MX2014002123A - Metodos para la regulacion de la proliferacion y diferenciacion celular de especies vegetales mediante el gene attctp2. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a la funcionalidad y utilidad del gen TCTP2 y la proteína que codifica, particularmente de Arabidopsis thaliana (AtTCTP2) y de los elementos que definen su papel en la proliferación celular, organogénesis y desarrollo en plantas, así como a la posibilidad de utilizarlo en la obtención de plantas transformadas cuando sobre- expresan AtTCTP2, ya que estas presentan una tasa de diferenciación celular y de organogénesis mayor que la que tiene el tipo silvestre, incrementándose su capacidad para regenerar plántulas, por lo que los métodos y los productos proporcionados con dicho gen tienen aplicación en el campo de la agrobiología.

Description

Métodos para la regulación de la proliferación y diferenciación celular de especies vegetales mediante el gene AtTCTP2 Campo de la invención.

La presente invención se refiere a la funcionalidad del gen AtTCTP2 y su papel en la proliferación celular, organogénesis y desarrollo en plantas así como a la posibilidad de utilizarlo en la obtención de plantas transformadas para aplicación en el campo de la agrobiología.

Antecedentes de la invención.

La proteína tumoral controlada traduccionalmente TCTP (por sus siglas en inglés: Translationally Control Tumor Protein) también llamada p21, p23, factor liberador de histamina y/o fortilina, fue descubierta hace más de 25 años por tres grupos dedicados a investigar genes regulados traduccionalmente [1,2,3]. La TCTP es una proteína de expresión ubicua y constitutiva en eucariontes, donde su función en animales y levaduras parece estar dirigida a la proliferación y diferenciación celular, y en muchos otros procesos como apoptosis, organización microtubular, homeostasis de hierro, así como también asociada a proteínas como polo-kinasa, tubulina y ATPasa de K+/Na+ (figura 1)[4] Este gen ¡nicialmente se encontró expresado en tumores cancerosos de tejidos de mamíferos, pero no es una proteína específica de tumores, también se expresa en los tejidos sanos tanto de plantas como de animales [5]. Se ha encontrado una elevada expresión en todas las partes de plantas como Arabidopsis [6], Hevea brasiliensis [7], Pharbitis [8] y Pisum sativum [9].

Un promotor de TCTP de Arabidopsis ya ha sido aislado, el cual es capaz de dirigir una elevada expresión de transgenes en plantas transgénicas. La mayoría de los estudios indican que en plantas como pea, Tabaco, Arabidopsis y en Japanese morning glory pueden tener al menos una o hasta dos copias del gene TCTP. Los estudios en oil palm revelan que existen tres isoformas del gene TCTP, donde sus secuencias de aminoácidos tienen una similitud de 97-98% pero sus regiones no traducidas (UTR) tanto 5' como 3' son notoriamente distintas.

El papel de la TCTP en plantas aún permanece poco claro. Estudios en calabaza mostraron la presencia, en floema, tanto de proteína como de transcritos de TCTP, revelando una función autónoma no celular, en tanto que otro estudio, mostró que la sobreexpresión de esta proteína (CmTCTP) en explantes de tabaco resultaba en organogenesis, lo cual es consistente con un posible papel en la regulación de la proliferación celular [10].

En bases de datos se encuentra descrito un gen para TCTP en Arabidopsis denominado AtTCTPI (At3g 16640), el cual es prácticamente constitutivo y del que se afirma es mediador en las rutas de señalización de auxinas (fitohormonas regulatorias del crecimiento) y está involucrado en la homeostasis de las mismas, en la regulación de crecimiento celular, entre otros. Además, los fenotipos observados por silenciamiento (bajo tamaño y células más pequeñas de lo normal) sugieren que TCTP podría actuar como un factor de Intercambio de Guanin-nucleótidos en la ruta de señalización de TOR (Blanco de Rapamicina, por sus siglas en inglés).

Sin embargo, el genoma de Arabidopsis thaliana tiene otro gen para TCTP aún no caracterizado, el cual, de expresarse, lo hace a niveles muy bajos, según los datos obtenidos por microarreglos en nuestro grupo de trabajo. Este gen, denominado AtTCTP2 (At3g05540) se encuentra reportado en la base de datos del genoma de Arabidopsis [11], en donde sólo se relaciona a esta proteína con la familia de TCTPs y señala una elevada semejanza con el gen AtTCTPI .

Berkowitz y colaboradores [6] examinaron la función de TCTP de Arabidopsis in planta, donde los resultados de este estudio indican que AtTCTPI se expresa en todos los tejidos de la planta, con una mayor expresión en tejido merismático y células en expansión. En este trabajo identifican a TCTP1 como un importante componente en la regulación del crecimiento en plantas, tal vez como mediador de la actividad de TOR con auxina como inductor. Además mediante knockout por inserción de T-DNA y silenciamiento (por RNAi) génico (del gen At3g16640-AtTCTP1) observaron un fenotipo característico (deterioro del crecimiento del tubo de polen, disminución en el crecimiento vegetativo, hojas de bajo tamaño, reducción en la formación de raíces laterales y afectaciones en el desarrollo de raíces), el cual concuerda con lo ya reportado en otros trabajos para TCTP en otros organismos, principalmente en Drosophila [6].

Sin embargo, en esta misma investigación se indica que el gen At3g05540, que codifica para AtTCTP2, es un pseudogen no funcional, basándose en los resultados nulos obtenidos al realizar RT-PCR cuantitativo en distintos tejidos de la planta (en los que no se detectaron transcritos) y en la ausencia de un fenotipo obvio en las mutantes por inserción de este gen (SALK_010334).

Así mismo Brioudes [12] describe que la mutación en tctp-2 (-/-) homocigota en plantas (referida específicamente a AtTCTPI) es letal y el desarrollo de los embriones se aborta.

Breve descripción de las figuras.

Figura 1. Se muestra la importancia de las funciones y regulaciones de la proteína TCTP. TCTP es una proteína ubicua en eucariontes cuya regulación y capacidad de asociación-interacción con otras proteínas y/o moleculas juegan papales decisivos en las diversas funciones que ejerce, dependiendo del sitio de localización y la etapa de desarrollo en la que esté actuando esta proteína.

Figura 2. Se muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de ambos genes (AtTCTPI y AtTCTP2) codificantes para TCTP en Arabidopsis. La diferencia más notable entre ambas proteínas es la región de 13 aminoácidos indicada en el recuadro, la cual no se encuentra en AtTCTP2.

Figura 3. Se muestran los genes que codifican para posibles productos funcionales de TCTP en planta. Se muestran algunos organismos vegetales representativos cuyas secuencias han sido identificadas en bases de datos (NCBI y Phytozome), en donde se observa que mientras que en algunos casos existe un solo gen para TCTP, en otros casos existe más de uno, indicando una posible especialización de algunas TCTPs en planta.

Figura 4. Se muestran plantas mutantes de T-DNA (SALK_045146). Se observan fenotipos representativos de plantas silvestres (WT), heterocigotas y homocigotas de mutantes de T-DNA en el gen codificante para AtTCTP2 (At3g05540) crecidas (A) in vitro (18 días en medio MS) y (B) en suelo a diferentes tiempos (3 y 6 semanas). Barra de tamaño: 2.5 cm.

Figura 5. Se muestra la genotipificación de plantas silvestres (WT), heterocigotas y homocigotas crecidas in vitro (medio MS) y en suelo. Se observa (A) un mapa representativo del sitio de inserción del T-DNA en la región codificante del gen codificante para AtTCTP2 (ORF AtTCTP2), así como los sitios de alineamiento de los oligonucleótidos AtTCTP2-LP (SEQ.ID. No. 2), AtTCTP2-RP (SEQ.ID. No. 1) y LBb1 (SEQ.ID. No. 3) usados en la presente invención para la genotipificación ; (B) amplificación de fragmentos LP-RP (paneles izquierdos) y LBb1-RP (panel derecho) para la genotipificación de mutantes de T-DNA usadas; las líneas heterocigotas (carriles 1, 2, A, B, 3, E y F) presentan ambas bandas (1 Kb y 450 pb), mientras que las homocigotas (carriles C y D) y silvestres (Silv) solo presentan una banda de 450 pb y 1 Kb respectivamente; (C) Genotipificación de 26 líneas analizadas, de las cuales 5 resultaron ser silvestres, mientras que 21 fueron corroboradas como mutantes de T-DNA (17 heterocigotas y 4 homocigotas).

Figura 6. Se muestran los fenotipos representativos de 4 líneas SALK_045146 comparadas con la planta silvestre (WT) a los 70 días despues de la germinación.

Figura 7. Se muestran los fenotipos representativos de 12 líneas SALK_045146 comparadas con una planta silvestre (WT) a los 45 días después de la germinación.

Figura 8. Se muestra la cuantificación de transcritos de AtTCTP2 y AtTCTPI en plantas heterocigotas de la línea SALK 045146, donde se observa que en las líneas heterocigotas analizadas dicho comportamiento es efectivamente solo imputable a la interrupción del gen AtTCTP2.

Figura 9. Se muestra el área foliar de 12 líneas de Arabidopsis SALK_045146 comparadas con 3 líneas silvestres (WT).

Figura 10. Se muestra la capacidad fotosintética de 12 líneas de Arabidopsis SALK_045146 comparadas con 3 líneas silvestres (WT). Las mediciones de consumo de CO2 fueron hechas usando el sistema portátil de medición de fotosíntesis LI-6400 XT de la compañía LI-COR (Nebraska, USA). Las plantas fueron medidas a los 45 y 50 días después de germinadas, y la corrección de la tasa fotosintética fue hecha respecto al área.

Figura 11. Se muestran las secuencias de los oligonucleótidos utilizados en la presente invención.

Figura 12. Se muestran esquemas gráficos de los vectores de clonación (pCR™8/GW/TOPO®TA Cloning®Kit, INVITROGEN) y sub-clonación usados en la presente invención (http:bgateway.psb.ugent.be).

Figura 13. Se muestra la mezcla de reacción y condiciones de qRT PCR tiempo real usadas en la presente invención.

Figura 14. Se muestra la metodología utilizada en la presente invención para amplificar y clonar el ORF de AtTCTP2.

