JP6439220B2 - 補酵素の製造方法及び補酵素製造用形質転換体セット - Google Patents
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Description
本発明は、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを必要とする酵素反応系において、ＮＡＤ＋の分解産物からＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを合成する方法、及び当該方法に用いるＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを製造するための形質転換体セットに関する。
本願は、２０１５年２月２４日に、日本に出願された特願２０１５−３３８４３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１５年２月２４日に、日本に出願された特願２０１５−３３８４３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
近年の遺伝子改変技術の発達に伴い、微生物を合成反応の反応系として用い、有用な有機化合物を微生物が備える代謝経路を利用して製造する方法が、工業上の量産にも利用されつつある。さらに、より効率よく有機化合物を合成するために、生きた微生物の代謝経路を改変するのではなく、複数の代謝酵素を予めモジュール化し、これらを任意に組み合わせることによって物質生産に特化した合成経路を人工的に構築すること（人工代謝システム）も試みられている。人工代謝システムを利用した方法により、例えば、グルコースやグリセロールから乳酸、リンゴ酸、１−ブタノールなどが選択的かつ高収率に生産できたことが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。
モジュール化して使用される代謝酵素（酵素モジュール）は、微生物に当該代謝酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換体に産生させることにより、安価かつ簡便に提供可能である。中でも、酵素モジュールとしては、物理的及び化学的な安定性に優れており、工業的利用に適していることから、耐熱性酵素を使用することが好ましい。耐熱性酵素を微生物によって産生する方法としては、例えば、非耐熱性の抗酸菌に目的の耐熱性酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養して当該形質転換体内に耐熱性酵素を産生させた後、培養された菌体物を加熱処理することによって、形質転換体の死滅菌体内に固定化された耐熱性酵素を得る方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。当該方法では、宿主である抗酸菌に由来するタンパク質が全て失活されており、目的の耐熱性酵素のみが活性を保持した状態で形質転換体の死滅菌体内に固定化されているため、当該死滅菌体をそのまま反応系に添加した場合でも、宿主由来の酵素による副反応が生じないという利点がある。
Krutsakorn，et al.，Metabolic Engineering，2013，vol.20，p.84〜91.
人工代謝システムを利用した方法によれば、基質特異性や合成物の立体選択性に優れ、かつ比較的穏和な条件下で目的の有機化合物を合成することができるという酵素反応の利点を活かし、有機合成では製造が困難であった有機化合物をより効率的に製造することができる。しかし、当該方法は、長時間反応時の安定性に乏しく、結果として得られる目的の有機化合物量は、工業上の量産レベルには未だ達していない。これは、用いる酵素モジュールの安定性の問題ではなく、酵素反応に必要な補酵素、特に酸化還元補酵素であるＮＡＤ＋、ＮＡＤＨの熱分解に起因するためである。長時間安定して目的の有機化合物を合成するためには、熱分解により減少したＮＡＤ＋やＮＡＤＨを反応系外から適宜補充する必要があるが、ＮＡＤ＋等は比較的高価であり、このことが、人工代謝システムを利用した方法の工業上利用が進まない一因となっている。
本発明は、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを必要とする酵素反応系に対して、熱分解により失われるＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを補充するために、当該酵素反応系内においてＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを合成する方法、及び当該方法に用いるＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを製造するための形質転換体セットを提供することを主たる目的とする。
本発明者らは、鋭意研究した結果、ＮＡＤ＋の熱分解産物であるニコチンアミドからＮＡＤ＋をサルベージ合成するための人工代謝経路（ＮＡＤ＋人工合成経路）及びニコチンアミドからＮＡＤＨをサルベージ合成するための人工代謝経路（ＮＡＤＨ人工合成経路）を構築し、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを必要とする酵素反応系に対して、直接ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを外添するのではなく、ＮＡＤ＋人工合成経路又はＮＡＤＨ人工合成経路に必要な代謝酵素を添加し、当該酵素反応系内においてＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを合成することによって、熱分解により失われるＮＡＤ＋又はＮＡＤＨをより安価に補充できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明に係る補酵素の製造方法及び補酵素製造用形質転換体セットは、下記［１］〜［１６］である。
［１］ ＮＡＤ＋を必要とする酵素反応系に、ＡＤＰ−リボースとニコチンアミドからＮＡＤ＋を合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素を添加することにより、前記酵素反応系内においてＮＡＤ＋の合成を行う補酵素の製造方法であって、
前記耐熱性酵素が、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋シンターゼ、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、及びリボースリン酸ピロホスホキナーゼである、補酵素の製造方法。
［２］ ＮＡＤＨを必要とする酵素反応系に、ＡＤＰ−リボースとニコチンアミドからＮＡＤＨを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素を添加することにより、前記酵素反応系内においてＮＡＤＨの合成を行う補酵素の製造方法であって、
前記耐熱性酵素が、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋シンターゼ、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ、及びＮＡＤ＋からＮＡＤＨを合成する反応を触媒する酸化還元酵素である、補酵素の製造方法。
［３］ 前記酸化還元酵素が、糖、アルコール、又は有機酸を基質とするデヒドロゲナーゼである、前記［２］の補酵素の製造方法。
［４］ 前記酵素反応系内に、さらに、ＡＭＰ又はＡＤＰからＡＴＰを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素を添加し、前記酵素反応系内においてＡＴＰの合成を行う、前記［１］〜［３］のいずれかの補酵素の製造方法。
［５］ 前記ＡＴＰを合成するための反応に要する耐熱性酵素が、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼである、前記［４］の補酵素の製造方法。
［６］ 前記耐熱性酵素が、非耐熱性微生物の発現系によって合成されたものである、前記［１］〜［５］のいずれかの補酵素の製造方法。
［７］ 前記耐熱性酵素が、非耐熱性微生物を宿主とし、耐熱性酵素をコードしている遺伝子を導入した形質転換体が合成したものである、前記［１］〜［６］のいずれかの補酵素の製造方法。
［８］ 前記形質転換体を培養して得られた菌体の加熱処理物を、前記酵素反応系に添加する、前記［７］の補酵素の製造方法。
［９］ 前記非耐熱性微生物が大腸菌である、前記［６］〜［８］のいずれかの補酵素の製造方法。
［１０］ 前記［１］〜［９］の補酵素の製造方法に用いられる補酵素製造用形質転換体セットであって、
非耐熱性微生物を宿主とし、ＡＤＰ−リボースとニコチンアミドからＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素をコードしている遺伝子が導入された１種又は２種以上の形質転換体からなることを特徴とする、補酵素製造用形質転換体セット。
［１１］ 前記耐熱性酵素が、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋シンターゼ、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、及びリボースリン酸ピロホスホキナーゼである、前記［１０］の補酵素製造用形質転換体セット。
［１２］ 前記耐熱性酵素が、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋シンターゼ、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ、及びＮＡＤ＋からＮＡＤＨを合成する反応を触媒する酸化還元酵素である、前記［１０］の補酵素製造用形質転換体セット。
［１３］ さらに、非耐熱性微生物を宿主とし、ＡＭＰ又はＡＤＰからＡＴＰを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素をコードしている遺伝子が導入された１種又は２種以上の形質転換体を含む、前記［１０］〜［１２］のいずれかの補酵素製造用形質転換体セット。
［１４］ １の形質転換体に１種類の耐熱性酵素をコードする遺伝子が導入されている、前記［１０］〜［１３］のいずれかの補酵素製造用形質転換体セット。
［１５］ 前記非耐熱性微生物が大腸菌である、前記［１０］〜［１４］のいずれかの補酵素製造用形質転換体セット。
［１６］ 前記形質転換体が、加熱処理されたものである、前記［１０］〜［１５］のいずれかの補酵素製造用形質転換体セット。
