JP5800311B2 - 植物油脂の製造方法 - Google Patents
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Description
しかしながら、例えばパーム油やヤシ油は栽培可能地域が東南アジアなどの一部に限られていること、また生物多様性確保の問題から森林伐採による植林地の拡大化は望めず、単位植物体あたりの油脂生産量の増大などが望まれている。
しかし、これらの方法を用いた場合でも、暗所や乾燥などの条件が採用され、植物の光合成が阻害されること等により、植物油脂の高生産化効率は満足できるものではなかった。
(1)デンプンの生合成が抑制された変異植物の植物体を栽培し、種子以外の組織に蓄積した中性脂質を回収することを特徴とする植物油脂の製造方法。
(2)変異植物が、ホスホグルコムターゼ遺伝子、ADPグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子及びデンプンシンターゼ遺伝子から選ばれる1種以上の遺伝子の機能を不活性化又は発現抑制したものである、上記(1)の植物油脂の製造方法。
(3)植物体を、リンが欠乏した状態で栽培する、上記(1)又は(2)の植物油脂の製造方法。
(4)リンが欠乏した状態での栽培が、組織が十分に生育した植物体を、リンが欠乏した媒体に移植するか或いは媒体をリンが欠乏した媒体に置換して栽培する、又は栽培過程の媒体において生じるリンの欠乏状態を維持しながら栽培するものである上記(3)の植物油脂の製造方法。
(5)種子以外の組織が、葉、茎、または根である、上記(1)〜(4)の植物油脂の製造方法。
(6)植物体が被子植物である、上記(1)〜(5)の植物油脂の製造方法。
(7)植物体が裸子植物である、上記(1)〜(5)の植物油脂の製造方法。
(8)植物体が双子葉植物である、上記(1)〜(5)の植物油脂の製造方法。
(9)植物体がシロイヌナズナである、上記(1)〜(5)の植物油脂の製造方法。
(10)デンプンの生合成が抑制された変異植物の植物体を栽培することを特徴とする、種子以外の組織への中性脂質の蓄積方法。
(11)リンが欠乏した状態で栽培する、上記(10)の中性脂質の蓄積方法。
本発明において、用いられる植物としては、陸上植物であればその種類は特に限定されないが、好適には生育速度や得られる植物体量(バイオマス量)などから種子植物を用いることが効率的生産に有利である。種子植物のうち被子植物としては、例えばヤシ科やイネ科等の単子葉植物、あるいはマメ科、アブラナ科、キク科、トウダイグサ科、ゴマ科、モクセイ科、ミソハギ科、シソ科、セリ科、アカザ科、アオイ科等の双子葉植物、また裸子植物としては、例えばマツ科、イチョウ科等が挙げられる。
デンプンの生合成を抑制する方法としては、例えば、デンプンの生合成のキーステップ、すなわちグルコース−6−リン酸からグルコース−1−リン酸の生成、グルコース−1−リン酸からADPグルコースの生成、及びADPグルコースからデンプンの生成に関与する酵素の構造遺伝子に対する、欠失或いは挿入変異による機能の不活性化の他、当該遺伝子の発現に関わる領域に対する、欠失或いは挿入変異による遺伝子発現の抑制(不活性化等)が挙げられる。
その他、遺伝子発現を不活性化する方法として、対象とする遺伝子の配列情報を利用するアンチセンス法やRNA干渉法等が挙げられる。
例えば、植物体としてシロイヌナズナを用いる場合、栽培は、18〜25℃、光強度30〜70μE/cm2、照射時間6〜24時間/日の範囲で行うことが好ましい。
尚、当該植物体を得るための、種子からの生育栽培も、植物固有の最適な温度、湿度、pH、光照射条件で栽培を行えばよい。シロイヌナズナを用いる場合、上記と同様の条件で栽培すればよい。
ここで、「リンが欠乏した状態で栽培する」とは、例えば、1)組織が十分に生育した植物体をリンが欠乏した媒体に移植して栽培すること、2)媒体をリンが欠乏した媒体に置換して当該植物体を栽培すること、3)栽培過程の媒体において生じるリンの欠乏状態を維持しながら栽培すること等が挙げられる。
例えば、後記表1に示した培地を用いて水耕栽培や寒天培地での栽培を行う場合、極めて低い濃度のリンを含む媒体のリン濃度は、33μM未満であり、好ましくは10μM以下、更に好適には3.3μM以下が望ましく、最適には1μM以下、或いは0.33μM以下とすることができる。
例えば、植物体としてシロイヌナズナを用いる場合、18〜25℃、光強度30〜70μE/cm2、照射時間6〜24時間/日の範囲であれば良い。
また水耕液や固体培地を用いる場合は、リン以外の必要栄養素を適当に配合した培養液、或いは培地を用いることができる。リン以外の必要栄養素は特に限定されないが、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸カルシウム、硝酸ナトリウム、塩化カリウム。塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸鉄(III)、塩化鉄(III)、硫酸鉄(III)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジ
アミン四酢酸鉄ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト、塩化アルミニウム、塩化ニッケル、ミオイノシトール、チアミン塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、ニコチン酸、葉酸、ビオチン、グリシン等を含むことができる。また固体培地のゲル化剤としては、特に限定されないが、寒天、ゼラチン、ゲルライト(和光純薬社製)等を用いることができる。
(1)抽出及び前処理