Figura 15. Se muestra el RNA total de Arabidopsis y LD-PCR a partir del cDNA. Las letras indican el tejido H (hoja) y T (tallo) del cual se extrajo el RNA total. Los números en blanco indican los ciclos de amplificación del cDNA y las lcyendas indicadas en la parte superior indican el tiempo que se trató el cDNA a 72°C.

Figura 16. Se muestra la prueba por PCR de los oligonucleótidos diseñados de la presente invención (SEQ.ID. No. 4 y 5). Se realizó un gradiente de temperatura: (carril 1) 54°C, (carril 2) 57°C, (carril 3) 60°C y (carril 4) 63°C. El tamaño del amplicón es de alrededor de 1.55 Kb pues equivale al locus genómico de AtTCTP2 (SEQ.ID. No.24).

Figura 17. Se muestra la amplificación del ORF AtTCTP2 a partir de cDNA. Utilizando los oligonucleótidos ORF-UTR AtTCTP2 (SEQ.ID. No. 4 y 7) seguido de una PCR anidada usando los oligonucleótidos con SEQ.ID. No. 4 y 5, bajo las condiciones indicadas, se amplificaron bandas con tamaños de alrededor de 500 pb (óvalos) y denominadas 1, 2 y 3 tal como se muestra.

Figura 18. Se muestra la digestión de verificación de la presencia del inserto de interes (ORF de AtTCTP2) en el vector de clonación PCR8GWTOPO por digestión con EcoRV. En el carril Ps/c se observa uno de los plásmidos sin ser digerido, mientras que en los carriles 1 a 4 se muestran los cuatro plásmidos digeridos, de los cuales solo el numero 4 mostró una orientación negativa (317 pb) mientras que los tres restantes si la presentaron (416 pb); carril M marcador de peso molecular.

Figura 19. Se muestra la digestión de verificación de la presencia del inserto de interés (ORF de AtTCTP2) en el vector de clonación PCR8GWTOPO mediante amplificación por PCR. En los carriles 1 y 2 se muestra la presencia del inserto en dos plásmidos binarios en E. coli mientras que en los carriles 3 y 4 se observa la comprobación del inserto en plásmidos extraídos de A. tumefaciens.

Figura 20. Se muestra la verificación de la clonación de AtTCTP2 mediante secuenciación nucleotídica. Se observan los datos de secuenciación obtenidos de la clona positiva. (SEQ.ID. No.28).

Figura 21. Se muestra un gel electroforético de amplificación de fragmento Prom-Locus AtTCTP2 (SEQ.ID. No.25).

Figura 22. Se muestra el análisis de restricción de clonas candidatas Prom-Locus AtTCTP2. A la izquierda se observa el escrutinio de 10 clonas candidatas, de las cuales solo 5 presentaron el patrón de bandeo esperado de la digestión con EcoRI (óvalos). A la derecha se muestra la digestión de los 5 plásmidos anteriores con EcoRV para identificar aquellos plásmidos con la orientación positiva, donde solamente 2 de estos plásmidos (óvalos) presentaron esta orientación.

Figura 23. Se muestra la comprobación por PCR de inserto en el vector binario pB7FGW0. En panel izquierdo se observa el inserto en el vector de expresión en 4 de las 5 clonas de E. coli., mientras que en el panel derecho se observa la comprobación de la construcción en las 5 clonas de Agrobacterium sometidas a PCR.

Figura 24. Se muestra la comprobación por PCR de la presencia de inserto Prom-Locus AtTCTP2 en el vector binario contenido en Agrobacterium tumefaciens.

Figura 25. Se muestra la cuantificación de los niveles de expresión de AtTCTP2 y AtTCTPI en planta en condiciones normales. Los niveles del transcrito (RNAm) en los diferentes tejidos de plantas silvestres de Arabidopsis fueron determinados mediante el método de cuantificación relativa AACT [13] tomando como referencia la expresión calculada en las hojas de roseta, usando como genes normalizadores a ubiquitina y 18S utilizando los oligonucleótidos con SEQ.ID. No. 12 a 19. Como se puede observar los niveles de expresión en AtTCTP2 fueron hasta 20 o 30 veces mayores para tejidos como hoja caulinar y tallo, mientras que para AtTCTPI los niveles de transcrito se mantuvieron similares, lo cual concuerda con lo reportado por Berkowitz [6].

Figura 26. Se muestra que el RNAm de AtTCTP2 posee una estructura secundaria. Se observa (a) un comparativo de las estructuras secundarias predictivas de AtTCTP2 y AtTCTPI , en donde se puede observar que la estructura predictiva del transcrito de AÍTCTP2 es más compleja respecto a la de AtTCTPI, lo cual es confirmado por los valores de energía libre para cada estructura predicha; (b) cuantificación de transcritos de AtTCTP2 y AtTCTPI en muestras de tejido vegetativo (hoja y raíz) donde se manejaron dos tratamientos del RNA total previo a la cuantificación por PCR tiempo real, donde en uno se trato termicamente al RNA total a 72°C/10 min (con tratamiento) tanto de hoja como de raíz, mientras que en el otro no se realizó ningún tratamiento previo (sin tratamiento). Resultó evidente que los niveles de AtTCTP2 aumentaron 30 y hasta 60 veces más (en hoja y raíz respectivamente) en las muestras donde se trató al RNA total en comparación con las muestras no tratadas. Mientras que para AtTCTPI los niveles de transcrito incrementaron 3 veces en ambos tejidos analizados.

Figura 27. Se muestra el esquema general de la construcción de análisis de la región promotora de AtTCTP2.

Figura 28. Se muestra el análisis de los sitios de expresión de la región promotora de AtTCTP2. Se observan (A) los resultados del análisis histoquímico para la detección de la actividad de GUS en donde muestran los sitios en donde AtTCTP2 se estaría expresando normalmente: en hojas y peciolo (a-e) acumulándose en tejido vascular, específicamente en venas secundarias (VS) y tricomas (Tr, señaladas con triángulos); en raíces (f-j) tanto en la raíz principal (RP) como en la raíz lateral (RL), destacando la alta expresión en los primordios de raíz lateral (PRL); en el meristemo floral (k-o) se observó en flores (Fl), específicamente en la papilla (Pa), óvulos (Ov), receptáculos (Re) y pedúnculo (Pe), pero además se encontró la señal en el tejido vascular (TV), y en la base de las silicuas (BS).; (B) detección de GFP mediante microscopía confocal en tejido vegetativo (hojas); se observa (panel derecho) la señal tanto en floema interconectante como en tricomas (flechas blancas) a diferencia de los controles silvestres (panel izquierdo). Barras de tamaño= 50 pm.

Figura 29. Se muestran esquemas representativos de las construcciones de sobreexpresión de AtTCTP2 y AtTCTPI.

Figura 30. Se muestra el patrón de acumulación de AtTCTP2-GFP y AtTCTP1-GFP en tejidos vegetativos. Se observa (a-b) 35S::AtTCTP2 locus genómico-GFP; (c- d) 35S:: AtTCTP2-GFP; (e-f) promAtTCTP2::AtTCTP2 locus genómico-GFP; (g-h) 35S::AtTCTP1-GFP; (i-j) silvestre. Las imágenes se muestran para hoja y raíz respectivamente. Los estomas (a, c, e, i) y núcleos de raíz (b, d, f, h, j) están señalados en óvalos; las flechas indican la señal nuclear en celulas de hoja presentada en la amplificación delimitada en los recuadros (g); la presencia de señal en tricomas se muestra en los recuadros inferiores izquierdos (a, c, e, i) y superiores (g). Barra de tamaño: 50 pm.

Figura 31. Se muestran callos de planta de tabaco seguidos en la cinética de crecimiento en peso seco. Se observan (panel izquierdo) controles (NT1) transformados con el vector vacío, y (panel derecho) callos transformados con la versión de sobreexpresión de AtTCTP2 de la presente invención, a los 28 días de comenzada la cinética.

Figura 32. Se muestra la cinética de crecimiento en peso seco de callos de planta de tabaco transformados con AtTCTP2. Callos de tabaco de la línea NT1 fueron transformados por biobalística con la construcción de sobre-expresión de AtTCTP2-GFP, y se siguió una cinética de crecimiento en peso seco de estos callos transformados respecto a callos transformados con el vector vacío (control). Como puede observarse, se encontraron diferencias de cerca del 30% en el crecimiento respecto a los controles hacia el final de la cinética (21 días), indicando un probable papel de AtTCTP2 en la regulación de la proliferación o crecimiento celular.

Figura 33. Se muestra la cuantificación de porcentajes de regeneración de planta de tabaco transformada con diferentes construcciones de sobreexpresión de AtTCTP2. Se llevaron a cabo tres eventos de transformación independientes con 100 replicas por cada uno. Se consideró como evento de regeneración a la aparición de nuevo tejido (generalmente un meristemo apical con tallo y al menos 2 hojas) a partir de los explantes (hojas) transformados a las 4 semanas después de la transformación de estos (se mantuvo en observación hasta las 12 semanas, sin notarse cambios significativos). Las barras de error indican la desviación estándar entre los 3 eventos de regeneración llevados a cabo. Como se puede observar, al sobreexpresar el locus fusionado a GFP (35S:AtTCTP2 locus genómico:GFP), el ORF fusionado a GFP (35S:AtTCTP2:GFP) o el ORF solo de AtTCTP2 (35S:AtTCTP2) se observaron valores similares de regeneración (en promedio 40 a 50%), mientras que para AtTCTPI (35S:AtTCTP1:GFP) los valores de regeneración se podrían considerar prácticamente básales, puesto que fueron muy similares al control (transformados con A. rhizogenes sin contener ninguna construcción).

Figura 34. Se muestran fenotipos de plantas de Nicotiana tabacum regeneradas con las construcciones de sobreexpresión de AtTCTP2 de la presente invención. Se observa (a-e) plantas regeneradas expresando el transgén AtTCTP2-GFP durante los días 15, 30 y 45 en medio MS (a-c) y los días 50 y 90 una vez trasplantadas a suelo (d-e); (f) la comprobación de la presencia del transgen fue hecha por PCR y RT PCR para amplificar GFP y 35S respectivamente. Barras de tamaño= 2cm.

