MX2007014885A - Elevacion del aceite en plantas monocotiledoneas. - Google Patents

Abstract

Se proveen metodos para la elaboracion de plantas de cosecha que tienen mayores niveles de aceite en sus semillas a incrementar el flujo glicolitico a traves de la sobre-expresion de los acidos nucleicos que codifican la fosfofructocinasa; la invencion puede comprender adicionalmente la sobre-expresion de acidos nucleicos que codifican un piruvato cinasa para alterar el contenido de aceite en las semillas de las plantas, y en las celulas monocotiledoneas y en las plantas transformadas con los transgenes de la fosfofructocinasa, o fosfofructocinasa y piruvato cinasa.

Description

ELEVACIÓN DEL ACEITE EN PLANTAS MONOCOTILEDONEAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta solicitud reclama prioridad conforme a 35 U.S.C. 119(e) a I partir de la Solicitud Provisional de E.U.A. No. de Serie 60/684,809, presentada el 26 de mayo de 2005, dicha solicitud se incorpora en la presente invención como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta ¡nvención se refiere a el incremento en los niveles de aceite en las semillas de plantas de cosecha mediante la sobre-expresión de la fosfof ructoci nasa.

TÉCNICA RELACIONADA La conversión de fructosa-6-fosfato (F-6-P) hacia fructosa-1 ,6- | bis-fosfato (F-1.6-BP) se cataliza por la enzima fosfof ructoci nasa (PFK). La i I PFK dependiente de ATP cataliza este paso en la mayoría de los organismos y tejidos y esta enzima ha estado implicada desde hace tiempo en la > regulación del flujo glicolítico. De hecho en muchos sistemas, incluyendo plantas, se cree que la regulación combinada de las enzimas alostéricas PFK-ATP y piruvato cinasa (PK) es principalmente responsable en la regulación de la glicólisis. En las plantas, PFK-ATP se localiza en los plastidios y en el citosol. Frecuentemente las enzimas encontradas en estas diferentes localizaciones celulares tienen diferentes propiedades cinéticas. Además de las enzimas PFK-ATP, existen otras dos enzimas que participan en la interconversión de estos dos metabolitos: PFK dependiente de pirofosfato (PFK-PPI), que cataliza la ¡nterconversión reversible dependiente de pirofosfato inorgánico de F-6-P y F-1.6-BP, y fructosa-1 ,6-bisfosfatasa, que cataliza la reación reversa para la gluconeogénesis. Doehlert et al. (1988) encontraron que PFK fue más abundante en los embriones (tejido con alta concentración de aceite) que en el endospermo (tejido con baja concentración de aceite) del maíz. En una búsqueda de la distribución de la abundancia de las enzimas implicadas en el metabolismo de carbohidratos en diferentes partes del grado, estos trabajadores encontraron que la actividad de PFK correlaciona con aquellas áreas del grado que depositaron la mayor concentración de aceite. Existe un gran cuerpo de evidencias que apoyan la importancia de la PFK en la regulación del flujo glicolítico (por ejemplo Plaxton, 1996). Aunque se han generado algunas plantas transgénicas que comprenden un gen de la fosfof ructoci nasa heteróloga (por ejemplo Patente de E.U.A. 7,012,171 ; Burrell et al., 1994; Thomas et al., 1997; WO 99/67392; Wood et al., 1999; Wood et al., 2002), no se ha reportado el uso de la PFK para incrementar el contenido de aceite en plantas monocotiledóneas y semillas. Con el objeto de producir niveles más elevados de aceite en las semillas en desarrollo de las monocotiledóneas, estos tejidos necesitan convertir la mayoría del carbón que ingresa (predominantemente sacarosa) hacia triacilgliceroles (TAG) en lugar de hacia el almidón. Esto sugiere que la mayoría de las hexosas necesitan ser degradadas por la glicólisis con el ¡ ' objeto de generar piruvato y acetil-CoA como sustratos para la síntesis de ácido graso.

BREVE DESCRIPCIÓN DE INVENCIÓN Esta invención ¡ncluye la sobre-expresión de un gen pfk con el efecto pretendido de incrementar el flujo glicolítico y por lo tanto incrementar el abastecimiento del sustrato, resultando en niveles más elevados de aceite en tejidos tales como las semillas de plantas monocotiledóneas. Más específicamente incluye la sobre-expresión del gen de la PFK dependiente de ATP a partir de la bacteria Lactobacillus delbreuckíi subespecie bulgaricus en las semillas de monocotíledóneas. Esta invención provee un método para la elaboración de una planta monocotiledónea que tiene concentración incrementada de aceite en su semilla, que comprende el paso de crecer una planta monocotiledónea transformada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfofructocinasa, operativamente asociada a un promotor mejorado en semilla que también está asociado operativamente de manera opcional a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito del plastidio excepto cuando dicho promotor mejorado en semilla es un promotor mejorado en embrión, para producir una semilla, en donde el contenido de aceite de la semilla se incrementa en comparación con una semilla de una planta isogénica que carece de la secuencia de ácido nucleico. Esta invención provee un método para la elaboración de una planta monocotiledónea que tiene una concentración incrementada de aceite en su semillas, que comprende el paso de crecer una planta monocotiledónea transformada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfofructocinasa diferente a SEQ ID NO: 9 ó 13, operativamente asociada a un promotor mejorado en semilla el cual también está operativamente asociado de manera opcional a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito del plastidio excepto cuando dicho promotor mejorado en semilla es un promotor mejorado en embrión, para producir una semilla, en donde el contenido de aceite de la semilla se incrementa en comparación con una semilla de una planta isogénica que carece de la secuencia de ácido nucleico. En una modalidad, el método comprende la elaboración de una planta monocotiledónea en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfofructocinasa se selecciona a partir del grupo que consiste de: -.k a) secuencias de ácido nucleico que comprenden SEQ ID NO: 1 ó 1 1 y b) secuencias de ácido nucleico que codifican SEQ ID NO: 2 ó 12. En otra modalidad, la planta comprende adicionalmente una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una piruvato cinasa, operativamente asociada a un promotor mejorado en semilla. En una versión de esta modalidad, la segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una piruvato cinasa se selecciona a partir del grupo que consiste de: a) una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 3 y b) una secuencia de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 4. En diversas modalidades, la planta monocotiledónea se selecciona a partir del grupo que consiste de maíz (Zea mays), arroz (Oryza sativa), cebada (Hordeum vulgare), mijo (Panicum miliaceum), centeno (Sécale cereale), trigo (Triticum aestivum), y sorgo (Sorghum bicolor). En diversas modalidades, el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste de promotores mejorados en embrión, promotores mejorados en endospermo y promotores mejorados en embrión y endospermo. La invención también provee células vegetales transformadas, plantas transformadas y progenie, semilla, aceite y harina. Adicionalmente, la invención provee composiciones de forraje animal y alimento de humano y métodos para la producción aceite.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfofructocinasa a partir de Lactobacillus delbreuckii ssp. bulgaricus.

SEQ ID NO: 2 establece una secuencia polipeptídica de una fosfofructocinasa a partir de Lactobacillus delbreuckii ssp. bulgaricus.

SEQ ID NO: 3 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una piruvato cinasa a partir de Lactobacillus delbreuckii ssp. bulgaricus.

SEQ ID NO: 4 establece una secuencia polipeptídica de una piruvato cinasa a partir de Lactobacillus delbreuckii ssp. bulgaricus.

SEQ ID NOs: 5-8 establecen iniciadores de ácido nucleico.

SEQ ID NO: 9 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfofructocinasa a partir de Schízosaccharomyces pombe.

SEQ ID NO: 10 establece una secuencia polipeptídica de una fosfofructocinasa a partir de Schizosaccharomyces pombe.

SEQ ID NO: 11 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfofructocinasa a partir Propionibacterium freudenreichii.

SEQ ID NO: 12 establece una secuencia polipeptídíca de una fosfofructocinasa a partir de Propionibacterium freudenreichii.

SEQ ID NO: 13 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfofructocinasa la partir de Escherichía coli.

SEQ ID NO: 14 establece una secuencia polipeptídíca de una fosfofructocínasa a partir de Escherichía coli.

I i BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor con referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de los modalidades específicas presentes en la presente invención.

La figura 1 muestra un alineamiento de la secuencia codificante del gen pfk (SEQ ID NO: 1 ) aislado a partir de Lactobacillus delbreuckii subspecies bulgaricus ATCC cepa 11842 con la secuencia publicada del gen de pfk (EMBL # de acceso X71403).

La figura 2 ilustra el plásmido pMON72008.

La figura 3 ilustra el plásmido pMON79823.

La figura 4 ilustra el plásmido pMON79824.

La figura 5 ilustra el plásmido pMON79827.

La figura 6 ilustra el plásmido pMON72028.

La figura 7 ¡lustra el plásmido pMON79832.

La figura 8 ilustra el plásmido pMON81470.

La figura 9 ilustra el plásmido pMON72029.

La figura 10 ¡lustra el plásmido pMON83715.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS Se proveen las siguientes definiciones como una ayuda para el entendimiento de esta invención. Las frases "secuencia de ADN", "secuencia de ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", y "segmento de ácido nucleico" se refieren a la estructura física que comprende un arreglo ordenado de nucleótidos. El segmento de ADN, secuencia, o secuencia nucleotídica pueden estar contenida dentro de una molécula nucleotídíca más grande, vector, o los similares. Además, en arreglo ordenado de ácido nucleicos en estas secuencias se pueden ilustrar en la forma de un listado de secuencia, figura, cuadro, medio electrónico, o los similares.

Las frases "secuencia codificante", "región codificante" "secuencia estructural", y "secuencia estructural del ácido nucleico" se refieren a todo o a un segmento de una secuencia de ADN, secuencia de ácido nucleico, molécula de ácido nucleico en la cual los nucleótidos se disponen en una serie de tripletes cada uno formando un codón. Cada codón codifica un aminoácido específico. Por ejemplo, la secuencia codificante, región codificante, secuencia estructural, y secuencia estructural del ácido nucleico codifican una series de aminoácidos que forman una proteína, polipéptido, o secuencia peptídica. La secuencia codificante, región codificante, secuencia estructural, y secuencia estructural del ácido nucleico pueden estar contenidas dentro de una molécula más grande de ácido nucleico, vector, o los similares. Además, el arreglo de nucleótidos en estas secuencias se puede ilustrar en la forma de un listado de secuencia, figura, cuadro, medio electrónico, o los similares. El término "ADNc" se refieren a un ADN de cadena doble que es complementario a y se deriva a partir de ARNm. "Expresión" se refiere al proceso por medio del cual la información codificada del gen se convierte hacia estructuras presentes y en operación en la célula. Los genes expresados incluyen aquéllos que se transcriben hacia ARN y luego traducirlos hacia proteína y aquéllos que se transcriben hacia ARN pero no se traducen hacia proteína (por ejemplo, ARN de transferencia y ARN ribosomal).

