CN1180380A - 植物中蔗糖磷酸化酶的表达 - Google Patents

Abstract

通过用一种基因的转化作用向植物引入蔗糖磷酸化酶活性,因为这种酶提高蔗糖水解速度,产生提高的淀粉,油和蛋白质水平。优选的基因来自变异链球菌。出人意料地实现在马铃薯块茎中转化以表达该基因,减小擦伤变色敏感性和提高淀粉在块茎中分布的均匀度。

Description

植物中蔗糖磷酸化酶的表达

基因工程中的最新进展提供了转化植物使之包含外来基因的必要手段。现在产生具有农业和作物加工重要性独特性质的植物已成为可能。肯定地说，一种有利特点是各种农作物中提高的淀粉和/或固体含量及品质。另一种有利特点是提高的各种农作物种子的油和蛋白含量。

蔗糖是自大多数植物源组织(source tissue)转运到吸收组织(sinktissue)的碳贮存单位。其在吸收组织中水解，并且这些成分过去常常建立其它的更复杂的贮存单位，主要是淀粉，蛋白质，和油。该水解最初伴随有产生UDP葡萄糖和果糖的蔗糖合成酶。UDP葡萄糖由UDP葡糖焦磷酸化酶转化成葡糖-1-磷酸。

各种农作物吸收组织的淀粉含量通过使用编码细菌ADP葡萄糖焦磷酸化酶的基因而被提高，参见PCT申请WO 91/19806(相当于U.S.登记号08/120703，Kishore，这里引入作为参考)。这种酶催化ADP葡萄糖自葡糖-1-磷酸的产生。也已经发现其在种子发育的某些阶段时表达能降低油含量，想必是因为原料转机为淀粉途径，伴随其油产生能力的降低。

在大规模生产，输送，和贮存马铃薯期间发现有马铃薯擦伤。最初发现该擦伤是块茎外皮区中的黑斑。擦伤可导致块茎质量的损失，消费者对马铃薯和马铃薯产品的接受力的降低，过度擦伤块茎的加工损失。已经发现有较高淀粉含量的马铃薯品种更易遭受擦伤。人们希望降低擦伤度或发生率，特别希望在提高块茎淀粉含量的同时降低擦伤度或擦伤发生率。

也希望淀粉和固体在马铃薯块茎中更均匀地分布。马铃薯的中心部或核心部一般比外部或外皮区有更低的固体含量。当从马铃薯块茎上切下纵向条块来做炸薯条时，这些薯条的中间部分比两端有更低的固体含量，当块茎中部切下薯条时该情况尤其明显。具有较低固体含量或具有较低固体含量区的薯条需要更长的烹饪时间以达到消费者接受的相同程度。较长烹饪时间可能导致较高固体含量薯条烹饪过度。较长的油煎时间也导致吸收更多的脂肪，因此低固体含量薯条和具有较低固体含量区的薯条会有更高脂肪含量。较高脂肪含量的油煎食品是较少营养的食品。在马铃薯薯条的制备中，纵横马铃薯块茎切下的条块和固体的不均匀分布会产生两端油炸过度而中间未熟透，且有较高脂肪含量(尤其是在中心部)的油煎食品产品。固体物质在马铃薯块茎中不均匀分布也导致在去皮过程中马铃薯固体(自外皮)不均衡的损失。

也希望番茄中有较高的固体含量，较高的可溶(通常是糖和酸)和不溶固体形式的固体含量有利于加工效率和产品的产量，产品如番茄沙司，酱，调味汁，和salsa。这些固体也对加工过的产品的味道和质地起作用。较高固体含量也对改善的新鲜番茄的味道起作用。

蔗糖磷酸化酶是一种催化葡糖-1-磷酸直接自蔗糖产生的微生物酶，在宽范围细菌和真菌种中已经发现了其活性，并且已经从一些细菌和真菌中分离出了这种酶(Pimental等，1992；Vandamme等，1987)。已经从土壤杆菌属(Fournier等，1994，这里引入作为参考)，变异链球菌，命名为gtfA的微生物(Russell等，Perry等)和肠系膜状明串珠菌，命名为spl的微生物(Kitao等，1992)中分离到了这种酶的基因。该基因在大肠杆菌中自变异链球菌的异源表达公开了美国专利4,888,170(Curtiss，1989)，这里引入作为参考。转化的微生物的应用是用作抗变异链球菌的疫苗。

提供一种改进的提高各种植物淀粉含量的方法是本发明的一个目的。提供一种降低油籽作物籽中蔗糖含量，导致降低不期望的碳水化合物如水苏糖和棉子糖的水平，同时增加用于油和蛋白质生产的碳的方法是本发明的又一个目的。提供在提供的所述方法中使用的新的DNA构建物是本发明的进一步的目的。提供具有更均匀分配于块茎中的提高的淀粉含量的马铃薯块茎是本发明的再一个目的。提供具有减小的受擦伤的敏感性的马铃薯块茎是本发明的又一个目的。提供改良的谷类作物，如玉米，稻，小麦和大麦也是本发明的又一个目的。

                      发明概述

本发明提供编码蔗糖磷酸化酶(SP)并用于在植物中产生提高的淀粉含量的DNA构建物。本发明的另一方面提供了具有降低水平的蔗糖和其它碳水化合物的种子，其将导致作为SP表达结果含量的提高的油和蛋白质含量。

在实施上述内容中，根据本发明的一个方面提供一种改变靶转基因植物碳水化合物含量的方法，包括下面步骤：

(a)向植物细胞基因组中插入重组双链DNA分子，其序列中

   包括：

  (i)在靶植物组织细胞中起作用的启动子，

  (ii)引起产生编码蔗糖磷酸化酶的RNA序列的结构DNA序列

  (iii)在植物细胞中起作用以引起转录终止和向RNA序列的3′

      末端加入聚腺苷酸化核苷酸的3′非翻译DNA序列；

(b)获得转化的植物细胞；和

(c)从转化的植物细胞再生基因工程转化的植物。

本发明的另一方面提供了一种重组双链DNA分子，其序列中包括

  (i)在靶植物组织细胞中起作用的启动子，

  (ii)引起产生编码蔗糖磷酸化酶的RNA序列的结构DNA序

      列，

  (iii)在植物细胞中起作用以引起转录终止和在RNA序列3′末

      端加入聚腺苷酸化核苷酸的3-非翻译DNA序列；

根据本发明的另一方面也提供了包含包括上述元件(i)，(ii)和(iii)的DNA的转化的植物细胞。又根据本发明的另一方面提供了分别在块茎中，果实和种子中具有提高了的淀粉含量的有区别的马铃薯，番茄和谷类植物，和种子中具有降低了的蔗糖和含有蔗糖的寡糖如水苏糖和棉子糖的有区别的油籽作物植物。

也提供了提高植物淀粉生产器官如马铃薯的块茎和谷物的种子中淀粉含量，降低油籽农作物如大豆和canola中蔗糖水平，产生提高的油和蛋白质含量的方法。在马铃薯中进行该方法时，出人意料地发现对块茎的质髓和外皮进行比较时淀粉更均匀地分布。本发明的另一方面提供了提供具有减小的对于擦伤的敏感性的马铃薯的方法。

