JP6818193B2 - 中性脂質の製造方法、トランスジェニック植物及びキット - Google Patents

中性脂質の製造方法、トランスジェニック植物及びキット Download PDF

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Description

本発明は、融合遺伝子、ベクター、トランスジェニック植物、植物油脂の製造方法、トランスジェニック植物の作出方法、およびトランスジェニック植物の作出用キットに関する。本願は、２０１３年８月２９日に、日本に出願された特願２０１３−１７７７７４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
植物油脂は、マーガリン、ショートニング、ドレッシング、食用硬化油等の食用、燃料用、潤滑油や界面活性剤原料などの工業用として世界で毎年１億トン以上が用いられており、世界的な人口増加などによりその需要は更に高まりつつある。一方、その生産量もパーム油及び大豆油を中心に、２００１年から２００８年までの間に約１．５倍に伸長してきているが、これらは例えばマレーシア及びインドネシアなどの主産地での植林量増加や品種改良などによるものや、特にヨーロッパにおけるバイオディーゼル用途の増加による補助金も含めた政策による影響も大きいと考えられる。
しかしながら、例えばパーム油やヤシ油は栽培可能地域が東南アジアなどの一部に限られていること、また生物多様性確保の問題から森林伐採による植林地の拡大化は望めず、単位植物体あたりの油脂生産量の増大などが望まれていた。
こうした状況を受け、これまでに本発明者らは、リン欠乏状態で栽培された植物体又はリンが欠乏状態となった植物体を用いた植物油脂製造方法を開発してきた（特許文献１）。また、デンプンの生合成が抑制された変異植物の植物体を栽培し、植物油脂を製造する方法も開発してきた（特許文献２）。
特開２０１２−７１４６号公報 特開２０１２−１５３８３３号公報
特許文献１および２の植物油脂の製造方法において用いられた植物体では、通常条件または野生型植物と比較して、ある程度多量の植物油脂を蓄積させることができた。しかしながら、植物体を用いた植物油脂の生産技術については未だ検討の余地がある。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、植物体の光合成を継続させながら、植物油脂を効率的に製造可能なトランスジェニック植物、融合遺伝子、該トランスジェニック植物の作出を可能とするベクター、該ベクターを備えたキット、該トランスジェニック植物の作出方法、および該トランスジェニック植物の栽培による植物油脂の製造方法の提供を課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、リン欠乏応答性の転写制御配列を用いて中性脂質の生合成又は蓄積に影響する核酸配列の発現を制御することで、良好に植物体を生育させつつ、植物体に蓄積される油脂量を著しく増加させること等が可能となることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）中性脂質の生合成又は蓄積に影響する核酸配列と、該核酸配列と作動可能に連結され該核酸配列の発現を制御するリン欠乏応答性発現制御配列と、を含むことを特徴とする融合遺伝子。
（２）前記核酸配列が、中性脂質の生合成又は蓄積に影響するタンパク質をコードする核酸配列である前記（１）に記載の融合遺伝子。
（３）前記中性脂質の生合成又は蓄積に影響するタンパク質が、ＤＧＡＴ又はＰＤＡＴである前記（２）に記載の融合遺伝子。
（４）前記制御配列がモノガラクトシルジアシルグリセロールシンターゼ遺伝子、ホスホリパーゼＣ遺伝子、ホスホリパーゼＤ遺伝子、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ遺伝子、スルホキノボシルジアシルグリセロールシンターゼ遺伝子、ＵＤＰ−スルホキノボースシンターゼ遺伝子、ＳＱＤＧシンターゼ遺伝子、及びＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子のプロモーターの配列である前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の融合遺伝子。
（５）前記中性脂質の生合成又は蓄積に影響するタンパク質が、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質である前記（２）〜（４）のいずれか一つに記載の融合遺伝子。
（ａ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有し、且つアシルトランスフェラーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列に対して、２５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＭＢＯＡＴ（膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼ）ファミリーに属し、且つアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（６）前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の融合遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
（７）前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の融合遺伝子を含有することを特徴とするトランスジェニック植物。
（８）前記（６）に記載のベクターが宿主に導入されてなることを特徴とするトランスジェニック植物。
（９）糖代謝、デンプン生合成及び膜脂質代謝からなる群から選ばれる少なくとも一つの機能が低下または抑制された植物体である前記（７）又は（８）に記載のトランスジェニック植物。
（１０）前記（７）又は（８）に記載のトランスジェニック植物と、糖代謝、デンプン生合成及び膜脂質代謝からなる群から選ばれる少なくとも一つの機能が低下または抑制された植物体との交配により得られるトランスジェニック植物。
（１１）前記（７）〜（１０）のいずれか一つに記載のトランスジェニック植物を栽培する栽培工程を含むことを特徴とする植物油脂の製造方法。
（１２）前記栽培工程は、
前記トランスジェニック植物を、リンが欠乏した状態で栽培する工程である前記（１１）に記載の植物油脂の製造方法。
（１３）前記リンが欠乏した状態での栽培が、組織が十分に生育した植物体を、リンが欠乏した媒体に移植する又は媒体をリンが欠乏した媒体に置換して栽培する、或いは栽培過程の媒体において生じるリンの欠乏状態を維持しながら栽培するものである前記（１２）に記載の植物油脂の製造方法。
（１４）前記栽培工程は、
前記トランスジェニック植物を、リンが欠乏状態となった植物体として栽培する工程である前記（１１）に記載の植物油脂の製造方法。
（１５）前記リンが欠乏状態となった植物体が、リン酸輸送機能が低下または抑制された植物体である前記（１４）に記載の植物油脂の製造方法。
（１６）前記（６）に記載のベクターを植物に導入する工程を含むことを特徴とするトランスジェニック植物の作出方法。
（１７）前記（６）に記載のベクターを備えたことを特徴とする、トランスジェニック植物の作出用キット。
本発明によれば、従来知られていたリン欠乏状態で栽培された植物体又はリンが欠乏状態となった植物体よりも、さらに効率的に植物油脂の製造が可能なトランスジェニック植物、およびさらに効率的な油脂製造方法を提供できる。
可溶性リン酸を含まない培地、及び１ｍＭ可溶性リン酸を含む培地を用いた栽培における、シロイヌナズナ野生株およびｐｇｍ−１変異株でのＤＧＡＴ１遺伝子の発現量（相対値）を示すグラフである。 可溶性リン酸を含まない培地、及び１ｍＭ可溶性リン酸を含む培地を用いた栽培における、シロイヌナズナ野生株およびｐｇｍ−１変異株でのＤＧＡＴ２遺伝子の発現量（相対値）を示すグラフである。 可溶性リン酸を含まない培地、及び１ｍＭ可溶性リン酸を含む培地を用いた栽培における、シロイヌナズナ野生株およびｐｇｍ−１変異株でのＰＤＡＴ１遺伝子の発現量（相対値）を示すグラフである。 可溶性リン酸を含まない培地、及び１ｍＭ可溶性リン酸を含む培地を用いた栽培条件下での、比較例３〜６及び実施例４〜７における各植物での、ＤＧＡＴ１遺伝子の発現量（相対値）を示すグラフである。 可溶性リン酸を含まない培地、及び１ｍＭ可溶性リン酸を含む培地を用いた栽培条件下での、比較例３〜６及び実施例８〜１１における各植物での、ＤＧＡＴ２遺伝子の発現量（相対値）を示すグラフである。 可溶性リン酸を含まない培地、及び１ｍＭ可溶性リン酸を含む培地を用いた栽培条件下での、比較例３〜６及び実施例１２〜１５における各植物での、ＰＤＡＴ１遺伝子の発現量（相対値）を示すグラフである。 実施例４〜１５及び比較例１〜６における、各植物体１個体あたりの新鮮重量を示すグラフである。 実施例４〜１５及び比較例１〜６における、植物体の乾燥重量あたりのＴＡＧの蓄積割合を示すグラフである。 実施例４〜１５及び比較例１〜６における、植物体の新鮮重量あたりのＴＡＧの蓄積量を示すグラフである。
《融合遺伝子》
本発明の融合遺伝子は、中性脂質の生合成又は蓄積に影響する核酸配列と、該核酸配列と作動可能に連結され該核酸配列の発現を制御するリン欠乏応答性発現制御配列と、を含む。
「中性脂質の生合成又は蓄積に影響する」とは、中性脂質量の生合成量を増加させる、中性脂質の蓄積量を増加させる又は中性脂質の組成を改変させることを意味する。中性脂質としては、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びトリアシルグリセロールのいずれでもよい。
「中性脂質の生合成又は蓄積に影響する核酸配列」とは、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のように核酸として影響するもの、及び該核酸配列にコードされるタンパク質として影響するものを含む。すなわち、本発明の融合遺伝子が含む中性脂質の生合成又は蓄積に影響する核酸配列は、中性脂質の生合成又は蓄積に影響するタンパク質をコードする核酸配列であってもよい。核酸配列としては、ＤＮＡ配列が好ましい。
「中性脂質の生合成又は蓄積に影響する核酸配列」又は「中性脂質の生合成又は蓄積に影響するタンパク質」とは、その核酸配列又はタンパク質の植物体での発現を制御することにより、植物体全体において若しくは植物体の任意の部分において合成される又は蓄積される中性脂質量を、宿主本来の中性脂質量よりも増加させ得る核酸配列又はタンパク質、並びに、本来の中性脂質組成と異なる中性脂質組成に中性脂質組成を改変し得る核酸配列又はタンパク質を指す。
なお、本発明の融合遺伝子が含む発現制御配列と、本発明の融合遺伝子が含む構造遺伝子配列とは、夫々異なる遺伝子の由来であることが好ましい。
