CN108414768A

CN108414768A - 一种抗草甘膦gat转基因农作物的金标检测试纸条

Info

Publication number: CN108414768A
Application number: CN201810119151.7A
Authority: CN
Inventors: 张维; 周正富; 刘奇; 张君; 陆伟; 林敏�
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Longping Biotechnology (Hainan) Co.,Ltd.
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2018-02-06
Publication date: 2018-08-17
Anticipated expiration: 2038-02-06
Also published as: CN108414768B

Abstract

本发明提供了一对杂交瘤细胞株，该对杂交瘤细胞株包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12277；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12278。本发明还提供了由这两株杂交瘤细胞分泌的一对配对单克隆抗体和它们在检测转GAT的转基因农作物中的用途以及一种免疫胶体金试纸条和检测转GAT的转基因农作物的方法。通过上述技术方案，本发明能够通过免疫胶体金试纸条，对GAT蛋白的检测取得1ng/mL的灵敏度，对28种非转基因作物和17种不同来源的各种非GAT转基因作物也不呈现交叉反应，具有较高的灵敏度和特异性。

Description

一种抗草甘膦GAT转基因农作物的金标检测试纸条

技术领域

本公开涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种杂交瘤细胞对、一种单克隆抗体对、该单克隆抗体对在检测转GAT的转基因农作物中的用途以及一种免疫胶体金试纸条和检测转GAT的转基因农作物的方法。

背景技术

草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine,glyphosate)是美国孟山都公司于20世纪70年代开发，目前在全世界广泛使用的一种非选择性、内吸传导型的除草剂。草甘膦的特点是低成本，对大多数植物和微生物都有很高的毒性，但是对人畜低毒、低残留，具有较高的商业价值。但由于草甘膦的光谱灭生性，对农作物也会造成危害，其作用机理是竞争抑制莽草酸合成途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性，该酶是真菌、细菌、藻类、高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中的一个关键酶，是植物和微生物共有。研发对草甘膦抗性的农作物，对农业生产发展和草甘膦工业都有一定的促进作用。EPSPS合成酶不受草甘膦抑制，具有草甘膦抗性，是当今商业化草甘膦耐受农作物最广泛的作用模式。但是，转EPSPS作物并不能对草甘膦起到解毒的效果，而是过量产生EPSPS来耐受高浓度的草甘膦，因此存在草甘膦在分生组织积累的情况，影响农作物的生长发育和产量。更新换代转基因产品，用转基因技术克服转基因作物产生的问题是目前研究的热点之一。研究发现了一种新的草甘膦代谢失活机制，应用草甘膦N-乙酰转移酶(glyphosate N-acetyhransferase，GAT)将草甘膦转变为对植物无毒的N-乙酰草甘膦(NAG)，失去除草剂活性。这一发现揭示了新的草甘膦耐受机制，为培育草甘膦耐受农作物提供了另一种可选模式。杜邦先锋公司于2010年已经获得农业部转基因生物安全证书，可进口耐除草剂转基因大豆356043作为食品与饲料加工原料。该转基因大豆利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)优化获得的gat基因，具有对除草剂草甘膦的耐性。2006年以来，已在美国、加拿大等17个国家和地区获得作为食品与饲料加工原料进口的许可；在美国、加拿大等11个国家和地区获得商业化种植许可。

根据国际农业生物技术应用服务组织ISAAA的数据，截止2015年，全世界已有28个国家种植转基因作物，全球转基因作物种植面积达1.797亿公顷。一方面转基因作物的种植面积逐渐增大，另一方面，社会对转基因安全性的争论愈演愈烈。转基因作物具有品质好、耐病虫害等优点，但是不排除转基因作物对生态环境和食品安全存在的潜在风险。因此，需要对转基因产品实行有效的监管、筛选和安全评估，行之有效的检测技术/工具是实现这一目标的有力支持。现有的检测技术，如酶免法、放免法等，检测时间长(酶免检测时间需2h、放免检测需3h左右)，需要特殊的检测设备，如酶标仪、放免闪烁仪、离心机等，检测专用的场地等，检测成本较高，需要专业的操作人员进行检测，实践推广应用的空间存在一定局限性。因此，需要有一种操作简便、结果准确可靠、可快速检测转基因植物中GAT蛋白的装置。

