CN1845990A - 耐热化蔗糖磷酸化酶(sp)的方法 - Google Patents
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Abstract
提供通过修饰天然SP获得的耐热蔗糖磷酸化酶和制备所述耐热化SP的方法。与天然蔗糖磷酸化酶相比，所述耐热SP在下列位置中至少一个位置的氨基酸残基不同：分别对应于基序序列1的第14位、第29位和第44位的位置、对应基序序列2的第7位、第19位、第23位和第34位的位置以及对应基序序列3的第19位的位置；并且在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于55℃加热20分钟以后，所述耐热SP在37℃的酶活性是未加热耐热SP在37℃的酶活性的20％或更多。
Description
技术领域
本发明涉及耐热蔗糖磷酸化酶和编码所述耐热蔗糖磷酸化酶的基因。另外，本发明还涉及生产所述耐热蔗糖磷酸化酶的方法。
背景技术
蔗糖磷酸化酶(以下也称SP或SP酶)是例如可用于α-葡聚糖合成及葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)合成的酶。
α-葡聚糖(尤其是不溶性直链淀粉)被认为具有与膳食纤维相同的功能，可用于健康食品。另外，线性α-葡聚糖的直链淀粉具有这样的特征，例如能在其分子内包含碘、脂肪酸等，因而预期可用于诸如药物、化妆品和卫生产品的领域。直链淀粉也可用作生产具有与直链淀粉相似包合能力的环糊精及环链淀粉(cycloamylose)的原料。而且，含直链淀粉的膜的抗张强度与通用塑料相当，有良好的前景用作生物可降解塑料的原材料。因此，预期直链淀粉可在各种应用中使用。但是，很难获得足够纯的直链淀粉，这种淀粉也非常昂贵，因而仅在试剂水平分销，而很少用作工业原材料。因此，需要一种稳定而便宜地生产直链淀粉的方法。
例如G-1-P可用作医疗抗菌剂、抗肿瘤剂(以铂络合物形式)、治疗心脏病的药物(以胺盐形式)及α-葡聚糖合成的底物。
据报道，一些细菌(链球菌属细菌、明串珠菌属微生物、大肠杆菌、乳酸菌(lactic acid bacteria)等)中存在SP，这些细菌中所发现的SP的氨基酸序列和碱基序列是已知的。
α-葡聚糖或G-1-P生产中可使用各种SP，经常使用来自明串珠菌属细菌的SP。这是因为容易获得较大量的酶。
α-葡聚糖的工业生产中，需要基本上除去其他污染酶的活性，尤其是磷酸酶活性和淀粉酶活性。这是因为如果使用SP和GP合成α-葡聚糖的过程中有磷酸酶，生成的反应中间体G-1-P会降解，使α-葡聚糖收率降低。如果存在淀粉酶，所合成的α-葡聚糖会发生降解使其分子量变小。因此，必须去除这些污染酶。大量生产SP时，大肠杆菌和枯草杆菌是表达SP基因的理想宿主。但是，如图2和图3所示，大肠杆菌具有淀粉酶活性和磷酸酶活性，而枯草杆菌具有淀粉酶活性。如图2和图3所示，这些宿主具有的酶不能被55℃热处理灭活，但几乎能被60℃热处理完全灭活。因此，希望得到即使在60℃热处理后也不丧失活性的耐热SP，或是耐热性比淀粉酶或磷酸酶更强的SP。
作为参考，下列表1给出了热处理前后不同细菌(大肠杆菌TG-1、大肠杆菌BL21及枯草杆菌ANA-1)细胞提取物中淀粉酶活性和磷酸酶活性的具体数值。
表1
| 磷酸酶活性(％) | 淀粉酶活性(％) | ||||
| TG-1 | BL21 | TG-1 | BL21 | ANA-1 | |
| 加热前50℃55℃60℃65℃ | 10099.160.92.92.5 | 10098.674.53.12.0 | 10021.69.10.40.9 | 10028.69.700 | 10033.819.83.02.4 |
然而，具有耐热性的SP尤其是在高温(如60℃～75℃)时保持足够活性的SP仍然未知。
生产α-葡聚糖或G-1-P时，也优选在尽可能高的温度下进行反应。这是因为反应在高温下进行时，反应速率通常会升高，α-葡聚糖的可操作性也得以改善。α-葡聚糖尤其是直链淀粉发生老化变得不可溶解，从而形成沉淀或凝胶。已知老化速度取决于温度。当反应温度低时，后期出现可操作性方面的问题，如生成后直链淀粉溶液凝胶化。如果反应在高温下进行，则需要酶耐热。
然而，上述所有的细菌都是嗜常温菌，来源于细菌的耐热SP尤其是在高温(如50℃～60℃)时保持足够活性的SP仍然未知。因此，使用常规SP时，加热处理不能降低纯化成本，反应也不能在高温下进行。
就来源于细菌(原核生物)之外生物的SP来说，报道了一种来源于霉菌(真核生物)的SP(见非专利文献1)。根据此文献报道，来源于好食念珠菌(Moniliasitophila)(也称为中间脉孢霉(Neurospora intermedia))的SP在70℃加热30分钟后活性仍保持90％或更高。
然而，此参考文献中所报道的实验结果是利用纯度非常低的SP获得的，因此所观察到的SP活性是否是可真正定量测量的SP活性仍值得置疑。而且，许多霉菌向细菌体外分泌淀粉酶，因此必须高度纯化所用的SP酶，而且SP酶的纯化需要大量的时间和成本。不可能使用基因重组技术将这种霉菌来源的SP酶引入分泌小量磷酸酶和淀粉酶的宿主中。这是因为这种霉菌来源的SP氨基酸序列和碱基序列都未知。
有报道表明，将SP酶固定化可以提高该酶的耐热性，但固定化酶存在缺点，如底物特异性改变，而且固定化对耐热性的提高有限，因此希望提高SP酶本身的耐热性。目前尚未见通过引入突变来提高SP酶耐热性的报道。
有高浓度的蔗糖存在时SP酶的表观耐热性得以提高(见专利文献1)。然而，高浓度蔗糖所带来的耐热性升高是有限的，因此希望提高SP酶本身的耐热性。
为了解决这些问题，需要一种便于工业生产使用而且具有高耐热性的SP。
已经尝试使普通酶具有更高耐热性的理论方法，如脯氨酸理论和基于酶立体结构信息的氨基酸替换，但没有获得必然的成功。因此，当前使用基于随机突变的方法或使用随机突变和理论方法组合的方法。然而，在任何这些方法中，每种蛋白必须通过试错法来表征。
对于SP以外的其它酶，已经报道一旦确定参与提高酶耐热性的具体氨基酸位置，通过用其它氨基酸替换具体氨基酸残基，可以使酶具有耐热性(例如见非专利文献2-4)。
(专利文献1)
国际公开号02/097077小册子
(非专利文献1)
M.C.B.Pimentel et al.，″SCREENING，THERMAL PROPERTIESAND PRODUCTION IN YAM EXTRACT OF FUNGAL SUCROSEPHOSPHORYLASE″，Rev，Microbiol.，Sao Paulo，1992，23(3)，pp.199-205
(非专利文献2)
Martin Lehmann and Markus Wyss：″Engineering proteinsfor thermostability：the use of sequence alignments versusrational design and directed evolution″，Current Opinionin Biotechnology，2001，12，pp.371-375
(非专利文献3)
M.Lehmann et al.，″The consensus concept forthermostability engineering of proteins″，BiochemicaBiophysica Acta，2000，1543，pp.408-415
(非专利文献4)
Junichi Miyazaki et al.，″Ancestral Residues Stabilizing3-Isopropylmalate Dehydrogenase of an Extreme Thermophile：Experimental Evidence Supporting the Thermophilic CommonAncestor Hypothesis″，J.Biochem.，2001，129，pp.777-782
发明内容
本发明待解决问题
本发明意图解决前述问题，并且本发明的一个目的是提供比常规蔗糖磷酸化酶具有更好耐热性的蔗糖磷酸化酶。
解决问题的手段
为了通过提高序列已知的SP耐热性来解决前述问题，本发明人继续勤奋研究，结果最终发现对SP氨基酸序列中特定位置的氨基酸残基替换，得到具有耐热化SP，并完成了本申请所基于的发明。
本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶是通过修饰天然蔗糖磷酸化酶而得到的耐热化蔗糖磷酸化酶。
其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置上具有与天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：
与基序序列1：AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSAFGDWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS中第14位对应的位置、第29位对应的位置和第44位对应的位置；
与基序序列2：RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTFGEEQID中第7位对应的位置、第19位对应的位置、第23位对应的位置和第34位对应的位置；以及
与基序序列3：ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG中第19位对应的位置；并且，
其中在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于55℃加热20分钟后，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性为加热之前在37℃的酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列可与选自下组的氨基酸序列具有至少40％一致性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列可与选自下组的氨基酸序列具有至少60％一致性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列可以由一种核酸分子编码，所述核酸分子在严谨条件下与由编码选自下组的氨基酸序列的碱基序列组成的核酸分子杂交：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列可选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，天然蔗糖磷酸化酶可来源于选自变异链球菌(Streptococcusmutans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、表兄链球菌(Streptococcussorbinus)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、酒类酒球菌(Oenococcus oeni)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)和单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的细菌。
在一个实施方案中，天然蔗糖磷酸化酶可来源于变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌或缓症链球菌。
在一个实施方案中，天然蔗糖磷酸化酶可来源于变异链球菌或肠膜明串珠菌。
在一个实施方案中，对应于基序序列1中第14位的氨基酸残基可以是丝氨酸或异亮氨酸。
在一个实施方案中，对应于基序序列1中第29位的氨基酸残基可以是脯氨酸、丙氨酸或赖氨酸。
在一个实施方案中，对应于基序序列1中第44位的氨基酸残基可以是组氨酸、精氨酸或色氨酸。
在一个实施方案中，对应于基序序列1中第44位的氨基酸残基可以是精氨酸。
在一个实施方案中，对应于基序序列2中第7位的氨基酸残基可以是亮氨酸或异亮氨酸。
在一个实施方案中，对应于基序序列2中第19位的氨基酸残基可以是甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或酪氨酸。
在一个实施方案中，对应于基序序列2中第19位的氨基酸残基可以是缬氨酸或酪氨酸。
在一个实施方案中，对应于基序序列2中第23位的氨基酸残基可以是精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸或缬氨酸。
在一个实施方案中，对应于基序序列2中第23位的氨基酸残基可以是组氨酸。
在一个实施方案中，对应于基序序列2中第34位的氨基酸残基可以是丝氨酸或苏氨酸。
在一个实施方案中，对应于基序序列2中第34位的氨基酸残基可以是丝氨酸。
在一个实施方案中，对应于基序序列3中第19位的氨基酸残基可以是甘氨酸、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或丝氨酸。
在一个实施方案中，对应于基序序列3中第19位的氨基酸残基可以是甘氨酸。
在一个实施方案中，在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于57℃加热20分钟后，耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性可以是加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性的10％或更多。
在一个实施方案中，在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于57℃加热20分钟后，耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性可以是加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，在含20％蔗糖的20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于65℃加热20分钟后，耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性可以是加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性的10％或更多。
在一个实施方案中，在含20％蔗糖的20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于65℃加热20分钟后，耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性可以是加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶可以至少在对应基序序列1中第14位的位置上具有与天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶可以至少在对应基序序列3中第19位的位置上具有与天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基。
本发明的一个方法是生产耐热化蔗糖磷酸化酶的方法，该方法包括：
修饰含有编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的第一核酸分子，从而获得含修饰序列的第二核酸分子；
制备含第二核酸分子的表达载体；
将该表达载体引入细胞中以表达耐热化蔗糖磷酸化酶；以及
回收所表达的耐热化蔗糖磷酸化酶，
其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置上具有与第一蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：
与基序序列1：AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSAFGDWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS中第14位对应的位置、第29位对应的位置和第44位对应的位置；
与基序序列2：RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTFGEEQID中第7位对应的位置、第19位对应的位置、第23位对应的位置和第34位对应的位置；以及
与基序序列3：ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG中第19位对应的位置；并且，
其中耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于55℃加热20分钟后，在37℃的酶活性为加热之前37℃时酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，第一蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列至少有40％一致性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，第一蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列至少有60％一致性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，第一蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列可以由一种核酸分子编码，所述核酸分子在严谨条件下与由编码选自下组的氨基酸序列的碱基序列组成的核酸分子杂交：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，第一蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列可选自：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，第一蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列可来源于选自变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌、缓症链球菌、肠膜明串珠菌、酒类酒球菌、嗜酸乳杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌的细菌。
在一个实施方案中，第一蔗糖磷酸化酶可来源于变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌或缓症链球菌。
在一个实施方案中，天然蔗糖磷酸化酶可来源于变异链球菌或肠膜明串珠菌。
在一个实施方案中，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于57℃加热20分钟后，其在37℃的酶活性可以是加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的10％或更多。
在一个实施方案中，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于57℃加热20分钟后，其在37℃的酶活性可以是加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，所述耐热化蔗糖磷酸化酶至少在对应基序序列1中第14位的位置上有与第一蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶至少在对应基序序列3中第19位的位置上有与第一蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基。
本发明的核酸分子包含编码耐热化蔗糖磷酸化酶的碱基序列。
本发明的载体包含所述核酸分子。
本发明的细胞包括所述核酸分子。
本发明的一个方法是合成葡萄糖-1-磷酸的方法，该方法包括使含根据权利要求1的耐热化蔗糖磷酸化酶、蔗糖和无机磷酸的反应液进行反应，生成葡萄糖-1-磷酸。
在一个实施方案中，反应可在50℃～70℃的温度下进行。
本发明的方法之一是合成葡萄糖聚合物的方法，该方法包括使含下列物质的反应液进行反应以生成葡萄糖聚合物：根据权利要求1的耐热化蔗糖磷酸化酶；以α-葡萄糖-1-磷酸为底物的第二磷酸化酶；蔗糖；引发剂；和无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸。
在一个实施方案中，所述葡萄糖聚合物可以是α-葡聚糖。
在一个实施方案中，所述第二磷酸化酶可以是α-葡聚糖磷酸化酶。
在一个实施方案中，所述第二磷酸化酶可选自纤维二糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶、昆布糊精(laminaridextrin)磷酸化酶、β-1，3-葡聚糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶。
在一个实施方案中，反应可在50℃～70℃的温度下进行。
本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶是修饰天然蔗糖磷酸化酶后得到的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置上具有与所述天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：与SEQ ID NO：2氨基酸序列中第47位苏氨酸(T47)对应的位置、第62位丝氨酸(S62)对应的位置、第77位酪氨酸(Y77)对应的位置、第128位缬氨酸(V128)对应的位置、第140位赖氨酸(K140)对应的位置、第144位谷氨酰胺(Q144)对应的位置、第155位天冬酰胺(N155)对应的位置和第249位天冬氨酸(D249)对应的位置；其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于55℃加热20分钟后，其在37℃的酶活性为加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，所述天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列可以有至少40％一致性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，所述天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列可以有至少60％一致性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，所述天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列可以由一种核酸分子编码，所述核酸分子在严谨条件下与由编码选自下组的氨基酸序列的碱基序列组成的核酸分子杂交：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，所述碱基序列可选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19。
在一个实施方案中，所述天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列可选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，所述天然蔗糖磷酸化酶可以来源于选自变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌、缓症链球菌、肠膜明串珠菌、酒类酒球菌、嗜酸乳杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌的细菌。
在一个实施方案中，所述天然蔗糖磷酸化酶可以来源于选自变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌和缓症链球菌的细菌。
在一个实施方案中，所述天然蔗糖磷酸化酶可以来源于变异链球菌或肠膜明串珠菌。
在一个实施方案中，与T47对应的位置上的氨基酸残基可以是丝氨酸或异亮氨酸。
在一个实施方案中，与S62对应的位置上的氨基酸残基可以是脯氨酸、丙氨酸或赖氨酸。
在一个实施方案中，与Y77对应的位置上的氨基酸残基可以是组氨酸、精氨酸或色氨酸。
在一个实施方案中，与Y77对应的位置上的氨基酸残基可以是精氨酸。
在一个实施方案中，与V128对应的位置上的氨基酸残基可以是亮氨酸或异亮氨酸。
在一个实施方案中，与K140对应的位置上的氨基酸残基可以是甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或酪氨酸。
在一个实施方案中，与K140对应的位置上的氨基酸残基可以是缬氨酸或酪氨酸。
在一个实施方案中，与Q144对应的位置上的氨基酸残基可以是精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸或缬氨酸。
在一个实施方案中，与Q144对应的位置上的氨基酸残基可以是组氨酸。
在一个实施方案中，与N155对应的位置上的氨基酸残基可以是丝氨酸或苏氨酸。
在一个实施方案中，与N155对应的位置上的氨基酸残基可以是丝氨酸。
在一个实施方案中，与D249对应的位置上的氨基酸残基可以是甘氨酸、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或丝氨酸。
在一个实施方案中，与D249对应的位置上的氨基酸残基可以是甘氨酸。
在一个实施方案中，本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于57℃加热20分钟后，其在37℃的酶活性可以是加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的10％或更多。
在一个实施方案中，本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于57℃加热20分钟后，其在37℃的酶活性可以是加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在含20％蔗糖的20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于65℃加热20分钟后，其在37℃的酶活性可以是加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的10％或更多。
在一个实施方案中，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在含20％蔗糖的20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于65℃加热20分钟后，其在37℃的酶活性可以是加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶与天然蔗糖磷酸化酶相比至少在与T47对应的位置上有不同氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶与天然蔗糖磷酸化酶相比至少在与T47对应的位置上有不同氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶与天然蔗糖磷酸化酶相比至少在与D249对应的位置上有不同氨基酸残基。
本发明的方法是生产耐热化蔗糖磷酸化酶的方法，该方法包括下列步骤：修饰含有编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的第一核酸分子，从而获得含修饰碱基序列的第二核酸分子；制备含第二核酸分子的表达载体；将表达载体导入细胞中以表达耐热化蔗糖磷酸化酶；以及回收所表达的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与第一蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：与氨基酸序列SEQ ID NO：2中的第47位苏氨酸(T47)对应的位置、第62位丝氨酸(S62)对应的位置、第77位酪氨酸(Y77)对应的位置、第128位缬氨酸(V128)对应的位置、第140位赖氨酸(K140)对应的位置、第144位谷氨酰胺(Q144)对应的位置、第155位天冬酰胺(N155)对应的位置和第249位天冬氨酸(D249)对应的位置；其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于55℃加热20分钟后，其在37℃的酶活性为加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，第一蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列与选自下列序列的氨基酸序列可以有至少40％一致性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，第一蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列与选自下列序列的氨基酸序列可以有至少60％一致性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，第一蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列可以由一种核酸分子编码，所述核酸分子在严谨条件下与由编码选自下组的氨基酸序列的碱基序列组成的核酸分子杂交：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，第一蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列可选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
在一个实施方案中，第一蔗糖磷酸化酶可来源于选自变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌、缓症链球菌、肠膜明串珠菌、酒类酒球菌、嗜酸乳杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌的细菌。
在一个实施方案中，第一蔗糖磷酸化酶可来源于选自变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌或缓症链球菌的细菌。
在一个实施方案中，第一蔗糖磷酸化酶来源于变异链球菌或肠膜明串珠菌。
在一个实施方案中，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于57℃加热20分钟后，其在37℃的酶活性为加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的10％或更多。
在一个实施方案中，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于57℃加热20分钟后，其在37℃的酶活性为加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，所述耐热化蔗糖磷酸化酶与第一蔗糖磷酸化酶相比至少在与T47对应的位置上有不同氨基酸残基。
在一个实施方案中，所述耐热化蔗糖磷酸化酶与第一蔗糖磷酸化酶相比至少在与D249对应的位置上有不同氨基酸残基。
本发明的核酸分子包含编码所述耐热化蔗糖磷酸化酶的碱基序列。
本发明的载体包含所述核酸分子。
本发明的细胞包含所述核酸分子。
根据本发明合成葡萄糖-1-磷酸的方法包括使含耐热化蔗糖磷酸化酶、蔗糖与无机磷酸的反应液进行反应以生成葡萄糖-1-磷酸。
在一个实施方案中，上述反应可以在50℃～70℃的温度下进行。
根据本发明合成葡萄糖聚合物的方法包括使含下列物质的反应液反应以生成葡萄糖聚合物：耐热化蔗糖磷酸化酶；以葡萄糖-1-磷酸为底物的第二磷酸化酶；蔗糖；引发剂；以及无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸。
在一个实施方案中，所述葡萄糖聚合物可以是α-葡聚糖。
在一个实施方案中，所述第二磷酸化酶可以是α-葡聚糖磷酸化酶。
在一个实施方案中，所述第二磷酸化酶可选自纤维二糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶、昆布糊精磷酸化酶、β-1，3-葡聚糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶。
在一个实施方案中，反应可在在50℃～70℃的温度下进行。
发明效果
根据本发明，得到了可在高温(如60℃或更高)下反应并且在高温(如60℃或更高)下具有很高活性的SP酶。经过这种耐热性提高，使通过抑制微生物污染及α-葡聚糖老化而高效生产G-1-P或α-葡聚糖成为可能。
要求保护的本发明具备这样的优点，当编码本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶的基因(如通过提高变异链球菌来源的SP耐热性而获得的、编码耐热化SP的基因)在嗜中温性细菌宿主如大肠杆菌中高度表达时，来源于所述宿主细菌的污染酶可通过在60℃加热含有耐热化酶的细菌细胞提取物而简便除去。因此，本发明的方法在酶纯化方面具有优势。
本发明的方法不仅对来源于变异链球菌的SP及来源于肠膜明串珠菌的SP有效，也可应用于提高与来源于变异链球菌的SP氨基酸结构具有高度同源性的其他SP的耐热性。
因此，其它生物来源的耐热化SP在选自下组的至少一个位置具有与天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：与基序序列1：
AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSAFGDWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS中第14位对应的位置、第29位对应的位置和第44位对应的位置；与基序序列2：RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTFGEEQID中第7位对应的位置、第19位对应的位置、第23位对应的位置和第34位对应的位置；以及与基序序列3：ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG中第19位对应的位置。
也可得到其他生物来源的耐热化SP，其在选在下组的至少一个位置具有与天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：与第47位苏氨酸(T47)对应的位置、与第62位丝氨酸(S62)对应的位置、与第77位酪氨酸(Y77)对应的位置、与第128位缬氨酸(V128)对应的位置、与第140位赖氨酸(K140)对应的位置、与第144位谷氨酰胺(Q144)对应的位置、与第155位天冬酰胺(N155)对应的位置以及与第249位天冬氨酸(D249)对应的位置。
附图简述
图1A：图1A表示来源于一些生物的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列，使用GENETYX-WIN Ver.4.0的多重匹配对它们进行匹配。图1B接着图1A。
图1B：图1B是图1A的续图。
图1C：图1C是图1B的续图。
图2：图2表示各种细菌(大肠杆菌TG-1和大肠杆菌BL21)分别在50℃、55℃、60℃或65℃下加热30分钟后的磷酸酶剩余活性(％)。
图3：图3表示各种细菌(大肠杆菌TG-1、大肠杆菌BL21及枯草杆菌ANA-1)分别在50℃、55℃、60℃或65℃下加热30分钟后的淀粉酶剩余活性(％)。
(序列表说明)