I , Como se utiliza en la presente ¡nvención, "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificantes hacia 5') y que siguen (secuencias no codificantes hacia 3') a la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se deriven a partir de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas a partir de la misma fuente, pero dispuestas en una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. Un gen "exógeno" o "transgén" se refiere a un gen que ha sido introducido dentro de genoma medíante un procedimiento de transformación. Un transgén incluye ADN genómico introducido mediante un procedimiento de transformación (por ejemplo, un ADN genómíco asociado a su promotor activo). "Heterólogo" se refiere a la relación entre dos o más secuencias de ácido nucleico o de proteína que se derivan a partir de diferentes fuentes. Por ejemplo, un promotor es heterólogo con respecto a una secuencia codificante si dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza. Además, una secuencia particular de ácido nucleico puede ser "heteróloga" con respecto a una célula u organismo dentro de la cual se inserta si no se presenta de manera natural en esa célula particular u organismo. "Homología de secuencia" se refiere al nivel de similitud entre 2 o más secuencias de ácido nucleico o de aminoácido en términos de porcentaje de identidad posicional. El término homología también se utiliza para referirse al concepto de propiedades funcionales similares entre los diferentes ácido nucleicos o proteínas. "Hibridación" se refiere a la capacidad de una primera cadena de ácido nucleico para unirse con una segunda cadena vía apareamiento de bases por enlace de hidrógeno cuando las dos cadenas de ácido nucleico tienen suficiente complementariedad de secuencia. Como se utiliza en la presente invención, se dice que una molécula de ácido nucleico es "complementaria" a otra molécula de ácido nucleico se exhiben complementariedad completa. Como se utiliza en la presente ¡nvención, se dice que las moléculas exhiben "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario a un nucleótido de la otra. Por lo tanto se dice que dos cadenas de ácido nucleico tienen suficiente complementariedad cuando éstas pueden hibridar entre sí con estabilidad adecuada para permitirles permanecer fijas entre sí bajo condiciones apropiadas. Las condiciones de severidad apropiadas que promueven la hibridación del ADN son, por ejemplo, 6.0 X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) aproximadamente a 45°C, seguido por un lavado de 2.0 X SSC a 20-25°C, y se conocen por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la concentración de la sal en el paso de lavado se puede seleccionar a partir de una baja severidad de aproximadamente 2.0 X SSC a 50°C hasta una alta severidad de aproximadamente 0.2 X SSC a 65°C. Además, la temperatura en el paso de lavado se puede incrementar a partir de condiciones de baja severidad a temperatura ambiente, de aproximadamente 22°C, hasta condiciones de alta severidad aproximadamente a 65°C. Tanto la temperatura como la sal pueden variar, o ya sea la temperatura o la concentración de la sal se pueden mantener constantes de tal manera que un ácido nucleico hibridará específicamente a una o más de las moléculas polinucleotídícas provistas en la presente invención, por ejemplo, como se estableció anteriormente en: SEQ ID NOs 1 , 3, o 11 , y complementos de las mismas, bajo condiciones moderadamente severas, por ejemplo aproximadamente a 2.0 X SSC y aproximadamente a 65°C. La frase "aislada" significa que ha sido removida a partir de su ambiente natural, sin importar su disposición eventual. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico "aislada" a partir del arroz, tal como mediante clonación a partir de una célula del arroz, permanece "aislada" cuando se inserta dentro del genoma de una célula del maíz. La frase "operativamente asociada" se refiere al arreglo espacial de dos o más regiones de ácido nucleico o secuencias de ácido nucleico de manera que ejerzan sus efectos apropiados entre sí. Por ejemplo, una región promotora se puede ubicar en relación con una secuencia de ácido nucleico de tal manera que la transcripción de la secuencia de ácido nucleico se dirige por la región promotora. La región promotora y la secuencia de ácido nucleico están "operativamente asociadas". El término "fosfofructocinasa" se refiere a una enzima capaz de convertir la fructosa-6-fosfato (F-6-P) hacia fructosa-1 ,6-bis-fosfato (F-1.6-BP). Esto incluye las enzimas a partir de the International Union of Biochemistry and Molecular Biology Enzyme Nomenclature classes EC 2.7.1.11 y EC 2.7.1.90 . El término "piruvato cinasa" se refiere a una enzima capaz de convertir la fosfoenol piruvato hacia piruvato. Esto incluye enzimas a partir de the International Union of Biochemistry and Molecular Biology Enzyme Nomenclature class EC 2.7.1.40. El término "plastidio" se refiere a un organelo citoplásmíco auto-replicante de células algales y vegetales, tal como un cloroplasto o cromoplasto. Un "péptido de tránsito" se refiere a una secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal de una proteína que dirige el polipéptido al palstídio a partir de su síntesis en el citosol y facilita su translocacíón a través de la membrana del plastidio. Después de que el polipéptido entra al plastidío, el péptido de tránsito se escinde a partir de polipéptido. "Corriente arriba" y "corriente abajo" son términos de posición utilizados con referencia a la ubicación de una secuencia nucleotídíca y la dirección de la transcripción o la traducción de las secuencias codificantes, que normalmente procede en la dirección 5' a 3'. Los términos "promotor" o "región promotora" se refieren a una secuencia de ácido nucleico, usualmente encontrada cascada arriba (5') a una secuencia codificante, que es capaz de dirigir la transcripción de una secuencia de ácido nucleico hacia una molécula de ARN. El promotor o región promotora típicamente provee un sitio de reconocimiento para la ARN polimerasa y los otros factores necesarios para el inicio adecuado de la transcripción. Como se contempla en la presente invención, un promotor o región promotora incluye variaciones de promotores derivados mediante la inserción o deleción de las regiones reguladoras, sometiendo el promotor a mutagénesis al azar o mutagénesis sitio dirigida, y los similares. La actividad o fuerza de un promotor se puede medir en términos de las cantidades de ARN que produce, o la cantidad de acumulación de proteína en una célula o tejido, en relación con un segundo promotor que se mide de manera similar. La frase "secuencias no codificantes hacia 3'" se refiere a secuencia nucleotídicas localizadas cascada abajo de una secuencia codificante e incluye secuencias de reconocimiento de la poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento del ARNm o la expresión del gen. Estas comúnmente se refieren como regiones no traducidas hacia 3' o 3'-UTRs. La señal de poliadenilación usualmente se caracteriza por afectar la adición de secciones de ácido poliadenílico hacia el extremo 3' del ARNm precursor. El uso de diferentes secuencias no codificantes hacia 3' se ejemplifica por Ingelbrecht et al. (1989). "Secuencia líder de traducción" o "región no traducida hacia 5'" o "5'-UTR" todas se refieren a una secuencia nucleotídíca localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificante. La 5'-UTR está presente en el ARNm completamente procesado cascada arriba de la secuencia de inicio de la traducción. La 5'-UTR puede afectar el procesamiento del transcrito primario al ARNm, estabilidad del ARNm o eficiencia de la traducción. Se han descrito los ejemplos de secuencias líder de traducción (Turner y Foster, 1995). "Transcrito de ARN" se refiere al producto resultante a partir de la transcripción de una secuencia de ADN catalizada por la ARN polimerasa. Cuando el transcrito de ARN es una copia perfectamente complementaria de la secuencia de ADN, se refiere como el transcrito primario. Una secuencia de ARN derivada a partir del procesamiento post-transcrípcional del transcrito primario se refiere como un ARN maduro. El "ARN mensajero" (ARNm) se refiere al ARN que no tiene intrones y que se puede traducir hacia un polipéptído por la célula. "Vector recombinante" se refiere a cualquier agente por medio del cual o en el cual un ácido nucleico de interés se amplifica, expresa, o almacena, tal como un plásmido, cósmido, virus, secuencia que se replica de manera autónoma, fago, o secuencia nucleotídica de ADN de cadena sencilla lineal, cadena sencilla circular, cadena doble lineal, o cadena doble circular o secuencia nucleotídica de ARN. El vector recombinante se puede sintetizar o derivar a partir de cualquier fuente y es capaz de llevar a cabo la integración genómica o la replicacíón autónoma. "Secuencia reguladora" se refiere a una secuencia nucleotídica localizada cascada arriba (5'), dentro, o cascada abajo (3') con respecto a una secuencia codificante, o un intrón, cuya presencia o ausencia afecta la transcripción y la expresión de la secuencia codificante. "Sustancialmente homologa" se refiere a dos secuencias que son al menos aproximadamente 90% idénticas en la secuencia, como se mide por el algoritmo CLUSTAL W en, por ejemplo DNAStar (Madison, Wl). "Sustancialmente purificada" se refiere a una molécula separada a partir de sustancialmente todas las otras moléculas normalmente asociadas con ésta en su estado nativo. Más preferiblemente, una molécula sustancialmente purificada es la especie predominante en una preparación. Una molécula sustancialmente purificada puede ser mayor de aproximadamente 60% libre, preferiblemente aproximadamente 75% libre, más preferiblemente de aproximadamente 90% libre, y más preferiblemente de aproximadamente 95% libre a partir de las otras moléculas (exclusivas del solvente) presentes en la mezcla natural. La frase "sustancialmente purificada" no se pretende que abarque moléculas presentes en su estado nativo. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos de esta invención están sustancialmente purificados.

El término "transformación" se refiere a la introducción del ácido nucleico dentro de un hospedero recipiente. El término "hospedero" se refiere a células bacterianas, hongos, anímales o células anímales, plantas o semillas, o cualesquiera partes vegetales o tejidos incluyendo células vegetales, protoplastos, callos, raíces, tubérculos, semillas, tallos, hojas, brotes, embriones, y polen. Como se utiliza en la presente invención, una "planta transgénica" es una planta que tiene establemente introducido dentro de su genoma, por ejemplo, los genomas nucleares o genomas del plastidio, ácido nucleico exógeno. El término "isogénico" como un término comparativo entre las plantas o líneas vegetales que tienen o que carecen de un transgén significan plantas o líneas que tienen el mismo fondo genético o un fondo genético similar, con excepción del transgén en cuestión. Por ejemplo, las denominadas líneas hermanas que representan selecciones fenotípícamente similares o idénticas a partir de la misma población F2 parental se consideran como "isogénícas". Cuando la progenie de una planta transformada de manera estable se cruza y retrocruza con las plantas de la línea parental no transformada para 3 a 6 generaciones (o más) utilizando el parental no transformado como el parental recurrente aunque se selecciona para el equipo (genético mediante análisis de marcador molecular, fenotipo por observación en campo, o ambos) y para el transgén, la línea transgénica ! > 1 resultante se considera como altamente "isogénica" con respecto a su línea parental no transformada. Los términos "semillas" "granos" y "grano" se entienden que poseen un significado equivalente. El término de frecuentemente se utiliza en la descripción de la semillas de una planta de maíz o de arroz. En todas las plantas la semilla es el óvulo maduro que consiste de un revestimiento de la semilla, el embrión, la aleurona, y un endospermo.

Acido nucleicos que codifican fosfofructocinasa y piruvato cínasa Esta invención provee, entre otras cosas, un método para el uso ; de las moléculas de ácido nucleico que codifican la fosfofructocinasa (International Union of Biochemistry and Molecular Biology Enzyme Nomenclature classes EC 2.7.1.11 y EC 2.7.1.90; más específicamente SEQ ID NOs: 1 y 11 ) y la piruvato cínasa (EC 2.7.1.40; más específicamente SEQ ID NO: 3). En una modalidad, estas moléculas de ácido nucleico se utilizan en el contexto de esta invención para la alteración del contenido de aceite de una semilla en una planta monocotiledónea. Dichas moléculas de ácido nucleico se pueden amplificar utilizando ADNc, ARNm o ADN genómíco como un molde e iniciadores oligonucleótidos apropiados de conformidad con las técnicas estándares de amplificación por PCR™. Alternativamente, éstos se pueden sintetizar utilizando las técnicas sintéticas estándares, tal como un sintetizador automatizado de ADN.