双抗体夹心法是应用最广泛的一种免疫结合胶体金层析法。利用抗原抗体反应相结合的原理，用免疫金标记技术，以微孔膜为固相载体，实现对样品的定性、半定量等检测。

双抗体夹心法是将首先将已知的特异性单抗或多抗包被于膜上作为检测带(T线)，可与金标物结合的二抗包被于膜上作为质控带(C线)。与包被抗体相配对的另一单抗与胶体金结合，吸附于金标垫。干燥的金标垫一端与膜相接，一端与样品垫相连。膜的另一侧粘贴吸水垫。检测时，加入样品垫上液体样品通过毛细管作用向吸水垫的方向移动，经过金标垫时，如标本中有待测抗原，则发生抗原抗体反应，形成金颗粒－抗体－抗原复合物；样本继续移动到达检测带位置，则与针对不同检测位点的包被抗体再次发生抗原抗体反应，形成金颗粒－抗体－抗原－包被抗体复合物，形成肉眼可见的T线，如样本中无待检抗原或待检抗原的浓度低于检测范围，则不能形成肉眼可见的红色条带。游离的金标结合物或金颗粒－抗体－抗原复合物越过检测带到达质控带，与二抗发生反应，聚集并产生肉眼可见的红色条带(C线)。无论样本中是否含有待检物质，质控带都会出现C线。

免疫结合胶体金层析法可对样品进行单份检测，具有操作便捷、不需要特殊设备和场地的优点。但目前免疫结合胶体金层析法普遍存在一定缺陷，如对样本的敏感度低，质量控制能力不够，批间、批内和不同试剂间变异系数过大等。因此，提高抗单克隆抗体对的敏感度和特异性，是弥补免疫结合胶体金层析法缺陷的重要手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏特异的免疫结合胶体金层析法检测GAT蛋白的方法。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞对，其中，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12277；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12278。

再一方面，本发明还提供了一种单克隆抗体对，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.12277；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12278。

再一方面，本发明还提供了如上所述的单克隆抗体对在检测转GAT的转基因农作物中的用途。

再一方面，本发明还提供了一种免疫胶体金试纸，该免疫胶体金试纸包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有质控线(C线)和检测线(T线)，所述C线上包被有抗鼠IgG的抗体，所述T线上包被有第一单克隆抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第二单克隆抗体，所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体构成单克隆抗体对，其中，所述单克隆抗体对为如上所述的单克隆抗体对。

再一方面，本发明还提供了一种检测转GAT的转基因农作物的方法，其中，该方法包括如下步骤：S1、从待检测的农作物中提取全蛋白；S2、对所述全蛋白使用如上所述的单克隆抗体对进行免疫胶体金试纸检测或双抗夹心酶连免疫检测；S3、如果免疫胶体金试纸检测或双抗夹心酶连免疫检测的结果中出现GAT的阳性结果，则指示待检测的农作物为转GAT的转基因农作物。

通过上述技术方案，本发明能够通过免疫胶体金试纸，对GAT蛋白的检测取得1ng/mL的灵敏度，对28种非转基因作物和17种不同来源的各种非GAT转基因作物也不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物材料保藏

本发明的第一杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编号为CGMCC NO.12277，保藏日期为2016年04月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为抗GAT单克隆抗体杂交瘤细胞株。

本发明的第二杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编号为CGMCC NO.12278，保藏日期为2016年04月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为抗GAT单克隆抗体杂交瘤细胞株。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是实施例1中His-Tag GAT融合蛋白的表达与纯化结果图。