吸收组织如马铃薯块茎中蔗糖磷酸化酶活性的另外的好处是涉及提供具有比K_m在50-300mM范围的植物蔗糖水解酶-蔗糖合成酶和转化酶低得多的K_m(1-25mM)的提高的新的蔗糖水解活性。这一优点在这种吸收组织的形成和强度方法非常重要，可能导致产量的增加。

                    发明的详细说明

以双链DNA形式存在的植物基因的表达涉及通过RNA聚合酶而从该DNA的一条链转录信使RNA(mRNA)，以及接下来的mRNA转录本在核中的最初加工。该加工涉及将聚腺苷酸化核苷酸加到RNA的3′末端的3′非翻译区。

DNA转录成mRNA通过一般称作为启动子的DNA区调控。该启动子区包含一段碱基序列其发出信号使RNA聚合酶与DNA结合用一条DNA链为模板引发mRNA转录以制备相应的RNA互补链。

文献中已经描述过一些在植物细胞中有活性的启动子。这些启动子包括胭脂氨酸合成酶(NOS)和章鱼碱合成酶(OCS)启动子(在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的癌诱发质粒上载有这些启动子)，花椰菜花叶病毒组启动子如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S和玄参花叶病毒35S-启动子，来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO，极高丰度的植物多肽)的小亚基的光诱导启动子，和叶绿素a/b结合蛋白基因启动子等等。所有这些启动子已经被用来产生各种类型的已经在植物中被表达的DNA构建物；参见，例如PCT公开WO84/02913(Rogers等，Monsanto)。

已知或发现引起DNA在植物细胞中转录的启动子可以在本发明中使用。这些启动子可以从多种来源如植物和植物病毒获得，而且包括但不限于增强的CaMV35S启动子和从植物基因如ssRUBISCO基因中分离的启动子。如下文所述，优选的是挑选出的特定启动子应该是能引起充分的表达以导致产生引起所需的淀粉含量增加的足够量的蔗糖磷酸化酶(SP)。另外，优选在植物的特定组织如根，块茎，种子，果实等中进行SP基因的表达，而且挑选的启动子应该具有所需组织和发育特异性。本领域技术人员应该理解引发所期望的淀粉含量的增加所需的蔗糖磷酸化酶的量可以根据植物类型而不同，而且过高的蔗糖磷酸化酶活性对植物有害。因此，启动子功能应该通过选择具有所期望的组织表达能力和大致的启动子强度的启动子，以及选择在靶组织中产生所期望的蔗糖磷酸化酶活性的转化物而优化。从转化子库中的挑选方法通常在异源结构基因在植物中的表达中使用，因为包含相同异源基因的转化物之间因为在植物基因组内的基因插入位点的不同而不同。(通常称作“位置效应”)。

优选的是在本发明双链DNA分子中使用的启动子在期望有提高的淀粉含量和/或干物质的组织中有相对高的表达，这样的组织如马铃薯植物的块茎，番茄果实，或玉米，小麦，稻和大麦的种子。通过组成型启动子，在所有或大部分植物组织中表达DNA分子的本发明双链DNA分子的表达很少是优选的，而且在某些情况下对植物生长可能是有害的。

I类马铃薯糖蛋白(patatin)启动子已经显示出既有高活性也有块茎特异性(Bevan等，1986；Jefferson等，1990)。一种块茎特异性I类马铃薯糖蛋白启动子1.0kb部分的序列优选用于本发明的块茎表达。已经公知一些有块茎特异性或增强的表达的其它基因，包括与马铃薯块茎ADPGPP基因，大和小亚基两者，(Muller等，1990)，蔗糖合成酶(Salanoubat和Belliard，1987，1989)，主要块茎蛋白质包括22kd蛋白质复合体和蛋白酶抑制剂(Hannapel，1990)，粒结合淀粉合成酶基因(GBSS)(Rohde等，1990)，和其它I类和II类马铃薯糖蛋白(RochSosa等，1989；Mignery等，1988)。其它预计在本发明中有用的启动子包括在马铃薯块茎中显示出增强的或特异性表达的启动子，这些启动子是通常与淀粉生物合成或修饰酶基因的表达相关的或者在马铃薯决茎中显示出不同表达模式的启动子。这些启动子的例子包括那些粒结合和其它淀粉合成酶，支化酶(Kossmann等，1991；Blennow，A.和Johansson，G，1991；WO92/14827；WO92/11375)，岐化酶(Takaha等；1993)，脱支酶，淀粉酶，淀粉磷酸化酶(Nakano等，1989；Mori等，1991)，果胶酯酶(Ebbelaar等，1993)，40kD糖蛋白，遍在蛋白，天冬氨酸蛋白酶抑制剂(Stukerlj等，1990)，羧肽酶抑制剂，块茎多酚氧化酶(Shahar等，1992，GenBank^登记号M95196和M95197)，推定的胰蛋白酶抑制剂和其它块茎cDNA(Stiekema等，1988)，以及β-淀粉酶和sporamms(来自Ipomoea batatas；Yoshida等，1992，Ohta等，1991)的基因的启动子。

另外，可以通过从马铃薯cDNA库中筛选选择性的或者优选在块茎中被表达的基因来鉴定启动子是块茎特异性的，然后确定获得块茎选择性或块茎增强的启动子的启动子区。

其它启动子也可以用来在特定组织如种子或果实中表达蔗糖磷酸化酶基因。β-伴大豆球蛋白(也已知为7S蛋白)是大豆中主要贮存蛋白的一种(Glycmemax)(Tierney，1987)。β-伴大豆球蛋白启动子或其它种子特异性启动子如napin和云扁豆蛋白启动子能用来在种子中特异地超量表达SP基因。这将导致种子蔗糖含量的降低，其结果导致不期望的寡糖的减少和可能的油和/或蛋白质含量的增加，而这正是用于生产油或蛋白质的种子如大豆，canola，油籽渣，葵花，红花等所期望的。SP基因将更快地提供更多的原料，而植物自身调节机理除受自异源基因产生的其它的酶的影响外将指导其在这些吸收组织中的运用。。

玉米醇溶蛋白是在玉米胚乳中发现的一组贮存蛋白。已经分离得到了玉米醇溶蛋白基因的基因组克隆(Pedersen，1982)，来自这些克隆的启动子，包括15kD，16kD，19kD，22kD，27kD和γ基因的启动子也可以用来在玉米和其它植物的种子中表达SP基因。已知在玉米中起作用的其它启动子包括下列基因的启动子：蜡质蛋白，脆质蛋白，收缩蛋白2，支化酶I和II，淀粉合成酶，脱支酶，油质蛋白，谷蛋白，和蔗糖合成酶。对于SP基因玉米胚乳表达的特别优选的启动子是来自稻的谷蛋白基因的启动子，更特别的是Osgt-l启动子(Zheng等，1993)。

如果想要增加玉米种子中的油而不是淀粉，可以选择在蓄集油期间引起SP基因表达的启动子。这样一种启动子在植物胚生成期间被激活。在胚胎发育期间活化的启动子的例子是来自球蛋白1基因的启动子和晚胚胎发育活性(lea)蛋白。