中性脂質の生合成経路の一例として、グリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）と脂肪酸とが反応してリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が合成され、ＬＰＡと脂肪酸とが反応してホスファチジン酸（ＰＡ）が合成され、ＰＡがホスファチジン酸ホスファターゼによって脱リン酸化されてジアシルグリセロール（ＤＡＧ）が合成され、ＤＡＧがジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）又はホスホリピド：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）によってトリアシルグリセロールが合成される。したがって、中性脂質量を増加させることが可能なタンパク質としては、上記の経路に関与するＤＧＡＴ又はＰＤＡＴを好ましいものとして挙げることができる。
すなわち、合成される中性脂質量を増加させ、中性脂質の生合成に影響するタンパク質は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。
（ａ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有し、且つアシルトランスフェラーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列に対して、２５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＭＢＯＡＴ（膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼ）ファミリーに属し、且つアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
また、合成される中性脂質量を増加させ、中性脂質の生合成に影響するタンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなり、且つＭＢＯＡＴ（膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼ）ファミリーに属し、且つアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質が好ましい。
（ａ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列に対して、２５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
シロイヌナズナのＤＧＡＴ１遺伝子（ＡＧＩコード：Ａｔ２ｇ１９４５０）は、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしており、シロイヌナズナのＤＧＡＴ２遺伝子（ＡＧＩコード：Ａｔ３ｇ５１５２０）は、前記配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしており、シロイヌナズナのＤＧＡＴ３遺伝子（ＡＧＩコード：Ａｔ１ｇ４８３００）は、前記配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしており、シロイヌナズナのＤＧＡＴ４遺伝子（ＡＧＩコード：Ａｔ３ｇ２６８４０）は、前記配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしており、シロイヌナズナのＰＤＡＴ遺伝子（ＡＧＩコード：Ａｔ５ｇ１３６４０）は、前記配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている
ＤＧＡＴ遺伝子及びＰＤＡＴ遺伝子はアシルトランスフェラーゼ活性に関与すると推定されるＰＬＮ０２４０１領域、ＬＰＬＡＴ＿ＭＧＡＴ＿Ｌｉｋｅ領域、ＰＬＮ０２５１７領域、又はＭＢＯＡＴ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙモチーフを含んでいる。
前記（ｂ）としては、例えば上記領域以外の部位に変異（欠失、挿入、置換、又は付加）を有するタンパク質、又は上記領域における変異であって、アシルトランスフェラーゼ活性を保持している変異を有するタンパク質が挙げられる。
ここで、欠失、挿入、置換、又は付加されてもよいアミノ酸の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
前記（ｃ）又は（ｄ）としては、配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列に対して、好ましくは２５％以上、好ましくは４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
好ましい同一性の理由を挙げると、配列番号２１で表されるコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）のＣｒＤＧＡＴ１は、シロイヌナズナのＡｔＤＧＡＴ１のオーソログであり、両アミノ酸配列間の同一性は６０％であることが例示できる。
また、配列番号２２で表されるコナミドリムシのＣｒＤＧＴＴ１はシロイヌナズナのＡｔＤＧＡＴ２のオーソログで、アシルトランスフェラーゼ活性を保持していることが示されており（Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１３ ＦＥＢＳ ｌｅｔ、Ｓａｎｊａｙａ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ）、シロイヌナズナのＡｔＤＧＡＴ２の間でのアミノ酸配列の同一性は２９％であることが例示できる。
さらには、アシルトランスフェラーゼ活性を保持しているオーソログとして、以下の遺伝子間の同一性が例示できる。
配列番号２３で表されるコナミドリムシのＣｒＤＧＴＴ２と、シロイヌナズナのＡｔＤＧＡＴ２の間でのアミノ酸配列の同一性は３１％であり、
配列番号２４で表されるコナミドリムシのＣｒＤＧＴＴ３と、シロイヌナズナのＡｔＤＧＡＴ２の間でのアミノ酸配列の同一性は３５％であり、
配列番号２５で表されるコナミドリムシのＣｒＤＧＴＴ４と、シロイヌナズナのＡｔＤＧＡＴ２の間でのアミノ酸配列の同一性は３５％であり、
配列番号２６で表されるコナミドリムシのＣｒＰＤＡＴと、シロイヌナズナのＡｔＰＤＡＴの間でのアミノ酸配列の同一性は３１％である。
また同様に、上記の中性脂質量を増加させ得るタンパク質をコードする遺伝子として、下記のいずれか一つのＤＮＡからなり、且つアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
なお、下記の配列番号６〜１０の塩基配列は、それぞれ前記シロイヌナズナのＤＧＡＴ１遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子およびＰＤＡＴ遺伝子の塩基配列である。
（ｄ）配列番号６〜１０のいずれか一つで表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｅ）配列番号６〜１０のいずれか一つで表される塩基配列に対して、好ましくは２５％以上、好ましくは４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｆ）配列番号６〜１０のいずれか一つで表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ
その他の、中性脂質量を増加させ得るタンパク質としては、膜脂質分解酵素であるホスホリパーゼＤ（ＰＬＤα１については、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ ２０１４ ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌで報告あり。）、脂肪酸合成を正に制御する転写因子であるＷＲＩ１（ｗｒｉｎｋｌｅｄ １）、ＭＹＢ−ｔｙｐｅ 転写因子（ＧｍＭＹＢ７３の報告あり。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ ２０１４ ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．）、ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ２ （ＬＥＣ２）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ ２０１３ ＦＥＢＳ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏ）などを挙げることができる。脂肪酸合成を負に制御するＴＡＧ分解酵素ＳＤＰ１、ＰＬＤα１の発現量を負に制御する転写因子であるＧＬＡＢＲＡ２（ＧＬ２）も、該タンパク質の発現が負に制御されることで、中性脂質量を増加させ得る。
前記中性脂質組成を改変し得るタンパク質としては、脂肪酸鎖長延長酵素、脂肪酸不飽和化酵素等が挙げられ、具体的には、アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子（ＦＡＴＡ，ＦＡＴＢ）、オレイン酸デサチュラーゼ遺伝子（ＦＡＤ２，ＦＡＤ３）を挙げることができる。
中性脂質の生合成又は蓄積に影響する核酸配列としては、ＴＡＧ分解酵素、上記ＧＬ２、脂肪酸鎖長延長酵素、脂肪酸不飽和化酵素からなる群から選ばれるいずれか１つ以上の因子に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導性核酸、アンチセンス核酸、リボザイムの配列が挙げられる。
本発明の融合遺伝子が含む「該核酸配列の発現を制御するリン欠乏応答性発現制御配列」とは、該制御配列によって発現制御され得る該核酸配列に対して、リン欠乏状況に応答して発現を変動させることができる配列であれば特に制限されず、エンハンサー領域、プロモーター配列等を含むものであり、好ましくはプロモーター配列である。「該核酸配列と作動可能に連結された」とは、リン欠乏応答性発現制御配列が、該核酸配列の発現を制御するように配置されることを云う。「発現を制御する」とは、発現を増加させることのみならず、発現を低下させる、発現時期を移行させること等の影響を及ぼす作用も含む。ここで「該核酸配列の発現を制御する」とは、該核酸配列由来のｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等の核酸の発現、および該核酸配列が翻訳されるタンパク質の発現が含まれる。
リン欠乏応答性のプロモーター配列は、レポーター遺伝子を用いた公知のレポーターアッセイ等により検討することが可能である。このようなレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＧＵＳ、ＧＦＰ等を挙げることができる。
プロモーター配列がリン欠乏応答性であるかは、例えば、該プロモーター配列の下流にレポーター遺伝子配列を発現制御可能なように結合させた塩基配列を有する形質転換植物を作出し、この形質転換植物を様々な濃度のリンを含有する媒体において栽培し、植物体におけるレポーター遺伝子の発現を検出する方法が挙げられる。このとき、比較に用いる媒体の通常のリン濃度としては０．１〜１ｍＭの範囲が挙げられ、検討方法としては、例えば、通常のリン濃度の範囲で栽培された植物体におけるレポーター遺伝子の発現レベルと通常のリン濃度よりも低いリン濃度で栽培された植物体におけるレポーター遺伝子の発現レベルとを比較し、低いリン濃度で栽培された植物体における発現レベルの方が高いプロモーター配列を選択することが挙げられる。