SEQ ID NO：1：编码变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：2：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：3：编码肺炎链球菌来源的蔗糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：4：肺炎链球菌来源的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：5：编码表兄链球菌来源的蔗糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：6：表兄链球菌来源的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：7：编码肠膜明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：8：肠膜明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：9：编码酒类酒球菌来源的蔗糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：10：酒类酒球菌来源的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：11：编码缓症链球菌来源的蔗糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：12：缓症链球菌来源的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：13：编码肠膜明串珠菌来源的第二种蔗糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：14：肠膜明串珠菌来源的第二种蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：15：编码嗜酸乳杆菌来源的第一种蔗糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：16：嗜酸乳杆菌来源的第一种蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：17：编码嗜酸乳杆菌来源的第二种蔗糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：18：嗜酸乳杆菌来源的第二种蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：19：编码单核细胞增生利斯特氏菌来源的蔗糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ IDNO：20：单核细胞增生利斯特氏菌来源的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：21：编码实施例2A(1)中制备的、包含全部8个突变(T47S、S62P、Y77H、V128L、K140M、Q144R、N155S和D249G)的耐热化蔗糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：22：实施例2A(1)中制备的、包含全部8个突变(T47S、S62P、Y77H、V128L、K140M、Q144R、N155S和D249G)的耐热化蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：23：编码实施例7中使用的、有氨基酸替换和C端插入的蔗糖磷酸化酶的碱基序列。
SEQ ID NO：24：实施例7中使用、有氨基酸替换和C端插入的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25：基序序列1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26：基序序列2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：27：基序序列3的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明将在下面解释。应该理解的是除非另外特别说明，在整篇本说明书中用于本说明书中的术语具有本领域正常使用的含义。
(1.蔗糖磷酸化酶)
除非另外特别说明，“蔗糖磷酸化酶”及“SP”在本说明书中可以互换使用，指具有蔗糖磷酸化酶活性的酶。蔗糖磷酸化酶在分类学上属于EC.2.4.1.7。蔗糖磷酸化酶所催化的反应如下式所示：
蔗糖+无机磷酸＜＝＞α-D-葡萄糖-1-磷酸+D-果糖 (1)
自然界中多种生物中均含有蔗糖磷酸化酶。产生蔗糖磷酸化酶的生物的例子包括链球菌属的细菌(如变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌、嗜热链球菌和缓症链球菌)、肠膜明串珠菌、酒类酒球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌属物种(如长双歧杆菌和青春双岐杆菌)、土壤杆菌属物种(如葡萄土壤杆菌)、假单胞菌属物种(如嗜糖假单胞菌)、大肠杆菌、利斯特氏菌属物种(如无害利斯特氏菌和单核细胞增生利斯特氏菌)、梭状芽胞杆菌属物种、产糖芽霉菌(Pullularia pullulans)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、聚球蓝细菌属物种(Synecococcus sp.)、黑曲霉、Sclerotinea escerotiorum和衣藻属物种。产生蔗糖磷酸化酶的生物不限于这些。
根据本发明方法所使用的第一蔗糖磷酸化酶(如天然蔗糖磷酸化酶)优选来源于细菌，更优选来自嗜常温菌。然而，这些蔗糖磷酸化酶不耐热。因此，这些蔗糖磷酸化酶在高温(如约50℃～60℃或更高)下不能充分地催化反应。因此，当反应在细菌来源SP最佳反应温度即约30℃～约40℃进行时，会出现细菌酶污染或α-葡聚糖老化的问题，使得不能高效生产α-葡聚糖或G-1-P。
在本发明说明书中，“来源于”一种生物的酶不仅指该酶直接从该生物分离出来，也指以任意形式利用该生物所得到的酶。例如，将从一种生物获得的编码酶的基因导入到大肠杆菌中并随后将所表达的酶从大肠杆菌分离出来时，该酶称为“来源于”该生物。
编码变异链球菌的天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列在SEQ ID NO：1中给出，其氨基酸序列在SEQ ID NO：2中给出。已知在变异链球菌中有含有与SEQ ID NO：2不同氨基酸序列的天然蔗糖磷酸化酶。含有SEQ ID NO：2氨基酸序列的SP和来源于变异链球菌的其他SP中，第47位氨基酸都是苏氨酸，第62位氨基酸都是丝氨酸，第77位氨基酸都是酪氨酸，第128位氨基酸都是缬氨酸，第140位氨基酸都是赖氨酸，第144位氨基酸都是谷氨酰胺，第155位氨基酸都是天冬酰胺，因此这两种蔗糖磷酸化酶的耐热性几乎是相等的。在本发明书中，“天然”蔗糖磷酸化酶不仅包括从最初生产蔗糖磷酸化酶的细菌分离的蔗糖磷酸化酶，也包括通过基因重组得到的氨基酸序列与天然蔗糖磷酸化酶相同的蔗糖磷酸化酶。
编码肺炎链球菌天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列在SEQ ID NO：3中给出，其编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：4中给出。
编码表兄链球菌天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列在SEQ ID NO：5中给出，其编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：6中给出。
编码肠膜明串珠菌天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列在SEQ ID NO：7中给出，其编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：8中给出。
编码酒类酒球菌天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列在SEQ ID NO：9中给出，其编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：10中给出。
编码缓症链球菌天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列在SEQ ID NO：11中给出，其编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：12中给出。
编码肠膜明串珠菌第二种天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列在SEQ ID NO：13中给出，其编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：14中给出。
编码嗜酸乳杆菌第一种天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列在SEQ ID NO：15中给出，其编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：16中给出。
编码嗜酸乳杆菌第二种天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列在SEQ ID NO：17中给出，其编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：18中给出。
编码单核细胞增生利斯特氏菌天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列在SEQ ID NO：19中给出，其编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：20中给出。
这些天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列和氨基酸序列是示例性的，已知自然界中也存在与这些序列稍微不同的变体(也称为等位基因变体)。除了这些示例性序列外，本发明在提高耐热性时也可使用这些天然变体。
根据本发明方法所使用的第一蔗糖磷酸化酶(如天然蔗糖磷酸化酶)优选来源于变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌、缓症链球菌、肠膜明串珠菌、酒类酒球菌、嗜酸乳杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌，更优选来源于变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌或缓症链球菌。天然蔗糖磷酸化酶最优选来源于变异链球菌或肠膜明串珠菌。
可参照已知蔗糖磷酸化酶的序列设计引物，并以来源于欲获取蔗糖磷酸化酶基因的基因组文库作为模板进行PCR，从而得到蔗糖磷酸化酶基因。作为替代方案，也可根据已知的SP基因序列信息直接通过化学合成来制备SP基因，而不需要制备基因组文库。例如Te′o等(FEMS Microbiological Letters，Vol.190，pp.13-19，2000)及其它文献中描述了合成基因的方法。
得到的SP基因可以用本领域熟练技术人员公知的方法插入合适的载体中。例如，对于大肠杆菌载体来说可使用pMW118(Nippon Gene Co.，Ltd.制造)、pUC18(Takara Bio Inc制造)、pKK233-2(Amersham-Pharmacia-Biotech制造)等，对于枯草杆菌载体来说可使用pUB110(可从American Type Culture Collection购买)、pHY300PLK(Takara Bio Inc制造)等。
(2.提高蔗糖磷酸化酶的耐热性)
根据本发明的方法包括修饰包含编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的第一核酸分子，从而获得包含修饰碱基序列的第二核酸分子；制备包含第二核酸分子的表达载体；将表达载体导入细胞以表达耐热化蔗糖磷酸化酶；和回收所表达的耐热化蔗糖磷酸化酶。
(2.1分离含编码第一蔗糖磷酸化酶(如天然蔗糖磷酸化酶)的碱基序列的核酸分子)
包含编码根据本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子也属于本发明的范围。这样的核酸分子可以根据本发明说明书的公开内容用本领域内已知的方法获得。
可以从产生所述天然蔗糖磷酸化酶的天然存在的细菌中直接分离包含编码所述天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子。
例如，首先，可从变异链球菌等直接分离天然蔗糖磷酸化酶。以变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶的方法为例，首先将变异链球菌接种入合适的培养基(如LB培养基)中，然后于37℃振摇培养过夜。然后离心培养物收集变异链球菌细胞。所得细胞沉淀悬于20mM Tris盐酸缓冲液(pH7.0)中，超声破坏细胞，得到含破裂细胞的液体。然后，向液体中加入蔗糖使其终浓度为10％。将此含破裂细胞的液体在55℃水浴中加热30分钟。加热后，用离心机(BECKMANN制造的AVANTI J-25I)离心所述含破裂细胞的液体，除去不溶性蛋白质，获得上清液。将得到的上清液流过预先平衡的阴离子交换树脂Q-Sepharose，使蔗糖磷酸化酶吸附到树脂上。树脂用含100mM氯化钠缓冲液洗涤除去杂质。然后，用含300mM氯化钠的缓冲液洗脱蔗糖磷酸化酶，得到来源于变异链球菌的蔗糖磷酸化酶溶液。
通常此阶段的溶液可作为用于胰蛋白酶处理的含蔗糖磷酸化酶溶液，但有时还需进一步纯化。在这种情况下，必要时，可以通过组合经Sephacryl S-200HR(Pharmacia制造)等的凝胶过滤层析进行分级分离以及经Phenyl-TOYOPEARL650M(Tosoh Corporation制造)的疏水层析进行分级分离，得到纯化的变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶溶液。其他细菌物种来源的蔗糖磷酸化酶也可用相同方法进行纯化。
这样得到的纯化蔗糖磷酸化酶用胰蛋白酶处理，得到的胰蛋白酶处理片段用HPLC分离，用肽测序仪测定分离得到的任意肽片段的N-端氨基酸序列。然后用基于已鉴定氨基酸序列而制备的合成寡核苷酸探针，筛选合适的基因组文库或cDNA文库，从而获得含编码天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子(也称基因)。制备寡核苷酸探针和cDNA文库以及通过核酸杂交筛选它们的基本策略对本领域技术人员是已知的。例如，见Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(1989)；DNA Cloning，vol.I and II(edited by D.N.Glover，1985)；Oligonucleotide Synthesis(edited by M.J.Gait，1984)；Nucleic Acid Hybridization(edited by B.D.Hames & S.J.Higgins，1984)。
作为替代方案，基于与编码蔗糖磷酸化酶的碱基序列已知的某些蔗糖磷酸化酶碱基序列的同源性，可以用含至少部分该碱基序列的核酸探针通过杂交而进行筛选，从而获得含另一种蔗糖磷酸化酶碱基序列的核酸分子。这些方法在本领域已知。
作为替代方案，制备对应于多种蔗糖磷酸化酶氨基酸序列中保守区域的简并引物，进行PCR，获得所述蔗糖磷酸化酶的碱基序列。这些方法在本领域已知。
筛选基因组文库时，可以使用本领域技术人员熟知的方法亚克隆所得核酸分子。例如将含目标基因的λ噬菌体、合适的大肠杆菌和合适的辅助噬菌体混合可以容易的获得含目标基因的质粒。而后，可以通过用含质粒的溶液转化合适的大肠杆菌来亚克隆目标基因。通过将得到的转化体加以培养，可以获得质粒DNA，例如用碱SDS方法获得质粒DNA，同时可以测定目标基因的碱基序列。测定碱基序列的方法对本领域技术人员公知。另外，通过使用基于DNA片段的碱基序列合成的引物，使用例如变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌等的基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR)，可以直接扩增蔗糖磷酸化酶基因。
在本说明书中，所述“核酸分子”可只由天然核苷酸组成，可以含有非天然核苷酸，或可以只由非天然核苷酸组成。非天然核苷酸的实例包括衍生核苷酸(也称核苷酸类似物)。所述“衍生核苷酸”和所述“核苷酸类似物”指那些不同于天然存在核苷酸但与起源核苷酸具有相似功能的核苷酸。这些衍生核苷酸和核苷酸类似物在本领域公知。这些衍生核苷酸和核苷酸类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。
(2.2修饰含编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的第一核酸分子)
修饰含编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的第一核酸分子，获得含修饰碱基序列的第二核酸分子。第一核酸分子可以是如上(2.1)获得的、含编码天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子。所述第一核酸分子也可以是含编码与天然蔗糖磷酸化酶相比具有基本相同酶活性的蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子，其中1个或几个或更多氨基酸被替换、缺失或添加到编码天然蔗糖磷酸化酶的碱基序列中。所列出的SEQ ID NO：23的碱基序列是这种编码具有天然蔗糖磷酸化酶氨基酸序列的氨基酸替换及插入的蔗糖磷酸化酶氨基酸序列的一个碱基序列实例。与天然碱基序列(即SEQ ID NO：1的碱基序列)相比，该碱基序列中3′-端的4个碱基被替换，而且3′-端还插入了18个碱基。因此与天然氨基酸序列(即SEQ ID NO：2的碱基序列)相比，该碱基序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：24的氨基酸序列)中C-端的两个氨基酸被替换，同时在C-端添加了6个氨基酸，但是此酶的酶活性基本与天然蔗糖磷酸化酶相同。“具有基本相同的酶活性”表示，在与天然蔗糖磷酸化酶相同的条件下测定与天然蔗糖磷酸化酶氨基酸序列相比具有氨基酸替换、缺失或添加的蔗糖磷酸化酶的酶活性时，酶活性范围在天然蔗糖磷酸化酶酶活性的±20％、优选±10％、更优选±5％的范围内。
可使用已知方法如定点突变、用诱变剂突变(用致突变剂如亚硝酸盐、紫外线处理目标基因)或易错PCR进行修饰。从容易获得目标突变的角度来看优选使用定点突变，因为当使用定点突变时可在目标位点引入目标修饰。作为替代方案，可直接合成含目标序列的核酸分子。这些化学合成方法在本领域公知。
本发明人发现，通过用另一个氨基酸残基替换蔗糖磷酸化酶氨基酸序列中特定位置上的氨基酸残基，可提高所得蔗糖磷酸化酶的耐热性。这种特定位置可通过将以下任意基序序列或SEQ ID NO：2的氨基酸序列与比较对象氨基酸序列进行比对而确定：
基序序列1：
AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSAFGDWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS(SEQ ID NO：25)；
基序序列2：RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTFGEEQID(SEQ IDNO：26)；以及
基序序列3：ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG(SEQ ID NO：27)。
基序序列1、2和3存在于变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶氨基酸序列(SEQ IDNO：2)中。这些基序序列在变异链球菌来源蔗糖磷酸化酶的如下位置：基序序列1：SEQ ID NO：2所列氨基酸序列的第34位至第89位；基序序列2：SEQ ID NO：2所列氨基酸序列的第122位至第163位；基序序列3：SEQ ID NO：2所列氨基酸序列的第231位至第268位。天然蔗糖磷酸化酶通常含有这些基序序列或与之高度同源的序列。本领域内的技术人员可以容易地确定这些基序序列在其他蔗糖磷酸化酶中的位置。
在根据本发明的方法中，修饰含编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子，以得到由修饰核酸分子编码的耐热化蔗糖磷酸化酶，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与所述天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：基序序列1中第14位对应的位置、第29位对应的位置和第44位对应的位置；基序序列2中第7位对应的位置、第19位对应的位置、第23位对应的位置和第34位对应的位置；和基序序列3中第19位对应的位置。作为替代方案，修饰含编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子，以得到由修饰核酸分子编码的耐热化蔗糖磷酸化酶，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与所述天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：与SEQ ID NO：2氨基酸序列中第47位苏氨酸(T47)对应的位置、第62位丝氨酸(S62)对应的位置、第77位酪氨酸(Y77)对应的位置、第128位缬氨酸(V128)对应的位置、第140位赖氨酸(K140)对应的位置、第144位谷氨酰胺(Q144)对应的位置、第155位天冬酰胺(N155)对应的位置和第249位天冬氨酸(D249)对应的位置。优选的是修饰含编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子，以得到由修饰核酸分子编码的耐热化蔗糖磷酸化酶，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少两个位置、更优选至少3个位置、还优选至少4个位位置、仍更优选至少5个位置、仍更优选至少6个位置、特别优选至少7个位置、最优选所有这8个位置具有与所述天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：基序序列1中第14位对应的位置、第29位对应的位置和第44位对应的位置；基序序列2中第7位对应的位置、第19位对应的位置、第23位对应的位置和第34位对应的位置；基序序列3中第19位对应的位置(或者是与SEQ ID NO：2氨基酸序列中第47位苏氨酸(T47)对应的位置、第62位丝氨酸(S62)对应的位置、第77位酪氨酸(Y77)对应的位置、第128位缬氨酸(V128)对应的位置、第140位赖氨酸(K140)对应的位置、第144位谷氨酰胺(Q144)对应的位置、第155位天冬酰胺(N155)对应的位置和第249位天冬氨酸(D249)对应的位置)。
在一个实施方案中，修饰含编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子，以得到由修饰核酸分子编码的耐热化蔗糖磷酸化酶，所述耐热化蔗糖磷酸化酶至少在基序序列1中第14位(或与SEQ ID NO：2氨基酸序列中第47位苏氨酸(T47)对应的位置)与天然蔗糖磷酸化酶不同。
在一个实施方案中，修饰含编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子，以得到由修饰核酸分子编码的耐热化蔗糖磷酸化酶，所述耐热化蔗糖磷酸化酶至少在基序序列3中第19位(或与SEQ ID NO：2氨基酸序列中第249位天冬氨酸(D249)对应的位置)与天然蔗糖磷酸化酶不同。
在一个实施方案中，修饰含编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子，以得到由修饰核酸分子编码的耐热化蔗糖磷酸化酶，所述耐热化蔗糖磷酸化酶至少在基序序列2中第34位(或与SEQ ID NO：2氨基酸序列中第155位天冬酰胺(N155)对应的位置)与天然蔗糖磷酸化酶不同。
在一个实施方案中，修饰含编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子，以得到由修饰核酸分子编码的耐热化蔗糖磷酸化酶，与天然蔗糖磷酸化酶相比，所述耐热化蔗糖磷酸化酶至少在与SEQ ID NO：2氨基酸序列中以下位置组合所对应的位置不同：
(1)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置、基序序列1中第44位对应位置、基序序列2中第7位对应位置、基序序列2中第19位对应位置、基序序列2中第23位对应位置、基序序列2中第34位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合(即所有8个位置)；
(2)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置、基序序列1中第44位对应位置、基序序列2中第7位对应位置、基序序列2中第23位对应位置、基序序列2中第34位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(3)基序序列1中第14位对应位置、基序序列2中第7位对应位置、基序序列2中第23位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(4)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置、基序序列2中第23位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(5)基序序列1中第14位对应位置、基序序列2中第7位对应位置、基序序列2中第23位对应位置、基序序列2中第34位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(6)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置、基序序列2中第7位对应位置、基序序列2中第34位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(7)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置、基序序列1中第44位对应位置、基序序列2中第7位对应位置、基序序列2中第19位对应位置和基序序列2中第23位对应位置的组合；
(8)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置、基序序列1中第44位对应位置、基序序列2中第7位对应位置、基序序列2中第23位对应位置和基序序列2中第34位对应位置的组合；
(9)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置、基序序列2中第23位对应位置、基序序列2中第34位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(10)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第44位对应位置、基序序列2中第19位对应位置、基序序列2中第23位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(11)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置、基序序列1中第44位对应位置、基序序列2中第23位对应位置、基序序列2中第34位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(12)基序序列2中第7位对应位置、基序序列2中第23位对应位置、基序序列2中第34位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(13)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置、基序序列2中第7位对应位置、基序序列2中第23位对应位置和基序序列2中第34位对应位置的组合；
(14)基序序列2中第7位对应位置、基序序列2中第34位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(15)基序序列1中第29位对应位置、基序序列2中第7位对应位置、基序序列2中第23位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(16)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置、基序序列2中第19位对应位置、基序序列2中第34位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(17)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(18)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置、基序序列2中第34位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(19)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置、基序序列1中第44位对应位置、基序序列2中第7位对应位置和基序序列2中第23位对应位置的组合；
(20)基序序列1中第44位对应位置、基序序列2中第7位对应位置和基序序列2中第34位对应位置的组合；
(21)基序序列1中第44位对应位置、基序序列2中第19位对应位置、基序序列2中第23位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合；
(22)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置和基序序列2中第7位对应位置的组合；
(23)基序序列1中第14位对应位置、基序序列1中第29位对应位置、基序序列2中第23位对应位置和基序序列2中第34位对应位置的组合；以及
(24)基序序列1中第14位对应位置和基序序列3中第19位对应位置的组合。
在另一实施方案中，修饰含编码第一种蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子，以得到由修饰核酸分子编码的耐热化蔗糖磷酸化酶，与天然蔗糖磷酸化酶相比，所述耐热化蔗糖磷酸化酶至少在与SEQ ID NO：2氨基酸序列中以下位置组合所对应的位置不同：
(1)第47位上苏氨酸(T47)对应位置、第62位上丝氨酸(S62)对应位置、第77位上酪氨酸(Y77)对应位置、第128位上缬氨酸(V128)对应位置、第140位上赖氨酸(K140)对应位置、第144位上谷氨酰胺(Q144)对应位置、第155位上天冬酰胺(N155)对应位置和第249位上天冬氨酸(D249)对应位置的组合(即所有8个位置)；
(2)第47位上苏氨酸(T47)对应位置、第62位上丝氨酸(S62)对应位置、第77位上酪氨酸(Y77)对应位置、第128位上缬氨酸(V128)对应位置、第144位上谷氨酰胺(Q144)对应位置、第155位上天冬酰胺(N155)对应位置和第249位上天冬氨酸(D249)对应位置的组合；
(3)T47对应位置、V128对应位置、Q144对应位置和D249对应位置的组合；
(4)T47对应位置、S62对应位置、Q144对应位置和D249对应位置的组合；
(5)T47对应位置、V128对应位置、Q144对应位置、N155对应位置和D249对应位置的组合；
(6)T47对应位置、S62对应位置、V128对应位置、N155对应位置和D249对应位置的组合；
(7)T47对应位置、S62对应位置、Y77对应位置、V128对应位置、K140对应位置和Q144对应位置的组合；
(8)T47对应位置、S62对应位置、Y77对应位置、V128对应位置、Q144对应位置和N155对应位置的组合；
(9)T47对应位置、S62对应位置、Q144对应位置、N155对应位置和D249对应位置的组合；
(10)T47对应位置、Y77对应位置、K140对应位置、Q144对应位置和D249对应位置的组合；
(11)T47对应位置、S62对应位置、Y77对应位置、Q144对应位置、N155对应位置和D249对应位置的组合；
(12)V128对应位置、Q144对应位置、N155对应位置和D249对应位置的组合；
(13)T47对应位置、S62对应位置、V128对应位置、Q144对应位置、N155对应位置的组合；
(14)V128对应位置、N155对应位置和D249对应位置的组合；
(15)S62对应位置、V128对应位置、Q144对应位置和D249对应位置的组合；
(16)T47对应位置、S62对应位置、K140对应位置、N155对应位置和D249对应位置的组合；
(17)T47对应位置、S62对应位置和D249对应位置的组合；
(18)T47对应位置、S62对应位置、N155对应位置和D249对应位置的组合；
(19)T47对应位置、S62对应位置、Y77对应位置、V128对应位置和Q144对应位置的组合；
(20)Y77对应位置、V128对应位置和N155对应位置的组合；
(21)Y77对应位置、K140对应位置、Q144对应位置和D249对应位置的组合；
(22)T47对应位置、S62对应位置和V128对应位置的组合；
(23)T47对应位置、S62对应位置、Q144对应位置和N155对应位置的组合；以及
(24)T47对应位置和D249对应位置的组合。
本发明说明书中“SEQ ID NO：2氨基酸序列中第47位上苏氨酸(T47)对应位置”表示，当被研究氨基酸序列和SEQ ID NO：2氨基酸序列进行比对以使两序列之间同源性最大时，如果必要可以在一个序列中插入间隙，与所列出的SEQ ID NO：2中第47位上的苏氨酸匹配的位置。SEQ ID NO：2氨基酸序列中插入间隙时，计算氨基酸残基数目时不计间隙。更优选的是，以上短语表示当SEQ ID NO：2氨基酸序列与被研究氨基酸序列在GENETYX-WIN Ver.4.0的多重比对中进行比对时，与SEQ IDNO：2中第47位苏氨酸(T47)匹配的位置，其中所述比对的条件是间隙罚分(肽)：插入＝-8，延伸＝-3，顶端位置间隙延伸(gap Extend on top position)：设定(钩选)[setted(checked)]，匹配模式：使用默认评分表局部匹配。关于氨基酸的默认评分表如下列表2所示。
表2
C 12，
S 0， 2，
T -2， 1， 3，
P -3， 1， 0， 6，
A -2， 1， 1， 1， 2，
G -3， 1， 0，-1， 1， 5，
N -4， 1， 0，-1， 0， 0， 2，
D -5， 0， 0，-1， 0， 1， 2， 4，
E -5， 0， 0，-1， 0， 0， 1， 3， 4，
Q -5，-1，-1， 0， 0，-1， 1， 2， 2， 4，
H -3，-1，-1， 0，-1，-2， 2， 1， 1， 3， 6，
R -4， 0，-1， 0，-2，-3， 0，-1，-1， 1， 2， 6，
K -5， 0， 0，-1，-1，-2， 1， 0， 0， 1， 0， 3， 5，
M -5，-2，-1，-2，-1，-3，-2，-3，-2，-1，-2， 0， 0， 6，
I -2，-1， 0，-2，-1，-3，-2，-2，-2，-2，-2，-2，-2， 2， 5，
L -6，-3，-2，-3，-2，-4，-3，-4，-3，-2，-2，-3，-3， 4， 2， 6，
V -2，-1， 0，-1， 0，-1，-2，-2，-2，-2，-2，-2，-2， 2， 4， 2， 4，
F -4，-3，-3，-5，-4，-5，-4，-6，-5，-5，-2，-4，-5， 0， 1， 2，-1， 9，
Y 0，-3，-3，-5，-3，-5，-2，-4，-4，-4， 0，-4，-4，-2，-1，-1，-2， 7，10，
W -8，-2，-5，-6，-6，-7，-4，-7，-7，-5，-3， 2，-3，-4，-5，-2，-6， 0， 0，17，
B -4， 0， 0，-1， 0， 0， 2， 3， 2， 1， 1，-1， 1，-2，-2，-3，-2，-5，-3，-5，2，
Z -5， 0，-1， 0， 0，-1， 1， 3， 3， 3， 2， 0， 0，-2，-2，-3，-2，-5，-4，-6，2，3，
X 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0，0，0，0
C S T P A G N D E Q H R K M I L V F Y W B Z X
GENETYX-WIN Ver.4.0的多重比对基于以下算法。在这个比对程序中，所有可能的序列配对被比对，两序列比对循环进行(成对比对)，其中具有高保守比例(成对比对中的评分)组合的序列被确定为共有序列，从共有序列产生假想序列(共有部分保持不变，同时对于非共有部分选择所述序列的任意一个)。用相同操作产生除了组成假想序列的序列以外的所有序列与假想序列之间的循环比较，直到产生最终的假想序列。此后，通过将有关用于产生所述假想序列的GAP插入和移位信息应用到所述起始序列，以组成整体，从而完成多重比对。用于这种成对比对的计算公式如下：
当序列a和b每个分别具有序列长度m或n时，各自序列表达为：
a＝a1 a2 a3...am
b＝b1 b2 b3...bm，
间隙罚分g用以下方程表示：
-g＝s(ai，φ)＝a(φ，bj).