Figura 35. Se muestran imágenes representativas de plantas de tabaco regeneradas con las distintas construcciones de sobreexpresión de AtTCTP2 de la presente invención. Barras de tamaño= 5 cm.

Figura 36. Se muestra que la autoregeneración de hojas de plantas regeneradas con AtTCTP2 Índica el papel de AtTCTP2 en la inducción de la embriogénesis somática. Se observa (panel izquierdo) el protocolo general del ensayo, así como imágenes representativas de 3 experimentos (panel derecho), en donde se muestra que hojas se tomaron para hacer el ensayo [(a-d), delimitadas y señaladas con una flecha], y como es que después de 4 semanas se observó la regeneración de nuevo tejido vegetativo (hojas) a partir de la incubación de las hojas seleccionadas [(e-h) delimitadas y señaladas con una flecha] en un medio MS basal (sin ningún regulador de crecimiento vegetal). Cabe recalcar que este fenómeno o efecto solo ocurrió a partir de hojas que contenían al transgén (a-c, e-g) a diferencia de donde no se expresaba éste (d, h) tal como se muestra en la comprobación por PCR de la presencia de GFP en estas (i). Como puede observarse en esta figura, el tejido vegetativo (hojas) de las plantas regeneradas que se muestran es capaz por sí solo de formar nuevo tejido.

Figura 37. Se muestra como AtTCTP2 induce el crecimiento acelerado durante las primeras etapas del desarrollo vegetativo. Se observan imágenes representativas de la progenie (F1) de plantas regeneradas con diferentes versiones de sobreexpresión de AtTCTP2 (locus-GFP, ORF-GFP y ORF) 45 y 70 días despues de la germinación. Se observa claramente que las plantas conteniendo a AtTCTP2 en todos los casos presentan hojas de mayor tamaño al día 45 (panel izquierdo), sin embargo, hacia el día 70 el tamaño de estas se equiparó (panel derecho). Lo anterior indica que AtTCTP2 podría estar induciendo un desarrollo más acelerado durante etapas tempranas del crecimiento vegetativo, lo cual ya ha sido reportado para TCTP de tabaco (NtTCTP) en la patente US6545202. En la parte inferior se muestra la detección por amplificación del transgen en el 40% de las muestras analizadas. Barra de tamaño= 5cm.

Descripción detallada de la invención.

La presente invención se refiere a la determinación de AtTCTP2 como un verdadero gen que se expresa en circunstancias y en niveles específicos así como a la localización celular y las funciones biológicas en las que podría estar involucrado.

Tomando como principio que el hecho de no poder detectarse un transcrito no es equivalente a que un gen nunca se exprese, nos dedicamos a elaborar una estrategia de análisis mediante téenicas de biología molecular para comprobar tanto la expresión de este gen como su funcionalidad. Una vez determinada su funcionalidad proporcionamos los fundamentos para utilizarlo en la obtención de plantas transgénicas para aplicación en el campo de la agrobiología.

En la figura 1 se muestra la importancia que tiene esta proteína en todos los organismos eucariontes en general, al parecer regulando o participando en la regulación de diversas funciones biológicas de importancia. En planta, encontramos algunos organismos vegetales que poseen sólo un gen codificante para esta proteína, mientras que otros parecen más de uno (figura 3), indicando un probable reparto del trabajo y/o diferencias funcionales entre estas versiones de TCTP. En el caso de Arabidopsis , esta posee 2 genes codificantes para TCTP, los cuales se encuentran dentro del cromosoma 3 del genoma de este organismo, AtTCTPI (At3g16640) y AtTCTP2 (At3g05540), y que poseen entre sí un 68% de identidad, y en las que se distinguen diferencias notables a nivel de secuencia y tamaño de la proteína (figura 2). Como ya se mencionó, el gen AtTCTPI ya ha sido estudiado y caracterizado parcialmente [6,12] indicando un papel fundamental en la regulación de la proliferación celular y el crecimiento mitótico, mientras que el gen AtTCTP2, que había sido considerado hasta antes de la presente invención como un pseudogen, es una de las modalidades preferidas de la presente invención.

Entre los indicios experimentales abordados por nuestro equipo de investigación para determinar la funcionalidad de AtTCTP2 se refiere a los estudios en donde se analizaron mutantes por inserción en este gen. Las mutantes SALK_045146 analizadas durante el desarrollo de la presente invención contienen una inserción de T-DNA en el segundo exón del gen At3g05540- AÍTCTP2, donde en el ejemplo 1 se describe su obtención. En la figura 4 se presenta el aspecto de plantas mutantes de T-DNA (SALK 045146) en el gen AtTCTP2, comparado con el aspecto de un control (planta silvestre). Estas mutantes evidenciaron un fenotipo diferente del silvestre, caracterizado por ausencia de floración, necrosis en hojas iniciada en tejido vascular y proliferación temprana de tricomas en hojas. Cabe señalar que observamos que en las mutantes de T-DNA analizadas por Berkowitz [6], la inserción se encontraba localizada en un intrón, lo que resultaría probablemente en la perdida del T-DNA en el transcrito maduro del gen AtTCTP2 en la mutante y por tanto en un fenotipo silvestre. Esto explicaría la discrepancia entre los resultados mostrados aquí y los de Berkowitz [6], al menos en cuanto al fenotipo de las mutantes.

Para poder realizar un análisis funcional completo del gen AtTCTP2 (y AtTCTPI como control) obtuvimos plantas transgénicas de Arabidopsis que expresaran diversas construcciones que permitieran determinar la expresión endógena del gen y la acumulación de sus productos bajo el control de un promotor constitutivo (35S) y su promotor endógeno (Prom AtTCTP2). De esta manera pudimos: a) Analizar la expresión del gen AtTCTP2 a nivel subcelular, tisular y etapa de desarrollo, lo que implicó cuantificar los niveles de expresión del RNAm de AtTCTP2 en diferentes sitios de la planta, así como generar una línea de análisis de la región promotora de este gen, b) Identificar los patrones de acumulación de la proteína AtTCTP2 comparándolos con los de AtTCTPI a nivel celular en Arabidopsis, y por supuesto realizar el análisis fenotípico de plantas sobreexpresoras de AtTCTP2 y AtTCTPI, así como, c) Determinar el papel de AtTCTP2 en el control de la proliferación celular, la diferenciación, y en general, en el desarrollo en plantas.

Para poder obtener estas plantas transgénicas, fue necesario extraer la región promotora (1.5 Kb río arriba [upstream] del sitio de inicio de la traducción) para poder hacer el análisis de los sitios de expresión del gen mediante los oligos de SEQ.ID. No. 10 y 11, del locus genómico de AtTCTP2 mediante los oligos de SEQ.ID. No. 4 y 5, así como los genes AtTCTP2 mediante los oligos de SEQ.ID. No. 4 y 5, y AtTCTPI mediante los oligos de SEQ.ID. No. 8 y 9, con el fin de sobre-expresarlos fusionados al gen reportero GFP. Así mismo, para evaluar la expresión endógena de AtTCTP2 (Promotor-ORF AtTCTP2) se amplificó un fragmento de 3 Kb (aprox.) que incluyera la región promotora y el locus genómico de AtTCTP2 fusionado traduccionalmente a GFP mediante los oligos de SEQ.ID. No. 10 y 5. En el ejemplo 2 se describe la clonación de estos genes y de los fragmentos de interés en los vectores de expresión para con ellos realizar las transformaciones de Agrobacterium tumefaciens C58C1 y después cada transformante se utilizó para obtener las líneas transgénicas de Arabidopsis mencionadas como se describe en el ejemplo 3.

Para obtener tanto el ORF de AtTCTPI como el de AtTCTP2, primero se extrajo RNA total de hoja y tallo de plantas silvestres de Arabidopsis, siendo después sometido a electroforesis para corroborar su integridad y entonces ser usado para sintetizar cDNA, (figura 14). Luego se sintetizaron oligonucleótidos (ORF-UTR AtTCTP2) para amplificar una porción de los otros, además del marco abierto de lectura de AtTCTP2. Estos se probaron mediante una PCR punto final utilizando DNA genómico como molde. Se llevó a cabo un PCR punto final para obtener el marco abierto de lectura (ORF) del gen At3g05540 (AtTCTP2) a partir de las muestras de cDNA obtenidas mediante los oligos de SEQ.ID. No. 4 y 5. Se amplificaron varios fragmentos con tamaños entre 470 y 530 pb aproximadamente (figura 17). Para el caso del Locus genómico de AtTCTP2 se realizó PCR usando como molde DNA genómico, y obteniendo un fragmento de 1.55 Kb aproximadamente (figura 16).

Estos productos de PCR fueron purificados y ligados cada uno al vector de clonación PCR8GWTOPO (figura 12). Se corroboró la clonación de los distintos amplicones en el vector, a través de la digestión con la enzima de restricción EcoRV debido a que AtTCTP2 y AtTCTPI tienen prácticamente el mismo tamaño, por lo cual se procedió a realizar un patrón de digestión que nos permitió determinar cuáles de estas clonas poseía el ORF de AtTCTP2; para esto se digirieron los plásmidos que resultaron positivos a la presencia de inserto junto con un plásmido que se sabía contenía como inserto el ORF de AtTCTPI. El ORF de AtTCTP2 posee sitio un interno para EcoRV mientras que AtTCTPI no posee sitio interno para esta enzima (figura 18); para corroborar por otro metodo también se realizó una reacción de PCR (figura 19). Así mismo se secuenció la clona positiva para corroborar que efectivamente se contara con el gen de AtTCTP2 (At3g05540); la secuencia completa del ORF de AtTCTP2 se muestra en la figura 20.

Se seleccionó una de las clonas anteriores y se subclonó en el vector de sobre-expresión pB7FWG2 (figura 12). Se obtuvieron nuevas clonas, a las cuales se les realizó escrutinio por PCR, para corroborar la presencia del inserto. Posteriormente se llevó a cabo la introducción de este plásmido binario a células de A. tumefaciens y la subsecuente corroboración del inserto por PCR. Finalmente crecimos los céspedes de A. tumefaciens para llevar a cabo la transformación de plantas silvestres de Arabidopsis por el método de inmersión floral (detallado en el ejemplo 3).