具体的なリン欠乏応答性のプロモーター配列としては、モノガラクトシルジアシルグリセロールシンターゼ遺伝子、ホスホリパーゼＣ遺伝子、ホスホリパーゼＤ遺伝子、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ遺伝子、スルホキノボシルジアシルグリセロールシンターゼ遺伝子、ＵＤＰ‐スルホキノボースシンターゼ遺伝子、ＳＱＤＧシンターゼ遺伝子、及びＵＤＰ‐グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子のプロモーターの配列を挙げることができる。
リン欠乏応答性のプロモーター配列として、より具体的には、シロイヌナズナ由来の以下の遺伝子のプロモーター配列；モノガラクトシルジアシルグリセロールシンターゼ２（ＭＧＤ２）遺伝子（ＡＧＩコード：Ａｔ５ｇ２０４１０）のプロモーター配列（配列番号：１１）、ＭＧＤ３遺伝子（ＡＧＩコード：Ａｔ２ｇ１１８１０）のプロモーター配列（配列番号１２）、ホスホリパーゼＣ５（ＮＰＣ５）遺伝子（ＡＧＩコード：Ａｔ３ｇ０３５４０）のプロモーター配列（配列番号：１３）、ホスホリパーゼＤ ζ２（ｚｅｔａ ２）（ＰＬＤ ζ２）遺伝子（ＡＧＩコード：Ａｔ３ｇ０５６３０）のプロモーター配列（配列番号：１４）、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ１（ＰＡＨ１）遺伝子（ＡＧＩコード：Ａｔ３ｇ０９５６０）のプロモーター配列（配列番号：１５）、ＵＤＰ‐スルホキノボースシンターゼ（ＳＱＤ１）遺伝子（ＡＧＩコード：Ａｔ４ｇ３３０３０）のプロモーター配列（配列番号：１６）、ＳＱＤＧシンターゼ（ＳＱＤ２）遺伝子（ＡＧＩコード：Ａｔ５ｇ０１２２０）のプロモーター配列（配列番号：１７）、ＵＤＰ‐グルコースピロホスホリラーゼ３（ＵＧＰ３）遺伝子のプロモーター配列（配列番号：１８）を挙げることができ、更には、上記の配列番号１１〜１８のいずれかに記載された塩基配列又は、配列番号１１〜１８のいずれかに記載された塩基配列の部分配列であって、リン欠乏応答性を有し且つ中性脂質の生合成又は蓄積に影響する核酸配列の発現を制御可能である当該部分配列に対して、例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８８％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるプロモーター配列、及び、配列番号１１〜１８のいずれかに記載された塩基配列からなるＤＮＡ又は、配列番号１１〜１８のいずれかに記載された塩基配列の部分配列からなるＤＮＡであって、リン欠乏応答性を有し且つ中性脂質の生合成又は蓄積に影響する核酸配列の発現を制御可能である当該部分配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるプロモーター配列、を挙げることができる。
本発明の融合遺伝子が含む、中性脂質の生合成又は蓄積に影響する核酸配列と、該核酸配列と作動可能に連結され該核酸配列の発現を制御するリン欠乏応答性発現制御配列との好ましい具体的な組み合わせをとして、例えば以下の融合遺伝子を例示できる。
ＤＧＡＴ遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ２遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
ＤＧＡＴ遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
ＰＤＡＴ遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ２遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
ＰＤＡＴ遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
より具体的には、それぞれシロイヌナズナ由来のＤＮＡ配列及びリン欠乏応答性発現制御配列での組み合わせとして、
シロイヌナズナのＤＧＡＴ１遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ２遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
シロイヌナズナのＤＧＡＴ２遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ２遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
シロイヌナズナのＤＧＡＴ３遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ２遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
シロイヌナズナのＤＧＡＴ４遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ２遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
シロイヌナズナのＰＤＡＴ遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ２遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
シロイヌナズナのＤＧＡＴ１遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
シロイヌナズナのＤＧＡＴ２遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
シロイヌナズナのＤＧＡＴ３遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
シロイヌナズナのＤＧＡＴ４遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
シロイヌナズナのＰＤＡＴ遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列と作動可能に連結され該ＤＮＡ配列の発現を制御するＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの配列と、を含む融合遺伝子。
なかでも、上記のＭＧＤ２およびＭＧＤ３遺伝子のプロモーター配列に係る配列は、リン欠乏状態時に非常に強く誘導されるとの観点から好ましい配列であり、尚且つリン欠乏状態となってから遅い時期に応答する制御配列であるので、宿主植物の成長過程により影響を与えにくいことからも、好ましい配列である。
本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム，０．３Ｍ クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
尚、塩基配列の同一性は、例えば、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５（１９８５））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。アミノ酸配列の同一性は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から提供されているＢＬＡＳＴＰのプログラムを用いて算出することが挙げられる。
《ベクター》
本発明のベクターは、本発明の融合遺伝子を含むものであれば特に制限されず、例えば、形質転換植物細胞や形質転換植物の作出のために通常用いられる任意の発現ベクターを利用し、周知の遺伝子組み換え技術を用いて当該遺伝子が組み込まれた発現ベクターとして作製されたものであってもよい。前記発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＣＡＭＢＩＡ、ＧＡＴＥＷＡＹ等のバイナリ―ベクター等がある。
本発明のベクターは、さらに任意の選抜マーカー遺伝子の配列を有してもよい。選抜マーカー遺伝子を利用することによって本発明のベクターが形質転換された植物と形質転換されていない植物との選抜を用意に行うことができる。このような選抜マーカー遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等が挙げられる。
本発明のベクターによれば、従来知られていたリン欠乏状態で栽培された植物体又はリンが欠乏状態となった植物体よりもさらに効率的に植物油脂を製造可能なトランスジェニック植物を提供できる。また同時に、製造する植物油脂の成分を宿主本来のものから改良して製造することも可能である。
≪トランスジェニック植物の作出用キット》
本発明のトランスジェニック植物の作出用キットは、本発明のベクターを備えたものである。本発明のキットは、本発明のベクターの他、溶媒、分散媒、試薬、それらを使用するための指示書などを備えていてもよい。ここで、溶媒等を「備えた」とは、キットを構成する個々の容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）のいずれかの中に内包されている状態を意味する。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。また、本発明のキットは、希釈剤、溶媒、洗浄液、その他の試薬を内包した容器を備え得ていてもよい。
《トランスジェニック植物およびトランスジェニック植物の作出方法》
本発明のトランスジェニック植物は、本発明の融合遺伝子を含有する。
本発明のトランスジェニック植物の作出にあたっては、トランクジェニック植物が作出される前に融合遺伝子を作製し、作製した融合遺伝子を宿主に導入して含有させてもよい。また、本発明のトランスジェニック植物の作出あたっては、例えば、宿主のゲノム中の「リン欠乏応答性発現制御配列」の近傍に、該核酸配列の発現を制御するよう「中性脂質の生合成又は蓄積に影響するタンパク質をコードする核酸配列」のみを宿主に導入して融合遺伝子を作製することで、本発明の融合遺伝子を含有させてもよい。若しくは、本発明のトランスジェニック植物の作出あたっては、宿主のゲノム中の「中性脂質の生合成又は蓄積に影響するタンパク質をコードする核酸配列」の近傍に、該核酸配列の発現を制御するよう「リン欠乏応答性発現制御配列」のみを宿主に導入して融合遺伝子を作製することで、本発明の融合遺伝子を含有させてもよい。上記の配列導入手法としては遺伝子ターゲッティングが挙げられる。