获得比对得分的方程如下：
G(0，0)＝0
G(i，0)＝i(-g)
G(0，j)＝j(-g)
-gk＝-[α+β(k-1)]
E(i，j)＝{G(i-1，j)-α，E(i-1，j)-β}
F(i，j)＝max{G(i，j-1)-α，F(i，j-1)-β}
G(i，j )＝max{E(i，j)，G(i-1，j-1)+s(ai，bj)，F(i，j)}
α为间隙插入罚分(GAP insertion penalty)，β是间隙延伸罚分(GAP extensionpenalty)。E、F和G是得分矩阵(score matrix)，基于此，产生及格矩阵(passmatrix)。
类似的分析第62位上丝氨酸(S62)对应的位置、第77位上酪氨酸(Y77)对应的位置、第128位上缬氨酸(V128)对应的位置、第140位上赖氨酸(K140)对应的位置、第144位上谷氨酰胺(Q144)对应的位置、第155位上天冬酰胺(N155)对应的位置和第249位上天冬氨酸(D249)对应的位置。
在按前述条件的GENETYX-WIN Ver.4.0多重比对中，SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20与SEQ ID NO：2进行比对。结果是，苏氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或丝氨酸与SEQ ID NO：2所列氨基酸序列中第47位上的苏氨酸(T47)匹配。丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸或谷氨酸与SEQ ID NO：2所列氨基酸序列中第62位上的丝氨酸(S62)匹配。酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、组氨酸、丝氨酸或丙氨酸与SEQ ID NO：2所列氨基酸序列中第77位上的酪氨酸(Y77)匹配。缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸与SEQ ID NO：2所列氨基酸序列中第128位上的缬氨酸(V128)匹配。赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酰胺与SEQ ID NO：2所列氨基酸序列中第140位上的赖氨酸(K140)匹配。缬氨酸、苏氨酸、精氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺与SEQ ID NO：2所列氨基酸序列中第144位上的谷氨酰胺(Q144)匹配。天冬酰胺、苏氨酸或缬氨酸与SEQ IDNO：2所列氨基酸序列中第155位上的天冬酰胺(N155)匹配。天冬氨酸、甘氨酸、缬氨酸或谷氨酸与SEQ ID NO：2所列氨基酸序列中第249位上的天冬氨酸(D249)匹配。比对的结果如图1A～图1C所示。在图1A～图1C中，“StMuSP”表示变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶氨基酸序列。“StPSP”表示肺炎链球菌来源的蔗糖磷酸化酶氨基酸序列。“StSSP”表示表兄链球菌来源的蔗糖磷酸化酶氨基酸序列。“LeuSP1”表示肠膜明串珠菌来源的第一种蔗糖磷酸化酶氨基酸序列。“LeuSP2”表示肠膜明串珠菌来源的第二种蔗糖磷酸化酶氨基酸序列。“OenSP”表示酒类酒球菌来源的蔗糖磷酸化酶氨基酸序列。“LBSP1”表示嗜酸乳杆菌来源的第一种蔗糖磷酸化酶氨基酸序列。“LBSP2”表示嗜酸乳杆菌来源的第二种蔗糖磷酸化酶氨基酸序列。“ListSP2”表示单核细胞增生利斯特氏菌来源的蔗糖磷酸化酶氨基酸序列。
本说明书中，使用GENETYX-WIN Ver.4.0(Genetics Co.，Ltd.)的最大匹配来计算序列的一致性百分比。该程序将待分析的序列数据和待比较的序列数据进行比对，使得在考虑替换和缺失时这些序列之间的氨基酸配对匹配最大，在此基础上分别对匹配(Matches)、错配(Mismatches)和间隙(Gaps)进行评分，计算总分，并输出最低总分的比对结果(参考文献：Takashi，K.，and Gotoh，O.1984.SequenceRelationships among Various 4.5 S RNA Species J.Biochem.92：1173-1177)。本说明书中，在匹配＝-1、错配＝1、间隙＝1、*N+＝2的条件下使用GENETYX-WIN Ver.4.0的最大匹配计算序列一致性百分比。
通过使用＝-1、错配＝1、间隙(Gaps)＝1和*N+＝2条件下GENETYX-WIN的最大匹配，对变异链球菌来源的SP氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、肺炎链球菌来源的SP氨基酸序列(SEQ ID NO：4)、表兄链球菌来源的SP氨基酸序列(SEQ IDNO：6)、肠膜明串珠菌来源的SP氨基酸序列(SEQ ID NO：8)、酒类酒球菌来源的SP氨基酸序列(SEQ ID NO：10)、缓症链球菌来源的SP氨基酸序列(SEQ IDNO：12)、肠膜明串珠菌来源的第二种SP氨基酸序列(SEQ ID NO：14)、嗜酸乳杆菌来源的SP氨基酸序列(SEQ ID NO：16)、嗜酸乳杆菌来源的第二种SP氨基酸序列(SEQ ID NO：18)、单核细胞增生利斯特氏菌来源的SP氨基酸序列(SEQ IDNO：20)进行比对，所得一致性百分比如表3所示。
表3
| A.A. | StMuSP | StPSP | StSSP | StMiSP | LeuSP1 | LeuSP2 | OenSP | LBSP1 | LBSP2 | ListMSP | ||
| 变异链球菌 | 481 | StMuSP | 100.0 | 83.8 | 82.5 | 84.7 | 65.9 | 66.2 | 65.0 | 63.6 | 72.1 | 68.8 |
| 肺炎链球菌 | 478 | StPSP | 83.8 | 100.0 | 79.2 | 95.2 | 66.7 | 65.2 | 63.8 | 63.1 | 69.0 | 69.0 |
| 表兄链球菌 | 481 | StSSP | 82.5 | 79.2 | 100.0 | 79.7 | 65.1 | 63.9 | 65.4 | 65.5 | 72.4 | 65.9 |
| 缓症链球菌 | 482 | StMiSP | 84.7 | 95.2 | 79.7 | 100.0 | 66.7 | 65.4 | 64.8 | 63.5 | 69.5 | 68.7 |
| 肠膜明串珠菌1 | 490 | LeuSP1 | 65.9 | 66.7 | 65.1 | 66.7 | 100.0 | 83.5 | 72.2 | 61.0 | 65.2 | 64.9 |
| 肠膜明串珠菌2 | 485 | LeuSP2 | 66.2 | 65.2 | 63.9 | 65.4 | 83.5 | 100.0 | 70.9 | 60.8 | 64.3 | 65.2 |
| 酒类酒球菌 | 489 | OenSP | 65.0 | 63.8 | 65.4 | 64.8 | 72.2 | 70.9 | 100.0 | 62.4 | 64.6 | 64.8 |
| 嗜酸乳杆菌1 | 480 | LBSP1 | 63.6 | 63.1 | 65.5 | 63.5 | 61.0 | 60.8 | 62.4 | 100.0 | 69.6 | 61.3 |
| 嗜酸乳杆菌2 | 480 | LBSP2 | 72.1 | 69.0 | 72.4 | 69.5 | 65.2 | 64.6 | 64.6 | 69.6 | 100.0 | 64.8 |
| 单核细胞增生利斯特氏菌 | 480 | ListMSP | 68.8 | 69.0 | 65.9 | 68.7 | 64.9 | 64.8 | 64.8 | 61.3 | 64.8 | 100.0 |
例如，在肺炎链球菌来源的蔗糖磷酸化酶中，与SEQ ID NO：2氨基酸序列第47位上的苏氨酸(T47)对应的位置是SEQ ID NO：4氨基酸序列中第47位，与SEQ IDNO：2氨基酸序列第62位上的丝氨酸(S62)对应的位置是SEQ ID NO：4氨基酸序列中第62位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列第77位上的酪氨酸(Y77)对应的位置是SEQ ID NO：4氨基酸序列中第77位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列第128位上的缬氨酸(V128)对应的位置是SEQ ID NO：4氨基酸序列中第128位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列第140位上的赖氨酸(K140)对应的位置是SEQ ID NO：4氨基酸序列中第140位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列第144位上的谷氨酰胺(Q144)对应的位置是SEQ ID NO：4氨基酸序列中第144位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列第155位上的天冬酰胺(N155)对应的位置是SEQ ID NO：4氨基酸序列中第155位，与SEQ IDNO：2氨基酸序列第249位上的天冬氨酸(D249)对应的位置是SEQ ID NO：4氨基酸序列中第249位。
例如，在表兄链球菌来源的蔗糖磷酸化酶中，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中T47对应的位置是SEQ ID NO：6氨基酸序列中第47位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中S62对应的位置是SEQ ID NO：6氨基酸序列中第62位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中Y77对应的位置是SEQ ID NO：6氨基酸序列中第77位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中V128对应的位置是SEQ ID NO：6氨基酸序列中第128位，与SEQ IDNO：2氨基酸序列第140位上的赖氨酸(K140)对应的位置是SEQ ID NO：6氨基酸序列中第140位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中Q144对应的位置是SEQ ID NO：6氨基酸序列中第144位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中N155对应的位置是SEQ IDNO：6氨基酸序列中第155位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中D249对应的位置是SEQ ID NO：6氨基酸序列中第249位。
例如，在肠膜明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶中，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中T47对应的位置是SEQ ID NO：8氨基酸序列中第47位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中S62对应的位置是SEQ ID NO：8氨基酸序列中第62位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中Y77对应的位置是SEQ ID NO：8氨基酸序列中第77位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中V128对应的位置是SEQ ID NO：8氨基酸序列中第131位，与SEQ IDNO：2氨基酸序列第140位上的赖氨酸(K140)对应的位置是SEQ ID NO：8氨基酸序列中第143位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中Q144对应的位置是SEQ ID NO：8氨基酸序列中第147位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中N155对应的位置是SEQ IDNO：8氨基酸序列中第158位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中D249对应的位置是SEQ ID NO：8氨基酸序列中第252位。
例如，在酒类酒球菌来源的蔗糖磷酸化酶中，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中T47对应的位置是SEQ ID NO：10氨基酸序列中第47位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中S62对应的位置是SEQ ID NO：10氨基酸序列中第62位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中Y77对应的位置是SEQ ID NO：10氨基酸序列中第77位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中V128对应的位置是SEQ ID NO：10氨基酸序列中第128位，与SEQ IDNO：2氨基酸序列中K140对应的位置是SEQ ID NO：10氨基酸序列中第140位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中Q144对应的位置是SEQ ID NO：10氨基酸序列中第144位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中N155对应的位置是SEQ ID NO：10氨基酸序列中第155位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中D249对应的位置是SEQ ID NO：10氨基酸序列中第249位。
例如，在缓症链球菌来源的蔗糖磷酸化酶中，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中T47对应的位置是SEQ ID NO：12氨基酸序列中第47位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中S62对应的位置是SEQ ID NO：12氨基酸序列中第62位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中Y77对应的位置是SEQ ID NO：12氨基酸序列中第77位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中V128对应的位置是SEQ ID NO：12氨基酸序列中第128位，与SEQ IDNO：2氨基酸序列中K140对应的位置是SEQ ID NO：12氨基酸序列中第140位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中Q144对应的位置是SEQ ID NO：12氨基酸序列中第144位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中N155对应的位置是SEQ ID NO：12氨基酸序列中第155位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中D249对应的位置是SEQ ID NO：12氨基酸序列中第249位。
例如，在肠膜明串珠菌来源的第二种蔗糖磷酸化酶中，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中T47对应的位置是SEQ ID NO：14氨基酸序列中第47位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中S62对应的位置是SEQ ID NO：14氨基酸序列中第62位，与SEQ IDNO：2氨基酸序列中Y77对应的位置是SEQ ID NO：14氨基酸序列中第77位，与SEQID NO：2氨基酸序列中V128对应的位置是SEQ ID NO：14氨基酸序列中第131位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中K140对应的位置是SEQ ID NO：14氨基酸序列中第143位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中Q144对应的位置是SEQ ID NO：14氨基酸序列中第147位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中N155对应的位置是SEQ ID NO：14氨基酸序列中第158位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中D249对应的位置是SEQ IDNO：14氨基酸序列中第252位。
例如，在嗜酸乳杆菌来源的第一种蔗糖磷酸化酶中，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中T47对应的位置是SEQ ID NO：16氨基酸序列中第47位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中S62对应的位置是SEQ ID NO：16氨基酸序列中第62位，与SEQ IDNO：2氨基酸序列中Y77对应的位置是SEQ ID NO：16氨基酸序列中第77位，与SEQID NO：2氨基酸序列中V128对应的位置是SEQ ID NO：16氨基酸序列中第128位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中K140对应的位置是SEQ ID NO：16氨基酸序列中第140位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中Q144对应的位置是SEQ ID NO：16氨基酸序列中第144位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中N155对应的位置是SEQ ID NO：16氨基酸序列中第155位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中D249对应的位置是SEQ IDNO：16氨基酸序列中第249位。
例如，在嗜酸乳杆菌来源的第二种蔗糖磷酸化酶中，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中T47对应的位置是SEQ ID NO：18氨基酸序列中第47位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中S62对应的位置是SEQ ID NO：18氨基酸序列中第62位，与SEQ IDNO：2氨基酸序列中Y77对应的位置是SEQ ID NO：18氨基酸序列中第77位，与SEQID NO：2氨基酸序列中V128)对应的位置是SEQ ID NO：18氨基酸序列中第128位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中K140对应的位置是SEQ ID NO：18氨基酸序列中第140位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中Q144对应的位置是SEQ ID NO：18氨基酸序列中第144位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中N155对应的位置是SEQ ID NO：18氨基酸序列中第155位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中D249对应的位置是SEQ IDNO：18氨基酸序列中第249位。
例如，在单核细胞增生利斯特氏菌来源的蔗糖磷酸化酶中，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中T47对应的位置是SEQ ID NO：20氨基酸序列中第47位，与SEQ IDNO：2氨基酸序列中S62对应的位置是SEQ ID NO：20氨基酸序列中第62位，与SEQID NO：2氨基酸序列中Y77对应的位置是SEQ ID NO：20氨基酸序列中第77位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中V128对应的位置是SEQ ID NO：20氨基酸序列中第128位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中K140对应的位置是SEQ ID NO：20氨基酸序列中第140位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中Q144对应的位置是SEQ ID NO：20氨基酸序列中第144位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中N155对应的位置是SEQ IDNO：20氨基酸序列中第155位，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中D249对应的位置是SEQ ID NO：20氨基酸序列中第249位。
提高耐热性的氨基酸残基位置不仅可以通过将被研究序列与SEQ ID NO：2长418个氨基酸残基的序列比对来确定，而且也可通过将被研究序列与选自前述基序序列1、2和3的一个或多个序列进行比对来确定。比对和SEQ ID NO：2具有高度同源性(如与SEQ ID NO：2氨基酸序列具有40％或更高的同源性)的SP氨基酸序列(SEQ ID NO：4氨基酸序列、SEQ ID NO：6氨基酸序列、SEQ ID NO：8氨基酸序列、SEQ ID NO：10氨基酸序列、SEQ ID NO：12氨基酸序列、SEQ ID NO：14氨基酸序列、SEQ ID NO：16氨基酸序列、SEQ ID NO：18氨基酸序列和SEQ ID NO：20氨基酸序列)时，不论使用SEQ ID NO：2还是使用基序序列1、2和3，所确定的位置都是相同的。
基序序列1在蔗糖磷酸化酶中非常保守，在来源于链球菌属的蔗糖磷酸化酶中尤其高度保守。SEQ ID NO：2所列氨基酸序列中第47位上的苏氨酸(T47)所对应的位置可以说就是基序序列1中第14位所对应的位置。
基序序列2在蔗糖磷酸化酶中非常保守。SEQ ID NO：2所列氨基酸序列中第128位上的缬氨酸(V128)所对应的位置可以说就是基序序列2中第7位所对应的位置。
基序序列3在蔗糖磷酸化酶中保守。SEQ ID NO：2所列氨基酸序列中第249位上的天冬氨酸(D249)所对应的位置可以说就是基序序列3中第19位所对应的位置。
这样，提高耐热性的氨基酸残基的位置也可用基序序列指定。提高耐热性的氨基酸的位置可以是选自下列位置的至少一个位置：基序序列1：AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSAFGDWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS中第14位对应的位置、第29位对应的位置和第44位对应的位置；基序序列2：RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTFGEEQID中第7位对应的位置、第19位、第23位对应的位置和34位对应的位置；以及基序序列3：ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG中第19位对应的位置。
因此，在根据本发明的方法中，可以说修饰含编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子，使得由修饰核酸编码的耐热化蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有不同于所述天然蔗糖磷酸化酶氨基酸残基的氨基酸残基：基序序列1：AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSAFGDWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS中第14位对应的位置、第29位对应的位置和第44位对应的位置；基序序列2：RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTFGEEQID中第7位对应的位置、第19位、第23位对应的位置和34位对应的位置；以及基序序列3：ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG中第19位对应的位置。
本说明书中，所述“基序序列”指在多种蛋白的氨基酸序列之间发现的、共有或高度保守的部分序列。通常，所述基序序列在很多情况下具有特定功能，但在本说明书中，甚至当未确定具体功能时，只要所述序列在多种氨基酸序列之间保守，就称为基序序列。
“基序序列1中第14位”的氨基酸残基指所述基序序列1的N端(左端)的氨基酸残基作为第1位依次计数的第14位氨基酸残基。“基序序列1中第29位”、“基序序列1中第44位”、“基序序列2中第7位”、“基序序列2中第19位”、“基序序列2中第23位”、“基序序列2中第34位”、“基序序列3中第19位”等与此类似。
这些基序序列通常在蔗糖磷酸化酶中非常保守。基序序列1、基序序列2、基序序列3(前半部分)的位置如图1A所示。基序序列3(后半部分)的位置如图1B所示。
本文中“基序序列1：
AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSAFGDWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS中第14位对应的位置”表示：将被研究氨基酸序列和所述基序序列1进行比对而不插入间隙使序列间同源性最大时，与所述基序序列1第14位氨基酸残基匹配的位置。更优选的是指在基序序列1与被研究氨基酸序列在GENETYX-WIN Ver.4.0多重比对中与基序序列1第14位氨基酸残基匹配的位置，所述比对的条件为：间隙罚分(肽)：插入＝-8，延伸＝-3，顶端位置间隙延伸：设定(钩选)；匹配模式：使用默认评分表局部匹配。
基序序列1中第29位、基序序列1中第44位，基序序列2中第7位、基序序列2中第19位、基序序列2中第23位、基序序列2中第34位，以及基序序列3中第19位具有类似的解释。
在前述条件下，用GENETYX-Win ver.4.0多重比对，将肺炎链球菌来源SP的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)、表兄链球菌来源的第二种SP的氨基酸序列(SEQ IDNO：6)、肠膜明串珠菌来源SP的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)、酒类酒球菌来源SP的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)、缓症链球菌来源SP的氨基酸序列(SEQ IDNO：12)、肠膜明串珠菌来源的第二种SP的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)、嗜酸乳杆菌来源的第一种SP的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)、嗜酸乳杆菌来源的第二种SP的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)及单核细胞增生利斯特氏菌来源SP的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)与变异链球菌来源SP的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)进行比对。
进一步在前述条件下用GENETYX-Win ver.4.0多重比对，将SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20与每一基序序列(基序序列1、2或3)进行比对。结果是苏氨酸或天冬酰胺与基序序列1中第14位匹配，丝氨酸、脯氨酸或丙氨酸与基序序列1中第29位匹配，酪氨酸与基序序列1中第44位匹配，缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸与基序序列2中第7位匹配，赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸与基序序列2中第19位匹配，谷氨酰胺、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸或谷氨酸与基序序列2中第23位匹配，天冬酰胺与基序序列2中第34位匹配，天冬氨酸或甘氨酸与基序序列3中第19位匹配。基序序列1、2及3是SEQ ID NO：2的部分序列。
就SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：30的每一个序列来说，将使用全长SEQ ID NO：2比对所得结果与使用基序序列1、2和3比对所得结果进行比较。结果是SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQID NO：28及SEQ ID NO：30的每一个序列中，与SEQ ID NO：2第47位对应的位置和与基序序列1第14位对应的位置是相同的；与SEQ ID NO：2第62位对应的位置和与基序序列1第29位对应的位置是相同的；与SEQ ID NO：2第77位对应的位置和与基序序列1第44位对应的位置是相同的；与SEQ ID NO：2第128位对应的位置和与基序序列2第7位对应的位置是相同的；与SEQ ID NO：2第140位对应的位置和与基序序列2第19位对应的位置是相同的；与SEQ ID NO：2第144位对应的位置和与基序序列2第23位对应的位置是相同的；与SEQ ID NO：2第155位对应的位置和与基序序列2第34位对应的位置是相同的；与SEQ ID NO：2第249位对应的位置和与基序序列3第19位对应的位置是相同的。这样可以确认，即使是使用基序序列进行比对，所确定的位置也是和使用SEQ ID NO：2氨基酸序列进行比对所确定的位置相同。
通过修饰含编码下列氨基酸序列的碱基序列的核酸分子而获得的含修饰碱基序列的核酸分子位于本发明范围内：序列表中的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQID NO：16、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20。
通过修饰含下列碱基序列的核酸分子而获得的含修饰碱基序列的核酸分子位于本发明范围内：序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：17或SEQ ID NO：19。
通过修饰含编码一定氨基酸序列的碱基序列的核酸分子而获得的含修饰碱基序列的核酸分子位于本发明范围内，所述氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少40％(优选至少60％)一致性：序列表中的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
在本发明中，序列(如氨基酸序列和碱基序列)的“一致性”表示两序列之间出现相同氨基酸(当比较碱基序列时为碱基)的程度。一致性的确定通常是通过比较两种氨基酸序列或两种碱基序列，并比较以最佳方式匹配的这两种序列，其中可以含有插入或缺失。一致性百分比这样计算：测定这两段序列之间相同氨基酸(当比较碱基序列时为碱基)位置的数目，将相同位置的数目除以比较位置的总数，所得结果乘以100，得到这两段序列之间的一致性百分比。
作为实例，在一个实施方案中用于获得本发明耐热化蔗糖磷酸化酶的第一(如天然)蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列可以与选自下组的氨基酸序列(即对照氨基酸序列)相同，也即100％一致：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18和SEQ ID NO：20；或是在另一个实施方案中，与对照氨基酸序列相比，该氨基酸序列可以改变一定数目的氨基酸残基。这种改变可以选自至少一个氨基酸的缺失、替换或插入，所述替换包括保守替换和非保守替换。这种改变可以发生在对照氨基酸序列的氨基端或羧基端，或发生在这些末端以外的其它任意位置。氨基酸残基改变可以单个残基分散分布，或几个残基连续。
类似地，用于获得本发明耐热化蔗糖磷酸化酶的编码第一(如天然)蔗糖磷酸化酶氨基酸序列的碱基序列与编码对照氨基酸序列(即对照氨基酸序列)的核苷酸序列相比，该氨基酸序列可以改变一定数目的氨基酸残基。这种改变可以选自至少一个核苷酸的缺失、替换或插入，所述替换包括转换和颠换。这种改变可以发生在对照碱基序列的5′端或3′端，或发生在这些末端以外的其它任意位置。碱基改变可以单个残基分散分布，或几个碱基连续。
核苷酸改变可以在编码序列中产生无义突变、错义突变或移码突变，从而可以改变由变化后碱基序列所编码的SP。
当两段氨基酸序列直接互相比较时，典型地是这些氨基酸序列之间至少有20％的氨基酸是相同的，优选至少30％、更优选40％、还更优选至少50％、特别优选至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98或99％的氨基酸相同。
也可使用序列与本说明书具体所述编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列或第一蔗糖磷酸化酶氨基酸序列(如SEQ ID NO：1、2等等)不相同但同源的酶或核酸分子作为第一种(如天然的)酶或核酸分子。这种与第一种(如天然)酶或核酸分子同源的酶或核酸分子包括但不限于：例如在前述条件下的GENETYX-WIN Ver.4.0中的最大匹配进行比较时，对于核酸，含有与比较对象序列至少有约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％一致性的碱基序列的核酸分子；对于酶，含有与比较对象序列至少有约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％一致性的氨基酸序列的酶。
通过修饰在严谨条件下与选自下组的碱基序列组成的核酸分子杂交的核酸分子而获得的含修饰碱基序列的核酸分子位于本发明范围内：序列表中的SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19。通过修饰在严谨条件下与选自下组的碱基序列组成的核酸分子杂交的核酸分子而获得含修饰碱基序列的核酸分子也位于本发明范围内：序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19。本领域技术人员可容易的选择期望的蔗糖磷酸化酶基因。
如此处所用，术语“严谨条件”表示这样的条件，在此条件下序列与特异性序列杂交但不与非特异性序列杂交。适当严谨条件的选择对本领域技术人员公知，并描述于例如Molecular Cloning(Sambrook，et al.，同上)。具体的，所述条件意味着例如使用所述条件可以鉴定多核苷酸，在此条件下，在一种溶液中用固定有来源于菌落或噬斑的DNA的滤膜在65℃进行杂交，所述溶液含50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液(0.2％ BSA、0.2％ Ficoll 400和0.2％聚乙烯吡咯烷酮)、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切鲑精DNA，并用0.1-2倍浓度的SSC(盐水-柠檬酸钠)溶液(一倍浓度的SSC溶液组成是150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)在65℃条件下洗涤滤膜。
用于本发明方法的修饰核酸分子可以是相对于含编码第一种蔗糖磷酸化酶碱基序列的核酸分子而被保守性修饰的核酸分子。在一个具体实施方案中，保守性修饰的核酸分子优选除了本发明中的目标修饰外还有保守性修饰。所述“相对于含编码第一种蔗糖磷酸化酶碱基序列的核酸分子而被保守性修饰的核酸分子”表示含编码一定氨基酸序列的碱基序列的核酸分子，所述氨基酸序列与由编码第一种蔗糖磷酸化酶的碱基序列编码的氨基酸序列相同或基本相同。所述“与由编码第一种蔗糖磷酸化酶的碱基序列编码的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列”表示与第一蔗糖磷酸化酶具有基本相同酶活性的氨基酸序列。由于遗传密码的简并性，很多功能等价的碱基序列编码一种指定的氨基酸序列。例如密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在由GCA密码子指定的所有丙氨酸位置上，密码子可以换成GCC、GCG或GCU，而不改变所编码的丙氨酸。类似的，对于可被多个密码子编码的氨基酸，在由一个密码子指定的所有氨基酸位置，所述密码子可以换成编码所述氨基酸的任意另一个密码子，而不改变所编码具体氨基酸。碱基序列的这种变化是“沉默突变”，这是一种保守性修饰的突变。本说明书中的编码多肽的所有碱基序列也包括所述核酸所有可能的沉默改变。沉默突变包括其中编码核酸(nucleic acid)不改变的“沉默替换”，和核酸原本不编码氨基酸的情况。当某种核酸编码氨基酸时，沉默突变与沉默替换有相同含义。在本说明书中，“沉默替换”表示在碱基序列中编码某种氨基酸的碱基序列用编码相同氨基酸的另一个碱基序列替换。基于遗传密码简并性的现象，在多种碱基序列编码某种氨基酸(如甘氨酸)的情况下，这种沉默替换是可能的。因此，具有由沉默替换产生的碱基序列编码的氨基酸序列的多肽具有与原多肽相同的氨基酸序列。因此，具有沉默替换所形成碱基序列编码的氨基酸序列的多肽具有与原多肽相同的氨基酸序列。因此，除了本发明针对的修饰(进行替换使得所述蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与所述天然蔗糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：基序序列1中第14位所对应位置、第29位所对应位置和第44位所对应位置；基序序列中第7位所对应位置、第19位所对应位置、第23位所对应位置和第34位所对应位置；基序序列3中第19位所对应位置；或在选自下组的至少一个位置具有与所述天然蔗糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：与SEQ ID NO：2氨基酸序列中第47位上苏氨酸(T47)所对应的位置、第62位上丝氨酸(S62)所对应的位置、第77位上酪氨酸(Y77)所对应的位置、第128位上缬氨酸(V128)所对应的位置、第140位上赖氨酸(K140)所对应的位置、第144位上谷氨酰胺(Q144)所对应的位置、第155位上的天冬酰胺(N155)所对应的位置和第249位上的天冬氨酸(D249)所对应的位置)以外，本发明耐热化蔗糖磷酸化酶还可包括碱基序列水平的沉默替换。在本领域中，可以理解核酸中的每个密码子(不包括AUG和TGG，其中AUG是通常编码甲硫氨酸的唯一密码子，TGG是通常编码色氨酸的唯一密码子)都可以加以修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默突变也隐含包括在每种所述序列中。优选的，可以进行这种改变使得避免替换半胱氨酸，半胱氨酸对多肽构象的影响很大。
可以改变编码本发明耐热化蔗糖磷酸化酶的碱基序列，使得与将要导入序列供表达的生物体的密码子使用偏好相一致。密码子使用偏好反映所述生物中高表达基因的使用偏好。例如，当要在大肠杆菌中表达时，可根据公开的密码子使用偏好表(如Sharp，et al.，Nucleic Acids Research 16，No.17，p.8207(1988))对所述序列进行大肠杆菌表达的优化。
(2.3制备表达载体)
使用含上述修饰的碱基序列的核酸分子制备表达载体。使用特定核酸序列制备表达载体的方法对本领域技术人员是公知的。
本说明书中提及核酸分子时，“载体”指可将目标碱基序列转移到目标细胞中的核酸分子。这些载体的实例包括可在目标细胞中自主复制或可整合到目标细胞染色体中并在适于转录修饰碱基序列的位置具有启动子的载体。在本说明书中，载体可以是质粒。
如此处所用，“表达载体”指可在目标细胞中表达修饰碱基序列(即编码修饰的蔗糖磷酸化酶的碱基序列)的载体。除了修饰碱基序列以外，表达载体还含有多种调节元件如调节表达的启动子，如果必要，还含有在目标细胞中复制和选择重组体所必需的因子(如复制起点(ori)和诸如药物抗性基因的选择标记)。在表达载体中，修饰的碱基序列可操作的连接，使得它可以被转录和翻译。调节元件包括启动子、终止子和增强子。此外，要将所表达的酶分泌到细胞外时，编码分泌信号肽的碱基序列以正确的读码框连接到修饰的碱基序列上游。本领域技术人员公知，用于导入特定生物(如细菌)中的表达载体类型和用于所述表达载体的调节元件和其它因子的种类都可以根据目标细胞而改变。
如此处所用，“终止子”是位于蛋白质编码区域下游的序列，参与将碱基序列转录成mRNA的转录过程的终止，参与添加多聚A序列。已知终止子通过影响mRNA稳定性来影响基因表达水平。
如此处所用，“启动子”指DNA上确定基因的转录起始位点并直接调节转录频率的区域，是结合RNA聚合酶并因此启动转录的碱基序列。因为在很多情况下用DNA分析软件预测基因组碱基序列中的蛋白质编码区域时，启动子区域通常是推断的蛋白质编码区域上游约2kbp或更近的区域，因此启动子区域是可以推断性的。推断性启动子区域随每个结构基因而变化，并通常位于结构基因上游但不限于此，还可以在结构基因下游。推断性启动子区域优选位于第一个外显子翻译起始位点上游约2kbp或更近。
如此处所用，“增强子”可用于增强目标基因的表达效率。这样的增强子在本领域公知。可以使用多种增强子，但只可以使用一种，或可以完全不用。
如此处所用，“可操作的连接”表示将期望碱基序列置于转录和翻译调节序列(如启动子、增强子等)或实现表达的翻译调节序列(即操纵)的控制之下。为了使启动子与基因可操作的连接，通常将启动子置于所述基因的即上游，但不必要将启动子置于与所述基因相邻的位置。