Si se desea, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para fosfofructocinasa o píruvato cinasa se pueden modificar sin cambiar la secuencia resultante de aminoácidos de la proteína expresada de manera que las secuencias son más capaces para llevar a cabo la expresión en hospederos vegetales. Una secuencia codificante puede ser un ADN artificial. Un ADN artificial, como se utiliza en la presente invención significa una molécula polinucleotídíca de ADN que no se presenta de manera natural. Las moléculas artificiales de ADN se pueden diseñar mediante una variedad de métodos, tales como, los métodos conocidos en la técnica que se basan en la sustitución del codón(es) de un primer polínucleótido para crear un polinucleótido artificial de segunda generación equivalente, o incluso un polinucleótído artificial de segunda generación mejorado, en donde este polinucleótido artificial novedoso se utiliza para la expresión mejorada en plantas transgénicas. El aspecto del diseño frecuentemente emplea un cuadro de uso del codón, el cuadro se produce mediante la compilación de la frecuencia de ocurrencia de los codones en una colección de secuencias codificantes aisladas a partir de una planta, tipo vegetal, familia o género. Otros aspectos del diseño incluyen la reducción de la ocurrencia de señales de poliadenilación, sitios de procesamiento del intrón, o extensiones largas AT o GC de la secuencia (Patente de E.U.A. 5,500,365). Las secuencias Vectores de expresión y Cassettes Un vector de expresión vegetal puede comprender un promotor nativo o no nativo operativamente asociado a una de las moléculas de ácido nucleico anteriormente mencionadas. La selección de los promotores, por ejemplo, promotores que se pueden describir como promotores fuertemente expresados, débilmente expresados, expresados de manera inducíble, expresados por tejido mejorado (por ejemplo, específicamente o preferiblemente expresados en tejido), expresados por un órgano mejorado (por ejemplo, específicamente o preferiblemente expresados en un órgano) y expresados por un desarrollo mejorado (por ejemplo, específicamente o preferiblemente expressed durante una etapa(s) particular del desarrollo), se encuentran dentro de la capacidad de la técnica . De manera similar, la combinación de una molécula de ácido nucleico como se describió anteriormente con un promotor también se encuentra dentro de la capacidad de la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). En una modalidad de esta invención, una molécula de ácido nucleico anteriormente descrita está operativamente asociada a un promotor mejorado en semilla ocasionando una expresión adecuada para incrementar el contenido de aceite en la semilla de una planta monocotiledónea. Los promotores de la presente invención generalmente incluyen, pero no se limitan a, promotores que funcionan en bacterias, bacteriófagos, o células vegetales. Los promotores útiles para expresión bacteriana son los promotores lacZ, Sp6, T7, T5 o E. coli glgC. Los promotores útiles para células vegetales incluyen el promotor de la globulina (véase por ejemplo Belanger y Kriz (1991), el promotor de la gamma zeina Z27 (véase, por ejemplo, Lopes et al. (1995), el promotor de la L3 oleosina (Patente de E.U.A. No. 6,433,252), el promotor de PER1 de cebada (Stacey et al. (1996), el promotor 35S de CaMV 35S (Odell et al. (1985)), el promotor CaMV 19S (Lawton et al., 1987), nos (Ebert et al., 1987), Adh (Walker et al., 1987), sacarosa sintasa (Yang et al., 1990), actina (Wang et al., 1992), cab (Sullivan et al., 1989), el promotor PEPCase (Hudspeth et al., 1989), o aquellos asociados con el complejo del gen R (Chandler et al., 1989). El promotor del virus del mosaico de la escrofularia (FMV) (Richíns et al., 1987), los promotores de arcelina, tomate E8, patatina, ubiquitina, manopina sintasa (mas) y tubulina son otros ejemplos de promotores útiles. Los promotores expresados en el maíz incluyen promotores a partir de los genes que codifican zeinas, las cuales son un grupo de proteínas de almacenamiento encontradas en el endospermo del maíz. Las clonas genómicas de los genes de zeina han sido aisladas (Pedersen et al., 1982) y Russell et al., 1997) y los promotores a partir de estas clonas, incluyendo los genes 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, y 27 kD, se pueden utilizar. Otros promotores mejorados para expresión de semilla que se sabe que funcionan en el maíz y en otras plantas incluyen los promotores para los siguientes genes: Waxy (almidón sintasa unida al granulo), Brittle y Shrunken 2 (ADP glucosa pirofosforilasa), Shrunken 1 (sacarosa sintasa), enzimas ramíficadoras I y II, almidón sintasas, enzimas desramificadoras, oleosínas, glutelinas, y BetU (capa de transferencia del endospermo basal). Otros promotores útiles en la práctica de la invención que se conocen por un experto en la técnica también se contemplan por la invención. Además, los potenciadores de la transcripción o las duplicaciones de potenciadores se puede utilizar para incrementar la expresión a partir de un promotor particular. Los ejemplos de dichos potenciadores incluyen, pero no se limitan al intrón 1 de Adh (Callis et al., 1987), un intrón de la actina del arroz (McEIroy et al., 1991 ; Patente de E.U.A. No. 5,641 ,876), el intrón de la sacarosa sintasa (Vasil et al., 1989), un intrón de la HSP70 del maíz (también referido como Zm.DnaK) (Patente de E.U.A. No. 5,424,412 Brown, et al.)) un elemento TMV omega (Gallie et al., 1999), el potenciador 35S de CaMV (Patentes de E.U.A. Nos. 5,359,142 & 5,196,525, McPherson et al.) o un potenciador de la octopina sintasa (Patente de E.U.A. No. 5,290,924, Last et al.). Puesto que la secuencia de ADN entre el sitio de inicio de la transcripción y el inicio de la secuencia codificante, por ejemplo, la secuencia líder no traducida, puede influir la expresión del gen, uno también puede desear utilizar una secuencia líder particular. Cualquier secuencia líder disponible por un experto en la técnica puede ser empleada. Las secuencias líder preferidas dirigen los niveles óptimos de expresión del gen unido, por ejemplo, al incrementar o mantener la estabilidad del ARNm y/o a prevenir el inicio inapropiado de la traducción (Joshi, 1987). La elección de dichas secuencias se encuentra a discreción de aquellos expertos en la técnica. Se contemplan las secuencias que se derivan a partir de los genes que se expresan altamente en el maíz, arroz y monocotiledóneas en particular. Los cassettes de expresión de esta invención también incluirán una secuencia cercana al extremo 3' del cassette que actúa como una señal para el término de la transcripción a partir de un ácido nucleico heterólogo y que dirige la poliadenílación del ARNm resultante. Estos comúnmente se refiere como regiones no traducidas hacia 3' o 3' UTRs. Algunos elementos hacia 3' que pueden actuar como señales para término de la transcripción incluyen aquellos a partir del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983), una región no traducida hacia 3' de la napina (Kridl et al., 1991 ), una región no traducida 3' hacia de la globulina (Belanger y Kriz, 1991 ) o un gen a partir de una zeina, tal como Z27 (Lopes et al., 1995). Otros elementos reguladores hacia 3' conocidos en la técnica también pueden ser utilizados en los vectores de la invención. Los vectores de expresión de esta invención también pueden incluir una secuencia codificante para un péptido de tránsito fusionada a la secuencia heteróloga de ácido nucleico. Los péptídos de tránsito de cloroplasto (CTPs) se diseñan para estar fusionados al extremo N-terminal de una proteína para dirigir la proteína hacia el cloroplasto de la planta. Muchas proteína localizadas en el cloroplasto se expresan a partir de los genes nucleares como precursores y se dirigen hacia el cloroplasto mediante un péptido de tránsito del cloroplasto que se remueve durante el proceso de importación. Los ejemplos de otras proteínas del cloroplasto incluyen la subunidad pequeña (SSU) de la Ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa, ferredoxina, ferredoxin oxidoreductasa, la proteína I y la proteína II del complejo de cosecha con luz, y tioredoxina F. En particular, se podría utilizar la CTP de la 1 ,5-bisfosfato carboxilasa subunidad pequeña del péptido de tránsito del cloroplasto de Nicotiana tabacum (SSU-CTP) (Mazur, et al., 1985). Se ha demostrado in vivo e in vitro que las proteínas no del cloroplasto se pueden dirigir hacia el cloroplasto mediante el uso de proteínas de fusión con una secuencia CTP y que una secuencia CTP es suficiente para dirigir una proteína hacia el cloroplasto. La incorporación de un péptido de tránsito del cloroplasto adecuado, tal como, la EPSPS CTP de Arabidopsis thaliana (Klee et al., 1987), y la EPSPS CTP de Petunia híbrida (della-Cioppa et al., 1986) se I ha mostrado que dirige las secuencias de la proteína EPSPS heteróloga hacia I los cloroplasto en plantas transgénicas. Esta invención provee adicionalmente un vector que comprende una molécula de ácido nucleico anteriormente descrita. Una molécula de ácido nucleico como se describió anteriormente se puede clonar dentro de cualquier vector adecuado y se puede utilizar para transformar o transfectar cualquier hospedero adecuado. La selección de los vectores y métodos para la construcción de los mismos se conocen comúnmente en la técnica y se describen en las referencias técnicas generales (véase, en general, "Recombinant DNA Part D" (1987)). El vector preferiblemente comprenderá secuencias reguladoras, tales como el inicio de la transcripción y de la traducción y los codones de término, los cuales son específicos al tipo de hospedero (por ejemplo, bacterias, hongos, o planta) dentro del cual se va a introducir el vector, como sea adecuado y tomando en consideración si el vector es ADN o ARN. Las construcciones de vectores que son circulares o lineares se pueden preparar para que contengan una secuencia total de ácido nucleico como se describió anteriormente o una porción de la misma ligada a un sistema de replicación funcional en una célula hospedera procarionte o eucarionte. Los sistema de replicación se pueden derivar a partir de ColEl , el plásmido 2 mµ, el fago ?, el fago filamentoso f1 , especies de Agrobacterium (por ejemplo, A. tumefaciens y A. rhizogenes), y los similares. Además del sistema de replicación y la secuencia insertada de ácido nucleico, la construcción puede incluir uno o más genes marcadores que permiten la selección de hospederos transformados o transfectados. Los genes marcadores incluyen genes para resistencia a biocida, tales como la resistencia a los antibióticos, metales pesados, herbicidas, etc., complementación en un hospedero auxotrófico para proveer prototrofía, y los similares. Esta invención provee una célula hospedera que comprende una molécula de ácido nucleico anteriormente descrita, opcionalmente en la forma de un vector. Los hospederos adecuados incluyen células vegetales, bacterias y células de levadura, incluyendo Escherichia coli, Bacíllus subtilis, Agrobacterium tumefaciens, Saccharomyces cerevisíae, y Neurospora crassa. Los hospederos de E. coli incluyen TB-1 , TG-2, DH5a, XL-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, CA), SA2821 , Y1090 y TG02. Las células vegetales incluyen células de monocotíledóneas, incluyendo, pero no limitadas al maíz, trigo, cebada, avena, centeno, mijo, sorgo, y arroz.

