CN1894418A - 将β－1,4－葡聚糖转化为α葡聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
从β－1，4－葡聚糖生产α葡聚糖的方法，该方法包括用包含β－1，4－葡聚糖、引物、磷酸源、β－1，4－葡聚糖磷酸化酶和α－1，4－葡聚糖磷酸化酶的反应液进行反应以获得α葡聚糖的步骤。在该方法中，上述β－1，4－葡聚糖可以是纤维二糖，而上述β－1，4－葡聚糖磷酸化酶可以是纤维二糖磷酸化酶。
Description
技术领域
本发明涉及一种从β-1，4-葡聚糖生产α葡聚糖的方法。
背景技术
人在消化时利用诸如淀粉之类的α葡聚糖作为能源。除了在食品工业中用作原料外，α葡聚糖还广泛地用作药物、化妆品、化工、造纸、纤维等的原料，它是一种用处非常广泛的物质。在α葡聚糖中，尤其是直链淀粉，由于其具有很多功能，因此人们希望把它用于各种领域。
近年来，由于污染加剧，已经把食品危机当成一个问题来看待，因此，预计将来将缺乏仅从植物淀粉生产的能源。
另一方面，由于人不能消化诸如纤维二糖之类的β-葡聚糖，因此人不能利用β葡聚糖作为能源，而β葡聚糖仅能用作食物纤维成分。因此，β葡聚糖不能用来解决食物危机问题。然而，一年产生的β葡聚糖的量估计是淀粉量的两万倍，不用担心被耗尽。出于这个原因，人们做了各种尝试，将β葡聚糖转变成一种可以被人用作能源的物质。
例如，已经做了将纤维素降解成葡萄糖的研究，并将此用在乙醇发酵中。葡萄糖能被人代谢，但由于其太甜了，因此在用作能源时不能大量消化。
如果β葡聚糖能转化成更容易被人消化的物质(尤其是淀粉，它也是葡萄糖的聚合物)，则这将极大地有助于解决食品危机问题，但以前没有公开过这种技术。
因此，本发明人尝试用β葡聚糖作为原料来生产α葡聚糖。β葡聚糖不能直接转化成α葡聚糖。在以前的方法中，已知一种在纤维二糖磷酸化酶(CBP)的作用下从G-1-PG-1-P和葡萄糖合成纤维二糖的方法。还已知一种在纤维糊精磷酸化酶(CDP)的作用下从G-1-P和纤维寡糖(聚合度是n)合成聚合度为n+1的纤维寡糖的方法。此外，在α-1，4-葡聚糖磷酸化酶作用下从G-1-P和低分子量α葡聚糖合成高分子量α葡聚糖的方法也是已知的。通常，因为由酶催化的反应在许多情况下是可逆的，所以本发明人认为由CBP催化的反应将朝着纤维二糖降解的方向进行，而由CDP催化的反应将朝着纤维寡糖降解成G-1-P的方向进行，而产生的G-1-P能合成α葡聚糖。因此，本发明人研究建立了从β-1，4-葡聚糖合成α葡聚糖方法。该方法有两步，利用纤维二糖磷酸化酶(CBP)或纤维寡糖磷酸化酶(CDP)将β葡聚糖磷酸化以获得G-1-P(第一步)，然后利用产生的G-1-P作为原料用葡聚糖磷酸化酶(GP)合成α葡聚糖(第二步)。在该方法的β-葡聚糖磷酸化反应中，为了有效地获得G-1-P，加入大量的无机磷酸是必要的。然而，由于大量的无机磷酸能抑制利用G-1-P作为原料合成α葡聚糖的反应，也就是第二步反应，因此，在完成第一步反应后必须除去无机磷酸。然而，该纯化步骤成本高，这是该两步法的缺点。
此外，当有人尝试用G-1-P作为原料来合成α-葡聚糖时，由于产生作为反应副产物的等摩尔磷酸，因此必须在完成反应后除去磷酸副产物。此外，由于产生磷酸副产物导致pH大大下降，通过添加碱等或使用高浓度的缓冲液等来保持反应溶液的pH的步骤是很必要的。出于这些原因，该两步法不能算是简单的生产方法。
因此，期望建立一种低成本、简单而有效的能克服这些缺点的方法。
已经在别的催化反应中建立了通过将各种酶偶联以进行由两个酶促反应步骤组成的催化反应的方法，该方法在单一的反应体系中进行反应。以前已知的这种反应体系的例子是将两种磷酸化酶偶联在一起使用的方法。例如，Kitaoka等人(非专利文献1)公开了在蔗糖磷酸化酶(SP)和CBP的同时作用下将蔗糖有效地转化成纤维二糖的技术。此外，Fujii等人(专利文献1)公开了在SP和GP的共同作用下将蔗糖有效地转化成直链淀粉的技术。
这些技术利用复杂的反应，这些反应中，两种酶共享底物和产生的产物(在Kitaoka等人的实施例中，G-1-P是SP的产物，同时又是CBP的底物，而磷酸是SP的底物，同时又是CBP的产物)。出于这个原因，这个反应机制是非常复杂的，而且和利用单一酶的反应有区别。此外，在本领域有一个公知常识：即使简单组合两种酶时，作为原料的底物也未必转化成目标产物。
在2001年举办的日本应用糖科学年会上，Kitaoka等人口头报告了利用SP和CBP的系统能有效地用在从蔗糖经G-1-P合成纤维二糖的方法中，但是不进行从纤维二糖经G-1-P合成蔗糖的反应。本发明人在该报告的基础上进行了确认试验(参考实施例2)，证实从纤维二糖经G-1-P合成蔗糖的反应不能进行。
也就是说，用CBP合成G-1-P的酶促反应和进一步合成G-1-P的酶促反应不能同时进行。
因此，认为利用纤维二糖作为起始物质进行同时的两步酶促反应是困难的。
此外，除了通过G-1-P所进行的方法，没有别的方法能有效地从β-1，4-葡聚糖合成α-葡聚糖。因此，没有一种低成本、简单有效地能从β-1，4-葡聚糖合成α-葡聚糖的方法。
葡萄糖参与从β-1，4-葡聚糖生产α-葡聚糖的酶促反应。因此，也可以认为通过控制葡萄糖的浓度有效地进行所期望的酶促反应是可能的。
Kitaoka等人(非专利文献2)声称为了在从蔗糖合成纤维二糖的反应系统中使反应朝着纤维二糖合成的方向进行，保持反应体系中低浓度葡萄糖是很重要的。葡萄糖是作为受体的关键原料。因此，通过利用木糖异构酶将SP作用产生的果糖转化成葡萄糖，就使得不用往系统中加入葡萄糖就能使反应进行，从而增加纤维二糖的产量。Kitaoka等人解释这是因为高浓度葡萄糖的积累显著降低了CBP催化的合成纤维二糖的反应，因为葡萄糖是CBP合成G-1-P的拮抗性抑制剂。因此，以前认为，在使用纤维二糖作为底物的酶促反应中，为了使反应朝纤维二糖合成的方向进行，降低反应溶液中葡萄糖的浓度是重要的，相反，为了使反应朝着纤维二糖降解的方向进行，就要增加反应溶液中葡萄糖的浓度。
本发明包括利用CBP降解纤维二糖的反应，后者是前者的底物。根据前面提到的发现，本领域的技术人员认为，通过抑制纤维二糖的合成反应，高浓度的葡萄糖是纤维二糖降解的有利条件。
另一方面，由于在将纤维二糖转化成直链淀粉的两酶反应中，CBP反应的平衡由G-1-P/磷酸比例和葡萄糖/CBP比例控制，甚至当只有葡萄糖浓度降低的时候也是如此，还不明确整个反应是否对纤维二糖转化成直链淀粉有利。事实上，在从纤维二糖合成蔗糖的系统中，即使降低葡萄糖的浓度也不会增加反应的产量(参考实施例2)。这意味着，在组合两种磷酸化酶的复杂反应系统中，即使清除了副产物也不会增加反应的产量。
专利文献1：国际公开号No.02/097107
小册子
非专利文献1：Kitaoka et al，Denpun Kagaku，1992，vol.39，No.4，1992，pp.281-283
非专利文献2：Kitaoka et al.，Trends in Glycoscience and Glycotechnology，vol.14，No.75，2002，pp.35-50
发明内容
本发明要解决的问题
本发明要解决上面提及到的问题。本发明的一个目的是提供一种不通过复杂的生产步骤而有效地将不是食品的β-1，4-葡聚糖转化成α-葡聚糖的方法。
解决这些问题的手段
作为勤奋研究以解决上述问题的结果，本发明人发现，通过将在β-1，4-葡聚糖磷酸化酶存在下使β-葡聚糖磷酸化而合成葡萄糖-1-磷酸的反应和在α-葡聚糖磷酸化酶的存在下使葡萄糖-1-磷酸和引物反应而合成α-葡聚糖的反应偶联，从β-1，4-葡聚糖有效合成了α-葡聚糖。基于这些发现，本发明人完成了本发明。
此外，本发明人意外发现，和以前的发现相反的是，在该反应系统中，通过降低β-葡聚糖在β-1，4-葡聚糖磷酸化酶存在下被磷酸化时产生的葡萄糖浓度，可以更有效地获得α-葡聚糖。
本发明的方法是从β-1，4-葡聚糖生产α-葡聚糖的方法，包括使含有β-1，4-葡聚糖、引物、磷酸源、β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的溶液反应，以生产α-葡聚糖。
在一个实施方案中，所述的β-1，4-葡聚糖可以是纤维二糖，所述的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以是纤维二糖磷酸化酶。
在一个实施方案中，所述的β-1，4-葡聚糖可以是聚合度为3或更高的纤维寡糖，所述的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以是纤维糊精磷酸化酶。
在一个实施方案中，所述的β-1，4-葡聚糖可以是聚合度为3或更高的纤维寡糖，所述的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以是纤维二糖磷酸化酶和纤维糊精磷酸化酶。
在一个实施方案中，所述生产步骤还包括在生产所述α-葡聚糖的同时，从溶液中除去作为副产物产生的葡萄糖。
在一个实施方案中，所述溶液还包含葡萄糖异构酶或葡萄糖氧化酶。
在一个实施方案中，所述溶液还包含葡萄糖氧化酶和变旋酶。
在一个实施方案中，所述溶液还包含过氧化氢酶或过氧化物酶。
在一个实施方案中，所述的磷酸源可以是无机磷酸、葡萄糖-1-磷酸，或无机磷酸和葡萄糖-1-磷酸的混合物。
在一个实施方案中，所述的磷酸源的浓度可以是1mM-50mM。
在一个实施方案中，本发明的方法是根据权利要求1的方法，其中所述的α-葡聚糖可以是直链淀粉。
发明效果
根据本发明的方法，不能消化的纤维素能被有效地转化成可以消化的食品。
附图说明
[图1]图1所示为本发明生产方法中所发生反应的示意图。
[图2]图2所示为纤维二糖用作β-1，4-葡聚糖、纤维二糖磷酸化酶用作β-1，4-葡聚糖磷酸化酶时，本发明生产方法中所发生反应的示意图。
[图3]图3所示为纤维二糖磷酸化酶的浓度变化时直链淀粉产量的变化。
[图4]图4所示为磷酸的浓度变化时直链淀粉产量的变化。
[图5]图5所示为纤维二糖浓度增加、而纤维二糖、引物和磷酸的浓度的比例保持恒定时直链淀粉产量的变化。
[图6]图6所示为在本发明的生产方法中加入葡萄糖异构酶(GI)或葡萄糖氧化酶(GOx)+变旋酶(MT)+过氧化物酶(POx)时直链淀粉产量的变化。
序列表自定义文本
SEQ ID No：1是合成的DNA引物1的碱基序列；
SEQ ID No：2是合成的DNA引物2的碱基序列。
具体实施方式
下面将详细介绍本发明。
应该可以理解，在整个本说明书中，如果没有特别提到，单数的表达方式也包括它的复数形式。此外，也应该可以理解，如果没有特别提到，本说明书中使用的术语采用的是本领域正常使用的含义。
本文所用术语“α-葡聚糖”指包含D-葡萄糖作为组成单元并且具有以α-1，4-糖苷键连接的至少2个或多个糖单元的糖。α-葡聚糖可以是线性的、分支的或环形的分子。线性的α-葡聚糖和α-1，4-葡聚糖是同义词。在线性的α-葡聚糖中，糖单元仅靠α-1，4-糖苷键相连。含有1个或多个α-1，6-糖苷键的α葡聚糖的是分支α-葡聚糖。α-葡聚糖优选含有一定程度的线性部分。没有分支的线性α-葡聚糖是更优选的。本发明生产的α-葡聚糖优选是直链淀粉、具有环形结构的葡聚糖或具有分支结构的葡聚糖，更优选的是直链淀粉。α-葡聚糖分子中包含的糖单元数目指的是该α-葡聚糖的聚合度。
在一些情况下，优选的是α-葡聚糖含有少量(即α-1，6-糖苷键数目)的分支。在这种情况下，分支的数目典型的是0-10000，优选的是0-1000，更优选的是0-500，进一步优选的是0-100，进一步优选的是0-50，进一步优选的是0-25，进一步优选的是0。
本发明方法生产的分支α-葡聚糖中，假设α-1，6-糖苷键数目是1，则α-1，4-糖苷键数目相对于α-1，6-糖苷键数目的比例优选是1-10000，更优选10-5000，进一步优选50-1000，进一步优选100-500。
α-1，6-糖苷键可以随机分布在α-葡聚糖中，或均匀分布。优选的是分布程度使α-葡聚糖中形成5个或多个糖单元的线性部分。
α-葡聚糖可以只由D-葡萄糖构成，或者是修饰程度不破坏α-葡聚糖性质的衍生物。优选的是α葡聚糖不经过修饰。修饰程度不破坏α-葡聚糖性质包括但不限于酯化、醚化、交联等。这些修饰可以根据本领域已知的方法进行。
α-葡聚糖的分子量典型的是约1×103或更高，优选的是约5×103或更高，更优选的是约1×104或更高，进一步优选的是约5×104或更高，进一步优选的是约1×105或更高。α-葡聚糖分子量典型的是约1×106或更低，优选的是约5×105或更低，进一步优选的是约1×105或更低。
本领域的技术人员能轻易地理解，具有所期望分子量的α-葡聚糖可以通过适当选择本发明生产方法中使用的底物(例如引物、β-1，4-葡聚糖等)量、酶量和反应时间等获得。
<α-葡聚糖生产中使用的材料>
在本发明的生产方法中，例如使用含有β-1，4-葡聚糖、引物、磷酸源、β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的溶液。例如在制备这种溶液时，使用β-1，4-葡聚糖、引物、无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸、β-1，4-葡聚糖磷酸化酶、α-1，4-葡聚糖磷酸化酶、缓冲液以及溶解这些成分的溶剂作为主要材料。这些物质通常是在反应开始时全部加入，但它们中的任何物质都可以在反应过程中额外地加入。
本文所用术语“磷酸源”指的是能给CBP的催化反应提供磷酸的分子。磷酸源的实例包含但不限于无机磷酸(无机磷酸盐如NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4和K2HPO4)和有机磷酸盐(如葡萄糖-1-磷酸)。
在本发明的生产方法中，溶液还可以包含葡萄糖异构酶或葡萄糖氧化酶。当使用葡萄糖氧化酶时，则还可以包含变旋酶。进一步说，当使用葡萄糖氧化酶时，本发明的溶液还可以包含过氧化氢酶或过氧化物酶。
在本发明的生产方法中，根据需要，可以使用选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶和糖原脱支酶的酶。选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转位酶和糖原脱支酶中的酶可以在本发明生产方法开始时加入溶液中，也可以在方法进行中加入，取决于目的α-葡聚糖的结构。
(1.β-1，4-葡聚糖)