为了将修饰核酸序列与前述调节元件可操作的连接，在有些情况下要加工目标蔗糖磷酸化酶基因。这样的实例包括启动子和编码区之间距离太长而预计转录效率降低的情况、核糖体结合位点和翻译起始密码子之间距离不合适的情况等。所述加工手段的实例包括用限制酶消化、用核酸外切酶如Bal31和ExoIII消化或用单链DNA如M13或PCR引入定点突变。
(2.4耐热化蔗糖磷酸化酶的表达)
然后，将如上述制备的表达载体导入细胞，因而表达耐热化蔗糖磷酸化酶。
在本说明书中，酶的“表达”指编码所述酶的碱基序列在体内或体外的转录和翻译，以及所编码酶的生成。
导入表达载体的细胞(也称为宿主)包括原核和真核细胞。考虑多种条件如表达蔗糖磷酸化酶的难易、培养的难易、生长速率和安全性，可以容易地选择要导入表达载体的细胞。例如当使用蔗糖磷酸化酶来合成高分子量直链淀粉时，因为优选蔗糖磷酸化酶不含淀粉酶污染，优选使用不产生淀粉酶或仅产生低水平淀粉酶的细胞。这样的细胞的实例包括诸如细菌和真菌的微生物。更优选的细胞的实例包括嗜常温微生物(例如大肠杆菌、枯草杆菌)。在本说明书中，所述“嗜常温微生物”是生长温度为正常温度环境的微生物，具体指最佳生长温度为20℃-40℃的微生物。细胞例如可以是微生物细胞，或可以是植物或动物细胞。取决于待用细胞，本发明的酶可以是经历翻译后加工的酶。植物包括但不限于双子叶植物，和单子叶植物如水稻、小麦、大麦和玉米。谷类如水稻具有在种子中积累储藏蛋白的性质，使用储藏蛋白系统，可以表达所述谷类使得本发明耐热化磷酸化酶在种子中积累(见日本特许公开No.2002-58492的说明书)。
在本发明方法中，将表达载体导入细胞中的技术可以是本领域已知的任意技术。这种技术的实例例如包括转化、转导和转染。这种导入核酸分子的技术在本领域公知，并且是常规技术，例如描述于Ausubel F.A.，et al.ed.(1988)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley，New York，NY；Sambrook J，et al.(1987)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY和Bessatsu Jikken-igaku“Idenshidounyu & Hatsugenkaiseki jikkenhou”，Yodosha，1997。
当使用植物细胞作为细胞时，使转化体重新分化成组织或植株的方法在本领域公知。这种方法的实例描述如下：Rogers，et al.，Methods in Enzymology118：627-640(1986)；Tabata，et al.，Plant Cell Physiol.，28：73-82(1987)；Shaw，PlantMolecular Biology：A Practical Approach.IRL press(1988)；Shimamoto，et al.，Nature 338：274(1989)；和Maliga，et al.，Methods in Plant Molecular Biology：ALaboratory course.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995)。转化木本植物的方法描述于Molecular Biology of Woody Plants(Vol.I，II)(ed.S.Mohan Jain，Subhash C.Minocha)，Kluwer Academic Publishers，(2000)。此外，转化木本植物的方法例如详细描述于Plant Cell Reports(1999)19：106-110。因此，根据目标转基因植物，本领域技术人员可以适当的使用前述公知方法使转化体重新分化。目标基因导入如此所得转基因植物，并且可以用已知方法如Northern印迹和Western印迹分析或其它公知常规技术确认基因的导入。
通过培养已导入表达载体并获得表达耐热化蔗糖磷酸化酶能力的细胞(也称转化细胞)，可以在细胞中表达耐热化蔗糖磷酸化酶。培养转化细胞的条件可根据待使用宿主细胞种类和表达载体中表达调节因子的种类适当选择。例如，可使用常规振荡培养方法。
不具体限定用于培养转化细胞的培养基，只要所使用细胞生长并能表达耐热化目标蔗糖磷酸化酶即可。除了碳源和氮源以外，如果必要可在培养基中单独或适当混合使用无机盐如磷酸盐、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Na+、K+等。此外，如果必要，可以添加转化细胞生长或表达耐热化目标蔗糖磷酸化酶所必需的多种无机物或有机物。
可以选择转化细胞的培养温度使得适于培养待使用的转化细胞。通常，温度在15℃-60℃之间。培养转化细胞的时间持续到足以表达耐热化蔗糖磷酸化酶。
当使用带诱导型启动子的表达载体时，可通过加入诱导剂、改变培养温度和调节培养基成分来控制表达。例如，当使用带乳糖诱导型启动子的表达载体时，可通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。
(2.5回收耐热化蔗糖磷酸化酶)
然后可以回收表达的耐热化蔗糖磷酸化酶。例如，耐热化蔗糖磷酸化酶在转化细胞中积累时，在适当条件下培养所述转化细胞，然后通过离心或过滤培养物从转化细胞培养物中回收细胞。所回收细胞悬于合适缓冲液中，并用常规方法如超声方法破碎，然后离心或过滤从而得到上清液。耐热化蔗糖磷酸化酶在细胞中积累时，以及耐热化蔗糖磷酸化酶分泌到转化细胞外时，转化的细胞如前所述进行培养，然后将培养物离心或过滤，分离细胞从而得到上清液。耐热化蔗糖磷酸化酶在转化的细胞中积累或分泌到转化细胞外时，所得到的含有耐热化蔗糖磷酸化酶的上清液用常规方法(如盐析、溶剂沉淀、超滤)浓缩，从而获得含耐热化蔗糖磷酸化酶的级分。该级分进行过滤、离心或脱盐，从而获得粗酶液。进而采用常规酶纯化方法如冷冻干燥、等电聚焦、离子交换层析及结晶的合适组合对粗酶液进行纯化从而获得耐热化蔗糖磷酸化酶的粗酶或纯化酶。当不含水解α-葡聚糖的酶如α-淀粉酶时，可以直接使用粗酶，例如用于制备高分子量α-葡聚糖。
通过如上述生产耐热化蔗糖磷酸化酶，有可能相当大的提高天然蔗糖磷酸化酶的耐热性。此外，所表达的耐热化蔗糖磷酸化酶可以利用这种耐热性简单纯化。简单的说，在约60℃热处理含耐热化蔗糖磷酸化酶的细胞提取物，使污染酶不再溶解。通过离心所述不溶物而除去它们，并进行透析处理，从而获得纯化的耐热化蔗糖磷酸化酶。
在一个优选实施方案中，蔗糖磷酸化酶可以在有蔗糖存在的条件下(一般是约4％～约30％，优选约8％～约30％、更优选约8％～约25％)在任何纯化步骤中加热。此加热步骤中的溶液温度优选为该溶液加热30分钟时溶液中所含蔗糖磷酸化酶的活性为加热前的50％或更高、更优选80％或更高的温度。此温度优选约50℃～约70℃，更优选约55℃～约65℃。例如，对于变异链球菌来源的耐热化蔗糖磷酸化酶，此温度优选为约50℃～约70℃，更优选55℃～65℃。加热时，考虑到反应温度，加热时间可任意设定，只要蔗糖磷酸化酶的活性不明显破坏即可。一般的加热时间为约10分钟～约90分钟，更优选约30分钟～60分钟。
(3.耐热化蔗糖磷酸化酶)
(3.1耐热化蔗糖磷酸化酶的性质)
通过前述方法获得的本发明酶在选自下组的至少一个位置具有与所述天然蔗糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：与基序序列1的第14位对应的位置、第29位对应的位置和第44位对应的位置；与基序序列2的第7位对应的位置、第19位对应的位置、第23位对应的位置和第34位对应的位置；以及与基序序列3的第19位对应的位置(或选自下组的至少一个位置：与SEQ ID NO：2氨基酸序列中第47位上苏氨酸(T47)对应的位置、第62位上丝氨酸(S62)对应的位置、第77位上酪氨酸(Y77)对应的位置、第128位上缬氨酸(V128)对应的位置、第140位上赖氨酸(K140)对应的位置、第144位上谷氨酰胺(Q144)对应的位置、第155位上的天冬酰胺(N155)对应的位置和第249位上的天冬氨酸(D249)对应的位置)，其中耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于55℃加热20分钟后，耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性为加热之前耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
本发明的酶在选自下组的至少2个位置、更优选的是至少3个位置、还更优选的至少4个位置、仍更优选的是至少5个位置、仍更优选的是至少6个位置、特别优选的是至少7个位置、最优选的是所有这8个位置具有与所述天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：与基序序列1的第14位对应的位置、第29位对应的位置和第44位对应的位置；与基序序列2的第7位对应的位置、第19位对应的位置、第23位对应的位置和第34位对应的位置；以及与基序序列3的第19位对应的位置(或者是与SEQ ID NO：2氨基酸序列中第47位上的苏氨酸(T47)对应的位置、第62位上的丝氨酸(S62)对应的位置、第77位上的酪氨酸(Y77)对应的位置、第128位上的缬氨酸(V128)对应的位置、第140位上的赖氨酸(K140)对应的位置、第144位上的谷氨酰胺(Q144)对应的位置、第155位上的天冬酰胺(N155)对应的位置和第249位上的天冬氨酸(D249)对应的位置)。例如，SEQ ID NO：22给出了含有在SEQ ID NO：2氨基酸序列的蔗糖糖磷酸化酶的8个位置全部发生替换的氨基酸序列实例，而SEQ ID NO：21则给出了编码此氨基酸序列的碱基序列。经过替换后，与未替换前的蔗糖磷酸化酶的耐热性相比，替换后的蔗糖磷酸化酶的耐热性得到了提高。本发明耐热化蔗糖磷酸化酶不仅可包含天然蔗糖磷酸化酶这些位置的氨基酸残基仅发生替换的氨基酸序列，也可以包含天然蔗糖磷酸化酶发生一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列。
据认为天然蔗糖磷酸化酶的前述8个位置在蔗糖磷酸化酶立体结构中与周围氨基酸相互作用，从而形成使酶变得不稳定的立体局部结构。将这些位置的一个残基变成另一个氨基酸残基就可以提高耐热性。另外，由于这些位置的残基在立体结构上与周围的氨基酸残基相互作用，氨基酸的替换有重要的显著影响。例如，变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶中，用其他残基替换T47位上的T具有重要的显著性结果。此外，例如，在嗜酸乳杆菌来源的蔗糖磷酸化酶中，基序序列1中第14位(或T47)对应位置的氨基酸是N，用其他氨基酸替换掉N具有重要的显著性结果。例如，如果N用T替换，替换后的序列将与变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶序列类似，在该序列中也可发现耐热性提高。
在根据本发明的酶中，基序序列1中第14位对应位置(或与T47对应位置)上的氨基酸残基可以是天然蔗糖磷酸化酶中所发现氨基酸残基之外的其他氨基酸。基序序列1中第14位对应位置(或与T47对应位置)上的氨基酸残基最优选是丝氨酸。在另一实施方案中，基序序列1中第14位对应位置(或与T47对应位置)上的氨基酸残基特别优选是丝氨酸或异亮氨酸，最优选异亮氨酸。
在根据本发明的酶中，基序序列1中第29位对应位置(或与S62对应位置)上的氨基酸残基可以是天然蔗糖磷酸化酶中所发现氨基酸残基之外的其他氨基酸。基序序列1中第29位对应位置(或与S62对应位置)上的氨基酸残基最优选是脯氨酸。在另一实施方案中，基序序列1中第29位对应位置(或与S62对应位置)上的氨基酸残基特别优选是脯氨酸、丙氨酸或赖氨酸，最优选是丙氨酸。
在根据本发明的酶中，基序序列1中第44位对应位置(或与Y77对应位置)上的氨基酸残基可以是天然蔗糖磷酸化酶中所发现氨基酸残基之外的其他氨基酸。基序序列1中第44位对应位置(或与Y77对应位置)上的氨基酸残基特别优选是组氨酸或色氨酸，最优选组氨酸。在另一实施方案中，基序序列1中第44位对应位置(或与Y77对应位置)上的氨基酸残基特别优选是组氨酸或精氨酸，最优选精氨酸。
在根据本发明的酶中，基序序列2中第7位对应位置(或与V128对应位置)上的氨基酸残基可以是天然蔗糖磷酸化酶中所发现氨基酸残基之外的其他氨基酸。基序序列2中第7位对应位置(或与V128对应位置)上的氨基酸残基最优选是亮氨酸。在另一实施方案中，基序序列2中第7位对应位置(或与V128对应位置)上的氨基酸残基特别优选是亮氨酸或异亮氨酸，最优选异亮氨酸。
在根据本发明的酶中，基序序列2中第19位对应位置(或与K140对应位置)上的氨基酸残基可以是天然蔗糖磷酸化酶中所发现氨基酸残基之外的其他氨基酸。基序序列2中第19位对应位置(或与K140对应位置)上的氨基酸残基特别优选是甲硫氨酸或半胱氨酸，最优选甲硫氨酸。在另一实施方案中，基序序列2中第19位对应位置(或与K140对应位置)上的氨基酸残基更优选是甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或酪氨酸，更为优选的是甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或酪氨酸，进一步更优选半胱氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或酪氨酸，甚至更优选苯丙氨酸、缬氨酸或酪氨酸，甚至更优选缬氨酸或酪氨酸，最优选酪氨酸。
在根据本发明的酶中，基序序列2中第23位对应位置(或与Q144对应位置)上的氨基酸残基可以是天然蔗糖磷酸化酶中所发现氨基酸残基之外的其他氨基酸。基序序列2中第23位对应位置(或与Q144对应位置)上的氨基酸残基特别优选是精氨酸或赖氨酸，最优选精氨酸。在另一实施方案中，基序序列2中第23位对应位置(或与Q144对应位置)上的氨基酸残基优选是精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸或缬氨酸，更优选组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸或缬氨酸，还更优选组氨酸、异亮氨酸或缬氨酸，进一步更优选组氨酸或异亮氨酸，最优选组氨酸。
在根据本发明的酶中，基序序列2中第34位对应位置(或与N155对应位置)上的氨基酸残基可以是天然蔗糖磷酸化酶中所发现氨基酸残基之外的其他氨基酸。基序序列2中第34位对应位置(或与N155对应位置)上的氨基酸残基特别优选是丝氨酸或苏氨酸，最优选丝氨酸。
在根据本发明的酶中，基序序列3中第19位对应位置(或与D249对应位置)上的氨基酸残基可以是天然蔗糖磷酸化酶中所发现氨基酸残基之外的其他氨基酸。基序序列3中第19位对应位置(或与D249对应位置)上的氨基酸残基特别优选是甘氨酸或丙氨酸，最优选甘氨酸。基序序列3中第19位对应位置(或与D249对应位置)上的氨基酸残基更优选是甘氨酸，半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或丝氨酸，还更优选甘氨酸、组氨酸或天冬酰胺，进一步更优选甘氨酸或天冬酰胺，最优选甘氨酸。
根据本发明方法，为了制备耐热化蔗糖磷酸化酶，除了本发明中的目标修饰(进行替换使耐热化蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与所述天然蔗糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：与基序序列1第14位对应的位置、第29位对应的位置和第44位对应的位置；与基序序列2第7位对应的位置、第19位对应的位置、第23位对应的位置和第34位对应的位置；以及与基序序列3第19位对应的位置(或与SEQ ID NO：2氨基酸序列中第47位上苏氨酸(T47)对应的位置、第62位上丝氨酸(S62)对应的位置、第77位上酪氨酸(Y77)对应的位置、第128位上缬氨酸(V128)对应的位置、第140位上赖氨酸(K140)对应的位置、第144位上谷氨酰胺(Q144)对应的位置、第155位上的天冬酰胺(N155)对应的位置和第249位上的天冬氨酸(D249)对应的位置))外，还可以进行氨基酸替换、添加、缺失或修饰。
氨基酸替换表示用一种氨基酸替换另一种氨基酸。可以替换任意位置任意数目的氨基酸，只要得到的蔗糖磷酸化酶具有与天然蔗糖磷酸化酶基本相同的酶活性即可。例如，可以进行优选1～30处、更优选1～20处、还更优选1～10处、尤其优选1～5处、最优选1～3处替换。这种氨基酸替换可以是单个残基分散分布，也可以2个或多个连续的残基替换。具体而言，当替换发生在N端或C端时，因为相对于其他位置的替换来说，这种替换对活性的影响更小，因而可以比其他位置替换更多的氨基酸残基。目标突变发生位置(与SEQ ID NO：2氨基酸序列中T47对应的位置、S62对应的位置、Y77对应的位置、V128对应的位置、K140对应的位置、Q144对应的位置、N155对应的位置和D249对应的位置)附近的替换可能影响耐热性，因而不是非常优选。
氨基酸添加指在原氨基酸序列的一些位置插入一个或多个氨基酸，例如插入1～30个、更优选1～20个、还更优选1～10个、尤其优选1～5个、最优选1～3个氨基酸。这种氨基酸添加也可以是单个残基分散分布，或2个或多个残基连续添加。具体而言，当氨基酸加在N端或C端时，因为相对于其他位置的添加来说，这种添加对活性的影响更小，因而可以比其他位置添加更多的氨基酸残基。例如，可以添加1～100个，更优选插入1～50个，还更优选1～30个、进一步更优选5～30个、最优选5～10个氨基酸残基。目标突变发生位置附近的添加可能影响耐热性，因而不是非常优选。
氨基酸缺失表示从原氨基酸序列的任意位置去除一个或更多氨基酸，例如1～30个、优选1～10个、尤其优选1～5个、最优选1～3个氨基酸。这种氨基酸缺失也可以是单个残基分散分布，或2个或多个残基连续缺失。具体而言，当缺失发生在N端或C端时，因为相对于其他位置的缺失来说，这种缺失对活性的影响更小，因而可以比其他位置缺失更多的氨基酸残基。目标突变发生位置附近的缺失可能影响耐热性，因而不是非常优选。
氨基酸修饰的实例包括但不限于酰胺化、羧化、硫酸化、卤化、烷基化、糖基化、磷酸化、羟化和酰化(如乙酰化)。可以用合成肽的方法合成本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶，此时需要替换或添加的氨基酸可以天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸类似物。优选使用天然氨基酸。
本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶可以是具有与蔗糖磷酸化酶相同酶活性的酶类似物。如此处所用，术语“酶类似物”表示一种实体，它是与天然酶不同的化合物，但至少在一种化学功能或生物学功能方面与天然酶等价。因此，所述酶类似物包括相对于原天然酶添加或替换一个或更多个氨基酸类似物的实体。所述酶类似物具有这样的添加或替换，使得它的功能(如蔗糖磷酸化酶活性)与原天然酶的功能基本相同或更好。这样的酶类似物可以用本领域公知的技术制备。因此，所述酶类似物可以是含氨基酸类似物的聚合物。在本说明书中，除非另外说明，所述“酶”包括这种酶类似物。
在本说明书中，“氨基酸”可以是天然氨基酸、非天然氨基酸、衍生氨基酸或氨基酸类似物。优选天然氨基酸。
术语“天然氨基酸”指L-型天然氨基酸。天然氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、γ-羧基谷氨酸、精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。除非另外说明，本说明书提及的氨基酸是L-型，同时使用D-型氨基酸的实施方案也在本发明范围内。
术语“非天然氨基酸”指通常在天然蛋白中未发现的氨基酸。非天然氨基酸的实例包括正亮氨酸、对硝基苯丙氨酸、高苯丙氨酸(homophenylalanine)、对氟苯丙氨酸、3-氨基-2-苯甲基丙酸、D-型或N-型高精氨酸(homoarginine)，以及D-苯丙氨酸。
术语“衍生氨基酸”表示通过衍生化氨基酸而获得的氨基酸。
术语“氨基酸类似物”指不是氨基酸但在物理性质和/或功能上与氨基酸相似的分子。氨基酸类似物的实例包括例如乙硫氨酸、刀豆氨酸和2-甲基谷氨酰胺。
在本说明书中，氨基酸可以用IUPAC-IUB Biochemical NomenclatureCommission推荐的任意公知三字母符号和单字母符号表示。与之相似，核苷酸可以用公认的单字母代码表示。
除了所述目标修饰以外，耐热化蔗糖磷酸化酶还可以包括相对于天然蔗糖磷酸化酶氨基酸序列而言一个或几个或更多个氨基酸替换、添加或缺失引起的修饰，这样的耐热化蔗糖磷酸化酶也在本发明范围内。目标修饰之外的此类氨基酸修饰优选的是保守性修饰，更优选的是保守性替换。此外，一般认为在天然蔗糖磷酸化酶N端或C端的添加或缺失比其他区域的添加或缺失对酶活性的影响要小。因此，可优选在N端或C端进行氨基酸的替换、添加或缺失。包括一个或几个或更多个氨基酸替换、添加或缺失的这种耐热化蔗糖磷酸化酶例如可以根据描述于下文的方法制备：Molecualr Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)，Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-38，John Wiley & Sons(1987-1997)，Nucleic Acids Research，10，6487(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，79，6409(1982)，Gene，34，315(1985)，Nucleic Acids Research 13，443(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，488(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，5662(1984)，Science，224，1431(1984)，PCT WO 85/00817(1985)，Nature，316，601(1985)。
本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶可用本领域公知的方法制备。例如，根据本发明的所述耐热化蔗糖磷酸化酶中氨基酸的缺失、替换或添加可以通过本领域公知的定点突变技术进行。定点突变技术在本领域公知。例如，见Nucl.Acid Research，Vol.10，pp.6487-6500(1982)。
在本说明书中，当用于耐热化蔗糖磷酸化酶目标修饰以外的修饰时，所述“一个或几个或更多个氨基酸的替换、添加或缺失”或所述“至少一个氨基酸的替换、添加或缺失”表示一定数目的替换、添加或缺失，这种改变程度使蔗糖磷酸化酶的酶活性不丧失，优选所述酶活性与标准品(如天然蔗糖磷酸化酶)等价或超过标准品。本领域技术人员可以容易的选择具有期望性质的耐热化蔗糖磷酸化酶。作为替代方案，目标耐热化蔗糖磷酸化酶可以直接化学合成。此类化学合成方法在本领域公知。
由此制备的本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶优选与第一(如天然)蔗糖磷酸化酶(优选变异链球菌或肺炎链球菌来源的蔗糖磷酸化酶)的氨基酸序列具有约40％、更优选约45％、更优选约50％、更优选约55％、更优选约60％、更优选约65％、更优选约70％、更优选约75％、更优选约80％、更优选约85％、更优选约90％、更优选约95％和最优选约99％一致性。
设计前述修饰时，可以考虑氨基酸的疏水性指数。疏水性氨基酸指数对赋予蛋白质相互作用性生物功能的重要性在本领域公知(Kyte.J and Doolittle，R.F.J.Mol.Biol.157(1)：105-132，1982)。氨基酸的疏水性对所产生蛋白的二级结构有贡献，并限定蛋白质和其它分子(如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)之间的相互作用。氨基酸根据疏水性和带电性质被指定一个疏水性指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。
本领域公知用具有相似疏水性指数的另一种氨基酸替换某种氨基酸，可以产生仍然具有基本相似生物功能的蛋白质(如酶活性基本等价的蛋白质)。在这种氨基酸替换中，疏水性指数优选在±2以内，更优选在±1以内，进一步优选在±0.5以内。本领域中可以理解基于疏水性的这种氨基酸替换是有效的。如USP No.4,554,101中描述，给氨基酸残基指定以下亲水性指数：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。可以理解，氨基酸可以用具有相似亲水性指数的另一种氨基酸替换，且仍然是生物学等价的。在这种氨基酸替换中，所述亲水性指数优选在±2以内，更优选在±1以内，进一步优选在±0.5以内。
本发明中，“保守性替换”指在氨基酸替换中原氨基酸和待替换氨基酸之间如上述的亲水性指数或/和疏水性指数相似的替换。保守性替换的实例对本领域技术人员公知，包括但不限于以下每组中的替换，例如：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
(3.2评价耐热性的方法)
本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶有一种特性，使得耐热化蔗糖磷酸化酶在20mMTris缓冲液(pH7.0)中55℃加热20分钟以后，其在37℃的酶活性是加热前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mMTris缓冲液(pH7.0)中55℃加热20分钟以后，其在37℃的酶活性是加热前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的优选约20％或更多，更优选约30％或更多，更优选约40％或更多，更优选约50％或更多，更优选约55％或更多，更优选约60％或更多，进一步优选约65％或更多，进一步优选约70％或更多，特别优选约80％或更多，最优选约90％或更多。
所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中57℃加热20分钟以后，其在37℃的酶活性是加热前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的优选约10％或更多，更优选约20％或更多，更优选约30％或更多，更优选约40％或更多，更优选约50％或更多，更优选约55％或更多，更优选约60％或更多，进一步优选约65％或更多，进一步优选约70％或更多，特别优选约80％或更多，最优选约90％或更多。
所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中60℃加热20分钟以后，其在37℃的酶活性是加热前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的优选约5％或更多、更优选约10％或更多、更优选约15％或更多、更优选约20％或更多，更优选约25％或更多，更优选约30％或更多，进一步优选约35％或更多，甚至更优选约40％或更多，甚至进一步更优选约50％或更多，特别优选约60％或更多，最优选约70％或更多。
所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中65℃加热20分钟以后，其在37℃的酶活性是加热前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的更优选10％或更多，更优选约20％或更多，更优选约30％或更多，更优选约40％或更多，更优选约50％或更多，更优选约55％或更多，进一步优选约60％或更多，甚至更优选约65％或更多，甚至进一步优选约70％或更多，特别优选约80％或更多，最优选约90％或更多。在本说明书中，蔗糖浓度以重量/体积计算，即：
(蔗糖重量)×100/(溶液体积)。
(3.2.1测定蔗糖磷酸化酶活性的方法)
蔗糖磷酸化酶的活性单位可以用本领域内已知的任意方法测定。例如，可以用后面实施例1.7中所述方法来测定。
(3.2.2测定耐热性的方法)
按照下列方法测定耐热性：
(i)含或不含20％蔗糖的2.5～3.5U/ml酶溶液(在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中)在55℃、57℃、60℃或65℃孵育20分钟。
(ii)20分钟后取出酶，置冰上冷却10分钟。
(iii)根据SP活性测定方法于37℃测定(ii)中酶溶液的酶活性。使用(Aafter)/(Abefore)×100％计算所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中55℃加热20分钟后在37℃的酶活性Aafter与加热前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性Abefore的比值。加热后耐热化蔗糖磷酸化酶酶活性Aafter相对于加热前耐热化蔗糖磷酸化酶酶活性Abefore的比值也称为剩余活性。
(3.3高温条件下的直链淀粉产率)
使用本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶，可在高温条件下合成直链淀粉。在本说明书中，短语“可在高温条件下合成直链淀粉”指使用58.5mM蔗糖、1mM麦芽四糖、10mM无机磷酸、1U/ml水生栖热菌来源的α-葡聚糖磷酸化酶(按照下文实施例2.2制备)及1U/ml耐热化蔗糖磷酸化酶在50℃孵育18小时来合成直链淀粉时，合成直链淀粉的产率为50％或更高。在此条件下合成直链淀粉时，直链淀粉的产率优选60％或更高、更优选70％或更高、还更优选80％或更高，最优选90％或更高。
(3.4本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶的比活性)
本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶在高温(优选55℃)时具有高的比活性，比活性指单位重量蔗糖磷酸化酶的活性(U/g)。
本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶在含5％蔗糖的250mM磷酸缓冲液(pH7.0)中于55℃反应15分钟时，其比活性优选至少20U/g、更优选至少30U/g、甚至更优选至少40U/g、甚至更优选至少50U/g、甚至更优选至少60U/g、甚至更优选至少70U/g、甚至更优选至少80U/g、甚至更优选至少90U/g、甚至更优选至少100U/g、甚至更优选至少110U/g、甚至更优选至少120U/g、甚至更优选至少130U/g、甚至更优选至少140U/g、甚至更优选至少150U/g、特别优选至少160U/g，最优选至少180U/g。
与天然SP酶相比，本发明的耐热化SP酶优选在高温下具有更高比活性及更高剩余活性。
(4.利用本发明的酶生产α-葡聚糖的方法)
可在生产α-葡聚糖的方法中方便地使用本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶。利用本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶生产α-葡聚糖的方法可以是本领域中已知生产α-葡聚糖的任意方法，但优选的是在同时使蔗糖磷酸化酶和α-葡聚糖磷酸化酶在蔗糖与引发剂上反应的方法(也指SP-GP方法)中使用本发明的蔗糖磷酸化酶。SP-GP方法有一个优势在于可以用便宜的底物生产线性葡聚糖。
本发明合成α-葡聚糖的方法包括使含有本发明耐热化蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂、与无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸的反应液进行反应，从而生成葡聚糖。
本说明书中，所述“α-葡聚糖”指的是一种糖，其中含D-葡萄糖作为组成单元，并具有以α-1，4-糖苷键连接的至少两个糖单元或更多个糖单元。α-葡聚糖可以是线性、支链或环状分子。线性葡聚糖与α-1，4-葡聚糖有相同含义。在线性葡聚糖中，糖单元之间只用α-1，4-糖苷键连接。含有一个或更多α-1，6-糖苷键的葡聚糖是支链葡聚糖。某种程度上葡聚糖优选含有一定程度的线性节段。无分支的线性葡聚糖较为优选。
某些情况下葡聚糖优选具有小量的(即α-1，6-糖苷键的数目)分支。这种情况下，典型的分支数目是0～10000，优选0～1000，更优选0～500，进一步优选0～100，进一步优选0～50，进一步优选0～25，进一步优选0。
本发明的葡聚糖中，将α-1，6-糖苷键的数目当作1，α-1，4-糖苷键数目相对于α-1，6-糖苷键数目的比值优选是1～10000，更优选10～5000，进一步优选50～1000，进一步优选100～500。
α-1，6-糖苷键可以随机分布于葡聚糖中，也可以均匀分布。优选的分布程度是葡聚糖中形成5个或更多糖单元的线性部分。
葡聚糖可以只由D-葡聚糖构成，或可以是程度修饰不使这种葡聚糖性质不变差的衍生物。优选的是，α-葡聚糖不加以修饰。
α-葡聚糖典型的分子量是约8×103或更高，优选约1×104或更高，更优选约5×104或更高，进一步优选约1×105或更高，进一步优选约6×105或更高。α-葡聚糖的典型分子量是约1×108或更低，更优选约1×107或更低，进一步优选约5×106或更低，进一步优选约1×106或更低。
本领域技术人员容易理解，通过适当选择用于本发明生产方法的底物量、酶量、反应时间等可以获得具有期望分子量的葡聚糖。
具有极佳生产率的SP-GP法描述于国际公开WO 02/097107小册子。
在本发明生产方法中，例如，耐热化蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂、无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸、缓冲剂和溶解它的溶剂被用作主要材料。通常这些材料在反应开始时全部加入，其中的任何材料还可以在反应过程中加入。在本发明的生产方法中，如果必要，可以使用选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶和糖原脱支酶的酶。根据α-葡聚糖的期望结构，可以在本发明生产方法开始时或在反应中途将选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶和糖原脱支酶的酶加入反应溶液中。
反应启动时溶液中蔗糖磷酸化酶相对于反应启动时溶液中蔗糖的含量通常为0.05～1,000U/g蔗糖，优选约0.1～500U/g蔗糖，更优选约0.5～100U/g蔗糖。如果蔗糖磷酸化酶用量太大，反应中变性的酶容易聚集。如果蔗糖磷酸化酶用量过低，α-葡聚糖的产率可能降低。
在本说明书中，所述“α-葡聚糖磷酸化酶”指具有α-葡聚糖磷酸化酶活性的酶。α-葡聚糖磷酸化酶分类为EC2.4.1.1。α-葡聚糖磷酸化酶活性指催化从无机磷酸和α-1，4-葡聚糖制备葡萄糖-1-磷酸及α-1，4-葡聚糖部分降解产物的反应或其逆反应的酶。α-葡聚糖磷酸化酶有时也称磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、糖原磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶等等。α-葡聚糖磷酸化酶也可催化α-1，4-葡聚糖合成反应，该反应为磷酸解的逆反应。具体反应向哪个方向进行取决于底物的量。在体内，由于无机磷酸含量大，α-葡聚糖磷酸化酶的反应向磷酸解方向发生。无机磷酸含量低时，则倾向于α-1，4-葡聚糖合成。
似乎所有已知α-葡聚糖磷酸化酶均需要吡哆醛5′-磷酸才能活化，催化机理也类似。尽管不同来源的酶的底物偏好及调节方式不同，所有α-葡聚糖磷酸化酶都属于一个包括许多α-葡聚糖磷酸化酶的大组。该组包括来自于细菌、酵母和动物的糖原磷酸化酶，来源于植物的淀粉磷酸化酶，以及来源于细菌的麦芽寡糖磷酸化酶。
据报道，α-葡聚糖磷酸化酶的α-葡聚糖合成反应的最小引发分子是麦芽四糖。也有报道说α-葡聚糖降解反应有效的最小底物是麦芽五糖。通常认为这些是α-葡聚糖磷酸化酶的共有特征。但是近年来有报道来源于嗜热菌(Thermus thermophilus)的α-葡聚糖磷酸化酶以及来源于嗜热球菌(Thermococcus litoralis)的α-葡聚糖磷酸化酶的底物特异性不同于其他α-葡聚糖磷酸化酶。对于这些α-葡聚糖磷酸化酶来说，α-葡聚糖合成反应的最小引发剂是麦芽三糖，而α-葡聚糖降解的最小底物是麦芽四糖。
据认为α-葡聚糖磷酸化酶普遍存在于可储存淀粉或糖原的各种植物、动物及微生物中。
产生α-葡聚糖磷酸化酶的植物实例包括根和块茎农作物如马铃薯(也称爱尔兰马铃薯)、甘薯、山药、芋头及木薯；蔬菜如卷心菜和菠菜；谷类植物如玉米、水稻、小麦、大麦、黑麦和粟(foxtail millet)；豆类如蚕豆、豌豆、大豆、赤豆和杂色菜豆，以及试验植物如拟南芥、柑桔、藻类等等。
产生α-葡聚糖磷酸化酶的植物实例包括哺乳动物如人类、兔、大鼠和猪。
产生α-葡聚糖磷酸化酶的微生物包括水生嗜热菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、大肠杆菌等。
产生α-葡聚糖磷酸化酶的生物并不局限于这些例子。α-葡聚糖磷酸化酶可以是天然的α-葡聚糖磷酸化酶或是耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，后者已通过在天然α-葡聚糖磷酸化酶中引入突变使耐热性得以提高。
优选的是，本发明方法中所用α-葡聚糖磷酸化酶来源于植物或动物，更优选来源于植物。通常，来源于植物的天然α-葡聚糖磷酸化酶能合成高分子量直链淀粉。但是，这些α-葡聚糖磷酸化酶的耐热性低。因为这个原因，它们不能在高温(如约60℃或更高)下催化。因此，当反应在马铃薯来源GP的最佳反应温度即约30℃～约40℃进行时，会带来各种微生物污染或α-葡聚糖老化的问题，使α-葡聚糖或G-1-P不能高效生成。
α-葡聚糖磷酸化酶可来源于任何产生α-葡聚糖磷酸化酶的生物。α-葡聚糖磷酸化酶优选具有一定的耐热性。α-葡聚糖磷酸化酶耐热性越高则越优选。例如，耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)于60℃加热10分钟后，在37℃的活性是加热前在37℃的活性的20％或更多。
α-葡聚糖磷酸化酶可以是天然的α-葡聚糖磷酸化酶或是耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，后者已通过在特定位置引入突变使耐热性得以提高。此类位置可以是选自下列位置的至少一个位置：GP基序序列1L：H-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位对应的位置或是GP基序序列1H：H-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位对应的位置；GP基序序列2：A-L-G-N-G-G-L-G中第4位对应的位置；GP基序序列3L：R-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位对应的位置；或GP基序序列3H：R-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位对应的位置(或与天然马铃薯L-型α-葡聚糖磷酸化酶成熟氨基酸序列中第39位上苯丙氨酸(F39)所对应的位置、第135上天冬酰胺(N135)所对应的位置及第706位上苏氨酸(T706)所对应的位置)。α-葡聚糖磷酸化酶中的这些特定位置可以用与测定SP相同的方法来测定。与GP基序序列中这些特定位置对应的位置可以用GENETYX-WIN Ver.4.0(Genetics Co.，Ltd.)的多重比对按前文所述条件进行测定，或是在下列条件下进行最大匹配来测定：匹配＝-1，错配＝1，间隙＝0，*N+＝2。
基序序列1L或1H中第4位或是F39所对应位置的氨基酸残基优选为脂肪族氨基酸或杂环氨基酸，更优选脂肪族氨基酸，特别优选支链氨基酸(即缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)，尤其优选异亮氨酸或亮氨酸，最优选亮氨酸。
GP基序序列2中第4位或是N135所对应位置的氨基酸残基优选为脂肪族氨基酸或杂环氨基酸，更优选丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或酪氨酸，特别优选半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸或缬氨酸。
GP基序序列3L或3H中第7位或是T706所对应位置的氨基酸残基优选为脂肪族氨基酸，更优选支链氨基酸(即缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)或含硫氨基酸(即半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸)，特别优选半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸，特别优选半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，最优选异亮氨酸。
优选在α-葡聚糖磷酸化酶的3个位置都进行修饰。
α-葡聚糖磷酸化酶优选来源于马铃薯、甘薯、蚕豆、拟南芥、菠菜、玉米、水稻、小麦或柑桔，更优选来源于马铃薯、甘薯、蚕豆、拟南芥、菠菜、玉米或水稻，最优选来源于马铃薯。α-葡聚糖磷酸化酶优选来源于L-型α-葡聚糖磷酸化酶。α-葡聚糖磷酸化酶优选来源于马铃薯的L型、L2型或H型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于甘薯的L型或H型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于蚕豆的L型或H型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于拟南芥的L型或H型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于菠菜的L型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于玉米的L型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于水稻的L型或H型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于小麦的H型α-葡聚糖磷酸化酶，或来源于柑桔的H型α-葡聚糖磷酸化酶；更优选来源于马铃薯的L型或L2型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于甘薯的L型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于蚕豆的L型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于拟南芥的L型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于菠菜的L型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于玉米的L型α-葡聚糖磷酸化酶，或来源于水稻的L型α-葡聚糖磷酸化酶；更优选来源于马铃薯的L型α-葡聚糖磷酸化酶或来源于拟南芥的L型α-葡聚糖磷酸化酶，最优选来源于马铃薯的L型α-葡聚糖磷酸化酶。α-葡聚糖磷酸化酶优选具有提高的耐热性。