图2是实施例2中利用胶体金产生的信号颜色深浅，进行定性或半定量检测的结果图。

图3是实施例2中利用胶体金产生的信号颜色深浅，对28种非转基因作物和17种不同来源的各种转基因作物(表1)做了特异性检测实验的结果图。

图4是免疫胶体金试纸的组装结构示意图。

附图标记说明

1 样品垫 2 被衬底板 3 胶体金垫

4 T线 5 C线 6 纤维素膜

7 吸收垫

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞对，其中，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.12277；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12278。

再一方面，本发明还提供了如上所述的单克隆抗体和如上所述的单克隆抗体对在检测转GAT的转基因农作物中的用途。

可选地，其中，所述农作物为棉花、玉米、水稻或大豆。

其中，所述GAT蛋白是指GAT基因所编码的蛋白，GAT基因是利用免培养技术提取草甘膦污染土壤的总DNA，构建了约含16,000个重组子的宏基因组文库。用20mM的草甘膦筛库，得到一株具有草甘膦抗性的重组菌株。提取质粒测序分析发现此片段中含有一个441bp的ORF序列。网上BLAST结果表明，此基因与已知N-乙酰转移酶基因具有较高的同源性。利用原核表达系统对其功能进行了分析验证，发现含有gat基因的菌株EGAT在300mM草甘膦浓度下仍能够生长；而且在37℃条件下，EGAT菌株经0.75mM IPTG诱导后，GAT蛋白也得到了高效表达，说明获得的gat基因具有高抗草甘膦特性，为N-乙酰转移酶基因的同源基因，将其命名为gat。GAT蛋白由146个氨基酸组成，分子量约16kDa。GAT蛋白质氨基酸序列在NCBI数据库中进行同源比对。结果显示，一致性最高的序列信息为来自Bacillus licheniformis菌株的glyphosate N-acetyltransferase蛋白(草甘膦N-乙酰基转移酶，蛋白ID:2JDC_A)，比对序列一致性为98％。具体地，GAT基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

再一方面，本发明还提供了一种免疫胶体金试纸，该免疫胶体金试纸包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有抗鼠IgG的抗体，所述T线上包被有第一单克隆抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第二单克隆抗体，所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体构成配对单克隆抗体。其中，所述配对单克隆抗体为如上所述的单克隆抗体对。

其中，所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12277；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12278。

其中，免疫胶体金试纸的检测原理可能包括：将待检样品滴入样品垫中，若样品中有GAT蛋白，待检样品中GAT蛋白先和胶体金标记的第二单克隆抗体结合，由于毛细管作用，GAT蛋白和胶体金标记的第二单克隆抗体形成的复合体沿基膜向前泳动，到达检测线时遇到包被在硝酸纤维素基膜上的第一单克隆抗体，由于第一单克隆抗体和第二单克隆抗体分别能结合GAT蛋白的不同抗原表位结合，从而形成“胶体金标记的第二单克隆抗体-GAT蛋白-第一单克隆抗体”复合体，从而使得胶体金富集在检测线上，形成特异性的红色层析线；没有和GAT蛋白结合的胶体金标记的第二单克隆抗体则会直接通过检测线，达到质控线后被质控线上的羊抗鼠IgG捕获，从而使得胶体金富集在质控线上形成红色层析线，即判为阳性结果；若样品中无GAT蛋白，由于无法在检测线上形成“胶体金标记的第二单克隆抗体-GAT蛋白-第一单克隆抗体”复合体，从而使得检测线上不会产生肉眼可见的颜色反应，没有和GAT蛋白结合的胶体金标记的第二单克隆抗体则会直接通过检测线，达到质控线后被质控线上的羊抗鼠IgG捕获，从而使得胶体金富集在质控线上形成红色层析线，即判为阴性结果。

本发明中，使用保藏编号为CGMCC NO.12277的杂交瘤细胞株和保藏编号为CGMCCNO.12278的杂交瘤细胞株分别制备和纯化第一单克隆抗体和第二单克隆抗体的方法可以为本领域常规的方法，例如小鼠腹水法和亲和层析法。