総脂質の抽出は、Bligh and Dyer法(Can. J. Biochem. Physiol. (1959) 37巻, 911頁)に基づき行った。総脂質からTAGの分離は、薄層クロマトグラフィー(TLC Silica gel 60, 20x20 cm, メルク, 製品コード1.05721.0009、展開溶媒組成は、ヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸=160:40:4(vol/vol))により行い、プレートからTAGのスポットをかきとって含量の測定を行った。
15:0脂肪酸を内部標準試料として、TAGをメタノリシス処理した。具体的には、ネジ栓付きガラス試験管内で、TAGを含むシリカゲル粉末に100 μlの1 mM 15:0ヘキサン溶液 (pentadecanoic acid, シグマ, P-6125)および350μlの5% 塩化水素メタノール溶液(和光, 089-03971)を添加して85℃で1時間処理した。メタノリシス処理後、ヘキサンで脂肪酸メチルエステルを回収し、窒素ガスで乾固後、60μlのヘキサンで回収し、そのうち3μlをガスクロマトグラフィーで解析した。ガスクロマトグラフィー(島津、GC-2014, カラムULBON HR-SS-10 (25 m, 0.25 mm ID)、カラム温度180℃、気化室および検出器250℃、入口圧(kPa) 68.2、カラム流量(ml/min) 0.53、スプリット比68.8、計測時間15分)を用いて分離・定量を行った。
凍結乾燥処理を20時間行った後、重量を測定し、乾燥重量とした。
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)Col-0株(野生株)及びpgm-1変異株の種子35個体をMS寒天培地(Physiologia Plantarum (1962) 15巻, 473頁)に播種し、22℃、光強度40〜70μE/cm2、照射時間24時間/日の条件で10日間栽培した。尚、pgm-1遺伝子変異株はArabidopsis Biological Resource Center保有のストックCS210(参考文献:Plant Physiology (1985) 79巻, 11頁、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1989) 86巻, 5830頁,Plant Physiology (2000)122巻,1193頁)を購入し、葉におけるデンプン蓄積が抑制されていることを確認した個体から収穫した種子を使用した。本pgm-1変異株はAGIコードAT5G51820の遺伝子が変異により不活性化している。
シロイヌナズナ野生株及びpgm-1変異株の種子70個体をMS寒天培地(Physiologia Plantarum (1962) 15巻, 473頁)に播種し、22℃、光強度40〜70μE/cm2、照射時間24時間/日の条件で10日間栽培した。
生育した植物体をMS寒天培地から注意深く引き抜き、可溶性リン酸(KH2PO4)を含まない(0mM)、上記表1の培地に35個体を移植した。またそれぞれ35個体を1mM可溶性リン酸を含む表1の培地に移植し、これらを上記と同条件で更に10日間栽培した。
栽培後の植物体を寒天培地から引き抜き、地上部(葉、茎)および根に切り分け、地上部の重量測定を行った後、液体窒素下すり鉢で粉砕し、Bligh and Dyer法で脂肪抽出を行った。この後、薄層クロマトグラフィーによりTAGを分離・精製後、塩酸メタノールでメタノリシス処理をしてガスクロマトグラフィーを用いて脂質分析を行った。
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)野生株の種子96個体をMS寒天培地(Physiologia Plantarum (1962) 15巻, 473頁)に播種し、22℃、光強度40〜70μE/cm2、照射時間24時間/日の条件で10日間栽培した。
生育した植物体をMS寒天培地から注意深く引き抜き、可溶性リン酸(KH2PO4)の濃度が0mM、0.01mM、0.033mM、或いは1mMである上記表1の培地にそれぞれ24個体を移植し、これらを上記と同条件で更に10日間栽培した。
栽培後の植物体を寒天培地から引き抜き、地上部(葉、茎)および根に切り分け、地上部の重量測定を行った後、液体窒素下すり鉢で粉砕し、Bligh and Dyer法で脂肪抽出を行った。この後、薄層クロマトグラフィーによりTAGを分離・精製後、塩酸メタノールでメタノリシス処理をしてガスクロマトグラフィーを用いて脂質分析を行った。
Claims (10)
- デンプンの生合成が抑制された変異植物の植物体を栽培し、種子以外の組織に蓄積した中性脂質を回収することを特徴とする植物油脂の製造方法。
- 変異植物が、ホスホグルコムターゼ遺伝子、ADPグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子及びデンプンシンターゼ遺伝子から選ばれる1種以上の遺伝子の機能を不活性化又は発現抑制したものである、請求項1記載の植物油脂の製造方法。
- 植物体を、リンが欠乏した状態で栽培する、請求項1又は2記載の植物油脂の製造方法。
- リンが欠乏した状態での栽培が、組織が十分に生育した植物体を、リンが欠乏した媒体に移植するか或いは媒体をリンが欠乏した媒体に置換して栽培する、又は栽培過程の媒体において生じるリンの欠乏状態を維持しながら栽培するものである請求項3記載の植物油脂の製造方法。
- 種子以外の組織が、葉、茎、または根である、請求項1〜4のいずれか1項記載の植物油脂の製造方法。
- 植物体が被子植物である、請求項1〜5のいずれか1項記載の植物油脂の製造方法。
- 植物体が裸子植物である、請求項1〜5のいずれか1項記載の植物油脂の製造方法。
- 植物体が双子葉植物である、請求項1〜5のいずれか1項記載の植物油脂の製造方法。
- 植物体がシロイヌナズナである、請求項1〜5のいずれか1項記載の植物油脂の製造方法。
- デンプンの生合成が抑制された変異植物の植物体を、リンが欠乏した状態で栽培することを特徴とする、種子以外の組織への中性脂質の蓄積方法。
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