CN111351933B

CN111351933B - 一种牛筋草pfk蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111351933B
Application number: CN202010202198.7A
Authority: CN
Inventors: 陈景超; 李香菊; 张朝贤; 崔海兰; 魏守辉; 黄红娟
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2040-03-20
Also published as: CN111351933A

Abstract

本发明公开了一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用。本发明提供了所述多克隆抗体在鉴定牛筋草对除草剂草甘膦抗药性上的应用；本应用具有检测周期短、灵敏度高、特异性强的优点，在牛筋草对草甘膦靶标抗性的检测和研究中具有重要的应用前景。本发明首次揭示了牛筋草PFK蛋白与除草剂草甘膦抗性之间的关系，可以通过检测PFK蛋白的含量来鉴定牛筋草对除草剂草甘膦是否产生靶标扩增抗性。本方法可快速鉴定抗性，并为科学选药防除牛筋草缓解牛筋草对草甘膦的抗性产生与蔓延具有指导意义。

Description

一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体，以及该多克隆抗体的制备方法和用途。

背景技术

牛筋草是世界十大恶性杂草之一，属一年生禾本科穇属植物，分布于全世界温带和热带地区，在我国南北各省均有分布，多生于果园、草坪、菜地等多种作物田。牛筋草的根系发达，繁殖能力强，成熟的牛筋草单株可产生近14万粒种子。以上特征使得牛筋草对农作物造成了严重的经济损失。

草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，能够有效的防除牛筋草等一年生及多年生杂草。草甘膦在我国有40多年的应用历史，主要应用于非耕地、农作物保护性喷雾等。在牛筋草危害严重的地区，草甘膦是常用的防除药剂。长时间的应用使得我国的牛筋草种群对草甘膦产生了较为严重的抗药性。而在生产中由于农民对杂草抗药性的认识上的不足，盲目增大草甘膦的用药剂量，增加了成本。因此，及时鉴定出抗草甘膦的牛筋草，采取措施及时对其进行防除，对于农民收入和国家粮食安全都有重要的意义。

草甘膦作用于植物的莽草酸代谢途径，其靶标酶是5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。草甘膦是一种竞争性抑制剂，他与EPSPS的催化底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)空间结构相似，抢占PEP与靶标酶EPSPS的结合位点，抑制该酶的催化功能，导致植物所必需的三种氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)合成受阻而死亡。磷酸果糖激酶(PFK)是能量代谢途径糖酵解途径的关键酶与限速酶。磷酸果糖激酶(PFK)的活性直接影响下游产物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的含量。杂草对草甘膦的靶标抗性机制分为靶标突变和靶标酶过量表达两种。目前，检测杂草对草甘膦的靶标抗性机制主要通过检测靶标基因EPSPS的突变和该酶的表达量。检测EPSPS的突变位点一般需要精密的测序仪器，成本较高。EPSPS酶活的检测则需要大量的试剂，过程繁琐，且酶的提取等过程对环境及操作要求较高。因此需要提供一种成本低、操作简便且快速准确检测牛筋草对草甘膦抗药性的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速准确检测牛筋草对草甘膦抗药性的方法。本发明的另一目的是提供一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供牛筋草PFK蛋白在评价牛筋草对草甘膦抗药性中的应用。

本发明进而提供了检测牛筋草PFK蛋白的试剂或试剂盒在鉴别对草甘膦具有抗性的牛筋草中的应用。

进一步地，本发明提供了一种用于诱导牛筋草PFK蛋白多克隆抗体的抗原多肽，其氨基酸序列为以下：

(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或

(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而形成的具有同等功能的序列。

上述抗原多肽的编码基因如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了含有上述抗原多肽编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、质粒、表达载体或宿主菌。优选地，所述表达载体是pGEX-4T-1。

本发明提供了上述抗原多肽或生物材料在制备检测牛筋草PFK蛋白或其表达量的试剂或试剂盒中的应用。优选所述的试剂为抗体。

本发明提供一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体。该多克隆抗体由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的抗原多肽诱导而成，特异性好、效价高。

本发明提供了上述牛筋草PFK蛋白多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建含有所述核苷酸序列(SEQ ID NO.2)的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白抗原；