本发明方法中使用的α-葡聚糖磷酸化酶可以按如下方法制备。首先，培养产生α-葡聚糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌等)。该微生物可以是直接产生α-葡聚糖磷酸化酶。作为替代方案，克隆编码α-葡聚糖磷酸化酶的基因，将该基因与便于表达α-葡聚糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌等)进行基因重组，从而获得重组微生物，α-葡聚糖磷酸化酶可以从得到的微生物获得。此外，所得基因可以在特定氨基酸位置如前文所述位置进行修饰以包含这些修饰，然后将此修饰基因与便于表达α-葡聚糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌等)进行基因重组，生成重组微生物，从而可以从所得微生物获得耐热化α-葡聚糖磷酸化酶。例如，国际公开NO.02/097107小册子描述了通过大肠杆菌与马铃薯来源α-葡聚糖磷酸化酶基因的基因重组获得重组马铃薯α-葡聚糖磷酸化酶的方法。
考虑到各种条件如表达α-葡聚糖磷酸化酶基因的难易、培养难易、生长速度以及安全性，可以容易地选择用于与α-葡聚糖磷酸化酶基因进行基因重组的微生物。由于α-葡聚糖磷酸化酶优选不含淀粉酶污染，基因重组中优选使用不产生淀粉酶或仅产生低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)。α-葡聚糖磷酸化酶的基因重组中优选使用嗜常温微生物如大肠杆菌或枯草杆菌。不产生淀粉酶或仅产生低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)产生的α-葡聚糖磷酸化酶基本不含淀粉酶，因而优选在本发明的方法中使用。
编码第一(如天然)α-葡聚糖磷酸化酶的基因可以用本领域内已知的方法进行修饰以便使有助于耐热性的特定位置的氨基酸改变。例如，这样的修饰例子包括定点突变、用诱变剂突变(用诱变剂如亚硝酸盐、紫外线处理被研究基因)或易错PCR。
微生物(如细菌、真菌等)与克隆基因的基因重组可以用本领域技术人员公知的方法进行。使用克隆基因时，优选将该基因与组成型启动子或诱导型启动子可操作的连接。术语“可操作的连接”指当启动子与基因连接起来时基因可以被启动子调节。当使用诱导型启动子时，培养优选在诱导条件下进行。各种诱导型启动子对本领域技术人员是已知的。
就克隆基因来说，编码信号肽的碱基序列可以与克隆基因相接，从而使产生的α-葡聚糖磷酸化酶可以分泌到微生物外。编码信号肽的碱基序列对本领域技术人员是已知的。
本领域技术人员可以适当设定微生物(如细菌、真菌等)的培养条件以产生α-葡聚糖磷酸化酶。适于培养微生物的培养基及每个诱导型启动子适合的诱导条件对本领域技术人员是已知的。
培养一段适当的时期后，从培养物中回收α-葡聚糖磷酸化酶。当产生的α-葡聚糖磷酸化酶分泌到微生物体外时，可通过离心除去微生物体而得到α-葡聚糖磷酸化酶上清液。当微生物产生的α-葡聚糖磷酸化酶不分泌到微生物体外时，对微生物进行破碎处理如超声、机械碾磨及化学破裂，从而得到含破碎细胞的液体。
在本发明的方法中，可以不纯化就使用含破碎细胞的液体。然后，含破碎细胞的液体可以离心，从而除去细胞碎片，得到上清液。可以用公知的方法从所得上清液回收本发明的酶，所述公知方法包括硫酸铵沉淀或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲合层析、羟基磷灰石层析及凝集素层析。必要时纯化回收的产品。
在一个优选实施方案中，α-葡聚糖磷酸化酶可以在纯化的任何步骤中被加热。此加热步骤中的溶液温度优选为该溶液加热30分钟时溶液中所含α-葡聚糖磷酸化酶的活性为加热前的50％或更多、更优选80％或更多的温度。此温度优选约50℃～约70℃，更优选约55℃～约65℃。例如，对于来源于马铃薯的耐热化L型α-葡聚糖磷酸化酶，此温度优选为约50℃～约60℃。加热时，考虑到反应温度，加热时间可任意设定，只要α-葡聚糖磷酸化酶的活性不明显破坏即可。一般的加热时间为约10分钟～约90分钟，更优选约30分钟～60分钟。
反应启动时溶液中α-葡聚糖磷酸化酶相对于反应启动时溶液中蔗糖的含量通常为0.05～1,000U/g蔗糖，优选约0.1～500U/g蔗糖，更优选约0.5～100U/g蔗糖。如果α-葡聚糖磷酸化酶用量过大，反应过程中变性的α-葡聚糖磷酸化酶容易聚集。如果α-葡聚糖磷酸化酶用量过少，α-葡聚糖的产率可能降低。
蔗糖是分子量约342的二糖，用C12H22O11表示。蔗糖存在于具有光合作用能力的所有植物中。蔗糖可以从植物中分离，或可以化学合成。从成本观点来看，优选从植物分离蔗糖。含大量蔗糖的植物的实例包括甘蔗和甜菜。甘蔗汁含约20％蔗糖。甜菜汁含约10-15％蔗糖。可以提供从含蔗糖的植物液或汁到纯化糖的任意纯化阶段的蔗糖。
用于本发明生产方法的耐热化蔗糖磷酸化酶和α-葡聚糖磷酸化酶可分别用于反应，甚至当固定化时也是如此，而无论是纯化酶还是粗酶，并且反应形式可以是批次形式或连续形式。作为固定化方法，可以使用载体结合方法(如共价结合方法、离子结合方法或物理吸附方法)、交联方法或包合方法(晶格形式或微囊形式)。
引发剂的实例包括麦芽寡糖、直链淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、出芽短梗孢糖(pullulan)、偶联糖、淀粉，及其衍生物。
在本说明书中，无机磷酸指SP反应中能提供磷酸根底物的物质。在本说明书中，磷酸根底物指用作葡萄糖-1-磷酸的磷酸部分原材料的物质。据认为在由蔗糖磷酸化酶催化的蔗糖磷酸解中，无机磷酸以磷酸根离子形式起底物作用。因为这种底物一般在本领域称为无机磷酸，在本说明书中这种底物也被称为无机磷酸。无机磷酸包括磷酸和磷酸的无机盐。通常，无机磷酸在含阳离子如碱金属离子的水中使用。在此情况下，因为磷酸、磷酸盐和磷酸根离子处于平衡状态，不可能区分磷酸和磷酸盐。因此，为了方便，磷酸和磷酸盐通称无机磷酸。在本发明中，无机磷酸优选是磷酸的任意金属盐，更优选是磷酸的碱金属盐。无机磷酸的优选具体实例包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸三钾、磷酸(H3PO4)、磷酸二氢铵和磷酸氢二铵。
反应起始时SP-GP反应体系中可以含有仅一种或多种无机磷酸。
例如可以通过物理、化学或酶促反应降解磷酸缩合物如多磷酸(如焦磷酸、三磷酸和四磷酸)或其盐，并将此加入反应液中来提供无机磷酸。
在本说明书中，葡萄糖-1-磷酸指葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)及其盐。葡萄糖-1-磷酸优选是狭义葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)的任意金属盐，更优选是葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)的任意碱金属盐。葡萄糖-1-磷酸的优选具体实例包括葡萄糖-1-磷酸二钠、葡萄糖-1-磷酸二钾和葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)。在本说明书中，没有在括号内标出化学式的葡萄糖-1-磷酸表示广义的葡萄糖-1-磷酸，即狭义葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)及其盐。
SP-GP反应体系中在反应起始时可以含有仅一种或多种葡萄糖-1-磷酸。
根据本发明生产α-葡聚糖的方法中，当产物中有分支产生时，如当使用含α-1，6-糖苷键的起始材料时，如果必要可使用脱支酶。
可用于本发明的脱支酶是能切割α-1，6-糖苷键的酶。脱支酶分成两类，即良好作用于支链淀粉和糖原的异淀粉酶(EC 3.2.1.68)，以及作用于支链淀粉、糖原和出芽短梗孢糖的α-糊精-内-1，6-α-糖苷酶(也称支链淀粉酶(pullulanase))(EC 3.2.1.41)。
脱支酶存在于微生物、细菌和植物中。产生脱支酶的微生物实例包括酿酒酵母和衣藻属物种。产生脱支酶的细菌实例包括短芽孢杆菌、Bacillusacidopullulyticus、胶质芽胞杆菌(Bacillus macerans)、嗜热脂肪芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、水生嗜热菌、肺炎克雷伯氏菌、高温放线菌(Thermoactinomycesthalpophilus)、产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)和Pseudomonasamyloderamosa。产生脱支酶的植物实例包括马铃薯、甘薯、玉米、水稻、小麦、大麦、燕麦和甜菜。产生脱支酶的生物不限于以上实例。
根据本发明的方法中，当希望在产物中产生分支时，如果必要可使用分支酶。
可用于本发明的分支酶是可转移一部分α-1，4-葡聚糖链到该α-1，4-葡聚糖链的某个葡萄糖残基上的第6位从而形成分支的酶。分支酶也称1，4-a-葡聚糖分支酶、分支产生酶或Q酶。
分支酶存在于微生物、动物和植物中。产生分支酶的微生物实例包括嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草杆菌、热溶芽孢杆菌(Bacillus caldolyticus)、Bacilluslichecniformis、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、Bacillus caldovelox、Bacillus thermocatenulatus、史氏芽胞杆菌(Bacillus smithii)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短芽孢杆菌、嗜碱性杆菌物种(Alkalophilic Bacillus sp.)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、Aquifex aeolicus、蓝藻物种(Synechosystis sp.)、大肠杆菌、根癌土壤杆菌、水生嗜热菌、Rhodothermus obamensis、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)和酵母。产生分支酶的动物的实例包括诸如人类、兔、大鼠和猪的哺乳动物。产生分支酶的植物实例包括藻类；块茎和根作物如马铃薯、甘薯、山药和木薯；蔬菜如菠菜；谷类如玉米、水稻、小麦、大麦、黑麦和粟；以及豆类如豌豆、大豆、赤豆和杂色菜豆。产生分支酶的生物不限于以上实例。
在根据本发明的方法中，产物中有环状结构产生时，如果必要可以使用4-α-葡聚糖转移酶。
可用于本发明的4-α-葡聚糖转移酶也称歧化酶、D-酶或淀粉麦芽糖酶，是可催化麦芽寡糖的糖转移反应(歧化反应)的酶。4-α-葡聚糖转移酶是将葡萄糖基团或麦芽糖基或麦芽寡糖基单元从供体分子的非还原端转移到受体分子的非还原端的酶。因此酶反应导致最初给定的麦芽寡糖的聚合程度歧化。当供体分子和受体分子相同时，引起分子内转移，并因而得到有环状结构的产物。
4-α-葡聚糖转移酶存在于微生物和植物中。产生4-α-葡聚糖转移酶的微生物实例包括Aquifex aeolicus、肺炎链球菌、丁基梭菌(Clostridium butylicum)、耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)、流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌、Thermococcus litralis、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、Thermotoganeapolitana、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、火球菌属物种(Pyrococcus sp.)、嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、蓝藻物种(Synechosystis sp.)、大肠杆菌和水生嗜热菌。产生4-α-葡聚糖转移酶的植物实例包括块茎和根作物如马铃薯、甘薯、山药和木薯；谷类如玉米、水稻和小麦；以及豆类如豌豆和大豆。产生4-α-葡聚糖转移酶的生物不限于以上实例。
在根据本发明的方法中，产物中有环状结构生成时，如果必要可以使用糖原脱支酶。
可用于本发明的糖原脱支酶是具有两种活性的酶，即α-1，6-糖苷酶活性和4-α-葡聚糖转移酶活性。由于糖原脱支酶具有4-α-葡聚糖转移酶活性，而获得具有环状结构的产物。
糖原脱支酶存在于微生物和动物。产生糖原脱支酶的微生物实例包括酵母。产生糖原脱支酶的动物实例包括哺乳动物如人、兔、大鼠和猪。产生糖原脱支酶的生物不限于以上实例。
用于本发明生产方法的溶剂可以是任何溶剂，只要它不破坏蔗糖磷酸化酶和α-葡聚糖磷酸化酶的酶活性。
只要产生α-葡聚糖的反应可以发生，溶剂就不必要完全溶解用于根据本发明生产方法的物质。例如，当酶由固相载体携带时，酶不必要溶于溶剂。而且，不必所有反应物质如蔗糖都溶解，只要部分物质溶解到可使反应进行的程度就足够了。
代表性的溶剂是水。溶剂可以是细胞裂解液中的水，制备蔗糖磷酸化酶或α-葡聚糖磷酸化酶时蔗糖磷酸化酶或α-葡聚糖磷酸化酶时附带的水。
在含有蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂、以及无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸的溶液中，还可以含有任何其它物质，只要不阻碍蔗糖磷酸化酶和蔗糖之间相互作用以及所述α-葡聚糖磷酸化酶与引发剂之间相互作用即可。此类物质的实例包括缓冲剂、产生蔗糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌)成分、产生α-葡聚糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌)成分、盐和培养基成分。
待使用的这些物质的量是已知的，并且可由本领域技术人员适当选择。
在根据本发明的生产方法中，首先制备反应溶液。例如，可通过向合适溶剂中加入蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶、固体蔗糖、引发剂以及无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸来制备反应溶液。作为替代方案，可通过混合分别含有蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂或是无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸的溶液来制备反应溶液。作为替代方案，可通过将其它固体成分与含有蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂以及无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸中一些成分的溶液混合来制备反应溶液。为了调节pH，必要时可以向此反应溶液中加入任何缓冲剂，只要它不抑制酶反应即可。如果必要，可以向此反应溶液中加入选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶和糖原脱支酶的酶。
如果必要，然后用本领域已知的方法加热反应溶液以使之反应。只要得到本发明的效果，反应温度可以是任何温度。当反应起始时反应溶液中的蔗糖浓度是约5％到约100％时，典型反应温度可以是约40℃到约70℃。优选的是，在此反应步骤中的溶液温度应使得预定反应时间后此反应溶液中所含蔗糖磷酸化酶和α-葡聚糖磷酸化酶中至少一种、优选两种酶活性保持反应前活性的约50％或更高，更优选约80％或更高。该温度优选是约50℃到约70℃，更优选约55℃到约70℃，进一步优选约55℃到约65℃。
考虑到反应温度、反应产生葡聚糖的分子量和剩余酶活性，反应时间可以设定为任何时间。典型反应时间是约1小时到约100小时，更优选约1小时到约72小时，进一步更优选约2小时到约36小时，最优选约2小时到约24小时。
这样就产生了含α-葡聚糖的溶液。
当SP在与实施例4中相同的条件下于55℃进行时反应，作为本发明的耐热化SP，SP优选得到比使用天然SP所得产率更高的直链淀粉产率。此时直链淀粉产率优选5％或高、更优选10％或高、还更优选20％或高，最优选30％或更高。可在与实施例4相同的条件下进行反应来测定直链淀粉产率，从而筛选出符合此条件的耐热化SP。
(5.用根据本发明的酶合成葡萄糖-1-磷酸的方法)
本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶也可以有利地用于合成葡萄糖-1-磷酸的方法。使用根据本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶合成葡萄糖-1-磷酸的方法可以是本领域已知合成葡萄糖-1-磷酸的任何方法。
本发明合成葡萄糖-1-磷酸的方法包括使含有本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶、蔗糖和无机磷酸的反应液发生反应，以产生葡萄糖-1-磷酸。
用于根据本发明合成葡萄糖-1-磷酸的方法中蔗糖和无机磷酸的定义与前述第4项中的相同。
待用于合成葡萄糖-1-磷酸方法中的物质的量已知，并可以由本领域技术人员适当选择。
在根据本发明合成葡萄糖-1-磷酸的方法中，首先制备反应溶液。例如，可通过向合适溶剂中加入蔗糖磷酸化酶、蔗糖和无机磷酸来制备反应溶液。作为替代方案，可通过混合分别含有蔗糖磷酸化酶、蔗糖或无机磷酸的溶液来制备反应溶液。此外，可将其它固体成分与含蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂和无机磷酸中一些成分的溶液混合来制备反应溶液。为了调节pH，必要时可以向此反应溶液中加入任何缓冲剂，只要它不抑制酶反应即可。
然后，如果必要，使用本领域已知的方法加热反应溶液以使之反应。只要得到本发明的效果，反应温度可以是任何温度。优选的是，此反应步骤中的溶液温度应使得预定反应时间后此反应溶液中所含蔗糖磷酸化酶活性保持反应前活性的约50％或更高，更优选约80％或更高。此温度优选为约50℃到约70℃，更优选约55℃到约70℃，进一步优选约55℃到约65℃。
考虑到反应温度和剩余酶活性，反应时间可以设定为任何时间。代表性反应时间是约1小时到约100小时，更优选约1小时到约72小时，进一步更优选约2小时到约36小时，最优选约2小时到约24小时。
这样就生成含葡萄糖-1-磷酸的溶液。
当使用SP在与实施例5中相同的条件下于55℃进行反应时，作为本发明的耐热化SP，SP优选得到比使用天然SP所得产率更高的直链淀粉产率。此时直链淀粉产率优选5％或高、更优选10％或高、还更优选20％或高、进一步优选30％或更高、甚至优选40％或更高、甚至优选50％或更高、甚至优选60％或更高、特别优选70％或更高，最优选80％。可在与实施例5相同的条件下进行反应来测定直链淀粉产率，从而筛选出符合此条件的耐热化SP。
(6.使用根据本发明的酶的其它生产方法)
除了前述生产方法以外，本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶可用于本领域已知的使用蔗糖磷酸化酶的任何生产方法。合成葡萄糖聚合物的方法就是此类方法的一个实例。此方法包括使含下列成分的反应溶液反应以生成葡萄糖聚合物：本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶；以α-葡萄糖-1-磷酸为底物的第二种蔗糖磷酸化酶；蔗糖；引发剂；以及无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸。在本说明书中，“葡萄糖聚合物”指部分地含有葡萄糖基的聚合物。葡萄糖聚合物的实例包括葡聚糖(如α-葡聚糖和β-1，3-葡聚糖)、纤维二糖、纤维寡糖、昆布二糖、昆布寡糖及海藻糖。当葡萄糖聚合物为α-葡聚糖，生产方法如前文第4项“使用本发明的酶生产α-葡聚糖的方法”所述。
生产除α-葡聚糖外其他葡萄糖聚合物的方法的实例包括：例如联合使用纤维二糖磷酸化酶和纤维糊精磷酸化酶生产纤维二糖和纤维寡糖(参见日本专利NO.2815023“A production method for cellobiose”)，联合使用昆布二糖磷酸化酶和昆布糊精(laminaridextrin)磷酸化酶生产昆布二糖和昆布寡糖(参见日本特许公开NO.6-343484：“A production method for laminarioliosaccharide”)，联用β-1，3-葡聚糖磷酸化酶生产β-1，3-葡聚糖的方法(参见日本特许公开NO.6-343484：“A productionmethod for laminarioliosaccharide”)，联用海藻糖磷酸化酶生产海藻糖的方法(参见JP-A 7-327691：“A production Method for trehalose”)。可以使用这些方法。在这些生产方法中使用本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶可容易的由本领域技术人员实施。如果在这些生产方法中使用本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶，反应可以在比常规温度更高的温度下进行，从而提高产品的产率。
(7.通过本发明生产方法获得的α-葡聚糖的用途)
通过本发明生产方法获得的α-葡聚糖可用于α-葡聚糖领域已知的用途。α-葡聚糖中，尤其是不溶性直链淀粉中，预测具有与膳食纤维相同的功能，并预计可用于健康食品。另外，因为直链淀粉具有例如能在分子中包合碘或脂肪酸的特性，可以预计在药物、化妆品或卫生产品领域的用途。直链淀粉能用作生产具有与直链淀粉相同包合能力的环糊精和环状淀粉(cycloamylose)的原材料。另外，含直链淀粉的膜具有与通用塑料相当的抗张强度，因而是非常有前景的生物降解塑料的材料。高分子量直链淀粉也适用于手性拆分。以此方式，可以预计直链淀粉的很多用途。
(8.通过本发明合成方法获得的葡萄糖-1-磷酸的用途)
根据本发明合成方法获得的葡萄糖-1-磷酸可用于葡萄糖-1-磷酸领域已知的用途。葡萄糖-1-磷酸例如用作医用抗菌剂、抗肿瘤药(铂络合物)、治疗心脏病的药物(胺盐)或合成葡聚糖(如α-1，4-葡聚糖或β-1，3-葡聚糖)的底物、合成纤维二糖的底物、合成纤维寡糖的底物、合成昆布二糖的底物、合成昆布寡糖的底物以及合成海藻糖的底物。
下面将基于实施例解释本发明，但提供实施例的目的只是为了举例说明。因此，本发明的范围不受前述本发明详细说明和以下实施例的限制，而仅受权利要求书限制。
实施例
(1.测定方法和计算方法)
根据以下测定方法测定本发明中的各种物质。
(1.1葡萄糖定量)
用商品化测定试剂盒定量葡萄糖。用葡萄糖AR-II显色试剂(由Wako PureChemical Industries，Ltd.制造)测定葡萄糖。
(1.2果糖定量)
用商品化测定试剂盒定量果糖。用F-kit，D-葡萄糖/D-果糖(Roche制造)测定果糖。
(1.3定量葡萄糖-1-磷酸)
用以下方法定量葡萄糖-1-磷酸。向300μl测定试剂(200mM Tris-HCl(pH7.0)，3mM NADP，15mM氯化镁，3mM EDTA，15μM葡萄糖-1，6-二磷酸，6μg/ml葡萄糖磷酸变位酶，6μg/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)中加入600μl含适当稀释的葡萄糖-1-磷酸溶液，搅拌，所得反应混合物在30℃反应30分钟。此后，用分光光度计测定340nm吸光度。类似地，测定已知浓度的葡萄糖-1-磷酸钠盐的吸光度，以制作标准曲线。将由样品获得的吸光度值拟合到此标准曲线上，并由此确定样品中葡萄糖-1-磷酸浓度。通常，在1分钟内产生1μmol葡萄糖-1-磷酸的活性定义为1单位。在此定量方法中，只定量葡萄糖-1-磷酸，而不定量无机磷酸的量。
(1.4定量无机磷酸)
用以下方法获得磷酸根离子形式的无机磷酸。向含无机磷酸的溶液(200μl)中混合800μl钼试剂(15mM钼酸铵，100mM醋酸锌)，随后加入200μl 568mM抗坏血酸(pH5.0)，搅拌，所得反应混合物在30℃反应30分钟。此后，用分光光度计测定850nm吸光度。类似地，测定已知浓度的无机磷酸的吸光度，以制作标准曲线。将由样品获得的吸光度值拟合到此标准曲线上，并由此确定样品中无机磷酸的测定值。在此定量方法中，定量无机磷酸的量，而不定量葡萄糖-1-磷酸的量。
(1.5葡聚糖产率的计算方法)
采用SP-GP方法合成葡聚糖时，使用无机磷酸为起始材料所生产的葡聚糖(如直链淀粉)产率可根据下列等式从反应终止后溶液中葡萄糖、果糖及葡萄糖-1-磷酸的含量来求得：
葡聚糖(mM葡萄糖当量)
＝(果糖(mM)-(葡萄糖-1-磷酸(mM))-(葡萄糖(mM))
此公式基于以下原理。
在本发明生产方法中，首先可以发生根据以下方程式的反应(A)。
(A)蔗糖+无机磷酸→葡萄糖-1-磷酸+果糖
此反应由蔗糖磷酸化酶催化。在此反应中，蔗糖和无机磷酸反应生成等摩尔量的葡萄糖-1-磷酸和果糖。因为所得果糖不再与其它物质反应，通过测定果糖的摩尔量可知所生成葡萄糖-1-磷酸的摩尔量。
除了前述反应(A)以外，作为副反应，蔗糖磷酸化酶可以催化以下反应(B)中蔗糖水解。
(B)蔗糖→葡萄糖+果糖
掺入葡聚糖中的葡萄糖量可计算如下。
掺入葡聚糖中的葡萄糖量
＝(反应(A)生成的葡萄糖-1-磷酸量)-(未反应葡萄糖-1-磷酸量)
＝(反应(A)生成的果糖量)-(未反应葡萄糖-1-磷酸量)
考虑到反应(B)生成的果糖，反应(A)生成的果糖量计算如下：
(反应(A)生成的果糖量)
＝(反应终止后的果糖量)-(反应终止后的葡萄糖量)
因此，由以下公式得到葡聚糖的产量。
(葡聚糖(mM葡萄糖当量))
＝(果糖(mM)-(葡萄糖-1-磷酸(mM))-(葡萄糖(mM))
由以下公式，从起始葡萄糖-1-磷酸量以及反应终止后溶液中葡萄糖、果糖和葡萄糖-1-磷酸量得到用葡萄糖-1-磷酸作为起始材料生成的葡聚糖产量。
(葡聚糖(mM葡萄糖当量))
＝(起始葡萄糖-1-磷酸(mM))+(果糖(mM))
-(葡萄糖(mM))-(反应后葡萄糖-1-磷酸(mM))
此公式基于以下原理。
在反应溶液中，除了起始的葡萄糖-1-磷酸，反应(A)也产生葡萄糖-1-磷酸。也就是说，起始葡萄糖-1-磷酸和生成的葡萄糖-1-磷酸可用于葡聚糖合成。通过从可用于葡聚糖合成的葡萄糖-1-磷酸量中减去反应终止后反应溶液中剩余的葡萄糖-1-磷酸量，可以计算用于反应的葡萄糖-1-磷酸量，即掺入葡聚糖中的葡萄糖量。因此，可用前述公式得到掺入葡聚糖中的葡萄糖量。当在SP-GP反应体系中一起使用无机磷酸和葡萄糖-1-磷酸作为起始材料时也可应用此公式。
(1.6葡聚糖的产率)
当用无机磷酸作为起始材料时生成的葡聚糖产率可用以下公式求得。
(葡聚糖产率(％))
＝(葡聚糖(mM葡萄糖当量))/(起始蔗糖(mM))×100
当用葡萄糖-1-磷酸作为起始材料时生成的葡聚糖产率可用以下公式求得。
(葡聚糖产率(％))
＝{(起始葡萄糖-1-磷酸(mM))+(果糖(mM))-(葡萄糖(mM)-(反应后葡萄糖-1-磷酸(mM))}÷{(起始蔗糖(mM))+(起始葡萄糖-1-磷酸(mM))}×100
SP-GP反应体系中一起使用无机磷酸和葡萄糖-1-磷酸作为起始材料时，此公式也适用。
(1.7蔗糖磷酸化酶活性的测定方法)
例如，蔗糖磷酸化酶的活性单位可按下述方法测得。
取25ul 10％蔗糖与20ul 500mM磷酸缓冲液(pH7.0)混合。混合液中加入5ul已除去不溶性蛋白、适当稀释的酶溶液，振摇，从而得到反应体系。此反应体系于37℃反应20分钟，然后于100℃加热5分钟以终止反应。之后，对反应后溶液中的葡萄糖-1-磷酸进行定量。通常，在1分钟内产生1μmol葡萄糖-1-磷酸的酶量定义为1单位。
(1.8磷酸酶活性的测定方法)
例如，磷酸酶的活性单位可按下述方法测得。将含100ul用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)适当稀释的酶溶液和100ul 50mM葡萄糖-1-磷酸水溶液的反应溶液于37℃反应60分钟，然后对反应溶液中葡萄糖-1-磷酸产生的游离无机磷酸进行定量，从而测定磷酸酶的活性。在1分钟内产生1μmol无机磷酸的酶量定义为1单位。
(1.9淀粉酶活性的测定方法)
例如，淀粉酶的活性单位可按下述方法测得。将含25ul用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)适当稀释的酶溶液和25ul 0.5％直链淀粉水溶液(重均分子量约70,000，Ajinoki Co.，Ltd.制造)的反应溶液于37℃反应60分钟，然后加入1ml碘水溶液(0.1％碘化钾，0.01％碘)，于660nm处测定反应溶液的吸光度。使660nm处测定吸光度每分钟减少10％的酶量定义为1单位。
(2.酶的制备方法)
本发明实施例中所用的每种酶按下列方法制备。
(2.1蔗糖磷酸化酶的制备)
将目标蔗糖磷酸化酶基因与选择标记基因Ampr和Tetr整合入pKK388-1中，得到质粒pKK388-SMSP。此质粒中，蔗糖磷酸化酶基因被可操作的连接，受异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型启动子控制。用感受态细胞方法将此质粒导入大肠杆菌TG-1(STRATAGENE制造)。将此大肠杆菌铺到含抗生素氨苄青霉素的LB培养板(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、50μg/ml氨苄青霉素、1.5％琼脂)上，然后于37℃培养过夜。选择能够在此该板上生长的大肠杆菌获得蔗糖磷酸化酶基因已导入的大肠杆菌。分析所导入基因的序列，证实所得大肠杆菌含有蔗糖磷酸化酶基因。另外，通过活性测定也证实所得大肠杆菌表达蔗糖磷酸化酶。
所得大肠杆菌在5ml LB液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、50μg/ml氨苄青霉素)中培养18小时，然后将整个培养物接种到另外1L液体LB培养基中，于37℃以120rpm转速振摇培养6～7小时。之后，培养基中加入终浓度为0.04mM的IPTG，然后所述大肠杆菌于30℃振摇再培养18小时以表达蔗糖磷酸化酶，将培养物以5,000rpm离心5分钟收集大肠杆菌细胞。所得大肠杆菌细胞悬于50ml 20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)中，超声破碎细胞，从而得到50ml含破碎微生物细胞的液体。然后，在此含破碎细胞的液体中加入蔗糖，从而得到含破碎细胞、含20％蔗糖的液体。将此含破碎细胞的液体置55℃水浴中加热20分钟。之后，用离心机(AVANTI J-25I，BECKMANN制造)以8,500rpm离心此液体20分钟，从而除去不溶性蛋白质，得到上清液。
将得到的上清装载到预先平衡的阴离子交换树脂Q-Sepharose柱(AmershamPharmacia)上，使蔗糖磷酸化酶吸附到树脂上。树脂用含100mM氯化钠缓冲液洗涤除去杂质。然后，用含300mM氯化钠的缓冲液洗脱蔗糖磷酸化酶，得到耐热化蔗糖磷酸化酶溶液。然后，将含有1.5M硫酸铵的耐热化蔗糖磷酸化酶溶液上样并吸附到预平衡的Phenyl-TOYOPEARL树脂(Tosoh Corporation制造)上。然后用含1.05M硫酸铵的缓冲液洗涤树脂以除去杂质。随后用含0.75M硫酸铵的缓冲液洗脱蔗糖磷酸化酶，得到纯化的蔗糖磷酸化酶。此阶段含蔗糖磷酸化酶的溶液可在本发明中使用，但需进一步纯化时在Sephacryl S-200HR(Pharmacia制造)柱上通过凝胶过滤层析等分级分离，得到纯化的酶溶液。
取约1ug所得纯化蔗糖磷酸化酶溶液进行SDS-PAGE电泳(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果是任意纯化蔗糖磷酸化酶溶液在分子量约为55,000所对应的位置显示单一的条带，其他任何位置均观测不到条带。这样就显示蔗糖磷酸化酶已纯化到同质了。
(2.2重组水生嗜热菌α-葡聚糖磷酸化酶的制备方法)
将水生嗜热菌α-葡聚糖磷酸化酶基因(J.Appl.Glycosci.，48(1)(2001)71)与选择标记基因Ampr和Tetr整合入pKK388-1(CLONTECH制造)中，生成质粒pKK388-GP。此质粒中，α-葡聚糖磷酸化酶基因被可操作的连接起来，受异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型启动子控制。用感受态细胞方法将此质粒导入大肠杆菌MC1061(Pharmacia制造)。将此大肠杆菌铺到含抗生素氨苄青霉素的LB培养板(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、50μg/ml氨苄青霉素、1.5％琼脂)上，然后于37℃培养过夜。选择能够在此培养板上生长的大肠杆菌获得α-葡聚糖磷酸化酶基因已导入的大肠杆菌。分析所导入基因的序列，证实所得大肠杆菌含有α-葡聚糖磷酸化酶基因。另外，通过活性测定也证实所得大肠杆菌表达α-葡聚糖磷酸化酶。
所得大肠杆菌在5ml LB液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、50μg/ml氨苄青霉素)中培养18小时，然后将整个培养物接种到另外1L液体LB培养基中，于37℃以120rpm转速振摇培养4～5小时。之后，培养基中加入终浓度为0.01mM IPTG，然后所述大肠杆菌于30℃振摇再培养20小时。然后培养物以5,000rpm离心5分钟收集大肠杆菌细胞。所得大肠杆菌细胞悬于50ml 20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)中，超声破碎细胞，从而得到50ml含破碎微生物细胞的液体。
然后，将此含破碎细胞的液体于70℃加热30分钟。之后，以8,500rpm离心此破碎细胞的液体20分钟，从而除去不溶性蛋白质等物质，得到上清液。得到的上清液用作重组水生嗜热菌α-葡聚糖磷酸化酶。
(实施例1：耐热化蔗糖磷酸化酶基因的制备、筛选和测序)
简要地说，向变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶基因中引入随机突变，将随机突变的基因导入大肠杆菌，表达随机突变的蔗糖磷酸化酶，并从表达蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌中选择表达在52.5℃加热15分钟后具有合成葡聚糖能力的耐热化蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌，从该大肠杆菌中分离耐热化蔗糖磷酸化酶的基因，并确定其序列。
细节如下。
首先，用本领域技术人员已知的易错PCR方法在SEQ ID NO：1给出的变异链球菌来源天然蔗糖磷酸化酶基因中引入随机突变，得到随机突变的SP基因。在此条件下，一个蔗糖磷酸化酶基因通常会引入1～2个随机突变。将随机突变的SP基因和选择标记Ampr和Tetr整合入pKK388-1中，得到质粒pKK388-SMSP。此质粒文库中，蔗糖磷酸化酶基因被可操作的连接受异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型启动子控制。
用感受态细胞方法将此质粒文库导入大肠杆菌TG-1。将此大肠杆菌铺到含抗生素氨苄青霉素的LB培养板(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、50μg/ml氨苄青霉素、1.5％琼脂)上，然后于37℃培养过夜。选择能够在此培养板上生长的大肠杆菌，获得蔗糖磷酸化酶基因已导入的约100,000个大肠杆菌克隆。
将所得大肠杆菌的每个克隆均接种到独立的150μl含50μg/ml氨苄青霉素的terrific broth液体培养基(GIBCO BRL制造)中，然后于37℃静态培养18小时。然后在培养物中加入150μl裂解液(10mg/ml卵清溶菌酶、1U/ml脱氧核糖核酸酶、200mM氯化镁、0.5％ Triton X-100)，然后于-80℃冷冻1小时，之后于37℃解冻1小时，得到微生物细胞提取物。得到的微生物细胞提取物用离心机(Hitachi制造的CT-13R)以13,000rpm离心10分钟，除去不溶的蛋白质等，得到上清液。
取所得上清液50μl到1.5ml的微型管中，于52.5℃加热15分钟，然后快速转到冰上终止加热。然后，加入50μl测试液(4％蔗糖、100mM磷酸缓冲液(pH7.0)、0.5mM麦芽四糖、2U/ml马铃薯来源的α-葡聚糖磷酸化酶)，混合，于45℃孵育2小时。之后，加入100μl碘溶液(1.3％碘化钾，0.13％碘)显色。如果上清液中含有蔗糖磷酸化酶，孵育时可以从蔗糖合成直链淀粉，碘可以使直链淀粉变蓝而不使蔗糖变蓝，因此用碘溶液变蓝的上清液含耐热化蔗糖磷酸化酶。通过上述方法筛选，从80,000株含随机突变蔗糖磷酸化酶基因的大肠杆菌转化体得到约100株含有耐热化蔗糖磷酸化酶基因的大肠杆菌。
用本领域内已知方法从上述筛选所得含有耐热化蔗糖磷酸化酶基因的大肠杆菌回收质粒，用DNA测序仪(ABI制造)测定该质粒中耐热化蔗糖磷酸化酶基因的序列。
将此耐热化蔗糖磷酸化酶基因所编码的氨基酸序列与天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸序列)比较，在与天然蔗糖磷酸化酶中第47、62、77、128、140、144、155及249位所对应的氨基酸位置引入了突变，这些位置的氨基酸替换分别如下所述：T47→S、S62→P、Y77→H、V128→L、K140→M、Q144→R、N155→S及D249→C。这样证实了8个氨基酸位置可以有效地提高蔗糖磷酸化酶的耐热性。这些替换中，具体而言，T47→S和V128→L突变是所谓的保守性替换。因为即使用另一类似的氨基酸进行替换也可观测到耐热性的提高，即保守性替换，推断该位置与耐热性特别相关，因此可以预测用另一不类似的氨基酸替换该氨基酸可以进一步提高耐热性。而且，除了这8个位置外，没有发现可影响耐热性的其他突变，因此可以认为其他位置的突变不会影响耐热性。
此外，T47位上S之外的氨基酸、S62位上P之外的氨基酸、Y77位上H之外的氨基酸、V128位上L之外的氨基酸、K140位上M之外的氨基酸、Q144位上R之外的氨基酸、N155位上S之外的氨基酸或D249位上G之外的氨基酸也提高耐热性。
(实施例2A：通过定点突变制备耐热化蔗糖磷酸化酶及测定耐热性)
(1)通过定点突变制备耐热化蔗糖磷酸化酶
简要地说，制备含有上述8个突变组合的文库，筛选该文库以得到耐热性进一步提高的蔗糖磷酸化酶。
详细地说，按实施例1中相同的方法制备耐热化蔗糖磷酸化酶的表达载体。在此实施例中，制备了编码仅在一个已发现对提高耐热性有贡献的位置发生替换的耐热化蔗糖磷酸化酶的基因，编码在2～7个位置的组合发生替换的耐热化蔗糖磷酸化酶的基因，及编码这8个位置全部发生替换的耐热化蔗糖磷酸化酶的基因。以实例的方式，SEQ ID NO：21列出了编码具有所有8个突变(T47S、S62P、Y77H、V128L、K140K、Q144R、N155S及D249G)的耐热化SP的碱基序列，此耐热化SP的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。这些氨基酸替换用本领域已知的定点突变技术产生。
将这些得到的每一个编码耐热化SP的基因均用前述实施例1所述同样方法整合入pKK388-1中，得到质粒pKK388-SPMS。用感受态细胞方法将此质粒导入大肠杆菌TG-1，将此大肠杆菌铺到含抗生素氨苄青霉素的LB培养板(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、50μg/ml氨苄青霉素、1.5％琼脂)上，然后于37℃培养过夜。选择能够在此培养板上生长的大肠杆菌，获得耐热化蔗糖磷酸化酶基因已导入的大肠杆菌。分析所导入基因的序列，证实所得大肠杆菌中含有蔗糖磷酸化酶基因。这样就可以制备表达耐热化SP的大肠杆菌。
按照2.1中所述方法从获得的表达耐热化蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌制备耐热化蔗糖磷酸化酶的溶液。
(1-2)天然蔗糖磷酸化酶的制备
按照2.1中所述方法，用SEQ ID NO：1的基因制备天然蔗糖磷酸化酶溶液。
(1-3)在天然蔗糖磷酸化酶C端具有替换和添加的蔗糖磷酸化酶(NO.33)的制备
按照2.1中所述方法，用SEQ ID NO：23的基因制备蔗糖磷酸化酶溶液(为方便起见称为NO.33)，该酶与SEQ ID NO：2的蔗糖磷酸化酶相比，C端的两个氨基酸FE替换为SL，在C端依次顺充添加了甲硫氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸。
(1-4)在突变SP的C端具有替换和添加的蔗糖磷酸化酶(Nos.1a、2a、3a、4a、5a和6a)的制备
在含有目标突变的耐热化SP酶的C端进行氨基酸替换和添加，确认这样的氨基酸替换和添加不影响耐热性。
具体地，制备C端修饰的SP酶的溶液并测量其耐热性，其中在表4A中耐热化No.1、2、3、4、5或6号SP酶中，C端的两个氨基酸(苯丙氨酸和谷氨酸)分别用亮氨酸和丝氨酸替换，同时将6个氨基酸即甲硫氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸依次添加到C端。
(2)各种蔗糖磷酸化酶耐热性的测定
测定上述(1)～(1-4)中制备的耐热化SP酶溶液或其他SP酶溶液的耐热性。按下述方法测定耐热性。
(i)无蔗糖存在时的SP耐热性
首先，于37℃将各SP酶溶液用20mM Tris缓冲液(pH7.0)适当稀释到2.5～3.5U/ml。取50μl稀释酶液于55℃加热20分钟、或57℃加热20分钟，或60℃加热20分钟。加热后，立即将各样品置冰上冷却10分钟。酶溶液冷却后的活性及该酶溶液加热前的活性按1.7所述SP活性测定方法于37℃测定。各酶的耐热性通过测定蔗糖磷酸化酶加热后酶活性与该酶加热前酶活性的比率(剩余活性)来衡量。