Para obtener plantas en las cuales se pudiera determinar el patrón endógeno de acumulación de AtTCTP2, una vez que se obtuvo la evidencia de la actividad de la región promotora de AtTCTP2 y por ende de su expresión, se determinó generar plantas transgénicas de Arabidopsis conteniendo una construcción que contuviera desde el promotor hasta el marco abierto de lectura de AtTCTP2 fusionado al gen reportero GFP (Prom-ORF AtTCTP2-GFP). Primero se amplificó, mediante PCR punto final, el fragmento de 3 Kb (aprox.) el cual abarca el promotor y ORF de AtTCTP2 (figura 21). Este amplicón fue clonado y analizado por enzimas de restricción para identificar aquellos plásmidos con orientación positiva (figura 22). Se seleccionó unp de estos plásmidos para linealizarlo, purificarlo y llevar a cabo la sub-clonación en el vector para expresión endógena, pB7FWG,0 (figura 12) el cual no posee ningún promotor, y permitirá que el promotor endógeno de AtTCTP2 dirija la expresión del gen de AtTCTP2 fusionado al gen reportero GFP, para posteriormente transformar a E. coli, y corroborar mediante PCR la presencia del inserto de 3 Kb (figura 23). Finalmente se realizó la transformación de A. tumefaciens con el plásmido conteniendo la construcción y realizamos la transformación de plantas de Arabidopsis, no sin antes llevar a cabo la comprobación del inserto en el vector binario (vector de expresión) por Agrobacterium tumefaciens por PCR (figura 24).

Por otro lado, procedimos a analizar la expresión del gen AtTCTP2 a nivel tisular con el fin de identificar los niveles de expresión de AtTCTP2 en diferentes sitios de la planta mediante q-RT PCR tiempo real. Para esto se llevó a cabo el protocolo descrito en el ejemplo 4, en donde básicamente se extrajeron muestras de RNA total de diferentes sitios s de la planta para formar “pools” (conjuntos) de al menos 5 plantas por tejido. Recordemos que debido a que el gen AtTCTP2 es similar en su secuencia nucleotídica con su homólogo AtTCTPI se decidió diseñar oligonucleótidos específicos para amplificar fragmentos específicos de ambos genes que abarcaran parte del ORF y de la región 3’ UTR para los dos genes. Estos fueron probados para verificar la amplificación específica, ío y los amplicones fueron clonados y secuenciados para asegurar la especificidad de las secuencias.

Se realizaron las curvas de calibración para AtTCTP2, AtTCTPI, 18S y actina mediante los oligos de SEQ.ID. No. 12 a 19. Se crecieron plantas silvestres de Arabidopsis thaliana y se extrajo RNA total a partir de tejidos como raíz, hoja de roseta, tallo, hoja caulinar, 15 meristemo floral y silicua (con semillas inmaduras) de 5 plantas distintas (pool de RNAs), tomando en cuenta lo reportado por Berkowitz [6]. Se determinó la concentración de estos RNAs totales espectrofotometricamente (Nanodrop 2000), y se homogenizaron las concentraciones de estos hasta tener 10 ng/mI en cada caso. Posteriormente se prepararon las mezclas de reacción por separado para cada fragmento específico a 20 amplificar, de acuerdo a las especificaciones del Kit Comercial (KAPA SYBR FAST Universal One -Step q-RT PCR Kit®) (figuras 13A y 13B).

Los niveles de expresión de RNAm de AtTCTP2 y AtTCTPI fueron calculados mediante el método de cuantificación relativa de Livak conocido como AACT [13] usando como gen endógeno 18S (Ubiquitina fue descartado) para homogenizar y tomar la expresión en hoja 25 como referencia (figura 25).

Como se observa en la figura 25, los tejidos en donde AtTCTP2 se expresa a niveles más altos son en orden descendente tallo, hoja caulinar, raíz, meristemo floral, hoja de roseta y silicua/semillas. Mientras que para el caso de AtTCTPI, este gen se estaría expresando a niveles muy altos pero similares entre los tejidos analizados, lo cual concuerda con lo 30 reportado por Berkowitz [6].

Los niveles de expresión de AtTCTP2 son muy bajos (Atgeneexpress), y la estructura secundaria predicha para su RNAm es muy intrincada (figura 26a), probables razones por las cuales no se había podido amplificar y clonar su marco de lectura abierto. Sin embargo, como se puede observar en la figura 26b, al tratar térmicamente al RNAm previo a la cuantificación los niveles de detección del transcrito aumentaron hasta a 80 veces más. Lo anterior nos indica que es muy probable que las características estructurales del RNAm de AtTCTP2 sean un paso clave en la regulación de los productos de este gen, y sea la principal razón por la cual los niveles de detección de este gen sean tan bajos que lo han llevado a ser considerado un pseudogen.

Tomando en cuenta que los niveles de expresión en tallo son más de 30 veces mayores que en hoja y además la estructura de este RNAm se pudo simplificar al tratar a este con calor (y aumentar 80 veces su expresión respecto a la muestra no tratada), se logró amplificar el marco de lectura abierto de AtTCTP2, utilizando la metodología descrita en la figura 14.

Para evaluar los sitios de expresión de AtTCTP2 se analizaron las plantas transgénicas que portaron como transgene a la región promotora de AtTCTP2 (SEQ.ID. No. 26) mediante los oligos de SEQ.ID. No. 10 y 11, ligada a los genes reporteros uidA y gfp (figura 27). En el ejemplo 5 se describe la estrategia usada con estas construcciones para la obtención de plantas de Arabidopsis transformadas, en donde básicamente se realizó la detección de la señal de los genes reporteros uidA (GUS) y gfp (GFP) mediante un ensayo de actividad enzimática y microscopía confocal (respectivamente).

En la figura 28 se muestra el ensayo de actividad de b-glucuronidasa (GUS) que se realizó aprovechando la expresión del gen uidA para hacer visible los sitios de expresión de esta región promotora. Para este ensayo, se utilizaron plántulas jóvenes (de 14 a 28 días de crecimiento) y más desarrolladas (50-60 días) de la misma línea transgénica analizada por microscopía confocal. En raíces se puede resaltar que la expresión más elevada se observó en sitios que dan lugar a raíces laterales, así como en algunas partes de la raíz principal (figura 28 A, f-j). En hoja de roseta se observó amplia expresión en tricomas, sobre todo en hojas jóvenes pero además en venas secundarias de manera débil y de manera segada o intermitente. Sin embargo, la señal se intensificó un tanto hacia la punta y borde de la hoja en las primeras hojas menos jóvenes, mientras que la señal en tricomas en estas disminuyó hasta ser casi nula (figura 28 A, a-d). La señal también fue detectada una vez más en tricomas en hoja y peciolo caulinares, además de en tallo (figura 28 A, e). La detección de la señal tanto en flor como en silicua, nos indica un papel importante en el desarrollo de este órgano de la planta. Se observa actividad del promotor en tejido vascular, en pedúnculos, receptáculos, papillas y en óvulos. Esta última localización podría indicar la participación de AtTCTP2 en la embriogénesis y maduración de los óvulos. Es importante mencionar que a pesar de no tener imágenes de semilla, se observa la localización de la señal en el tejido que lo que parecen ser la base de silicuas (figura 28 A, k-o).

En el ensayo de detección de GFP, se muestra que aunque la señal sea débil, está localizada sobre todo en el tejido vascular (figura 28 B). Es de importancia recalcar que la señal se observó además de en el floema principal, en lo que pareciera ser floema interconectante, lo cual no es tan común. Como podemos dRNAos cuenta, los patrones de expresión encontrados en microscopía confocal y en el ensayo de GUS son congruentes, aun cuando las etapas de desarrollo de las plantas ensayadas en ambos casos fueron distintas. Además los niveles de detección mostrados concuerdan con la información en bases de datos (Atgene Express) en donde indican niveles muy bajos para este gen.

Una vez que se caracterizaron tanto los niveles, como los sitios de expresión de AP?TR2, y se pudo amplificar y clonar el ORF de AtTCTP2, se procedió a obtener plantas transgénicas en donde se sobre-expresaran diferentes versiones de AtTCTP2 y como control el ORF de AtTCTPI (SEQ.ID. No.27), siendo el protocolo de obtención de estas el detallado en los ejemplos 2 y 3. El uso de microscopía confocal posibilitó la detección de la acumulación GFP en las plantas transgénicas de Arabidopsis transformadas con la construcciones representadas gráficamente en la figura 29. Los resultados de la figura 30 muestran los sitios de acumulación de la proteína en tejido vegetativo (hoja y raíz); cabe resaltar el patrón de acumulación en el tejido vascular en hojas, así como en estomas y tricomas (mesófilo en algunos casos), el cual se repite con todas las versiones de sobreexpresión de AtTCTP2. Lo más interesante se observó al analizar las células que conforman la parte media de la corteza de raíces en donde se detectó señal nuclear en todas las versiones mientras que para AtTCTPI no fue así. Estos resultados indican una muy probable regulación a nivel transcripcional de AtTCTP2, así como la presencia de diferencias a nivel de sitios de acumulación entre AtTCTP2 y AtTCTPI permitiendo suponer que podría haber diferencias funcionales de algún tipo. No está de más agregar que los fenotipos observados en plantas transgénicas que sobreexpresan a AtTCTP2 no mostraron diferencias notables o evidentes respecto a plantas silvestres crecidas en las mismas condiciones en suelo (resultados no mostrados).

Una vez que se determinó que AtTCTP2 no puede ser considerado como pseudogen, y que existen diferencias en cuanto a los niveles de expresión y sitios de acumulación respecto a AtTCTPI, se diseñó un experimento para determinar el papel de AtTCTP2 en el control del crecimiento (proliferación celular).