(2)将所述重组蛋白抗原免疫动物，经血清分离纯化获得牛筋草PFK多克隆抗体。

含有所述牛筋草PFK蛋白多克隆抗体的试剂盒属于本发明的保护范围。

本发明的用于检测PFK蛋白的试剂盒包括但不限于ELISA试剂盒、酶免疫层析检测试剂盒、化学发光检测试剂盒以及免疫荧光检测试剂盒。

在本发明的一个具体的实施方式中，为ELISA检测试剂盒，该试剂盒中可以包括样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照以及阴性对照。阳性对照可以是原核或真核表达的纯化的PFK蛋白；阴性对照可以是牛筋草的其他蛋白。

用于检测牛筋草PFK蛋白的ELISA检测试剂盒的制备方法可以包括以下步骤：

(1)利用本发明所述的PFK蛋白的多克隆抗体，将其在酶标板上进行包被。

(2)配制样品稀释液、洗涤液、显色液A液、显色液B液、终止液，制备阳性对照以及阴性对照；

(3)组装成ELISA检测试剂盒。

优选的，在本发明的所述ELISA检测试剂盒的制备方法中，所述步骤(2)中包被时所用的包被液可以为碳酸盐缓冲液，优选为pH7.3的碳酸盐缓冲液。

本发明提供了所述牛筋草PFK蛋白多克隆抗体或所述的试剂盒在检测具有草甘膦抗性的牛筋草中的应用。

具体地，所述的应用包括检测PFK蛋白在植株中的含量来判断不同牛筋草材料对除草剂草甘膦的抗性。

牛筋草体内EPSPS蛋白过量表达会引起其对除草剂草甘膦产生抗药性。要科学的防治抗草甘膦的牛筋草，首先需要根据其机制检测抗性是否存在。现有技术的方法是检测EPSPS的表达量，且现有技术没有发现PFK与EPSPS之间存在表达或酶含量的定量关系。本领域公知，不同的抗性基因在抗性植株中是相互独立的，即：一种或几种抗性基因可能同时或单独存在于杂草中，都能引起抗性，但是抗性基因之间没有关联。而本发明研究发现，发生EPSPS过量表达的牛筋草，PFK蛋白也存在过量表达现象，且与EPSPS蛋白的含量成正相关线性关系。利用蛋白质免疫印迹分析的方法检测磷酸果糖激酶(PFK)的活性，可以快速检测牛筋草因靶标过量表达而对草甘膦产生的抗药性。但是有关于牛筋草磷酸果糖激酶(PFK)的抗体却未见报道。本发明根据PFK与EPSPS的线性关系，通过检测PFK蛋白的含量判断抗性是否产生，检测结果准确，灵敏度高，特异性好，操作方便，节省成本，从而为研究该蛋白的生物学功能以及检测牛筋草对草甘膦抗药性的产生提供有力工具。

附图说明

图1为抗草甘膦牛筋草中EPSPS与PFK酶活绝对值比值。

图2为目的DNA的PCR扩增电泳图谱结果。

图3为原核表达载体菌体PCR检测电泳图。

图4为重组蛋白SDS-PAGE电泳图；其中1为0.4mg/mL BSA；2为Marker；3为上清；4为流穿；5为纯化样2倍稀释；6为纯化样5倍稀释。

图5为重组蛋白纯化后SDS-PAGE电泳图；其中，1为蛋白Marker；2为稀释5倍的纯化蛋白；3为稀释10倍的纯化蛋白。

图6为PFK抗原Western检测图片。

图7为本发明PFK蛋白多克隆抗体灵敏度检测。

图8为本发明PFK蛋白多克隆抗体检测抗草甘膦牛筋草植株与敏感牛筋草植株蛋白表达电泳图；其中1-2为敏感牛筋草植株；3-7为抗性牛筋草植株。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细的说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

以下实施例中所使用的仪器和试剂均可以通过购买市售产品的方式获得。

实施例1发现PFK蛋白与EPSPS蛋白的含量成正相关线性关系

选取成熟饱满一致抗性种群牛筋草种子，播种到盛有土壤表层土与有机质(3∶1)混合土壤的花盆，置于温室培养至5-6叶期(每盆保留牛筋草一株)。选取20株抗性植株，每株剪取叶片0.2液氮速冻之后保存于-80℃g，用于检测EPSPS与PFK酶活。