本発明の融合遺伝子は、リン欠乏応答性の発現制御配列を有しているので、本発明の融合遺伝子を含有することで、リン欠乏応答性の発現制御配列により中性脂質の生合成又は蓄積に影響する核酸配列が発現した本発明のトランスジェニック植物は、良好に生育することができる。そのような理由の一つとしては、発芽直後の植物体は僅かなリンを利用して生育でき、その後ある程度生育してからリン欠乏状態が生じ易い傾向にある。そのため、リン欠乏応答は植物体がある程度生育して組織が十分に生育してから誘導される傾向にある。したがって、リン欠乏応答性の発現制御配列による中性脂質の生合成又は蓄積に影響するタンパク質の発現の誘導は、宿主植物の成長過程に影響を与えにくいことが挙げられる。植物体を良好に生育させることができれば、より効率的に植物油脂を製造することが可能となる。これは、油脂の製造場所となる植物組織の形成が良好に整えられ、その後、油脂の製造が開始されることで、油脂の製造機能が申し分なく発揮されることによると考えられる。
さらに、リン欠乏応答性の発現制御配列によれば、種子以外の組織において多量に中性脂質を蓄積させることも可能である。従来、特殊な脂肪酸組成を持つ中性脂質の生合成に影響するタンパク質を種子で強制発現させて、種子において多量に特殊な脂肪酸組成を持つ中性脂質を合成させることが試みられていた。しかし、種子に過剰に特殊な脂肪酸組成を持つ中性脂質を蓄積させると、脂肪酸の種類によっては稔性が低下する場合があり、植物体の利用上好ましくなかった。対して、リン欠乏応答性の発現制御配列を利用し、さらに葉において多量に中性脂質を製造させることは、種子における宿主植物の発生過程にも影響を与えにくく、より一層効率的に植物油脂を製造することが可能となる。
又は、本発明のトランスジェニック植物は、本発明のベクターを宿主に導入してなるものである。
「本発明のベクターを宿主に導入」するとは、本発明の融合遺伝子が宿主に導入されるのであれば、当該ベクター全体が導入されることであっても当該ベクターの一部の核酸配列が導入されることであっても構わない。
本発明における植物体及び宿主として用いられる植物体としては、光合成を行う生物であれば特にその種類は限定されない。本法は藻類にも適用可能であり、藍藻、紅藻、珪藻、緑藻などのあらゆる藻類に適用可能である。
本発明における植物体及び宿主として用いられる植物体としては、陸上植物であることが好ましい。好適には生育速度や得られる植物体量（バイオマス量）などから種子植物を用いることが効率的生産に有利である。種子植物のうち被子植物としては、例えばヤシ科やイネ科等の単子葉植物、あるいはマメ科、アブラナ科、キク科、トウダイグサ科、ゴマ科、モクセイ科、ミソハギ科、シソ科、セリ科、アカザ科、アオイ科等の双子葉植物、また裸子植物としては、例えばマツ科、イチョウ科等が挙げられる。
より具体的な植物種の例としては、ヤシ科のココヤシ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パームヤシ（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉ， Ｅｌａｅｉｓ ｏｌｅｉｆｅｒａ）等、イネ科のイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ， Ｏｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ミスカンザス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）、イヌビエ（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｃｒｕｓ−ｇａｌｌｉ）等、マメ科のダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）等、アブラナ科のナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ， Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ナガミノアマナズナ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｖａｒ． ｇｌａｂｒａ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ｃａｐｉｔａｔａ）、コマツナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｖａｒ． ｐｅｒｕｖｉｒｉｄｉｓ）、ミズナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｖａｒ． ｎｉｐｐｏｓｉｎｉｃａ）、クレソン（Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）等、キク科のヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）等、トウダイグサ科のヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ヤトロファ（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）、ゴマ科のゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）等、モクセイ科のオリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐｅａ）等、ミソハギ科のクフェア（Ｃｕｐｈｅａ ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）等、シソ科のアオジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ ｖａｒ． ｃｒｉｓｐａ）、アカジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎ ｖａｒ． ｃｒｉｓｐａ）、バジル（Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌｉｃｕｍ Ｌ．）等、セリ科のミツバ（Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、コリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｕｍ ｃｒｉｓｐｕｍ）等、アカザ科のホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ）等、ナス科のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ Ｌ．）等が挙げられる。このうち、被子植物が好ましく、より好適には双子葉植物、更に好適にはアブラナ科植物が挙げられ、このうちシロイヌナズナ、トマト、ナタネ、イヌビエ又はタバコがより好ましく、シロイヌナズナがさらに好ましい。
本発明のベクター又は本発明の融合遺伝子に含まれる当該配列の植物体への導入方法としては、公知のアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等を用いることができる。
本発明のベクター又は本発明の融合遺伝子に含まれる当該配列の導入対象とする植物材料としては、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物器官や植物組織を用いてもよく、植物培養細胞を用いてもよい。形質転換材料として植物組織等を用いる場合は、例えば、これらを周知のカルス形成用培地中で脱分化したカルスを形成させ、その後再分化誘導用の培地に移しかえて得られる不定胚、不定芽等から形質転換された植物体を得る方法が採用できる。
本発明のトランスジェニック植物には、本発明のベクター又は本発明の融合遺伝子に含まれる当該配列が発現可能に導入された植物細胞、植物体、若しくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
本発明のベクター又は本発明の融合遺伝子に含まれる当該配列が植物体へ導入されたか否かを確かめる方法としては、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行ってもよく、前述の選抜マーカー遺伝子を用いて行ってもよい。選抜マーカー遺伝子としてレポーター遺伝子を用いた場合は植物体におけるレポーター遺伝子の発現を指標とすることができ、また、選抜マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いた場合は当該薬剤への耐性を指標としてトランスジェニック植物の選抜を行うことができる。
また、本発明のトランスジェニック植物は、糖代謝、デンプン生合成及び膜脂質代謝からなる群から選ばれる少なくとも一つの機能が低下または抑制された植物体であってもよい。
また前記宿主が、糖代謝、デンプン生合成及び膜脂質代謝からなる群から選ばれる少なくとも一つの機能が低下または抑制された植物体であってもよい。
デンプン生合成の機能が低下又は抑制された植物体とは、デンプンの生合成が抑制され、例えば葉におけるデンプン蓄積が本来（野生型）よりも低下している植物、例えば、葉におけるデンプン蓄積量が、好ましくは野生型の０〜５０％程度、より好ましくは０〜２０％程度まで低下している植物体が挙げられる。
デンプンの生合成が抑制された植物体を得る方法としては、例えば、デンプンの生合成のキーステップ、すなわちグルコース−６−リン酸からグルコース−１−リン酸の生成、グルコース−１−リン酸からＡＤＰグルコースの生成、及びＡＤＰグルコースからデンプンの生成に関与する酵素の構造遺伝子に対する、欠失或いは挿入変異による機能の不活性化の他、当該遺伝子の発現に関わる領域に対する、欠失或いは挿入変異による遺伝子発現の抑制（不活性化等）が挙げられる。
デンプンの生合成に関わる酵素としては、グルコース−６−リン酸からグルコース−１−リン酸の生成に関与するホスホグルコムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ（ＰＧＭ））、グルコース−１−リン酸からＡＤＰグルコースの生成に関与するＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＡＧＰａｓｅ）、及びＡＤＰグルコースからデンプンを合成するスターチシンターゼ（Ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＳ））が挙げられ、その構造遺伝子としては、ＰＧＭ遺伝子、ＡＰＬ遺伝子、ＡＤＧ遺伝子及びｓｏｌｕｂｌｅ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ遺伝子が挙げられる（特開２０１２−１５３８３３号公報参照）。具体的な植物体としては、ＡＤＧ遺伝子の機能がそれぞれ不活性化及び抑制されたシロイヌナズナａｄｇ１−１変異体、ａｐｓ１変異体が例示できる。
ここで「膜脂質代謝の機能」が低下又は抑制された植物体とは、膜脂質代謝のうち中性脂質生合成の前駆体物質量を減少させることに係わる機能が低下又は抑制されたもの指す。