(ii)有蔗糖存在时的SP耐热性
最后，各酶液用20mM Tris缓冲液(pH7.0)适当稀释到5.0～7.0U/ml。取25μl稀释酶液与25μl含40％蔗糖的20mM Tris缓冲液(pH7.0)混合。将此50μl混合溶液于65℃加热20分钟。加热后，立即将各样品置冰上冷却10分钟。。酶溶液冷却后的活性及该酶溶液加热前的活性按1.7所述SP活性测定方法于37℃测定。各酶的耐热性通过测定蔗糖磷酸化酶加热后酶活性与该酶加热前酶活性的比率(剩余活性)来衡量。无蔗糖存在时SP于55℃、57℃或60℃加热所得结果及蔗糖存在时SP于65℃加热所得结果如下列表4A所示。表4A也列出了具有突变的各突变体。
表4A
| 55℃ | 57℃ | 60℃ | 65℃ | T47S | S62P | Y77H | V128L | K140M | Q144R | N155S | D249G | C端修饰 | |
| No. | -Suc | -Suc | -Suc | +Suc | |||||||||
| 1 | 99.3 | 98.3 | 80.6 | 99.3 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | - |
| 1a | 99.1 | 97.4 | 80.5 | 98.9 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 |
| 2 | 99.4 | 95.2 | 67.2 | 99.1 | 是 | 是 | 是 | 是 | - | 是 | 是 | 是 | - |
| 2a | 99.1 | 96.1 | 66.4 | 98.3 | 是 | 是 | 是 | 是 | - | 是 | 是 | 是 | 是 |
| 3 | 98.3 | 86.5 | 20.9 | 98.2 | 是 | - | - | 是 | - | 是 | - | 是 | - |
| 3a | 98.7 | 85.1 | 21.3 | 97.4 | 是 | - | - | 是 | - | 是 | - | 是 | 是 |
| 4 | 94.2 | 86.5 | 14.8 | 91.7 | 是 | 是 | - | - | - | 是 | - | 是 | - |
| 4a | 95.8 | 88.1 | 15.3 | 93.3 | 是 | 是 | - | - | - | 是 | - | 是 | 是 |
| 5 | 95.8 | 93.7 | 35.9 | 94.8 | 是 | - | - | 是 | - | 是 | 是 | 是 | - |
| 5a | 94.9 | 94.2 | 37.4 | 92.9 | 是 | - | - | 是 | - | 是 | 是 | 是 | 是 |
| 6 | 98.4 | 99.3 | 38.4 | 95.4 | 是 | 是 | - | 是 | - | - | 是 | 是 | - |
| 6a | 97.3 | 96.3 | 36.1 | 93.2 | 是 | 是 | - | 是 | - | - | 是 | 是 | 是 |
| 7 | 95.5 | 94.1 | 30.6 | 93.3 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | - | - | - |
| 8 | 91.8 | 80.8 | 28.9 | 88.9 | 是 | 是 | 是 | 是 | - | 是 | 是 | - | - |
| 9 | 99.4 | 83.5 | 22.0 | 84.3 | 是 | 是 | - | - | - | 是 | 是 | 是 | - |
| 10 | 95.4 | 83.2 | 27.1 | 88.4 | 是 | - | 是 | - | 是 | 是 | - | 是 | - |
| 11 | 96.2 | 89.4 | 26.1 | 89.6 | 是 | 是 | 是 | - | - | 是 | 是 | 是 | - |
| 12 | 96.3 | 83.0 | 25.4 | 69.4 | - | - | - | 是 | - | 是 | 是 | 是 | - |
| 13 | 91.8 | 70.3 | 19.1 | 78.3 | 是 | 是 | - | 是 | - | 是 | 是 | - | - |
| 14 | 90.5 | 78.0 | 20.5 | 62.4 | - | - | - | 是 | - | - | 是 | 是 | - |
| 15 | 90.0 | 77.1 | 17.7 | 82.6 | - | 是 | - | 是 | - | 是 | - | 是 | - |
| 16 | 94.3 | 80.6 | 18.3 | 85.0 | 是 | 是 | - | - | - | - | 是 | 是 | - |
| 17 | 92.2 | 75.9 | 11.5 | 85.0 | 是 | 是 | - | - | - | - | - | 是 | - |
| 18 | 98.5 | 81.9 | 14.6 | 83.5 | 是 | 是 | - | - | - | - | 是 | 是 | - |
| 19 | 88.7 | 60.7 | 11.9 | 83.2 | 是 | 是 | 是 | 是 | - | 是 | - | - | - |
| 20 | 80.3 | 49.4 | 7.6 | 38.7 | - | - | 是 | 是 | - | - | 是 | - | - |
| 21 | 80.8 | 48.8 | 7.1 | 53.4 | - | - | 是 | - | 是 | 是 | - | 是 | - |
| 22 | 81.2 | 47.5 | 4.1 | 79.1 | 是 | 是 | - | 是 | - | - | - | - | - |
| 23 | 85.2 | 40.2 | 3.6 | 55.8 | 是 | 是 | - | - | - | 是 | 是 | - | - |
| 24 | 77.4 | 30.1 | 1.1 | 38.2 | 是 | - | - | - | - | - | - | 是 | - |
| 25 | 47.3 | 11.5 | 1.1 | 30.4 | 是 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 26 | 33.4 | 4.4 | 1.4 | 9.5 | - | 是 | - | - | - | - | - | - | - |
| 27 | 22.6 | 2.2 | 1.4 | 6.9 | - | - | 是 | - | - | - | - | - | - |
| 28 | 26.6 | 3.0 | 1.7 | 10.8 | - | - | - | 是 | - | - | - | - | - |
| 29 | 39.9 | 6.1 | 1.1 | 12.3 | - | - | - | - | 是 | - | - | - | - |
| 30 | 23.2 | 2.1 | 1.3 | 5.2 | - | - | - | - | - | 是 | - | - | - |
| 31 | 37.8 | 6.3 | 1.0 | 6.3 | - | - | - | - | - | - | 是 | - | - |
| 32 | 47.7 | 11.1 | 1.2 | 27.5 | - | - | - | - | - | - | - | 是 | - |
| 33 | 10.6 | 2.3 | 1.8 | 1.9 | - | - | - | - | - | - | - | - | 是 |
| WT | 11.3 | 2.3 | 1.8 | 1.9 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
上述表4A中，WT表示未突变的天然变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶。突变体No.33表示下述蔗糖磷酸化酶，该酶在天然变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶中，在C端的两个氨基酸FE用SL替换，并在C端依次添加了甲硫氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸。“是”表示该位置发生突变。例如，突变体No.33在T47S、V128L、Q144R及D249G发生突变。该表中低于5％活性值非常接近于经活性测定来定量葡萄糖-1-磷酸的检测限，由于可靠性极低而可以认为几乎为0。
C端修饰为“是”时，第480位上的苯丙氨酸用亮氨酸替换，第481位上的谷氨酸用丝氨酸替换，并将甲硫氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸添加到连续位置(482～487位)中。
结果发现，与天然SP相比，8个对耐热性有贡献的位置中只替换一个就可以提高耐热性。同时也发现，这8个位置进行多个或全部氨基酸残基替换可以进一步提高蔗糖磷酸化酶的耐热性。
另一方面，C端的氨基酸替换及添加很难影响耐热性。因而可以这样实施氨基酸替换或添加而使本发明的效果不受抑制，同时本发明人发现的这些位置的替换对于耐热性很重要，而其他位置的替换则无意义。
有蔗糖存在时，各突变蔗糖磷酸化酶所测量的耐热性与无蔗糖存在时的耐热性相比均有提高。
(实施例2B：制备有各种氨基酸残基替换的耐热化蔗糖磷酸化酶及耐热性测定)
按实施例2A中相同方法制备含修饰蔗糖磷酸化酶基因的质粒，只是所用引物设计成用另一氨基酸替换T47、S62、Y77、V128、K140、Q144、N155及D249中的一个氨基酸，得到各种修饰SP酶的溶液。
按实施例2A(2)(i)中相同方法测量这些修饰SP酶加热后的剩余活性来确定这些修饰SP酶的耐热性，只是加热条件为55℃20分钟。结果如下列表4B所示。
表4B
| 酶溶液 | 剩余活性(％) |
| T47S | 47.3 |
| T47I | 50.0 |
| S62P | 33.4 |
| S62A | 31.0 |
| S62K | 26.3 |
| Y77H | 22.6 |
| Y77R | 34.8 |
| V128L | 26.6 |
| V128I | 49.5 |
| N155S | 37.8 |
| WT | 11.3 |
| 酶溶液 | 剩余活性(％) |
| K140M | 39.9 |
| K140C | 45.9 |
| K140F | 47.4 |
| K140I | 23.0 |
| K140V | 51.4 |
| K140Y | 53.8 |
| Q144R | 23.2 |
| Q144H | 38.2 |
| Q144I | 33.6 |
| Q144K | 30.3 |
| Q144V | 33.1 |
| 酶溶液 | 剩余活性(％) |
| D249G | 47.7 |
| D249C | 22.5 |
| D249H | 35.4 |
| D249K | 29.3 |
| D249L | 21.3 |
| D249N | 43.3 |
| D249P | 26.5 |
| D249Q | 24.5 |
| D249R | 21.3 |
| D249S | 22.4 |
该表中，T47S表示变异链球菌来源SP中第47位上苏氨酸替换成丝氨酸的突变体。对于其他突变体来说，其替换按此方式解释。WT表示变异链球菌来源的天然SP。
结果发现，与天然SP相比，在对耐热性有贡献的这8个位置中每一位置上的氨基酸残基用其他氨基酸残基替换均可以提高耐热性。
(实施例2C：肠膜明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶耐热性的提高及耐热性测定)
按实施例2A中相同方法制备含修饰蔗糖磷酸化酶基因的质粒，只是用编码肠膜明串珠菌来源SP的基因(SEQ ID NO：7)替代编码变异链球菌来源SP的基因，同时引物设计成可以分别发生A62P、V128I或N155S氨基酸替换，得到各种修饰SP酶的溶液。使用肠膜明串珠菌来源的天然SP的酶溶液作为对照。
按实施例2A(2)(i)中相同方法测量这些修饰SP酶溶液加热后的剩余活性来确定这些修饰SP酶的耐热性，只是加热条件为50℃、52℃或55℃持续20分钟。结果如下列表4C所示。肠膜明串珠菌来源的天然SP的结果如WT所示。
表4C
| 样品 | 50℃ | 52℃ | 55℃ |
| WT | 82.7 | 58.3 | 8.6 |
| A62P | 90.5 | 71.2 | 23.9 |
| V128I | 93.0 | 70.8 | 27.3 |
| N155S | 91.3 | 69.2 | 37.9 |
A62是与SEQ ID NO：2中S62对应的位置。V128是与SEQ ID NO：2中V128对应的位置。N155是与SEQ ID NO：2中N155对应的位置。
结果也发现，与天然SP相比，在这些肠膜明串珠菌来源SP中对耐热性有贡献的位置中每一位置上的氨基酸残基用其他氨基酸残基替换均可以提高耐热性。可以得到耐热化SP。
(实施例3：高温下耐热化蔗糖磷酸化酶的比活性)
检验了本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶在55℃的比活性。
具体地说，首先于37℃用20mM Tris缓冲液(pH7.0)将纯化后的No.2、3、4、5或6号耐热化蔗糖磷酸化酶溶液或对照天然(WT)变异链球菌蔗糖磷酸化酶溶液稀释到1U/ml。按1.7所述SP活性测定方法于37℃测定稀释酶溶液的酶活性，只是反应温度为55℃。
使用蛋白测试试剂盒(Bio-Rad制造)按厂商说明书对上述反应使用的相同体积酶溶液中的蔗糖磷酸化酶含量进行定量。使用IgG绘制测定标准曲线。
从这样所测得的SP活性(A(U/ml))和SP重量(W(mg/ml))，根据A/W(U/mg)确定SP的比活性。
结果如下列表5所示。
表5
| No. | 比活性(U/mg蛋白) |
| 2 | 44.1 |
| 3 | 96.4 |
| 4 | 163.9 |
| 5 | 32.2 |
| 6 | 40.3 |
| WT | 10.7 |
结果发现，引入突变使55℃时的比活性显著升高。
(实施例4：利用耐热化蔗糖磷酸化酶合成直链淀粉)
检验了利用耐热化蔗糖磷酸化酶合成直链淀粉的直链淀粉产率。使用实施例3中所制备的各种耐热化SP(No.1～6、25和32)作为耐热化蔗糖磷酸化酶。
使用变异链球菌来源的天然蔗糖磷酸化酶作为对照。
直链淀粉合成反应于50℃或55℃反应18小时，反应体系的组成如下列表6所示。
表6
| 用于直链淀粉合成反应的组分 | 量 |
| 蔗糖 | 292.3mM |
| 麦芽四糖(G4) | 1mM |
| 无机磷酸(Pi) | 10mM |
| α葡聚糖磷酸化酸 | 1U/ml |
| 蔗糖磷酸化酶 | 1U/ml |
使用2.2中制备的重组水生嗜热菌来源的葡聚糖磷酸化酶作为α-葡聚糖磷酸化酶。
按照前文“1.测定方法和计算方法”中所述计算此反应合成直链淀粉的产率。
此方法合成直链淀粉的产率如下表7所示。
表7
合成的直链淀粉的产率
| No. | 直链淀粉产率(％) | |
| 50℃ | 55℃ | |
| 1 | 91.3 | 35.3 |
| 2 | 91.9 | 34.1 |
| 3 | 90.3 | 30.5 |
| 4 | 87.4 | 26.3 |
| 5 | 88.8 | 24.7 |
| 6 | 91.1 | 27.7 |
| 25 | 61.3 | 7.3 |
| 32 | 59.5 | 5.4 |
| WT | 27.8 | 2.1 |
如上所示，发现本发明的耐热化SP在高温(如50℃-55℃)下可以合成直链淀粉。发现使用本发明的耐热化SP时合成直链淀粉的产率是使用野生型SP时产率的约2～约18倍。
(实施例5：利用耐热化蔗糖磷酸化酶合成葡萄糖-1-磷酸)
检验了利用本发明的耐热化蔗糖磷酸化酶合成葡萄糖-1-磷酸的葡萄糖-1-磷酸产率。使用实施例3中所制备的各种耐热化SP(No.1～6、25和32)作为耐热化蔗糖磷酸化酶。使用变异链球菌来源的天然蔗糖磷酸化酶(SEQ ID NO：2)作为对照。葡萄糖-1-磷酸合成反应于50℃或55℃反应18小时，反应体系的组成如下列表8所示。
表8
| 用于G-1-P合成反应的组分 | 量 |
| 蔗糖 | 300mM |
| 无机磷酸(Pi) | 300mM |
| 蔗糖磷酸化酶 | 1U/ml |
按照前文“1.测定方法和计算方法”中所述计算此反应合成葡萄糖-1-磷酸的产率。所得葡萄糖-1-磷酸的产率按下式计算：
产率(％)＝葡萄糖-1-磷酸产量(mM)/起始蔗糖浓度(300mM)×100
结果如下表9所示。
表9
| No. | 葡萄糖-1-磷酸的产率(％) | |
| 在50℃反应 | 在55℃反应 | |
| 1 | 88.2 | 88.5 |
| 2 | 89.3 | 87.2 |
| 3 | 87.6 | 89.4 |
| 4 | 88.1 | 87.3 |
| 5 | 85.8 | 80.3 |
| 6 | 81.1 | 82.2 |
| 25 | 78.0 | 19.0 |
| 32 | 79.9 | 7.8 |
| WT | 70.4 | 5.4 |
如上所示，发现本发明的耐热化SP在高温条件下可以合成葡萄糖-1-磷酸。发现当使用本发明的耐热化SP时，特别是在55℃的反应条件下合成葡萄糖-1-磷酸的产率是使用野生型SP时的约1.5～约16倍。
(实施例6：确认经热处理去除污染蛋白质)
下述方法证实加热处理可以容易地纯化耐热化的蔗糖磷酸化酶。
按实施例2A(1)所述方法培养表4A中No.1、2、3、4或5号表达耐热化蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌，同时培养表达天然(SEQ ID NO：2)变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶作为对照。将各培养物离心回收微生物细胞，然后悬于缓冲液中超声，得到微生物细胞提取物。微生物细胞提取物中加入蔗糖，得到含20％浓度蔗糖的混合物，于65℃加热20分钟，然后离心除去不溶性蛋白质，从而得到SP酶溶液。测定该酶溶液在37℃下的比活性。结果如表10所示。按实施例3中所述方法测定蛋白质含量并计算比活性。测定酶溶液加热之前和之后的磷酸酶活性和淀粉酶活性，以确定磷酸酶活性和淀粉酶活性相对于加热前活性的比值。结果如表11所示。
表10
比活性
| No. | 加热前(U/mg蛋白) | 加热后(U/mg蛋白) |
| 1 | 11.8 | 37.2 |
| 2 | 8.5 | 42.2 |
| 3 | 9.3 | 33.8 |
| 4 | 14.1 | 56.8 |
| 5 | 8.0 | 27.2 |
| 6 | 13.9 | 41.1 |
| WT | 10.5 | 0.1 |
表11
SP酶溶液中的磷酸酶活性和淀粉酶活性
| No. | 磷酸酶活性(％) | 淀粉酶活性(％) |
| 1 | 2.6 | 0.6 |
| 2 | 2.1 | 0.2 |
| 3 | 1.7 | 0.4 |
| 4 | 2.7 | 0.6 |
| 5 | 2.5 | 0.2 |
| 6 | 1.8 | 0.4 |
| WT | 2.2 | 0.5 |
含有耐热化SP的酶溶液于65℃加热以除去变性的蛋白，因此得到的纯化酶溶液的比活性为加热前的约3～约5倍。这表明，大部分污染蛋白已经变性并除去，而不使耐热化SP变性。另一方面，天然(WT；SEQ ID NO：2)SP的比活性降低到约1/100。这表明不仅污染蛋白发生变性，SP蛋白也发生变性。而且，65℃加热使源自微生物宿主的磷酸酶活性及淀粉酶活性分别降低到加热之前的约3.0％或以下和约1.0％或以下。因此通过热处理耐热化SP，可以容易地纯化耐热化SP。
(实施例7：C端氨基酸替换及C端氨基酸添加对比活性的影响)
除了目标突变外，在SP酶的C端进行氨基酸替换和添加，证实比活性不受这些氨基酸替换及添加的影响。
具体地说，用含有SEQ ID NO：23所列碱基序列的DNA，按照2.1所述方法，制备含有SEQ ID NO：24中所列氨基酸序列的C端修饰SP酶(上述实施例2A(1-3)中所制备的No.33)，并测定比活性。
按实施例3中所述方法于37℃测定C端修饰SP酶及天然SP酶的比活性，只是反应温度为37℃。结果如表12所示。结果很难区分C端修饰SP酶比活性和天然SP酶比活性之间的差别。因此，蔗糖磷酸化酶的活性几乎不受C端氨基酸替换和C端氨基酸添加的影响。
表12
| 酶 | 比活性(U/mg蛋白) |
| 天然SP酶 | 62.5 |
| C端修饰的SP酶(No.33) | 60.4 |
如上述，本发明用本发明的优选实施方案举例说明，但不应理解为将本发明限制于这些实施方案。可以理解，本发明的范围只由权利要求书解释。可以理解，基于本发明的描述和常规技术知识，从本发明优选实施方案的具体描述，本领域技术人员可在等价的范围实施。可以理解，本说明书引用的专利、专利申请和参考文献内容本身应引入作为参考，就像其内容在本说明书中具体描述一样。
工业实用性
根据本发明可以提供耐热化蔗糖磷酸化酶，该酶可应用于高温条件下葡聚糖、G-1-P等的高效生产。
序列表
<110>江崎格力高株式会社
<120>耐热化蔗糖磷酸化酶(SP)的方法
<130>EG014PCT
<140>PCT/JP2004/012533
<141>2004-08-31
<150>JP2003-313305
<151>2003-09-04
<160>27
<170>Patentin version 3.3
<210>1
<211>1443
<212>DNA
<213>变异链球菌(Streptococcus mutans)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1443)
<400>1
atg cca att aca aat aaa aca atg ttg att act tac gca gac agt ttg 48
Met Pro Ile Thr Asn Lys Thr Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu
1 5 10 15
ggt aaa aat ttg aaa gaa ttg aat gaa aat att gag aat tat ttt gga 96
Gly Lys Asn Leu Lys Glu Leu Asn Glu Asn Ile Glu Asn Tyr Phe Gly
20 25 30
gat gct gtt ggc ggt gtc cat ttg ctg cca ttc ttt cct tcc aca ggt 144
Asp Ala Val Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly
35 40 45
gat cgt ggc ttt gca ccg att gat tac cat gaa gtt gac tct gct ttt 192
Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ile Asp Tyr His Glu Val Asp Ser Ala Phe
50 55 60
ggc gat tgg gat gat gtc aaa cgt ttg ggt gaa aaa tat tac ctc atg 240
Gly Asp Trp Asp Asp Val Lys Arg Leu Gly Glu Lys Tyr Tyr Leu Met
65 70 75 80
ttt gat ttc atg att aat cat att tcg cgt cag tct aaa tat tat aaa 288
Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Gln Ser Lys Tyr Tyr Lys
85 90 95
gat tac caa gaa aag cat gaa gca agt gct tat aaa gat cta ttt tta 336
Asp Tyr Gln Glu Lys His Glu Ala Ser Ala Tyr Lys Asp Leu Phe Leu
100 105 110
aat tgg gat aaa ttt tgg cct aaa aat cgc ccg aca caa gaa gat gtg 384
Asn Trp Asp Lys Phe Trp Pro Lys Asn Arg Pro Thr Gln Glu Asp Val
115 120 125
gac ctg att tat aag cgt aag gat cga gca cct aag cag gaa atc caa 432
Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Arg Ala Pro Lys Gln Glu Ile Gln
130 135 140
ttt gca gat ggc agt gtt gaa cat ctc tgg aac act ttt ggg gag gaa 480
Phe Ala Asp Gly Ser Val Glu His Leu Trp Asn Thr Phe Gly Glu Glu
145 150 155 160
cag att gat ctt gac gtg act aaa gaa gtg act atg gat ttt att cgc 528
Gln Ile Asp Leu Asp Vat Thr Lys Glu Val Thr Met Asp Phe Ile Arg
165 170 175
tct acc att gaa aat tta gca gcc aac ggc tgt gat ctc att cgt ttg 576
Ser Thr Ile Glu Asn Leu Ala Ala Asn Gly Cys Asp Leu Ile Arg Leu
180 185 190
gat gcc ttt gct tat gct gtt aaa aag cta gat acg aat gat ttc ttt 624
Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Leu Asp Thr Asn Asp Phe Phe
195 200 205
gtt gaa cct gaa atc tgg act ctg cta gat aaa gtt cgt gat ata gct 672
Val Glu Pro Glu Ile Trp Thr Leu Leu Asp Lys Val Arg Asp Ile Ala
210 215 220
gct gta tcg ggt gcg gaa atc ttg ccg gaa att cat gaa cac tat act 720
Ala Val Ser Gly Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Thr
225 230 235 240
att caa ttt aaa att gca gac cat gat tac tat gtt tat gat ttt gcc 768
Ile Gln Phe Lys Ile Ala Asp His Asp Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala
245 250 255
ctg cct atg gtg acg ctc tac agc cta tat tcg ggc aag gtt gac cgt 816
Leu Pro Met Val Thr Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Gly Lys Val Asp Arg
260 265 270
ctt gcc aaa tgg ctg aaa atg agt ccg atg aaa cag ttc acc acc ctt 864
Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr Leu
275 280 285
gat aca cat gac ggt att ggt gtg gtt gat gtt aag gat atc ctg act 912
Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Val Lys Asp Ile Leu Thr
290 295 300
gac gaa gaa att acc tat act tct aat gag ctt tat aag gtc ggt gcc 960
Asp Glu Glu Ile Thr Tyr Thr Ser Asn Glu Leu Tyr Lys Val Gly Ala
305 310 315 320
aat gtc aat cgt aag tat tca act gcc gaa tat aat aac ttg gat atc 1008
Asn Val Asn Arg Lys Tyr Ser Thr Ala Glu Tyr Asn Asn Leu Asp Ile
325 330 335
tat caa att aat tca act tac tat tca gca ctt ggt gat gat gat caa 1056
Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asp Asp Asp Gln
340 345 350
aaa tac ttt ttg gcc cgc ttg ata caa gct ttt gct cca ggt att cca 1104
Lys Tyr Phe Leu Ala Arg Leu Ile Gln Ala Phe Ala Pro Gly Ile Pro
355 360 365
cag gtt tat tac gtt ggc ttt tta gct ggc aag aat gat ctt gaa tta 1152
Gln Val Tyr Tyr Val Gly Phe Leu Ala Gly Lys Asn Asp Leu Glu Leu
370 375 380
ctg gaa agc act aaa gaa ggc cgc aat atc aac cgt cat tat tat agt 1200
Leu Glu Ser Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser
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agt gaa gaa att gct aag gaa gtg aag cgg cca gtt gtc aag gca ctt 1248
Ser Glu Glu Ile Ala Lys Glu Val Lys Arg Pro Val Val Lys Ala Leu
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tta aat ctc ttt act tac cgc aat cag tca gca gct ttt gat ttg gat 1296
Leu Asn Leu Phe Thr Tyr Arg Asn Gln Ser Ala Ala Phe Asp Leu Asp
420 425 430
ggc cgt att gaa gtg gaa acg cca aat gaa gcg acc att gtc ata gaa 1344
Gly Arg Ile Glu Val Glu Thr Pro Asn Glu Ala Thr Ile Val Ile Glu
435 440 445
cgt caa aat aaa gat ggc agt cat atc gca aca gca gag att aat ctc 1392
Arg Gln Asn Lys Asp Gly Ser His Ile Ala Thr Ala Glu Ile Asn Leu
450 455 460
caa gat atg aca tac aga gta aca gaa aat gat caa aca ata agc ttt 1440
Gln Asp Met Thr Tyr Arg Val Thr Glu Asn Asp Gln Thr Ile Ser Phe
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gaa 1443
Glu
<210>2
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<213>变异链球菌(Streptococcus mutans)
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Gly Lys Asn Leu Lys Glu Leu Asn Glu Asn Ile Glu Asn Tyr Phe Gly
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Asp Ala Val Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly
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Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ile Asp Tyr His Glu Val Asp Ser Ala Phe
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Asn Trp Asp Lys Phe Trp Pro Lys Asn Arg Pro Thr Gln Glu Asp Val
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Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Arg Ala Pro Lys Gln Glu Ile Gln
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Phe Ala Asp Gly Ser Val Glu His Leu Trp Asn Thr Phe Gly Glu Glu
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Ala Val Ser Gly Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Thr
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Ile Gln Phe Lys Ile Ala Asp His Asp Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala
245 250 255
Leu Pro Met Val Thr Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Gly Lys Val Asp Arg
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Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr Leu
275 280 285
Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Val Lys Asp Ile Leu Thr
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Leu Asn Leu Phe Thr Tyr Arg Asn Gln Ser Ala Ala Phe Asp Leu Asp
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Gly Arg Ile Glu Val Glu Thr Pro Asn Glu Ala Thr Ile Val Ile Glu
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Glu
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<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<220>
<221>CDS
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Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Arg Ala Pro Lys Gln Glu Ile Val
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<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>4
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Phe Glu Asp Gly Ser Val Glu His Leu Trp Asn Thr Phe Gly Glu Glu
145 150 155 160
Gln Ile Asp Leu Asp Val Thr Lys Glu Val Thr Met Glu Phe Ile Arg
165 170 175
Lys Thr Ile Gln His Leu Ala Ser Asn Gly Cys Asp Leu Ile Arg Leu
180 185 190
Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Leu Asp Thr Asn Asp Phe Phe
195 200 205
Val Glu Pro Asp Ile Trp Asp Leu Leu Asp Lys Val Arg Asp Ile Ala
210 215 220
Ala Glu Tyr Gly Thr Glu Leu Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Ser
225 230 235 240
Ile Gln Phe Lys Ile Ala Asp His Asp Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala
245 250 255
Leu Pro Met Val Thr Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Arg Thr Glu Arg
260 265 270
Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr Leu
275 280 285
Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Val Lys Asp Ile Leu Thr
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Asp Glu Glu Ile Asp Tyr Ala Ser Asn Glu Leu Tyr Lys Val Gly Ala
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Asn Val Lys Arg Lys Tyr Ser Ser Ala Glu Tyr Asn Asn Leu Asp Ile
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Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asp Asp Asp Val
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Lys Tyr Phe Leu Ala Arg Leu Ile Gln Ala Phe Ala Pro Gly Ile Pro
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Arg Gln Asn Lys Asp Lys Ser Val Thr Ala Val Val Glu Ile Asp Leu
450 455 460
Gln Asn Gln Thr Tyr Arg Val Ile Glu Asn Gly Val Glu Val
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<220>
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ggt agg aac cta aaa gag ctg gat gaa aat atc agc atc tat ttt gga 96
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gat gca att gga ggc gtc cat ctc ctg cct ttc ttc ccc tcg aca gga 144
Asp Ala Ile Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly
35 40 45
gat agg gga ttc gct cca gtt gat tac gat aag gtg gat cct gct ttt 192
Asp Arg Gly Phe Ala Pro Val Asp Tyr Asp Lys Val Asp Pro Ala Phe
50 55 60
ggt gac tgg gat gat gtc aaa cgt tta ggt gct aaa tac tac ctg atg 240
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ttt gat ttt atg att aat cat atc tcc cgt caa tct aag tat tat aag 288
Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Gln Ser Lys Tyr Tyr Lys
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gat ttt caa gag aaa aaa gat gct tct gac tat gcg gat tta ttt ctg 336
