.8) に酵素標品を添加して 37 Cで保温することで反応を行い、 100°C、 1分間の熱処理により反応を停止させる。 HP LCを用いて反応液中の ADPを定量し、 37でで1分間に2 mo 1 eの ADPを生成する活性を 1単位（ユニット）とする。

また、 AMP、ポリリン酸、本発明の PAP及びアデニレ一トキナ一ゼから成る ATPの生成 ·再生系は、微量 ATPの存在を検出し、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できる生物発光によるアデニンヌクレオチドの検査方法に応用可能である（WOO 1/53513等参照）。

さらに、 AT Pを消費する酵素反応を利用した化合物の製造法において、生成した AMPを、ポリリン酸、本発明の PAP及びアデ二レー卜キナーゼから成る AT Pの再生する系を利用することで、 AMPから AT Pに再生しなから目的とする化合物の酵素合成反応を効率的に行うことができる。

このような ATP再生系と組み合わせ可能な酵素反応系としては、たとえば、ガラクトキナーゼを用いたガラクトースー 1一リン酸合成系、 UMPキナーゼを用いた UD P合成系、コリンキナーゼを用いたホスホコリン合成系などを例示することができるが、これに限定されず、 AT Pを消費する酵素反応であれば適用可能である。

このような ATP合成系と酵素反応との反応条件は、小規模試験にて適宜決定すればよく、また目的化合物の単離精製も公知の方法により行うことができる。実施例

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。また、実施例における DNAの調製、制限酵素による切断、 T 4 D N Aリガーゼによる D N A連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular cloning II」 (Sambrookら編、 Cold spring Harbor Laboratory, C old Spring Harbor, New York(1989)) に従って行った。また、制限酵素、及び Amp 1 i Ta qDNAポリメラ一ゼ、 T 4 DNAリガーゼなどの DNA関連酵素はすべて宝酒造（株）より入手した。さらに、反応液中のヌクレオチド類の定量には HP LC法により行った。具体的には、分離には YMC社製の ODS—A Q312カラムを用い、溶出液として 0. 5M リン酸一カリウム溶液を用いた。実施例 1 ；本発明 PAPの調製

(1) Acinetobacter johnsonii 210株の PAP遺伝子のクローニング

(1 -1) 大腸菌ポリリン酸キナーゼ及び放射性標識ポリリン酸の調製

文献 (J. Biosci. Bioeng., 91, 557-563 (2001)) に記載された方法で大腸菌ポリリン酸キナーゼを調製した。さらに調製した大腸菌ポリリン酸キナーゼを用いて秋山らの方法 . Biol. Chem. , 268, 633-639 (1993)) に従い放射性標識ポリリン酸を調製した。 . (1-2) Acinetobacter Johnsoniiゲノムライブラリ—の作製とスクリーニング

Acinetobacter johnsonii 210 A株を LB培地に植菌し、 30°Cでー晚振とう培養した。遠心分離により菌体を回収し、染色体 DNAを精製した。 Acinetobacter johnsonii染色体 DMを制限酵素 Sau3AIで部分分解した後、蔗糖密度勾配遠心により分画し、約 7— 10Kbの画分を回収した。該 DNA断片と BamHIで切断したプラスミドベクター pBlueScript SK(+) (東洋紡より購入）を T4 DNA ligas eにより連結し、該 DNA液を用いて大腸菌 JM109株（宝酒造より購入）を形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換体 6000株を単離し、 50ずつグループ化した。

各グループを LB培地で 37°Cで一晩培養し、遠心分離により菌体を回収後 2 OmM Tris- HCl(pH8.0)で菌体を洗浄し、同緩衝液で菌体を再縣濁した。菌体縣濁液に等量の BugBuster (宝酒造より購入）を加え、室温で 30分放置し溶菌させたのち、 3倍容の 2 OmM Tris- HCKpHS.O)を加えて、菌体抽出液とした。先に調製した放射性標識ポリリン酸（リン酸として 0.24mM) を含有する活性検出液（50mM トリス塩酸 (pHS.O), 40raM (NH₄)₂S0₄, 4mM MgCl₂, lmM AMP) 2 0 1に菌体抽出液 1 xlを加え、 37°Cで 1時間反応させた。該反応液を薄層クロマトグラフィー（展開液： 0.75M K¾P0₄ (pH 3.5)) にかけ、ホスホイメージアナラィザ一 BASS2000 (Fujix製）で AD Pの生成を検出することで、得られた形質転換体のスクリーニングを行い、 6000株中 1クローンに PAP活性が検出された。