本发明中，将单克隆抗体进行胶体金标记的方法可以为本领域常规的方法，例如可以包括：将0.01重量％的HAuCl₄溶液加热煮沸后加入1重量％的柠檬酸三钠溶液直至溶液的颜色完全变为透明的红色时，继续回流10min后停止加热，冷却至室温，即得到胶体金；取1mL制取好的胶体金，用1重量％的K₂CO₃调节pH值到8.0，加入20μg单克隆抗体，混合均匀，室温反应40min；加入5重量％的BSA至终浓度为0.1重量％，静置30min；先用低速(1500×g)离心15分钟，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀；然后用10000×g离心30分钟；仔细吸出上清，沉淀物用0.1mL含1％BSA的0.1M PBS(pH 7.4)复溶，加入5％叠氮钠至终浓度为0.05％，4℃保存。

本发明中，制备免疫胶体金试纸的方法可以为本领域常规的方法，例如可以包括：用喷金点膜机将第一单克隆抗体和羊抗鼠IgG喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平行的检测T线和质控C线，然后烘干；将胶体金标记的第二单克隆抗体用喷金点膜机均匀的喷在金标垫上；然后将样品垫、金标垫、喷有T线和C线的基膜(硝酸纤维素膜)和吸水纸依次连接组装，而后裁切包装备用。

可选地，其中，所述金标垫中所含有胶体金标记的第二单克隆抗体是由5-100μg/mL胶体金标记的第二单克隆抗体溶液以0.5-5μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在金标垫上干燥后得到的。

可选地，其中，所述T线上包被的第一单克隆抗体是由0.2-5mg/mL的第一单克隆抗体溶液以0.2-4μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在T线上干燥后得到的。

可选地，其中，所述C线上包被的羊抗鼠IgG的抗体是由0.2-5mg/mL的羊抗鼠IgG的抗体溶液以0.2-4μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在C线上干燥后得到的。

根据如上所述的方法，可选地，其中，所述农作物为棉花、玉米、水稻或大豆。

以下通过实施例进一步详细说明本发明：

实施例1

gat基因的PCR克隆：根据gat的ORF序列设计引物(两端带有BamHI与SacI位点)；Fgat：CGCGGATCCATGATTGACGTGAACCCAAT(SEQ ID NO.1)和Rgat：CGCGAGCTCTTATGCGATCCTCTTGTACA(SEQ ID NO.2)；以Fgat和Rgat为引物，抗性重组子质粒DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物连入pGEM-Tvector载体，转化大肠杆菌DH5α；挑选阳性克隆并测序，测序结果显示GAT基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.4为：MIDVNPINAEDTYELRHRILRPNQPIEACMFESDLLRGAFHLGGYYGGKLISIASFHQAEHSELQGQKQYQLRGMATLEGYREQKAGSSLIKHAEEILRKRGADLLWCNARTSASGYYKKLGFSEQGEVFDTPPVGPHILMYKRIA；具体参见序列表。

SEQ ID NO.3为：atgattgacgtgaacccaattaacgctgaggatacttacgagcttagacatagaattcttagaccaaaccaaccaatcgaggcttgcatgttcgagtctgatcttcttagaggagctttccatcttggaggttactacggaggtaagcttatttctattgcttctttccatcaagctgagcattctgagcttcaaggacaaaagcaataccaacttaggggaatggctactcttgagggatacagagagcaaaaggctggttcttctcttatcaagcatgccgaggagatcctcaggaagaggggcgccgaccttctttggtgcaacgctaggacttccgcctctggatactacaagaagcttggcttctctgagcagggagaggtgttcgacactccacctgtgggaccccatatccttatgtacaagaggatcgcataa；具体参见序列表。

gat基因大肠杆菌表达载体的构建：用BamHI与SacI酶切表达载体pET-28a(+)和pGAT，分别回收5.6kb和0.45kb的DNA片段；将回收得到的表达载体pET-28a酶切片段和gat回收片段连接；连接产物利用氯化钙转化法转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑选阳性克隆，命名为pEGAT。

gat基因在原核中的表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备：诱导表达：EGAT接种于3mL含卡那霉素100μg/mL的LB液体培养基中，37℃过夜培养，按1％接菌量加入到6mL含卡那霉素100μg/mL的LB液体培养基中，振荡培养至OD₆₀₀值为0.6，加入IPTG至终浓度为0.75mM，继续于37℃摇床培养，对其进行诱导表达，以IPTG诱导的含pET28a(+)空载体菌株、未经IPTG诱导的EGAT菌株以及BL21菌株为对照。离心收集菌体后加入100μL上样缓冲液，煮沸10min，12000×g离心10min，取上清置4℃备用，诱导产物经12％的SDS-PAGE电泳分析。