［１］ ＮＡＤ＋を必要とする酵素反応系に、ＡＤＰ−リボースとニコチンアミドからＮＡＤ＋を合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素を添加することにより、前記酵素反応系内においてＮＡＤ＋の合成を行う補酵素の製造方法であって、
前記耐熱性酵素が、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋シンターゼ、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、及びリボースリン酸ピロホスホキナーゼである、補酵素の製造方法。
［２］ ＮＡＤＨを必要とする酵素反応系に、ＡＤＰ−リボースとニコチンアミドからＮＡＤＨを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素を添加することにより、前記酵素反応系内においてＮＡＤＨの合成を行う補酵素の製造方法であって、
前記耐熱性酵素が、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋シンターゼ、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ、及びＮＡＤ＋からＮＡＤＨを合成する反応を触媒する酸化還元酵素である、補酵素の製造方法。
［３］ 前記酸化還元酵素が、糖、アルコール、又は有機酸を基質とするデヒドロゲナーゼである、前記［２］の補酵素の製造方法。
［４］ 前記酵素反応系内に、さらに、ＡＭＰ又はＡＤＰからＡＴＰを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素を添加し、前記酵素反応系内においてＡＴＰの合成を行う、前記［１］〜［３］のいずれかの補酵素の製造方法。
［５］ 前記ＡＴＰを合成するための反応に要する耐熱性酵素が、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼである、前記［４］の補酵素の製造方法。
［６］ 前記耐熱性酵素が、非耐熱性微生物の発現系によって合成されたものである、前記［１］〜［５］のいずれかの補酵素の製造方法。
［７］ 前記耐熱性酵素が、非耐熱性微生物を宿主とし、耐熱性酵素をコードしている遺伝子を導入した形質転換体が合成したものである、前記［１］〜［６］のいずれかの補酵素の製造方法。
［８］ 前記形質転換体を培養して得られた菌体の加熱処理物を、前記酵素反応系に添加する、前記［７］の補酵素の製造方法。
［９］ 前記非耐熱性微生物が大腸菌である、前記［６］〜［８］のいずれかの補酵素の製造方法。
［１０］ 前記［１］〜［９］の補酵素の製造方法に用いられる補酵素製造用形質転換体セットであって、
非耐熱性微生物を宿主とし、ＡＤＰ−リボースとニコチンアミドからＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素をコードしている遺伝子が導入された１種又は２種以上の形質転換体からなることを特徴とする、補酵素製造用形質転換体セット。
［１１］ 前記耐熱性酵素が、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋シンターゼ、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、及びリボースリン酸ピロホスホキナーゼである、前記［１０］の補酵素製造用形質転換体セット。
［１２］ 前記耐熱性酵素が、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋シンターゼ、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ、及びＮＡＤ＋からＮＡＤＨを合成する反応を触媒する酸化還元酵素である、前記［１０］の補酵素製造用形質転換体セット。
［１３］ さらに、非耐熱性微生物を宿主とし、ＡＭＰ又はＡＤＰからＡＴＰを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素をコードしている遺伝子が導入された１種又は２種以上の形質転換体を含む、前記［１０］〜［１２］のいずれかの補酵素製造用形質転換体セット。
［１４］ １の形質転換体に１種類の耐熱性酵素をコードする遺伝子が導入されている、前記［１０］〜［１３］のいずれかの補酵素製造用形質転換体セット。
［１５］ 前記非耐熱性微生物が大腸菌である、前記［１０］〜［１４］のいずれかの補酵素製造用形質転換体セット。
［１６］ 前記形質転換体が、加熱処理されたものである、前記［１０］〜［１５］のいずれかの補酵素製造用形質転換体セット。
本発明に係る補酵素の製造方法により、熱分解により失われやすいＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを補酵素として必須とする酵素を用いた酵素反応系において、酵素反応開始後に高価なＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを外添せずとも、長時間安定して目的の酵素反応を行うことができる。
また、本発明に係る補酵素製造用形質転換体セットにより、より簡便に、前記補酵素の製造方法を実施することができる。
また、本発明に係る補酵素製造用形質転換体セットにより、より簡便に、前記補酵素の製造方法を実施することができる。
本発明に係る補酵素の製造方法は、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを必要とする酵素反応系に、ニコチンアミドからＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素を添加することにより、前記酵素反応系内においてＮＡＤ＋又はＮＡＤＨのサルベージ合成を行うことを特徴とする。本発明に係る補酵素の製造方法は、ＮＡＤ＋とＮＡＤＨの両方を必要とする酵素反応系に利用してもよい。本発明に係る補酵素の製造方法のうち、ＮＡＤ＋を必要とする酵素反応系に、ＮＡＤ＋を合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素を添加してＮＡＤ＋のサルベージ合成を行う方法を、「ＮＡＤ＋の製造方法」という。本発明に係る補酵素の製造方法のうち、ＮＡＤＨを必要とする酵素反応系に、ＮＡＤＨを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素を添加してＮＡＤＨのサルベージ合成を行う方法を、「ＮＡＤＨの製造方法」という。ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを必要とする酵素反応系内において、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨの熱分解物であるニコチンアミドからＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを合成させることにより、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを直接外添せずとも、熱分解により失われたＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを補充し、当該酵素反応系の目的産物である有機化合物を長時間安定的に合成することができる。
本発明に係るＮＡＤ＋の製造方法において、「ＮＡＤ＋を必要とする酵素反応系」は、細胞外の反応系（いわゆるin vitroの反応系）であって、ＮＡＤ＋を補酵素とする酵素による酵素反応を含む反応系を意味する。当該酵素反応系は、１段階の酵素反応のみからなる反応系であってもよく、２段階以上の酵素反応からなる反応系であってもよい。２段階以上の酵素反応からなる酵素反応系の場合には、少なくとも１の段階がＮＡＤ＋を補酵素とする酵素による酵素反応であればよい。また、ＮＡＤ＋を補酵素とする酵素も、特に限定されるものではなく、目的の有機化合物及び反応経路に基づいて適宜決定することができる。
本発明に係るＮＡＤＨの製造方法において、「ＮＡＤＨを必要とする酵素反応系」は、細胞外の反応系（いわゆるin vitroの反応系）であって、ＮＡＤＨを補酵素とする酵素による酵素反応を含む反応系を意味する。当該酵素反応系は、１段階の酵素反応のみからなる反応系であってもよく、２段階以上の酵素反応からなる反応系であってもよい。２段階以上の酵素反応からなる酵素反応系の場合には、少なくとも１の段階がＮＡＤＨを補酵素とする酵素による酵素反応であればよい。また、ＮＡＤＨを補酵素とする酵素も、特に限定されるものではなく、目的の有機化合物及び反応経路に基づいて適宜決定することができる。
本発明に係る補酵素の製造方法において、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを必要とする酵素反応系としては、中性〜アルカリ性の環境下で行われる反応系が好ましく、ｐＨが７．６〜９．０の弱アルカリ性環境下で行われる反応系がより好ましく、ｐＨが７．８〜８．５の弱アルカリ性環境下で行われる反応系がさらに好ましい。反応系のｐＨが中性〜アルカリ性の場合には、ＮＡＤ＋やＮＡＤＨの熱分解の主たる産物がニコチンアミドとＡＤＰ−リボースになり、本発明に係る補酵素の製造方法により効率よくＮＡＤ＋及びＮＡＤＨを再合成できるためである。
なお、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを必要とする酵素反応系が合成する目的の有機化合物は、特に限定されるものではないが、乳酸、リンゴ酸、ｎ−ブタノール等のように、化学合成品や医薬品、化粧品、飲食品等の原材料として有用な有機化合物であることが好ましい。
本発明に係るＮＡＤ＋の製造方法において、「ニコチンアミドからＮＡＤ＋を合成するための反応」は、ニコチンアミドを基質とする１段階又は２段階以上の酵素反応により、最終的にＮＡＤ＋を合成する酵素反応を意味する。当該反応は、以降、「ＮＡＤ＋サルベージ合成経路」ということがある。ＮＡＤ＋サルベージ合成経路は、いずれかの生物が本来有する天然の代謝経路であってもよく、当該天然の代謝経路を適宜改変したものであってもよく、人工的に合成した代謝経路であってもよい。