Polipéptidos Esta invención provee fosfofructocinasas y, en algunos casos, una piruvato cinasa codificada por una molécula de ácido nucleico anteriormente descrita. El polípéptido preferiblemente comprende un extremo I ! amino y un extremo carboxilo. El polípéptido puede comprender D-aminoácidos, L-amínoácidos o una mezcla de D- y L-aminoácídos. Las alteraciones de la secuencia nativa de aminoácidos para producir polipéptidos variantes se pueden realizar mediante una variedad de formas conocidas por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden ¡ntroducir de manera conveniente sustituciones de aminoácidos dentro de los polipéptidos mediante el cambio de la secuencia de la molécula de ácido nucleico en el momento de la síntesis. Las mutaciones específicas del sitio también se pueden introducir mediante la ligación dentro de un vector de expresión un oligonucleótído sintetizado que comprende la secuencia modificada. Alternativamente, se pueden utilizar los procedimientos de mutagénesis dirigida por oligonucleótido, mutagénesis sitio dirigida, tal como se describen en Walder et al. (1986); Bauer et al. (1985); y Patente de E.U.A. Nos. 4,518,584 y 4,737,462.

Se encuentra dentro de la capacidad del experto en la técnica la selección de los aminoácidos sintéticos y que se presentan de manera natural que afectan las sustituciones conservativas o neutras para cualquier aminoácido particular que se presenta de manera natural. El experto en la técnica considerará el contexto en el cual se realiza una sustitución particular de aminoácido, además de considerar la hidrofobicidad o polaridad de la cadena lateral, el tamaño general de la cadena lateral y el valor pK de las cadenas laterales con carácter ácido o básico bajo condiciones fisiológicas. Por ejemplo, lisina, arginina, y histídina frecuentemente se sustituyen de manera adecuada entre sí, y más frecuentemente argínina y histidina. Como se sabe en la técnica, esto es debido a que los tres aminoácidos tienen cadenas laterales básicas, mientras que el valor pK para las cadenas laterales de la lisina y arginina son mucho más cercanos entre sí (de aproximadamente 10 y 12) en comparación con la histídina (de aproximadamente 6). De manera similar, glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucína frecuentemente se sustituyen de manera adecuada entre sí, con la condición de que la glicina no se sustituyen de manera adecuada frecuentemente por los otros miembros del grupo. Esto es debido a que cada uno de estos aminoácidos es relativamente hidrófobo cuando se incorpora dentro de un polípéptido, pero la falta de un carbono a en la glicina permite la presencia de los ángulos de rotación phi y psi (alrededor del carbono a) así que la mayor libertad conformacional de esos residuos de glicinilo puede activar cambios en la conformación o en la estructura secundaria que frecuentemente no ocurren cuando se sustituyen otros aminoácidos entre sí. Otros grupos de aminoácidos frecuentemente adecuados para ser sustituidos entre sí incluyen, pero no se limitan a, el grupo que consiste de ácidos glutámico y aspártico; el grupo que consiste de fenilalanina, tirosina y triptofano; y el grupo que consiste de serina, treonina y, opcionalmente, tirosina. Adicionalmente, el experto en la técnica puede agrupar fácilmenta a los aminoácidos sintéticos con aminoácidos que se presentan de manera natural. Si se desea, los polipéptidos pueden ser modificados, por ejemplo, mediante glícosilación, amidación, carboxilación, o fosforilación, o mediante la creación de sales de adición acidas, amidas, esteres, en particular esteres C-terminales, y derivados N-acilo de los polipéptidos de la invención. Los polipéptidos también se pueden modificar para crear derivados de proteína medíante la formación de complejos covalentes o no covalentes con otras porciones de conformidad con los métodos conocidos en la técnica. Los complejos unidos de manera covalente se pueden preparar mediante la asociación de las porciones químicas a los grupos funcionales en las cadenas laterales de los aminoácidos que comprenden los polipéptidos, o en los extremos N- o C-terminales. De manera deseable, dichas modificaciones y conjugaciones no afectan de manera adversa la actividad de los polipéptidos (y variantes de los mismos). Aunque dichas modificaciones y conjugaciones pueden tener una mayor o menor actividad, la actividad siempre está presente y es característica del polipéptido no alterado.

Los polipéptidos (y fragmentos, variantes y proteínas de fusión) se pueden preparar mediante cualquiera de numerosas técnicas convencionales. El polipéptido se puede aislar o modificar sustancialmente a partir de una fuente en la que se presenta de manera natural o a partir de una fuente recombinante. Por ejemplo, en el caso de las proteínas recombinantes, un fragmento de ADN que codifica una proteína deseada puede ser subclonado dentro de un vector apropiado utilizando las técnicas bien conocidas de genética molecular (véase, por ejemplo, Maniatis et al., 1989) y otras referencias se citan en la presente invención bajo el título "ejemplos"). El fragmento se puede transcribir y subsecuentemente la proteína se traduce in vitro. Los equipos comercíalmente disponibles también pueden ser empleados (por ejemplo, tales como los elaborados por Clontech, Amersham Life Sciences, Inc., Ariington Heights, IL; Invitrogen, y los similares). Opcionalmente se puede emplear la reacción en cadena de la polimerasa en la manipulación de los ácidos nucleicos. Dichos polipéptidos también se pueden sintetizar utilizando un sintetizador peptídico automatizado de conformidad con los métodos conocidos en la técnica. Alternativamente, se puede sintetizar el polipéptido (y fragmentos, variantes, y proteínas de fusión) utilizando las técnicas estándares para síntesis peptídíca bien conocidas por aquellos expertos en la técnica (por ejemplo, como se resume en Bodanszky, 1984)). En particular, el polipéptido se puede sintetizar utilizando el procedimiento de síntesis en fase sólida (véase, por ejemplo, Merrifield, 1963; Barany et al., 1987; y Patente de E.U.A. No. 5,424,398). Si se desea, esto se puede realizar utilizando un sintetizador peptídico automatizado. La remoción de los grupos para bloqueo de aminoácido t-butiloxicarbonilo (t-BOC) o 9-fluorenilmefiloxicarbonilo (Fmoc) y la separación de la proteína a partir de la resina se pueden lograr mediante, por ejemplo, tratamiento con ácido a temperatura reducida. La mezcla que contiene el polipéptido se puede extraer entonces, por ejemplo, con dietil éter, para remover los compuestos orgánicos no peptídicos, y la proteína sintetizada se puede extraer a partir de la resina en polvo (por ejemplo, con aproximadamente 25% p/v de ácido acético). Después de la síntesis de polipéptido, se puede realizar de manera opcional una purificación adicional (por ejemplo, utilizando CLAR) con el objeto de eliminar cualesquiera proteínas incompletas, polipéptidos, péptidos o aminoácidos libres. Se puede llevar a cabo un análisis de aminoácidos y/o CLAR sobre el polipéptido sintetizado para validar su identidad. Para otras aplicaciones de conformidad con la intención, puede ser preferible producir el polipéptido como parte de una proteína de fusión más grande, ya sea mediante conjugación química, o a través de formas genéticas conocidas en la técnica. A este respecto, esta invención también provee una proteína de fusión que comprende el polipéptido (a un fragmento del mismo) o una variante del mismo y uno o más de otros polipéptidos/proteína(s) que tienen cualesquiera propiedades deseadas o funciones efectoras. Los ensayos para la producción e identificación de proteínas específicas se basan en diversas propiedades y fisicoquímicas, estructurales, funcionales, o en otras propiedades de las proteínas. Las propiedades fisicoquímicas o estructurales únicas permiten que las proteínas sean separadas e identificadas mediante procedimientos electroforéticos, tales como electroforesis en gel nativo o desnaturalizante o foco isoeléctrico, o mediante técnicas cromatográficas tales como cromatografía por intercambio de iones o cromatografía por exclusión en gel. Las estructuras únicas de las proteínas individuales ofrecen oportunidades para el uso de anticuerpos específicos para detectar su presencia en formatos tales como en el ensayo de ELISA. Las combinaciones de métodos se pueden utilizar para lograr una especificidad incluso mayor tal como western blot en la cual los anticuerpos se utilizan para localizar los productos génicos individuales que han sido separados mediante técnicas electroforéticas. Se pueden utilizar técnicas adicionales para confirmar de manera absoluta la identidad del producto de interés tal como la evaluación mediante la secuenciación de aminoácidos después de la purificación. Aunque éstos se encuentran entre los más comunes, también se pueden utilizar otros procedimientos. Los procedimientos de ensayos pueden identificar la expresión de proteínas por su funcionalidad, particularmente cuando la proteína expresada es una enzima capaz de catalizar reacciones químicas incluyen a sustratos específicos y a productos. Por ejemplo, en los extractos vegetales estas reacciones se pueden medir al proveer y cuantificar la pérdida de sustratos o la generación de los productos de la reacción mediante procedimientos físicos y/o químicos.

La actividad de la fosfofructocinasa o piruvato cinasa se puede medir in vitro utilizando dicho ensayo. Los ejemplos de dichos ensayos incluyen LeBras et al. (1991 ) y LeBras et al. (1993). Los estudios con radiotrazadores metabólicos pueden medir la generación de diferentes productos agrupados in vivo. En dichos estudios, los precursores radiactivamente marcados se proveen a los tejidos intactos y se monítorea el destino de la marca radiactiva conforme el precursor se metaboliza. En muchos casos, la expresión de un producto del gen se determina mediante la evaluación de los resultados fenotípicos de su expresión. Dichas evaluaciones pueden ser simplemente como observaciones visuales, o pueden incluir ensayos. Dichos ensayos pueden tomar muchas formas, tales como el análisis de los cambios en la composición química, morfología, o propiedades fisiológicas de la planta. La composición química se puede alterar por la expresión de genes que codifican enzimas o proteínas de almacenamiento de cambian su composición de aminoácidos y estos cambios se pueden detectar mediante análisis de aminoácidos, o por enzimas que cambian la cantidad de almidón, lo cual se puede analizar por espectrometría de reflectancía cercana al infrarrojo. Los cambios morfológicos pueden influir una mayor estatura o tallos más gruesos. Las moléculas de ácido nucleico, vectores y polipéptidos de esta invención se pueden utilizar en métodos agrícolas y en diversos ensayos de selección. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico se puede utilizar para expresar fosfofructocinasa vía un vector en una célula hospedera, para detectar el ARNm que codifica la fosfofructocinasa en una muestra biológica, para detectar una alteración genética en un gen que codifica la fosfof ructoci nasa vía un Southern blot, para suprimir la fosfofructocinasa, o para sobre-regular la fosfofructocinasa. Los polipéptídos se pueden utilizar para compensar las deficiencias en la fosfofructocinasa o para la presencia de una fosfofructocinasa mutada que tiene una actividad reducida o que no tiene actividad en una planta, o para tratar niveles excesivos de sustratos, ya sea de manera directa o indirecta, para la fosfofructocinasa en una planta. Alternativamente, los polipéptidos se pueden utilizar para seleccionar agentes por su capacidad para modular su actividad. Los anticuerpos se pueden utilizar para detectar y aislar los polipéptídos respectivos así como para disminuir la disposición de dichos polipéptidos in vivo.