适于SP基因在小麦中表达的启动子的例子包括对于ADP葡糖焦磷酸化酶(APPGPP)亚基基因，粒结合和其它淀粉合成酶基因，支化酸和脱支酶基因，胚胎发育-高丰度蛋白基因，麦醇溶蛋白基因，麦谷蛋白基因的那些启动子。稻中这样的启动子的例子包括对于ADPGPP亚基基因，粒结合和其它淀粉合成酶基因，支化酸基因，脱支酶基因，蔗糖合成酶基因，谷蛋白基因的那些启动子。特别优选的启动子是对于稻谷谷蛋白，Osgt-l的启动子。这种对于大麦的启动子的例子包括对于ADPGPP亚基基因，粒结合和其它淀粉合成酶基因，支化酸基因，脱支酶基因，蔗糖合成酶基因，大麦醇溶蛋白基因，胚胎球蛋白基因，以及糊粉特定蛋白基因的那些启动子。

番茄果实的固体含量能通过表达在果实特异启动子后面SP基因而提高。来自2A11基因组克隆(Pear，1989)的启动子将控制ADP葡糖焦磷酸化酶在番茄果实中的表达。E8启动子(Deikman，1988)也将在番茄果实中表达SP基因。另外，在番茄绿果期起作用的启动子公开于1994年6月27日，指定美国的PCT申请PCTUS94/07072中，这里引入作为参考。它们被命名为TFM7和TFM9。TFM7是从番茄中分离到的，大约2.3kb，其中1.4kb的3′末端如SEQ ID NO：3所示的DNA片段。TFM9是大约900bp，其中400bp的3′末端如SEQ ID NO：4所示的DNA片段。

现在也已知马铃薯块茎启动子将在番茄植物中起作用以引起导入基因的果实特异性表达(参见美国登记号08/344,639，Barry等，1994年11月4日申请，这里引入作为参考)。这样的启动子包括马铃薯糖蛋白启动子，马铃薯ADPGPP启动子，和马铃薯颗粒结合淀粉合成酶启动子。对于番茄果实表达特别优选的启动子是编码马铃薯中ADPGPP小亚基基因的启动子。

根组织的固体含量可通过表达在根特异性启动子之后SP基因而提高。来自酸性壳多糖酶基因(Samac等，1990)的启动子将在根组织中表达SP基因。在根组织中的表达也可以通过使用已经鉴定的CaMV35S启动子(Benfey等，1989)的根特异性亚结构域而实现。

通过本发明DNA构建物产生的RNA也可以包含5′非翻译前导序列。该序列能从被选择来表达该基因的启动子衍生，并且能被特异性地修饰以使增加mRNA的翻译。5′非翻译区也能从病毒RNA，从适当的真核基因，或者从合成基因序列获得。本发明不局限于其中该非翻译区是从伴随启动子序列的5′非翻译序列衍生的如下列实施例中存在的构建物。而且，该非翻译前导序列可以从如上文所讨论的不相关的启动子或编码序列衍生。导向信号序列

提高蔗糖水解速率的另一种方法是使SP导向非原质体。为此需要在功能蛋白质的N′末端上需要的信号肽。编码该信号肽之序列的优选例子是来自PR-1B蛋白(Ohshima等，1990)的植物内质网信号序列。因此SP在非原质体中将是有活性的，且使蔗糖胞外水解，并使将葡萄糖更快运送到细胞中。

另一种可替代的方法是使SP导向液泡区。SP对于植物细胞的导向需要除该信号肽(Nakamura和Matsuoka，1993)之外的信息。一种早期前信号肽可能会与FT的氨基末端融合以使该酶导向液泡(Sonnewald等，1991)。或者，羧基末端序列延伸端可能与ER信号序列结合而使该酶导向该液泡。蔗糖磷酸化酶

这里所使用的术语“蔗糖磷酸化酶”是指催化蔗糖和无机磷酸向α-D-葡糖-1-磷酸和D-果糖可逆转化的一种酶。它可以从很多微生物源分离到，包括变异链球菌，巴斯德氏固氮梭状芽孢杆菌(Clostridium pasteurianum)(Vandamme等，1987)，嗜糖假单孢菌(Pseudomonas saccharopyhila)(Silverstein等)，腐败假单孢菌(Pseudomonas putrifaciens)，出芽茁蕾(Pullularia pullulans)，木质醋杆菌(Acetobacter xylinum)(Vandamme等，1987)，土壤杆菌(Fournier等，1994)和肠系膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。

SP酶的基因可以通过已知方法获得，而且已经从几种生物体如肠系膜状明串珠菌(Kitao等，1992)和土壤杆菌(Fournier等，1994)中获得。来自变异链球菌(S.mutans)的基因已经在大肠杆菌(E.coli)中表达出来(Robeson等，1983，鉴定活性是糖基转移酶)。从变异链球菌中分离基因在下面的实施例中说明。其序列如SEQ ID NO：5所给出。该基因可以作为分离物将其插入到适于下面描述的选择的转化方法的植物表达载体中。

编码SP的基因(ORK 488)已经在Agrobacterium vitus(以前是根癌土壤杆菌生物型3)的Ti质粒中鉴定出来。相关的序列已报道在其它根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)菌株的Ti质粒中，特别是在pTiC58(Fournier等，1994)中。可能的是编码SP的基因可能会在所有这样的质粒上发现。

已经证明了SP酶从其它细菌和真菌源的纯化(如上所述)。得到这些材料使得接下来的克隆这种酶的基因变得容易：该蛋白质可以用作免疫原来产生可以用来鉴定以表达为基础的库如λgt11中的克隆的抗体(Sambrook等)这些蛋白质的N-末端的肽序列可以通过常规的蛋白质序列测定而获得；和根据已确立的有限蛋白水解方法，也可以确定内部区域的序列。这些序列可以用于设计可以用来从克隆库中鉴定基因或者扩增来自源生物体的RNA，cDNA或DNA制剂中基因或其部分的核苷酸探针或引物。检测包含蔗糖磷酸化酶克隆的E.coli通过在以蔗糖为唯一碳源的基本培养基中生长也是可能的(Ferretti等，1988)。

其它使用SP水解蔗糖的微生物可以通过检测能使用蔗糖为唯一碳源的生物体而发现(Russell等)。该蛋白质可以通过使用已知方法根据级分中酶的活性而被分离。之后，编码该蛋白的基因能如刚说明的而被分离出来。

因此，很多不同的编码具有蔗糖磷酸化酶活性的蛋白质的基因可以分离出来并在本发明中使用。聚腺苷酸化信号

嵌合植物基因的3′非翻译区包含在植物中起作用引起向RNA的3′末端加入聚腺苷酸化核苷酸的聚腺苷酸化信号。合适的3′区的例子是(1)包含土壤杆菌癌诱导(Ti)质粒基因如胭脂氨酸合成酶(NOS)基因的聚腺苷酸化信号，和(2)植物基因，象大豆贮存蛋白基因，和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚基(ssRUIBSCO)基因。优选的3′区的例子是来自豌豆的ssRUFBISCO基因的3′区，也已知为E93′区。合成的基因构建物

来自变异链球菌的SP基因有高A+T含量，这可能对在植物细胞中的高水平表达是不利的，但如下文所述，该基因在足以正影响淀粉含量的水平上表达。如果需要，SP基因的基因序列以一种可以提高表达的方式在不改变蛋白质序列情况下改变。这样在转化植物中实现更大正影响淀粉含量。在基因序列中进行变化的原则在WO90/10076(Fischh off等)公开。这里列出的用下述原则合成的基因可以如下所述引入植物中而导致更高水平SP酶的表达。这可能对单子叶植物如玉米，稻，小麦和大麦特别有用。与其它转基因组合