ＮＡＤ＋サルベージ合成経路としては、具体的には、例えば、図１に示すように、ＡＤＰ−リボースとニコチンアミドを出発原料とし、ニコチンアミダーゼ（ＮＡａｓｅ）、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＡＴ）、ＮＡＤ＋シンターゼ（ＮＡＤＳ）、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ（ＡＤＰＲＰ）、及びリボースリン酸ピロホスホキナーゼ（ＲＰＫ）を用いた経路が挙げられる。ＡＤＰ−リボースを基質としてＡＤＰ−リボースピロホスファターゼによりリボース−５−リン酸が合成され、リボース−５−リン酸を基質としてリボースリン酸ピロホスホキナーゼによりホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）が合成される。これとは独立して、ニコチンアミドを基質とし、ニコチンアミダーゼによりニコチン酸が合成される。ニコチン酸とホスホリボシルピロリン酸を基質としてニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼによりニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）が合成され、ニコチン酸モノヌクレオチドとＡＴＰからニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼによりデアミノＮＡＤ＋が合成される。このデアミノＮＡＤ＋を基質としてＮＡＤ＋シンターゼによりＮＡＤ＋が合成される。
ＮＡＤ＋サルベージ合成経路としては、また、例えば、図２に示すように、ニコチンアミドを出発原料とし、ＮＭＮヌクレオシダーゼ及びニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼを用いた経路が挙げられる。ニコチンアミドとホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）等のリン酸化リボース供与体からＮＭＮヌクレオシダーゼによりニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）が合成され、ニコチンアミドモノヌクレオチドを基質としてニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼによりＮＡＤ＋が合成される。
本発明に係るＮＡＤＨの製造方法において、「ニコチンアミドからＮＡＤＨを合成するための反応」は、ニコチンアミドを基質とする１段階又は２段階以上の酵素反応により、最終的にＮＡＤＨを合成する酵素反応を意味する。当該反応は、以降、「ＮＡＤＨサルベージ合成経路」ということがある。ＮＡＤＨサルベージ合成経路は、いずれかの生物が本来有する天然の代謝経路であってもよく、当該天然の代謝経路を適宜改変したものであってもよく、人工的に合成した代謝経路であってもよい。
ＮＡＤＨは、熱分解によりまずＮＡＤ＋に分解され、その後、ＡＤＰ−リボースとニコチンアミドにまで分解される。そこで、ＮＡＤＨサルベージ合成経路としては、ＡＤＰ−リボースとニコチンアミドからＮＡＤＨを合成する反応経路が好ましい。例えば、前記ＮＡＤ＋サルベージ合成経路に、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを合成する反応を触媒する酸化還元酵素を付加した経路を、ＮＡＤＨサルベージ合成経路とすることができる。
ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを合成する反応は、ＮＡＤ＋を補酵素とする各種の酸化反応によって行うことができる。ＮＡＤ＋を補酵素とする酸化反応の基質や酸化還元酵素としては、特に限定されるものではない。本発明において用いられるＮＡＤ＋からＮＡＤＨを合成する反応を触媒する酸化還元酵素としては、例えば、糖、アルコール、又は有機酸を基質とするデヒドロゲナーゼを用いることができる。糖を基質とするデヒドロゲナーゼとしては、グルコースデヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.47）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.49）、ガラクトース−１−デヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.48）、Ｌ−アラビノース−１−デヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.46）、Ｄ−キシロース−１−デヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.175）、グルクロン酸レダクターゼ（EC.1.1.1.19）等が挙げられる。アルコールを基質とするデヒドロゲナーゼとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.1）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.6）、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）（EC.1.1.1.8）、マンニトール−１−リン酸−５−デヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.17）、イノシトール−２−デヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.18）、マンニトール−２−デヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.67）等が挙げられる。有機酸を基質とするデヒドロゲナーゼとしては、乳酸デヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.27、EC.1.1.1.28）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.37、EC.1.1.1.38、EC.1.1.1.39）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.41）、酒石酸デヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.93）、グルコン酸−５−デヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.69）ギ酸デヒドロゲナーゼ（EC.EC.1.2.1.2）等が挙げられる。
本発明において用いられるＮＡＤ＋からＮＡＤＨを合成する反応を触媒する酸化還元酵素としては、基質が比較的安価であることから、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、又は乳酸デヒドロゲナーゼを用いることが特に好ましい。例えば、ＮＡＤＨのサルベージ合成を行う酵素反応系に、グルコースとグルコースデヒドロゲナーゼを添加することにより、サルベージ合成されたＮＡＤ＋とグルコースからグルコースデヒドロゲナーゼにより、グルコノラクトンと共にＮＡＤＨが合成される。同様に、ＮＡＤＨのサルベージ合成を行う酵素反応系に、ギ酸とギ酸デヒドロゲナーゼを添加することによって二酸化炭素と共にＮＡＤＨが合成され、アルコールとアルコールデヒドロゲナーゼを添加することによってアルデヒドと共にＮＡＤＨが合成され、乳酸と乳酸デヒドロゲナーゼを添加することによってピルビン酸と共にＮＡＤＨが合成される。
本発明に係る補酵素の製造方法において、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを必要とする酵素反応系に添加されるＮＡＤ＋サルベージ合成経路又はＮＡＤＨサルベージ合成経路に要する酵素としては、耐熱性酵素であることが好ましい。耐熱性酵素は、非耐熱性酵素と比較して、化学的及び熱的安定性に優れているため、酵素反応系内において、より安定してＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを合成することができる。
本発明及び本願明細書において、「耐熱性酵素」とは、６０℃の加熱処理を行った場合でも変性することなく、酵素活性を保持できる酵素を意味する。ＮＡＤ＋を必要とする酵素反応系に添加される耐熱性酵素としては、７０℃の加熱処理を行った場合でも変性することなく、酵素活性を保持できる耐熱性を有するものが好ましい。
耐熱性酵素としては、天然型の酵素（いずれかの生物が本来有している酵素）であってもよく、天然型の酵素を改変したものであってもよく、人工的に設計・合成されたものであってもよい。天然型の耐熱性酵素は、例えば、超好熱菌又は好熱菌から単離することができる。超好熱菌又は好熱菌としては、例えば、パイロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）、パイロコッカス・アビッシ（Pyrococcus abyssi）、パイロコッカス・グリコボランス（Pyrococcus glycovorans）、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、パイロコッカス・ウォセイ（Pyrococcus wosei）等のパイロコッカス属；メタノパイラス・カンドラリ（Methanopyrus kandleri）等のメタノパイラス属；パイロロバス・フマリ（Pyrolobus fumarii）等のパイロロバス属；スルフォロバス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）、スルフォロバス・アイランディカス（Sulfolobus islandicus）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、スルフォロバス・トウコウダイ（Sulfolobus tokodaii）等のスルフォロバス属；パイロディクティム・アキュルタム（Pyrodictium occultum）、パイロディクティム・アビッシ（Pyrodictium abyssi）、パイロディクティム・ブロッキ（Pyrodictium brockii）等のパイロディクティム属；ハイパーサーマス・ブチリカス（Hyperthermus butylicuｓ）等のハイパーサーマス属；パイロバキュラム・アエロフィラム（Pyrobaculum aerophilum）、パイロバキュラム・アルセナティカム（Pyrobaculum arsenaticum）、パイロバキュラム・オルガノトロファム（Pyrobaculum organotrophum）等のパイロバキュラム属；アエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）等のアエロパイラム属；サーモコッカス・プロファンダス（Thermococcus profundus）、サーモコッカス・コダカレンシス（Thermococcus kodakarensis）、サーモコッカス・ガンマトレランス（Thermococcus gammatolerans）等のサーモコッカス属；アクイフェックス・パイロフィラス（Aquifex pyrophilus）等のアクイフェックス属；サーモトーガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、サーモトーガ・ナフトフィラ（Thermotoga naphthophila）、サーモトーガ・レティンガエ（Thermotoga lettingae）、サーモトーガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）、サーモトーガ・ペトロフィラ（Thermotoga petrophila）等のサーモトーガ属；サーモデスルフォバクテリウム・コムネ（Thermodesulfobacterium commune）等のサーモデスルフォバクテリウム属；サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）等のサーマス属；サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）、サーモプラズマ・ヴォルカニウム（Thermoplasma volcanium）等のサーモプラズマ属；ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）等のゲオバシラス属；アシジロバス・サッカロボランス（Acidilobus saccharovorans）等のアシジロバス属；スルフォロブス・ソルファタチカス（Sulfolobus solfataticus）等のスルフォロブス属、等に属する微生物が挙げられる。