磷酸果糖激酶(PFK)活性的检测利用试剂盒(MAK093)(Sigma-Aldrich)采用比色皿法测定，按照说明书的步骤取牛筋草叶片组织0.1g冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清30μL，与反应试剂在1mL石英比色皿中催化10min，340nm下检测10min吸光值变化。EPSPS的酶活利用试剂盒EnzChek Phosphate Assay Kit(E-6646)(Life Science Research)进行检测。同样取牛筋草叶片组织0.1g，提取叶片中的总蛋白Minute^TM(InventBiotechnologies)，进一步按照说明书步骤，在360nm条件下检测试剂与EPSPS反应时释放出的无机磷含量间接检测酶活。最后比较EPSPS与PFK酶活数值在不同植株之间的关系，结果显示，不同植株之间EPSPS与PFK酶活的比值都在1.4左右(图1)。

实施例2牛筋草PFK基因的克隆和原核表达载体的构建

(1)牛筋草PFK基因冻干质粒的制备。首先，对牛筋草PFK基因序列(具体核苷酸序列见SEQ ID NO.5)进行密码子优化分析，未发现影响后续反应的密码子。委托北京擎科新业生物科技有限公司，利用标准载体pUC57人工合成牛筋草PFK基因(SEQ ID NO.5)，得到PFK基因冻干质粒。

(2)利用CFSSP蛋白二级结构在线分析工具、TopPred 1.10蛋白疏水性在线分析工具和Parker Antigenicity Plot蛋白免疫原性在线分析工具对牛筋草PFK的氨基酸序列进行分析。选定结构相对松散，不存在大的α-螺旋或β-折叠区，且亲水性和免疫原性极强的一段区域，设计引物进行克隆。

所设计的引物如下：

PFK-F：5’-ATGGCGCAGCCGCCGGCATGGCGCAGCCGCCGGC-3’(SEQ ID NO:3)，

PFK-R：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATCTCATCTGACTCAAAATAGACCCTT-3’(SEQ IDNO:4)；

引物由华大基因公司合成。以步骤(1)所得的质粒为模板，以上游引物F(SEQ IDNO.3)和下游引物R(SEQ ID NO.4)为引物进行PCR扩增。其中PCR反应体系为(50μL):10×ExTaq Buffer 5μL、2.5mmol/L的dNTP4μL、10μmol/L上游引物I1μL、10μmol/L下游引物I1μL、ExTaq酶0.5μL、模板DNA 100ng，最后补灭菌水至50μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，33个循环；72℃延伸10min。将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得大小为450bp的PCR扩增产物(见图2)。并将产物回收纯化备用。

(3)原核表达载体与目的基因片段的连接。将载体pGEX-4T-1用EcoR I、Not I进行双酶切，酶切体系为(20μL)：10×H Buffer 2μL、EcoR I 1IU、Not I 1IU、pGEX-4T-1<1μg，最后补灭菌水至20μL；37℃酶切过夜，反应完毕后，用1％琼脂糖凝胶电泳检查酶切结果，用DNA产物回收试剂盒回收载体片段。将步骤(2)回收后的目的基因片段与线性化的pGEX-4T-1载体进行连接，连接反应体系为(20μL)：10×T4 Ligase Buffer 2μL、T4Ligase 1IU、pGEX-4T-1 200ng、目的基因片段1μg，最后补灭菌水至20μL。16℃水浴连接过夜，得连接产物。

(4)转化感受态细胞并进行阳性克隆鉴定。将连接产物加入E.coli Rosetta感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min；随后42℃水浴热激90s，立即冰浴3min；加入900μL不含抗生素LB培养基，37℃振荡培养1h；3000rpm离心2min，弃上清，将沉淀用100μL新鲜LB培养基混匀，涂于含有氨苄青霉霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养14～16h。挑取单菌落，重悬于10μL灭菌ddH₂O中，取1μL进行直接菌液PCR，反应结束后1％琼脂糖凝胶检测。将菌液PCR鉴定为阳性(见图3)的菌株送北京擎科新业生物科技有限公司进行序列测定。测序结果与预期结果(SEQ ID NO.2)一致，表明原核表达载体pGEX-4T-1-PFK构建成功。