SP在转基因植物中的作用能通过将其与正影响淀粉/或油含量的其它基因组合而增加。例如，提高植物中ADP葡糖焦磷酸化酶(ADPGPP)活性的基因可以与SP基因结合使用以增加淀粉。这样的ADPGPP基因包括E.coli glgC基因和其突变体glgC16。WO91/19806公开了怎样为了增加淀粉和/或固体而将该基因引入众多植物物种中。

另一种能与SP组合以增加淀粉的基因是能从植物中获得的蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因。WO92/16631公开了一种这样的基因及其在转基因植物中的应用。

另一种能与SP结合以增加油的基因是可以从植物获得的乙酰CoA羧化酶基因。WO93/11243公开了一种这样的基因。植物转化/再生

通过实施本发明而使具有提高的多糖(例如淀粉)含量的植物包括但不限于玉米，小麦，稻，番茄，马铃薯，甘薯，花生，大麦，棉花，草莓，木莓，和木薯。通过实施本发明而使具有改变的碳水化合物含量的植物包括但不限于玉米，小麦，稻，番茄，马铃薯，甘薯，花生，大麦，甘菜，甘蔗，苹果，梨，桔子，葡萄，棉花，草莓，木莓，和木薯。通过实施本发明而使具有减少的擦伤变色的植物包括但不限于小麦，马铃薯，甘薯，大麦，甜菜，甘蔗，苹果，梨，桃，桔子，葡萄，香蕉，大蕉和木薯。通过实施本发明而使具有改良的均匀固体含量的植物包括但不限于马铃薯，甘薯，香蕉，木蕉和木薯。通过实施本发明而使具有收获物质提高的产量的植物包括但不限于玉米，小麦，稻，番茄，马铃薯，甘薯，花生，大麦，甜菜，甘蔗，苹果，梨，桔子，桃，香蕉，大蕉，葡萄，棉花，草莓，木莓，和木薯。能使其减少蔗糖而导致提高的油或蛋白质含量的植物包括大豆，玉米，canola和向日葵。

包含SP基因的本发明双链DNA分子能通过任何合适的方法插入到植物的基因组中。合适的植物转化载体包括从根癌土壤杆菌Ti质粒衍生的那些载体，以及例如由Herrera-Estrella(1983)，Bevan(1984)，Klee(1985)和EPO公开120516(Schilperoort等)公开的那些载体。除了自土壤杆菌Ti或根诱导(Ri)质粒衍生的植物转化载体外，能使用其它方法将本发明DNA构建物插入到植物细胞中。这样的方法可以包括，例如，使用脂质体，电穿孔，增加游离的DNA摄入的化学品，通过微粒轰击的游离DNA运送，和使用病毒或花粉的转化作用。

适于使用微粒轰击而将SP基因引入单子叶植物的质粒表达载体由下列组成：对于在单子叶植物淀粉贮存组织，一般为胚乳中的表达是特异的或增强的启动子，如在玉米胚乳中发现的对于玉米醇蛋白溶基因的启动子(Pedersen等，1982)，提供有利于基因表达的剪接位点的内含子，如Hsp70内含子(PCT公开WO93/19189)；和一个3′聚腺苷酸化序列，如胭脂氨酸合成酶3′序列(NOS3′Fraley等，1983)。该表达盒可以在适于产生大量DNA的高拷贝复制子上装配。

用于双子叶植物转化的特别有用的土壤杆菌为基础的植物转化载体是质粒载体pMON530(Rogers，S.G.1987)。质粒pMON530是通过将pMON316(Rogers，S.G.，1987)的23kb Stu I-Hind III片段转移入pMON526而制备的pMON505的衍生物。质粒pMON526是其中通过用XmaI消化，用Klenow聚合酶处理并连接而去除了SmaI位点的pMON505的一种单一衍生物。质粒pMON530保留了pMON505的所有性质和CaMV35S-NOS表达盒，并且现在在启动子和聚腺苷酸化信号之间包含一特定的Smal酶切位点。

双元载体pMON505是一种pMON200(Rogers，S.G.，1987)的衍生物，其中Ti质粒同源区，LIH，已用小RK2质粒pTJS75(Schmidhauser&Helinski，1985)之SmaIHind III片段替代。该片段包含复制RK2起点，oriV，和转移起点，oriT用于使用三亲株接合方法(Horsch&Klee，1986)接合到土壤杆菌中。质粒pMON505保留了pMON200的所有重要特性，包括用于插入所需DNA片段的合成的多接头，植物细胞中卡那霉素抗性的嵌合的NOS/NPTII/NOS基因，在E.coli和根癌土壤杆菌中选择的壮观霉素/链霉素抗性决定簇，有利于在子代中评价转化子和遗传的完整的胭脂氨酸合成酶基因，和易于在E.coli中制备大量载体的pBR322复制起点。质粒pMON505包含自pTiT37胭脂氨酸型T-DNA右端衍生的一个单一的T-DNA边缘。Southern分析表明质粒pMON505和其载有的任何DNA被整合到植物基因组中，即整个质粒是被插入到植物基因组中的T-DNA，整合了的DNA的一端位于右边缘序列和胭脂氨酸合成酶基因之间，而另一端位于该边缘序列和pBR322序列之间。

另一个特别有用的Ti质粒盒载体是pMON-17227。Barry等在WO92/04449(对应于U.S.S.N.07/749,611，这里引入作为参考)中描述了该载体，该载体包含编码使具有草甘膦抗性的基因(命名为CP4)，该基因对于植物，包括马铃薯和番茄，是极好的选择标记基因。该基因与Arabidopsis EPSPS叶绿体转运肽(CTP2)融合，并且从如这里所描述的FMV启动子表达。

当获得了合适数目的包含SP基因或cDNA的细胞(或原生质体)时，这些细胞(或原生质体)再生成整个植物。选择再生步骤的方法并不苛刻，有适合来自豆科(苜蓿，大豆，三叶草等)，伞形科(胡罗卜，芹菜，欧洲防风)，十字花科(卷心菜，小罗卜，carnola/油菜子等)，葫芦科(甜瓜和黄瓜)，禾本科(小麦，大麦，稻，玉米等)，茄科(马铃薯，番茄，烟草，胡椒)的宿主，各种开花作物，如向日葵，和生长坚果的树，如巴旦杏，槚如坚果，胡桃，和美洲山核桃的合适的方法。参见，例如Ammirato，1984；Shimamoto，1989；Fromm，1990；Vasil，1990；Vasil，1992；Hayashimoto，1989；Shimamoto，1989；和Datta，1990。

提供下面的实施例以更好地阐述本发明的实施而不应该在任何方面限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解不脱离本发明的精神和范围可以对这里所描述的方法和基因进行各种改变，取舍等。实施例实施例1