リン欠乏状態となった植物体では、植物体内のリン脂質由来のリンを利用し、リン脂質の代替として糖脂質を合成しようとする代謝経路が働き、それに伴いＴＡＧの前駆体物質であるフォスファチジルコリン（ＰＣ）がジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を経て糖脂質（ジガラクトシルジアシルグリセロール、ＤＧＤＧ）へと転換される。したがって、前記膜脂質代謝の機能が低下又は抑制された植物体を得る方法として、例えば、ＰＣからＤＡＧを経たＤＧＤＧへの転換に関与する酵素であるＰＬＤ等の酵素の構造遺伝子に対する欠失或いは挿入変異による機能の不活性化の他、当該遺伝子の発現に関わる領域に対する、欠失或いは挿入変異による遺伝子発現の抑制（不活性化等）が挙げられる。
尚、当該遺伝子、当該発現制御配列等の領域の塩基配列への欠失変異を行う方法としては、メタンスルホン酸エチルやニトロソグアニジン等の突然変異誘起剤を用いる方法やγ線等を照射する方法が挙げられる。これらの欠失方法により生じたランダムな変異体の集団から、目的とする機能が低下又は抑制された変異体を選抜すれば良い。
また、当該遺伝子、当該発現制御配列等の領域の塩基配列への挿入変異を行う方法としては、アグロバクテリウム形質転換法によるＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の挿入や、トランスポゾンを用いた方法等が挙げられる。これらの挿入方法により生じたランダムな変異体の集団から、目的とする機能が低下又は抑制された変異体を選抜すれば良い。
また、本発明のトランスジェニック植物は、本発明の融合遺伝子を含有するトランスジェニック植物又は本発明のベクターが導入された宿主となるトランスジェニック植物と、糖代謝、デンプン生合成及び膜脂質代謝からなる群から選ばれる少なくとも一つの機能が低下または抑制された植物体との交配により得られたものであってもよい。
例えば、宿主として野生型の植物体を用いて本発明のベクターを野生型の植物に導入してトランスジェニック植物を得た後、該トランスジェニック植物に糖代謝、デンプン生合成及び膜脂質代謝からなる群から選ばれる少なくとも一つの機能が低下または抑制された任意の植物体とを交配させ、本発明のベクターを有し且つ当該機能が低下または抑制されたトランスジェニック植物を得ても良い。
このように、本発明のトランスジェニック植物において、さらに、糖代謝、デンプン生合成及び膜脂質代謝からなる群から選ばれる少なくとも一つの機能を低下または抑制させることにより、植物体に蓄積される油脂量を著しく増大させることができ、植物油脂を効率的に製造可能となる。
《植物油脂の製造方法》
本発明の植物油脂の製造方法は、本発明のトランスジェニック植物を栽培する栽培工程を含む。
本発明の植物油脂の製造方法によって製造された油脂の回収にあたっては、当該油脂は組織が十分に生育した本発明のトランスジェニック植物により回収されることが好ましい。
ここで、「組織が十分に生育したトランスジェニック植物」とは、通常の条件で、根、茎、及び葉等の植物組織が十分に生育した植物体を意味し、即ち、種子から発芽させた場合は発根及び２枚以上の本葉が観察される程度に生育した植物体を意味し、好適には、リンを適量含む媒体で栽培され、根、茎、及び葉等の植物組織が生育し、十分な植物体量（バイオマス量）を有する植物体、即ち植物体重量が種子重量の１０倍以上に生育した植物体が挙げられる。
また、本発明の植物油脂の製造方法によって製造された油脂の回収は、バイオマス量が多いとの観点から、種子以外の組織に蓄積した中性脂質を回収することが好ましく、生産され得るバイオマス量が非常に多いとの観点から、種子以外の組織が葉であることがより好ましい。
また、本発明の植物油脂の製造方法は、本発明のトランスジェニック植物を、リンが欠乏した状態で栽培する工程を含むことが好ましい。
ここで、「リンが欠乏した状態で栽培する」とは、例えば、１）組織が十分に生育した植物体をリンが欠乏した媒体に移植して栽培すること、２）媒体をリンが欠乏した媒体に置換して当該植物体を栽培すること、３）栽培過程の媒体において生じるリンの欠乏状態を維持しながら栽培すること等が挙げられる。
ここで、栽培に用いる媒体は、植物体の生育段階、及び油脂蓄積段階のいずれにおいても限定されず、土壌、水耕液（培養液）、或いは固体培地等を用いることができる。また屋外での日照、及び屋内における人工照明等のいずれも利用可能であり、光量や照射時間も特に制限されないが、植物体に固有な最適条件を用いることが望ましい。
「リンが欠乏した状態」とは、媒体中にリンを含まないか又は媒体中のリン濃度が極めて低い状態を意味する。具体的には、中性脂質の蓄積促進の点から、媒体中のリン濃度がゼロに近いことが望ましいが、好ましくはゼロでなくても通常の栽培で用いるリン酸濃度の１／３０未満、より好ましくは１／１００以下、さらに好ましくは１／３００以下、特に好ましくは１／１０００以下である。
例えば、表１に示した培地を用いて水耕栽培や寒天培地での栽培を行う場合、極めて低い濃度のリンを含む媒体のリン濃度は、好ましくは３３μＭ未満であり、より好ましくは１０μＭ以下、更に好ましくは３．３μＭ以下であり、特に好ましくは１μＭ以下、最も好ましくは０．３３μＭ以下とすることができる。
また、本発明の植物油脂の製造方法は、本発明のトランスジェニック植物を、リンが欠乏状態となった植物体として栽培する工程を含むことが好ましい。
「リンが欠乏状態となった変異植物体」とは、例えばリン酸輸送に支障が生じる等して、植物体中のリン濃度が低値となった変異植物体を意味する。ここで、リン酸輸送に支障を生じるとは、例えばリン酸輸送に関わる遺伝子に支障が生じることが挙げられ、斯かる変異体として、例えばシロイヌナズナではｐｈｏ１及びｐｈｏ２が挙げられる（参考文献：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （１９９１） ９７巻， １０８７頁）。このような変異植物体は、リンが欠乏した状態で栽培しなくても、すなわちリンを含む媒体においても中性脂質の蓄積促進が行われる。
リンが欠乏した状態での栽培は、通常の温度、湿度、ｐＨ、光照射条件で栽培を行えばよい。このリンが欠乏した状態における栽培期間は特に限定されないが、中性脂質蓄積の点から、好適には数日〜数週間、特には３日間〜３週間、最適には１〜２週間である。
例えば、植物体としてシロイヌナズナを用いる場合、１８〜２５℃、光強度３０〜７０μＥ／ｃｍ２、照射時間６〜２４時間／日の範囲であれば良い。
リンが欠乏した状態での栽培において、媒体の調製方法は特に限定されないが、一般にリン欠乏土壌と言われる土壌、例えば可溶性リン酸が１００ｍｇ／１００ｇ以下、更には５０ｍｇ／１００ｇ以下の土壌、或いはこの様な土壌にＮＫ化成肥料等のリンを含まない肥料の施肥を行うか、或いはこの様な土壌にＮＫ化成肥料等のリンを含まない肥料に少量のリン酸等のリン肥料を加えた肥料の施肥を行うことにより調製することができる。また水耕液や固体培地を用いる場合は、リン以外の必要栄養素を適当に配合した培養液、或いは培地を用いることができる。リン以外の必要栄養素は特に限定されないが、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸カルシウム、硝酸ナトリウム、塩化カリウム。塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト、塩化アルミニウム、塩化ニッケル、ミオイノシトール、チアミン塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、ニコチン酸、葉酸、ビオチン、グリシン等を含むことができる。また固体培地のゲル化剤としては、特に限定されないが、寒天、ゼラチン、ゲルライト（和光純薬社製）等を用いることができる。
「リンが欠乏した状態」での栽培の一態様としては、例えば、ＭＳ培地（ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔａｒｕｍ （１９６２） １５巻， ４７３頁）で、組織が十分に生育した植物体を表１に示した組成をもつ培地に移すか又はＭＳ培地を表１に示したうちのリン非含有培地に置換して栽培すること、リンを含まないか又はリン濃度が極めて低い状態、例えば、好ましくは３３μＭ未満、より好ましくは１０μＭ以下、更に好ましくは３．３μＭ以下、特に好ましくは１μＭ以下、最も好ましくは０．３３μＭ以下で更に数日間〜数週間の栽培をすることが挙げられる。
Figure 0006818193
また別の一態様として、栽培過程において生じるリンの欠乏状態を維持しながら栽培することが挙げられ、この場合には、植物体を適当な期間栽培してリン濃度が極めて低くなってから、更に数日〜数週間の栽培を継続すればよい。この場合に用いる媒体中のリン濃度は、植物体が十分に生育した後に媒体中のリン濃度が上記に示した極めて低い濃度またはゼロとなる様に、初期濃度を調整することにより行えばよい。
かくして植物体の根、葉、或いは茎等に蓄積した中性脂質を植物体から回収する方法は、特に限定されず、例えば、植物体の根、葉、或いは茎等を粉砕、圧搾すること、或いは適当な溶剤により抽出する方法等で植物油脂を得ることができる。より具体的には例えば、植物体の根、葉、或いは茎等を粉砕後、ノルマルヘキサンにより抽出する方法、或いはＢｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒ法（Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． （１９５９） ３７巻， ９１１頁）などの方法を用いることで効率的に植物油脂を抽出することができ、植物油脂に含まれる形で中性脂質を回収することが可能である。斯かる植物油脂は、そのまま中性脂質として用いることもできるが、一般的な脱ガム、脱酸、脱色、脱臭等の精製の後に用いることもでき、その方法は特に限定されない。更に植物油脂から中性脂質を分離・回収することもでき、その方法についても特に限定されない。より具体的に例えば、薄層クロマトグラフィーによる分離およびシリカゲルプレートからの回収、高速液体クロマトグラフィーを用いた分離・回収などが挙げられる。
本発明のトランスジェニック植物をリンが欠乏した状態で栽培又はリンが欠乏状態となった植物体として栽培することで、植物体に蓄積される油脂量をさらに増加させることができる。また、本発明のトランスジェニック植物は、「中性脂質の生合成又は蓄積に影響する核酸配列と、該核酸配列と作動可能に連結され該核酸配列の発現を制御するリン欠乏応答性発現制御配列と、を含有する」ベクターが導入されているため、当該状態で又は当該植物体として栽培することにより、リン欠乏条件を利用して、非常に効率よく油脂を製造することができる。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜中性脂質の生合成に影響するタンパク質の選定＞
本発明の融合遺伝子に含まれる「中性脂質の生合成又は蓄積に影響する核酸配列」が中性脂質の生合成又は蓄積に影響するタンパク質をコードする場合のタンパク質としては、種々ものを選択することができるが、ＴＡＧ合成の最終段階に関与することから、中性脂質の生合成の影響するものとしては、ＤＧＡＴ又はＰＤＡＴ１の影響が大きいと考えられた。さらに、油脂の製造量をさらに増加させるという観点から、上記のＤＧＡＴ又はＰＤＡＴ１がＴＡＧ合成量に影響を与える余地がある条件を検討した。