El modelo elegido fueron callos de tabaco incapaces de diferenciarse (línea NT1) los cuales fueron transformados por bombardeo con los plásmidos conteniendo las construcciones de sobreexpresión de AtTCTP2- GFP, y el vector vacío como control de acuerdo a como se muestra en el ejemplo 7. Se siguió la cinética del crecimiento de estos callos mediante peso seco, en donde para cada construcción se tomaron pesos promedio de 10 callos transformados por construcción, además de 10 como control (vector vacío) para cada punto de la cinética (figura 31). En la figura 32 se muestra que durante las dos primeras semanas de la cinética no se observaron diferencias significativas entre los callos transgénicos y los controles. Sin embargo, hacia la tercera semana de ésta se hizo evidente un aumento promedio de alrededor del 30% para los callos transgénicos, indicando que AtTCTP2 induce la acumulación de biomasa, lo cual podría estar involucrado con la proliferación celular tal como está reportado que lo hace AtTCTPI, aunque este último parece estar restringido al control del crecimiento mitótico [12]. Finalmente se llevaron a cabo ensayos de regeneración de plantas de tabaco, en donde básicamente se utilizaron explantes de tabaco silvestre para ser transformados (por punción) con distintas construcciones de AtTCTP2 y AtTCTPI en Agrobacterium rhizogenes (como control), tal como se hace referencia en el ejemplo 8. Se han realizado hasta el momento, más de 8 eventos de transformación independientes, con un promedio de 300, y en algunos casos, hasta 500 unidades experimentales para cada construcción analizada.

En la figura 33 se muestra que AtTCTP2 en todas sus versiones [locus-GFP, ORF-GFP (usando los oligos con SEQ.ID. No. 4 y 5) y ORF (usando los oligos con SEQ.ID. No. 4 y 6)], fue capaz de inducir la formación de nuevo tejido que eventualmente se convirtió en plantas completamente desarrolladas, a diferencia de AtTCTPI, el cual no fue capaz de regenerar plántula alguna, tal como se observó para el control. Es importante resaltar que se realizaron diversos ensayos de regeneración modificando no solo las versiones de sobreexpresión de AtTCTP2, si no los sitios de inoculación, los tamaños de los explantes, el tipo de cepa de Agrobacteríum y el número de inoculaciones de la suspensión bacteriana conteniendo las construcciones.

Los mejores resultados fueron observados con las construcciones de ORF de AP?TR2, ya sea fusionado a GFP o solo. Estos fueron mejorados al hacer de 2 a 5 inoculaciones sobre las venas centrales o secundarias en un explante de hoja completo, incluyendo el peciolo, de 2 a 4 cm de diámetro, y solamente utilizando a Agrobacteríum rhizogenes (A. tumefaciens no funcionó). Un dato interesante es que al parecer, sin importar el sitio de inoculación, la regeneración comienza hacia la base de la hoja y el peciolo en la gran mayoría de los casos.

Para caracterizar las plantas regeneradas durante estos ensayos, se decidió seguir el fenotipo de estas a diferentes tiempos (figura 34). Sin embargo, no se observaron diferencias fenotípicas respecto a plantas silvestres incluso usando distintas versiones de sobreexpresión de AtTCTP2 (figura 35). La única diferencia parecía ser un aumento ligero en el tamaño de las plantas regeneradas, sin embargo, no se pudo hacer un comparativo con plantas silvestres en la misma etapa de desarrollo. Por esta razón se propuso analizar tanto las hojas de las plantas regeneradas, así como la progenie (primera generación) de estas.

Para el primer caso, se siguió el protocolo descrito en el ejemplo 9, en donde básicamente se tomaron hojas jóvenes de plantas en proceso de regeneración in vitro (21 despues de la inoculación), y se traspasaron a medio sólido MS sin ninguna hormona o regulador de crecimiento, donde al cabo de 28 días se observó la clara formación de nuevo tejido (tallo y hojas), pero solo se observó este efecto exclusivamente en hojas que contenían al transgen (figura 37). Este resultado fue interesante, puesto que se puede inferir que conforme a la presente invención, el efecto de regeneración provocado por AtTCTP2 podría estar relacionado con la embriogénesis somática y/o la organogénesis.

Para el caso del análisis de la progenie, se siguió el protocolo descrito a detalle en el ejemplo 9, en donde se obtuvo la semilla de algunas plantas regeneradas con AtTCTP2, se sembraron en suelo, se crecieron en invernadero y se compararon respecto a plantas silvestres crecidas en las mismas condiciones durante 100 días. En la figura 37 se muestra que en las primeras etapas de desarrollo se observan plantas con mayor tamaño respecto a las silvestres, pero en etapas posteriores estas diferencias en tamaño no eran apreciables. Para complementar este estudio, se escogieron 15 plantas al azar para extraer su DNA genómico, y usar este como molde para llevar a cabo una PCR punto final para la detección del transgen en estas usando los oligos con SEQ.ID. No. 20 y 21; el resultado muestra que aproximadamente el 40% de estas plantas son transgenicas mientras que el 60% restante puede considerarse silvestre.

Todos los resultados presentados, indican que AtTCTP2 es un gen funcional en Arabidopsis, cuyo papel parece estar más relacionado con la regulación de la diferenciación celular, a diferencia de su homologo AtTCTPI en Arabidopsis, el cual no es capaz de ejercer el efecto de regeneración, pero sí de inducir la proliferación celular a niveles altos.

El objetivo de la presente invención es proporcionar los elementos para utilizar AtTCTP2 (DNA, RNAm y proteína) en agrobiología, tanto para la diferenciación y organogénesis de plántulas en desarrollo de diferentes especies, como en la regeneración de cultivos de interés económico y de preservación de especies.

Si bien el gen de AtTCTP2 se expresa a niveles bajos, en la presente invención hemos podido determinar que tiene una función biológica, donde al parecer tiene un papel importante en la diferenciación celular, mientras que AtTCTPI está más relacionada al crecimiento y desarrollo celular, donde además tiene un patrón de acumulación diferente al de AtTCTPI.

Dentro de las modalidades de la invención se encuentra el uso del gen AtTCTP2 para generar plantas silvestres recalcitrantes o difíciles a la regeneración y plantas transgénicas, cuya sobre expresión puede ser incrementada y modulada por un promotor homólogo ó heterólogo.

AtTCTP2 tiene funciones que se asemejan más a las funciones de TCTP de calabaza (CmTCTP) que también hemos caracterizado en nuestro grupo, es decir, que tanto el RNA como la proteína AtTCTP2 circulan a través del floema y podrían tener una función señalizadora a distancia (datos no presentados).

La sobreexpresión del locus genómico de AtTCTP2 resultó en un alto porcentaje de regeneración de plántulas de tabaco (mayor al 45%), por lo que en la presente invención se presenta su uso como una alternativa bioteenológica para la regeneración de cultivos de interés agrícola (silvestres o transgénicos) o biotecnológico (transgénicos).

A continuación se presentan los siguientes ejemplos únicamente con la finalidad de ilustrar la presente invención, sin que con ello se interpreten limitaciones a su alcance.

Ejemplo 1. Obtención de mutantes nulas (Knock-out de AtTCTP2) SALK_045146; genotipificación y análisis del fenotipo.

La línea mutante de T-DNA en el gen de AtTCTP2, SALK_045146, fue obtenida del Centro de Recursos Biológicos de Arabidopsis (ABRC, por sus siglas en ingles). Las mutantes de T-DNA son mutantes en las que un fragmento de DNA (denominado T-DNA) se inserta de manera aleatoria en algún sitio del locus o de la región promotora de un gen en especifico provocando la inactivación de este. En el caso de la línea SALK_045146, dicha inserción se encuentra en el exón 3 o 4 del gen At4g05540 ( AtTCTP2 ), tal como se muestra en la figura 5A.

Estas semillas mutantes, SALK_045146, fueron sembradas in vitro en medio MS y en suelo, con el fin de analizar los fenotipos en etapas tempranas de desarrollo respecto a plantas silvestres. En la figura 4 se aprecia el aspecto de las mutantes T-DNA homocigotas y heterocigotas comparado con el de las plantas silvestres sembradas todas en Medio MS con Kanamicina durante 18 días, además de los fenotipos en suelo en donde se observa fenotipos de retardo en el crecimiento en algunas de las líneas heterocigotas a las 3 y 6 semanas (figura 4).

Para la genotipificación de líneas de T-DNA (SALK 045146), se extrajo DNA genómico de las 24 muestras (se hicieron pools de algunas con fenotipo similar), y se llevaron a cabo PCRs para genotipificar estas mutantes mostradas. Para esto se usaron los oligonucleótidos específicos LP (SEQ.ID. No. 2) y RP (SEQ.ID. No. 1) para flanquear específicamente la región del gen AtTCTP2 (LP y RP), además del oligonucleótido LBb1 (SEQ.ID. No. 3) para detectar la inserción de T-DNA en la región codificante del gen AtTCTP2 (figura 11). En la figura 5 se muestran el esquema de la construcción, los resultados del ensayo PCR y las observaciones referentes al fenotipo de las plantas heterocigotas y homocigotas en la inserción T-DNA SALK 045146 comparando con las silvestres.

La importancia de AtTCTP2 en la regulación o control del desarrollo en Arabidopsis (y muy probablemente en plantas) se hace evidente al analizar los fenotipos de las plantas en las que este gen está interrumpido, observándose un claro retraso en el crecimiento, necrosis y eventual muerte en etapas tempranas del desarrollo en las plantas homocigotas, mientras que incluso algunas plantas heterocigotas presentaron un fenotipo de retraso en el crecimiento, donde en algunos casos no se pudo obtener progenie (figuras 6 y 7). Por lo anterior se decidió cuantificar tanto AtTCTP2 y AtTCTPI en forma de transcritos, mediante 5 PCR en tiempo real, para determinar si los fenotipos que observábamos en estas plantas heterocigotas estaban relacionados únicamente con la disminución de RNAm de AtTCTP2, y no con la de merma en el expresión de AtTCTPI. En la figura 8 se muestran los resultados de la cuantificación de ambos transcritos en las mismas muestras, observándose una clara disminución de los niveles de RNAm de AtTCTP2, mientras que ío los niveles de AtTCTPI fueron incluso mayores, con lo cual se puede concluir que los fenotipos observados son muestra clara del papel tan importante que juega AtTCTP2 en el control del desarrollo en plantas, esto además es una evidencia contundente de que este gen no puede ser considerado un pseudogen. Además se realizaron mediciones de áreas de roseta (figura 9), así como de la capacidad fotosintetica (figura 10) de cada una de las 15 líneas analizadas, en donde se observa que el área en las líneas mutantes es inferior respecto a plantas silvestres, y que además la capacidad de fijación de CO2 en las primeras no se ve tan afectado por esta disminución en el tamaño.