本文所用术语“β-1，4-葡聚糖”指包含D-葡萄糖作为组成单位并且至少具有通过β-1，4-糖苷键相连的2个或多个糖单元的酶。β-1，4-葡聚糖可以是线性分子。线性的β-葡聚糖、β-1，4-葡聚糖和纤维素是同义词。在线性的β-葡聚糖中，糖单元仅靠β-1，4-糖苷键相连。一个β-1，4-葡聚糖分子中包含的糖单元数目指的是这种β-1，4-葡聚糖的聚合度。β-1，4-葡聚糖的聚合度优选的是约2-10，更优选的是约2-8，更优选的是约2-5。聚合度是约2-约10的β-1，4-葡聚糖也称作纤维寡糖。具体而言，聚合度是2的β-1，4-葡聚糖称作纤维二糖。聚合度是3的β-1，4-葡聚糖称作纤维三糖。聚合度是4的β-1，4-葡聚糖称作纤维四糖。因为当β-1，4-葡聚糖的聚合度降低时，它的溶解性增加并且且更容易处理，因此更优选具有较低聚合度的β-1，4-葡聚糖。β-1，4-葡聚糖存在于所有植物中。β-1，4-葡聚糖可以在从植物中分离之后不进行修饰的，也可以是对分离自植物的β-1，4-葡聚糖进行化学处理或酶处理而获得的。作为替代方案，β-1，4-葡聚糖可以是从废纸如用过的纸、建筑材料和用过的布再生的纤维素，或是从中制备的β-1，4-葡聚糖。例如，通过使纤维素酶作用于从植物中分离的高分子量纤维素，可以获得具有较低分子量的纤维寡糖。从植物生产大量纤维寡糖的方法在本领域公知。这种文献的例子包括日本专利特开平No.2001-95594。β-1，4-葡聚糖可以在生产的任何阶段提供，从含有β-1，4-葡聚糖的粗制植物溶液到纯化的β-1，4-葡聚糖。本发明生产方法中使用的β-1，4-葡聚糖优选是纯的。然而，β-1，4-葡聚糖可以含有任何别的污染物，只要本发明中使用的任何一种酶的作用不受到抑制即可。
溶液中包含的β-1，4-葡聚糖的浓度典型的是约0.1％-约40％，优选的是约0.5％-约30％，更优选的是约1％-约20％，尤其优选的是约2％-约15％，最优选的是约3％-约12％。应该注意到，在本说明书中，β-1，4-葡聚糖的浓度是以重量/体积计算的，即(β-1，4-葡聚糖重量)×100/(溶液的体积)。在一些情况下，当β-1，4-葡聚糖的重量太大时，未反应的β-1，4-葡聚糖在溶液中沉淀下来。在另一些情况下，当要使用的β-1，4-葡聚糖的量太少时，即便反应本身在高温下进行，但产量却下降。
在本发明中，将溶液中β-1，4-葡聚糖的摩尔浓度除以无机磷酸摩尔浓度和葡萄糖-1-磷酸摩尔浓度的总和，得到的比例可以称作β-1，4-葡聚糖∶磷酸比例。换句话说，该比例表示如下：
(公式1)
β-1，4-葡聚糖∶磷酸比例
＝(β-1，4-葡聚糖的摩尔浓度)/(无机磷酸摩尔浓度和葡萄糖-1-磷酸摩尔浓度的总和)。
如果将所有的反应物质放入溶液中来开始反应，而且在反应过程中不添加别的物质，β-1，4-葡聚糖：磷酸比例在反应起始时是最高的。β-1，4-葡聚糖∶磷酸比例在反应起始时可以是任何比例，但优选的是约0.01或更大，更优选的是约0.03或更大，进一步优选的是约0.06或更大，尤其优选的是约0.1或更大，最优选的是约0.1-约0.6。
(2.引物)
在本发明中使用的引物指的是充当添加糖苷残基合成α-葡聚糖的起始物质的分子。应该注意到，在本说明书中，糖苷残基和葡萄糖残基可以交互使用。也可以把引物说成是作为G-1-P的糖苷残基受体的分子。如果引物具有可以通过α-1，4-糖苷键和糖单元连接的一个或多个自由基团，则引物的其它部分可以形成不具有糖的基团。在本发明的方法中，通过α-1，4-键将一个糖苷残基转移到反应起始时所含的引物上，就形成了聚合度比引物大1的α-葡聚糖。形成的α-葡聚糖可以在同一溶液中再次充当受体。这样，在本发明的方法中，糖苷残基能连续地通过α-1，4-糖苷键连接到引物上，从而合成具任何聚合度的α葡聚糖。引物包括能在-葡聚糖磷酸化酶的作用下添加糖单元的任何糖类。
能充当本发明反应起始物质的引物是充足的。例如，也可以利用通过本发明方法合成的α-葡聚糖作为引物，再次根据本发明方法延伸α-1，4-糖苷链。
引物可以是仅含α-1，4-糖苷键的α-1，4-葡聚糖，或可以部分含有α-1，6-糖苷键。本领域的技术人员能根据所期望的葡聚糖容易地选择合适的引物。在合成线性直链淀粉时，因为线性的直链淀粉不用脱支酶就能合成，所以优选使用只含α-1，4-糖苷键的α-1，4-葡聚糖作为引物。
引物的具体实施例包含麦芽寡糖、直链淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、普鲁兰多糖、偶合糖、淀粉及其衍生物。
本发明使用的麦芽寡糖指的是通过约2-约10个葡萄糖脱水缩合而成并通过α-1，4-键连接的物质。麦芽寡糖优选含有约3-约10个糖单元，更优选含有约4-约10个糖单元，进一步优选含有约5-约10个糖单元。麦芽寡糖的具体实施例包括诸如麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、麦芽八糖、麦芽九糖和麦芽十糖之类的麦芽寡糖。在一个实施方案中，麦芽寡糖优选是麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖或麦芽七糖，更优选的是麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖或麦芽七糖，进一步优选的是麦芽四糖。麦芽寡糖可以是单一成分的物质，也可以是各种麦芽寡糖的混合物。由于混合的麦芽寡糖廉价，所以优选。在一个实施方案中，除了聚合度高于麦芽四糖的麦芽寡糖外，麦芽寡糖的混合物还含有麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖中的至少一种。本文中“聚合度高于麦芽四糖的麦芽寡糖”指聚合度为4或更高的麦芽寡糖。麦芽寡糖可以是线性或分支的麦芽寡糖。麦芽寡糖在其分子中可以具有环形的部分。在本发明中，优选线性的麦芽寡糖。
直链淀粉是一种由通过α-1，4-糖苷键连接的葡萄糖单元构成的线性分子。天然淀粉中含有直链淀粉。
支链淀粉是一种分支的分子，其中葡萄糖单元通过α-1，6-糖苷键连接到已经通过α-1，4-糖苷键连接的葡萄糖单元上。天然淀粉中含有支链淀粉。例如，可以使用由100％支链淀粉组成的蜡玉米淀粉作为支链淀粉。例如，可以使用聚合度大约是1×105或更高的支链淀粉作为原料。
糖原是一种由葡萄糖组成的葡聚糖，而且是具有高频率分支的葡聚糖。糖原作为一种贮藏多糖，以颗粒形式广泛地分布在动物和植物的几乎所有细胞中。在植物中，糖原例如存在于玉米等植物的种子中。典型地说，在糖原中，由通过α-1，4-糖苷键相连、平均聚合度为12-18的葡萄糖组成的糖链通过α-1，6-糖苷键、以大致每3个单位的葡萄糖一条链的比例连接由α-1，4-键连接的葡萄糖组成的糖链。此外，类似地，由α-1，4-糖苷键连接的葡萄糖组成的糖链通过α-1，6-键连接α-1，4-键连接的分支。因此，糖原形成网状结构。
糖原的分子量典型的是约1×105-1×108，优选的是约1×106-1×107。
普鲁兰多糖是分子量约为1×105-3×105(例如，大约2×105)的葡聚糖，其中麦芽三糖通过α-1，6-糖苷键有规律地逐步连接。例如，可以利用淀粉作为原料，通过培养黑酵母出芽短梗霉菌来生产普鲁兰多糖。例如，普鲁兰多糖可从Hayashibara Shoji公司获得。
偶联糖是一种含有蔗糖、葡糖基蔗糖和麦芽糖基蔗糖作为主要成分的混合物。例如，偶联糖是使环糊精葡萄糖转移酶作用于蔗糖和淀粉的混合溶液而产生的，其中环糊精葡萄糖转移酶是由巨大芽胞杆菌等细菌产生的。例如，偶联糖可以从Hayashibara Shoji公司获得。
淀粉是直链淀粉和支链淀粉的混合物。只要能通过商业途径获得，任何淀粉都可以用。淀粉中直链淀粉和支链淀粉的比例是不同的，这主要取决于产生淀粉的植物的种类。糯米，糯玉米等含有的几乎所有的淀粉都是支链淀粉。另一方面，只由直链淀粉组成而不含支链淀粉的淀粉不能从常见植物获得。
淀粉可以分为天然淀粉、降解淀粉和改性淀粉。
天然淀粉根据原料不同分为块茎淀粉和谷类淀粉。块茎淀粉的具体实施例包括马铃薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉、葛根淀粉、蕨类淀粉等。谷类淀粉的具体实施例包括玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉等。天然淀粉的实例都是直链淀粉含量高的淀粉(例如高直链淀粉的玉米淀粉)，其中直链淀粉的含量增加到50-70％，这是培育产淀粉植物的结果。其他天然淀粉例子包括不含直链淀粉的腊质淀粉，这是培育产淀粉植物的结果。
可溶性淀粉指的是通过对天然淀粉进行各种处理而获得的水溶性淀粉。
改性淀粉是对天然淀粉进行诸如水解、酯化或凝胶化之类的处理而赋予其更可利用特性的淀粉。可以获得具有不同的胶凝化初始温度、糊粘度、糊透明度以及老化稳定性组合的各种改性淀粉。有许多种改性淀粉。这种淀粉的一个实例是下述淀粉，其中通过将淀粉颗粒浸入温度不高于淀粉胶凝化温度的酸中，淀粉分子被切割，但淀粉颗粒未被破坏。
降解淀粉是一种通过下列方法获得的寡糖或多聚糖：将淀粉进行诸如酶处理或水解的处理，产生比处理前具有更小分子量的淀粉。降解淀粉的例子包括用脱支酶降解的淀粉、用磷酸化酶降解的淀粉和部分水解的淀粉。
用脱支酶降解的淀粉可以通过使脱支酶作用于淀粉而获得。通过随意改变脱支酶的作用时间，获得分支部分(即α-1，6-糖苷键)被切割成任意程度的用脱支酶降解的淀粉。用脱支酶降解的淀粉的例子包括在4-10000个糖单元中有1-20个α-1，6-糖苷键的降解产物、在3-500个糖单元中没有α-1，6-糖苷键的降解产物、麦芽寡糖和直链淀粉。对于用脱支酶降解的淀粉来说，所得降解产物分子量的分布是不同的，取决于待降解的淀粉的种类。用脱支酶降解的淀粉可以是不同长度糖链的混合物。
用磷酸化酶降解的淀粉可以通过使葡聚糖磷酸化酶(也称作磷酸化酶)作用于淀粉而获得。葡聚糖磷酸化酶将淀粉非还原末端的葡萄糖残基糖单元逐个转移到另一个底物上。由于葡聚糖磷酸化酶不能切割α-1，6-糖苷键，因此，当葡聚糖磷酸化酶作用于淀粉足够长的时间时，获得切割终止于α-1，6-糖苷键的降解产物。在本发明中，磷酸化酶降解的淀粉含有的糖单元数目优选为约10-约100,000，更优选为约50-约50,000，进一步更优选为约100-约10,000。用磷酸化酶降解的淀粉可以具有所得降解产物的不同分子量分布，取决于待降解的淀粉种类。用磷酸化酶降解的淀粉可以是具有不同长度糖链的混合物。
糊精和部分水解的淀粉指的是通过在酸、烷基、酶等的作用下部分降解淀粉而获得的降解产物。在本发明中，糊精和部分水解的淀粉中糖单元的数目优选为约10-约100,000，更优选为约50-约50,000，进一步更优选为约100-10,000。对于糊精和部分水解的淀粉来说，所得降解产物分子量的分布是不同的，取决于待降解的淀粉的种类。糊精和部分水解的淀粉可以是不同长度糖链的混合物。
优选的是，淀粉选自可溶性淀粉、蜡质淀粉、高直链淀粉含量的淀粉、用脱支酶降解的淀粉、用磷酸化酶降解的淀粉、部分水解的淀粉、改性淀粉，及其衍生物。
在本发明的方法中，上述不同糖的衍生物可以用作引物。例如，能够使用上述糖的至少一个醇羟基被羟烷基化、烷基化、乙酰化、羧甲基化、硫酸化或磷酸化的衍生物。进一步说，可以使用两种或多种这些衍生物的混合物作为原料。
(3.无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸)
在本说明书中，诸如无机磷酸的磷酸源指的是在和CBP反应中能提供磷酸底物的物质。在本文中，磷酸底物指的是葡萄糖-1-磷酸的磷酸基团的原料。在β-1，4-葡聚糖磷酸化酶催化的β-1，4-葡聚糖磷酸解过程中，认为无机磷酸以磷酸盐离子的形式充当底物。因为该底物在本领域中传统上是指无机磷酸，因此在本说明书中，该底物也指无机磷酸。无机磷酸包括磷酸和磷酸的无机盐。通常，无机磷酸在含有阳离子如碱金属离子的水中使用。在这种情况下，因为磷酸、磷酸盐和磷酸根离子达到一种平衡状态，难以区分磷酸和磷酸盐。因此，按照常规，磷酸和磷酸盐统指无机磷酸。在本发明中，无机磷酸优选指磷酸的任何金属盐，更优选的是磷酸的碱金属盐。优选的无机磷酸具体例子包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸三钾、磷酸(H3PO4)、磷酸二氢胺、磷酸氢二铵等。
反应起始时，CBP-GP反应体系中可以包含仅一种或多种无机磷酸。
例如，可以通过下列方法提供磷酸：通过物理、化学或酶促反应降解诸如多聚磷酸(如焦磷酸、三磷酸和四磷酸)及其盐的磷酸缩合物，并将其加入反应溶液中。
在本说明书中，葡萄糖-1-磷酸指的是葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)及其盐类。从狭义上说，葡萄糖-1-磷酸优选是葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)的任何金属盐，更优选是葡萄糖-1-磷酸的碱金属盐(C6H13O9P)。葡萄糖-1-磷酸的优选的具体例子包括葡萄糖-1-磷酸二钠盐，葡萄糖-1-磷酸二钾盐，葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)等。在本说明书中，未在括号内标出化学式的葡萄糖-1-磷酸指的是广义的葡萄糖-1-磷酸，即狭义的葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)及其盐类。
反应起始时，CBP-GP反应体系可以包含仅一种或多种葡萄糖-1-磷酸。
在本发明的方法中，反应起始时，反应溶液中磷酸和葡萄糖-1-磷酸的比例可以是任何比例。
反应溶液中包含的无机磷酸摩尔浓度和葡萄糖-1-磷酸摩尔浓度的总和典型的是约0.1mM-约1000mM，优选约1mM-约500mM，更优选约1mM-约50mM，进一步更优选约5mM-约30mM。当无机磷酸和葡萄糖-1-磷酸的量太大时，反应本身就会发生，但是在某些情况下，α-葡聚糖的产量反而会下降。当无机磷酸和葡萄糖-1-磷酸的量太小时，在某些情况下，得花费很长的时间才能合成α-葡聚糖。
在本发明方法中，可以用本领域已知的方法对溶液中无机磷酸的含量进行定量。可以用本领域已知的方法对溶液中葡萄糖-1-磷酸的含量进行定量。当不参与反应的含磷物质没被使用时，在这种情况下，无机磷酸和葡萄糖-1-磷酸的总量可以用原子吸收法测定。
可以通过以下方法获得无机磷酸，例如磷酸盐离子形式。向含无机磷酸的溶液(200μl)中混入800μl钼试剂(15mM钼酸铵，100mM醋酸锌)，随后再加200μl568mM抗坏血酸(pH5.0)并搅动，以获得反应体系。将该反应体系在30℃保持20分钟后，用分光光度计测850nm处的吸光值。用已知浓度的无机磷酸以相同的方法测定吸光值以生成标准曲线。将样品的吸光值拟合到该标准曲线上以求得样品中无机磷酸的浓度。在该定量方法中，定量无机磷酸的量，而不定量葡萄糖-1-磷酸的量。
例如通过下面的方法可以定量葡萄糖-1-磷酸。向300μl测定试剂(200mMTris-HCl，(pH7.0)，3mM NADP，15mM MgCl2，3mM EDTA，15μM 1，6-二磷酸葡萄糖，6μg/ml葡萄糖磷酸变位酶，6μg/ml 6-磷酸葡萄糖脱氢酶)中加入600μl含适当稀释的葡萄糖-1-磷酸的溶液并搅动，以获得反应体系。将该反应体系在30℃保持30分钟后，用分光光度计测340nm处的吸光值。用已知浓度的葡萄糖-1-磷酸钠以同样的方法测定吸光值以生成标准曲线。将样品的吸光值拟合到标准曲线方程上以求得样品中葡萄糖-1-磷酸的浓度。通常，把一分钟产生1μmol的葡萄糖-1-磷酸的酶活性定义为一个单位。在该定量分析方法中，只定量葡萄糖-1-磷酸的量，而不定量无机磷酸的量。