リンが欠乏した状態でＴＡＧの蓄積量が特に増加することが知られている植物体として、シロイヌナズナｐｇｍ−１変異株がある。ｐｇｍ−１変異株はＡＧＩコード：Ａｔ５ｇ５１８２０の遺伝子が変異により機能損傷しており、糖代謝及びデンプン生合成に支障を生じた変異株である。このｐｇｍ−１変異株と野生株とにおけるＤＧＡＴ１遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子およびＰＤＡＴ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定を以下に示すように行った。
（発現解析）
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のＣｏｌ−０株（野生株）の種子４０個体とｐｇｍ−１変異株の種子４０個体とをＭＳ寒天培地（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ （１９６２） １５巻， ４７３頁）に播種し、２２℃、光強度４０〜７０μＥ／ｃｍ２、照射時間２４時間／日の条件で１０日間栽培した。生育した植物体をＭＳ寒天培地から注意深く引き抜き、可溶性リン酸（ＫＨ２ＰＯ４）の濃度が０ｍＭである表１の培地にそれぞれ２０個体を移植した。また対称として２０個体を、１ｍＭ可溶性リン酸を含む表１の培地に移植し、これらを上記と同条件で更に１０日間栽培した。栽培後の植物体を寒天培地から引き抜き、地上部を切り分けて地上部の重量測定を行った後、この地上部を液体窒素下すり鉢で粉砕し、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて抽出を行った。この後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社製）を用いて逆転写反応を行い全ｍＲＮＡのｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを用いてＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＰ８００、ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社製）によりリアルタイムＰＣＲを行った。この際、試薬としてＳＹＢＲ ＰｒｅＭｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社製）を用いた。標的とする転写産物の量をユビキチン１０遺伝子のｍＲＮＡの発現量を基準にして補正し、ＤＧＡＴ１遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子及びＰＤＡＴ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量をそれぞれ相対化した。図１Ａ〜図１Ｃに、野生株およびｐｇｍ−１変異株における、通常のリン濃度条件下（１ｍＭ）（＋Ｐで表す）又はリン欠乏条件下（０ｍＭ）（−Ｐで表す）でのＤＧＡＴ１遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子及びＰＤＡＴ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量の相対値を示す。図１ＡはＤＧＡＴ１遺伝子、図１ＢはＤＧＡＴ２遺伝子、図１ＣはＰＤＡＴ１遺伝子の発現量の各測定結果である。図１Ａ〜図１Ｃに示した結果から、リン欠乏条件下でＴＡＧの蓄積量が特に増加することが知られているｐｇｍ−１変異株において、通常のリン濃度条件下又はリン欠乏条件下のいずれの条件下においても、ＤＧＡＴ１遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子及びＰＤＡＴ１遺伝子のそれぞれの発現量は、野生株のものと同等であることがわかる。
＜ベクターの作製＞
本発明者らは、上記の通り、リンが欠乏した状態で栽培された植物体において、植物体あたりのトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）量が増加しているにも関わらず、ＴＡＧ生合成の最終段階であるジアシルグリセロール（ＤＡＧ）骨格へのアシル基転移反応を行うアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現量が野生型植物体での発現量と同様であることをつきとめた。このことより着想を得て、リン欠乏状態で栽培された植物体又はリンが欠乏状態となった植物体においてＴＡＧ合成経路に係る遺伝子の発現を制御することで、さらに多くのＴＡＧを植物組織に蓄積させることが可能であると考え、以下に示すベクターを作製した。
［実施例１−１］
まず、シロイヌナズナ野生株の葉から抽出した総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを得て、プライマー１−１Ｆ：５’−ＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＴＧＧＣＧＡＴＴＴＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号：１９）とプライマー２−１：５’−ＧＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＴＧＡＣＡＴＣＧＡＴＣＣＴＴＴＴＣＧＧＴＴＣ−３’（配列番号：２０）を用いて配列を増幅し、ＤＧＡＴ１遺伝子をコードする塩基配列を得た後、ｐＭＤ２０ ｃｌｏｎｉｎｇ ｂｅｃｔｏｒ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）にクローニングし、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、配列内部のＳａｃＩ切断部位を改変し、ＤＧＡＴ１遺伝子をコードする塩基配列を含む改変後の配列を得た。
配列番号１２で表されるＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの塩基配列を含むａｔＭＧＤ３：：ＧＵＳ／ｐＢＩ１０１ベクターをＫｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２００４ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．に記載の方法で得た。前記ＤＧＡＴ１遺伝子をコードする塩基配列を含む改変後の配列を、前記バイナリーベクターａｔＭＧＤ３：：ＧＵＳ／ｐＢＩ１０１上のＳｍａＩ／ＳａｃＩの位置にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ）（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社製）を用いてライゲーション反応により連結し、ＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの塩基配列およびＤＧＡＴ１遺伝子をコードする塩基配列を有する実施例１−１のベクターを得た。
この実施例１−１のベクターをアグロバクテリウムＧＶ３１０１株に導入した。
［実施例１−２］
シロイヌナズナ野生株の葉から抽出した総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを得て、プライマー１−２：５’‐ ＧＣＣＣＣＧＧＧＴＡＴＧＧＧＴＧＧＴＴＣＣＡＧＡＧＡＧＴＴＣＣＧＡＧ‐３’（配列番号：２７）とプライマー２−２：５’‐ ＧＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＡＡＧＡＴＣ‐３’（配列番号：２８）を用いて配列を増幅し、ＤＧＡＴ２遺伝子をコードする塩基配列を得た。その後、上記実施例１−１と同様にして、ＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの塩基配列およびＤＧＡＴ２遺伝子をコードする塩基配列を有する実施例１−２のベクターを得た。
この実施例１−２のベクターをアグロバクテリウムＧＶ３１０１株に導入した。
［実施例１−３］
シロイヌナズナ野生株の葉から抽出した総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを得て、プライマー１−３：５’‐ ＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＣＡＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧ ‐３’（配列番号：２９）とプライマー２−３：５’‐ ＧＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＣＡＡＴＡＣＧＣＴＣ‐３’（配列番号：３０）を用いて配列を増幅し、ＰＤＡＴ１遺伝子をコードする塩基配列を得た。その後、上記実施例１−１と同様にして、ＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの塩基配列およびＰＤＡＴ１遺伝子をコードする塩基配列を有する実施例１−３のベクターを得た。
この実施例１−３のベクターをアグロバクテリウムＧＶ３１０１株に導入した。
＜トランスジェニック植物の作製＞
［実施例２−１］
シロイヌナズナ野生株を栽培し、上記の実施例１−１のベクターを保持するアグロバクテリウムにＦｌｏｒａｌ ｄｉｐ法（文献Ｃｌｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ （１９９８） １６：７３５−７４３参照）により、実施例１−１のベクターを導入し、ＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの塩基配列およびＤＧＡＴ１遺伝子をコードする塩基配列を有する実施例２−１のトランスジェニック植物を得た。
［実施例２−２］
シロイヌナズナ野生株を栽培し、実施例２−１と同様にして実施例１−２のベクターを導入し、ＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの塩基配列およびＤＧＡＴ２遺伝子をコードする塩基配列を有する実施例２−２のトランスジェニック植物を得た。
［実施例２−３］
シロイヌナズナ野生株を栽培し、実施例２−１と同様にして実施例１−３のベクターを導入し、ＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの塩基配列およびＰＤＡＴ１遺伝子をコードする塩基配列を有する実施例２−３のトランスジェニック植物を得た。
［実施例３−１］
ｐｇｍ−１変異株を栽培し、実施例２−１と同様にして実施例１−１のベクターを導入し、ＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの塩基配列およびＤＧＡＴ１遺伝子をコードする塩基配列を有し、且つＰＧＭ遺伝子の機能が損傷した実施例３−１のトランスジェニック植物を得た。
［実施例３−２］