得られたクローンより、 Acinetobacter johnsonii 21 OA株の PAP遺伝子が揷入されたプラスミド P PAP 2を得た（図 1) 。なお、プラスミド pPAP 2は、約 10 k bの Acinetobacter johnsonii 210 A株の染色体 DNA力揷入されており、プラスミド DNA (pPAP2) の表記で、平成 14年（2002) 5月 2 1日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央 6 (郵便番号 305-8566)) にブタぺスト条約に基づく国際寄託がなされ、受託番号として FERM BP— 8047を与えられている。

(1-3) Acinetobacter johnsonii 210株の PAP遺伝子の解析

p PAP 2の含有する 10 Kbの Acinetobacter johnsonii 210 A株の DN Aを種々のプラスミドにサブクロ一ニングし、それら形質転換体の PAP化活性を前述の方法で測定した結果、約 2. 5 kbの Sacl- Hpal DNA断片に PAP遺伝子が存在することが、確認された（図 1) 。この DNA断片の塩基配列をダイデォキシチェイン夕一ミーネーター法（Science, 214, 1295 (1981)) で決定した。その結果、 PAP遺伝子は、 475アミノ酸から成るポリペプチド（分子量； 55.8kd) をコードしていることが判明した（図 2及び 3) 。

(2) Acinetobacter johnsonii PAPの調製

プラスミド pPAP 2を保持する大腸菌 JM109菌をアンピシリンを 100 g/ml含有する 2 X YT培地で 28°Cで一晩培養した。遠心分離により菌体を回収し、 50mM トリス塩酸 (pH 7.8) ， ImM ED T Aからなる緩衝液に縣濁し、超音波処理後、遠心分離により菌体抽出液を回収した。得られた抽出液中の PAPの活性を測定したところ、 PAPは、培養液 lml当たり 18. 1ュニットの生産量であり、対照（プラスミドを保持していない大腸菌 JM109) の約 90 00倍の活性であった。

なお、この生産性は、 Acinetobacter Johnsoniiによる PAPの生産性の約 1 50倍に相当する。該抽出液を DEAEトヨパール 650M (1 ソ一）によるイオン交換クロマトグラフィー（溶出液： 50mM トリス塩酸 (pH 7.8), 0〜0.5M NaClの濃度勾配）で分画することで、 PAPを部分精製し、回収された画分を酵素標品とした。なお、該画分における PAPの比活性は、 80. 5ユニット Zmg 蛋白質であった。

(3) PAPの諸性質の解析

(3- 1) 各種 NDPの合成（基質特異性の解析） 100mM MgCl₂、ポリリン酸（無機リン酸として lOmM) 、 5mM各種 NMP また d NM Pを含有する 50 mMトリス塩酸緩衝液 (pH 8.0) に種々の濃度で P APを添加し、 37°Cで 10分間保温した。 100°Cで 1分間の熱処理により反応を停止させ、反応終了液を HP L Cにて生成した ND Pもしくは d NMPを定量した。 AMPのリン酸化における PAPの比活性を 100%として、各種 NM Pもしくは dNMPにおける比活性の相対値を表 1に示す。基質比活性（相対値）

AMP 100 %

GMP 10

CMP 0.09

UMP 0.13

IMP 2.2

d層 18

dGMP 2.6

dCMP 0.008

TMP. 0.012

(3-2) pH安定性

各 pHに設定した 50 mMマレイン酸塩あるいは 5 OmMトリス塩酸緩衝液中、 10 OmM 塩化マグネシウム存在下で 37°Cで 10分間保温し、残存活性を測定した。残存活性は、 5 OmM トリス緩衝液（pH 8.0) 、 10 OmM塩化マグネシウム、 5mM AMP、ポリリン酸（無機リン酸として 1 OmM) 存在下で 37°Cで 10分間の反応を行い、生成した ADPを H PLCで定量することで測定した。

その結果、図 4に示すように、 p H 8の酵素活性を 100とした場合、本酵素は pH7〜9で 80 %以上の酵素活性を示すことが判明した。

(3— 3) 至適 pH

各 pHに設定した 5 OmM マレイン酸塩あるいは 5 OmMトリス緩衝液中、 10 OmM塩化マグネシウム、ポリリン酸（無機リン酸として 1 OmM) 、 5mM AMP存在下で 37°Cで 10分間反応を行い、生成した ADPを HPLCで定量することで測定した。

その結果、図 5に示すように、本酵素の至適 pHは 8. 5であった。

(3-4) 熱安定性

10 OmM塩化マグネシウムを含む 5 OmM トリス塩酸緩衝液 (pH8.0) 中でポリリン酸（無機リン酸として 10mM) 存在、もしくは非存在下で各温度に設定した湯浴中にて 10分間保温して、上述の方法で残存活性を測定した。

その結果、図 6に示すように、ポリリン酸存在下で、本酵素は 50°Cまで安定であることが判明した。

(3-5) 至適温度

10 OmM塩化マグネシウムを含む 5 OmM トリス塩酸緩衝液（pH8.0) 中でポリリン酸（無機リン酸として 1 OmM) 及び 5mM AMP存在下で各温度に設定した湯浴中にて 10分間保温し、生成した ADPを HPLCで定量することで酵素活性を測定した。