Ejemplo 2. Obtención de construcciones AtTCTPI y AtTCTP2 para sobreexpresión y 20 para evaluación de expresión endógena.

Se inició con la extracción de DNA genómico y RNA total de plantas silvestres de Arabidopsis, las cuales se cultivaron y a las seis semanas de edad se extrajo DNA genómico de hojas y RNA total de tallo mediante crio-fractura con los sistemas comerciales DNAeasy y RNAeasy (QIAGEN, Hilen, Alemania); se determinó su integridad 25 mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, mientras que en las muestras de RNA se realizó la separación electroforética en gel de agarosa 1.2% en condiciones desnaturalizantes. Se analizó la imagen y se determinó la concentración y pureza de las muestras de DNA genómico RNA total mediante espectrofotometría.

A partir del DNA genómico se amplificaron tanto el locus genómico como la región 30 promotora de y el fragmento promotor-ORF de AtTCTP2. Para amplificar el marco abierto de lectura (ORF, por sus siglas en inglés) de AtTCTP2 y AtTCTPI se sintetizó cDNA a partir del RNA total extraído de tejido perteneciente a tallo de plantas silvestres de Arabidopsis empleando la enzima reverso transcriptasa SuperScript™ III (Invitrogen), siguiendo las especificaciones del proveedor. Para el caso del ORF de AtTCTP2 se trató al RNA total de manera similar a los RNAs de origen viral (figura 14), para obtener el cDNA, del cual finalmente se amplificó el ORF con oligonucleótidos específicos (figura 11) utilizando la DNA polimerasa TaKaRa ExHS (Takara Bio Inc.), siguiendo las especificaciones del proveedor.

Los productos de las reacciones de amplificación se separaron en geles de agarosa al 1% con bromuro de etidio, posteriormente los geles fueron visualizados con luz ultravioleta. Se capturó y analizó cada imagen con el sistema de documentación electroforetica Gel Logic 2000.

Procedimos a la clonación de los fragmentos de interés, donde primero fue necesaria la purificación de los productos del PCR, lo que se realizó utilizando el sistema comercial QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del proveedor, separando el fragmento del gel de agarosa que contenía la banda deseada y procesándolo para eliminar la agarosa utilizando isopropanol, cromatografía, y lavados del DNA obtenido mediante ciclos de centrifugación y elución.

Los productos de PCR purificados fueron ligados al vector de clonación comercial pCR8GWTOPO (Invitrogen) atendiendo las indicaciones del proveedor. Posteriormente, se utilizó el producto de la reacción para transformar células competentes de Escheríchia coli (DH5a o Matchl) previamente cultivadas y preparadas, para lo cual se sometieron a choque térmico en presencia del producto de ligación, incubándolas a 42°C durante 53 seg. y trasladándolas al hielo inmediatamente después, donde se les adicionó medio SOC y se incubaron durante 1-2 horas a 37°C en agitación constante. Después, la suspensión fue distribuida y esparcida uniformemente en medio LB sólido suplementado con espectinomicina (100 mg/mL). Las cajas fueron incubadas a 37°C toda la noche para posteriormente seleccionar las colonias candidatas a contener plásmidos recombinantes [14].

Procedimos a extraer por lisis alcalina el DNA plasmídico de E. coli de las colonias candidatas positivas después de ser cultivadas, donde el DNA presente en los productos de esta lisis celular fue precipitado y lavado con etanol absoluto y etanol al 70%, la pastilla de DNA fue lavada con 250 mL de etanol al 70% en dos ocasiones. La pastilla se secó a temperatura ambiente y el material fue resuspendido en 32 pL de agua bidestilada estéril, agregándose RNAsa A e incubándose a 37°C por 1h. El material se almacenó a -20°C hasta su uso. También se midió la concentración de cada uno de los plásmidos por espectrofotometría en Nanodrop (ND-1000). Posteriormente se procedió a determinar la presencia del inserto mediante caracterización con enzimas de restricción y mediante reacciones de PCR con las condiciones estandarizadas anteriormente. Los plásmidos seleccionados fueron sometidos a reacciones de secuenciación en un secuenciador de capilar Genetic Analyzer ABI Prism (modelo 3100) y las secuencias obtenidas fueron editadas mediante el programa Gene Doc v2.7. Las secuencias se compararon por medio de los programas BLASTN y BLASTP con las bases de datos del banco de genes disponibles en Centro Nacional para la Información Bioteenológica (NCBI, por sus siglas en inglés).

Una vez confirmada la presencia de los insertos de interés y su correcta orientación, se procedió a la sub-clonación en vectores de expresión en planta, para lo cual se realizó la reacción de recombinación de los plásmidos linealizados mencionados anteriormente en los vectores de expresión en planta pB7GWFS7 (análisis de la región promotora), pB7FWG2,0 (para sobreexpresión) y pB7FWG,0 (para expresión endógena de la línea reportera) (figura 12).

Para ello se realizó una mezcla de reacción que contenía 1 mL de vector, 1 pL de plásmido lineal, 0.5 pL de enzima LR Clonasa (Invitrogen) y 2.5 pL de agua bidestilada estéril, la cual se incubó a 22°C toda la noche. Posteriormente, se realizó la transformación de células competentes de E. coli DH5a utilizando la mezcla de reacción anterior mediante choque térmico, sembrándose en medio selectivo con espectinomicina, de donde surgieron clonas candidatas para la extracción de DNA plasmídico. Estas clonas fueron sometidas a una comprobación por digestión y/o por PCR punto final utilizando los oligonucleótidos específicos descritos en la figura 11.

Ejemplo 3. Obtención de plantas transgénicas y comprobación.

A partir de los plásmidos recombinantes obtenidos anteriormente (purificados de ser necesario) se realizó la transformación de células electrocompetentes de Agrobacterium tumefaciens C58C1 y/o de Agrobacterium rhizogenes por electroporación. Para esto se agregó 1-2 pL (1-3 pg) de plásmido al vial con las células competentes (mantenidas a -80°C antes de la transformación), se tomó todo el volumen del vial y se trasladó hacia la celda de electroporación, se le aplicó un choque eléctrico (1800 mV) e inmediatamente se agregó medio SOC para trasladar toda esta mezcla a un tubo Eppendorf estéril e inocularse en placas con medio sólido YEB con espectinomicina (100 mg/mL), las que se incubaron para así obtener clonas candidatas de Agrobacterium tumefaciens conteniendo la construcción deseada. Como último paso, se realizó la comprobación de la presencia de cada uno de los insertos en las clonas candidatas mediante PCR, utilizando los oligonucleótidos específicos de la figura 11 , para cada de una de las construcciones.

La obtención de plantas transgénicas de Arabidopsis se llevó a cabo mediante inmersión floral por el método modificado denominado “Floral Dip” o “Inmersión Floral” [15] Este método aprovecha la circunstancia que A. tumefaciens puede infectar óvulos, y por tanto, transferirles T-DNA. Por otra parte, el amortiguador contiene sacarosa como fuente de carbono para Agrobacterium, y citocinas, para inducir proliferación de células vegetales.

Se cultivó A. tumefaciens en cajas de medio sólido LB con espectinomicina, que luego se colocaron en el buffer especial para inmersión floral, sumergiendo cada planta en esta mezcla durante 40-60 segundos (procurando embeber bien las flores jóvenes) y después se colocaron horizontalmente en charolas amplias (desinfectadas) cubiertas con paños de papel humedecidos. Estas últimas fueron mantenidas en reposo en cámara de crecimiento (20°C aprox.) durante 2 días. Transcurrido este tiempo las plantas fueron trasladadas a un invernadero, regándolas con solución nutritiva fertilizante (Miracle-Gro®).

La comprobación de la presencia de GFP (720 pb aproximadamente) en cada una de las líneas transformantes se realizó por PCR punto final. Para esto se extrajo DNA genómico de varias plantas pertenecientes a las líneas transformantes mediante criofractura con nitrógeno líquido y este fue usado como molde para amplificar a GFP usando oligonucleótidos específicos para este transgen (SEQ.ID. No. 20 y 21).

Ejemplo 4. Cuantificación del transcrito (expresión a nivel tejido y etapa de desarrollo).

Para poder cuantificar el transcrito de AÍTCTP2 y AtTCTPI en plantas silvestres de Arabidopsis mediante q-RT-PCR se diseñaron oligonucleótidos que se alinean en las regiones 5’UTR y 3’UTR de ambos genes, pero que además abarcan los primeras bases del marco abierto de lectura de este.

Se realizó la extracción de RNA total a partir de diversos tejidos representativos de la planta (raíz, hoja de roseta, tallo, hoja caulinar, flor y silicua) en plantas silvestre de Arabidopsis a diferentes tiempos (tejido vegetativo a los 30 días y el resto a los 60 días), para poder así dar un seguimiento de la expresión de este gen mediante la cuantifícación de su transcrito por q-RT PCR en tiempo real.

La cuantifícación de AtTCTP2 por q-RT PCR tiempo real se realizó en el equipo Corbett Research RG-3000. Primero se estandarizaron las concentraciones del RNA total extraído, para dejarlos a una concentración entre 100 y 150 ng/pL, para posteriormente realizar las mezclas de reacción y llevar a cabo la corrida de q-RT PCR tiempo real, la cual se llevó a cabo por triplicado para cada muestra (raíz, hoja de roseta, tallo, hoja caulinar, flor y silicua), usando como control a 18S y Ubiquitina. Las condiciones de la corrida se muestran en la figura 13.

Como muestran los resultados, los niveles de expresión de AtTCTP2 fueron hasta 20 y 30 veces superiores en el caso de hoja caulinar y tallo respecto a los niveles de transcrito encontrados en hoja de roseta (control). En todos los casos se observó mayor expresión respecto al control, con excepción del tejido de silicua, en donde se presentaron niveles de expresión inferiores a los vistos en hoja de roseta. Es interesante que para el caso de AtTCTPI, los niveles de expresión fueron similares en todos los tejidos, lo cual concuerda con lo reportado por Berkowitz [6].