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cgc tgg gaa aaa ttc tgg ccg gaa aac cgt ccc acc caa gca gat att 384
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aaa aac atc gag cat cta gca gtc aat ggt tgt gat ctc att cgc ctg 576
Lys Asn Ile Glu His Leu Ala Val Asn Gly Cys Asp Leu Ile Arg Leu
180 185 190
gat gcc ttt gcc tac gcc gtg aaa aaa ttg gac act aat gat ttc ttt 624
Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Leu Asp Thr Asn Asp Phe Phe
195 200 205
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210 215 220
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Lys Glu Ala Gly Ala Asp Ile Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Ser
225 230 235 240
atc cag ttc aaa att gct gag cat gac tat ttc att tat gat ttt gcc 768
Ile Gln Phe Lys Ile Ala Glu His Asp Tyr Phe Ile Tyr Asp Phe Ala
245 250 255
ctt cca atg gta acc ctt tac tct ctt tat agc ggt agg gtg caa cgt 816
Leu Pro Met Val Thr Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Gly Arg Val Gln Arg
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Leu Ala Asp Trp Leu Ala Lys Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr Leu
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tat caa atc aac tcg acc tac tat tca gcc ctt ggt gac gat gac aag 1056
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Lys Tyr Phe Leu Ala Arg Leu Ile Gln Ala Phe Ala Pro Gly Ile Pro
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caa gtt tat tat gtt gga ctt ttg gct gga aaa aac gat ctg aag ctc 1152
Gln Val Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Lys Asn Asp Leu Lys Leu
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Ile Lys Leu Phe Ser Tyr Arg Asn Asn Ser Gln Ala Phe Asp Leu Asp
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ggc agc ctt gaa acg gaa gtt ctg gat gac cac acc atc gtt atc aag 1344
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Glu
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gat tta att tac aaa aga aaa gat aag gcg ccg att cag ggg att act 432
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Leu Pro Leu Val Ile Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Gly Asn Pro Lys Gln
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Asp Glu Glu Ile Asp Tyr Thr Ser Ser Glu Leu Tyr Lys Val Gly Ala
305 310 315 320
aac gtc aaa cgg act tat tca tct gcg gcc tat aat aat ttg gat att 1008
Asn Val Lys Arg Thr Tyr Ser Ser Ala Ala Tyr Asn Asn Leu Asp Ile
325 330 335
tac cag att aac tcg acc tat tat tca gct ctt ggc aat gat gac aaa 1056
Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asn Asp Asp Lys
340 345 350
gcc tat ttg ctt gcc cgt gca ata caa att ttt gcc ccg gga att cca 1104
Ala Tyr Leu Leu Ala Arg Ala Ile Gln Ile Phe Ala Pro Gly Ile Pro
355 360 365
caa atc tat tac gca ggc ctg ctg gct ggt gaa aac gat ttg gat ttg 1152
Gln Ile Tyr Tyr Ala Gly Leu Leu Ala Gly Glu Asn Asp Leu Asp Leu
370 375 380
ttg gaa aag acc aag gaa gga cgc aat ata aat cgt cat tat tac agt 1200
Leu Glu Lys Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser
385 390 395 400
gaa gaa gaa gtt gcc aat gaa gtg cag aga cca att gtt gcc tgc cta 1248
Glu Glu Glu Val Ala Asn Glu Val Gln Arg Pro Ile Val Ala Cys Leu
405 410 415
ctg aaa ttg ttg gct tgg cgc aat cgc agt gcc gct ttt gat ctt caa 1296
Leu Lys Leu Leu Ala Trp Arg Asn Arg Ser Ala Ala Phe Asp Leu Gln
420 425 430
gga gat att caa gtc agc gca acc gac aaa aat gaa atc aaa att att 1344
Gly Asp Ile Gln Val Ser Ala Thr Asp Lys Asn Glu Ile Lys Ile Ile
435 440 445
cga act tca acc aat ggc caa gac acc gcg gaa tta acc gct aat gtg 1392
Arg Thr Ser Thr Asn Gly Gln Asp Thr Ala Glu Leu 7hr Ala Asn Val
450 455 460
gct cta aaa acc ttt act ata aag gaa aat gat aaa att att tta att 1440
Ala Leu Lys Thr Phe Thr Ile Lys Glu Asn Asp Lys Ile Ile Leu Ile
465 470 475 480
gaa gat cag act gat aca aag gat atc 1467
Glu Asp Gln Thr Asp Thr Lys Asp Ile
485
<210>10
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<212>PRT
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Asp Ala Ile Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly
35 40 45
Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ser Asp Tyr Thr Arg Val Asn Pro Asp Phe
50 55 60
Gly Asp Trp Glu Asp Val Glu Glu Leu Gly Lys Lys Tyr Tyr Leu Met
65 70 75 80
Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Glu Ser Ile Met Tyr Gln
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Arg Trp Glu Lys Phe Trp Pro Lys Gly Arg Pro Thr Lys Ala Asp Ile
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Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Lys Ala Pro Ile Gln Gly Ile Thr
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Phe Ala Asp Gly Ser Gln Glu His Leu Trp Asn Thr Phe Gly Asp Glu
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Gln Ile Asp Ile Asn Val Lys Ser Lys Val Ala Gln Glu Phe Phe Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Gln Ser Met Val Lys His Gly Ala Asp Leu Ile Arg Leu
180 185 190
Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Ile Lys Lys Ile Asp Thr Asn Asp Phe Phe
195 200 205
Ile Glu Pro Glu Ile Trp Asp Leu Leu Glu Ser Val Arg Lys Ile Leu
210 215 220
Asp Pro Leu His Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile Tyr Glu His Tyr Thr
225 230 235 240
Ile Pro Ala Lys Ile Asn Glu Tyr Gly Tyr Phe Thr Tyr Asp Phe Val
245 250 255
Leu Pro Leu Val Ile Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Gly Asn Pro Lys Gln
260 265 270
Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Lys Lys Gln Phe Thr Thr Leu
275 280 285
Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Ala Arg Asp Ile Leu Thr
290 295 300
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305 310 315 320
Asn Val Lys Arg Thr Tyr Ser Ser Ala Ala Tyr Asn Asn Leu Asp Ile
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405 410 415
Leu Lys Leu Leu Ala Trp Arg Asn Arg Ser Ala Ala Phe Asp Leu Gln
420 425 430
Gly Asp Ile Gln Val Ser Ala Thr Asp Lys Asn Glu Ile Lys Ile Ile
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<220>
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gga aat aat ctt aaa gac tta tat gag aat ttg gaa gag tat ttt gga 96
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20 25 30
gat gct att ggg gga gtt cac ctt cta cca ttt ttc cca tca aca ggt 144
Asp Ala Ile Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly
35 40 45
gat cgt gga ttt gcg cca gtt gac tac gac gaa gtg gat tca gct ttt 192
Asp Arg Gly Phe Ala Pro Val Asp Tyr Asp Glu Val Asp Ser Ala Phe
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ggt gat tgg gag gat gtt aag cgt tta ggt gag aaa tat tat ctt atg 240
Gly Asp Trp Glu Asp Val Lys Arg Leu Gly Glu Lys Tyr Tyr Leu Met
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ttt gac ttt atg att aat cat att tct cgt caa tct aag tat tat aag 288
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gat tta att tac aag cgt aag gat cgt gca cca aag caa gag att gtt 432
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ttt gaa gat ggg tca gtc gaa cat ttg tgg aat acc ttt ggt gag gag 480
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180 185 190
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gta gaa cca gat att tgg gat tta ttg gac aaa gtt cga gat atc gct 672
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210 215 220
gct gag tat ggg aca gag ctc tta cct gag att cat gaa cat tat tcg 720
Ala Glu Tyr Gly Thr Glu Leu Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Ser
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att cag ttt aaa ata gca gac cat gat tac tat gtt tat gat ttt gct 768
Ile Gln Phe Lys Ile Ala Asp His Asp Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala
245 250 255
ctt cca atg gtg aca ctt tat act ctt tac agt tcc aga aca gag cgt 816
Leu Pro Met Val Thr Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Arg Thr Glu Arg
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ttg gct aag tgg tta aag atg agc cca atg aag caa ttt acg acg cta 864
Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr Leu
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gac acc cat gat ggg att gga gtg gtg gat gtc aag gat atc ttg aca 912
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Leu Asn Leu Phe Ser Phe Arg Asn Arg Ser Val Ala Phe Asp Leu Glu
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gga act att gac gtt gaa aca cca aca gcc cac agc att gta atc aaa 1344
Gly Thr Ile Asp Val Glu Thr Pro Thr Ala His Ser Ile Val Ile Lys
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cgt caa aat aaa gat aag tcc gta aca gca gta gca gaa att gat ttg 1392
Arg Gln Asn Lys Asp Lys Ser Val Thr Ala Val Ala Glu Ile Asp Leu
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<213>缓症链球菌(Streptococcus mitis)
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Leu Pro Met Val Thr Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Arg Thr Glu Arg
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Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe Tyr Thr Leu
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Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Val Lys Asp Ile Leu Thr
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Gln Val Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Lys Asn Asp Leu Lys Leu
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Leu Glu Glu Thr Lys Val Gly Arg Asn Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser
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Asn Glu Glu Ile Ala Glu Glu Val Gln Arg Pro Val Val Lys Ala Leu
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Leu Asn Leu Phe Ser Phe Arg Asn Arg Ser Val Ala Phe Asp Leu Glu
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35 40 45
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ggt gat tgg aat gat gtt gag gca ctt ggg caa gaa tac tat ttg atg 240
Gly Asp Trp Asn Asp Val Glu Ala Leu Gly Gln Glu Tyr Tyr Leu Met
65 70 75 80
ttt gat ttt atg atc aat cat att tct cgt gaa tcg gag atg tat caa 288
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85 90 95
gat ttt aaa gca aat cac gat caa tca aag tac cgt gat ttc ttc att 336
Asp Phe Lys Ala Asn His Asp Gln Ser Lys Tyr Arg Asp Phe Phe Ile
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195 200 205
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225 230 235 240
cat tat aca att cct caa aag atc aac gcc cat ggt tat ttc act tat 768
His Tyr Thr Ile Pro Gln Lys Ile Asn Ala His Gly Tyr Phe Thr Tyr
245 250 255
gat ttt gct ttg cca atg aca gta ctt tat acg ctt tac tca ggc aaa 816
Asp Phe Ala Leu Pro Met Thr Val Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Gly Lys
260 265 270
aca aat cga cta gcc aac tgg ctc aaa cag tct ccg atg aaa caa ttc 864
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acg acg tta gat acg cat gat ggc att ggg gtt gtt gac gca cgt gat 912
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gct gac tta ttg gca tta tta tca tgg cgt aat cag ttt tca gca ttt 1296
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gct ctg gat ggg aca atc act gtc gag aca cca tca gaa cat gat att 1344
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<213>肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)
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355 360 365
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Ile Asp Leu Leu Glu Ser Ser Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His
385 390 395 400
Tyr Tyr Thr Arg Glu Glu Ile Lys Ser Ala Val Lys Arg Pro Val Val
405 410 415
Ala Asp Leu Leu Ala Leu Leu Ser Trp Arg Asn Gln Phe Ser Ala Phe
420 425 430
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450 455 460
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<222>(1)..(1443)
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atg aaa tta caa aat aag gca ata ttg ata act tat cca gat agt tta 48
Met Lys Leu Gln Asn Lys Ala Ile Leu Ile Thr Tyr Pro Asp Ser Leu
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ggt cat aat ttg aag gac ttg gat cat gta atg gat cgc tat ttt aat 96
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Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Ile Lys Lys Leu Asp Thr Asn Asp Phe Phe
195 200 205
Val Glu Pro Glu Ile Trp Asp Leu Leu Asp Glu Val Lys Ala Glu Ala
210 215 220
Ala Lys Tyr Asp Met Glu Leu Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Ser
225 230 235 240
Ile Gln Met Lys Ile Ala Asn His Asp Tyr Tyr Ile Tyr Asp Phe Ala
245 250 255
Leu Pro Met Val Met Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Gly Arg Val Glu Arg
260 265 270
Leu Ala Lys Trp Leu Glu Met Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr Leu
275 280 285
Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Ala Arg Asp Leu Leu Thr
290 295 300
Asp Glu Glu Leu Asp Tyr Thr Ser Ala Glu Leu Tyr Lys Ile Gly Ala
305 310 315 320
Asn Val Lys Lys Ile Tyr Ser Ser Glu Lys Tyr Asn Asn Leu Asp Ile
325 330 335
Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asp Asp Asp Lys
340 345 350
Ser Tyr Leu Leu Ala Arg Val Ile Gln Cys Phe Ala Pro Gly Ile Pro
355 360 365
Gln Ile Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Lys Asn Asp Ile Asp Leu
370 375 380
Leu Glu Glu Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His Tyr Tyr Thr
385 390 395 400
Ile Asp Glu Ile Lys Asn Glu Val Lys Arg Pro Val Val Lys Ala Leu
405 410 415
Cys Asn Leu Leu Arg Phe Arg Asn Thr Ser Glu Ala Phe Asp Leu Glu
420 425 430
Gly Ser Ile Glu Ile Glu Thr Pro Ser Ser Asn Glu Ile Val Ile Ile
435 440 445
Arg Lys Asn Lys Thr Asn Lys Ile Thr Ala Thr Leu Lys Ala Asn Leu
450 455 460
Ser Thr Lys Thr Phe Gln Ile Ser Glu Asn Glu Arg Asn Ile Leu Ile
465 470 475 480
<210>21
<211>1443
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>变异链球菌蔗糖磷酸化酶的突变体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1443)
<400>21
atg cca att aca aat aaa aca atg ttg att act tac gca gac agt ttg 48
Met Pro Ile Thr Asn Lys Thr Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu
1 5 10 15
ggt aaa aat ttg aaa gaa ttg aat gaa aat att gag aat tat ttt gga 96
Gly Lys Asn Leu Lys Glu Leu Asn Glu Asn Ile Glu Asn Tyr Phe Gly
20 25 30
gat gct gtt ggc ggt gtc cat ttg ctg cca ttc ttt cct tcc tca ggt 144
Asp Ala Val Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Ser Gly
35 40 45
gat cgt ggc ttt gca ccg att gat tac cat gaa gtt gac cct gct ttt 192
Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ile Asp Tyr His Glu Val Asp Pro Ala Phe
50 55 60
ggc gat tgg gat gat gtc aaa cgt ttg ggt gaa aaa cat tac ctc atg 240
Gly Asp Trp Asp Asp Val Lys Arg Leu Gly Glu Lys His Tyr Leu Met
65 70 75 80
ttt gat ttc atg att aat cat att tcg cgt cag tct aaa tat tat aaa 288
Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Gln Ser Lys Tyr Tyr Lys
85 90 95
gat tac caa gaa aag cat gaa gca agt gct tat aaa gat cta ttt tta 336
Asp Tyr Gln Glu Lys His Glu Ala Ser Ala Tyr Lys Asp Leu Phe Leu
100 105 110
aat tgg gat aaa ttt tgg cct aaa aat cgc ccg aca caa gaa gat ctg 384
Asn Trp Asp Lys Phe Trp Pro Lys Asn Arg Pro Thr Gln Glu Asp Leu
115 120 125
gac ctg att tat aag cgt aag gat cga gca cct atg cae gaa atc cga 432
Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Arg Ala Pro Met Gln Glu Ile Arg
130 135 140
ttt gca gat ggc agt gtt gaa cat ctc tgg agc act ttt ggg gag gaa 480
Phe Ala Asp Gly Ser Val Glu His Leu Trp Ser Thr Phe Gly Glu Glu
145 150 155 160
cag att gat ctt gac gtg act aaa gaa gtg act atg gat ttt att cgc 528
Gln Ile Asp Leu Asp Val Thr Lys Glu Val Thr Met Asp Phe Ile Arg
165 170 175
tct acc att gaa aat tta gca gcc aac ggc tgt gat ctc att cgt ttg 576
Ser Thr Ile Glu Asn Leu Ala Ala Asn Gly Cys Asp Leu Ile Arg Leu
180 185 190
gat gcc ttt gct tat gct gtt aaa aag cta gat acg aat gat ttc ttt 624
Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Leu Asp Thr Asn Asp Phe Phe
195 200 205
gtt gaa cct gaa atc tgg act ctg cta gat aaa gtt cgt gat ata gct 672
Val Glu Pro Glu Ile Trp Thr Leu Leu Asp Lys Val Arg Asp Ile Ala
210 215 220
gct gta tcg ggt gcg gaa atc ttg ccg gaa att cat gaa cac tat act 720
Ala Val Ser Gly Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Thr
225 230 235 240
att caa ttt aaa att gca gac cat ggt tac tat gtt tat gat ttt gcc 768
Ile Gln Phe Lys Ile Ala Asp His Gly Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala
245 250 255
ctg cct atg gtg acg ctc tac agc cta tat tcg ggc aag gtt gac cgt 816
Leu Pro Met Val Thr Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Gly Lys Val Asp Arg
260 265 270
ctt gcc aaa tgg ctg aaa atg agt ccg atg aaa cag ttc acc acc ctt 864
Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr Leu
275 280 285
gat aca cat gac ggt att ggt gtg gtt gat gtt aag gat atc ctg act 912
Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Val Lys Asp Ile Leu Thr
290 295 300
gac gaa gaa att acc tat act tct aat gag ctt tat aag gtc ggt gcc 960
Asp Glu Glu Ile Thr Tyr Thr Ser Asn Glu Leu Tyr Lys Val Gly Ala
305 310 315 320
aat gtc aat cgt aag tat tca act gcc gaa tat aat aac ttg gat atc 1008
Asn Val Asn Arg Lys Tyr Ser Thr Ala Glu Tyr Asn Asn Leu Asp Ile
325 330 335
tat caa att aat tca act tac tat tca gca ctt ggt gat gat gat caa 1056
Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asp Asp Asp Gln
340 345 350
aaa tac ttt ttg gcc cgc ttg ata caa gct ttt gct cca ggt att cca 1104
Lys Tyr Phe Leu Ala Arg Leu Ile Gln Ala Phe Ala Pro Gly Ile Pro
355 360 365
cag gtt tat tac gtt ggc ttt tta gct ggc aag aat gat ctt gaa tta 1152
Gln Val Tyr Tyr Val Gly Phe Leu Ala Gly Lys Asn Asp Leu Glu Leu
370 375 380
ctg gaa agc act aaa gaa ggc cgc aat atc aac cgt cat tat tat agt 1200
Leu Glu Ser Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser
385 390 395 400
agt gaa gaa att gct aag gaa gtg aag cgg cca gtt gtc aag gca ctt 1248
Ser Glu Glu Ile Ala Lys Glu Val Lys Arg Pro Val Val Lys Ala Leu
405 410 415
tta aat ctc ttt act tac cgc aat cag tca gca gct ttt gat ttg gat 1296
Leu Asn Leu Phe Thr Tyr Arg Asn Gln Ser Ala Ala Phe Asp Leu Asp
420 425 430
ggc cgt att gaa gtg gaa acg cca aat gaa gcg acc att gtc ata gaa 1344
Gly Arg Ile Glu Val Glu Thr Pro Asn Glu Ala Thr Ile Val Ile Glu
435 440 445
cgt caa aat aaa gat ggc agt cat atc gca aca gca gag att aat ctc 1392
Arg Gln Asn Lys Asp Gly Ser His Ile Ala Thr Ala Glu Ile Asn Leu
450 455 460
caa gat atg aca tac aga gta aca gaa aat gat caa aca ata agc ttt 1440
Gln Asp Met Thr Tyr Arg Val Thr Glu Asn Asp Gln Thr Ile Ser Phe
465 470 475 480
gaa 1443
Glu
<210>22
<211>481
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>22
Met Pro Ile Thr Asn Lys Thr Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu
1 5 10 15
Gly Lys Asn Leu Lys Glu Leu Asn Glu Asn Ile Glu Asn Tyr Phe Gly
20 25 30
Asp Ala Val Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Ser Gly
35 40 45
Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ile Asp Tyr His Glu Val Asp Pro Ala Phe
50 55 60
Gly Asp Trp Asp Asp Val Lys Arg Leu Gly Glu Lys His Tyr Leu Met
65 70 75 80
Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Gln Ser Lys Tyr Tyr Lys
85 90 95
Asp Tyr Gln Glu Lys His Glu Ala Ser Ala Tyr Lys Asp Leu Phe Leu