ＮＡＤ＋サルベージ合成経路又はＮＡＤＨサルベージ合成経路が多段階反応の場合、各段階における酵素反応の速度は、酵素反応自体の反応速度と、酵素反応系内における耐熱性酵素の存在量により規定される。そこで、これらの合成経路に使用される各耐熱性酵素は、酵素量の不足による反応効率の低下を招かないよう、反応系内に充分量添加することが好ましい。特に、反応速度が比較的遅い耐熱性酵素の存在量（ユニット量）は、当該耐熱性酵素による酵素反応が律速とならないように、反応系に充分量添加されることが好ましく、反応速度が比較的速い耐熱性酵素の存在量よりも多くなるように酵素反応系に添加されることも好ましい。酵素反応系内における各耐熱性酵素の存在量を、反応速度とのバランスを考慮して調節することにより、酵素量を抑えつつ、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨをより迅速に効率よく合成することができる。なお、本発明に係る補酵素の製造方法において、耐熱性酵素は、酵素反応系が目的とする有機化合物を合成するための酵素反応の反応開始前に酵素反応系に添加してもよく、酵素反応開始後に酵素反応系に添加してもよい。
例えば、図１に示すＮＡＤ＋サルベージ合成経路の場合、酵素反応系内に存在する各耐熱性酵素の存在量比（ユニット比）が、ニコチンアミダーゼ＝１に対して、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ＝５〜５０、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ＝１０〜１００、ＮＡＤ＋シンターゼ＝２００〜６００、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ＝１〜２、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ＝５〜１０となるように、各耐熱性酵素を酵素反応系に添加することが好ましく、ニコチンアミダーゼ：ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ：ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ：ＮＡＤ＋シンターゼ：ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ：リボースリン酸ピロホスホキナーゼ＝１：５０：７５：５００：１．２：１０となるように、各耐熱性酵素を酵素反応系に添加することがより好ましい。
ＮＡＤ＋サルベージ合成経路及びＮＡＤＨサルベージ合成経路においては、ＡＴＰを用いた反応が含まれている。そこで、本発明に係る補酵素の製造方法においては、ＮＡＤ＋サルベージ合成経路又はＮＡＤＨサルベージ合成経路に要する耐熱性酵素に加えて、ＡＴＰを合成する反応（ＡＴＰ合成経路）に要する耐熱性酵素も、ＮＡＤ＋を必要とする酵素反応系又はＮＡＤＨを必要とする酵素反応系に添加することも好ましい。ＡＴＰ合成経路としては、具体的には、例えば、図３に示すように、ＡＭＰとＡＴＰを出発原料とし、アデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）及びポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）を用いた経路が挙げられる。１分子のＡＭＰと１分子のＡＴＰからアデニル酸キナーゼにより２分子のＡＤＰが合成され、この２分子のＡＤＰからポリリン酸キナーゼにより２分子のＡＴＰが合成される。
本発明において用いられるＮＡＤ＋サルベージ合成経路に要する耐熱性酵素、ＮＡＤＨサルベージ合成経路に要する耐熱性酵素、及びＡＴＰ合成経路に要する耐熱性酵素は、例えば、微生物の代謝系を利用した発現系によって製造できる。当該発現系は、微生物に、耐熱性酵素をコードしている遺伝子（耐熱性酵素遺伝子）が導入された形質転換体内において発現させる発現系であってもよく、いわゆる、セルフリー発現系であってもよい。
本発明において酵素反応系に添加する耐熱性酵素を形質転換体内で合成させる場合、一つの形質転換体が発現させる耐熱性酵素は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。また、ＮＡＤ＋サルベージ合成経路又はＮＡＤＨサルベージ合成経路に要する全ての耐熱性酵素遺伝子を、一つの形質転換体内で発現させてもよい。
耐熱性酵素遺伝子の超好熱菌又は好熱菌からの単離は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。具体的には、先ず、超好熱菌又は好熱菌のゲノムＤＮＡを作製した後に、ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、同一の制限酵素又は共通の切断末端を与える制限酵素で切断したプラスミド又はファージにリガーゼ等を用いて連結することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。次いで、取得目的の耐熱性酵素の塩基配列に基づき設計したプライマーセットを用いて、これらのゲノムＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲを行うことにより目的の耐熱性酵素遺伝子を得ることができる。或いは、上記塩基配列に基づき設計したプローブを用いて、これらのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによっても、目的の耐熱性酵素遺伝子を得ることができる。得られた耐熱性酵素遺伝子は、コードする耐熱性酵素のアミノ酸配列は変更せずに、宿主細胞において使用頻度の高いコドンへ改変してもよい。なお、コドンの改変は、公知の遺伝子組換え技術によって行うことができる。
当該耐熱性酵素遺伝子は、Ｎ末端やＣ末端に、各種タグが付加されたキメラ遺伝子であってもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現又は精製において汎用されているタグを用いることができる。耐熱性酵素をタグが付加された状態で発現させることにより、発現系からの精製や発現量の測定等が簡便になる。
宿主細胞に耐熱性酵素遺伝子を導入した形質転換体の作製は、公知の方法により又は公知の方法を適宜改変した方法により行うことができる。具体的には、例えば、耐熱性酵素遺伝子を適当なベクターに連結することによって、当該遺伝子を含有する組換えベクターを得、当該組換えベクターを用いて、宿主細胞を形質転換する方法が挙げられる。当該組換えベクターによる宿主細胞の形質転換は、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等の公知の方法に従って行うことができる。
耐熱性酵素遺伝子の導入に使用されるベクターとしては、形質転換する宿主細胞において耐熱性酵素を発現させ得るものであれば、特に制限されない。例えば、プラスミド、ファージ等のベクターを用いることができる。具体的には、ｐＥＴ１１ａ、ｐＥＴ２１ａ、ｐＵＣ１８、ｐＫＫ２２３−３、ｐＢＡＤ、ｐＲＣＩ（Ninh et al.，Biotechnology and Bioengineering，2015，vol.112, p.189−196）、ｐＮｉｔ−ＱＴ２、ｐＮｉｔ−ＲＣ２、ｐＴｉｐ−ＱＴ２、ｐＴｉｐ−ＲＣ２等が挙げられる。また、当該組換えベクターには、宿主細胞内において耐熱性酵素遺伝子の発現を可能にするためのプロモーターやその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列）が含まれていることが好ましい。当該プロモーターとして、具体的には、Ｔ７プロモーター、ｌａｍｂｄａ ＰＲプロモーター、ＰｎｉｔＡプロモーター、ＰｔｉｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｐＢＡＤ／ＡｒａＣプロモーター等のプロモーターが挙げられる。
ＮＡＤ＋サルベージ合成経路及びＮＡＤＨサルベージ合成経路に要する耐熱性酵素が複数ある場合、各耐熱性酵素遺伝子の発現を制御するプロモーターは、全て同一種類のものであってもよく、互いに異なる種類のものであってもよい。各耐熱性酵素遺伝子の発現を制御するプロモーターが全て同一種類のものではない場合には、酵素反応系への添加量が比較的多くなる反応速度が遅い耐熱性酵素の発現を制御するプロモーターには発現効率が高いものを用いることが好ましい。酵素反応系への添加量が比較的少なくて済む反応速度が速い耐熱性酵素の発現を制御するプロモーターには、発現効率が比較的低いものを用いてもよい。
また、当該組換えベクターには、形質転換された細胞の選択を可能とするために、マーカー遺伝子が含まれていてもよい。当該マーカー遺伝子としては、例えば、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子、薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。