Debido a que los niveles de expresión de AtTCTP2 son 3 órdenes de magnitud inferiores que AtTCTPI y en algunos casos hasta 4 órdenes de magnitud inferiores que AtTCTPI, resulta interesante que al interrumpir el gen (incluso parcialmente) se observaron fenotipos tan marcados (figura 4). Se infirió que la baja detección de los transcritos de AtTCTP2 es debida a la probable alta estructura secundaria de su RNAm, por lo cual se realizó nuevamente el ensayo de cuantifícación de AP?TR2 y AtTCTPI comparando los niveles de expresión relativa de muestras de RNA total sometidas a un tratamiento termico (72°C/10min) previo al ensayo, respecto a muestras sin tratamiento previo alguno. Los resultados mostraron que los niveles de expresión en las muestras tratadas (hoja de roseta y raíz) aumentaron 30 y 80 veces (respectivamente), mientras que para AtTCTPI aumentaron 3 veces. Estos resultados aunados a las estructuras predictivas de ambos transcritos permiten inferir que la estructura del RNAm de AtTCTP2 es más compleja que la de AtTCTPI, y quizás ésta alta estructura secundaria es la que impide que el transcrito de AtTCTP2 sea detectado, pero no significa que no se exprese normalmente en la planta. Lo anterior, junto con los fenotipos encontrados en las mutantes de T-DNA (figuras 4, 6, 7) indica que este gen podría tener una regulación a nivel transcripcional, pero es de suma importancia para el correcto desarrollo en Arabidopsis, y en general en plantas.

Ejemplo 5. Análisis de la expresión del gen AtTCTP2 a nivel tisular.

La construcción para realizar el análisis de los sitios de expresión de AtTCTP2 fue realizada tal como se menciona en el ejemplo 2, mientras que una vez que se contó con esta, se procedió a obtener plantas transgénicas de acuerdo al ejemplo 3. Se analizaron las primeras y segundas generaciones de al menos 3 eventos de transformación distintos, observándose los mismos patrones en todos los casos.

Para en análisis histoquímico, los tejidos fueron sumergidos en la solución de reacción (buffer de fosfatos 1 M, EDTA 0.25 M, ferrocianuro de potasio 5 mM, ferricianuro de potasio 5 mM, tritón 10%, X-Gluc 40 mM, agua destilada) cubriendo completamente el tejido. Después los tejidos fueron infiltrados con vacío durante 30 minutos, envueltos con papel aluminio para cubrirlos de la luz e incubados a 38°C por 24 horas. Transcurrido este tiempo, se realizó un cambio de solución, sustituyendo la anterior por una solución de etanol-ácido acético (3:1) y dejándola actuar por 6 horas. Posteriormente, se cambió esta última solución por una solución de etanol-acetona (3:1) y se dejó actuar toda la noche (12 horas aprox.). Finalmente se dejaron reaccionar en lactofenol y se conservaron en glicerol al 50% en refrigeración para ser observadas en el microscopio estereoscópico.

Para la observación por microscopía multifotónica para averiguar la funcionalidad de la región promotora de AtTCTP2, se sembraron de 4 a 6 semillas en cada una de las 20 macetas, donde cada maceta representaba una línea transgénica distinta (de dos eventos de transformación independientes). Se extrajeron muestras de tejido (hoja y peciolo) semanalmente a partir de la tercera semana después de la germinación, con el fin de observar desde etapas tempranas la expresión de AtTCTP2. El tejido extraído fue sometido a un tratamiento previo con una solución de lavado durante 3 días a 4°C. Posteriormente se realizaron cortes longitudinales y transversales del tejido haciendo el montaje en glicerol entre dos cubreobjetos, donde finalmente estos cortes fueron visualizados en el Microscopio Multifotónico TCS-SP5/MO-TANDEM marca Leica (objetivo 20X: HCxPLAPO l-blue IMM UV 0.7 A.N.), el cual posee un láser Tisaph 200M 2X (resolución: 1024 x 1024 pixeles). Las imágenes resultantes de la microscopía fueron tratadas y analizadas con el Software Leica Las AF.

En la figura 28A, se muestran los sitios de expresión de AtTCTP2 dentro de los diferentes tejidos de la planta. Como se puede observar la expresión en hojas jóvenes se ve 5 caracterizada por la detección de la señal en tricomas y en el tejido vascular (de manera intermitente). Para el caso de raíces, la señal fue encontrada en la raíz principal y en las raíces secundarias, sobre todo en etapas muy tempranas de la formación de estas últimas. Finalmente, se observó una expresión marcada en el meristemo floral, específicamente en la papilla, receptáculo, pedúnculo y óvulos. Además se encontró señal ío clara en la base de silicuas.

La expresión del RNAm de AtTCTP2 indica su posible movimiento a larga distancia a traves del floema principal e interconectante, así mismo, la presencia de señal en óvulos nos permite inferir un posible papel durante la embriogénesis. El patrón de expresión de AtTCTP2 en los diferentes tejidos de la planta (figura 28) y los niveles de expresión de 15 este (figura 25) contrastan con la reportado para AtTCTPI por Berkowitz [6] donde sugieren que los productos de este gen (transcrito y proteína) se encuentran en niveles muy superiores en toda la planta.

Ejemplo 6. Análisis de los sitios de acumulación de la proteína AtTCTP2. 20 Las construcciones de sobreexpresión de la presente invención (figura 29) nos permitieron transformar plantas silvestres de Arabidopsis (ejemplo 3), las cuales fueron seleccionadas con herbicida (en suelo), y analizadas mediante microscopía confocal. Para estos análisis, se tomaron muestras de tejido de diferentes partes de la planta (hoja aérea, hoja de roseta, peciolo, raíz y tallo). Estos tejidos fueron tratados durante 3 días a 4°C con una 25 solución de lavado (para retirar pigmentos) o fueron cortados en fresco; luego se trasladaron a una solución de glicerol en donde se mantuvieron hasta el momento de realizar los cortes en hojas (apical, basal, transversal-medio, longitudinal-vena central), peciolos (longitudinal y transversal), tallos (transversal), y raíces (longitudinal); estos se montaron en glicerol entre cubreobjetos. 30 Las imágenes se tomaron con un microscopio confocal TCS-SPE marca Leica (objetivos 40 X y 60 X: ACS 1.15 IMMAN) y un multifotónico TCS-SP5/MO-TANDEM marca Leica (objetivo 20X: HCxPLAPO l-blue IMM UV 0.7 A.N.), el cual posee un láser Tisaph 200M 2X (resolución: 1024 x 1024 pixeles). Las imágenes resultantes de la microscopía se trataron y analizaron con el Software Leica Las AF.

Se observó el mismo patrón de localización en las construcciones en donde se sobreexpresaron el locus genómico o el marco abierto de lectura de AtTCTP2 usando al promotor constitutivo 35S. Sin embargo, tambien se observó el mismo patrón en la línea reportera (Prom AtTCTP2:: locus AtTCTP2-GFP), el cual fue caracterizado por la acumulación en estomas y mesófilo en hojas, mientras que en raíces se observó en sobre todo a nivel de núcleo en las células de la corteza media. Mientras que para AtTCTPI se encontró señal sobre todo en mesófilo y núcleo en hojas, no presentó acumulación nuclear en raíz. Lo anterior sugiere que probablemente las diferencias a nivel de patrones de acumulación entre AtTCTP2 y AtTCTPI sean un indicio de que existen diferencias funcionales entre los productos de ambos genes. Además el hecho de que los patrones de acumulación de AtTCTP2 fueron similares entre las versiones de sobreexpresión analizadas apunta hacia una regulación a nivel traduccional.

Ejemplo 7. Cinética de crecimiento de callos de tabaco (NT1) transformados por biobalística.

En esta serie de experimentos se buscó identificar si AtTCTP2 es capaz de estimular el crecimiento a nivel de proliferación celular, tal como se ha reportado para AtTCTPI [12]. Para logar lo anterior, como modelo se usaron callos de tabaco de la línea NT1, los cuales son caracterizados por su incapacidad para diferenciarse, por lo que fueron muy útiles para poder determinar la capacidad de inducción de la proliferación celular que tiene AtTCTP2.

Estos callos de tabaco fueron mantenidos en medio MS (Murashige & Skoog) sin reguladores de crecimiento u hormonas, realizándose pases a medio fresco cada 7-10 días, durante un mes antes de ser transformadas. Para llevar a cabo la transformación de estos callos, se prepararon los plásmidos con construcciones conteniendo el marco abierto de lectura de AtTCTP2 y el vector pB7FWG2 vacío (como control negativo), extrayendo DNA plasmídico mediante el Kit comercial QIAgen (siguiendo las instrucciones del proveedor) obteniéndose concentraciones entre 500 - 1000 ng/pL.

Las micro-partículas de tungsteno utilizadas para el bombardeo fueron preparadas siguiendo el protocolo de Tomes [16] modificado por Cabrera [17]; a grandes rasgos se prepararon de la siguiente manera: se pesaron 15 mg de partículas de tungsteno M10 (0.7 mieras), las que fueron lavadas con 500 mL de etanol absoluto frío y sonicadas para dispersarlas homogéneamente; se centrifugaron 1min/3000 rpm y se removió el sobrenadante; se adicionó 1 mL de agua fría grado biología molecular, para resuspenderse usando vórtex; posteriormente se centrifugaron de 15-30 seg. a 5000 rpm, se removió el sobrenadante de nuevo y se resuspendieron en 500 pL de agua fría grado biología molecular; finalmente se sonicaron nuevamente para homogenizarlas y se alicuotaron (50 pL) para ser almacenadas a -20°C, antes de ser usadas.

El recubrimiento de los micro-proyectiles con el DNA plasmídico se realizó según Cabrera [17] de la siguiente manera: se tomó una alícuota (50 pL) de las partículas preparadas y se le adicionaron 5 pL del DNA plasmídico (0.5-1 mg/ pL); después de una suave homogenización se agregaron 50 pL de cloruro de calcio 2.5 M y se mezclaron gentilmente; se agregaron 20 pL de espermidina 0.1 M y se sonicaron para homogenizarlas; se centrifugaron 15 seg./5000 rpm y se retiró el sobrenadante; se realizó un lavado con 600 pL de etanol absoluto frío, se sonicaron, y se volvieron a centrifugar 15 seg./5000 rpm; se retiró el sobrenadante y se agregaron 75 pL de etanol absoluto frío; finalmente en cada membrana de Kapton (macroacarreador) se adicionaron 10 pL de la mezcla en el centro y se dejó evaporar el etanol.