その結果、図 7に示すように、本酵素の至適反応温度は 50°Cであることが判明した。実施例 2 ： PAPとアデ二レートキナ一ゼによる AT Pの合成

(1) 大腸菌アデ二レートキナーゼの調製

大腸菌アデ二レートキナーゼは、文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14 168-14171 (2000)) 記載の方法で調製した。ただし、超音波処理により調製された菌体抽出液を酵素液とし、該酵素液におけるアデ二レートキナーゼの比活性は、 12. 5ユニット/ mg蛋白質であった。

(2) AT Pの合成

2 OmM MgCl₂、ポリリン酸（無機リン酸として 30 ）、 1 OmM AMPを含有する 50 mM トリス塩酸緩衝液 (pH7.8) に、 P A Pを 1. 5ユニット Zm 1、アデ二レートキナーゼを 0. 4ユニット/ m 1となるように添加し、 37°C で 60分保温した。反応終了後反応液中のヌクレオチドを HPLCを用いて定量した。

その結果、図 8に示すように、 AMPは PAPにより速やかにリン酸化され A D Pが生成し、さらに共存するアデ二レートキナーゼの触媒により生成した AD Pは速やかに AT Pと AMPに変換され、このサイクルを繰り返すことで、 AT Pが蓄積することが確認された。実施例 3 ： PAPとアデ二レートキナ一ゼの組み合わせからなる AT P再生系によるガラクトース— 1ーリン酸の合成

(1) 大腸菌ガラク卜キナーゼの調製

大腸菌ガラクトキナーゼ遺伝子を含有するプラスミド PDR 540 (Gene, 2 0, 231 (1982)、フアルマシア社より入手）を保持する大腸菌 JM109菌を、 1 00 g/mlのアンピシリンを含有する 2 xYT培地に植菌し、 37 °Cで振とう培養した。 4x 10⁸菌 Zm 1に達した時点で、培養液に終濃度 ImMになるように I PTGを添加し、さらに 30°Cで 5時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、 30mlの緩衝液 (50mM トリス塩酸 (pH7.8) 、 ImM EDTA) に懸濁した。菌体縣濁液を超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離により菌体残さを除去した。回収液を DEAEトヨパール 650M (トーソ一）によるイオン交換クロマトグラフィー（溶出液： 50mM トリス塩酸 ( H 7.8), 0〜0.5M NaClの濃度勾配）で分画することで、ガラクトキナーゼを部分精製し、回収された上清をガラクトキナーゼ酵素液とした。酵素液におけるガラクトキナ一ゼの比活性は、 6. 5ユニット Zmg蛋白質であった。

なお、ガラクトキナーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものである。 5mM MgCl₂、 1 OmM ATP、 1 OmM ガラク卜ースを含有する l O OmM トリス塩酸緩衝液（ρΗ7·8) に酵素標品を添加して、 3 7 °Cで保温することで反応を行い、 100°C、 1分間の熱処理により反応を停止させる。糖分析装置（ダイォネックス社）を用いて反応液中のガラク卜一スー 1 一リン酸を定量し、 37°Cで 1分間に 1 m o 1 eのガラク ] ス— 1一リン酸を生成する活性を 1単位（ユニット）とする。

(2) ガラクトースー 1一リン酸の合成

20mM MgCl₂、ポリリン酸（無機リン酸として 30 ）、 5mM AMP及び 5 OmM (d)ガラクト一スを含有する 5 OmM トリス塩酸緩衝液（pH7.8) に 0. 2ユニット Zml PAP及び 0. 2ユニット/ ml アデ二レートキナーゼを添加し、さらに 0. 5ユニット Zm 1となるようにガラクトキナーゼを添加し、 37 °Cで 8時間保温した。なお、反応中 2時間後及び 4時間後にポリリン酸を無機リン酸として 2 OmMとなるように添加した。反応終了液を糖分析装置（ダィォネックス社）を用いて分析したところ、 37. 8mMのガラクトースー 1一リン酸の生成が確認された。

実施例 4：ヌクレオチドジリン酸の合成

(1) 各種 NDPの合成

10 OmM MgCl₂、ポリリン酸（無機リン酸として 30mM) 、 1 OmM各種 NM P (AMP, GMP, CMP, UMP, IMP) を含有する 50 mM トリス塩酸緩衝液に、 16ュニット Zm 1となるように PAPを添加し、 37 °Cで 30分間保温した。反応液を HPLCにて分析した結果を表 2に示す。なお、対照に大腸菌 JM109の菌体抽出液を用いた場合、 ND Pの生成は認められなかった。