(4.β-1，4-葡聚糖磷酸化酶)
本文所用的“β-1，4-葡聚糖磷酸化酶”指的是能进行磷酸解的任何酶，它们将β-1，4-葡聚糖的非还原末端的葡萄糖残基转移到磷酸基团上。β-1，4-葡聚糖磷酸化酶也能催化合成β-1，4-葡聚糖的反应，这是磷酸解的逆反应。反应按哪个方向进行取决于底物量，但这个反应更易倾向于进行合成β-1，4-葡聚糖的反应。β-1，4-葡聚糖磷酸化酶催化的反应用下面的反应式表示：
(化学反应式1)
应该注意到，在这个反应式中，如果β-1，4-葡聚糖的聚合度在开始时为2，则生成的就是葡萄糖，而不是β-1，4-葡聚糖。
β-1，4-葡聚糖磷酸化酶优选是纤维二糖磷酸化酶(EC：2.4.1.20)或纤维糊精磷酸化酶(EC：2.4.1.49)。
纤维二糖磷酸化酶指的是能进行磷酸解的酶，它们将纤维二糖的非还原末端的葡萄糖残基转移到磷酸基团上。纤维二糖磷酸化酶催化的反应用下面的反应式表示：
(化学反应式2)
纤维糊精磷酸化酶指的是能进行磷酸解的酶，它们将聚合度为3或更高的纤维寡糖的非还原末端的葡萄糖残基转移到磷酸基团上。纤维寡糖也称作纤维糊精。纤维糊精磷酸化酶催化的反应用下面的反应式表示：
(化学反应式3)
在本发明的方法中，当β-1，4-葡聚糖是纤维二糖时，优选使用纤维二糖磷酸化酶作为β-1，4-葡聚糖磷酸化酶。在本发明方法中，当β-1，4-葡聚糖是纤维寡糖时，优选使用纤维糊精磷酸化酶作为β-1，4-葡聚糖磷酸化酶。此外，在本发明的方法中，当β-1，4-葡聚糖是纤维寡糖时，优选使用纤维二糖磷酸化酶和纤维糊精磷酸化酶作为β-1，4-葡聚糖磷酸化酶。在这种情况下，由于在纤维二糖磷酸化酶作用下，降解磷酸寡糖产生的葡萄糖-1-磷酸用于合成α-葡聚糖，并最终产生能被纤维二糖磷酸化酶降解的纤维二糖，因此从纤维寡糖合成α-葡聚糖的速率变得更高。
在自然界，许多生物中都含有β-1，4-葡聚糖磷酸化酶。能产生β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的生物的例子包括梭状芽孢杆菌属的微生物(如热纤维梭菌和粪堆梭菌)、纤维弧菌属的微生物(如淡黄纤维弧菌)、栖热袍菌属的微生物(如那不勒斯栖热袍菌和海栖热袍菌)、瘤胃球菌属的微生物(如生黄瘤胃球菌)、层孔菌属的微生物(如Fomesannos)、纤维单胞菌属和欧文氏菌属的微生物。产生β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的生物优选选自热纤维梭菌、粪堆梭菌、淡黄纤维弧菌、那不勒斯栖热袍菌、海栖热袍菌、生黄瘤胃球菌、Fomes annos、纤维单胞菌属和欧文氏菌属的微生物。β-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以来源于植物。
在自然界，许多生物中都含有纤维二糖磷酸化酶。能产生纤维糊二糖磷酸化酶的生物的例子包括梭状芽孢杆菌属的微生物(如热纤维梭菌和粪堆梭菌)、纤维弧菌属的微生物(如淡黄纤维弧菌)、栖热袍菌属的微生物(如那不勒斯栖热袍菌和海栖热袍菌)、瘤胃球菌属的微生物(如生黄瘤胃球菌)、层孔菌属的微生物(如Fomesannos)、纤维单胞菌属和欧文氏菌属的微生物。产生纤维二糖磷酸化酶的生物优选选自热纤维梭菌和粪堆梭菌、淡黄纤维弧菌、那不勒斯栖热袍菌和海栖热袍菌、生黄瘤胃球菌、Fomes annos、纤维单胞菌属和欧文氏菌属的微生物。更优选选自热纤维梭菌或者淡黄纤维弧菌，最优选选自热纤维梭菌。纤维二糖磷酸化酶可以来源于植物。
在自然界，许多生物中都含有纤维糊精磷酸化酶。能产生纤维糊精磷酸化酶的生物的例子包括梭状芽孢杆菌属的微生物(如热纤维梭菌和粪堆梭菌)、纤维弧菌属的微生物(如淡黄纤维弧菌)、栖热袍菌属的微生物(如那不勒斯栖热袍菌和海栖热袍菌)、瘤胃球菌属的微生物(如生黄瘤胃球菌)、层孔菌属的微生物(如Fomesannos)、纤维单胞菌属和欧文氏菌属的微生物。产生纤维糊精磷酸化酶的生物优选选自热纤维梭菌和粪堆梭菌、淡黄纤维弧菌、那不勒斯栖热袍菌和海栖热袍菌，生黄瘤胃球菌、Fomes annos、纤维单胞菌属和欧文氏菌属的微生物。更优选选自热纤维梭菌或者纤维单胞菌属的微生物，最优选选自热纤维梭菌。纤维糊精磷酸化酶可以来源于植物。
β-1，4-葡聚糖磷酸化酶(优选的是纤维二糖磷酸化酶或纤维糊精磷酸化酶，更优选的是纤维二糖磷酸化酶)可以来源于产生β-1，4-葡聚糖磷酸化酶(优选的是纤维二糖磷酸化酶或纤维糊精磷酸化酶，更优选的是纤维二糖磷酸化酶)的任何生物。优选具有一定程度热稳定性的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶，更优选具有高度热稳定性的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶。例如，把β-1，4-葡聚糖磷酸化酶在含1.4mM巯基乙醇的50mM磷酸缓冲液(pH7.5)中于55℃加热20分钟时，保留加热前β-1，4-葡聚糖磷酸化酶活性的优选50％或更多，更优选为60％或更多，进一步优选为70％或更多，尤其优选为80％或更多，最优选的是85％或更多。β-1，4-葡聚糖磷酸化酶优选来源于选自热纤维梭菌、粪堆梭菌、淡黄纤维弧菌、那不勒斯栖热袍菌、海栖热袍菌，生黄瘤胃球菌、Fomes annos、纤维单胞菌属和欧文氏菌属的细菌。
当β-1，4-葡聚糖磷酸化酶是纤维二糖磷酸化酶时，纤维二糖磷酸化酶优选来源于选自热纤维梭菌、粪堆梭菌、淡黄纤维弧菌、那不勒斯栖热袍菌、海栖热袍菌、生黄瘤胃球菌、Fomes annos、纤维单胞菌属和欧文氏菌属的细菌，更优选来源于热纤维梭菌或淡黄纤维弧菌，最优选来源于热纤维梭菌。
当β-1，4-葡聚糖磷酸化酶是纤维二糖磷酸化酶时，纤维二糖磷酸化酶优选来源于选自热纤维梭菌、粪堆梭菌、淡黄纤维弧菌、那不勒斯栖热袍菌、海栖热袍菌、生黄瘤胃球菌、Fomes annos、纤维单胞菌属和欧文氏菌属的细菌，更优选来源于热纤维梭菌或纤维单胞菌属，最优选来源于热纤维梭菌。
在本说明书中，酶“来源”于微生物不仅指这种酶直接分离自微生物，而且还指通过利用微生物而获得的任何形式的酶。例如，当将从生物获得的编码酶的基因导入大肠杆菌并将酶从大肠杆菌中分离时，该酶就“来源”于该生物。
本发明中使用的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶能直接从自然界中产生β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的生物分离，如从前述的生物中分离。本发明使用的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以从已经用编码分离自上述生物的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的基因进行遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)分离。
例如，本发明方法中使用的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以根据如下方式制备。首先，培养产生β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌等)。该微生物可以是直接产生β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的微生物。作为替代方案，也可以克隆编码β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的基因，用该基因对利于表达β-1，4-葡聚糖磷酸化酶基因的微生物(如细菌、真菌等)进行遗传修饰以获得重组的微生物，β-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以从所得的微生物获得。
考虑诸如表达β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的难易、培养难易、繁殖速度以及安全性等多种条件，可以容易地选择用β-1，4-葡聚糖磷酸化酶基因进行遗传修饰的微生物。因为β-1，4-葡聚糖磷酸化酶优选不含有直链淀粉杂质，因此，优选的是使用不产生直链淀粉或仅低水平表达直链淀粉的微生物(如细菌、真菌等)进行遗传修饰。为遗传修饰β-1，4-葡聚糖磷酸化酶，优选使用嗜常温微生物，如大肠杆菌或枯草芽胞杆菌。使用不产生直链淀粉或仅低水平表达直链淀粉而基本不含直链淀粉的微生物(如细菌、真菌等)所产生的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶是本发明方法所优选使用的。
可以根据本领域技术人员公知的方法用克隆的基因对微生物(如细菌，真菌等)进行遗传修饰。使用克隆的基因时，优选的是把该基因可操作连接到组成型或诱导型启动子上。“可操作连接”指的是启动子和基因的连接使得基因的表达能受启动子的调控。当使用诱导型启动子时，优选在诱导条件下进行培养。本领域的技术人员熟悉多种诱导型启动子。
关于克隆的基因，可以在该基因上连接编码信号肽的碱基序列，从而使得产生的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶能分泌到细菌外部。编码信号肽的碱基序列是本领域技术人员公知的。
本领域的技术人员可以合适地设定培养微生物(如细菌、真菌等)的条件以生产β-1，4-葡聚糖磷酸化酶。培养微生物的合适培养基、诱导每个诱导启动子的合适条件等都是本领域技术人员所熟知的。
例如，在合适的培养条件下培养转化的细胞后，当表达的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶在转化细胞中积累时，通过离心或过滤培养基收集细胞，然后悬浮在合适的缓冲液中。接着通过超声等破碎细胞，随即通过离心或过滤获取上清。作为替代方案，用同样的方式培养转化细胞后，如果表达的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶分泌到转化细胞外，通过离心或过滤培养基来分离细胞，获得上清。β-1，4-葡聚糖磷酸化酶积累在转化细胞中时，和β-1，4-葡聚糖磷酸化酶分泌到转化细胞外时，如此得到的含β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的上清都必须通过常规的方法(如盐析方法、溶剂沉淀或超滤)进行浓缩，从而获得含β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的组分。对该组分进行过滤，或进行诸如离心、脱盐等处理，以得到粗制的酶溶液。进一步，通过对粗制的酶溶液组合运用一些常规的酶纯化技术手段，如冻干、等电聚焦、离子交换层析和结晶，可以获得比活性更高的粗制酶或纯化的酶。当粗制的酶中不含能水解诸如α-直链淀粉这样的葡聚糖的酶时，这种酶能用来生产α-葡聚糖。
相对于反应开始时溶液中的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶，反应开始时溶液中β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的含量典型的是约0.01-1000U/g β-1，4-葡聚糖，优选的是约0.05-500U/gβ-1，4-葡聚糖，更优选的是约0.1-100U/g β-1，4-葡聚糖，尤其优选的是约0.5-50U/gβ-1，4-葡聚糖，最优选的是约1-7U/g β-1，4-葡聚糖。在某些情况下，如果β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的量太大时，反应过程中变性的酶很容易聚集。但在某些情况下，如果β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的量太小，反应能自发进行，但葡聚糖的产量降低。
β-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以是纯化的，或未纯化的。β-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以是固定化的，或未固定化的。优选的是，β-1，4-葡聚糖磷酸化酶是固定的。就固定化方法而言，可以使用本领域技术人员公知的方法，如载体结合法(例如，共价结合法、离子结合法或者物理吸附法)、交联法或者包合法(晶格型或微胶囊型)。优选的是将β-1，4-葡聚糖磷酸化酶固定在载体上。
(5.α-1，4-葡聚糖磷酸化酶)
α-1，4-葡聚糖磷酸化酶(EC：2.4.1.1)是催化α-1，4-葡聚糖(聚合度n)磷酸解生成α-1，4-葡聚糖(聚合度n-1)和α-D-葡萄糖-1-磷酸的酶类的通用名，有些情况下也称为磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、糖原磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶等。葡聚糖磷酸化酶也能催化从α-1，4-葡聚糖(聚合度n-1)和α-D-葡萄糖-1-磷酸合成α-1，4-葡聚糖(聚合度n)的反应，这是磷酸解的逆反应。反应朝哪个方向进行决定于底物的量。在体外，因为无机磷酸的量大，葡聚糖磷酸化酶推动反应向磷酸解的方向进行。在本发明的方法中，因为无机磷酸用于β-1，4-葡聚糖的磷酸解，在反应液中无机磷酸的量小，所以反应向着α-葡聚糖合成的方向进行。
一般认为，α-1，4-葡聚糖磷酸化酶广泛存在于存储淀粉或者糖原的各种植物、动物和微生物中。
产生α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的植物例子包含藻类；块茎如马铃薯(也指爱尔兰马铃薯)、甜马铃薯(也叫甘薯)、洋芋、芋头和木薯；蔬菜如卷心菜和菠菜；谷类如玉米、水稻、小麦、大麦、裸麦和狐尾草籽；豆类如豌豆、大豆、赤豆、杂色菜豆等。
产生α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的动物的例子包括哺乳动物，如人、兔、大鼠和猪。
产生α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的微生物的例子包括水生栖热菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、耐放射异常球菌、Thermococcus litoralis、天蓝色链霉菌、Pyrococcus horikoshi、结核分枝杆菌、海栖热袍菌、Aquifex aeolicus、詹氏甲烷球菌、铜绿假单胞菌、肺炎衣原体、小球藻、根癌土壤杆菌、巴氏梭菌、肺炎克雷伯氏菌、聚球蓝细菌属、集胞蓝细菌属、大肠杆菌、粗糙脉孢菌、酿酒酵母和衣藻。产生α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的微生物不限于这些。