蛋白纯化：样品的准备：准备细胞，在细胞OD₆₀₀≈0.5-0.8时，用0.75mM IPTG诱导4h，收集细胞，加入1/20细胞生长体积的NTA-O Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,PMSF的工作浓度为1mM。将细胞悬浮起来，加入溶菌酶(工作浓度为0.2-0.4mg/mL)，混匀，冰上放置30min，超声或匀浆破碎细胞，该步骤冰上操作；加入10％Triton X-100，使Triton终浓度为0.05％，充分混匀，冰上放置15min，间或混匀，冰上超声破碎细胞；加入1M MgCl₂，使MgCl₂终浓度为1mM。加入DNase，使DNase的终浓度为10μg/mL，混匀，室温放置10min；20,000×g，4℃离心15min以上。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。层析：将NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗；将步骤1)准备好的样品加到NTA层析柱中，流速控制在15mL/h，收集穿透部分，用SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况；层析用5倍NTA体积的NTA-0Buffer洗，流速控制在30mL/h左右；用5倍NTA体积的NTA-20Buffer(20mM Tris-HClpH 7.9,0.5M NaCl,10％Glycerol,20mM Imidazole)，NTA-40Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10％Glycerol,40mM Imidazole)，NTA-60Buffer(20mM Tris-HCl pH 7.9,0.5M NaCl,10％Glycerol,60mM Imidazole)，NTA-80Buffer(20mM Tris-HCl pH 7.9,0.5MNaCl,10％Glycerol,80mM Imidazole)，NTA-100 Buffer(20mM Tris-HCl pH 7.9,0.5MNaCl,10％Glycerol,100mM Imidazole)，NTA-200Buffer(20mM Tris-HCl pH 7.9,0.5MNaCl,10％Glycerol,200mM Imidazole)，NTA-1000Buffer(20mM Tris-HCl pH 7.9,0.5MNaCl,10％Glycerol,1000mM Imidazole)洗脱，流速控制在15mL/h左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积；SDS-PAGE确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况。GAT蛋白片段的理论大小为16.5kDa，但由于表达时在其N端加了His·Tag和T7·Tag，所以融合蛋白大小分别为20.5kDa与GAT分子量的理论值相符，如图1所示。图1中，泳道2为分子量标记，泳道3为诱导表达后的蛋白，泳道4-8为纯化后的His-Tag GAT融合蛋白，可见纯度较高。纯化的GAT蛋白可用于制备其单克隆抗体。

实施例2

GAT蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

将6-8W⁺的BALB/c雌小鼠按剂量分为四组，按剂量50、100、150、200μg/只(即实施例1得到的GAT蛋白)进行免疫，共免疫3次。初次免疫前取眼血作为阴性对照，初次免疫时加等体积福氏完全佐剂皮下多点注射；以后隔四周进行一次免疫，以相同剂量重组抗原加等体积福氏不完全佐剂皮下多点注射。第三次免疫结束后10天左右用重组抗原包被ELISA板，用间接ELISA测定小鼠血清的抗体效价；融合前三天对抗体效价最高的(1:10⁵以上)小鼠尾静脉注射50μg重组GAT蛋白加强免疫。加强免疫三天后进行细胞融合。