ｐｇｍ−１変異株を栽培し、実施例２−１と同様にして実施例１−２のベクターを導入し、ＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの塩基配列およびＤＧＡＴ２遺伝子をコードする塩基配列を有し、且つＰＧＭ遺伝子の機能が損傷した実施例３−２のトランスジェニック植物を得た。
［実施例３−３］
ｐｇｍ−１変異株を栽培し、実施例２−１と同様にして実施例１−３のベクターを導入し、ＭＧＤ３遺伝子のプロモーターの塩基配列およびＰＤＡＴ１遺伝子をコードする塩基配列を有し、且つＰＧＭ遺伝子の機能が損傷した実施例３−３のトランスジェニック植物を得た。
（トランスジェニック植物におけるＤＧＡＴ１遺伝子発現の確認）
上記のＤＧＡＴ１遺伝子の発現解析と同様にして、実施例２−１及び実施例３−１のトランスジェニック植物におけるＤＧＡＴ１遺伝子発現量を求め、実施例２−２及び実施例３―２のトランスジェニック植物におけるＤＧＡＴ２遺伝子発現量を求め、実施例２−３及び実施例３―３のトランスジェニック植物におけるＰＤＡＴ１遺伝子発現量を求めた。結果を図２Ａ〜Ｃに示す。この結果から、実施例２−１〜実施例２−３および実施例３−１〜実施例３−３のトランスジェニック植物では、リン欠乏に応答してＤＧＡＴ１遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子及びＤＡＴ１遺伝子の各遺伝子の発現が制御され、ＤＧＡＴ１遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子及びＤＡＴ１遺伝子の各遺伝子の発現が上昇したことが確認できた。
＜油脂の製造＞
［実施例４］
実施例２−１のトランスジェニック植物の種子２０個体分をＭＳ寒天培地に播種し、２２℃、光強度４０〜７０μＥ／ｃｍ２、照射時間２４時間／日の条件で１０日間栽培した。生育した植物体をＭＳ寒天培地から注意深く引き抜き、可溶性リン酸（ＫＨ２ＰＯ４）の濃度が１ｍＭである表１の培地にそれぞれ２０個体を移植した。これらを上記と同条件で更に１０日間栽培した。
［実施例５］
実施例２−１のトランスジェニック植物の種子２０個体分をＭＳ寒天培地に播種し、２２℃、光強度４０〜７０μＥ／ｃｍ２、照射時間２４時間／日の条件で１０日間栽培した。その後、２０個体を、可溶性リン酸の濃度が０ｍＭである表１の培地に移植した。これらを上記と同条件で更に１０日間栽培した。
［実施例６］
実施例３−１のトランスジェニック植物の種子２０個体分を用いて、実施例４と同様の条件で栽培した。
［実施例７］
実施例３−１のトランスジェニック植物の種子２０個体分を用いて、実施例５と同様の条件で栽培した。
［実施例８］
実施例２−２のトランスジェニック植物の種子２０個体分を用いて、実施例４と同様の条件で栽培した。
［実施例９］
実施例２−２のトランスジェニック植物の種子２０個体分を用いて、実施例５と同様の条件で栽培した。
［実施例１０］
実施例３−２のトランスジェニック植物の種子２０個体分を用いて、実施例４と同様の条件で栽培した。
［実施例１１］
実施例３−２のトランスジェニック植物の種子２０個体分を用いて、実施例５と同様の条件で栽培した。
［実施例１２］
実施例２−３のトランスジェニック植物の種子２０個体分を用いて、実施例４と同様の条件で栽培した。
［実施例１３］
実施例２−３のトランスジェニック植物の種子２０個体分を用いて、実施例５と同様の条件で栽培した。
［実施例１４］
実施例３−３のトランスジェニック植物の種子２０個体分を用いて、実施例４と同様の条件で栽培した。
［実施例１５］
実施例３−３のトランスジェニック植物の種子２０個体分を用いて、実施例５と同様の条件で栽培した。
［比較例１］
野生株の種子２０個体分をＭＳ寒天培地に播種し、２２℃、光強度４０〜７０μＥ／ｃｍ２、照射時間２４時間／日の条件で１０日間栽培した。生育した植物体をＭＳ寒天培地から注意深く引き抜き、窒素（Ｎ）の濃度が（通常）４．５ｍＭである表２の培地に２０個体を移植した。これらを上記と同条件で更に１０日間栽培した。
［比較例２］
野生株の種子２０個体分をＭＳ寒天培地に播種し、２２℃、光強度４０〜７０μＥ／ｃｍ２、照射時間２４時間／日の条件で１０日間栽培した。生育した植物体をＭＳ寒天培地から注意深く引き抜き、窒素（Ｎ）の濃度が０ｍＭである表２の培地に２０個体を移植した。これらを上記と同条件で更に１０日間栽培した。
［比較例３］
野生株の種子２０個体分を、実施例４と同様の条件および方法で栽培した。
［比較例４］
野生株の種子２０個体分を、実施例５と同様のリン欠乏条件および方法で栽培した。
［比較例５］
実施例１−１〜実施例１−３のいずれのベクターも導入されていないｐｇｍ−１変異株由来の種子２０個体分を、実施例４と同様の条件および方法で栽培した。
［比較例６］
実施例１−１〜実施例１−３のいずれのベクターも導入されていないｐｇｍ−１変異株由来の種子２０個体分を、実施例５と同様のリン欠乏条件および方法で栽培した。
Figure 0006818193
油脂の製造に用いた各実施例の植物体について表３に示す。
Figure 0006818193
（植物体の新鮮重の測定）
比較例１〜６の油脂の製造において栽培した各植物体、及び実施例４〜１５の油脂の製造で栽培した各トランスジェニック植物について、栽培後の各植物を寒天培地から引き抜き、地上部（葉、茎）および根に切り分け、地上部の重量測定を行った（各２０個体）。この結果を図３に示す。
比較例１〜２と比較例３〜４との比較によれば、窒素欠乏条件下での栽培と比べて、リン欠乏条件での栽培は植物の成長が良好であることがわかる。また、実施例４〜１５と比較例３〜６との比較によれば、実施例１−１〜実施例１−３のいずれかのベクターが導入された実施例４〜１５のトランスジェニック植物は、実施例１−１〜実施例１−３のいずれのベクターも導入されていない野生型及びｐｇｍ−１変異株と同等の良好な成長が認められた。
（植物体の油脂蓄積量の測定）
植物組織中の油脂成分の分析は、下記に記載の方法により行った。
（１）抽出及び前処理
総脂質の抽出は、Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒ法（Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． （１９５９） ３７巻， ９１１頁）に基づき行った。総脂質からＴＡＧの分離は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ６０， ２０ｘ２０ ｃｍ， メルク， 製品コード１．０５７２１．０００９、展開溶媒組成は、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝１６０：４０：４（ｖｏｌ／ｖｏｌ））により行い、プレートからＴＡＧのスポットをかきとって含量の測定を行った。
（２）中性脂質量の測定
１５：０脂肪酸を内部標準試料として、ＴＡＧをメタノリシス処理した。具体的には、ネジ栓付きガラス試験管内で、ＴＡＧを含むシリカゲル粉末に１００ μｌの１ ｍＭ １５：０ヘキサン溶液 （ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ， シグマアルドリッチ， Ｐ−６１２５）および３５０μｌの５％ 塩化水素メタノール溶液（和光純薬， ０８９−０３９７１）を添加して８５℃で１時間処理した。メタノリシス処理後、ヘキサンで脂肪酸メチルエステルを回収し、窒素ガスで乾固後、６０μｌのヘキサンで回収し、そのうち３μｌをガスクロマトグラフィーで解析した。ガスクロマトグラフィー（島津製作所、ＧＣ−２０１４， カラム、信和化工ＵＬＢＯＮ ＨＲ−ＳＳ−１０ （２５ ｍ， ０．２５ ｍｍ ＩＤ）、カラム温度１８０℃、気化室および検出器２５０℃、入口圧（ｋＰａ） ６８．２、カラム流量（ｍｌ／ｍｉｎ） ０．５３、スプリット比６８．８、計測時間１５分）を用いて分離・定量を行った。
（３）植物組織乾燥重量の測定
凍結乾燥処理を２０時間行った後、重量を測定し、乾燥重量とした。
比較例１〜６の油脂の製造において栽培した各植物体、及び実施例４〜１５の油脂の製造で栽培した各トランスジェニック植物について、栽培後の各植物を寒天培地から引き抜き、地上部（葉、茎）および根に切り分け、この地上部を液体窒素下すり鉢で粉砕し、上記のＢｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒ法で脂肪抽出を行った（各２０個体）。その後、薄層クロマトグラフィーによりＴＡＧを分離・精製後、塩酸メタノールでメタノリシス処理をしてガスクロマトグラフィーを用いて脂質分析を行った。植物個体（乾燥重量）あたりのＴＡＧ量の割合（重量％）を図４に示す。また、植物個体（新鮮重量）あたりのＴＡＧ量を図５に示す。
図４および図５に示されるように、窒素欠乏条件での栽培と比べ、リン欠乏条件での栽培では、植物の成長が良好に保たれたまま油脂蓄積を向上させることが可能であることがわかる。
図４で示されるように、実施例４におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例３における野生株と比較した場合に約４倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
実施例８におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例３における野生株と比較した場合に約２倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
実施例１２におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例３における野生株と比較した場合に約２倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
実施例５におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例４における野生株と比較した場合に約２．５倍、比較例３での野生株と比較した場合には約２０倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
実施例９におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例４における野生株と比較した場合に約１．３倍、比較例３での野生株と比較した場合には約７倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
実施例１３におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例４における野生株と比較した場合に約２倍、比較例３での野生株と比較した場合には約１０倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
以上のことから、リン欠乏応答性のプロモーター配列によってＤＧＡＴ１遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子、ＰＤＡＴ１遺伝子の各遺伝子を発現させたトランスジェニック植物では、植物体のＴＡＧ蓄積を向上させることができ、該トランスジェニック植物をリンが欠乏した状態で栽培することで、格段にＴＡＧ蓄積を向上可能であることが明らかである。