本发明中所用的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶优选来源于马铃薯、水生栖热菌或嗜热脂肪芽胞杆菌，更优选来源于马铃薯。本发明优选具有高的最适反应温度的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶。例如，具有高的最适反应温度的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以来源于极嗜热细菌。
本发明中所用的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以直接从前述产生α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的动物、植物和微生物分离，这些都存在于自然界。
本发明中所用的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以从已经用分离自动物、植物或微生物的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶编码基因进行遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)分离。
α-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以采用和前面提取β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样的方法从遗传修饰的微生物中获得。
如前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样，考虑多种条件如表达α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的难易、培养的难容、增殖速度及安全性，可以容易的选择用于遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)。既然优选α-1，4-葡聚糖磷酸化酶不含淀粉酶污染，那么就优选使用不产生淀粉酶或者低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)进行遗传修饰。为遗传修饰α-1，4-葡聚糖磷酸化酶，优选使用嗜温性微生物，如大肠杆菌或者枯草杆菌。本发明方法中优选使用由不产生淀粉酶或者低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)产生而基本不含淀粉酶的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶。
通过遗传修饰获得的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的生产和纯化可以采用和前面β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样的方法进行。
相对于反应开始时溶液中的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶，反应开始时溶液中α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的含量典型的是约0.05-1000U/g β-1，4-葡聚糖，优选约0.1-500U/gβ-1，4-葡聚糖，更优选约0.5-100U/g β-1，4-葡聚糖，特别优选约1-80U/g β-1，4-葡聚糖，最优选约10-50U/g β-1，4-葡聚糖。在某些情况下，当β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的量太大时，反应过程中变性的酶很容易积累。但在某些情况下，如果β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的量太小，反应自发进行，但葡聚糖的产量降低。
α-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以是纯化的，或是未纯化的。α-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以是固定化的，或未固定化的。优选的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶是固定化的。就固定化方法而言，可以使用本领域技术人员公知的方法，如载体结合法(例如，共价结合法、离子结合法或者物理吸附法)、交联法或者包合法(晶格型或微胶囊型)。优选的是将α-1，4-葡聚糖磷酸化酶固定在载体上。进一步说，α-1，4-葡聚糖磷酸化酶可以固定在和β-1，4-葡聚糖磷酸化酶同一载体上，也可以固定在不同的载体上。固定在同一载体上是优选的。
(6.葡萄糖异构酶(EC：5.3.1.5))
在本发明的生产方法中，优选的是溶液中还包含葡萄糖异构酶。通过在溶液中包含葡萄糖异构酶，就能将纤维二糖磷酸解产生的葡萄糖转化成果糖。因为葡萄糖抑制反应向纤维二糖磷酸解的方向进行，通过在溶液中包含葡萄糖异构酶，可进一步促进纤维二糖的磷酸解，提高最终获得的α-葡聚糖产量。
可以用于本发明生产方法中的葡萄糖异构酶是催化D-葡萄糖和D-果糖相互转化的酶。因为葡萄糖异构酶也可以催化D-木糖和D-木酮糖的相互转化，所以也称为木糖异构酶。
葡萄糖异构酶存在于微生物、动物和植物中。产生葡萄糖异构酶的微生物的例子包括锈赤霉链霉菌、橄榄产色链霉菌、鼠灰链霉菌、streptomyces vionaceoniger、淀粉酶链霉菌、白色链霉菌、链霉菌、大肠杆菌、解木聚糖拟杆菌、节杆菌、博伊丁假丝酵母、热产硫磺热厌氧杆菌、热硫化氢热厌氧杆菌、解糖热厌氧杆菌、热厌氧杆菌属、那不勒斯栖热袍菌、水生栖热菌、短乳杆菌、乳链球菌、根癌土壤杆菌、芽孢杆菌属、米密苏里游动放线菌和类产气副大肠杆菌。产生葡萄糖异构酶的动物例子包括布氏锥虫。葡萄糖异构酶可以来源于植物。产生葡萄糖异构酶的生物不限于这些。
可以用于本发明的葡萄糖异构酶优选来源于锈赤霉链霉菌或者芽孢杆菌属，更优选来源于锈赤霉链霉菌。优选的是，用于本发明的葡萄糖异构酶具有高的最适反应温度。具有高的最适反应温度的葡萄糖异构酶例如可以来源于极嗜热细菌。
可以用于本发明中的葡萄糖异构酶可以直接来源于前面所提到的产生葡萄糖异构酶的生物，其存在于自然界。
可以用于本发明的葡萄糖异构酶可以从已经用编码分离自这些生物的葡萄糖异构酶的基因进行遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)中分离。
葡萄糖异构酶可以和前述β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样从遗传修饰的微生物获得。
和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的情况一样，考虑到各种条件如表达葡萄糖异构酶的难易、培养的难易、增殖速度及安全性，可以容易地选择用于遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)。既然优选葡萄糖异构酶不含淀粉酶污染，那么就优选使用不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)进行遗传修饰。为了遗传修饰葡萄糖异构酶，优选使用嗜温微生物，例如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌。本发明方法中优选使用由不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)产生而基本不含淀粉酶的葡萄糖异构酶。
遗传修饰的葡萄糖异构酶的生产和纯化可以和前述β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样进行。
相对于反应开始时溶液中的β-1，4-葡聚糖，反应开始时溶液中葡萄糖异构酶的含量典型的是约0.01-500U/g β-1，4-葡聚糖，优选约0.05-100U/g β-1，4-葡聚糖，更优选约0.1-50U/g β-1，4-葡聚糖，特别优选约0.5-10U/g β-1，4-葡聚糖，最优选约1-5U/gβ-1，4-葡聚糖。当葡萄糖异构酶的量太大时，在一些情况下，反应过程中变性的酶容易聚集。但在某些情况下，如果葡萄糖异构酶的量太小，反应自发进行，但葡聚糖的产量降低。
葡萄糖异构酶可以是纯化的，或未纯化的。葡萄糖异构酶可以是固定化的，或未固定化的。优选的葡萄糖异构酶是固定化的。就固定化方法而言，可以使用本领域技术人员公知的方法，如载体结合法(例如，共价结合法、离子结合法或者物理吸附法)、交联法或者包合法(晶格型或微胶囊型)。优选的是将葡萄糖异构酶固定在一载体上。进一步说，葡萄糖异构酶可以与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶中至少一种固定在同一载体上，或者固定在另一载体上。优选的是葡萄糖异构酶与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶固定在同一载体上。
(7.葡萄糖氧化酶)
在本发明的生产方法中，优选的是溶液中还包含葡萄糖氧化酶。通过在反应溶液中包含葡萄糖氧化酶，由纤维二糖磷酸解产生的α-葡萄糖天然转化而来的β-葡萄糖可以转化成β-葡萄糖-δ内酯。因为α-葡萄糖抑制反应向纤维二糖磷酸解的方向进行，通过在溶液中包含葡萄糖氧化酶，可进一步促进纤维二糖的磷酸解，提高最终获得的α-葡聚糖产量。
可以用于本发明生产方法中的葡萄糖氧化酶催化如下反应：
(化学方程式4)
葡萄糖氧化酶存在于微生物和植物中。产生葡萄糖氧化酶的微生物的例子包括黑曲霉、Penicillium amagasakiense、点青霉和黄孢原毛平革菌。葡萄糖氧化酶可以来源于植物。产生葡萄糖氧化酶的生物不限于这些。
可以用于本发明的葡萄糖氧化酶优选来源于黑曲霉或者Penicilliumamagasakiense，更优选来源于黑曲霉。优选的是用于本发明的葡萄糖氧化酶具有最适反应温度。例如，具有高的最适反应温度的葡萄糖氧化酶可以来源于极嗜热细菌。
可以用于本发明的葡萄糖氧化酶可以直接从前面所提到的产生葡萄糖氧化酶的生物中分离，这些都存在于自然界。
可以用于本发明的葡萄糖氧化酶可以从已经用编码分离自这些生物的葡萄糖氧化酶的基因进行遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)分离。
葡萄糖氧化酶可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样从遗传修饰的微生物获得。
和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样，考虑各种条件，如表达葡萄糖氧化酶的难易、培养的难易、增殖速度及安全性，可以容易地选择用于遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)。既然优选葡萄糖氧化酶不含淀粉酶污染，那么就优选使用不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)进行遗传修饰。为遗传修饰葡萄糖氧化酶，优选使用嗜温微生物，例如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌。本发明方法中，优选使用由不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)产生而基本不含淀粉酶的葡萄糖氧化酶。
遗传修饰的葡萄糖氧化酶的生产和纯化可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样进行。
相对于反应开始时溶液中的β-1，4-葡聚糖，反应开始时溶液中葡萄糖氧化酶的含量典型的是约0.5-1,000U/g β-1，4-葡聚糖，优选约1-500U/g β-1，4-葡聚糖，更优选约5-400U/g β-1，4-葡聚糖，特别优选约10-300U/g β-1，4-葡聚糖，最优选约20-200U/gβ-1，4-葡聚糖。当葡萄糖氧化酶的量太大时，在一些情况下，反应过程中变性的酶容易聚集。当葡萄糖氧化酶的量太小时，在一些情况下，反应会自发进行，但是葡聚糖产量下降。
葡萄糖氧化酶可以是纯化，或未纯化的。葡萄糖氧化酶可以是固定化的，或未固定化的。优选的葡萄糖氧化酶是固定化的。就固定化方法而言，可以使用本领域技术人员公知的方法，如载体结合法(例如，共价结合法、离子结合法或者物理吸附法)、交联法或者包合法(晶格型或微胶囊型)。优选的是将葡萄糖氧化酶固定在载体上。进一步说，葡萄糖氧化酶可以与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶中至少一种固定在同一载体上，或者固定在另一载体上。优选的是葡萄糖氧化酶与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶固定在同一载体上。
(8.变旋酶)
在本发明的生产方法中，当溶液中含有葡萄糖氧化酶时，优选的是溶液中还包含变旋酶。通过在溶液中加变旋酶，可以使纤维二糖磷酸解产生的α-葡萄糖和β-葡萄糖互相转化。虽然α-葡萄糖和β-葡萄糖不加变旋酶就可自然互相转化，但因为加变旋酶后促进这种互相转换，所以可以进一步提高降低溶液反应所产生的α-葡萄糖量的效率。因此，在反应液中加入葡萄糖氧化酶和变旋酶降低反应液中α-葡萄糖浓度，从而进一步促进纤维二糖磷酸解，最终提高获得的α葡聚糖产量。
可以用于本发明生产方法的变旋酶可以催化α-葡萄糖和β-葡萄糖的互相转化。
变旋酶存在于微生物、动物和植物中。产生变旋酶的微生物的例子包括点青霉和大肠杆菌。产生变旋酶的动物的例子包括猪和牛。产生变旋酶的植物的例子包括辣椒。产生变旋酶的生物不限于这些。
可以用于本发明的变旋酶优选来源于猪或者牛，更优选来源于猪。优选的是用于本发明的变旋酶具有高的最适反应温度。例如，具有高的最适反应温度的变旋酶可以来源于极嗜热细菌。
可以用于本发明的变旋酶可以直接从前面所提到的产生变旋酶的生物中分离，这些都存在于自然界。
可以用于本发明的变旋酶可以从已经用编码分离自这些生物的变旋酶的基因进行遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)分离。
变旋酶可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样从遗传修饰的微生物中获得。