Métodos Esta invención provee un método para incrementar el contenido de aceite en una semilla de una monocotiledónea en comparación con una semilla de una planta no transformada que tiene un fondo genético similar. En una modalidad, el método para incrementar el contenido de aceite comprende el paso de hacer crecer una planta monocotiledónea transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfofructocinasa diferente a SEQ ID NO:9 o 13 operativamente asociada a un promotor mejorado en semilla el cual está operativamente asociado de manera opcional a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito del plastídio excepto cuando el promotor mejorado en semilla es un promotor mejorado en embrión, para producir una semilla. En otra modalidad, el método para incrementar el contenido de aceite comprende el paso de introducir dentro de las células de la monocotiledónea una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfofructocinasa selecciona a partir del grupo que consiste de: a) secuencias de ácido nucleico que comprenden SEQ ID NO: 1 o 11 y b) secuencias de ácido nucleico que codifican SEQ ID NO: 2 o 12. En otra modalidad, el método para incrementar el contenido de aceite comprende el paso adicional de transformar la planta con una secuencia secundaria de ácido nucleico que codifica una piruvato cinasa, operativamente asociada a un promotor mejorado en semilla. En incluso otra modalidad, el método para incrementar el contenido de aceite comprende el paso adicional de ¡ntroducir dentro de una planta una secuencia secundaria de ácido nucleico que codifica una piruvato cinasa, seleccionar a partir del grupo que consiste de: a) una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 3 y b) una secuencia de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 4.

En diversas modalidades, la planta monocotiledónea se selecciona a partir del grupo que consiste de maíz (Zea mays), arroz (Oryza sativa), cebada (Hordeum vulgare), mijo (Panicum miliaceum), centeno (Sécale cereale), trigo (Tritícum aestivum), y sorgo (Sorghum bicolor). En diversas modalidades, el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste de promotores mejorados en embrión, promotores mejorados en endospermo y promotores mejorados en embrión y en endospermo.

Transformación vegetal En una modalidad de la ¡nvención, se produce una planta transgénica que expresa la proteína deseada o proteínas. Se conocen en la técnica diversos métodos para la introducción de una secuencia polinucleotídica deseada que codifica la proteína deseada dentro de células vegetales, incluyendo: (1 ) métodos físicos tales como microinyección, electroporación, y administración mediada por micropartículas (biolístícos o tecnología de pistola de genes); (2) administración mediada por virus; y (3) transformación mediada por Agrobacterium. Los métodos más comúnmente utilizados para la transformación de células vegetales son el procedimiento de transferencia de ADN mediado por Agrobacterium y los biolísticos o el procedimiento mediado por bombardeo de microproyectiles o micropartículas. Típicamente, se desea la transformación nuclear pero cuando es deseable transformar específicamente los plastidios, tales como cloroplastos o amiloplastos, los plastidios vegetales se pueden transformar utilizando una administración mediada por micropartículas de polinucleótido deseado. La transformación mediada por Agrobacterium se logra a través del uso de una bacteria de suelo genéticamente diseñada que pertenece al género Agrobacterium. Se pueden utilizar numerosas cepas de tipo silvestre y cepas desarmadas de Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes que contienen los plásmidos Tí o Ri para la transferencia del gen dentro de las plantas. La transferencia del gen se realiza vía la transferencia de un ADN específico conocido como "ADN-T" que se puede diseñar genéticamente para portar cualquier pieza deseada de ADN dentro de muchas especies vegetales, conoce elaborar adicionalmente, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. 6,265,638 a Bidney et al., la descripción de la cual se incorpora en la presente invención como referencia. La transformación genética de las plantas mediada por Agrobacterium incluye varios pasos. El primer paso, en el cual Agrobacterium virulenta y las células vegetales se ponen en contacto entre sí, generalmente se denomina "inoculación". La inoculación preferiblemente se acompaña por algún método de lesión a algunas de la células vegetales, lo cual libera constituyentes celulares vegetales, tales como coumaril alcohol, sinapinato (el cual se reduce hacia acetosiringona), sinapil alcohol, y coniferil alcohol, que activan los factores de virulencia en Agrobacterium. Después de la inoculación, Agrobacterium y las células/tejidos vegetales se dejan crecer juntos por un período de varias horas a varios días o más bajo condiciones adecuadas para crecimiento y para transferencia de ADN-T. Este paso se denomina "co-cultivo". Después del co-cultivo y la administración del ADN-T, las células vegetales se tratan con agentes bactericidas o bacteriostáticos para eliminar el Agrobacterium remanente en contacto con el explante y/o en el recipiente que contiene el explante. Si esto se realiza en la ausencia de I i cualesquiera agentes de selección para promover el crecimiento preferencial de las plantas transgénicas contra las plantas no transgénicas, entonces típicamente se refiere como el paso de "retraso". Si se realiza en la presencia de una presión de selección que favorece a las células de la planta transgénica, entonces se refiere como un paso de "selección". Cuando se utiliza un "retraso", éste típicamente es seguido por uno o más pasos de "selección". Con respecto al bombardeo por micropartículas (Patente de E.U.A. No. 5,550,318 (Adams et al.); Patente de E.U.A. No. 5,538,880 (Lundquist et. al.), Patente de E.U.A. No. 5,610,042 (Chang et al.); y Publicación PCT WO 95/06128 (Adams et al.); cada una de las cuales se I ! incorpora específicamente en la presente invención como referencia en su totalidad), las partículas microscópicas se revisten con ácidos nucleicos y se administran dentro de las células mediante una fuerza impulsora. Las partículas ejemplares incluyen aquellas comprendidas de tungsteno, platino, y preferiblemente, oro. Una modalidad ilustrativa de un método para la administración de ADN dentro de células vegetales mediante la aceleración es el Biolistics I Particle Delivery System (BioRad, Hercules, CA), el cual se puede utilizar para impulsar partículas revestidas con ADN o células a través de una pantalla, tal como una pantalla de acero inoxidable o una pantalla de Nytex, sobre una superficie de filtro revestida con células de una planta monocotiledónea cultivadas en suspensión. Las técnicas de bombardeo por micropartículas son ampliamente aplicables, y se pueden utilizar para transformar virtualmente cualesquiera especies vegetales. Los ejemplos de especies que han sido transformadas mediante bombardeo por micropartículas incluyen especies monocotiledóneas tales como maíz (Publicación Internacional No. WO 95/06128 (Adams et al.)), cebada, trigo (Patente de E.U.A. No. 5,563,055 (Townsend et al.) incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad), arroz, avena, centeno, caña de azúcar, y sorgo; así como numerosas dicotiledóneas incluyendo tabaco, frijol de soya (Patente de E.U.A. No. 5,322,783 (Tomes et al.), incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad), girasol, cacahuate, algodón, tomate, y legumbres en general (Patente de E.U.A. No. 5,563,055 (Townsend et al.) incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad). Para seleccionar o evaluar las células vegetales transformadas sin importar la metodología de transformación, el ADN introducido dentro de la célula contiene un gen que funciona en un tejido vegetale regenerable para producir un compuesto que confiere al tejido vegetale resistencia a un compuesto que sería tóxico de otra manera. Los genes de interés para uso como marcadores de selección, que se pueden explorar, o evaluar podría incluir pero no se limitan a beta-glucuronidasa (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), luciferasa (LUX), genes de tolerancia a antibióticos o a herbicidas. Los ejemplos de genes para resistencia antibióticos incluyen las penicilinas, canamicina (y neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (y trimetoprim); cloramfenicol; canamicina y tetraciclina. Las moléculas polinucleotídicas que codifican proteínas que participan en la tolerancia al herbicida se conocen en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a una molécula polinucleotídica que codifica la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) descrita en la Patente de E.U.A. No. 5,627,061 (Barry, et al.), Patente de E.U.A. No 5,633,435 (Barry, et al.), y Patente de E.U.A. No 6,040,497 (Spencer, et al.) y aroA descrita en la Patente de E.U.A. No. 5,094,945 (Comai) para la tolerancia al glifosato; una molécula polinucleotídíca que codifica bromoxinil nitrilasa (Bxn) descrita en la Patente de E.U.A. No. 4,810,648 (Duerrschnabel, et al.) para la tolerancia a Bromoxinil; una molécula polinucleotídica que codifica fitoeno desaturasa (crtl) descrita en Misawa et al. (1993) y Misawa et al. (1994) para la tolerancia al norflurazon; una molécula polinucleotídica que codifica acetohidroxiácido sintasa (AHAS, aka ALS) descrita en Sathasiivan et al. (1990) para la tolerancia a las herbicidas de sulfonilurea; y tanto el gen PAT descrito en Wohlleben et al. (1988) como el gen bar descrito en DeBlock et al. (1987) cada uno de los cuales provee tolerancia al glufosinato y a bialafos. hkl La generación, desarrollo, y cultivo de plantas a partir de diferentes explantes transformadas están bien documentados en la técnica. Este proceso de regeneración y crecimiento típicamente incluye los pasos de seleccionar células transformadas y cultivar aquellas células individualizadas a través de las etapas usuales de desarrollo embrionario a una etapa de plántula con raíz. Los embriones transgénicos y las semillas se regeneran de manera similar. Los brotes transgénicos con raíz resultantes se siembran entonces en un medio apropiado para crecimiento vegetales tal como el suelo. Las células que sobreviven a la exposición al agente de selección, o células que han sido evaluadas como positivas en un ensayo de selección, se pueden cultivar en medios que mantienen la regeneración de las plantas. Las plántulas en desarrollo se transfieren a una mezcla para crecimiento vegetales con menos suelo, y se endurecen, antes de la transferencia a un invernadero o cámara de crecimiento para maduración. Esta invención se puede utilizar con cualquier célula o tejido transformable. Por transformable como se utiliza en la presente invención se entiende una célula o tejido que es capaz de llevar a cabo una propagación adicional para dar lugar a una planta. Aquellos expertos en la técnica reconocen que numerosas células o tejidos vegetales se pueden transformar, en los cuales después de la inserción del ADN exógeno y de las condiciones de cultivo adecuadas las células o tejidos vegetales se puede formar hacia una planta diferenciada. El tejido adecuado para estos propósitos puede incluir pero no se limita a embriones inmaduros, tejido escutelar, cultivos de células en suspensión, inflorescencias inmaduras, meristemo del brote, explantes nodales, tejido del callo, tejido de hípocotiledón, cotiledones, raíces, y hojas. La patente a Tomes et al. 783, anteriormente citada, describe un método para el tratamiento con una citoquinina seguido por la incubación por un periodo suficiente para permitir que las células no diferenciadas en el tejido del nodo del cotiledón se diferencien hacia células meristemáticas y para permitir que las células entren en las fases entre las fases G1 y de división para el desarrollo, lo cual se ha establecido que mejora la susceptibilidad a la transformación. Se utiliza cualquier medio de cultivo vegetal adecuado. Los medios adecuados incluyen pero no se limitan a medio basado en MS (Murashige y Skoog, 1962) o medio basado en N6 (Chu et al., 1975) suplementado con reguladores adicionales para crecimiento vegetal incluyendo pero limitados a auxinas, citoquininas, ABA, y giberelinas. Aquellos expertos en la técnica se están familiarizados con la variedad de medios de cultivo para tejidos, los cuales cuando se suplementan de manera apropiada, mantienen el crecimiento del tejido vegetal y el desarrollo y son adecuados ! I para la transformación de la planta y la regeneración. Estos medios de cultivo i I I ! para tejidos se pueden obtenerlas ya sea a partir de una preparación comercial, o se pueden preparar y modificar de manera habitual. Aquellos expertos en la técnica están conscientes de que el medio y los suplementos I i para el medio tales como nutrientes y reguladores del crecimiento para uso en transformación y regeneración y otras condiciones de cultivo tales como la intensidad de la luz durante la incubación, pH, y las temperaturas de incubación se pueden optimizar para la variedad particular interés. Después de que se incorpora de manera estable un cassette de expresión en las plantas transgénicas y se confirma que es operable, éste se puede producir dentro de otras plantas de la misma especie o de otras especies sexualmente compatibles mediante cruza sexual. Se puede utilizar cualquiera de numerosas técnicas de cruza estándar, dependiendo de las especies a ser cruzadas.