细胞融合前一天，按照以下方法制备饲养层细胞：1)将8W⁺健康雄性BALB/c小鼠，拉颈处死后，于75％乙醇浸泡3-5min；2)移至超净台内，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，并用75％乙醇消毒其腹膜；3)用止血钳轻轻拉起腹膜，将10mL预温的1640液体培养基用注射器注入腹腔，用棉球轻揉腹腔1-2min，吸出细胞悬液，放入离心管中；4)离心：1000×g，5min，弃上清；5)用10mL含血清HAT培养基将细胞混匀，细胞计数，调整细胞密度于2×10⁵/mL；6)将此细胞悬液按100μL/孔加入96孔细胞培养板，则细胞密度为2×10⁴/孔；7)置37℃，5％CO₂孵箱培养，供次日融合实验用。

骨髓瘤细胞SP2/0的制备：1)收获对数生长期SP2/0细胞，用1640液体培养基洗涤3次，1000×g离心5min，弃上清；2)用1640液体培养基重悬细胞。取100μL细胞悬液，以0.2％台盼蓝染色，进行细胞计数，要求细胞活力>95％，并调整细胞密度待用。

脾细胞悬液的制备：1)将3天前经过冲击免疫的BALB/c小鼠摘除眼球放血，断颈处死，于75％乙醇浸泡2min；2)移至超净台内，剪开腹部皮肤向两侧剥离，暴露腹壁；换剪刀、镊子，剪开腹膜，取出脾脏，去掉脂肪和结缔组织，用1640培养基冲洗；3)将脾脏置于200目的筛网上，一边用注射器芯轻轻地研磨；一边以培养液冲洗，收集脾细胞悬液，离心1000×g，5min，弃上清；4)用1640培养基重悬细胞，离心洗涤2次：1000×g，5min，弃上清；5)用10mL不完全培养基重悬。取100μL细胞悬液，以0.2％台盼蓝染色，要求细胞活力>95％，并计数脾细胞。剩余细胞调整细胞密度待用。

细胞融合及培养：1)将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以5:1比例混合于50mL离心管中，1000×g离心5min，弃上清，轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散；2)一边均匀转动离心管，一边用吸管滴加37℃预温的50％PEG 4000 1mL，于1min内完成；3)加37℃预热的1640培养基1mL，在1min内完成；4)加37℃预热的1640培养基10mL，在5min内完成；5)800×g离心8min；用100mL HAT培养基重悬细胞沉淀；6)按100μL/孔将细胞悬液转移到接种了饲养细胞的细胞培养板中，同时留2孔加未经融合的SP2/0细胞作对照，观察细胞对HAT的敏感性。培养板置于37℃、5％CO₂孵箱中培养；7)融合3天后，每孔补加100μL新鲜的HAT培养液。以后每3-5天半量更换HAT培养液一次；8)2周后，HT培养基半量换液；9)3-4周后，换完全培养基维持培养。

ELISA筛选阳性杂交瘤细胞：1)融合后的细胞生长到培养孔底面积的1/4时(培养约12-15天左右)，取上清用间接ELISA法检测特异性反应和交叉反应，对杂交瘤细胞进行筛选。重组蛋白GAT为包被抗原，包被浓度5μg/mL常规包被ELISA板。往包被ELISA板中加100μL/孔的细胞培养上清液，用PBS 1:100稀释的免疫鼠血清为阳性对照，SP2/0细胞孔培养上清为阴性对照。细胞上清与包被ELISA板37℃孵育30min，充分洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:10000稀释)100μL/孔，37℃孵育30min，弃二抗。充分洗板后每孔加TMB 100μL显色15min，每孔再加入50μL 1N H₂SO₄终止反应。测定OD₄₅₀值。2)ELISA筛选获得98株分泌GAT单抗的细胞株；上述43株GAT单抗的细胞株所分泌的单克隆抗体均对重组GAT蛋白具有阳性反应。选择其中阳性反应最强的15株细胞进一步亚克隆培养，其余细胞株直接扩大培养，冻存和少量生产腹水。