和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样，考虑各种条件，如表达变旋酶的难易、培养的难易、增殖速度及安全性，可以容易地选择用于遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)。既然优选变旋酶不含淀粉酶污染，那么就优选使用不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)进行遗传修饰。为遗传修饰变旋酶，优选使用嗜温微生物，例如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌。本发明方法中优选使用由不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)产生而基本不含淀粉酶的变旋酶。
遗传修饰的变旋酶的生产和纯化可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样进行。
相对于反应开始时溶液中的β-1，4-葡聚糖，反应开始时溶液中变旋酶的含量典型的是约0.01-500U/g β-1，4-葡聚糖，优选约0.01-100U/g β-1，4-葡聚糖，更优选约0.01-50U/g β-1，4-葡聚糖，特别优选约0.05-10U/g β-1，4-葡聚糖，最优选约0.1-5U/gβ-1，4-葡聚糖。当变旋酶的量太大时，在一些情况下，反应过程中变性的酶容易聚集。当变旋酶的量太小时，在某些情况下，反应自发进行，但是葡聚糖产量下降。
变旋酶可以是纯化，或未纯化的。变旋酶可以是固定化的，或未固定化的。优选的变旋酶是固定化的。就固定化方法而言，可以使用本领域技术人员公知的方法，如载体结合法(例如，共价结合法、离子结合法或者物理吸附法)、交联法或者包合法(晶格型或微胶囊型)。优选的是将变旋酶固定在载体上。进一步说，变旋酶可以与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶中至少一种固定在同一载体上，或者固定在凌夷载体上。优选的是变旋酶与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶固定在同一载体上。
(9.过氧化氢酶和过氧化物酶)
在本发明的生产方法中，当溶液中含有葡萄糖氧化酶时，优选的是溶液中还包含过氧化氢酶或者过氧化物酶。通过在溶液中加过氧化氢酶或者过氧化物酶，可将葡萄糖氧化酶催化产生的过氧化氢转化为氧气，使得氧气得以循环。因此，通过在反应液中添加葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶或者过氧化物酶，可以降低反应液中α-葡萄糖的浓度，从而进一步促进纤维二糖磷酸解，提高最终获得的α-葡聚糖产量。
可以用于本发明生产方法中的过氧化氢酶是一种催化过氧化氢降解为氧气和水的酶。
过氧化氢酶存在于微生物、动物和植物中。产生过氧化氢酶的微生物的例子有过氧化醋杆菌、马胎无胆甾原体、马无胆甾原体、菜氏无胆甾原体、黑曲霉、微紫青霉、盐生盐杆菌、死海盐盒菌、大肠杆菌、关节炎枝原体、山羊枝原体、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌、鼠肺炎霉浆菌(mycoplasma pulmunis)、枝原体属、嗜热脂肪芽孢杆菌、类球红细菌、植物乳杆菌、白栖热嗜油菌、黄孢原毛平革菌、酿酒酵母、皱褶假丝酵母、克勒克酵母属、肺炎克雷伯氏菌、施氏假单胞菌、脱氮副球菌。产生过氧化氢酶的动物的例子有家山羊、牛、人、褐家鼠和notomastus lobatus(多毛纲)。产生过氧化氢酶的植物的例子有棉花、白芥、菠菜、烟草、林生烟草(美花烟草)、纤细眼虫(藻类)和豌豆。产生过氧化氢酶的生物不限于这些。
可以用于本发明的过氧化氢酶优选来源于黑曲霉、牛肝或人红血球，更优选来源于黑曲霉。优选的是用于本发明的过氧化氢酶具有高的最适反应温度。例如，具有高的最适反应温度的过氧化氢酶可以来源于极端嗜热细菌。
可以用于本发明生产方法中的过氧化物酶是一种把过氧化氢作为氢受体，催化各种有机底物氧化的酶。
过氧化物酶存在于微生物、动物和植物中。产生过氧化物酶的微生物的例子有糙皮侧耳、盐生盐杆菌、死海盐盒菌、光头鬼伞、黄孢原毛平革菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌、脑膜脓毒性金黄杆菌、Arthromyces ramosus、火木层孔菌、大肠杆菌、白栖热嗜油菌、克勒克酵母属、嗜热脂肪芽孢杆菌、黑伞菇和长根鬼伞。应该注意，在本说明书中，微生物包括细菌和真菌。产生过氧化物酶的动物的例子有人、家犬、褐家鼠、猪和绵羊。产生过氧化物酶的植物的例子有辣根、马萝卜、山葵、中华猕猴桃、橙、毛果杨、林生烟草(美花烟草)、北美西加云杉、云杉、karsten、矮牵牛、番木瓜、华东葡萄、大麦、白菜、桃、蚕豆和栽培稻。产生过氧化物酶的生物不限于这些。
可以用于本发明的过氧化物酶优选来源于辣根和嗜热脂肪芽孢杆菌，更优选来源于辣根。优选的是用于本发明的过氧化物酶具有高的最适反应温度。例如，具有高的最适反应温度的过氧化物酶可以来源于极嗜热细菌。
可以用于本发明的过氧化氢酶或者过氧化物酶可以直接从前面所提到的产生过氧化氢酶或过氧化物酶的生物中分离，这些都存在于自然界。
本发明中所用的过氧化氢酶或过氧化物酶可以从已经用编码分离自这些生物的过氧化氢酶或过氧化物酶的基因进行遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)分离。
过氧化氢酶或过氧化物酶可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样从遗传修饰的微生物获得。
和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样，考虑各种条件，如表达过氧化氢酶或过氧化物酶的难易、培养的难易、增殖速度及安全性，可以容易地选择用于遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)。既然优选过氧化氢酶或过氧化物酶不含淀粉酶污染，那么就优选使用不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)进行遗传修饰。为遗传修饰过氧化氢酶或过氧化物酶，优选使用嗜温微生物，例如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌。本发明方法中，优选使用由不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)产生而基本不含淀粉酶的过氧化氢酶或过氧化物酶。
遗传修饰的过氧化氢酶或过氧化物酶的生产和纯化可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样进行。
相对于反应开始时溶液中的β-1，4-葡聚糖，反应开始时溶液中过氧化氢酶或过氧化物酶的含量典型的是约0.05-1,000U/g β-1，4-葡聚糖，优选约0.1-500U/g β-1，4-葡聚糖，更优选约1.0-200U/g β-1，4-葡聚糖。当过氧化氢酶或过氧化物酶的量太大时，在一些情况下，反应过程中变性的酶容易聚集。当过氧化氢酶或过氧化物酶的量太小时，在某些情况下，反应自发进行，但是葡聚糖产量下降。
过氧化氢酶或过氧化物酶可以是纯化的，或未纯化的。过氧化氢酶或过氧化物酶可以是固定化的，或未固定化的。优选的过氧化氢酶或过氧化物酶是固定化的。就固定化方法而言，可以使用本领域技术人员公知的方法，如载体结合法(例如，共价结合法、离子结合法或者物理吸附法)、交联法或者包合法(晶格型或微胶囊型)。优选的是过氧化氢酶或过氧化物酶固定在载体上。进一步说，过氧化氢酶或过氧化物酶可以与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶中至少一种固定在同一载体上，或者固定在另一载体上。优选的是过氧化氢酶或过氧化物酶与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶固定在同一载体上。
(10.脱支酶)
在本发明的方法中，当在产物中产生分支时，例如使用含有α-1，6-葡糖苷键的起始物质时，可以根据需要使用脱支酶。
可以用于本发明的脱支酶是能切割α-1，6-葡糖苷键的酶。脱支酶可以分成两类，一类是异淀粉酶(EC3.2.1.68)，能很好地作用于支链淀粉和糖原，另一类是α-糊精内切-1，6-α-葡萄糖苷酶(也叫普鲁兰酶)(E.C3.2.1.41)，能作用于支链淀粉、糖原和普鲁兰多糖。
脱支酶存在于微生物和植物中。能产生脱支酶的微生物的例子包括酿酒酵母、衣藻、短芽孢杆菌、嗜酸普鲁兰芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、水生栖热菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜温高温放线菌、产乙醇热厌氧杆菌和介支淀粉假单胞菌。能产生脱支酶的植物的例子包括马铃薯、甘薯、玉米、水稻、小麦、大麦、裸麦和甜菜。能产生脱支酶的生物不限于上述这些。
可以用于本发明的脱支酶优选来源于肺炎克雷伯氏菌、短芽孢杆菌、嗜酸普鲁兰芽孢杆菌或者介支淀粉假单胞菌，更优选来源于肺炎克雷伯氏菌或者介支淀粉假单胞菌。优选的是用于本发明的脱支酶具有高的最适反应温度。例如，具有高的最适反应温度的脱支酶可以来源于极嗜热细菌。
可以用于本发明的脱支酶可以直接从前面所提到的产生脱支酶的生物中分离，这些都存在于自然界。
可以用于本发明的脱支酶可以从已经用编码分离自这些微生物和植物的脱支酶的基因进行遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)分离。
可以用于本发明的脱支酶可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样从遗传修饰的微生物获得。
和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样，考虑各种条件，如表达脱支酶的难易、培养的难易、增殖速度及安全性，可以容易地选择用于遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)。既然优选脱支酶不含淀粉酶污染，那么就优选使用不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)进行遗传修饰。为遗传修饰脱支酶，优选使用嗜温微生物，例如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌。本发明方法中，优选使用由不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)产生而基本不含淀粉酶的脱支酶。
遗传修饰的脱支酶的生产和纯化可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样进行。
相对于反应开始时溶液中的β-1，4-葡聚糖，反应开始时溶液中脱支酶的含量典型的是约0.05-1,000U/g β-1，4-葡聚糖，优选约0.1-500U/g β-1，4-葡聚糖，更优选约0.5-100U/g β-1，4-葡聚糖。当脱支酶的量太大时，在一些情况下，反应过程中变性的酶容易聚集。当脱支酶的量太小时，在某些情况下，反应自发进行，但是葡聚糖产量下降。
脱支酶可以是纯化的，或未纯化的。脱支酶可以是固定化的，或未固定化的。优选的脱支酶是固定化的。就固定化方法而言，可以使用本领域技术人员公知的方法，如载体结合法(例如，共价结合法、离子结合法或者物理吸附法)、交联法或者包合法(晶格型或微胶囊型)。优选的是将脱支酶固定在载体上。进一步说，脱支酶可以与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶中至少一种固定在同一载体上，或者固定在另一载体上。优选的是脱支酶与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶固定在同一载体上。
(11.分支酶(EC：2.4.1.18))
在本发明的方法中，当期望在产物中产生分支时，可以根据需要使用分支酶。
可以根据本发明使用的分支酶是将α-1，4-葡聚糖的一部分转移到该α-1，4-葡聚糖链中某个葡萄糖残基6位上形成分支的酶。分支酶也称作1，4-葡聚糖分支酶，生分支酶或者Q酶。
分支酶存在于微生物、动物和植物中。能产生分支酶的微生物的例子包括嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽胞杆菌、热速芽孢杆菌、热链形芽孢杆菌、史氏芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、短芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌属、蓝色链霉菌、aquifex aeolicus、蓝藻、大肠杆菌、根癌土壤杆菌、水生栖热菌、rhodothermus obamensis、链孢霉和酵母。能产生分支酶的动物的例子包括哺乳动物，如人、兔、大鼠和猪。能产生分支酶的植物的例子有藻类，块茎如马铃薯、甘薯、洋芋和木薯；蔬菜如菠菜；谷类如玉米、水稻、小麦、大麦、裸麦和狐尾草籽；豆类有豌豆、大豆、赤豆及杂色菜豆等物。能产生分支酶的生物不限于上述这些。
可以用于本发明的分支酶优选来源于马铃薯、嗜热脂肪芽孢杆菌或者aquifexaeolicus，更优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌或者aquifex aeolicus。优选的是用于本发明的分支酶具有高的最适反应温度。例如，具有高的最适反应温度的分支酶可以来源于极嗜热细菌。
可以用于本发明的分支酶可以直接从前面所提到的产生分支酶的微生物、动物和植物分离，这些都存在于自然界。
本发明中所用的分支酶可以从已经用编码分离自这些微生物、动物或植物的分支酶的基因进行遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)分离。
分支酶可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样从遗传修饰的微生物获得。
和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样，考虑各种条件，如表达分支酶的难易、培养的难易、增殖速度及安全性，可以容易地选择用于遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)。既然优选分支酶不含淀粉酶污染，那么就优选使用不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)进行遗传修饰。为遗传修饰分支酶，优选使用嗜温微生物，例如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌。本发明方法中，优选使用由不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)产生而基本不含淀粉酶的分支酶。