所有基础的DNA操作如PCR，琼脂糖电泳，限制性酶消化，连接，和E.coli转化都根据Sambrook等人的描述的标准方法进行。

通过PCR扩增从变异链球菌细胞产生蔗糖磷酸化酶基因，gtfA。用5′寡核苷酸5′CCCGGATCCATGGCAATTACAAATAAAAC(SEQ ID NO：1)和3′寡核苷酸5′GGGGAGCTCACTCGAAGCTTATTGTTTGATCATTTTCTG(SEQ IDNO：2)扩增该基因。PCR循环条件如下：94℃，3′；55℃，2′；22℃，2′(5个周期)；94℃，1’；55 ℃，2′；72℃，2′(30个周期)。1462bpPCR产物用Gene Clean纯化系统(Bio101，Vista，California)纯化，用BamHI和SacI消化，并与pUC119的BamHI和SacI位点连接。连接过的DNA转化到JM101，并使用蓝-白筛选来鉴别用于质粒制备和限制性酶消化的菌落。用Hind III消化来筛选包含gtfA基因的转化物。筛选具有正确限制性酶切方式的克隆用于通过利用蔗糖为唯一碳源的性能而进行的表型表达如下：将克隆转化到gal-E.coli菌株，SK1592，并在含有棉子糖(其被吸收并水解成半乳糖和蔗糖)的基础培养基上生长，鉴定有活性克隆并命名为pMON17353。

构建表达盒以使在植物中组成型表达gtfA。通过用BglII和SacI的限制性酶切消化而从pMON999(Rogers等，1987a)制备包含有增强的35S启动子(Kay，R.1987)，胭脂氨酸合成酶3′区(Bevan，M.1984)，和pUC载体骨架的片段。通过用BamHI和SacI限制性酶切消化而从pMON17353制备包含gtfA编码区的片段。正确的片段用琼脂糖凝胶电泳分离并用Gene Clean方法纯化。该片段被连接转化到E.coliJM101，并通过用NotI限制性酶切筛选推定的重组体质粒。鉴定一个克隆并命名为pMON17359。

构建第二个表达盒来指导马铃薯块茎中gtfA的表达。通过用BamHI和SacI的限制性酶切从中间体载体制备包含马铃薯糖蛋白1.0启动子(如上所述)，胭脂氨酸合成酶3′区，和pUC载体骨架的片段。也构建了表达盒来指导番茄果实的gtgA的表达。通过用BglII和SacI的限制性酶切从由pMON999衍生但包含TFM7启动子的pMON16987(PCT申请PCTUS94/07072，1994年6月27日申请)制备包含TFM7启动子，胭脂氨酸合成酶3′区，和pUC载体骨架的片段。正确的片段用琼脂糖凝胶电泳分离并用Gene Clean方法纯化。这些片段的每一个与来自pMON17353的BamHI和SacI片段连接。如上所述转化和筛选克隆。指定为正确的克隆并命名为pMON17356(Pat1.0/gtfA/NOS)pMON17389(TFM7/gtfA/NOS)。

构建第三个表达盒来指导用马铃薯糖蛋白3.5kb启动子自质粒pBI240.7(Bevan等，1986)获得。从pBI240.7，从Hind III位点(在～-3500)至在-337的XbaI位点，切除大部分3.5启动子，并与剩余的启动子结合，从XbaI位点至在+22的BgIII位点(前面为DraI位点)，以三连接方式进入提供BglII位点形成pMON17280的载体。通过用BamHI/SacI消化pMON17353，并将该片段插入到pBS而制备中间体载体。然后用EcoRI和SacI消化该载体。用EcoRI和SacI消化pMON17280产生包含马铃薯糖蛋白3.5启动子，胭脂氨酸合成酶3′区，和pUC载体骨架的片段。用琼脂糖凝胶电泳和Gene Clean方法获得正确大小的片段。这些片段被连接转化到E.coli JM101，并通过用Hind III限制性酶切筛选。选定正确的一个克隆并命名为pMON17495。

在pMON17356，pMON17359，pMON17389，和pMON17495中，能在NotI限制片段上分离启动子，gefA基因和Nos3′区。然后这些片段能插入到载体pMON17227(如上所述)或pMON17320的单一的NotI位点来构建草甘膦选择性植物转化载体。pMON17320是也包含P马铃薯糖蛋白1.0/(TP1-glgC16盒的pMON17227的衍生物。如Kishore在WO91/19806中所述，CTP1-glgC16融合物编码修饰的ADP葡糖焦磷酸化酶。通过gtfA基因和来自pMON17356的3′区与-2.0kb马铃薯小ADP葡糖焦磷酸化酶亚基基因启动子在植物转化载体中结合(参见美国登记号08/344639，Barry等，1994年11月4日，这里引入作为参考)以生成pMON17486也构建了用于GtfA的番茄表达的载体。

通过用NotI消化，接着用牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)处理而制备载体DNA。通过用NotI消化，琼脂糖凝胶电泳和Gene Clean纯化来制备包含gtfA的片段。载体和插入DNA被连接转化到E.coli菌株LE392，用限制性酶切消化筛选转化物以鉴定包含有gtfA表达盒的克隆。从gtfA盒的转录是和自可选择标记物的转录是相同方向的克隆被指定为正确的，并命名为pMON17357(FMV/CP4/E9，Pat1.0/gtfA/NOS)，pMON17358(Pat1.0/CTP1-glgC16/E9，Pat1.0/gtfA/NOS，FMV/CP4/E9)，pMON17360(FMV/CP4/E9，E35S/gtfA/NOS)，pMON17390(FMV/CP4/E9，TFM7/gtfA/NOS)，pMON17392(Pat1.0/CTP1-g/gC16/E9，TFM7/gtfA/NOS，FMV/CP4/E9)和pMON17496(FMV/CP4/E9，Pat35/gtfA/NOS)。

构建转化载体来指导gtfA在玉米种子中的表达。通过限制性酶切消化，琼脂糖凝胶电泳，和Gene Clean而制备包含谷蛋白启动子Osgt-1，Hsp70内含子(如上所述)，胭脂氨酸合成酶3′区，卡那霉素抗性，和pUC骨架的片段。通过用NcoI和NotI的限制性酶切消化而从pMON17359制备包含gtfA编码区的片段。该片段被连接，转化，并用限制性酶切消化筛选。鉴别正确的克隆并命名为pMON24502(Osgt1/Hsp70/gtfA/NOS)。

构建转化载体以指导gtfA在油籽作物种子中的表达。将pMON17353的BamHI-EcoRI片段连接到中间体载体的BgIII-EcoRI位点，得到将gtfA置于7s启动子之后的pMON26104(如上所讨论的)，并使用E93′终止剂序列。包含FMV启动子，CTP2和草甘膦抗性基因的融合序列，Nos 3′序列的NotI片段被连接到pMON26104的NotI位点，得到pMON26106，一种有两个相同取向盒的双边缘植物转化载体。实施例2

用Barry等在WO94/28149中对于转化系的草甘膦选择性所说明的方法将载体pMON17357转化到Russet Burbank马铃薯愈伤组织。可获得很多品系，并在田间试验中评估。该试验的结果见表1。可以看出，在一些品系中鉴定出含有较高淀粉水平(以总固定测量)，其中一些有降低的擦伤性。

              表1

          固体(％) 擦伤系数品系鉴定    平均值   平均值对照          21.9    3.399

1           22.9    3.798

3           22.2    3.479

4           23.3    2.899

6           21.8    2.798

8           22.7    2.979

11          21.6    2.968

12          22.0    3.383

14          22.3    3.218

15          22.7    2.979

17          22.3    3.394

18          21.7    3.394

19          22.4    3.213

22          22.7    3.503

对12种品系的块茎试验了质髓或外皮之间淀粉分布中的变化。通过将块茎剥皮，将其切成象炸薯条的条，用盐水浮选比较试验测量固体。从外皮薯条的平均固体水平减去质髓薯条的平均固体水平。比对照物(在该试验中为4.61％)小的固体含量之差是非常期望的块茎中淀粉更均匀分布的表征。结果见表2。如所见到的，12个品系中有10品系减小了质髓和外皮之间固体含量的差别。