Semillas, harina, aceite y productos que comprenden semillas, harina y aceite Esta invención también provee un contenedor de más de aproximadamente 1000, más preferiblemente de aproximadamente 20,000, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 40,000 semillas en donde aproximadamente 10%, más preferiblemente aproximadamente 25%, más preferiblemente aproximadamente 50%, e incluso más preferiblemente aproximadamente 75% o más preferiblemente aproximadamente 90% de las semillas son semillas derivadas a partir de una planta de esta invención. Esta ¡nvención también provee un contenedor de más de aproximadamente 10 kg, más preferiblemente de aproximadamente 25 kg, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 50 kg de semillas en donde aproximadamente 10%, más preferiblemente aproximadamente 25%, más preferiblemente aproximadamente 50%, e incluso más preferiblemente aproximadamente 75% o más preferiblemente aproximadamente 90% de las semillas son semillas derivadas a partir de una planta de esta invención. Cualesquiera de las plantas a partir de las mismas de esta invención se pueden cosechar y, opcionalmente, procesar para producir una preparación de forraje, harina, o aceite. Una parte vegetal particularmente preferida para este propósito es el grano cosechado, pero se pueden cosechar otras partes vegetales y utilizar para estufa o ensilaje. En una modalidad la preparación de forraje, harina, o aceite se formula para animales rumiantes. En dichas formulaciones, el contenido incrementado de aceite en el grano y la harina que se realiza por esta invención provee una "desviación de la grasa" que es especialmente útil para proveer una ingesta calórica incrementada a las vacas lecheras después de parir con menores riesgos de acidosis. Los métodos para producir preparaciones de forraje, harina, y aceite se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Patentes de E.U.A. 4,957,748; 5,100,679; 5,219,596; 5,936,069; 6,005,076; 6,146,669; y 6,156,227. El grano o harina de esta invención se puede mezclar con otros granos o harinas. En una modalidad, la harina producida a partir del grano cosechado de esta invención o generado mediante un método de esta ¡nvención constitucional de aproximadamente 0.5%, aproximadamente 1%, aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 25%, aproximadamente 50%, aproximadamente 75%, o aproximadamente 90% en volumen o peso del componente de la harina de cualquier producto. En otra modalidad, la preparación de harina se puede mezclar y puede constituir más de aproximadamente 10%, aproximadamente 25%, aproximadamente 35%, I i aproximadamente 50%, o aproximadamente 75% de la mezcla en volumen. El aceite de maíz y/o la harina de maíz producida de conformidad con esta invención se puede combinar con una variedad de otros ingredientes. Los ingredientes específicos incluidos en un producto serán determinados de conformidad con el uso final del producto. Los productos ejemplares incluyen forraje animal, material crudo para modificación química, plástico biodegradable, producto alimenticio mezclado, aceite comestible, aceite para cocinar, lubricante, biodiesel, bocadillos, cosméticos, y material crudo para proceso de fermentación. Los productos que incorporan la harina descritos en la presente ¡nvención también incluyen forrajes completos o parcialmente completos para cerdo, aves de corral, y ganado, alimentos para mascotas, y productos alimenticios para humanos tales como bocadillos extruidos, panes, como un agente aglutinante del alimento, forrajes de uso en acuacultura, mezclas fermentables, suplementos alimenticios, bebidas deportivas, barras de alimentos nutritivos, suplementos de multi-vitaminas, bebidas de dieta, y cereales. La harina de maíz se somete opcionalmente a métodos convencionales para la separación del almidón y de los componentes proteicos. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, procedimientos de molido en seco, molido en húmedo, bombeo a alta presión, o procedimientos criogénicos. Estos y otros procedimientos adecuados se describen en Watson ki (1987), la descripción del cual se ¡ncorpora en la presente invención como referencia. Otros granos de monocotiledónea de esta invención, incluyendo trigo, cebada, sorgo y arroz se puede procesar de manera similar o moler para producir forrajes, harinas, almidones, meáis, jarabes, cereales y bebidas fermentadas bien conocidas en la técnica. Esta invención se describe adicionalmente en el contexto de los siguientes ejemplos. Estos ejemplos sirven para ilustrar adicionalmente esta invención y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

EJEMPLOS Aquellos expertos en la técnica apreciarán las muchas ventajas de los métodos y composiciones provistas por la presente invención. Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades de la invención. Se debe apreciar por aquellos expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos a continuación representan técnicas descubiertas por los interventores para funcionar bien en la práctica de la invención. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que se puedan realizar muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y aún así obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Todas las referencias citadas en la presente invención se incorporan aquí como referencias hasta el grado en que éstas suplementan, explican, proveen un fondo para, o enseñan la metodología, técnicas, o composiciones empleadas en la presente invención.

EJEMPLO 1 Clonación de los genes pfk y pyk de Lactobacillus delbreuckii subspecies bulgaricus Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus (ATCC cepa 11842) se obtuvo a partir de ATCC (Manassas, VA) y se creció en un caldo ATCC 416. El gen pfk de L. delbreuckii subsp. bulgaricus se amplificó medíante PCR™ como un producto de 967 pb a partir de una alícuota de cultivo lisado utilizando un iniciador hacia 5' (Oligo. # 17166) (SEQ ID NO: 5) para introducir un sitio de clonación Ascl cascada arriba del marco de lectura abierto de pfk (ORF) y un iniciador hacia 3' (Oligo. # 17167) (SEQ ID NO:6) para introducir un sitio de clonación Sbfl justo cascada abajo del ORF. De manera similar, the pyk gene se amplificó mediante PCR™ amplified as a 1777 pb product from an aliquot of the lysed culture utilizando un iniciador hacia 5' (Oligo. # 17168) (SEQ ID NO:7) para introducir un Ascl cloning site just upstream of the pyk ORF y un iniciador hacia 3' (Oligo. # 17169) (SEQ ID NO:8) para introducir un sitio de clonación Sbfl cascada abajo del ORF. Los productos de PCR pfk y pyk se clonaron cada uno dentro de pCR2.1 mediante clonación Topo TA (Invitrogen, Carisbad, CA). Las clonas se seleccionaron para el injerto apropiado mediante PCR™ utilizando los oligos previamente descritos. Las clonas que fueron positivas mediante PCR a los genes pfk o pyk se monitorearon mediante análisis de restricción para conflrmar la presencia de los sitios de clonación flanqueantes introducidos por la PCR™ y luego mediante secuenciación. La figura 1 muestra un alineamiento de la secuencia codificante del gen pfk (SEQ ID NO:1 ) aislado a partir de Lactobacillus delbreuckíi subspecies bulgaricus ATCC cepa 11842 con la secuencia publicada de gen pfk (EMBL # de acceso X71403). Se presentó una diferencia entre la secuencia anteriormente obtenida y la secuencia publicada; la secuencia publicada tiene una A en el residuo codificante 261 mientras que el gen aislado como se describió anteriormente tiene una G en esa posición. El alineamiento de las secuencias pronosticadas de la proteína PFK (por ejemplo SEQ ID NO: 2) reveló que fueron idénticas. La secuencia de ADN del gen pyk de Lactobacillus delbreuckii subspecies bulgaricus (SEQ ID NO: 3) también se obtuvo y fue idéntica a la secuencia publicada (EMBL # de acceso X71403). Por lo tanto la secuencia pronosticada de proteína (SEQ ID NO: 4) fue idéntica a la secuencia publicada pronosticada para la proteína PYK.

CUADRO 1 EJEMPLO 2 Construcción de vectores para transformación dirigida al embrión PMON72008 El gen pfk de 967 pb Ascl/Sbfl descrito en el ejemplo 1 se clonó dentro de los sitios Ascl/Sse8387l cascada abajo de las secuencias del promotor de L3 oleosina del maíz (P-Zm.L3) y del intrón de actina del arroz (I-Os.Act) en el vector de transformación binario de E. coli/Agrobacterium tumefaciens pMON71055 para formar pMON72004. De manera similar, el gen pyk de 1777 pb Ascl/Sbfl descrito en el ejemplo 1 se clonó dentro de los sitios Ascl/Sse8387l cascada abajo de las secuencia P-Zm.L3 y l-Os.Act en el vector de transformación binario de E. coli/A. tumefaciens pMON71055 para formar pMON72005. Se preparó la construcción del gen doble pfk/pyk (pMON72008) mediante el aislamiento de un fragmento de 7165 pb Pmel/Xbal a partir de pMON72004 que contenía el cassette pfk, haciendo romo el fragmento utilizando Pfu polimerasa, y luego clonando el fragmento con extremos romos dentro del sitio Pmel de pMON72005. La construcción final, pMON72008 (figura 2) se confirmó mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.

PMON79823 El fragmento de 3616 pb Pmel/Xbal a partir del pMON72004 se utilizó para reemplazar el fragmento de 2145 pb Pmel/Xbal a partir del vector de expresión en germen pMON71273 para hacer pMON79823 (figura 3), que contenía el gen pfk dirigido por P-Zm.L3 con el l-Os.Act.

PMON79824 El fragmento de 4426 pb Pmel/Xbal a partir del pMON72005 se utilizó para reemplazar el fragmento de 2145 pb Pmel/Xbal a partir del vector de expresión en germen pMON71273 para hacer pMON79824 (figura 4), que contenía el gen pyk dirigido por P-Zm.L3 con el l-Os.Act.

PMON79827 El fragmento de 6809 Pmel/Kspl a partir de pMON79824 se utilizó para reemplazar el fragmento de 2358 pb Smal/Kspl a partir de pMON79823 para hacer pMON79827 (figura 5) que contenía los genes pfk y pyk, cada uno dirigido por P-Zm.L3 con el l-Os.Act.