实施例3本发明牛筋草PFK重组蛋白的诱导表达与纯化

将含有pGEX-4T-1-PFK的大肠杆菌菌液，接种至LB培养液中，使用恒温摇床，37℃，180rpm培养，待菌体OD值达到0.5，加入终浓度0.8mM的IPTG，并将温度调至37℃，180rpm继续培养4h。取50ml大肠杆菌菌液，放置在离心机，10000rpm，1min，弃上清收集菌体，加入10ml PBS，重新悬浮菌体。将重新悬浮的菌体放置在冰浴中，使用超声破碎仪，进行菌体破碎。将破碎处理后的菌液，放置在离心机中，12000rpm，10min，分别收集上清和沉淀，沉淀使用10ml PBS重新悬浮，分别取两种溶液10μl，加入10μl 2×SDS缓冲液，沸水煮沸10min，离心后，取上清进行SDS-PAGE检测，检测结果显示：上清中含有一条目的蛋白大小的条带(图4)。将上清溶液，经Ni柱纯化后，进行SDS-PAGE检测，结果显示：能够纯化出目标蛋白条带，与预测目的蛋白大小一致(图5)。

实施例4PFK抗原多肽动物免疫与PFK蛋白抗体的分离纯化

以实施例3所得的PFK多肽免疫两只日本大耳白兔。将纯化的重组蛋白0.6mg与完全弗氏佐剂1:1混合，进行第一次免疫，第一次免疫后第12天，将纯化的抗原0.3mg与非完全弗氏佐剂1:1混合，进行第二次免疫，第二次免疫后第14天，将纯化的抗原0.3mg与非完全弗氏佐剂1:1混合，进行第三次免疫，第三次免疫后第14天，将纯化的抗原0.3mg与非完全弗氏佐剂1:1混合，进行第四次免疫进行；待第四次免疫后第12天，将免疫用两只日本大耳白兔采用颈动脉放血，将血液在37℃恒温箱中放置30分钟，再在4℃放置过夜。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4℃，10000g离心10min，收集上清液即为抗血清。用His-MBP重组蛋白抗原偶联NHS活化的琼脂糖柱，亲和纯化抗血清，得到高纯度的牛筋草PFK蛋白多克隆抗体。抗体的浓度可以达到3.5mg/mL。

实施例5本发明牛筋草PFK蛋白多克隆抗体的特异性检测

以实施例4所获得的PFK抗体为一抗，以实施例3所得到的牛筋草PFK重组蛋白为靶标蛋白，并稀释以不同的含量(10ng,5ng,1ng,500pg)以植物通用的内参蛋白ACTIN(购于湖北武汉爱博泰克生物科技有限公司)为非靶标蛋白(10ng,5ng,1ng,500pg)作为对照蛋白。PFK蛋白和ACTIN蛋白分别经SDS凝胶电泳分离后，转至PVDF膜上，用1:1000稀释的抗体为一抗进行Western Blot检测。结果(见图6)制备的多克隆抗体与牛筋草PFK有特异性反应，而与低浓度蛋白反应较弱，说明本发明牛筋草PFK蛋白多克隆抗体具有很高的灵敏性。而制备的多克隆抗体与ACTIN蛋白在不同的浓度下都没有产生反应，说明本发明牛筋草PFK蛋白多克隆抗体特异性强。实施例6本发明牛筋草PFK蛋白ELISA试剂盒敏感性检测

将本发明的PFK蛋白多克隆抗体按照表1不同的稀释倍数稀释，并包被在微孔板中，并设置阴性对照。

表1

每个孔中加入实施例2所得到的牛筋草PFK重组蛋白为靶标蛋白125ng。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；用封板膜封板后置37℃温育30分钟；将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；再次温育洗涤之后每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；每孔加终止液50μl，终止反应；以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。根据吸光值以及酶标板的微孔的液体颜色(图7)可以得出，本发明的牛筋草PFK抗体在稀释512000倍之后仍然能检测到抗原，本发明的牛筋草PFK抗体灵敏性高。