耐熱性酵素遺伝子が導入された形質転換体を得るための宿主細胞としては、特に限定されるものではなく、原核細胞であってもよく、真核単細胞であってもよく、真核多細胞生物の細胞であってもよい。真核多細胞生物の細胞としては、植物細胞であってもよく、昆虫細胞や哺乳細胞等の動物細胞であってもよい。当該宿主細胞としては、培養が容易であり、かつ大量発現に適していることから、微生物であることが好ましい。
耐熱性酵素遺伝子が導入された形質転換体を得るための宿主細胞としては、特に、非耐熱性微生物が好ましい。非耐熱性微生物を宿主細胞とした形質転換体内において耐熱性酵素を発現させた場合、当該形質転換体を加熱処理することにより、耐熱性酵素の活性は維持させたまま、宿主細胞由来の全てのタンパク質を熱変性させて失活させることができる。このため、耐熱性酵素と共に宿主細胞由来のタンパク質が酵素反応系に持ち込まれた場合でも、意図せぬ副反応を抑制することができる。宿主細胞とする非耐熱性微生物としては、大腸菌；バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）等のバシラス属菌；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescense）等のシュードモナス属菌；ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）等のロドコッカス属菌；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属菌；シゾサッカロマイセス・ポンベ（Scizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属菌；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等のピキア属菌、等が好ましく、発現効率が高く、かつ培養を比較的低コストで容易に培養可能なことから、大腸菌が特に好ましい。
本発明において酵素反応系に添加する耐熱性酵素は、精製されたものであってもよく、粗精製されたものであってもよく、精製されていないものであってもよい。発現系からの耐熱性酵素の精製は、常法により行うことができる。
特に、耐熱性酵素を、非耐熱性微生物を宿主細胞とし、耐熱性酵素遺伝子を導入した形質転換体によって合成した場合には、耐熱性酵素を発現させた形質転換体の加熱処理物を、そのまま酵素反応系に添加することができる。加熱処理により、耐熱性酵素は活性を維持しつつ、宿主細胞由来のタンパクが失活するため、意図せぬ副反応を引き起こすことなく、耐熱性酵素を精製せずに加熱処理物をそのまま酵素反応系内に添加することができる。また、加熱処理により形質転換体の細胞構造、特に細胞膜や細胞壁が部分的に破壊され、形質転換体の内外への物質の透過性が向上する。つまり、基質と酵素反応の生産物は死滅菌体（加熱処理後の形質転換体）を透過することができるため、加熱処理物中の耐熱性酵素が形質転換体の死滅菌体内に保持されている場合でも、加熱処理物をそのまま酵素反応系に添加した場合でも、当該酵素反応系内において当該加熱処理物中の耐熱性酵素による酵素反応を行うことができる。さらに、加熱処理物に含まれている宿主細胞由来のＡＤＰ−リボース、ニコチンアミド、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＡＴＰ、及びＡＭＰ等の成分を、酵素反応系における酵素反応の原料として使用できる。
大腸菌は、比較的細胞壁が加熱処理により破壊されやすい。このため、大腸菌を宿主細胞とし、耐熱性酵素遺伝子を導入した形質転換体の場合には、加熱処理物中の耐熱性酵素は、死滅菌体内に保持されるよりも、死滅菌体外に流出しやすい。加熱処理物を酵素反応系に添加した場合に、死滅菌体外に流出した耐熱性酵素は、酵素反応系内に分散する。耐熱性酵素が死滅菌体内に保持されている場合よりも酵素反応系内を広く分散しているほうが、当該耐熱性酵素による酵素反応の効率がよい。酵素反応系内における反応効率の点からも、細胞壁が加熱処理により破壊され難い非耐熱性微生物よりも、大腸菌のように比較的細胞壁が加熱処理により破壊されやすい非耐熱性微生物のほうが、本発明において用いられる耐熱性酵素を発現させる宿主細胞として好ましい。
本発明に係る補酵素の製造方法においては、酵素反応系に元々補酵素として添加されたＮＡＤ＋及び／又はＮＡＤＨの熱分解物であるニコチンアミド及び／又はＡＤＰ−リボースを基質とすることにより、当該酵素反応系にニコチンアミドやＡＤＰ−リボースを外添せずともＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを合成することができる。また、酵素反応系に、ＮＡＤ＋を一切添加せず、ニコチンアミド等のＮＡＤ＋サルベージ合成経路の出発原料となる化合物のみを添加し、ＮＡＤ＋サルベージ合成経路により合成されたＮＡＤ＋のみを酵素反応系内において使用してもよい。同様に、酵素反応系に、ＮＡＤＨを一切添加せず、ニコチンアミド等のＮＡＤＨサルベージ合成経路の出発原料となる化合物のみを添加し、ＮＡＤＨサルベージ合成経路により合成されたＮＡＤＨのみを酵素反応系内において使用してもよい。
非耐熱性微生物に耐熱性酵素を発現させた形質転換体の加熱処理の条件は、宿主細胞由来のタンパク質は失活するが、目的の耐熱性酵素の活性は維持される条件であれば特に限定されるものではない。例えば、加熱処理は、耐熱性酵素を発現させた形質転換体を、６０〜９０℃程度で１〜３０分間加熱する条件で行うことができる。
本発明に係る補酵素製造用形質転換体セットは、非耐熱性微生物を宿主とし、当該補酵素のサルベージ合成経路に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素をコードしている遺伝子が導入された１種又は２種以上の形質転換体からなることを特徴とする。本発明に係る補酵素製造用形質転換体セットのうち、非耐熱性微生物を宿主とし、ＮＡＤ＋サルベージ合成経路に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素をコードしている遺伝子が導入された１種又は２種以上の形質転換体からなるものをＮＡＤ＋製造用形質転換体セットという。同様に、非耐熱性微生物を宿主とし、ＮＡＤＨサルベージ合成経路に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素をコードしている遺伝子が導入された１種又は２種以上の形質転換体からなるものをＮＡＤＨ製造用形質転換体セットという。
ＮＡＤ＋サルベージ合成経路に要する耐熱性酵素は、当該ＮＡＤ＋製造用形質転換体セットに含まれるいずれかの形質転換体内で発現される。つまり、当該ＮＡＤ＋製造用形質転換体セットに含まれる形質転換体を培養することにより、ＮＡＤ＋サルベージ合成経路に要する全種類の耐熱性酵素を製造することができる。同様に、ＮＡＤＨサルベージ合成経路に要する耐熱性酵素は、当該ＮＡＤＨ製造用形質転換体セットに含まれるいずれかの形質転換体内で発現され、当該ＮＡＤＨ製造用形質転換体セットに含まれる形質転換体を培養することにより、ＮＡＤＨサルベージ合成経路に要する全種類の耐熱性酵素を製造することができる。
例えば、ＮＡＤ＋サルベージ合成経路が図１に示すように、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋シンターゼ、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、及びリボースリン酸ピロホスホキナーゼの全６種類の耐熱性酵素を要する場合、当該ＮＡＤ＋製造用形質転換体セットは、これらの６種類の耐熱性酵素遺伝子が全て導入された１種類の形質転換体からなってもよく、それぞれの耐熱性酵素遺伝子がそれぞれ異なる形質転換体に導入された６種類の形質転換体からなってもよい。また、これら６種類の耐熱性酵素遺伝子のうち、３種類が導入された形質転換体と、残りの３種類が導入された形質転換体との２種類の形質転換体からなってもよい。
当該ＮＡＤ＋製造用形質転換体セット及びＮＡＤＨ製造用形質転換体セットには、さらに、ＡＴＰ合成経路に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素をコードしている遺伝子が導入された１種又は２種以上の形質転換体が含まれていてもよい。
当該補酵素製造用形質転換体セットに含まれる形質転換体としては、前記の通りのものを用いることができ、大腸菌を宿主細胞とするものが好ましい。
当該補酵素製造用形質転換体セットに含まれる形質転換体は、長期保存に適したグリセロールストックの状態であってもよく、寒天培地でコロニーを形成させた状態であってもよい。また、培養用培地にてある程度培養させた培養液の状態（懸濁液）であってもよく、培養後の湿菌体を加熱処理されたものであってもよい。
次に、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
＜ＨＰＬＣ分析＞
ＮＡＤ＋、ＡＤＰ−リボース、ニコチンアミド、ニコチン酸、ニコチン酸モノヌクレオチド、及びデアミノＮＡＤ＋は、５Ｃ１８ＡＲ−ＩＩカラム（４．６ｍｍ（内径）×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）を用いてＨＰＬＣにて定量分析した。溶出には、溶離液Ａとして５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、溶離液Ｂとして同緩衝液に２５％（ｖ／ｖ）メタノールと５ ｍＭ １−オクタンスルホン酸ナトリウムを溶解させた溶液を用いたグラジエント溶出を用いた。溶離液の流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎとし、溶出開始から５分間は溶離液Ａ単独での溶出、その後５〜１１分までの間に溶離液Ｂの混合比率を０から１００％ （ｖ／ｖ）にまで上昇させた後、さらに、溶離液Ｂ単独で６分間の溶出を行った。カラム温度は４０℃に保ち、溶出液は２５４ｎｍでモニターした。
ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの定量は、ＨＩＬＩＣカラム（４．６ｍｍ（内径）×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）を用いたＨＰＬＣ分析により実施した。溶離液として、２０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）とアセトニトリルを当容量ずつ混合した溶液を用い、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで溶出した。カラム温度は４０℃に保ち、溶出液は２５４ｎｍでモニターした。