100 105 110
Asn Trp Asp Lys Phe Trp Pro Lys Asn Arg Pro Thr Gln Glu Asp Leu
115 120 125
Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Arg Ala Pro Met Gln Glu Ile Arg
130 135 140
Phe Ala Asp Gly Ser Val Glu His Leu Trp Ser Thr Phe Gly Glu Glu
145 150 155 160
Gln Ile Asp Leu Asp Val Thr Lys Glu Val Thr Met Asp Phe Ile Arg
165 170 175
Ser Thr Ile Glu Asn Leu Ala Ala Asn Gly Cys Asp Leu Ile Arg Leu
180 185 190
Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Leu Asp Thr Asn Asp Phe Phe
195 200 205
Val Glu Pro Glu Ile Trp Thr Leu Leu Asp Lys Val Arg Asp Ile Ala
210 215 220
Ala Val Ser Gly Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Thr
225 230 235 240
Ile Gln Phe Lys Ile Ala Asp His Gly Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala
245 250 255
Leu Pro Met Val Thr Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Gly Lys Val Asp Arg
260 265 270
Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr Leu
275 280 285
Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Val Lys Asp Ile Leu Thr
290 295 300
Asp Glu Glu Ile Thr Tyr Thr Ser Asn Glu Leu Tyr Lys Val Gly Ala
305 310 315 320
Asn Val Asn Arg Lys Tyr Ser Thr Ala Glu Tyr Asn Asn Leu Asp Ile
325 330 335
Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asp Asp Asp Gln
340 345 350
Lys Tyr Phe Leu Ala Arg Leu Ile Gln Ala Phe Ala Pro Gly Ile Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Tyr Val Gly Phe Leu Ala Gly Lys Asn Asp Leu Glu Leu
370 375 380
Leu Glu Ser Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser
385 390 395 400
Ser Glu Glu Ile Ala Lys Glu Val Lys Arg Pro Val Val Lys Ala Leu
405 410 415
Leu Asn Leu Phe Thr Tyr Arg Asn Gln Ser Ala Ala Phe Asp Leu Asp
420 425 430
Gly Arg Ile Glu Val Glu Thr Pro Asn Glu Ala Thr Ile Val Ile Glu
435 440 445
Arg Gln Asn Lys Asp Gly Ser His Ile Ala Thr Ala Glu Ile Asn Leu
450 455 460
Gln Asp Met Thr Tyr Arg Val Thr Glu Asn Asp Gln Thr Ile Ser Phe
465 470 475 480
Glu
<210>23
<211>1461
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>变异链球菌蔗糖磷酸化酶的突变体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1461)
<400>23
atg cca att aca a at aaa aca atg ttg att act tac gca gac agt ttg 48
Met Pro Ile Thr Asn Lys Thr Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu
1 5 10 15
ggt aaa aat ttg aaa gaa ttg aat gaa aat att gag aat tat ttt gga 96
Gly Lys Asn Leu Lys Glu Leu Asn Glu Asn Ile Glu Asn Tyr Phe Gly
20 25 30
gat gct gtt ggc ggt gtc cat ttg ctg cca ttc ttt cct tcc aca ggt 144
Asp Ala Val Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly
35 40 45
gat cgt ggc ttt gca ccg att gat tac cat gaa gtt gac tct gct ttt 192
Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ile Asp Tyr His Glu Val Asp Ser Ala Phe
50 55 60
ggc gat tgg gat gat gtc aaa cgt ttg ggt gaa aaa tat tac ctc atg 240
Gly Asp Trp Asp Asp Val Lys Arg Leu Gly Glu Lys Tyr Tyr Leu Met
65 70 75 80
ttt gat ttc atg att aat cat att tcg cgt cag tct aaa tat tat aaa 288
Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Gln Ser Lys Tyr Tyr Lys
85 90 95
gat tac caa gaa aag cat gaa gca agt gct tat aaa gat cta ttt tta 336
Asp Tyr Gln Glu Lys His Glu Ala Ser Ala Tyr Lys Asp Leu Phe Leu
100 105 110
aat tgg gat aaa ttt tgg cct aaa aat cgc ccg aca caa gaa gat gtg 384
Asn Trp Asp Lys Phe Trp Pro Lys Asn Arg Pro Thr Gln Glu Asp Val
115 120 125
gac ctg att tat aag cgt aag gat cga gca cct aag cag gaa atc caa 432
Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Arg Ala Pro Lys Gln Glu Ile Gln
130 135 140
ttt gca gat ggc agt gtt gaa cat ctc tgg aac act ttt ggg gag gaa 480
Phe Ala Asp Gly Ser Val Glu His Leu Trp Asn Thr Phe Gly Glu Glu
145 150 155 160
cag att gat ctt gac gtg act aaa gaa gtg act atg gat ttt att cgc 528
Gln Ile Asp Leu Asp Val Thr Lys Glu Val Thr Met Asp Phe Ile Arg
165 170 175
tct acc att gaa aat tta gca gcc aac ggc tgt gat ctc att cgt ttg 576
Ser Thr Ile Glu Asn Leu Ala Ala Asn Gly Cys Asp Leu Ile Arg Leu
180 185 190
gat gcc ttt gct tat gct gtt aaa aag cta gat acg aat gat ttc ttt 624
Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Leu Asp Thr Asn Asp Phe Phe
195 200 205
gtt gaa cct gaa atc tgg act ctg cta gat aaa gtt cgt gat ata gct 672
Val Glu Pro Glu Ile Trp Thr Leu Leu Asp Lys Val Arg Asp Ile Ala
210 215 220
gct gta tcg ggt gcg gaa atc ttg ccg gaa att cat gaa cac tat act 720
Ala Val Ser Gly Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Thr
225 230 235 240
att caa ttt aaa att gca gac cat gat tac tat gtt tat gat ttt gcc 768
Ile Gln Phe Lys Ile Ala Asp His Asp Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala
245 250 255
ctg cct atg gtg acg ctc tac agc cta tat tcg ggc aag gtt gac cgt 816
Leu Pro Met Val Thr Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Gly Lys Val Asp Arg
260 265 270
ctt gcc aaa tgg ctg aaa atg agt ccg atg aaa cag ttc acc acc ctt 864
Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr Leu
275 280 285
gat aca cat gac ggt att ggt gtg gtt gat gtt aag gat atc ctg act 912
Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Val Lys Asp Ile Leu Thr
290 295 300
gac gaa gaa att acc tat act tct aat gag ctt tat aag gtc ggt gcc 960
Asp Glu Glu Ile Thr Tyr Thr Ser Asn Glu Leu Tyr Lys Val Gly Ala
305 310 315 320
aat gtc aat cgt aag tat tca act gcc gaa tat aat aac ttg gat atc 1008
Asn Val Asn Arg Lys Tyr Ser Thr Ala Glu Tyr Asn Asn Leu Asp Ile
325 330 335
tat caa att aat tca act tac tat tca gca ctt ggt gat gat gat caa 1056
Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asp Asp Asp Gln
340 345 350
aaa tac ttt ttg gcc cgc ttg ata caa gct ttt gct cca ggt att cca 1104
Lys Tyr Phe Leu Ala Arg Leu Ile Gln Ala Phe Ala Pro Gly Ile Pro
355 360 365
cag gtt tat tac gtt ggc ttt tta gct ggc aag aat gat ctt gaa tta 1152
Gln Val Tyr Tyr Val Gly Phe Leu Ala Gly Lys Asn Asp Leu Glu Leu
370 375 380
ctg gaa agc act aaa gaa ggc cgc aat atc aac cgt cat tat tat agt 1200
Leu Glu Ser Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser
385 390 395 400
agt gaa gaa att gct aag gaa gtg aag cgg cca gtt gtc aag gca ctt 1248
Ser Glu Glu Ile Ala Lys Glu Val Lys Arg Pro Val Val Lys Ala Leu
405 410 415
tta aat ctc ttt act tac cgc aat cag tca gca gct ttt gat ttg gat 1296
Leu Asn Leu Phe Thr Tyr Arg Asn Gln Ser Ala Ala Phe Asp Leu Asp
420 425 430
ggc cgt att gaa gtg gaa acg cca aat gaa gcg acc att gtc ata gaa 1344
Gly Arg Ile Glu Val Glu Thr Pro Asn Glu Ala Thr Ile Val Ile Glu
435 440 445
cgt caa aat aaa gat ggc agt cat atc gca aca gca gag att aat ctc 1392
Arg Gln Asn Lys Asp Gly Ser His Ile Ala Thr Ala Glu Ile Asn Leu
450 455 460
caa gat atg aca tac aga gta aca gaa aat gat caa aca ata agc tta 1440
Gln Asp Met Thr Tyr Arg Val Thr Glu Asn Asp Gln Thr Ile Ser Leu
465 470 475 480
tcc atg ata agc tgt caa aca 1461
Ser Met Ile Ser Cys Gln Thr
485
<210>24
<211>487
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>24
Met Pro Ile Thr Asn Lys Thr Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu
1 5 10 15
Gly Lys Asn Leu Lys Glu Leu Asn Glu Asn Ile Glu Asn Tyr Phe Gly
20 25 30
Asp Ala Val Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly
35 40 45
Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ile Asp Tyr His Glu Val Asp Ser Ala Phe
50 55 60
Gly Asp Trp Asp Asp Val Lys Arg Leu Gly Glu Lys Tyr Tyr Leu Met
65 70 75 80
Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Gln Ser Lys Tyr Tyr Lys
85 90 95
Asp Tyr Gln Glu Lys His Glu Ala Ser Ala Tyr Lys Asp Leu Phe Leu
100 105 110
Asn Trp Asp Lys Phe Trp Pro Lys Asn Arg Pro Thr Gln Glu Asp Val
115 120 125
Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Arg Ala Pro Lys Gln Glu Ile Gln
130 135 140
Phe Ala Asp Gly Ser Val Glu His Leu Trp Asn Thr Phe Gly Glu Glu
145 150 155 160
Gln Ile Asp Leu Asp Val Thr Lys Glu Val Thr Met Asp Phe Ile Arg
165 170 175
Ser Thr Ile Glu Asn Leu Ala Ala Asn Gly Cys Asp Leu Ile Arg Leu
180 185 190
Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Leu Asp Thr Asn Asp Phe Phe
195 200 205
Val Glu Pro Glu Ile Trp Thr Leu Leu Asp Lys Val Arg Asp Ile Ala
210 215 220
Ala Val Ser Gly Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Thr
225 230 235 240
Ile Gln Phe Lys Ile Ala Asp His Asp Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala
245 250 255
Leu Pro Met Val Thr Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Gly Lys Val Asp Arg
260 265 270
Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr Leu
275 280 285
Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Val Lys Asp Ile Leu Thr
290 295 300
Asp Glu Glu Ile Thr Tyr Thr Ser Asn Glu Leu Tyr Lys Val Gly Ala
305 310 315 320
Asn Val Asn Arg Lys Tyr Ser Thr Ala Glu Tyr Asn Asn Leu Asp Ile
325 330 335
Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asp Asp Asp Gln
340 345 350
Lys Tyr Phe Leu Ala Arg Leu Ile Gln Ala Phe Ala Pro Gly Ile Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Tyr Val Gly Phe Leu Ala Gly Lys Asn Asp Leu Glu Leu
370 375 380
Leu Glu Ser Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser
385 390 395 400
Ser Glu Glu Ile Ala Lys Glu Val Lys Arg Pro Val Val Lys Ala Leu
405 410 415
Leu Asn Leu Phe Thr Tyr Arg Asn Gln Ser Ala Ala Phe Asp Leu Asp
420 425 430
Gly Arg Ile Glu Val Glu Thr Pro Asn Glu Ala Thr Ile Val Ile Glu
435 440 445
Arg Gln Asn Lys Asp Gly Ser His Ile Ala Thr Ala Glu Ile Asn Leu
450 455 460
Gln Asp Met Thr Tyr Arg Val Thr Glu Asn Asp Gln Thr Ile Ser Leu
465 470 475 480
Ser Met Ile Ser Cys Gln Thr
485
<210>25
<211>56
<212>PRT
<213>变异链球菌(Streptococcus mutans)
<400>25
Ala Val Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly Asp
1 5 10 15
Arg Gly Phe Ala Pro Ile Asp Tyr His Glu Val Asp Ser Ala Phe Gly
20 25 30
Asp Trp Asp Asp Val Lys Arg Leu Gly Glu Lys Tyr Tyr Leu Met Phe
35 40 45
Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser
50 55
<210>26
<211>42
<212>PRT
<213>变异链球菌(Streptococcus mutans)
<400>26
Arg Pro Thr Gln Glu Asp Val Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Arg
1 5 10 15
Ala Pro Lys Gln Glu Ile Gln Phe Ala Asp Gly Ser Val Glu His Leu
20 25 30
Trp Asn Thr Phe Gly Glu Glu Gln Ile Asp
35 40
<210>27
<211>38
<212>PRT
<213>变异链球菌(Streptococcus mutans)
<400>27
Ile Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Thr Ile Gln Phe Lys Ile Ala
1 5 10 15
Asp His Asp Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala Leu Pro Met Val Thr Leu
20 25 30
Tyr Ser Leu Tyr Ser Gly
35
Claims (53)
1.耐热化蔗糖磷酸化酶，其通过修饰天然蔗糖磷酸化酶获得，
其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置上具有与天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸残基不同的氨基酸残基：
与基序序列1：AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYIIEVDSAFGDWDDVKRLGEKYYLMFDFMINIIIS中第14位对应的位置、第29位对应的位置和第44位对应的位置；
与基序序列2：RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEIILWNTFGEEQID中第7位对应的位置、第19位对应的位置、第23位对应的位置和第34位对应的位置；以及
与基序序列3：ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG中第19位对应的位置；并且
其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于55℃加热20分钟后，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性为加热之前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
2.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中所述天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少40％一致性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
3.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中所述天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少60％一致性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
4.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中所述天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列由一种核酸分子编码，该核酸分子在严谨条件下与由编码选自下组的氨基酸序列的碱基序列组成的核酸分子杂交：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18和SEQ ID NO：20。
5.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中所述天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
6.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中所述天然蔗糖磷酸化酶来源于选自变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌、缓症链球菌、肠膜明串珠菌、酒类酒球菌、嗜酸乳杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌的细菌。
7.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中所述天然蔗糖磷酸化酶来源于变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌或缓症链球菌。
8.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中所述天然蔗糖磷酸化酶来源于变异链球菌或肠膜明串珠菌。
9.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中对应于基序序列1中第14位的位置上的氨基酸残基是丝氨酸或异亮氨酸。
10.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中对应于基序序列1中第29位的位置上的氨基酸残基是脯氨酸、丙氨酸或赖氨酸。
11.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中对应于基序序列1中第44位的位置上的氨基酸残基是组氨酸、精氨酸或色氨酸。
12.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中对应于基序序列1中第44位的位置上的氨基酸残基是精氨酸。
13.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中对应于基序序列2中第7位的位置上的氨基酸残基是亮氨酸或异亮氨酸。
14.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中对应于基序序列2中第19位的位置上的氨基酸残基是甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或酪氨酸。
15.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中对应于基序序列2中第19位的位置上的氨基酸残基是缬氨酸或酪氨酸。
16.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中对应于基序序列2中第23位的位置上的氨基酸残基是精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸或缬氨酸。
17.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中对应于基序序列2中第23位的位置上的氨基酸残基是组氨酸。
18.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中对应于基序序列2中第34位的位置上的氨基酸残基是丝氨酸或苏氨酸。
19.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中对应于基序序列2中第34位的位置上的氨基酸残基是丝氨酸。
20.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中对应于基序序列3中第19位的位置上的氨基酸残基是甘氨酸、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或丝氨酸。
21.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中对应于基序序列3中第19位的位置上的氨基酸残基是甘氨酸。
22.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mMTris缓冲液(pH7.0)中于57℃加热20分钟后，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性为加热之前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的10％或更多。
23.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mMTris缓冲液(pH7.0)中于57℃加热20分钟后，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性为加热之前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
24.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在含20％蔗糖的20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于65℃加热20分钟后，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性为加热之前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的10％或更多。
25.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在含20％蔗糖的20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于65℃加热20分钟后，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性为加热之前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
26.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其至少在与基序序列1中第14位对应的位置上具有与天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基。
27.权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶，其至少在与基序序列3中第19位对应的位置上具有与天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基。
28.生产耐热化蔗糖磷酸化酶的方法，该方法包括：
修饰含有编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的第一核酸分子，从而获得含修饰碱基序列的第二核酸分子；
制备含第二核酸分子的表达载体；
将该表达载体导入细胞中以表达耐热化蔗糖磷酸化酶；和
回收所表达的耐热化蔗糖磷酸化酶，
其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与第一蔗糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：
与基序序列1：AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSAFGDWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS中第14位对应的位置、第29位对应的位置和第44位对应的位置；
与基序序列2：RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEIILWNTFGEEQID中第7位对应的位置、第19位对应的位置、第23位对应的位置和第34位对应的位置；以及
与基序序列3：ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG中第19位对应的位置；并且，
其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于55℃加热20分钟后，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性为加热之前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
29.权利要求28所述的方法，其中所述第一蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列与选自下列序列的氨基酸序列至少有40％一致性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
30.权利要求28所述的方法，其中所述第一蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列与选自下列序列的氨基酸序列至少有60％一致性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
31.权利要求28所述的方法，其中所述第一蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列可以由一种核酸分子编码，该核酸分子在严谨条件下与由编码选自下组的氨基酸序列的碱基序列组成的核酸分子杂交：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
32.权利要求28所述的方法，其中所述第一蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
33.权利要求28所述的方法，其中所述第一蔗糖磷酸化酶来源于选自变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌、缓症链球菌、肠膜明串珠菌、酒类酒球菌、嗜酸乳杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌的细菌。
34.权利要求28所述的方法，其中所述第一蔗糖磷酸化酶来源于变异链球菌、肺炎链球菌、表兄链球菌或缓症链球菌。
35.权利要求28所述的方法，其中所述天然蔗糖磷酸化酶来源于变异链球菌或肠膜明串珠菌。
36.权利要求28所述的方法，其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于57℃加热20分钟后，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性为加热之前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的10％或更多。
37.权利要求28所述的方法，其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于57℃加热20分钟后，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性为加热之前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
38.权利要求28所述的方法，其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶至少在与基序序列1中第14位对应的位置上具有与第一蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基。
39.权利要求28所述的方法，其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶至少在与基序序列3中第19位对应的位置上具有与第一蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基。
40.核酸分子，包含编码权利要求1所述耐热化蔗糖磷酸化酶的碱基序列。
41.包含权利要求40所述核酸分子的载体。
42.包含权利要求40所述核酸分子的细胞。
43.合成葡萄糖-1-磷酸的方法，该方法包括使含权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶、蔗糖和无机磷酸的反应液反应而生成葡萄糖-1-磷酸。
44.权利要求43所述的方法，其中所述反应在50℃～70℃的温度下进行。
45.合成葡萄糖聚合物的方法，该方法使含下列物质的反应液反应生成葡萄糖聚合物：权利要求1所述的耐热化蔗糖磷酸化酶；以葡萄糖-1-磷酸为底物的第二种磷酸化酶；蔗糖；引发剂；以及无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸。
46.权利要求45所述的方法，其中所述葡萄糖聚合物是α-葡聚糖。
47.权利要求45所述的方法，其中所述第二种磷酸化酶是α-葡聚糖磷酸化酶。
48.权利要求45所述的方法，其中所述第二种磷酸化酶选自纤维二糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶、昆布糊精磷酸化酶、β-1，3-葡聚糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶。
49.权利要求45所述的方法，其中所述反应在50℃～70℃的温度下进行。
50.通过修饰天然蔗糖磷酸化酶得到的耐热化蔗糖磷酸化酶，
其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：
与SEQ ID NO：2氨基酸序列中第47位苏氨酸(T47)对应的位置、第62位丝氨酸(S62)对应的位置、第77位酪氨酸(Y77)对应的位置、第128位缬氨酸(V128)对应的位置、第140位赖氨酸(K140)对应的位置、第144位谷氨酰胺(Q144)对应的位置、第155位天冬酰胺(N155)对应的位置和第249位天冬氨酸(D249)对应的位置；并且，
其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于55℃加热20分钟后，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性为加热之前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
51.生产耐热化蔗糖磷酸化酶的方法，该方法包括下列步骤：
修饰含有编码第一蔗糖磷酸化酶的碱基序列的第一核酸分子，从而获得含修饰碱基序列的第二核酸分子；
制备含第二核酸分子的表达载体；
将该表达载体导入细胞中以表达耐热化蔗糖磷酸化酶；和
回收所表达的耐热化蔗糖磷酸化酶，
其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与第一蔗糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：
与SEQ ID NO：2氨基酸序列中第47位苏氨酸(T47)对应的位置、第62位丝氨酸(S62)对应的位置、第77位酪氨酸(Y77)对应的位置、第128位缬氨酸(V128)对应的位置、第140位赖氨酸(K140)对应的位置、第144位谷氨酰胺(Q144)对应的位置、第155位天冬酰胺(N155)对应的位置和第249位天冬氨酸(D249)对应的位置；并且，
其中所述耐热化蔗糖磷酸化酶在20mM Tris缓冲液(pH7.0)中于55℃加热20分钟后，所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃的酶活性为加热之前所述耐热化蔗糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
52.合成葡萄糖-1-磷酸的方法，该方法包括使含权利要求50所述耐热化蔗糖磷酸化酶、蔗糖和无机磷酸的反应液反应以生成葡萄糖-1-磷酸。
53.合成葡萄糖聚合物的方法，包括使含下列物质的反应液反应以生成葡萄糖聚合物：权利要求50所述耐热化蔗糖磷酸化酶；以葡萄糖-1-磷酸为底物的第二种磷酸化酶；蔗糖；引发剂；以及无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸。
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