实施例7利用本发明牛筋草PFK蛋白多克隆抗体鉴定抗草甘膦的牛筋草植株

按照如下方法进行。选取对草甘膦具有抗药性的牛筋草植株以及对草甘膦敏感的牛筋草植株为实验材料，使用康为世纪公司的植物蛋白质提取试剂盒(货号：CW0885B)，分别提取总蛋白。具体步骤为：选取牛筋草叶片组织大约100mg，放置在研钵中，加入抽提试剂0.5ml，进行匀浆处理；匀浆后冰上孵育20分钟后，利用低温高速冷冻离心机在4℃条件下12000rp m离心20分钟；收集上清中的可溶性蛋白，并经BCA蛋白定量分析试剂盒(北京赛诺博生物技术中心)进行蛋白定量，最后将可溶性蛋白放置在4℃，待下一步实验。提取蛋白质经SDS-PAGE电泳后，经半干转膜仪，转移至硝酸纤维素膜上，以5％的脱脂奶粉(TBST缓冲液溶解)在4℃条件下，封闭2h；加入纯化的多克隆抗体(1:1000)，在4℃条件下，反应12h；加入辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG抗体(1:2000)，在37℃条件下，反应1h；采用化学发光显色，检测结果如图7所示，抗草甘膦牛筋草的杂交条带信号明显高于敏感植株(图8)。

结论：上述实验结果表明，制备的牛筋草PFK蛋白多克隆抗体能够识别牛筋草中的PFK蛋白，能够检测PFK蛋白，而不与植物体内的其他蛋白发生明显作用。利用该多克隆抗体检测PFK蛋白的表达可以能够明显区分对草甘膦产生抗性的牛筋草植株和敏感的牛筋草植株。该多克隆抗体，可以作为PFK蛋白检测试剂，对PFK蛋白的功能鉴定以及对抗草甘膦牛筋草的检测都具有重要的意义。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用

<130> KHP181115833.1

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Gln Pro Pro Ala Ser Pro Ala Ala Glu Pro Ala Pro Asp Asn

1 5 10 15

Asn Pro Arg Pro Ala Ala Pro Val Pro Ile Thr Val Pro Ser Pro His

20 25 30

Asp Asp Asp His His His Leu Val Asp Arg Arg Asp Thr Pro Arg Gly

35 40 45

Arg Ala Trp Glu Pro Glu Arg Ala Arg Ser His Pro Glu Pro Met Asp

50 55 60

Gly Val Ala Thr Lys Leu Val Thr Gly Glu Ala Gly Tyr Val Leu Glu

65 70 75 80

Asp Val Pro His Val Ser Asp Tyr Leu Pro Asp Leu Pro Thr Tyr Pro

85 90 95

Asn Pro Leu Gln Asp Asn Pro Ala Tyr Ser Val Val Lys Gln Tyr Phe

100 105 110

Val Asp Pro Asp Asp Thr Val Cys Gln Lys Ile Val Val His Lys Gly

115 120 125

Gly Ala Arg Gly Asn His Phe Arg Arg Ala Gly Pro Arg Gln Arg Val

130 135 140

Tyr Phe Glu Ser Asp Glu

145 150

<210> 2

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcgcagc cgccggcgtc ccccgccgct gaacccgccc ccgacaacaa ccccaggccc 60

gccgcgcccg tgcccatcac cgtcccgagc ccgcacgacg acgaccacca ccacctggtt 120

gatcgccgcg acacgccgcg gggccgcgcg tgggagccgg agagggcgcg gagccatccg 180

gagccgatgg acggggtggc caccaagctg gtgaccggcg aggccgggta cgtcctcgag 240

gacgtgccgc acgtgtctga ctacctcccc gatctcccga catacccaaa tccgctgcag 300

gataatccag catactcggt tgtgaagcag tactttgtgg atccagatga tactgtctgc 360

cagaagattg tcgttcacaa gggtggagca agaggaaacc acttccgtcg tgctggacct 420

cgccaaaggg tctattttga gtcagatgag 450

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcgcagc cgccggcatg gcgcagccgc cggc 34