ＮＡＤ＋、ＡＤＰ−リボース、ニコチンアミド、ニコチン酸、ニコチン酸モノヌクレオチド、及びデアミノＮＡＤ＋は、５Ｃ１８ＡＲ−ＩＩカラム（４．６ｍｍ（内径）×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）を用いてＨＰＬＣにて定量分析した。溶出には、溶離液Ａとして５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、溶離液Ｂとして同緩衝液に２５％（ｖ／ｖ）メタノールと５ ｍＭ １−オクタンスルホン酸ナトリウムを溶解させた溶液を用いたグラジエント溶出を用いた。溶離液の流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎとし、溶出開始から５分間は溶離液Ａ単独での溶出、その後５〜１１分までの間に溶離液Ｂの混合比率を０から１００％ （ｖ／ｖ）にまで上昇させた後、さらに、溶離液Ｂ単独で６分間の溶出を行った。カラム温度は４０℃に保ち、溶出液は２５４ｎｍでモニターした。
ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの定量は、ＨＩＬＩＣカラム（４．６ｍｍ（内径）×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）を用いたＨＰＬＣ分析により実施した。溶離液として、２０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）とアセトニトリルを当容量ずつ混合した溶液を用い、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで溶出した。カラム温度は４０℃に保ち、溶出液は２５４ｎｍでモニターした。
［参考例１］
１分子のＮＡＤ＋が熱分解されると、１分子のニコチンアミドと１分子のＡＤＰ−リボースが生産される（図４）。
終濃度１ｍＭのＮＡＤ＋溶液を７０℃で３時間インキュベートした後、５Ｃ１８ＡＲ−ＩＩカラムを用いたＨＰＬＣ分析に供したところ、ＮＡＤ＋のほかに２本のピークが観察された。ＮＡＤ＋の構成単位となる各種化合物の分析結果と比較したところ、ニコチンアミド、ＡＤＰ−リボースがそれらのピークと同じ保持時間を示すことが明らかとなった。次に、ＮＡＤ＋の熱分解を経時的に追跡したところ、分解に伴ってニコチンアミド、ＡＤＰ−リボースが化学量論的に蓄積することが明らかとなった（図５）。この結果より、ニコチンアミド及びＡＤＰ−リボースの両物質は、ＮＡＤ＋に比して熱に対する安定性に優れることが示唆され、サルベージ合成の出発物質として利用可能であると判断された。
なお、ここで示された分解様式は、Chenaultらの総説（Chenault and Whitesides，Applied Biochemistry and Biotechnology，1987，vol.14，p.147−197）において、アルカリ触媒下におけるＮＡＤ＋分解スキームとして提唱されている知見ともよく合致した。
１分子のＮＡＤ＋が熱分解されると、１分子のニコチンアミドと１分子のＡＤＰ−リボースが生産される（図４）。
終濃度１ｍＭのＮＡＤ＋溶液を７０℃で３時間インキュベートした後、５Ｃ１８ＡＲ−ＩＩカラムを用いたＨＰＬＣ分析に供したところ、ＮＡＤ＋のほかに２本のピークが観察された。ＮＡＤ＋の構成単位となる各種化合物の分析結果と比較したところ、ニコチンアミド、ＡＤＰ−リボースがそれらのピークと同じ保持時間を示すことが明らかとなった。次に、ＮＡＤ＋の熱分解を経時的に追跡したところ、分解に伴ってニコチンアミド、ＡＤＰ−リボースが化学量論的に蓄積することが明らかとなった（図５）。この結果より、ニコチンアミド及びＡＤＰ−リボースの両物質は、ＮＡＤ＋に比して熱に対する安定性に優れることが示唆され、サルベージ合成の出発物質として利用可能であると判断された。
なお、ここで示された分解様式は、Chenaultらの総説（Chenault and Whitesides，Applied Biochemistry and Biotechnology，1987，vol.14，p.147−197）において、アルカリ触媒下におけるＮＡＤ＋分解スキームとして提唱されている知見ともよく合致した。
［実施例１］
＜ＮＡＤ＋サルベージ合成経路のデザイン＞
ニコチンアミドを出発物質としたＮＡＤ＋サルベージ合成経路をデザインしたところ、図１及び２に示す２ルートが考えられた。図１に示すＮＡＤ＋サルベージ合成経路に必要とされる６種類の酵素について、超好熱菌又は好熱菌由来の酵素の中から表１に示す酵素を選択した。また、合わせて、図３に示すＡＴＰ合成経路に必要とされる２種類の酵素と、グルコースデヒドロゲナーゼについて、超好熱菌又は好熱菌由来の酵素の中から表１に示す酵素を選択した。なお、グルコースデヒドロゲナーゼは、合成されたＮＡＤ＋の定量のために使用するものである。表１中、「ＧＩ ｎｕｍｂｅｒ」は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）が提供する塩基配列データベース）のアクセッション番号である。
＜ＮＡＤ＋サルベージ合成経路のデザイン＞
ニコチンアミドを出発物質としたＮＡＤ＋サルベージ合成経路をデザインしたところ、図１及び２に示す２ルートが考えられた。図１に示すＮＡＤ＋サルベージ合成経路に必要とされる６種類の酵素について、超好熱菌又は好熱菌由来の酵素の中から表１に示す酵素を選択した。また、合わせて、図３に示すＡＴＰ合成経路に必要とされる２種類の酵素と、グルコースデヒドロゲナーゼについて、超好熱菌又は好熱菌由来の酵素の中から表１に示す酵素を選択した。なお、グルコースデヒドロゲナーゼは、合成されたＮＡＤ＋の定量のために使用するものである。表１中、「ＧＩ ｎｕｍｂｅｒ」は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）が提供する塩基配列データベース）のアクセッション番号である。
サーモプラズマ・アシドフィラムのニコチンアミダーゼは、ニコチンアミダーゼ活性があり、大腸菌内での異種発現も可能であるとの報告があるアシジロバス・サッカロボランス由来ニコチンアミダーゼ(GI:503031789)のアミノ酸配列をクエリ配列としてＢＬＡＳＴ検索を行った結果に見出された酵素であり、当該酵素をコードする遺伝子は、サーモプラズマ・アシドフィラムのゲノムＤＮＡよりＰＣＲ法によって単離した。単離された酵素遺伝子を大腸菌に導入し、得られた形質転換体内において当該酵素を発現させたところ、６０℃においてニコチンアミダーゼ活性を備えることを確認した。
また、デアミノＮＡＤ＋のアミノ化酵素（ＮＡＤシンターゼ）は、表１に記載の酵素に代えて、サーマス・サーモフィラス由来のＮＡＤシンターゼを用いてもよい。
なお、表１中のＴｔＮＭＡＴは、ニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）のみならず、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）も基質としうる酵素である。
また、デアミノＮＡＤ＋のアミノ化酵素（ＮＡＤシンターゼ）は、表１に記載の酵素に代えて、サーマス・サーモフィラス由来のＮＡＤシンターゼを用いてもよい。
なお、表１中のＴｔＮＭＡＴは、ニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）のみならず、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）も基質としうる酵素である。
＜形質転換体の作製＞
表１に記載の耐熱性酵素について、各耐熱性酵素遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体（組換え大腸菌）を作製した。
表１に記載の耐熱性酵素のうち、サーマス・サーモフィラス ＨＢ８由来のものは、いずれも理化学研究所より提供を受けた同菌の１遺伝子発現プラスミドライブラリー（Yokoyama，et al.，Nature Structural Biology，2000，vol.7，p.943−945）に含まれるものである。同ライブラリーの発現ベクターはｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）及びその誘導体をバックボーンとして作製されたものであり、目的遺伝子はＴ７プロモーター制御下に配置され、ＩＰＴＧによる発現誘導を受ける。
サーマス・サーモフィラス ＨＢ２７由来のポリリン酸キナーゼ（ＴｔＰＫＫ）及びサーモプラズマ・アシドフィラム由来ニコチンアミダーゼ（ＴａＮＡａｓｅ）は、各微生物のゲノムＤＮＡよりＰＣＲ増幅した当該遺伝子をｐＥＴ２１ａに連結し、同様にＴ７プロモーター制御下で発現させた。
これらの遺伝子発現ベクターは、全てＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に導入し、形質転換体を作製した。
表１に記載の耐熱性酵素について、各耐熱性酵素遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体（組換え大腸菌）を作製した。
表１に記載の耐熱性酵素のうち、サーマス・サーモフィラス ＨＢ８由来のものは、いずれも理化学研究所より提供を受けた同菌の１遺伝子発現プラスミドライブラリー（Yokoyama，et al.，Nature Structural Biology，2000，vol.7，p.943−945）に含まれるものである。同ライブラリーの発現ベクターはｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）及びその誘導体をバックボーンとして作製されたものであり、目的遺伝子はＴ７プロモーター制御下に配置され、ＩＰＴＧによる発現誘導を受ける。
サーマス・サーモフィラス ＨＢ２７由来のポリリン酸キナーゼ（ＴｔＰＫＫ）及びサーモプラズマ・アシドフィラム由来ニコチンアミダーゼ（ＴａＮＡａｓｅ）は、各微生物のゲノムＤＮＡよりＰＣＲ増幅した当該遺伝子をｐＥＴ２１ａに連結し、同様にＴ７プロモーター制御下で発現させた。
これらの遺伝子発現ベクターは、全てＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に導入し、形質転換体を作製した。
スルフォロブス・ソルファタチカス由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＳｓＧＤＨ）遺伝子は、ｐＲＣＩのｌａｍｂｄａ ＰＲプロモーター制御下に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株に導入し、形質転換体を作製した。ＳｓＧＤＨ遺伝子の発現は、培養温度を４２℃にシフトさせることによって誘導を行った。