EJEMPLO 3 Construcción de los vectores dirigidos al endospermo PMON72028 El gen pfk de 967 pb Ascl/Sbfl descrito en el ejemplo 1 anteriormente mencionado se clonó dentro de los sitios Ascl/Sse8387l cascada abajo de las secuencias del promotor Z27 de Zea mays (P-Zm.Z27) y del intron Hsp70 de Z. mays (l-Zm.DnaK) en pMON68203 para hacer pMON72012. De manera similar, el gen pyk de 1777 pb Ascl/Sbfl descrito en el ejemplo 1 anteriormente mencionado se clonó dentro de los sitios Ascl/Sse8387l cascada abajo del las secuencias P-Zm.Z27 y l-Zm.DnaK en pMON68203 para hacer pMON72013. El vector para co-expresión de los genes pfk y pyk se preparó mediante el aislamiento del fragmento 3256 pb Pmel/EcoRI que contenía el cassette de expresión pfk a partir de pMON72012, se hicieron romos los extremos del fragmento con Pfu polimerasa, y se clonó dentro del sitio Pmel de pMON72013 (figura 5) para dar pMON72015. Para mejorar la estabilidad del vector pfk pyk durante la transformación con A. tumefaciens, el número de elementos repetitivos se redujo mediante el reemplazo del fragmento de 7318 pb Pmel/EcoRI de la estructura base de vector pMON72015 con el fragmento de 5496 pb Pmel/EcoRI de la estructura base de vector pMON72021 para generar el vector de transformación final con gen doble pMON72028 (figura 6).

PMON79832: El gen 973 pfk de pb Notl/Sse8387l descrito en el ejemplo 1 anteriormente mencionado se clonó dentro de los sitios Bsp120l/Sse8387l cascada abajo de las secuencias P-Zm.Z27 y l-Zm.DnaK en pMON71274 para hacer pMON79832 (figura 7), que contenía el gen pfk dirigido por P-Zm.Z27 con el l-Zm.DnaK.

PMON81470: El gene pyk de 1783 pb Notl/Sse8387l descrito en el ejemplo 1 anteriormente mencionado se clonó dentro de los sitios Notl/Sse8387l de pMON71274 cascada abajo de las secuencias P-Zm.Z27 y l-Zm.DnaK. El cassete del gen pyk del vector resultante se cortó entonces con Ascl/Srfl y se ligó dentro de los sitios Mlul/Srfl de pMON79832 anteriormente descrito para hacer pMON81470 (figura 8), que contenía los genes pfk y pyk, cada uno dirigido por P-Zm.Z27 con el I- Zm.DnaK.

PMON72029 El fragmento de ADN de 1199 pb Ascl/Sse8387l que contenía la subunidad pequeña del péptido de tránsito cloroplasto de Nicotiana tabacum (SSU-CTP) se fusionó al gen pfk a partir de pMON72006 clonado dentro de los sitios Ascl/Sse8387l de pMON68203 para formar pMON72017. De manera similar, el fragmento de 2041 pb Ascl/Sse8387l que contenía la SSU-CTP de N. tabacum se fusionó al gen pyk a partir de pMON72007 clonado dentro de los sitios Ascl/Sse8387l de pMON68203 para formar pMON72019. El vector para co-expresión de los genes pfk y pyk se preparó mediante el aislamiento del fragmento de ADN de 3204 pb Pmel/EcoRI que contenía el cassette de expresión pfk a partir de pMON72017, se hicieron romos los extremos del fragmento con Pfu polimerasa, y se clonó dentro del sitio Pmel de pMON72019 para dar pMON72020. Para mejorar la estabilidad de este vector con gen doble pfk/pyk durante la transformación con Agrobacterium tumefaciens, el número de elementos repetitivos se redujo medíante el reemplazo del fragmento de la estructura base fragmento de 7135 pb Pmel/EcoRI de la estructura base de vector de pMON72020 con el fragmento de 5496 pb Pmel/EcoRI de la estructura base de vector de pMON72021 para generar el vector de transformación final con gen doble pMON72029 (figura 9). PMON83715 El fragmento de ADN de 1.2 kb Notl/Sse8387l a partir de pMON72017 que contenía la subunidad pequeña del péptido de tránsito del cloroplasto de Nicotiana tabacum (SSU-CTP) fusionado al gen pfk se clonó dentro de los sitios Notl/Sse8387l del plásmido para selección de glifosato pMON93102 cascada abajo del promotor Z27 de Zea mays (P-Zm.Z27) y el intrón Hsp70 de Z. mays (l-Zm.DnaK) para hacer pMON83715 (figura 10).

EJEMPLO 4 Transformación del maíz Las líneas Élite del maíz (Corn States Hybrid Serv., LLC, Des Moines, IA) se utilizan para transformación en conexión con esta invención. Estas incluyen LH59 (transformada con pMON72008, pMON72028, pMON72029), LH172 (transformada con pMON72008, pMON72028), y LH244 (transformada con pMON79823, pMON79824, pMON79827, pMON79832, pMON81470). Los explantes transformados se obtuvieron a través de la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens para todas las construcciones excepto para pMON72029, la cual se obtuvo a través de bombardeo por micropartículas. Las plantas se regeneraron a partir del tejido transformado. Las plantas crecidas en invernadero se analizaron entonces para los niveles de expresión del gen de interés así como para los niveles de aceite y de proteína.

EJEMPLO 5 Análisis de las construcciones PFK y PK dirigidas al citosol en expresadas en el endospermo PMON72028 La construcción pMON72028 se diseñó para producir la expresión de ambos genes pfk y pyk dirigidos al citosol en el endospermo. Los granos maduros a partir de la primera generación se analizaron mediante PCR™ para los transgenes pfk y pyk. Se analizaron sesenta y siete eventos mediante RMN y PCR™ de un grano particular. 64 eventos fueron positivos mediante PCR para el transgén pyk y 7 de éstos también fueron positivos para el transgén pfk. Dos eventos que contenían ambos genes demostraron ser positivos mediante PCR de los granos que fueron estadísticamente mayores que niveles de aceite de grano total mediante la comparación con los granos negativos mediante PCR (incremento máximo de 0.73%, P=0.05). Los 7 eventos que positivos para ambos transgenes se sembraron en el campo. El análisis de NIT (transmitancia cercana al infrarrojo) del aceite revelaron que para 3 eventos hubo una diferencia significativa en porcentaje medio de aceite en el grano total para los granos agrupados a partir de las mazorcas segregantes positivas y negativas a canamicina. Estos eventos, 62221 , 71907 y 73131 , tuvieron incrementos estadísticamente significativos en los niveles de aceite en las mazorcas positivas (1.2%, 0.8%, 0.5%, P=0.05) respectivamente. Los niveles de aceite estuvieron elevados en los 4 eventos remanentes que se sabe que contienen ambos transgenes, pero la elevación no fue significativa a P=0.05. Cinco eventos de la construcción pMON72028 que contenían ambos transgenes pfk y pyk y sus segregantes negativos se cruzaron con los diferentes pruebas. La primera prueba fue una cruza convencional stiff stalk y la segunda fue una prueba con stiff stalk con un fenotipo de alto contenido de aceite (7.5% per se de aceite). Las semillas híbridas F1 se sembraron en 6 ubicaciones es un diseño que resultó en la separación de las líneas que contenían el transgén a partir de las líneas sin un transgén medíante un intervalo de machos híbridos estériles. Los registros se tomaron al azar preferentemente en cada ubicación. Se cosecharon seis mazorcas a mano a partir del centro de cada una de las parcelas, were shelled, y los demás se analizaron para aceite, proteína y almidón mediante transmitancia cercana al infrarrojo (NIT). El porcentaje de aceite se incrementó en los 5 eventos de +0.5% a +1.1% con ambas pruebas (p<0.005).

PMON79832, F1 El análisis de aceite por RMN de los granos F1 a partir de 26 eventos pMON79832 en LH244 revelaron que los granos positivos a pfk mediante PCR a partir de 9 de los 26 eventos evaluados fueron significativamente superiores (P=0.05) en el porcentaje de aceite del grano total, con un incremento máximo de 0.95%. Considerando juntos todos los eventos, la prueba T de student reveló que el porcentaje medio de aceite del grano para los granos positivos mediante PCR (3.85%) fue significativamente mayor (0.19%) (P<0.0001 ) en la media para los granos negativos mediante PCR (3.66%). El análisis del tejido de endospermo disecado reveló que los granos positivos mediante PCR a partir de 8 de los eventos tuvieron significativamente (P=0.05) mayor porcentaje de aceite en el endospermo que los granos negativos (incremento máximo de 0.48%) y 7 eventos tuvieron significativamente (P=0.05) mayor aceite en el endospermo total en una base de mg/grano (incremento máximo de 0.48 mg/grano) a pesar del hecho de que el endospermo total en peso seco se redujo significativamente (P=0.05) (disminución media de 8 mg/grano, disminución máxima de 41 mg/grano).

PMON81470, F1 El análisis del aceite por RMN en granos F1 a partir de 20 eventos pMON79832 en LH244 reveló que los granos positivos a pfk mediante PCR a partir de 9 de los 20 eventos fueron significativamente (P=0.05) mayores en el porcentaje de aceite en grano total, con un incremento máximo de 1.1%. Considerando todos los eventos juntos, la prueba T de student reveló que el porcentaje medio de aceite en grano para los granos positivos mediante PCR (4.47%) fue significativamente mayor (0.4%, P<0.0001 ) que la media para los granos negativos (4.07%). El análisis de tejido de endospermo disecado reveló que los granos positivos mediante PCR a partir de 9 de los eventos tuvieron significativamente (P=0.05) mayor porcentaje de aceite en el endospermo que los granos negativos (incremento medio de 0.3%, incremento máximo de 0.62%) y 6 eventos tuvieron significativamente mayor aceite en el endospermo total en una base de mg/grano (incremento medio, 0.28 mg/grano; incremento máximo, 0.48 mg/grano) (P=0.05) a pesar del hecho de que el endospermo total en peso seco se redujo significativamente (disminución media 30 mg/grano) (P=0.05). Comparando estos datos con los datos a partir de la construcción sólo con pfk (pMON79832) parece que la magnitud de la diferencia del contenido de aceite es mayor o la construcción de doble gen pMON81470 y existe una mayor frecuencia de eventos con un incremento en los niveles de aceite.

EJEMPLO 6 Análisis de la construcción dirigida al plastidio expresada en el endospermo La construcción pMON72029 se diseñó para producir la expresión de ambos genes pfk y pyk dirigidos al plastidio en endospermo de maíz. Se llevaron a cabo cruzas recíprocas entre las plantas transgénicas que contenían pMON72029 y LH59 no transgénico y los granos maduros se cosecharon a partir de 62 eventos separados. El análisis de grano particular reveló que la concentración media de aceite en endospermo se incrementó significativamente en 9 de los 13 eventos encontrados que contenían ambos transgenes mediante PCR™ (incremento medio de 0.94%, incremento máximo de 1.7%, P=0.05). Ninguno de los 3 eventos que contenía solamente el gen pyk tuvieron un porcentaje elevado de aceite en endospermo. En términos del porcentaje de aceite en grano total, 10 de los 13 eventos que contenían ambos transgenes tuvieron significativamente (P=0.05) un porcentaje incremento de aceite en grano total (incremento medio de 1.75%, incremento máximo de 2.9%). En términos de la cantidad absoluta de aceite/grano, 4 de los 13 eventos con ambos genes éstos tuvieron significativamente (P=0.05) un incremento en los miligramos de aceite/grano (incremento medio de 1.5mg/grano, incremento máximo de 2.5 mg/grano).