Una vez preparados los proyectiles y teniendo dispersados los callos, se procedió al bombardeo de acuerdo al protocolo siguiente: se definió el área de bombardeo (3.5 cm aprox.) y se transfirieron los callos anteriormente disgregados (4 mm aprox.) al área marcada dentro de la caja con medio osmótico; se esterilizaron todas las piezas del equipo de bombardeo en isopropanol, así como la cámara de bombardeo (con cloro y alcohol); se utilizaron discos de ruptura de 1100 psi y se realizaron los bombardeos; los callos fueron mantenidos en medio osmótico de 24 a 36 hrs. y después transferidos a medio de selección (con glufosinato de amonio) para ser mantenidos en obscuridad a 26°C durante 7 a 10 días; después se realizó una serie de pases a medio de selección fresco para aislar aquellos callos transformados.

Para la cinética de crecimiento se decidió seguir el peso seco de los callos transformados con las construcciones control (vector vacío) y de sobreexpresión de AtTCTP2. Para esto se disgregaron los callos transformados para tener tamaños y pesos homogéneos (150 mg aprox.) y se colocaron en cajas con medio MS sin agente de selección; se colocaron 10 unidades experimentales por cada caja, con un total de 4 cajas por cada construcción, una por cada punto de la cinética (a los días 1, 7, 14 y 21); durante cada punto de la cinética se determinó el peso seco de cada uno de los callos (unidades experimentales), hasta el final de la cinética. Como se puede observar en los resultados presentados en la figura 32, se observó una inducción de la acumulación de peso seco de alrededor del 30% respecto al control, pero solo hacia la tercer semana (día 21) de la cinética, indicando una posible función de inducción de la proliferación celular, aunque a niveles inferiores a lo que lo hace AtTCTPI [12].

Ejemplo 8. Ensayo de regeneración (diferenciación celular).

Tomando en cuenta que se había determinado que AtTCTP2 no es un pseudogen, al haber podido clonar su ORF, analizar sus sitios y niveles de expresión, además de los sitios de acumulación de la proteína, y que se sugería un papel en el control del crecimiento (proliferación celular), se decidió llevar a cabo un ensayo que permitiera determinar el papel de AtTCTP2 en la regulación de la diferenciación celular. Para analizar lo anterior se decidieron hacer ensayos de regeneración usando como modelo explantes de Nicotiana tabaccum, transformados con diferentes construcciones de sobreexpresión tanto de AtTCTP2 como de AtTCTPI usando como vehículo de transformación a Agrobacteríum rhizogenes.

Para la transformación de hojas de N. tabacum con construcciones en A. rhizogenes, se crecieron plantas de N. tabacum en una mezcla de suelo, turba y agrolita (2:2:1), regadas cada 2 días con solución nutritiva. A partir de plantas de 1-2 meses de edad, fueron sustraídas las hojas (2-4 cm de diámetro) notablemente vigorosas (abarcando el peciolo), las cuales fueron desinfectadas con cloro comercial al 10%/20-25 min y lavadas (3-4 veces) con agua estéril, para dejarlas listas para la transformación. Previamente se preparó medio Murashige & Skoog (MS) utilizando la mezcla comercial GibcoMR sin suplementación con hormonas (composición por litro de medio: 4.49 gr. sales de Gibco, 20 gr. de sacarosa, 2.5 gr GeIRite, pH 5.8), y fue gelificado en condiciones de esterilidad en envases plásticos (estériles). Al mismo tiempo se crecieron (a 27°C durante 36 horas) las cepas de A. rhizogenes en medio liquido LB (suplementado con espectinomicina) conteniendo las construcciones de sobreexpresión de AtTCTP2 (locus y ORF) y de AtTCTPI (ORF) con y sin GFP en fase, y además el control (vector vacío y/o cepa de A. rhizogenes 599 sola).

La inoculación con las suspensiones de A. rhizogenes se realizó (en condiciones de esterilidad) con la ayuda de jeringas para insulina, procurando hacer las punciones en tres sitios sobre la vena central de las hojas, para finalmente colocar las hojas inoculadas con el peciolo incrustado en el medio MS para que la hoja pudiera seguir absorbiendo nutrientes. Los envases fueron sellados y colocados en estantes con iluminación constante y/o periodos de días largos (16:8 de luz:obscuridad), para finalmente llevar a cabo un seguimiento de la aparición de nuevo tejido cada 2 días durante un mínimo de 30 días y un máximo de 90 días.

En la figura 33 se muestra que AtTCTP2 es capaz de inducir la regeneración de plantas con porcentajes altos a comparación de AtTCTPI, la cual se mantiene a niveles básales, muy similares a los del control. En las figuras 34 y 35 además se observan los fenotipos de las plantas regeneradas a diferentes etapas de desarrollo y con diferentes construcciones de sobreexpresión de AtTCTP2 conforme a la presente invención, además de la verificación de la presencia del transgen, en algunas de ellas por PCR punto final mediante el uso de oligonucleótidos específicos para GFP (SEQ.ID. No. 20 y 21) y 35S (SEQ.ID. No.22 y 23). Estos resultados indican que efectivamente AtTCTP2 posee ciertas funciones específicas en las que AtTCTPI no está involucrada.

Ejemplo 9. Análisis de la progenie de plantas regeneradas de tabaco.

Para caracterizar la progenie de las plantas regeneradas con AtTCTP2 en A. rhizogenes se decidió utilizar como modelos de estudio tanto las hojas de las plantas regeneradas como la primera generación producto de las plantas regeneradas.

Para el primer caso, se seleccionaron hojas de algunas de las plantas regeneradas (a los 21 días aproximadamente), se esterilizaron con una solución de cloro al 10% por 15 min, seguido de 3-4 lavados con agua estéril, después se colocaron estas hojas en medio sólido MS que no contenía ninguna hormona o regulador de crecimiento vegetal, para finalmente incubarse en condiciones de luz continua o de día largo en cámaras de crecimiento con condiciones controladas (26°C/25% humedad) durante al menos 30 días (y hasta 60 días). Cabe mencionar que como control de utilizaron hojas provenientes de plantas silvestres de tabaco.

Para el segundo caso, se obtuvo semilla a partir de algunas plantas regeneradas con AtTCTP2. Esta semilla se separó por líneas y construcciones usadas y fue primeramente secada (a 36°C/3 días) para posteriormente ser sincronizada a 4°C durante 3 días. Las semillas fueron sembradas en una mezcla de suelo esteril, turba y agrolita (2:2:1), germinadas en cámara de crecimiento para posteriormente ser trasladadas a invernadero, en donde fueron mantenidas en condiciones semicontroladas durante al menos 100 días. Se realizaron análisis de presencia/ausencia del transgen mediante detección por PCR usando como molde DNA genómico, el cual fue obtenido a partir de las hojas usadas como molde en el primer ensayo y en el segundo a partir de un pool de 3 hojas de cada planta de la primera generación (F1) de una línea regenerada con AP?TR2 locus genómico-GFP.

En la figura 36 se muestra que solo en las hojas que contenían al transgen se observa la formación de nuevo tejido, indicando que AtTCTP2 podría estar influenciando la embriogénesis somática y/o organogénesis. Además en la figura 37 se muestra al analizar la progenie, que las plantas de la primera generación parecen inducir el desarrollo en etapas tempranas, pero este se ve equiparado en etapas posteriores, tal como lo han reportado otros autores para TCTP de otros organismos vegetales como tabaco. Es importante mencionar que el porcentaje de plantas regeneradas transgénicas esta en alrededor del 40%, lo cual podría ser útil para regeneración de plantas recalcitrantes o de difícil tratamiento que necesiten ser comercializadas como silvestres, pero además para la concepción de plantas transgénicas que sean capaces de “autoregenerarse” a través de explantes vegetativos, o para la obtención plantas difíciles de transformar conteniendo otros transgenes de interés, posibilitando su estudio y caracterización.

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Claims (8)

Reivindicaciones

1. Una planta, un tejido ó una célula transgénicos, donde el transgene es un ácido nucleico que codifica para la proteína tumoral 2 traduccionalmente controlada (TCTP2).

2. Una planta, un tejido ó una célula transgénicos, donde el transgene es un ácido nucleico que codifica para la proteína tumoral 2 traduccionalmente controlada de Arabidopsis thaliana (AtTCTP2) que tiene la SEQ. ID. No.28.

3. La planta, tejido o célula transgénica de la reivindicación 1 caracterizada además porque la secuencia de ácido nucleico que codifica para la AtTCTP2 está incluida como ORF, unida operacionalmente a un promotor homólogo ó heterólogo para inducir su sobre expresión o está incluida como locus genómico.

4. La planta, tejido o célula transgénica de la reivindicación 1 ó 2 caracterizada además porque durante su desarrollo presenta una tasa de diferenciación celular y de organogénesis mayor que la que tiene el tipo silvestre.

5. Un cultivo de plantas transgénicas de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque presenta un aumento en la regeneración de plántulas.

6. Un método para obtener plantas transgénicas caracterizadas por tener una capacidad de diferenciación mayor al tipo silvestre o a la planta correspondiente no transgénica y una capacidad de regeneración de plántulas 55% mayor a la capacidad que tiene el tipo silvestre o a la planta correspondiente no transgénica, que comprende: a) Introducir en dicha planta un DNA que codifica la proteína tumoral 2 traduccionalmente controlada (AtTCTP2) que tiene la SEQ. ID. No.28. b) Propagar la planta verificando la estabilidad de la expresión del transgene.

7. Un método para obtener plantas transgénicas caracterizadas por tener una capacidad de diferenciación mayor al tipo silvestre o a la planta correspondiente no transgénica y una capacidad de regeneración de plántulas 55% mayor a la capacidad que tiene el tipo silvestre o a la planta correspondiente no transgénica, que comprende: a) Transformar dicha planta con un vector de expresión que comprende un DNA que codifica a la proteína tumoral 2 traduccionalmente controlada (AtTCTP2) que tiene la SEQ. ID. No.2

8. b) Propagar la planta verificando la estabilidad de la expresión del transgene.