遗传修饰的分支酶的生产和纯化可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样进行。
相对于反应开始时溶液中的β-1，4-葡聚糖，反应开始时溶液中分支酶的含量典型的是约10-100,000U/g β-1，4-葡聚糖，优选约100-50,000U/g β-1，4-葡聚糖，更优选约1,000-10,000U/g β-1，4-葡聚糖。当分支酶的量太大时，在一些情况下，反应过程中变性的酶容易聚集。当分支酶的量太小时，在某些情况下，反应自发进行，但葡聚糖产量下降。
分支酶可以是纯化的，或未纯化的。分支酶可以是固定化的，或未固定化的。优选的分支酶是固定化的。就固定化方法而言，可以使用本领域技术人员公知的方法，如载体结合法(例如，共价结合法、离子结合法或者物理吸附法)、交联法或者包合法(晶格型或微胶囊型)。优选的是将分支酶固定在载体上。进一步说，分支酶可以与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶中至少一种固定在同一载体上，或者固定在另一载体上。优选的是分支酶与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶固定在同一载体上。
(12.-α-葡糖基转移酶(EC：2.4.1.25))
在本发明的方法中，当产生环状结构的产物时，可以根据需要使用4-α-葡糖基转移酶。
可以用于本发明的4-α-葡糖基转移酶也称作岐化酶、D-酶或者麦芽糖转葡糖基酶，是催化麦芽寡糖糖基转移反应(歧化反应)的酶。4-α-葡糖基转移酶能将供体分子非还原末端的葡糖基团，麦芽糖或者麦芽寡糖基团转移到受体分子的非还原末端。因此，酶促反应导致第一个给定麦芽寡糖聚合度的歧化。当供体与受体分子一样时，会发生分子内的转移，结果得到环状结构的产物。
4-α-葡糖基转移酶存在于微生物和植物中。能产生4-α-葡糖基转移酶的微生物的例子包括aquifex aeolicus、肺炎链球菌、丁酸梭菌、耐放射异常球菌、流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌、thermococcus litralis、海栖热袍菌、那不勒斯嗜热袍菌、鹦鹉热衣原体、火球菌属、嗜热网球菌、布氏疏螺旋体、蓝藻、大肠杆菌和水生栖热菌。能产生4-α-葡糖基转移酶的植物的例子包括块茎如马铃薯、甘薯、洋芋和木薯；谷类如玉米、水稻和小麦；豆类如豌豆和大豆等；以及其他类似的生物。能产生4-α-葡糖基转移酶的生物不限于上述这些。
可以用于本发明的4-α-葡糖基转移酶优选来源于马铃薯、水生栖热菌或者thermococcus litralis，更优选来源于马铃薯或者水生栖热菌。优选的是用于本发明的4-α-葡糖基转移酶具有高的最适反应温度。例如，具有高的最适反应温度的4-α-葡糖基转移酶可以来源于极嗜热细菌。
可以用于本发明的4-α-葡糖基转移酶可以直接从前面所提到的产生4-α-葡糖基转移酶的微生物和植物中分离，这些都存在于自然界。
可以用于本发明的4-α-葡糖基转移酶可以从已经用编码分离自这些微生物和植物的4-α-葡糖基转移酶的基因进行遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)分离。
4-α-葡糖基转移酶可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样从遗传修饰的微生物获得。
和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样，考虑各种条件，如表达4-α-葡糖基转移酶的难易、培养的难易、增殖速度及安全性，可以容易地选择用于遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)。既然优选4-α-葡糖基转移酶不含淀粉酶污染，那么就优选使用不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)进行遗传修饰。为遗传修饰4-α-葡糖基转移酶，优选使用嗜温微生物，例如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌。本发明方法中，优选使用由不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)产生而基本不含淀粉酶的4-α-葡糖基转移酶。
遗传修饰的-α-葡糖基转移酶的生产和纯化可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样进行。
相对于反应开始时溶液中的β-1，4-葡聚糖，反应开始时溶液中4-α-葡糖基转移酶的含量典型的是约0.05-1,000U/g β-1，4-葡聚糖，优选约0.1-500U/g β-1，4-葡聚糖，更优选约0.5-100U/g β-1，4-葡聚糖。当4-α-葡糖基转移酶的量太大时，在一些情况下，反应过程中变性的酶容易聚集。当4-α-葡糖基转移酶的量太小时，在某些情况下，反应自发进行，但是葡聚糖产量下降。
4-α-葡糖基转移酶可以是纯化的，或未纯化的。4-α-葡糖基转移酶可以是固定化的，或未固定化的。优选的4-α-葡糖基转移酶是固定化的。就固定化方法而言，可以使用本领域技术人员公知的方法，如载体结合法(例如，共价结合法、离子结合法或者物理吸附法)、交联法或者包合法(晶格型或微胶囊型)。优选的是将4-α-葡糖基转移酶固定在载体上。进一步说，4-α-葡糖基转移酶可以与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶中至少一种固定在同一载体上，或者固定在另一载体上。优选的是4-α-葡糖基转移酶与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶固定在同一载体上。
(13.糖原脱支酶(EC：2.4.1.25/EC：3.2.1.33))
在本发明的方法中，当在产物中产生环状结构时，可以根据需要使用糖原脱支酶。
可以用于本发明的糖原脱支酶具有两种活性：α-1，6-葡糖苷酶活性和4-α-葡糖基转移酶活性。通过糖原脱支酶所具有的4-α-葡糖基转移酶活性，得到环状结构的产物。
糖原脱支酶存在于微生物和动物中。能产生糖原脱支酶的微生物的例子包括酵母等。能产生糖原脱支酶的动物的例子包括哺乳动物，如人、兔、大鼠和猪。能产生糖原脱支酶的生物不限于这些。
可以用于本发明的糖原脱支酶优选来源于酵母。优选的是，可以用于本发明的糖原脱支酶优选具有高的最适反应温度。例如，具有高的最适反应温度的糖原脱支酶可以通过蛋白质工程技术对能在中等温度水平下发挥作用的酶进行修饰而获得。
可以用于本发明的糖原脱支酶可以直接从前面所提到的产生糖原脱支酶的微生物和动物分离，这些都存在于自然界。
本发明中所用的糖原脱支酶可以已经用编码分离自这些微生物或动物的糖原脱支酶的基因进行遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)分离。
糖原脱支酶可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样从遗传修饰的微生物获得。
和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样，考虑各种条件，如表达糖原脱支酶的难易、培养的难易、增殖速度及安全性，可以容易地选择用于遗传修饰的微生物(如细菌、真菌等)。既然优选糖原脱支酶不含淀粉酶污染，那么就优选使用不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)进行遗传修饰。为遗传修饰糖原脱支酶，优选使用嗜温微生物，例如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌。本发明方法中，优选使用由不产生淀粉酶或者仅低水平表达淀粉酶的微生物(例如细菌、真菌等)产生而基本不含淀粉酶的糖原脱支酶。
遗传修饰的糖原脱支酶的生产和纯化可以和前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶一样进行。
相对于反应开始时溶液中的β-1，4-葡聚糖，反应开始时溶液中糖原脱支酶的量典型的是约0.01-5,000U/g β-1，4-葡聚糖，优选约0.1-1,000U/g β-1，4-葡聚糖，更优选约1-500U/g β-1，4-葡聚糖。当糖原脱支酶的量太大时，在一些情况下，反应过程中变性的酶容易聚集。当糖原脱支酶的量太小时，在某些情况下反应自发进行，但是葡聚糖产量下降。
糖原脱支酶可以是纯化的，或未纯化的。糖原脱支酶可以是固定化的，或未固定化的。优选的糖原脱支酶是固定化的。就固定化方法而言，可以使用本领域技术人员公知的方法，如载体结合法(例如，共价结合法、离子结合法或者物理吸附法)、交联法或者包合法(晶格型或微胶囊型)。优选的是将糖原脱支酶固定在载体上。进一步说，糖原脱支酶可以与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶中至少一种固定在同一载体上，或者固定在另一载体上。优选的是糖原脱支酶与β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶固定在同一载体上。
(14.溶剂)
本发明方法中所用的溶剂可以是任何溶剂，只要不损害β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶活性即可。
应该注意到，只要生成葡聚糖的反应持续进行即可，没有必要将本发明方法中所需要的材料都完全溶于溶剂。例如，当酶固定在固相载体上时，就没有必要把酶溶于溶剂中。另外，不是所有的反应物质，例如β-1，4-葡聚糖，都必须溶于溶剂，只要材料的一部分溶于溶剂使得反应持续进行即可。
典型的溶剂是水。溶剂可以是细胞裂解液中的水，细胞裂解液是在制备前面提到的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶或α-1，4-葡聚糖磷酸化酶时，伴随β-1，4-葡聚糖磷酸化酶或α-1，4-葡聚糖磷酸化酶产生的。
水可以是任何软水、中水和硬水。硬水是指硬度为20°或更高的水，中水是指硬度低于20°但不低于10°的水，软水是指硬度低于10°的水。水优选软水或中水，更优选软水。
(15.其他组分)
溶液中除了含有β-1，4-葡聚糖、引物、无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸、β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶外，还可以含有其他物质，只要不阻碍β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和β-1，4-葡聚糖之间以及α-1，4-葡聚糖磷酸化酶和引物之间的相互作用即可。例如，这样的物质包括缓冲剂、产生β-1，4-葡聚糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌等)组分、产生α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌等)组分、盐类、培养基成分等。
<α-葡聚糖的生成>
本发明的α-葡聚糖通过使含有β-1，4-葡聚糖、引物、无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸、β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的溶液发生反应而生成。
图2所示为本发明生产方法中所发生反应的示意图。使用β-1，4-葡聚糖磷酸化酶从β-1，4-葡聚糖(聚合度为n)和无机磷酸生成葡萄糖-1-磷酸和β-1，4-葡聚糖(聚合度为n-1)。生成的葡萄糖-1-磷酸(和已经加到溶液中的葡萄糖-1-磷酸)立即在α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的作用下通过α-1，4-键转移到适当的引物(聚合度为m)上，延伸成α-葡聚糖链(聚合度m+1)。进一步说，存在产生的无机磷酸再循环到β-1，4-葡聚糖磷酸化酶催化的反应中的机制。
另外，，当起始的β-1，4-葡聚糖是纤维二糖、β-1，4-葡聚糖磷酸化酶是纤维二糖磷酸化酶时本发明生产方法中所发生反应的示意图示于图2。使用纤维二糖磷酸化酶从纤维二糖(聚合度2)和无机磷酸生成葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖。反应生成的葡萄糖-1-磷酸(和已经加到溶液中的葡萄糖-1-磷酸)立即在α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的作用下通过α-1，4-键转移到适当的引物(聚合度为m)上，延伸成α-葡聚糖链(聚合度m+1)。进一步说，存在产生的无机磷酸再循环到β-1，4-葡聚糖磷酸化酶催化的反应中的机制。
例如，在本发明生产方法中，首先制备溶液。例如，可以把固体β-1，4-葡聚糖、引物、无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸、β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶加入适当的溶剂中来制备溶液。作为替代方案，可以通过将分别含有β-1，4-葡聚糖溶液、引物、磷酸源如无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸、β-1，4-葡聚糖磷酸化酶或α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的溶液混合而制备所述溶液。作为替代方案，可以将含有β-1，4-葡聚糖、引物、磷酸源如无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸、β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶中几种成分的溶液和固体形式的其他成分混合而制备所述溶液。可以根据需要向本发明生产方法所用的溶液中加入任何缓冲液以调节pH，只要酶促反应不受到抑制即可。溶液的pH可以是任何值，只要酶活性没有受到太大抑制即可。优选的pH值为约6-约8，更优选为约6.5-约7.5。pH可以根据反应中酶的最适反应pH进行适当调节。溶液中盐的浓度可以是任何浓度，只要酶促反应没有受到太大抑制即可。盐浓度优选为1.0mM-50mM，更优选为5mM-30mM。