また、図４で示されるように、実施例６におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例３における野生株及び比較例５におけるｐｇｍ−１変異株と比較した場合に、それぞれ約１０倍及び約７倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
実施例１０におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例３における野生株及び比較例５におけるｐｇｍ−１変異株と比較した場合に、それぞれ約６．５倍及び約３．５倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
実施例１４におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例３における野生株及び比較例５におけるｐｇｍ−１変異株と比較した場合に、それぞれ約８倍及び約４．５倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
実施例７におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例４における野生株及び比較例６におけるｐｇｍ−１変異株と比較した場合、それぞれ約４倍及び約２．５倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
実施例１１におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例４における野生株及び比較例６におけるｐｇｍ−１変異株と比較した場合、それぞれ約２倍及び約１．１倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
実施例１５におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例４における野生株及び比較例６におけるｐｇｍ−１変異株と比較した場合、それぞれ約３．５倍及び約２倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
また、実施例７におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例３における野生株及び比較例５におけるｐｇｍ−１変異株と比較した場合、それぞれ約３０倍及び約１７倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
また、実施例１１におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例３における野生株及び比較例５におけるｐｇｍ−１変異株と比較した場合、それぞれ約１２倍及び約７倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
また、実施例１５におけるトランスジェニック植物の葉及び茎には、比較例３における野生株及び比較例５におけるｐｇｍ−１変異株と比較した場合、それぞれ約１９倍及び約１１倍のＴＡＧ蓄積向上効果があった。
以上のことから、リン欠乏応答性のプロモーター配列によってＤＧＡＴ１遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子、ＰＤＡＴ１遺伝子のいずれの遺伝子を発現させたトランスジェニック植物においても、糖代謝およびデンプン生合成の機能を低下させることにより、植物体のＴＡＧ蓄積をさらに向上させることができ、該トランスジェニック植物をリンが欠乏した状態で栽培することで、ＴＡＧ蓄積を著しく向上させることが可能であることが判明した。
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
本発明によれば、植物体の光合成を継続させながら、植物油脂を効率的に製造可能なトランスジェニック植物を取得することができる。本発明のトランスジェニック植物は、特にリン酸欠乏土壌での栽培のようなリン欠乏条件下での栽培時に植物油脂が特に効率的に製造され、有用性が発揮される。したがって、アジアをはじめとした世界各地に広がり、穀物等の育成には不向きであるために農業的な活用において問題となっているリン欠乏土壌の有効な活用に貢献するとともに、これまで油脂生産に通常用いられることのなかった植物の葉を用いて、大量に油脂を製造できる新たな方法を提供できる。
さらに、生成される油脂の性質は自由に改変可能であり、市場価値の高い燃料用途向けの脂肪酸組成の油脂を製造すること等により、さらに産業上の利用の可能性を広げることができる。

Claims (11)

  1. 植物を、窒素のみが欠乏した状態で栽培した場合よりも成長を良好に保ったまま栽培し、中性脂質を製造する、中性脂質の製造方法であって、
    前記植物に、中性脂質の生合成量を増加させるか、中性脂質の蓄積量を増加させるか、又は、中性脂質の組成を改変させる核酸配列と、該核酸配列と作動可能に連結され該核酸配列の発現を制御するリン欠乏応答性発現制御配列とを含む融合遺伝子を含有させたトランスジェニック植物を、リンが欠乏した状態で栽培する栽培工程を含み、
    前記リン欠乏応答性発現制御配列が、モノガラクトシルジアシルグリセロールシンターゼ遺伝子、ホスホリパーゼＣ遺伝子、ホスホリパーゼＤ遺伝子、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ遺伝子、スルホキノボシルジアシルグリセロールシンターゼ遺伝子、ＵＤＰ−スルホキノボースシンターゼ遺伝子、ＳＱＤＧシンターゼ遺伝子、及びＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子のプロモーターの配列である、製造方法。
  2. 前記核酸配列が、中性脂質の生合成量を増加させるか、中性脂質の蓄積量を増加させるか、又は、中性脂質の組成を改変させるタンパク質をコードする核酸配列である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記中性脂質の生合成量を増加させるか、中性脂質の蓄積量を増加させるか、又は、中性脂質の組成を改変させるタンパク質が、ＤＧＡＴ又はＰＤＡＴである請求項２に記載の製造方法。
  4. 前記中性脂質の生合成量を増加させるか、中性脂質の蓄積量を増加させるか、又は、中性脂質の組成を改変させるタンパク質が、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項２又は３に記載の製造方法。
    （ａ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｂ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列からなり、且つアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、
    （ｃ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、
    （ｄ）配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列に対して、２５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＭＢＯＡＴ（膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼ）ファミリーに属し、且つアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
  5. 前記トランスジェニック植物が、糖代謝、デンプン生合成及び膜脂質代謝からなる群から選ばれる少なくとも一つの機能が低下又は抑制された植物体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 前記トランスジェニック植物が、中性脂質の生合成量を増加させるか、中性脂質の蓄積量を増加させるか、又は、中性脂質の組成を改変させる核酸配列と、該核酸配列と作動可能に連結され該核酸配列の発現を制御するリン欠乏応答性発現制御配列とを含む、融合遺伝子を含有する、トランスジェニック植物と、糖代謝、デンプン生合成及び膜脂質代謝からなる群から選ばれる少なくとも一つの機能が低下又は抑制された植物体との交配により得られるトランスジェニック植物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 前記栽培工程が、組織が十分に生育した前記トランスジェニック植物を、リンが欠乏した媒体に移植する又は媒体をリンが欠乏した媒体に置換して栽培する、或いは栽培過程の媒体において生じるリンの欠乏状態を維持しながら栽培する工程である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 前記栽培工程は、前記トランスジェニック植物を、リンが欠乏状態となった植物体として栽培する工程である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
  9. 前記リンが欠乏状態となった植物体が、リン酸輸送機能が低下又は抑制された植物体である、請求項８に記載の製造方法。
  10. 中性脂質の生合成量を増加させるか、中性脂質の蓄積量を増加させるか、又は、中性脂質の組成を改変させる核酸配列と、該核酸配列と作動可能に連結され該核酸配列の発現を制御するリン欠乏応答性発現制御配列と、を含み、前記リン欠乏応答性発現制御配列が、モノガラクトシルジアシルグリセロールシンターゼ遺伝子、ホスホリパーゼＣ遺伝子、ホスホリパーゼＤ遺伝子、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ遺伝子、スルホキノボシルジアシルグリセロールシンターゼ遺伝子、ＵＤＰ−スルホキノボースシンターゼ遺伝子、及びＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子のプロモーターの配列である、トランスジェニック植物。
  11. 中性脂質の生合成量を増加させるか、中性脂質の蓄積量を増加させるか、又は、中性脂質の組成を改変させる核酸配列と、該核酸配列と作動可能に連結され該核酸配列の発現を制御するリン欠乏応答性発現制御配列と、を含み、前記リン欠乏応答性発現制御配列が、モノガラクトシルジアシルグリセロールシンターゼ遺伝子、ホスホリパーゼＣ遺伝子、ホスホリパーゼＤ遺伝子、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ遺伝子、スルホキノボシルジアシルグリセロールシンターゼ遺伝子、ＵＤＰ−スルホキノボースシンターゼ遺伝子、及びＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子のプロモーターの配列である、ベクターを備える、トランスジェニック植物の作出用キット。
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