表 2

基質生成した NDP

AMP 6.76mM ADP

GMP 7.16mM GDP

CMP 0.98mM CDP

UMP 0.85mM UDP

IMP 6.75mM I DP (2) I DPの酵素合成

l OOmM MgCl₂、ポリリン酸（無機リン酸として 65mM) 、 4 OmM IMP を含有する 50mM トリス塩酸緩衝液に、 16ユニット Zmlとなるように PA Pを添加し、 37 °Cで 19時間保温した。反応液を HP LCにて分析した結果、 2 1. 2 mMの I D Pの生成が確認された。産業上の利用可能性

本発明により、新規な PAP及びその遺伝子が提供され、従来大量調製が不可能であった P A Pを容易に大量に調製することが可能となった。このことから、 AM Pからの効率的かつ安価に AT Pを合成又は再生することが可能となり、 A T Pを消費する酵素反応系と組み合わせることにより、消費された AT Pを再生し、効率的に目的とする化合物を合成することも可能となった。

また、本発明の PAPは従来の PAPと異なり、 AMP以外の他のヌクレオシド 5' — ΐノリン酸又はデォキシヌクレオシド 5' —モノリン酸の合成のリン酸化活性も有しており、各種ヌクレオシド 5' —ジリン酸又はデォキシヌクレオシド 5' —ジリン酸を酵素的に容易に調製可能である。

Claims

請求の範囲

1. 下記の理化学的性質を有するポリリン酸： AMPリン酸転移酵素。

(A) 作用：下記の 2つの反応を触媒する。

NMP+ P o 1 y P_(n) → NDP + Po l y P ^

dNMP+ Po l yP_(n) → dNDP + Po l y P _(n.₀

(B) 基質特異性： AMP、 GMP、 IMP, dAMP、 dGMPに特異的で、 CMP、 UMP、 dCMP、 TMPにも作用する。

(C) 分子量：約 55〜56Kd (キロダルトン）である。

(D) 比活性：酵素蛋白 lmg当たり、 70単位（ユニット）以上である。ただし、 1単位（ユニット）とは、 37°Cで 1分間に 1 mo 1 eの ADPを生成する活性を示し、以下の条件で測定する。

<測定条件 >

2 OmM塩化マグネシウム、 10mM AMP、及びポリリン酸（無機リン酸として 30mM) を含有する 50 mMトリス塩酸緩衝液（pH7.8) に酵素標品を添加して、 37 °Cで保温することで反応を行い、 100 ° (、 1分間の熱処理により反応を停止させ、高速液体クロマトグラフィー（HPLC) を用いて反応液中の ADP を定量する。

2. 配列番号 1に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリリン酸： AM Pリン酸転移酵素。

3. 配列番号 1に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコ一ドするポリリン酸： AM Pリン酸転移酵素遺伝子。

4. ポリリン酸： AM Pリン酸転移酵素遺伝子が、配列番号 2に示す塩基配列又は該塩基配列の一若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものである、請求項 3記載の遺伝子。

5 . 請求項 3又は 4記載の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつポリリン酸： AM Pリン酸転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする D N A断片。

6. ヌクレオシドモノリン酸からヌクレオシドジリン酸を酵素的に製造する方法であって、酵素として請求項 1又は 2記載のポリリン酸： AM P リン酸転移酵素を使用し、リン酸ドナ一としてポリリン酸を使用する、ヌクレオシドジリン酸の製造法。

7 . AM Pから AT Pを酵素的に製造する方法であって、酵素として請求項 1 又は 2記載のポリリン酸： AM P リン酸転移酵素とアデ二レートキナーゼのニ種の酵素を使用し、リン酸ドナ一としてポリリン酸を使用する、 AT Pの製造法。

8 . AM P、ポリリン酸、ポリリン酸： AM P リン酸転移酵素及びアデニレートキナーゼから成る AT Pの生成 ·再生系において、ポリリン酸： AM P リン酸転移酵素として、請求項 1又は 2記載の酵素を使用する A T Pの生成 ·再生系。

9 . AT Pを消費する酵素反応を利用した化合物の製造法において、生成した AM Pを、ポリリン酸、ポリリン酸： AM P リン酸転移酵素及びアデ二レートキナーゼから成る AT Pの再生系を利用して再生する際、ポリリン酸： AM P リン酸転移酵素として請求項 1又は 2記載の酵素を使用する、 AM Pから AT P に再生しなから当該酵素反応を行うことを特徴とする当該化合物の製造法。