如果β-1，4-葡聚糖是纤维二糖，β-1，4-葡聚糖磷酸化酶是纤维二糖磷酸化酶，例如，可以进一步将葡萄糖异构酶或者葡萄糖氧化酶(和变旋酶)加入该溶液中，以从溶液中除去α-葡聚糖生产时所产生的葡萄糖。另外，可以向溶液中加入过氧化氢酶或过氧化物酶。作为替代方案，可以加入通过代谢葡萄糖而从溶液中除去葡萄糖的微生物，如酵母。作为替代方案，可以向溶液中加入特异性吸附葡萄糖的树脂。优选加入酶或者微生物的方法，因为这种方法可以在反应持续进行的同时除去葡萄糖。应该注意到，本文所用的“除去”包括减少反应液中葡萄糖的量和消除葡萄糖的存在。
另外，可以根据需要向该溶液中加入选自脱支酶、分支酶、4-α-葡糖基转移酶和糖原脱支酶的酶。这些酶可以在α-葡聚糖合成反应起始时加入，可以在反应过程中加入，或者在反应完成后加入。
然后，根据需要通过本领域已知的方法加热溶液使溶液反应。溶液温度可以是任何温度，只要能获得本发明效果即可，可以是所加入酶发挥其活性的温度。例如，通过使用热稳定性酶并将反应温度调整到该热稳定性酶的最适反应温度，可以抑制所加入热稳定性酶以外的任何污染酶的活性。优选的是，该反应步骤中的温度是预定反应时间之后保留反应之前该溶液中所含的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶至少之一、优选二者活性的约50％或更高、更优选约80％或更高活性的温度。该温度优选约30℃-约70℃，更优选约35℃-约60℃。
反应时间可以根据反应温度、反应产生的葡聚糖分子量和剩余的酶活性来设定。反应时间典型的是约1-约100小时，更优选约1-约72小时，进一步优选约2-约36小时，最优选约2-约24小时。
可以采用任何手段进行加热，在搅动时加热是优选的，这样热量能均匀传递到整个溶液中。例如，可以将溶液放入带有温水夹套和搅动装置的不锈反应槽中进行搅动。
本发明方法中，当反应进行到某种程度时，可以向反应液中再加入β-1，4-葡聚糖，β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶中的至少一种。
如上所述，当β-1，4-葡聚糖是纤维二糖、β-1，4-葡聚糖磷酸化酶是纤维二糖磷酸化酶时，优选在生产步骤的同时进行加入酶例如葡萄糖异构酶的步骤，以除去在产生α-葡聚糖的同时所产生的副产物葡萄糖。另一方面，除去葡萄糖的步骤可以与生产α-葡聚糖的步骤在不同时间进行。例如，在本发明的方法中，在反应进行到某种程度时，为了除去反应生成的葡萄糖，用物理去除葡萄糖的方法例如层析分级分离和膜分级分离法对溶液进行处理，随后再进行反应。物理去除葡萄糖的方法可以进行一次，或进行两次或者更多次。当该方法进行两次或更多次时，例如，当反应进行了2个小时后，用此法除去葡萄糖，然后，反应再进行2个小时，再除去葡萄糖，然后反应再进行2个小时。
通过这种方式产生含有α-葡聚糖的溶液。
当反应完成后，根据需要加热反应液，例如，在100℃加热10分钟，以灭活溶液中酶活性。作为替代方案，可以不进行灭活酶的处理而进行后续步骤。溶液可以储存起来或者进行处理来分离生成的葡聚糖。
<纯化方法>
可以根据需要纯化生成的α-葡聚糖。通过纯化去除的杂质例如是葡萄糖。对于纯化α-葡聚糖的方法的例子，有利用有机溶剂的方法(T.J.Schoch et al.，J.AmericanChemical Society，64，2957(1942))和不用有机溶剂的方法。
利用有机溶剂纯化的方法中可以用到的有机溶剂例如包括丙酮、正戊醇、五唑、正丙醇、正己醇、2-乙基-1-丁醇、2-乙基-1-己醇、十二醇、环己醇、正丁醇、3-戊醇、4-甲基-2-戊醇、d，l-龙脑(borneol)、α-松油醇、异丁醇、仲丁醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔戊醇、薄荷醇、甲醇、乙醇和乙醚。
不用有机溶剂的纯化方法的实例如下所示。
(1)一种方法是，在生产α-葡聚糖的反应后，冷却反应液以沉淀α-葡聚糖，通过一般的固体-液体分离法如膜分级分离、过滤和离心纯化沉淀的α-葡聚糖；
(2)一种方法是，在生产α-葡聚糖的反应发生过程中或者生产α-葡聚糖的反应之后，冷却溶液以使α-葡聚糖胶凝，回收胶凝的α-葡聚糖，通过诸如水洗、冻融和过滤的程序将葡萄糖从胶凝的α-葡聚糖中除去；
(3)一种方法是，在生产α-葡聚糖的反应之后，不将溶于水的α-葡聚糖沉淀，用超滤法或者层析法将反应混合物进行膜分级分离而除去葡萄糖。
可以用于纯化的超滤膜的例子有分级分离分子量为约1,000-约100,000，优选为约5,000-约50,000，更优选为约10,000-约30,000的超滤膜(Daicel生产的UF膜单位)。
可以用于层析中的载体例子有凝胶过滤层析载体、配位体交换层析载体、离子交换层析载体和疏水层析载体。
实施例1
将通过下面的实施例更详细地说明本发明。但本发明并不局限于下面这些实施例。
(1.测定方法和计算方法)
本发明中各种酶活性及所得α-葡聚糖产量的测定采用下面的方法。(1.1测定纤维二糖磷酸化酶活性的方法)
将30μl 40mM纤维二糖水溶液与30μl 40mM磷酸钠水溶液(pH 7.5)混合，再加入60μl经过适当稀释的酶液(样品)，在120μl的混合物中开始反应。为使反应进行，将该混合物在37℃孵育10分钟，然后在100℃下保持10分钟以使酶灭活。随后，向该混合物中加入780μl 1M Tris-HCL缓冲液(pH 7.0)和120μl显色剂(葡萄糖AR-II显色剂(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造))，混合，测定505nm处的吸光值。类似地使用已知浓度的葡萄糖水溶液测定吸光值，并制作标准曲线。将样品测得的吸光值拟合到该标准曲线上以获得样品中的葡萄糖量。一个单位的纤维二糖磷酸化酶定义为：使用前面所述方法，1分钟内从20mM纤维二糖生成1μmol葡萄糖所需要的酶量。
(1.2测定α-1，4-葡聚糖磷酸化酶活性的方法)
将50μl 4％的分歧状糊精(cluster dextrin)水溶液与50μl 50mM葡萄糖-1-磷酸钠水溶液混合，再加入100μl经过适当稀释的酶液，在200μl混合物中开始反应。为了使反应进行，该混合物在37℃孵育15分钟，然后，向该混合物中加入800μl钼试剂(15mM钼酸铵，100mM醋酸锌)以终止反应。随后，加入200μl 568mM抗坏血酸(pH 5.0)，搅动以获得反应体系。将该反应体系在30℃保持20分钟后，用分光光度计测定在850nm处的吸光值。类似地使用已知浓度的无机磷酸水溶液测定吸光值，并制作标准曲线。将样品测得的吸光值拟合到标准曲线上，以获得样品中无机磷酸的量。将一分钟内通过这种方法生成1μmol无机磷酸的酶活性定义为一个单位的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶。
(1.3计算所得α-葡聚糖产量的方法)
本发明生产方法中α-葡聚糖产量的计算是基于葡萄糖残基的摩尔数，是所得α-葡聚糖相对于初始所加的纤维二糖摩尔数的％。反应完成之向溶液中加入乙醇至终浓度为50％，以沉淀α-葡聚糖，弃掉上清，α-葡聚糖进一步用适量的50％乙醇洗涤2次，干燥，溶于适量的水中，随后，用酚-硫酸法测定葡萄糖的浓度，从而计算出α-葡聚糖的量(摩尔数)。通过将该产量(摩尔数)除以纤维二糖的摩尔数再乘以100而计算产量。计算公式如下：
公式2：
(α-葡聚糖产量(％))
＝(α-葡聚糖(mM葡萄糖当量))/(初始纤维二糖(mM))×100
(1.4测定α-葡聚糖平均分子量的方法)
将本发明合成的α-葡聚糖完全溶于1N氢氧化钠，用适量的盐酸中和，将约300μg等份的α-葡聚糖用差示折光计和多角度光散射检测器一起进行凝胶过滤层析，从而获得平均分子量。
更具体而言，使用Shodex SB806M-HQ(SHOWA DENKO K.K.制造)作为柱，使用依次连接的多角度光散射检测器(DAWN-DSP，Wyatt Technology制造)和差示折光计(Shodex RI-71，SHOWADENKO K.K.制造)作为检测器。柱子保持在40℃，使用1mM/min流速的0.1M的硝酸钠溶液作为洗脱液。用数据分析软件(商品名：ASTRA，Wyatt Technology制造)收集所得信号，并用该软件分析，从而得到重均分子量。
(2.酶的制备)
本发明实施例中所用的各种酶采用下面方法制备。
(2.1重组纤维二糖磷酸化酶的制备方法)
提取热纤维梭菌染色体基因作为模板。用以下两种合成的DNA引物进行PCR，合成的DNA引物1：
5’aaactctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatggagtt
cggtttttttgatgat 3’(SEQ ID NO：1)和
合成的DNA引物2：
5’aaactcgagaattacttcaactttgtgagtcttt 3’(SEQ ID NO：2)
在依次98℃1分钟，55℃1分钟，68℃3分钟进行30个循环的加热条件下，扩增含有CBP基因的区域。将扩增的基因与选择标记基因Kmr一起整合到表达载体pET28a(STRATAGENE制造)，获得质粒pET28a-CBP1。在该质粒中，纤维二糖磷酸化酶基因与异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子可操作连接并受其控制。
通过感受态细胞的方法，将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(STRATAGENE制造)中。将该大肠杆菌铺到含有抗生素卡那霉素的LB培养基(1％蛋白胨(Difco制造)，0.5％酵母提取物(Difco制造)，1％氯化钠，1.5％琼脂)平板上，37℃培养过夜。挑选该平板上的大肠杆菌，获得成功导入来源于热纤梭菌的纤维二糖磷酸化酶基因的大肠杆菌。
通过分析所导入基因的序列，证实了所得大肠杆菌含有纤维二糖磷酸化酶基因。此外，通过活性测定证实了所得大肠杆菌表达纤维二糖磷酸化酶。
将该大肠杆菌接种到1L含有抗生素卡那霉素的LB培养液(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物(两者都由Difco制造)，1％氯化钠)中，37℃下120rpm震荡培养3小时。然后，在该培养基中加入IPTG至1.0mM，再在37℃振荡培养8小时。然后，将该培养物于5,000rpm离心5分钟，以收集大肠杆菌细胞。将所得的大肠杆菌细胞悬浮于含有1.4mM 2-巯基乙醇的50ml 50mM的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中。然后，用超声法破碎获得50ml破碎细胞液。该破碎细胞液含132U/ml纤维二糖磷酸化酶。
将该破碎细胞液在55℃加热20分钟。加热后，8,500rpm离心20分钟，以除去不溶性蛋白质等，得到上清。将所得上清加到预平衡的His-Tag吸附树脂Ni-NTA琼脂糖(QIAGEN生产)上，使纤维二糖磷酸化酶吸附到树脂上。将树脂用含有300mM氯化钠、20mM咪唑和1.4mM 2-巯基乙醇的缓冲液洗涤，以除去杂质。随后，将蛋白质用含有300mM氯化钠、150mM咪唑和1.4mM 2-巯基乙醇的缓冲液洗脱，得到重组纤维二糖磷酸化酶溶液。
(2.2制备重组马铃薯α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的方法)
将马铃薯α-1，4-葡聚糖磷酸化酶基因(Nakano et al.，Journal of biochemistry(Tokyo)106(1989)691)与选择标记基因Ampr一起整合到表达载体pET3d(STRATAGENE制造)中，获得质粒pET-PGP113。在该质粒中，α-1，4-葡聚糖磷酸化酶基因与异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子可操作连接并受其控制。通过感受态细胞方法，将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)(STRATAGENE生产)中。将该大肠杆菌铺到含有抗生素氨苄青霉素的LB培养基(1％蛋白胨(Difco制造)，0.5％酵母提取物(Difco制造)，1％氯化钠，1.5％琼脂)平板上，37℃培养过夜。挑选该平板上的大肠杆菌，获得成功导入马铃薯来源的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶基因的大肠杆菌。通过分析所导入基因的序列，证实了所得大肠杆菌含有葡聚糖磷酸化酶基因。此外，通过活性测定证实了所得大肠杆菌表达葡聚糖磷酸化酶。
将该大肠杆菌接种到1L含有抗生素氨苄青霉素的LB培养液(1％蛋白胨(由Difco制造)，0.5％酵母提取物(由Difco制造)，1％氯化钠)中，37℃于120rpm震荡培养3小时。此后，向该培养基中加入IPTG至0.1mM，向该培养基中加入维生素B6至1mM，在22℃继续震荡培养20小时。然后，将该培养物于5,000rpm离心5分钟，以收集大肠杆菌细胞。将所得的细胞悬浮于含有0.05％Triton X-100的50ml20mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7)中，然后，用超声破碎法破碎获得50ml破碎的细胞液。该破碎细胞液含有4.7U/ml葡聚糖磷酸化酶。
将该破碎细胞液在55℃加热30分钟。加热后，8,500rpm离心20分钟以除去不溶性蛋白质等，得到上清。将上清(含有125mg蛋白质)加到用平衡缓冲液(20mM磷酸缓冲液，pH7.0)预平衡的阴离子交换树脂Q-Sepharose上，使葡聚糖磷酸化酶吸附到树脂上。用含有200mM氯化钠的缓冲液洗涤树脂，除去杂质。随后，将蛋白质用含有300mM氯化钠的缓冲液洗涤，得到重组葡聚糖磷酸化酶溶液。
(实施例1-1-1-6：不同引物浓度下直链淀粉的合成)
将具有下表1所示组成的反应混合物在45℃孵育16小时以上，合成直链淀粉。
(表1)
表1
| No | 组成 | 重均分子量 | ||||
| 引物浓度(G4*1)(μM) | 纤维二糖浓度(％) | 磷酸浓度*2(mM) | CBP(U/g纤维二糖) | GP(U/g纤维二糖) | ||
| 实施例1-1 | 6,000 | 3 | 30 | 6.6 | 50 | 14,560 |
| 实施例1-2 | 3,000 | 3 | 30 | 6.6 | 50 | 22,920 |
| 实施例1-3 | 100 | 3 | 30 | 6.6 | 50 | 51,120 |
| 实施例1-4 | 75 | 3 | 30 | 6.6 | 50 | 136,100 |
| 实施例1-5 | 9.4 | 3 | 30 | 6.6 | 50 | 306,500 |
| 实施例1-6 | 2.4 | 3 | 30 | 6.6 | 50 | 461,200 |
*1G4：麦芽四糖
*2磷酸作为磷酸二氢钾-磷酸氢二纳缓冲液加入。磷酸盐缓冲液的pH为7.0。
反应后，根据前述1.4确定合成的直链淀粉的重均分子量。结果如表1所示。