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ataagaatgc ggccgctaaa ctatctcatc tgactcaaaa tagaccctt 49

<210> 5

<211> 1656

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcgcagc cgccggcgtc ccccgccgct gaacccgccc ccgacaacaa ccccaggccc 60

gccgcgcccg tgcccatcac cgtcccgagc ccgcacgacg acgaccacca ccacctggtt 120

gatcgccgcg acacgccgcg gggccgcgcg tgggagccgg agagggcgcg gagccatccg 180

gagccgatgg acggggtggc caccaagctg gtgaccggcg aggccgggta cgtcctcgag 240

gacgtgccgc acgtgtctga ctacctcccc gatctcccga catacccaaa tccgctgcag 300

gataatccag catactcggt tgtgaagcag tactttgtgg atccagatga tactgtctgc 360

cagaagattg tcgttcacaa gggtggagca agaggaaacc acttccgtcg tgctggacct 420

cgccaaaggg tctattttga gtcagatgag gtccatgcat gcattgtcac ctgtggagga 480

ctgtgtcctg gacttaatac tgtgattagg gaaattgtat gtggcttata tgacatgtat 540

ggtgttacca agatacttgg aattcagggt gggtatagag gcttctatgc tcgcaacacc 600

attaacttga ccccaaaatg cgtaaatgac gttcataaaa ggggtgggac tattcttgga 660

tcatcaagag gaggccatga taccacaaag atcgttgaca gcattcaaga tcgtggcata 720

aatcaggtct atgtgattgg tggtgatggt actcaaaggg gcgcaggagt gatttttgaa 780

gaagttagaa gacgtggcct caaagtttct gttgctggca ttccaaagac tattgacaat 840

gacatacctg taattgacaa gtcatttggt ttcgacacag cagttgagga ggctcagcgt 900

gcaataaatg cagcccatgt ggaagctgta agtgctgaga acggtatagg tcttgttaag 960

cttatggggc gacacagtgg tttcattgct cagtatgcta ctctggctag cagggacgtg 1020

gattgttgct tgattccaga gtcgcctttc tatctggagg gtgaaggtgg acttctcaga 1080

tatatagaaa agcgtctgaa ggacaatggt catatggtta ttgttgttgc tgagggtgct 1140

gggcagaaac ttattgctga aaccatgcag tcaattggga aagatgcttc aggaaatgag 1200

ctgcttcttg atgttggtct ttggttatct caaaagataa atgagtattt caagaaaacc 1260

aagatgacaa taaatttgaa gtacatagat ccgacataca tgatacgtgc catccctagc 1320

aacgcttctg ataatgtcta ttgcactctg ttggctcaca gtgtggtcca tggagccatg 1380

gctggatata ctggttttac catcggtcaa gtaaatggtc gccattgcta tatcccattt 1440

tataggatca cggagaagca gaacagagtc tcaataaccg acaggatgtg ggcaaggctg 1500

ctctcctcca ccaaccagcc aagcttcctc tgcaacaaag tcatcgaaga ggcaaagaag 1560

gaacacgaga gagcggccca acttttagat ggctcgcctt cccatcggaa ggttgaggag 1620

aaggttgcat cttccaaatc tagtggcaag aagtga 1656

Claims

1.一种用于诱导牛筋草PFK蛋白多克隆抗体的抗原多肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.含有权利要求1所述的抗原多肽的编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、质粒、表达载体或宿主菌。

3.权利要求1所述的抗原多肽或权利要求2所述的生物材料在制备检测牛筋草PFK蛋白或其表达量的试剂或试剂盒中的应用。

4.一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体的抗原为SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列组成的多肽诱导而成。

5.权利要求4所述的牛筋草PFK蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括：

(1)构建含有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白抗原；

(2)将所述重组蛋白抗原4次免疫动物，首先将重组蛋白抗原与完全弗氏佐剂混合后第1次免疫动物，而后将重组蛋白抗原与非完全弗氏佐剂混合后进行第2-4次免疫，经血清分离纯化获得牛筋草PFK蛋白多克隆抗体。

6.含有权利要求4所述牛筋草PFK蛋白多克隆抗体的试剂盒。