EJEMPLO 7 Análisis de las construcciones PFK y PK dirigidas al citosol expresadas en el germen PMON79823, F1 El análisis de RMN de los niveles de aceite en los granos disecados positivos al gen pfk mediante PCR y los granos negativos F1 para 20 eventos a partir de pMON79823 reveló que 7 de los 20 eventos analizados tuvieron significativamente (P=0.05) mayor porcentaje de aceite en el germen en los granos positivos (incremento medio de 1.7%, incremento máximo de 5.8%). También, 7 eventos tuvieron significativamente (P=0.05) mayor porcentaje de aceite en el endospermo en los granos positivos (incremento medio de 0.14%, incremento máximo de 0.34%), 4 de los cuales fueron los mismos eventos que tuvieron el incremento en el porcentaje de aceite en el germen.

PMON79824, F1 El análisis de aceite por RMN de los granos positivos al gen pyk mediante PCR y los granos negativos F1 para 24 eventos a partir de pMON79824 reveló que el porcentaje de aceite en el germen no cambió en todos sino solamente en 1 de los eventos y, de manera similar, el porcentaje de aceite en el grano completo no cambió en todos sino solamente en 1 evento diferente. Una frecuencia de 1/24 para los eventos con niveles alterados de aceite no fue mayor de lo que se podría esperar en la variación al azar. Por lo tanto, parece que el transgén pyk transgén solo bajo estas condiciones no afecta los niveles de aceite.

PMON79827, F1 Los eventos pfk/pyk fueron inicialmente seleccionados para el transgén pfk. El análisis de aceite por RMN de los granos positivos al gen pfk mediante PCR y los granos negativos F1 para los 24 eventos a partir de pMON79827 reveló que 10 de los 20 eventos tuvieron significativamente (P=0.05) un porcentaje incrementado de aceite en el germen (incremento medio de 2.23%, incremento máximo de 5.39%). También, a pesar del promotor que está mejorado en el germen, el porcentaje de aceite en el endospermo se incrementó en 5 de los eventos 20.

PMON72008 La construcción pMON72008 se transformó en la variedad élite LH172. La prueba de comparación T de student de porcentaje medio de aceite en el germen determinado por el análisis de RMN del tejido de germen maduro disecado a partir de 32 eventos reveló que la media de todos los granos positivos al gen pfk mediante PCR a través de todos los eventos fue mayor que la media para los granos negativos en un valor absoluto de 2.59 % y esta diferencia fue estadísticamente significativa (p=0.05). El incremento máximo observado fue del 3.5%. El promedio de porcentaje de aceite en grano total para los granos positivos al gen pfk mediante PCR a través de todos los eventos (2.89%) fue ligeramente menor que la media para los granos negativos (3.01 %) aunque esta diferencia no fue significativa a P=0.05. Aunque la expresión de los transgenes se dirigió por el promotor de L3 oleosina, el cual se expresa preferiblemente en el tejido del germen, hubo un pequeño incremento pero estadísticamente significativo en el porcentaje promedio de aceite en el endospermo a través de todos los eventos para los granos positivos al gen pfk mediante PCR en comparación con los granos negativos (incremento medio de 0.07%, incremento máximo de 0.24%).

El análisis adicional de expresión del transgén para los genes pfk y pyk en los granos en desarrollo a partir de los eventos en pMON72008 se llevó a cabo tanto mediante el análisis de western blot para evaluar la expresión de la proteína como mediante ensayos enzimáticos. El análisis de western blot reveló que todos los 30 eventos positivos al gen pfk mediante PCR expresaban la proteína PK, mientras que se encontró que 29 de los 30 expresaban la proteína PFK. La proteína PK siempre se expresó a un mayor nivel que la proteína PFK. La actividad enzimátíca resulta de consistente con los resultados de expresión de la proteína en western blot. La elevación en la actividad de la PK fue mayor que la elevación en la actividad de la PFK, de conformidad con los resultados de expresión de proteína.

EJEMPLO 8 Construcción de los vectores de transformación que expresan fosfofructocinasa de Propionibacterium freudenreichii Se generaron las construcciones adicionales específicas de la semilla que expresan la fosfofructocinasa a partir del Propionibacterium freudenreichii. Para la expresión citosólica en el endospermo, el gen pfk de P. freudenreichii pfk (Genbank # de acceso M67447) (SEQ ID NO: 11) se amplificó y se clonó cascada abajo del promotor Z27 de zeina del maíz opcionalmente seguido por el intrón DnaK del maíz como un potencíador en un vector diseñado para la transformación del maíz. Para la expresión plsatidial en el endospermo, el gen pfk de P. freudenreichíi (SEQ ID NO: 11) se amplificó y se clonó cascada abajo del promotor Z27 de zeina del maíz seguido por la SSU CTP de N. tabacum fusionada al gen pfk en un vector diseñado para transformación del maíz. Para la expresión citosólica en el germen, el gen pfk de P. freudenreichii (SEQ ID NO: 11 ) se amplificó y se clonó cascada abajo del promotor PER1 de la cebada opcionalmente seguido por el intrón DnaK del maíz como un potenciador en un vector diseñado para la transformación del maíz. Los explantes transformado se obtuvieron a través de la transformación para todas las construcciones. Las plantas se regeneraron a partir del tejido transformado. Las plantas crecidas en invernadero se analizaron entonces para los niveles de expresión del gen de interés así como para los niveles de aceite y de proteína. Todas las composiciones y métodos descritos y reclamados en la presente invención se pueden elaborar y ejecutar sin llevar a cabo experimentación a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de las modalidades ilustrativas precedentes, será evidente a aquellos expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones, cambios, modificaciones, y alteraciones a la composición, métodos, y en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos descritos en la presente invención, sin apartarse del concepto verdadero, espíritu, y alcance de la ¡nvención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están tanto químicamente como fisiológicamente relacionados se pueden sustituir por los agentes descritos en la presente invención y que se podrían lograr resultados parecidos o similares. Para los sustituyentes similares y modificaciones evidentes a aquellos expertos en la técnica se consideran dentro del espíritu, alcance, y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones anexas.

Referencias Las siguientes referencias, se incorporan específicamente en la presente invención como referencias hasta el grado en que provean procedimientos ejemplares u otros detalles suplementarios a aquellos establecidos en la presente invención. Patente de E.U.A. 4,518,584; Patente de E.U.A. 4,737,462; Patente de E.U.A. 4,810,648; Patente de E.U.A. 4,957,748; Patente de E.U.A. 5,094,945; Patente de E.U.A. 5,100,679; Patente de E.U.A. 5,196,525; Patente de E.U.A. 5,219,596; Patente de E.U.A. 5,290,924; Patente de E.U.A. 5,322,783; Patente de E.U.A. 5,359,142; Patente de E.U.A. 5,424,398; Patente de E.U.A. 5,424,412; Patente de E.U.A. 5,500,365; Patente de E.U.A. 5,538,880; Patente de E.U.A. 5,550,318; Patente de E.U.A. 5,563,055; Patente de E.U.A. 5,610,042; Patente de E.U.A. 5,627,061 ; Patente de E.U.A. 5,633,435; Patente de E.U A. 5,641 ,876; Patente de E.U.A. 5,936,069; Patente de E.U.A. 6,005,076; Patente de E.U.A. 6,040,497; Patente de E.U.A. 6,146,669; Patente de E.U.A. 6,156,227; Patente de E.U.A. 6,265,638; Patente de E.U.A. 6,433,252; Patente de E.U.A. 7,012,171 Barany et al., Int. J. Peptide Proteín Res., 30: 705-739, 1987.

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Claims (22)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para la producción de una planta monocotiledónea que tiene concentración incrementada de aceite en su semilla, que comprende introducir dentro de dicha planta un polinucleótido que codifica una fosfofructocinasa, operativamente asociada a un promotor mejorado en semilla en donde el contenido de aceite de la semilla se incrementa en comparación con una semilla de una planta isogénica que carece de la secuencia de ácido nucleico.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido que codifica una fosfofructocinasa comprende una secuencia diferente a SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 13.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido que codifica una fosfofructocinasa está operativamente asociado a un polinucleótido que codifica un péptido de tránsito del plastidio excepto cuando dicho promotor mejorado en semilla es un promotor mejorado en embrión.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de: (a) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 11 ; y (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 12.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el polinucleótído comprende una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de (a) o (b) o un complemento de la misma bajo condiciones de alta severidad de aproximadamente 0.2 x SSC y 65°C.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la planta comprende adicionalmente un polinucleótido que codifica una piruvato cinasa operativamente asociada a un promotor mejorado en semilla.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el polinucleótido que codifica una piruvato cinasa comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de: (a) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3; y (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 4.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de (a) o (b) o un complemento de la misma bajo condiciones de alta severidad de aproximadamente 0.2 x SSC y 65°C.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la planta es una monocotiledónea seleccionada a partir del grupo que consiste de maíz (Zea mays), arroz (Oryza sativa), cebada (Hordeum vulgare), mijo (Panícum miliaceum), centeno (Sécale cereale), trigo (Triticum aestívum), y sorgo (Sorghum bicolor).

10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste de promotores mejorados en embrión, promotores mejorados en endospermo y promotores mejorados en embrión y en endospermo.

11.- Una planta monocotiledónea que comprende un polinucleótido que codifica una fosfofructocinasa, operativamente asociada a un promotor mejorado en semilla.

12.- La planta de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque el polinucleótido que codifica una fosfofructocínasa comprende una secuencia diferente a SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 13. üh-L

13.- La planta de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque el polinucleótido que codifica una fosfofructocinasa se asocia a un polinucleótído que codifica un péptido de tránsito del plastidio excepto cuando dicho promotor mejorado en semilla es un promotor mejorado en embrión.

14.- Una célula de planta monocotiledónea que comprende un polinucleótido que codifica una fosfofructocinasa, operativamente asociada a un promotor mejorado en semilla.

15.- Una semilla producida a partir de la planta de conformidad con la reivindicación 11 , que comprende un polinucleótido que codifica una fosfofructocinasa de la reivindicación 7.

16.- Una harina producida a partir de la semilla de conformidad con la reivindicación 15, que comprende un polinucleótido que codifica una fosfofructocinasa de la reivindicación 11.

17.- Una composición de forraje animal producida a partir de la semilla de conformidad con la reivindicación 15, que comprende un polinucleótido que codifica una fosfofructocinasa de la reivindicación 11.

18.- Una composición de alimento de humano producida a partir de la semilla de conformidad con la reivindicación 15, que comprende un polinucleótido que codifica una fosfofructocinasa de la reivindicación 11.

19.- Una composición de forraje animal que comprende la harina de conformidad con la reivindicación 16, que comprende un polinucleótido que codifica una fosfofructocinasa de la reivindicación 11.

20.- Un método para la elaboración de un aceite de planta monocotiledónea que comprende los pasos de: a) hacer crecer una planta monocotiledónea transformada que comprende un polinucleótido que codifica una fosfofructocinasa operativamente asociada a un promotor mejorado en semilla, para producir una semilla; y b) procesar la semilla para obtener el aceite.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el polínucleótido que codifica una fosfofructocínasa comprende una secuencia diferente a SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 13.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el polínucleótido que codifica una fosfofructocinasa se asocia a un polinucleótido que codifica un péptido de I i tránsito del plastidio excepto cuando dicho promotor mejorado en semilla es un promotor mejorado en embrión. I