       表2

品系    固体差异(％)

对照    4.61

3       4.53

4       4.16

6       3.57

8       3.20

11      3.94

12     4.39

14     4.67

15     3.56

17     2.61

18     3.79

19     5.19

22     3.92

田间第二年对这些品系中的五个进行了试验，其中四种是多区域试验(第8号品系只在一个地方试验)。这五种品系中固体的绝对增加再次证明每种品系中淀粉含量的提高。结果见表3。

     表3

品系    固体增加

1       0.256

4       0.856

8       2.61

15      0.211

22      0.162实施例3

gtfA在玉米中的表达产生了新的催化活性，其可能有利于通过产生较陡的浓度梯度而使蔗糖进入到胚乳中并保存能量，因为通常需要1摩尔的ATP的当量将蔗糖转化为己糖加己糖磷酸。通过用两种不同类型的用于转化的胚发生愈伤组织，用微粒轰击而将载体pMON24502引入到玉米细胞中。用(1)包含增强的35S启动子选择盒，Hsp70内含子，卡那霉素抗性的NPTII编码序列，和nos3′序列的pMON19476或者(2)包含两个草甘膦抗性的选择盒的pMON19336，其中每一选择盒使用了稻肌动蛋白启动子和Hsp70内含子，但一个使用编码草甘膦氧化酶基因而一个使用CP4草甘膦抗性基因，用(1)或(2)之一共转化。

(1)如EP586355 A2所述分离不成熟的玉米胚(H99表型)。如Duncan等(1985)所述在称为培养基D的培养基上将不成熟的胚培养大约两星期而获得胚发生胼底体。两星期后得到愈伤组织(I型)，并通过每2-3星期在新鲜培养基D上继代培养而保持。轰击前大约4小时，将生长旺盛的愈伤组织(中间继代培养周期)置于培养基D上，加入甘露糖醇和山梨糖醇用于渗透预处理。用包被有pMON24502和pMON19476的粒子轰击后大约16-24小时，将组织置于没有甘露糖醇和山梨糖醇的培养基D上。大约两天后，将组织转移到含有巴龙霉素的培养基D上。以大约三星期的间隔将抗性组织转移到有巴龙霉素的新鲜培养基D上。在培养基D上用6-苄基氨基嘌呤(没有二氯甲氧苯酸)进行3-6天“脉冲”，接着置于没有激素的MS培养基上而实现植物再生。

(2)根据Dennehy等1994年的方法使用自“Hi-II”表型的不成熟的胚产生的II型愈伤组织。在用pMON24502和pMON19336轰击前在含有0.4M甘露糖醇+山梨糖醇(每份为0.2M)的N61-100-25培养基上预处理II型愈伤组织4小时，并在轰击后置于相同培养基上16-24小时。然后将组织转移到没有加甘露糖醇或山梨糖醇的N61-100-25培养基上。用N61-0-25培养基(不含有酪蛋白氨基酸)中的1-3mM草甘膦进行选择。

通过每一方法和它们的种子试验得到了多产的玉米植物。通过蛋白质印迹分析，用抗E.coli-表达的gtfA的山羊抗体证明了gtfA基因的表达。筛选出用于表达的16个品系中，9个品系显示出以总细胞蛋白质的大约0.05至0.5％表达gtfA。体外用已先前公开的(Felker等，1990)糖进食分析测定表达GtfA(蔗糖磷酸化酶)的玉米胚乳组织中的淀粉合成速率。用PCR筛选田间生长植物来鉴别正和负分离子。来自两个GtfA转化的品系(Know(和De)的正的和对照穗在授粉后20至22天，在线性谷粒饱满时收获。回收胚乳部分并浸入50和200mM浓度的¹⁴C-蔗糖。200mM浓度是生理上最相关的，但是因为GtfA的K_m对于蔗糖比内源酶更低，因此使用较低浓度(50mM)来提高测定来自GtfA的作用的可能性。在给与¹⁴C之后1和2小时取时间点并测定渗入到淀粉级分中的放射性。两个品系的结果总结在下面的表中(以结合到淀粉级分中的平均数来报道数据)：

表4A：用50mM蔗糖处理

取样时间    对照物    Konwl

1hr         9033      20895

2hr         15947     26695

            对照物    De

1hr         10909     10860

2hr         19193     24284

表4B：用200mM蔗糖处理

取样时间    对照物    Konwl

1hr         9880      12980

2hr         11175     21407

            对照物    De

1hr         7703      7471

2hr         11038     13007结果证明表达GtfA的玉米胚乳组织能以比对照物更快的速率(两倍)产生淀粉。淀粉产生速率的不同在较低底物浓度时更为明显，可能是因为GtfA和内源蔗糖合成酶之间底物动力学的差异。比较De系和Knowl系中的效果时也注意到了差异，Knowl有更大的正效果。GtfA表达在Knowl中非常高，以总蛋白质的0.5％的范围，而De中GtfA表达是在0.05％的范围。淀粉生物合成速率的差异可能是GtfA表达水平的函数。实施例4

载体pMON26106通过土壤杆菌的转化作用(Hinchee等)而引入到canola和大豆愈伤组织中。用草甘膦选择转化的细胞并再生到整个植物中后，分析这些植物产生的种子。实施例5

载体pMON24502通过微粒轰击而引入小麦细胞。如Vasil等(1993)所述分离不成为小麦胚乳。通过在含有大约40g/l麦芽糖和大约2mg/(2，4-D的改变的MS培养基上将不成熟胚乳培养4-7天而获得胚发生愈伤组织。用包被pMON24502和含有双丙氨酰膦抗性基因的质粒的微粒轰击该愈伤组织。轰击一天后，将不成成熟胚乳转移到含有选择剂双丙氨酰膦的生长培养基上，在生长和选择培养基上生长7天后，将不成熟胚乳衍生的愈伤组织转移到含有双丙氨酰膦的茎产生培养基(没有2，4-D的改变的MS培养基)中并生长28-40天。进行PCR测定证明茎中存在gtfA基因。包含gtfA基因的茎会生根并长到土壤中。当收获转化的植物并使生长至成熟时，它们的种子显示出提高的淀粉水平。实施例6

载体pMON24502可以通过微粒轰击而引入到稻细胞中。再生和选择后，对转化的植物测试gtfA基因的表达，证实有高表达作用的那些植物生长至成成熟。成熟植物的种子会具有提高的淀粉含量。