組換え大腸菌は全て１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地を用い、３７℃で好気的に培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの培養では、さらに３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを培地に添加した。対数増殖後期に培養液に０．２ｍＭ ＩＰＴＧの添加、若しくは熱誘導（４２℃）により、目的酵素遺伝子の発現誘導を行った。
＜粗酵素液の調製＞
目的の耐熱性酵素を発現させた組換え大腸菌の湿菌体を２００ｍｇ（ｗｅｔ ｃｅｌｌｓ）／ｍＬとなるように１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）に懸濁した。得られた懸濁液を超音波破砕処理に供することにより菌体を破砕し、無細胞抽出液を得た。当該無細胞抽出液に対し、７０℃、３０分間の熱処理を施し、宿主由来タンパク質を変性させ、失活させた。熱処理後の懸濁液を遠心分離処理し、細胞残さと変性タンパク質を取り除いた上清を粗酵素液として活性測定に用いた。
目的の耐熱性酵素を発現させた組換え大腸菌の湿菌体を２００ｍｇ（ｗｅｔ ｃｅｌｌｓ）／ｍＬとなるように１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）に懸濁した。得られた懸濁液を超音波破砕処理に供することにより菌体を破砕し、無細胞抽出液を得た。当該無細胞抽出液に対し、７０℃、３０分間の熱処理を施し、宿主由来タンパク質を変性させ、失活させた。熱処理後の懸濁液を遠心分離処理し、細胞残さと変性タンパク質を取り除いた上清を粗酵素液として活性測定に用いた。
＜酵素活性測定＞
活性測定には４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）を使用し、反応は全て６０℃で実施した。各酵素の活性は、図１に示すＮＡＤ＋サルベージ合成経路において下流に位置する酵素とカップリングさせることにより生じるＮＡＤ＋を、さらにＳｓＧＤＨによって還元し、蓄積するＮＡＤＨの濃度を３４０ｎｍにおける吸収をモニターすることによって測定した。各酵素の活性は、本測定条件下で１分間に１μｍｏｌの基質消費を触媒する量を１ユニット（Ｕ）と定義して表す。
活性測定には４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）を使用し、反応は全て６０℃で実施した。各酵素の活性は、図１に示すＮＡＤ＋サルベージ合成経路において下流に位置する酵素とカップリングさせることにより生じるＮＡＤ＋を、さらにＳｓＧＤＨによって還元し、蓄積するＮＡＤＨの濃度を３４０ｎｍにおける吸収をモニターすることによって測定した。各酵素の活性は、本測定条件下で１分間に１μｍｏｌの基質消費を触媒する量を１ユニット（Ｕ）と定義して表す。
ＴａＮＡａｓｅの活性測定は、４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ グルコース、６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ポリリン酸（平均鎖長６０）、０．２ｍＭ ホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）からなる反応液中で実施した。当該反応溶液に、ＴａＮＡａｓｅ、ＴｔＮＡＰＲＴ、ＴｔＮＭＡＴ、ＧｓＮＡＤＳ、及びＳｓＧＤＨの粗酵素液を添加し、６０℃で３分間プレインキュベートした。なおこの際、ＴｔＮＡＰＲＴ、ＴｔＮＭＡＴ、ＧｓＮＡＤＳ、ＳｓＧＤＨは、ＴａＮＡａｓｅに対して活性値において過剰量となるように添加し、下流酵素の反応がＮＡＤＨ合成反応の律速段階とならないようにした。プレインキュベーション後、終濃度０．２ｍＭのニコチンアミドを添加し、３４０ｎｍにおける吸光度の上昇をモニターした。反応速度の算定には、同波長におけるＮＡＤＨのモル吸光度係数６．２ｍＭ―１ｃｍ―１を使用した。
同様にＴｔＮＡＰＲＴの活性測定は、ＴａＮＡａｓｅを添加しないことを除き、同じ組成の反応液で実施した。プレインキュベーションの後に、基質として０．２ｍＭのニコチン酸を加えることにより反応を開始させた。同様にＴｔＮＭＡＴ、ＧｓＮＡＤＳについても、各酵素の基質（ニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）、デアミノＮＡＤ）０．２ｍＭを用いて活性測定を行った。また、ＴｔＡＤＰＲＰ、ＴｔＲＰＫの活性も、それぞれ０．２ｍＭのＡＤＰ−リボース、リボース５−リン酸を基質とし、ＴｔＮＡＰＲＴ、ＴｔＮＭＡＴ、ＧｓＮＡＤＳ、又はＳｓＧＤＨとのカップリング反応速度を定量することによって測定した。
また、ＮＡＤ＋存在下における各酵素の活性を評価する場合には、４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）中で各酵素とその基質を６０℃でインキュベートし、生産物の濃度をＨＰＬＣで測定した。
ＴｔＡＤＫ、ＴｔＰＰＫについては、これらの粗酵素液を４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）中で、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＡＴＰ、３．０ｍＭ ＡＭＰ、１ｍＭ ポリリン酸と共に６０℃でインキュベートし、ＡＴＰ蓄積量及びＡＭＰ減少量をＨＰＬＣで測定した。
ＴｔＡＤＫ、ＴｔＰＰＫについては、これらの粗酵素液を４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）中で、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＡＴＰ、３．０ｍＭ ＡＭＰ、１ｍＭ ポリリン酸と共に６０℃でインキュベートし、ＡＴＰ蓄積量及びＡＭＰ減少量をＨＰＬＣで測定した。
＜ＮＡＤ＋サルベージ合成試験＞
ＮＡＤ＋サルベージ合成試験は、４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４ｍＭ ＮＡＤ＋、３ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ポリリン酸（平均鎖長６０）、０．２ｍＭ ＡＤＰ−リボース、０．２ｍＭ ニコチンアミドからなる反応液中で実施した。
反応液量０．５ｍＬに対し、ＴａＮＡａｓｅ、ＴｔＮＡＰＲＴ、ＴｔＮＭＡＴ、ＧｓＮＡＤＳ、ＴｔＡＤＰＲＰ、ＴｔＲＰＫ、ＴｔＡＤＫ、及びＴｔＰＰＫを個別に発現させた組換え大腸菌からそれぞれ調製した粗酵素液を混合し、各酵素の終濃度がそれぞれ０．０２、０．１８、０．２５、０．５１、０．０２、０．０３、０．０５、及び０．０５Ｕ／ｍＬとなるように添加した。また、対照試験として、組換え大腸菌や粗酵素液を含まない反応液を用意し、これらを６０℃でインキュベートした。経時的にサンプリングを行い、反応液中のＮＡＤ＋をＨＰＬＣで定量した。
ＮＡＤ＋サルベージ合成試験は、４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４ｍＭ ＮＡＤ＋、３ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ポリリン酸（平均鎖長６０）、０．２ｍＭ ＡＤＰ−リボース、０．２ｍＭ ニコチンアミドからなる反応液中で実施した。
反応液量０．５ｍＬに対し、ＴａＮＡａｓｅ、ＴｔＮＡＰＲＴ、ＴｔＮＭＡＴ、ＧｓＮＡＤＳ、ＴｔＡＤＰＲＰ、ＴｔＲＰＫ、ＴｔＡＤＫ、及びＴｔＰＰＫを個別に発現させた組換え大腸菌からそれぞれ調製した粗酵素液を混合し、各酵素の終濃度がそれぞれ０．０２、０．１８、０．２５、０．５１、０．０２、０．０３、０．０５、及び０．０５Ｕ／ｍＬとなるように添加した。また、対照試験として、組換え大腸菌や粗酵素液を含まない反応液を用意し、これらを６０℃でインキュベートした。経時的にサンプリングを行い、反応液中のＮＡＤ＋をＨＰＬＣで定量した。
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（４００ｍＭ、ｐＨ８）中、６０℃にて４ｍＭのＮＡＤ＋をインキュベートしたところ、その分解速度は５０μＭ／ｍｉｎ程度と見積もられた。そこで、酵素活性測定法に示した反応条件のもと、ＮＡＤＨ生産速度を吸光度変化によってモニターしつつ、各酵素の添加量を調節することにより、ＡＤＰ−リボース、ニコチンアミド各０．２ｍＭから５０μＭ／ｍｉｎの速度でＮＡＤＨを合成するために必要な酵素の濃度を見積もった。
一方、ＨＰＬＣ分析により４ｍＭ ＮＡＤ＋存在下での各酵素の活性測定を行った。この結果、ニコチン酸のホスホリボシル化を触媒するＴｔＮＡＰＲＴがＮＡＤ＋により顕著な阻害を受けることが明らかとなった。図６に、横軸に示す濃度のＮＡＤ＋を含む４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）中でＴｔＮＡＰＲＴを、各０．２ｍＭのＰＲＰＰ、ＡＴＰ、及びニコチン酸とともに６０℃でインキュベートした後、反応液中のニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）濃度をＨＰＬＣで定量し、活性値（ＮＡＤ＋を含まない反応液中での活性を１００％とした場合の相対活性値）を算出した結果を示す。同条件下でのＴｔＮＡＰＲＴ活性はＮＡＤ＋非存在下のそれの約１／４と見積もられたことから、本酵素に関しては吸光度測定に基づき決定した酵素濃度の４倍量を添加することとした。
＜ＡＴＰ合成経路とのカップリング＞
図１のＮＡＤ＋サルベージ合成経路では、ＮＡＤ＋を１分子合成するに当たり３分子のＡＴＰが消費され、３分子のＡＭＰが放出される。そこで、ＴｔＡＤＫとＴｔＰＰＫによるポリリン酸をリン酸基供与源としたＡＭＰからのＡＴＰ合成経路をＮＡＤ＋サルベージ合成経路にカップリングさせた。この際の酵素量は、ＮＡＤ＋分解速度から必要と見積もられる速度（１５０μＭ／ｍｉｎ）に比して、過剰量となるように設定した。
図１のＮＡＤ＋サルベージ合成経路では、ＮＡＤ＋を１分子合成するに当たり３分子のＡＴＰが消費され、３分子のＡＭＰが放出される。そこで、ＴｔＡＤＫとＴｔＰＰＫによるポリリン酸をリン酸基供与源としたＡＭＰからのＡＴＰ合成経路をＮＡＤ＋サルベージ合成経路にカップリングさせた。この際の酵素量は、ＮＡＤ＋分解速度から必要と見積もられる速度（１５０μＭ／ｍｉｎ）に比して、過剰量となるように設定した。