结果，通过在磷酸存在的条件下进行使纤维二糖磷酸化酶(CBP)作用于纤维二糖产生葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖的反应，在同一溶液中在引物的存在下进行使葡聚糖磷酸化酶(GP)作用于葡萄糖-1-磷酸以将葡萄糖残基转移到引物上的反应，可以生产直链淀粉。此外，证实了通过改变反应溶液中引物的浓度，能随意地控制合成直链淀粉的聚合度，换句话说，当期望合成高分子量的直链淀粉时，可以使用较小量的引物，当期望合成低分子量的直链淀粉时，则使用较大量的引物。
(实施例2-1～2-5：不同纤维二糖磷酸化酶浓度下直链淀粉的合成)
将具有下表2所示组成的反应混合物(反应开始时)在45℃孵育16小时以上，以合成直链淀粉。
表2
| No. | 重均分子量 | 产量(％) | |||||
| CBP浓度(U/g纤维二糖) | 纤维二糖浓度(％) | 磷酸浓度*2(mM) | GP浓度(U/g纤维二糖) | 引物浓度(G4*1)(μM) | |||
| 实施例2-1 | 0.83 | 3 | 30 | 50 | 75 | 83,600 | 14.7 |
| 实施例2-2 | 1.65 | 3 | 30 | 50 | 75 | 91,080 | 20.7 |
| 实施例2-3 | 3.30 | 3 | 30 | 50 | 75 | 111,200 | 25.7 |
| 实施例2-4 | 6.60 | 3 | 30 | 50 | 75 | 129,900 | 33.8 |
| 实施例2-5 | 13.20 | 3 | 30 | 50 | 75 | 144,900 | 35.2 |
*1G4：麦芽四糖
*2磷酸作为磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液加入.磷酸盐缓冲液的pH为7.0。
反应后，根据前述1.3和1.4确定合成的直链淀粉的重均分子量和产量。结果如表2和图3所示。
结果发现，在达到纤维二糖6.60U/g之前，随着纤维二糖磷酸化酶量的增加，直链淀粉的产量增加，而当纤维二糖的浓度大于6.6U/g时，即使纤维二糖磷酸化酶的量增加，直链淀粉的产量增加减少。因此，发现纤维二糖磷酸化酶的优选浓度是6.60U/g纤维二糖。此外，由于合成直链淀粉的反应的产量最高能达到33.8％，因此，通过这些结果能够确认可以进行工业水平的直链淀粉生产。
(实施例3-1～3-5：不同磷酸浓度下直链淀粉的合成)
将具有下表3所示组成的反应混合物(反应开始时)在45℃孵育16小时以上，合成直链淀粉。
(表3)
表3
| No. | 组成 | 重均分子量 | 产量(％) | ||||
| 磷酸浓度*2(mM) | 引物浓度(G4*1)(μM) | 纤维二糖浓度(％) | GBP浓度(U/g纤维二糖) | GP浓度(U/g纤维二糖) | |||
| 实施例3-1 | 5 | 75 | 3 | 6.6 | 50 | 112,300 | 29.4 |
| 实施例3-2 | 15 | 75 | 3 | 6.6 | 50 | 110,200 | 32.2 |
| 实施例3-3 | 30 | 75 | 3 | 6.6 | 50 | 111,000 | 32.3 |
| 实施例3-4 | 45 | 75 | 3 | 6.6 | 50 | 91,360 | 24.6 |
| 实施例3-5 | 100 | 75 | 3 | 6.6 | 50 | 88,060 | 12.8 |
*1G4：麦芽四糖
*2磷酸作为磷酸二氢钾磷酸氢二钠缓冲液加入.磷酸盐缓冲液的pH为7.0。
反应后，根据前述1.3和1.4确定合成的直链淀粉的重均分子量和产量。结果如表3和图4所示。
结果发现，在磷酸浓度是15mM-30mM时，直链淀粉的产量是最高的，但由于直链淀粉在5-45mM磷酸时的产量没有显著变化，因此，在磷酸浓度为5-45mM时，直链淀粉都能有效地合成。
(实施例4-1-4-3：不同纤维二糖浓度下直链淀粉的合成)
把具有下表4所示组成的反应混合物(反应开始时)在45℃孵育16小时以上，合成直链淀粉。
表4
| No. | 组成 | 重均分子量 | 产量(％) | ||||
| 纤维二糖浓度(％) | 引物浓度(G4*1)(μM) | 磷酸浓度*2(mM) | GBP浓度(U/g纤维二糖) | GP浓度(U/g纤维二糖) | |||
| 实施例4-1 | 3 | 75 | 30 | 6.6 | 50 | 122,000 | 32.1 |
| 实施例4-2 | 6 | 150 | 60 | 6.6 | 50 | 110,200 | 30.3 |
| 实施例4-3 | 12 | 300 | 120 | 6.6 | 50 | 112,500 | 27.2 |
*1G4：麦芽四糖
*2磷酸作为磷酸二氢钾磷酸氢二钠缓冲液加入.磷酸盐缓冲液的pH为7.0。
反应后，根据前述1.3和1.4确定合成的直链淀粉的重均分子量和产量。结果如表4和图5所示。
结果，当纤维二糖浓度增加而不改变纤维二糖、引物和磷酸的浓度比例时，不发生由于纤维二糖浓度增加导致的对直链淀粉合成的抑制作用。因此，结果发现，为了合成大量的直链淀粉，可以增加纤维二糖的浓度。
(实施例5-1～5-4：使用葡萄糖异构酶或葡萄糖氧化酶、变旋酶和过氧物酶合成直链淀粉)
将具有下表5所示组成的反应混合物(反应开始时)在45℃孵育16小时以上，合成直链淀粉。
(表5)
表5
| 实施例No. | 组成 | 重均分子量 | 产量(％) | ||||||||
| 葡萄糖异构酶浓度(U/g纤维二糖) | 葡萄糖氧化酶浓度(U/g纤维二糖) | 变旋酶浓度(U/g纤维二糖) | 过氧物酶浓度(U/g纤维二糖) | 纤维二糖浓度(％) | 引物浓度(G4*1)(μm) | 磷酸浓度*2(mM) | GBP浓度(U/g纤维二糖) | GP浓度(U/g纤维二糖) | |||
| 5-1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 75 | 30 | 6.6 | 50 | 136,100 | 32.8 |
| 5-2 | 2.7 | 0 | 0 | 0 | 3 | 75 | 30 | 6.6 | 50 | 169,100 | 45.6 |
| 5-3 | 0 | 20 | 0.43 | 4.2 | 3 | 75 | 30 | 6.6 | 50 | 132,700 | 54.9 |
| 5-4 | 0 | 200 | 4.3 | 42 | 3 | 75 | 30 | 6.6 | 50 | 133,400 | 64.8 |
*1G4：麦芽四糖
*2磷酸作为磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液加入.磷酸盐缓冲液的pH为7.0。
反应后，根据前述1.3和1.4确定合成的直链淀粉的重均分子量和产量。结果如表5和图6所示。
结果发现，在反应系统中加入葡萄糖异构酶(GI)或葡萄糖氧化酶(GOx)+变旋酶(MT)+过氧物酶(Pox)能显著提高直链淀粉的产量。具体而言，当加入葡萄糖氧化酶(GOx)+变旋酶(MT)+过氧物酶(Pox)时，支链淀粉的产量是64.8％，大约是不加这些酶时产量(32.8％)的2倍。
认为产量的提高是因为：虽然纤维二糖磷酸解产生的葡萄糖抑制CBP和GP的反应，但通过GI或GOx降解葡萄糖而降低其相对浓度可以避免对CBP和GP的反应抑制问题。
(实施例6：含α-1，6分支的葡聚糖的合成)
将0.3g的纤维二糖和0.75微摩尔的引物(G4)溶解在10mL的30mM磷酸缓冲液中(pH7.0)，然后，加入根据上述2.1制备方法获得1.98U的重组纤维二糖磷酸化酶、根据上述2.2制备方法获得15U重组马铃薯α-1，4-葡聚糖磷酸化酶、根据日本特开平No.2000-316581实施例1中所述的方法制备aquifex aeolicus来源的1500U分支酶，制备成反应溶液，然后将该反应溶液在45℃孵育16小时。孵育完成后，向反应溶液加入等体积的乙醇以沉淀葡聚糖。进行离心以回收沉淀，将沉淀冻干，得到0.048g具分支结构的葡聚糖(产量大约是32％)。
(分析实施例6中获得的葡聚糖)
根据H.Takata et al.，Carbohydr Res，295，91-101(1996)所述的方法来确定实施例6中合成的葡聚糖是否具有分支结构，以及合成的葡聚糖的平均单元链长度。结果证实合成的葡聚糖具有分支结构，平均单元链长为11。这样发现在溶液中除了加入CBP和GP外再加入分支酶能从纤维二糖合成具分支结构的葡聚糖。
(实施例7：合成具环形结构的葡聚糖)
将0.3g的纤维二糖和0.75微摩尔的引物(G4)溶解在10mL的30mM磷酸缓冲液中(pH7.0)，然后，加入根据上述2.1制备方法获得的1.98U重组纤维二糖磷酸化酶、根据上述2.2制备方法获得的15U重组马铃薯α-1，4-葡聚糖磷酸化酶和1.5UThermus aquaticus来源的4-α-葡糖基转移酶，制备成反应溶液，然后将该反应溶液在45℃孵育16小时。应该注意的是Thermus aquaticus来源的4-α-葡糖基转移酶采用和前述2.2制备α-1，4-葡聚糖磷酸化酶同样的方法制备的，利用的是Thermusaquaticus来源的唯一已知的4-α-葡糖基转移酶DNA序列。
孵育完成后，向反应溶液加入等体积的乙醇以沉淀葡聚糖。进行离心，回收沉淀，并将沉淀冻干。得到0.05g具环形结构(环形葡聚糖)和线性结构(直链淀粉)的葡聚糖混合物(产量大约是33％)。
(分析实施例7中获得的葡聚糖)
当4-α-葡糖基转移酶作用于直链淀粉时，完全从直链淀粉剪切并合成环形葡聚糖，并保留比环形葡聚糖链长更短的直链淀粉。这样，可以根据T.Takaha，M.Yanase，H.Takata，S.Okada and S.M.Sumith：J.Biol.Chem，271，2902-2908(1996)中所述的方法对合成的环形葡聚糖的量进行测定。在该方法中，将溶液中的直链淀粉降解成葡萄糖单元，然后测定剩余的环形葡聚糖的量。测定结果证实形成了环形葡聚糖。此外，通过比较测定的环形葡聚糖和起始原料纤维二糖的量，环形葡聚糖的产量计算为9.6％。因此，发现实施例7中得到的葡聚糖中大约29％是环形葡聚糖，而剩余的71％是线性的直链淀粉。通过这种方式，发现：除了在溶液中添加CBP和GP外，进一步添加4-α-葡糖基转移酶可以从纤维二糖合成具环形结构的葡聚糖。
(参考实施例1：蔗糖磷酸化酶平衡时的产量)
为了研究蔗糖磷酸化酶(SP)平衡时的产量，在以G-1-P为起始物质时，获得了平衡时的产量。
首先将
终浓度为50mM的G-1-P；
终浓度为50U/ml的酶(SP)；
终浓度为50mM的受体(果糖)；
和终浓度为50mM的Tris-HCl(pH7.0)混合，在45℃孵育6小时或16小时，然后通过钼分析方法测定游离磷酸的浓度。从所得磷酸盐浓度根据下列公式计算，这种酶平衡时的产量：
平衡时的产量(％)
＝磷的浓度(mM)/50×100
结果如下表6所示：
(表6)
表6
| 酶 | 受体(50mM) | 平衡时产量(％) | |
| 6小时 | 16小时 | ||
| 蔗糖磷酸化酶 | 果糖(Fru) | 15.8 | 15.8 |
(参考实施例2：在磷酸存在下，偶联两种磷酸化酶时产物的产量)
在下列两种情况下获得反应物的产量：
(2-1)从纤维二糖生产蔗糖(CBP+SP+Fru)
(2-2)在GOx+MT+POx存在的情况下，从纤维二糖生产蔗糖(CBP+SP+Fru+GOx+MT+Pox)
首先，将终浓度为50mM的起始原料(纤维二糖)、终浓度为10、30或100mM的磷酸缓冲液(pH7.0)和终浓度为50U/ml的各种酶混合，在45℃反应16小时。反应完成后，用转化酶降解溶液，测定游离葡萄糖的浓度，从而获得蔗糖的浓度。在这两种反应体系中，蔗糖是产物。根据获得的蔗糖浓度，利用下列等式计算平衡时每个反应系统中的产量。
平衡时产量(％)
＝蔗糖浓度(mM)/(50m)×100
结果示于下表7：
(表7)
表7
| 没有GOx+MT+POx | 有GOx+MT+POx | ||
| 反应 | Pi浓度*1(mM) | 蔗糖产量(％) | 蔗糖产量(％) |
| 纤维二糖↓蔗糖 | 10 | 1.22 | - |
| 30 | 1.00 | 1.20 | |
| 100 | 1.50 | - | |
*1磷酸作为磷酸二氢钾-磷酸氢二纳缓冲液加入。磷酸盐缓冲液的pH为7.0。
结果，从纤维二糖合成蔗糖的反应产量极低，即使改变磷酸的浓度也是如此。此外，也尝试利用葡萄糖氧化酶、变旋酶和过氧化物酶除去反应系统中的葡萄糖来增加蔗糖的产量，但产量几乎没增加。
工业应用
根据本发明的方法，不能消化的β-1，4-葡聚糖(尤其是纤维素以及其部分降解的产物)能转化成可食用的食品。由于地球上大量存在的生物物质β-1，4-葡聚糖可以以低成本和高效率转化成α-1，4-葡聚糖，因此本发明也极大地有助于解决食品问题和污染问题。
如上所述，本发明利用本发明优选的实施方案进行了说明，但是本发明不应该理解成只限于这些实施方案。应该理解，本发明的范围只能通过权利要求来解释。应该理解，根据本发明的说明书和公知技术常识，本领域的技术人员可以实施与本发明特异优选实施方案的描述等价的范围。应该理解，本说明书中引用的专利、专利申请以及公开出版物都通过引用并入本文，就象其本身内容在本说明书中具体描述一样。
Claims (11)
1.从β-1，4-葡聚糖生产α葡聚糖的方法，包括：
使含有β-1，4-葡聚糖、引物、磷酸源、β-1，4-葡聚糖磷酸化酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶的溶液反应，以生产α葡聚糖。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的β-1，4-葡聚糖是纤维二糖，所述的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶是纤维二糖磷酸化酶。
3.根据权利要求1的方法，其中所述的β-1，4-葡聚糖是聚合度为3或更高的纤维寡糖，所述的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶是纤维糊精磷酸化酶。
4.根据权利要求1的方法，其中所述的β-1，4-葡聚糖是聚合度为3或更高的纤维寡糖，所述的β-1，4-葡聚糖磷酸化酶是纤维二糖磷酸化酶和纤维糊精磷酸化酶。
5.根据权利要求1的方法，其中所述的生产步骤还包括在生产所述的α-葡聚糖的同时，从所述的溶液中除去作为副产物产生的葡萄糖。
6.根据权利要求5的方法，其中所述的溶液还包含葡萄糖异构酶或葡萄糖氧化酶。
7.根据权利要求5的方法，其中所述的溶液还包含葡萄糖氧化酶和变旋酶。
8.根据权利要求7的方法，其中所述的溶液还包含过氧化氢酶或过氧化物酶。
9.根据权利要求1的方法，其中所述的磷酸源是无机磷酸、葡萄糖-1-磷酸，或无机磷酸和葡萄糖-1-磷酸的混合物。
10.根据权利要求1的方法，其中所述的磷酸源的浓度是1mM-50mM。
11.根据权利要求1的方法，其中所述的α-葡聚糖是直链淀粉。
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