本说明书中提到的所有公开物和专利在这里引入作为参考，而每一个公开物或专利具体而各别地作为参考而引入。

如上所述可以看出很好地使用本发明以获得具有明显优点且为本发明所固有的上文一起所提出的所有结果和目的。

应该明白一些性质和进一步的结合是有用的，而且可以不用参考其它性质和进一步的结合而实施。这些都由本发明范围所包括或在本发明范围内。

因为不超出本发明范围可以进行很多的可能的实施方案，所以应该明白这里提出的所有事物或附图中所示的事物都是为详细说明而不意味限制本发明。

                   参考文献目录Ammirato，P.V.，等《植物细胞培养手册-作物品种》(Handbook of

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序列表(1)总说明：(i)申请人：

  (A)名称：Moneanto公司

  (B)街道：800 North Lindbergh Boulevard

  (C)城市：St.Louis

  (D)州：Missouri

  (E)国家：美国

  (F)邮编：(ZIP)63167

  (G)电话：(314)694-3131

  (H)电传：(314)694-5435(ii)发明名称：植物中蔗糖磷酸化酶的表达(iii)序列数目：5(iv)计算机可读形式：

  (A)介质类型：Floppy盘，

  (B)计算机：IBM PC兼容

  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

  (D)软件：Patentln Release#1.0，Version 1.30(EPO)(vi)优先权数据：

  (A)申请号：US08/386，860

  (B)提交日期：10-FEB-1995(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：

  (A)长度：29个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链数：单链

  (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它的核酸

  (A)说明/desc＝“合成的DNA”  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CCCGGATCCA TGGCAATTAC AAATAAAAC                                                 29(2)SEQID NO：2的信息：(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明/desc＝合成的DNA(xi)序列描述：SEQID NO：2：GGGGAGCTCA CTCGAAGCTT ATTGTTTGAT CATTTTCTG                                      39(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1478个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO 3：AGCCTTGTGT TAGGGGGTAT TCAAACCTTC TTTGACTGAA AATTTTATTA TTTATACATG               60TTTAAAATTA CTTTTTAATC TATATATAAT AGATATCAAT CCTTCATTTA ATTGTATTTT               120TGTATTAATT CTATAAATAT TAAATTACTT TATTAAAAAT TCTAATTCTG TCACTCGTCA               180TTTCATAATA TTCTTGACGG TGATGGTAGT GATAATTACG TTGATTGGAG CCACATGGGC               240CGCTACTTTT TAAAAGGATG AACCTTGGAA TGTAGTGAAT GTTGAGTCTC ATAGCTCACT   300CACGGACTCA ACAGCAAAAT CTGTCCTCTT TTTCCCTTCT CCAATTCACA TACTGTCACT   360TGGACAAATA ATATTTGAAA ATTTTGGCCT AAAGTTAGGT TTGGAGCCGT ATGGTAATTT   420GATACACAAA TTATTATATA ATTGATATAT CAGGTATATA TATCAAGTTG TCGCTTCTTC   480GTTCATTGTT TCTCTCACTA AAATTTTCAA TTCACTTTTT AAAAAATCGA TAAATTTTTA   540ATATAACTTT ACATAACATA TTCAAAATTA CAAAAATAAA GGATATTTTT ATATGTTTAT   600TTTTAATGTA AGATTAAATA TTTAGAATTC TTTTTAAGAA CGGTACAAGC AAATTAAAAG   660AGAGAAGGTA TATTAGTGGG CCTATGTATC TTTGATATCA TATGCCTCTC AAAGAGCATC   720CTGATGAGTC TATATATCTT TGTTGATAGT GATTTAACCA TTTATGTATG TACGTAGTAC   780TAAGACATGT TAAATAAGAT CCTAGAGAAA GATTTTTGGA AAAGTGAAAA CAGCAATAAA   840GAAAAGTCAT TTAAACACTT TCCAACAAAC ATTTGGTAAT CGATTTTAAT TACCCACTTA   900AACAAAACTA TTTGTACGTA AAATGTTTAA GTAGAAAAGA GATTTTTTTA AAAAAAAAAA   960GAAGGCAAGA GGTCATATAT CTGACCCTTC CTTAAATCCC CGCGTATAAC ACTTTCTTTT   1020TTTTGTGTGT GTATGTTCAG GAACATTTGT ATTTTCTATT TGAAATTTCT CATTAAGTCA   1080AATTCGAAAT CTTTTAAATA ATGTAGAGAA ATCTCATTAT ATTTAACAAT CCCACTTGAT   1140GAATTCCTAA ACATTTTCTA TAAAATAACA CTAAATCTTT AATTATACAT ATTACATACC   1200TAACTCAAGC AATCTTGTCG GAAAAATCAT TAGAAAAGAA TTGGAAATAG GGAAATAAAT   1260AGACATATTT TGGTTAGTAT CTTTGTCTAT AAGAATGGGT GTGTTAAAGA GCTAGTGCCA   1320TAGTGTACCA TTCTATTGGT AGCATTTGGC AAGAGTTATT CCCTCTCTCC ATACCAATGG   1380AGAAGTTTAA TCTTGCTAGA GTCTTATTGT TGCTTCTTCA ACTTGGAACT TTGTTCATTG   1440CCCATGCATG TCCTTATTGT CCATATCCTC CTTCCACC                           1478(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：

(A)长度：450个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：AAATAAATAT TTCAAAGTAA ATTGTTACTC CCTCTATCCC ATACTCTTTT CTTTTTTTAA         60TCGATTTCTT ACTCTAATTG AACTATTGGA GACAACTTAA ATGTAAATTT TTTTTTTCTT         120TATCAAAATG ATTGGCTGCT ATATAAATAT CTAATGGTTA TTATACATAA ATTTTAATAT         180TTTTTATAAA AAAATATCGA GCTAAATCAT ATCGTTTAAA TATAGAGATG TGTTATTTAT         240TTAAAAATTA ATTTTAAAAA AGTGAATATT GTAAATTAGG ATGAAAGAGT ATTATATTGG         300TTGTCGCAGT ATAAATACCC TGCATGCCAT TACATTTGTT CAATCATCTT TGCAACGATT         360TGTGTGCTTT AGCTTCCTTA CATAACATGG CTTCTATAAC TAAAGCCTCA TTACTTATCC         420TTTTCCTCTC CTTGAATCTC CTTTTCTTCG                                          450(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1446个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：ATGGCAATTA CAAATAAAAC AATGTTGATT ACTTACGCAG ACAGTTTGGG TAAAAATTTG       60AAAGAATTGA ATGAAAATAT TGAGAATTAT TTTGCAGATG CTGTTGGCGG TGTCCATTTG       120CTGCCATTCT TTCCTTCCAC AGGTGATCGT GGCTTTGCAC CGATTGATTA CCATGAAGTT       180GACTCTGCTT TTGGCGATTG GGATGATGTC AAACGTTTGG GTGAAAAATA TTACCTCATG       240TTTGATTTCA TGATTAATCA TATTTCGCGT CAGTCTAAAT ATTATAAAGA TTACCAAGAA       300AAGCATGAAG CAAGTGCTTA TAAAGATCTA TTTTTAAATT GGGATAAATT TTGGCCTAAA       360AATCGCCCGA CACAAGAAGA TGTGGACCTG ATTTATAAGC GTAAGGATCG AGCACCTAAG       420CAGGAAATCC AATTTGCAGA TGGCAGTGTT GAACATCTCT GGAACACTTT TGGGGAGGAA       480CAGATTGATC TTGACGTGAC TAAAGAAGTG ACTATGGATT TTATTCGCTC TACCATTGAA       540AATTTAGCAG CCAACGGCTG TGATCTCATT CGTTTGGATG CCTTTGCTTA TGCTGTTAAA       600AAGCTAGATA CGAATGATTT CTTTGTTGAA CCTGAAATCT GGACTCTGCT AGATAAAGTT       660CGTGATATAG CTGCTGTATC GGGTGCGGAA ATCTTGCCGG AAATTCATGA ACACTATACT       720ATTCAATTTA AAATTGCAGA CCATGATTAC TATGTTTATG ATTTTGCCCT GCCTATGGTG       780ACGCTCTACA GCCTATATTC GGGCAAGGTT GACCGTCTTG CCAAATGGGT GAAAATGAGT       840CCGATGAAAC AGTTCACCAC CCTTGATACA CATGACGGTA TTGGTGTGGT TGATGTTAAG       900GATATCCTGA CTGACGAAGA AATTACCTAT ACTTCTAATG AGCTTTATAA GGTCGGTGCC       960AATGTCAATC GTAAGTATTC AACTGCCGAA TATAATAACT TGGATATCTA TCAAATTAAT       1020TCAACTTACT ATTCAGCACT TGGTGATGAT GATCAAAAAT ACTTTTTGGC CCGGTTGATA       1080CAAGCTTTTG CTCCAGGTAT TCCACAGGTT TATTACGTTG GCTTTTTAGC TGGCAAGAAT       1140GATCTTGAAT TACTGGAAAG CACTAAAGAA GGCCGCATTA TCAACCGTCA TTATTATAGT       1200AGTGAAGAAA TTGCTAAGGA AGTGAAGCGG CCAGTTGTCA AGGCACTTTT AAATCTCTTT       1260ACTTACCGCA TTCAGTCAGC AGCTTTTGAT TTGGATGGCC GTATTGAAGT GGAAACGCCA       1320AATGAAGAGA ACATTGTCAT AGAACGTCAA AATAAAGATG GCAGTCATAT CGCAACAGCA       1380GAGATTAATC TCCAAGATAT GACATACAGA GTAACAGAAA ATGATCAAAC AATAAGCTTC     1440GAGTGA                                                                1446