有限稀释法进行克隆化培养：1)用移液器将待克隆的细胞吹打混匀，用含20％血清的HT选择培养液稀释至1个细胞/孔的密度，加入已有饲养细胞的细胞板，置5％CO₂、37℃的培养箱中进行培养；2)培养至第4天时，在倒置显微镜下观察并记录细胞单克隆生长孔；培养1周左右，吸取100μL已变黄的细胞培养液上清，用上述ELISA法检测细胞培养上清；3)检测为强阳性的孔内细胞进行2-3次亚克隆，直到最后一次所有仅一个细胞集落生长的培养孔上清ELISA检测结果均为阳性为止；4)将最后一次有限稀释后ELISA检测结果最好的杂交瘤细胞克隆扩大培养，并冻存。

腹水的制备：1)选取10周龄BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡0.5mL/只；2)7天后，腹腔接种经PBS稀释的培养至对数期的阳性杂交瘤细胞，每只小鼠5×10⁵/mL杂交瘤细胞；3)5天后观察，当小鼠腹部明显膨胀时，用12号注射针头收集腹水，每隔3天收集一次，直到小鼠死亡；4)将腹水以7 000×g，离心10min；留上清分装后-80℃冰箱保存。

单克隆抗体的纯化(protein A亲和层析)：1)装柱：用Equilibration Buffer(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.6)湿润柱子，检查柱子是否堵塞，加5mL Protein AAgarose于柱中；2)加入10倍柱体积的Equilibration Buffer平衡柱子；3)缓慢将腹水上样；4)加入10倍柱体积的Equilibration Buffer，按4-5mL/管收集穿透液直至OD₂₈₀<0.1；5)准备收集管，收集洗脱液的试管按500μL/管加入中和缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.7)；6)用5倍柱体积的Elution Buffer(50mM glycine，0.5M NaCl，pH 2.3)洗脱，按1.5mL/管收集洗脱液直至OD₂₈₀<0.1；7)用5倍柱体积的Equilibration Buffer洗柱及平衡柱子。

单克隆抗体配对筛选：将所获得的43株纯化单抗两两组合，共得到(43×43)对组合，每对组合中的两个抗体分别包被硝酸纤维素膜和标记胶体金，制备胶体金试纸条，通过对GAT重组抗原，GAT转基因作物的灵敏性筛选，对非转基因作物，非GAT转基因作物的特异性筛选，最后筛选出只针对GAT高特异性高灵敏性的配对单抗。具体如下：

制备胶体金颗粒:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒。具体步骤为:用超纯水将氯金酸配制成0.01％水溶液，取100mL与1.2mL 1％的柠檬酸三钠水溶液混合，加热至持续沸腾5min。冷却后用超纯水恢复至原体积，制成颗粒直径约为30nm的胶体金颗粒。

确定胶体金标记的抗体最适稳定量：采用经典MEY法确定标记1mL胶体金所需要的抗体用量为20μg。

硝酸纤维素膜(NC)的包被：用0.0l M pH 7.2的PBS缓冲液稀释纯化单抗至2mg/mL，用于包被T线，用0.0l M pH 7.2的PBS缓冲液稀释羊抗鼠IgG至l mg/mL，用于包被C线。用BIODOT公司XYZ3050工作系统以30mm/s速度喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平行的检测T线和质控C线，37℃烘干。

免疫胶体金试纸的组装：将包被了C线5和T线4的硝酸纤维素膜6，吸收垫7，胶体金垫3以及样品垫1依次粘附于不吸水的PVC被衬底板2上，如图4组装成免疫胶体金试纸。

单克隆抗体的配对筛选：43株单克隆抗体，一共获得43×43(1849)组配对单克隆抗体，组合成1849种胶体金试纸条。配对筛选时以ddH₂O作为阴性样本，重组GAT蛋白1μg/mL,转GAT棉花种子抽提物0.2g/mL作为阳性样本，转CP4-EPSPS大豆RR Soybean及转BT玉米BT2836种子抽提物各0.2g/mL作为交叉反应检测样本，对每一种试纸条进行测试。将针对重组GAT蛋白，转GAT棉花种子抽提物呈阳性反应，而对其它样本呈阴性反应的12株，9对配对单克隆抗体筛选出来作为候选的配对单抗。对于候选的9对配对单抗，进一步筛选检测其对重组GAT及转GAT作物的检测灵敏度和对其他常见的非转基因作物和非GAT的转基因作物的特异性。选择对重组GAT蛋白检测灵敏度达到1ng/mL水平，对转GAT作物种子检测达到0.2μg/mL水平，与非转基因及非GAT转基因作物没有交叉反应的配对单克隆抗体作为制备双抗体夹心法检测试剂盒的配对单克隆抗体。实验最终得到第一单克隆抗体FH6和第二单克隆抗体JG7a。