こうして決定された濃度の活性値を有する粗酵素液、又は当該粗酵素液と同等の酵素活性値を有する耐熱性酵素を含む組換え大腸菌の懸濁液を熱処理（７０℃、３０分間）に供したものを加えた反応液中で、６０℃にて４ｍＭ ＮＡＤ＋をインキュベートし、その濃度変化を経時追跡した（図７）。この結果、少なくとも６時間までの間において、酵素非添加時に比べＮＡＤ＋の見かけ上の分解速度が大きく低下し、初発濃度に近しい濃度のＮＡＤ＋が維持され続けることが確認された。すなわち、ＮＡＤ＋サルベージ合成経路とＡＴＰ合成経路に要する耐熱性酵素を添加することにより、ＮＡＤ＋の熱分解物からＮＡＤ＋が再合成され、見掛け上、系内のＮＡＤ＋濃度は低下しないこと、よって、ＮＡＤ＋を必要とする酵素反応系にＮＡＤ＋サルベージ合成経路に要する耐熱性酵素を添加することにより、ＮＡＤ＋を外添せずともＮＡＤ＋の熱分解による濃度低下を抑制することができ、ひいては目的の有機化合物の合成を長時間安定して行えることが確認された。
［実施例２］
ＮＡＤ＋サルベージ合成経路及びＡＴＰ合成経路に要する耐熱性酵素を用いて、ＮＡＤ＋サルベージ合成試験を行った。使用した各種耐熱性酵素は、実施例１で用いたものを用いた。
ＮＡＤ＋サルベージ合成経路及びＡＴＰ合成経路に要する耐熱性酵素を用いて、ＮＡＤ＋サルベージ合成試験を行った。使用した各種耐熱性酵素は、実施例１で用いたものを用いた。
具体的には、ＮＡＤ＋サルベージ合成反応を、３００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ポリリン酸（平均鎖長６０）、４ｍＭ ＮＡＤ＋、３ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭ ニコチンアミド、０．２ｍＭ ＡＤＰ−リボース、及び実施例１で用いた各種耐熱性酵素の混合物である酵素カクテルを含む反応液２ｍＬ中で実施した。なお、当該反応液に含まれている耐熱性酵素の最終濃度はそれぞれ、ＴａＮＡａｓｅが０．１２Ｕ（０．６Ｕ／ｍＬ）、ＴｔＮＡＰＲＴが０．２６Ｕ（０．１３Ｕ／ｍＬ）、ＴｔＮＭＡＴが１．６Ｕ（０．８Ｕ／ｍＬ）、ＧｓＮＡＤＳが１０Ｕ（５Ｕ／ｍＬ）、ＴｔＡＤＰＲＰが０．１２Ｕ（０．６Ｕ／ｍＬ）、ＴｔＲＰＫが０．２Ｕ（０．１Ｕ／ｍＬ）、ＴｔＡＤＫが１８Ｕ（９Ｕ／ｍＬ）、ＴｔＰＰＫが１０Ｕ（５Ｕ／ｍＬ）であった。
調製した反応液を、６０℃でインキュベートした。また、対照試験として、酵素カクテルを含まない反応液を用意し、同様に６０℃でインキュベートした。反応開始から３時間ごとにサンプリングを行い、反応液中のＮＡＤ＋をＨＰＬＣで定量した。反応液中のＮＡＤ＋量の経時的変化を図８に示す。図中、「酵素有り」が酵素カクテルを添加した反応液の結果を示し、「酵素なし」が酵素カクテルを添加していない反応液の結果を示す。図８に示すように、耐熱性酵素を添加していない反応液では、ＮＡＤ＋はインキュベート開始直後から時間経過と共に徐々に低下した。これに対して、ＮＡＤ＋サルベージ合成経路及びＡＴＰ合成経路に要する耐熱性酵素を添加した反応液では、インキュベート開始から２１時間くらいまでは、ＮＡＤ＋の量はさほど低下しなかった。これらの結果から、当該反応液中では、ＮＡＤ＋サルベージ合成反応によりＮＡＤ＋の分解物からＮＡＤ＋が合成されていること、ＮＡＤ＋の合成に必要なＡＴＰもＡＴＰ合成反応により補給されていることが確認できた。
［実施例３］
ＮＡＤＨサルベージ合成経路及びＡＴＰ合成経路に要する耐熱性酵素を用いて、ＮＡＤＨ合成試験を行った。使用した各種耐熱性酵素は、実施例１で用いたものを用いた。
ＮＡＤＨサルベージ合成経路及びＡＴＰ合成経路に要する耐熱性酵素を用いて、ＮＡＤＨ合成試験を行った。使用した各種耐熱性酵素は、実施例１で用いたものを用いた。
具体的には、ＮＡＤＨサルベージ合成反応を、３００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ポリリン酸（平均鎖長６０）、４ｍＭ ＮＡＤＨ、５０ｍＭ グルコース、３ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭ ニコチンアミド、０．２ｍＭ ＡＤＰ−リボース、及び実施例１で用いた各種耐熱性酵素の混合物である酵素カクテルを含む反応液２ｍＬ中で実施した。なお、当該反応液に含まれている耐熱性酵素の最終濃度はそれぞれ、ＴａＮＡａｓｅが０．１２Ｕ（０．６Ｕ／ｍＬ）、ＴｔＮＡＰＲＴが０．２６Ｕ（０．１３Ｕ／ｍＬ）、ＴｔＮＭＡＴが１．６Ｕ（０．８Ｕ／ｍＬ）、ＧｓＮＡＤＳが１０Ｕ（５Ｕ／ｍＬ）、ＴｔＡＤＰＲＰが０．１２Ｕ（０．６Ｕ／ｍＬ）、ＴｔＲＰＫが０．２Ｕ（０．１Ｕ／ｍＬ）、ＴｔＡＤＫが１８Ｕ（９Ｕ／ｍＬ）、ＴｔＰＰＫが１０Ｕ（５Ｕ／ｍＬ）、ＳｓＧＤＨが１０Ｕ（５Ｕ／ｍＬ）であった。
調製した反応液を、６０℃でインキュベートした。また、対照試験として、酵素カクテルを含まない反応液を用意し、同様に６０℃でインキュベートした。反応開始から３時間ごとにサンプリングを行い、反応液中のＮＡＤＨをＨＰＬＣで定量した。反応液中のＮＡＤＨ量の経時的変化を図９に示す。図中、「酵素有り」が酵素カクテルを添加した反応液の結果を示し、「酵素なし」が酵素カクテルを添加していない反応液の結果を示す。図９に示すように、耐熱性酵素を添加していない反応液では、ＮＡＤＨはインキュベート開始直後から時間経過と共に徐々に低下した。これに対して、ＮＡＤＨサルベージ合成経路及びＡＴＰ合成経路に要する耐熱性酵素を添加した反応液では、インキュベート開始から１５時間くらいまでは、ＮＡＤＨの量はほとんど低下していなかった。これらの結果から、当該反応液中では、ＮＡＤＨサルベージ合成反応によりＮＡＤＨの分解物からＮＡＤＨが合成されていること、ＮＡＤＨの合成に必要なＡＴＰもＡＴＰ合成反応により補給されていることが確認できた。
Claims (16)
- ＮＡＤ＋を必要とする酵素反応系に、ＡＤＰ−リボースとニコチンアミドからＮＡＤ＋を合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素を添加することにより、前記酵素反応系内においてＮＡＤ＋の合成を行う補酵素の製造方法であって、
前記耐熱性酵素が、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ ＋ シンターゼ、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、及びリボースリン酸ピロホスホキナーゼである、補酵素の製造方法。 - ＮＡＤＨを必要とする酵素反応系に、ＡＤＰ−リボースとニコチンアミドからＮＡＤＨを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素を添加することにより、前記酵素反応系内においてＮＡＤＨの合成を行う補酵素の製造方法であって、
前記耐熱性酵素が、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ ＋ シンターゼ、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ、及びＮＡＤ ＋ からＮＡＤＨを合成する反応を触媒する酸化還元酵素である、補酵素の製造方法。 - 前記酸化還元酵素が、糖、アルコール、又は有機酸を基質とするデヒドロゲナーゼである、請求項２に記載の補酵素の製造方法。
- 前記酵素反応系内に、さらに、ＡＭＰ又はＡＤＰからＡＴＰを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素を添加し、前記酵素反応系内においてＡＴＰの合成を行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載の補酵素の製造方法。
- 前記ＡＴＰを合成するための反応に要する耐熱性酵素が、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼである、請求項４に記載の補酵素の製造方法。
- 前記耐熱性酵素が、非耐熱性微生物の発現系によって合成されたものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の補酵素の製造方法。
- 前記耐熱性酵素が、非耐熱性微生物を宿主とし、耐熱性酵素をコードしている遺伝子を導入した形質転換体が合成したものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の補酵素の製造方法。
- 前記形質転換体を培養して得られた菌体の加熱処理物を、前記酵素反応系に添加する、請求項７記載の補酵素の製造方法。
- 前記非耐熱性微生物が大腸菌である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の補酵素の製造方法。
- 請求項１〜９のいずれか一項に記載の補酵素の製造方法に用いられる補酵素製造用形質転換体セットであって、
非耐熱性微生物を宿主とし、ＡＤＰ−リボースとニコチンアミドからＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素をコードしている遺伝子が導入された１種又は２種以上の形質転換体からなることを特徴とする、補酵素製造用形質転換体セット。 - 前記耐熱性酵素が、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋シンターゼ、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、及びリボースリン酸ピロホスホキナーゼである、請求項１０に記載の補酵素製造用形質転換体セット。
- 前記耐熱性酵素が、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋シンターゼ、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ、及びＮＡＤ＋からＮＡＤＨを合成する反応を触媒する酸化還元酵素である、請求項１０に記載の補酵素製造用形質転換体セット。
- さらに、非耐熱性微生物を宿主とし、ＡＭＰ又はＡＤＰからＡＴＰを合成するための反応に要する１種又は２種以上の耐熱性酵素をコードしている遺伝子が導入された１種又は２種以上の形質転換体を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の補酵素製造用形質転換体セット。
- １の形質転換体に１種類の耐熱性酵素をコードする遺伝子が導入されている、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の補酵素製造用形質転換体セット。
- 前記非耐熱性微生物が大腸菌である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の補酵素製造用形質転換体セット。
- 前記形質転換体が、加熱処理されたものである、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の補酵素製造用形質転換体セット。
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