Claims (28)

1.一种产生转基因植物的方法，包括下面步骤：

  (a)向植物细胞基因组中插入重组双链DNA分子，该分子包括：

    (i)在靶植物组织细胞中起作用的启动子，

    (ii)引起编码蔗糖磷酸化酶的RNA序列产生的结构DNA序

        列，

    (iii)在植物细胞中起作用，引起转录中止和向RNA序列3′末端加入聚腺苷酸化核苷酸的3′非翻译DNA序列；

  (b)获得转化的植物细胞；和

  (c)从所述转化过的植物细胞中再生出一种基因工程转化的植物，其基因组包含步骤(a)所述重组双链DNA分子。

2.权利要求1的方法，其中所述编码蔗糖磷酸化酶的DNA序列是从变异链球菌获得的。

3.权利要求2的方法，其中所述编码蔗糖磷酸化酶的DNA序列具有SEQ ID NO：5所示的序列。

4.权利要求1的方法，其中所述基因工程转化的植物具有选自下组的性质：含有改变的碳水化合物含量；提高的多糖(例如淀粉)含量；提高的产量；提高的固体分布均匀性；和减小的擦伤变色的敏感性。

5.权利要求4的方法，其中所述的性质是含有改变的碳水化合物含量。

6.权利要求5的方法，其中所述的改变的碳水化合物含量是固体含量的增加。

7.权利要求6的方法，其中所述基因工程转化的植物选自马铃薯和番茄。

8.权利要求4的方法，其中所述性质是提高的固体分布均匀性。

9.权利要求8的方法，其中所述基因工程转化的植物选自马铃薯和甘薯。

10.权利要求4的方法，其中所述性质是减小的擦伤变色的敏感性。

11.权利要求10的方法，其中所述基因工程转化的植物选自马铃薯，香蕉，苹果，小麦，葡萄，和桃。

12.权利要求4的方法，其中所述性质是提高的多糖(例如淀粉)含量。

13.权利要求12的方法，其中所述基因工程转化的植物选自玉米，小麦，稻，番茄，马铃薯，甘薯，花生，大麦，棉花，草莓，木莓，和木薯。

14.权利要求4的方法，其中所述性质是提高的产量。

15.权利要求14的方法，其中所述基因工程转化的植物选自玉米，小麦，稻，番茄，马铃薯，甘薯，花生，大麦，甜菜，甘蔗，苹果，梨，桔子，桃，葡萄，棉花，草莓，木莓，和木薯。

16.权利要求1的方法，其中所述植物细胞选自马铃薯植物细胞，玉米植物细胞，稻植物细胞，小麦植物细胞，番茄植物细胞，大麦植物细胞，甜菜植物细胞，甘薯植物细胞，花生植物细胞，甘蔗植物细胞，葡萄植物细胞，梨植物细胞，苹果植物细胞，桔子植物细胞，木薯植物细胞，香蕉植物细胞，大蕉植物细胞，棉花植物细胞，草莓植物细胞，木莓植物细胞和桃植物细胞。

17.权利要求16的方法，其中所述植物细胞是马铃薯植物细胞。

18.权利要求16的方法，其中所述植物细胞是玉米植物细胞。。

19.权利要求16的方法，其中所述植物细胞选自小麦植物细胞，大麦植物细胞，稻植物细胞，和番茄植物细胞。

20.一种重组双链DNA分子，其序列中包括：

   (a)在靶植物组织细胞中起作用的启动子；

   (b)引起编码蔗糖磷酸化酶的RNA序列产生的结构DNA序

      列；和

   (c)在植物细胞中起作用，引起转录中止和向RNA序列3′末端加入聚腺苷酸化核苷酸的3′非翻译序列。

21.权利要求20的DNA分子，其中所述编码蔗糖磷酸化酶的DNA序列是从变异链球菌获得的。

22.权利要求21的DNA分子，其中所述编码蔗糖磷酸化酶的DNA序列具有SEQ ID NO：5所示的序列。

23.权利要求20的DNA分子，其中所述启动子选自玉米醇溶蛋白启动子，马铃薯糖蛋白启动子，稻谷蛋白启动子，大豆7s启动子，ADP葡糖焦磷酸化酶亚基的启动子，TFM7启动子，和TFM9启动子。

24.一种包含重组双链DNA分子的转化的植物细胞，其序列中包括：

(a)在所述植物细胞中起作用的启动子；

(b)引起编码蔗糖磷酸化酶的RNA序列产生的结构DNA序

   列；和

(c)在植物细胞中起作用以引起转录终止和向RNA序列的3′末端加入聚腺苷酸化核苷酸的3′非翻译区。

25.权利要求24的植物细胞，其中所述编码蔗糖磷酸化酶的DNA序列是从变异链球菌获得的。

26.权利要求25的植物细胞，其中所述编码蔗糖磷酸化酶的DNA序列具有SEQ ID NO：5所示的序列。

27.权利要求24的植物细胞，其中所述启动子选自玉米醇溶蛋白启动子，马铃薯糖蛋白启动子，稻谷蛋白启动子，大豆7s启动子，ADP葡糖焦磷酸化酶亚基的启动子，TFM7启动子，和TFM9启动子。

28.权利要求24的植物细胞，其中所述植物细胞选自马铃薯植物细胞，玉米植物细胞，稻植物细胞，小麦植物细胞，番茄植物细胞，大麦植物细胞，甜菜植物细胞，甘薯植物细胞，花生植物细胞，甘蔗植物细胞，葡萄植物细胞，梨植物细胞，苹果植物细胞，桔子植物细胞，木薯植物细胞，香蕉植物细胞，大蕉植物细胞和桃植物细胞。