单克隆抗体亚类的鉴定：利用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒(Sigma公司)对各株单抗进行亚类鉴定，具体试验方法如下：1)在酶标板中分别加入1:1000倍PBS稀释的羊抗鼠IgG(IgM、IgA、IgG₁、IgG_2a、IgG_2b和IgG₃)，100μL/孔，37℃放置1h；2)弃去酶标板中液体，用PBST洗涤3次；3)100μL/孔加入PBS稀释后的纯化单克隆抗体(抗体浓度2-5μg/mL)，室温孵育1h；PBST洗涤3次；4)加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:10000稀释)100μL/孔，室温孵育30min。5)充分洗板后每孔加100μL TMB，显色15min，每孔再加入50μL 1N H₂SO₄终止反应。测定OD₄₅₀值。最终鉴定得到第一单克隆抗体FH6的抗体亚类为IgG1，第二单克隆抗体JG7a的抗体亚类均为IgG2b。

配对抗体灵敏度评价：筛选到的配对单克隆抗体：第一单克隆抗体FH6和第二单克隆抗体JG7a，对重组GAT蛋白检测灵敏度达1ng/mL；对转GAT棉花种子的检测灵敏度可达0.2μg/mL；如表1，图2所示。

表1

膜包被抗体(第一单克隆抗体)	FH6
		胶体金标记抗体(第二单克隆抗体)	JG7a
ddH₂O	-
		rGAT 1μg/mL	+++±
rGAT 100ng/mL	++
		rGAT 10ng/mL	+
rGAT 1ng/mL	±
		GAT棉花种子0.2g/mL	+++
GAT棉花种子20μg/mL	++
		GAT棉花种子2μg/mL	+
GAT棉花种子0.2μg/mL	±

配对抗体特异性评价：本实验筛选到的配对单克隆抗体：第一单克隆抗体FH6和第二单克隆抗体JG7a，对28种非转基因作物和17种不同来源的各种非GAT转基因作物(表2)做了特异性检测实验。检测结果如表2及图3示。配对单克隆抗体FH6-JG7a对所有检测非转基因和非GAT转基因作物没有交叉反应。综上所述，配对单克隆抗体FH6-JG7a制备的检测试纸条对大部分非转基因和非GAT转基因作物没有交叉反应。将产FH6单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.12277；将产JG7a单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.12278。

表2

根据实施例2可以看出，本发明筛选到了一对单克隆抗体FH6-JG7a，能够通过免疫胶体金试纸，对重组GAT蛋白检测灵敏度达1ng/mL，对转GAT作物种子的检测灵敏度可达2μg/mL，对28种非转基因作物和17种不同来源的各种非GAT转基因作物也不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种抗草甘膦GAT转基因农作物的金标检测试纸条

<130> 8989CAAS_B

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcggatcca tgattgacgt gaacccaat 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcgagctct tatgcgatcc tcttgtaca 29

<210> 3

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgattgacg tgaacccaat taacgctgag gatacttacg agcttagaca tagaattctt 60

agaccaaacc aaccaatcga ggcttgcatg ttcgagtctg atcttcttag aggagctttc 120

catcttggag gttactacgg aggtaagctt atttctattg cttctttcca tcaagctgag 180

cattctgagc ttcaaggaca aaagcaatac caacttaggg gaatggctac tcttgaggga 240

tacagagagc aaaaggctgg ttcttctctt atcaagcatg ccgaggagat cctcaggaag 300

aggggcgccg accttctttg gtgcaacgct aggacttccg cctctggata ctacaagaag 360

cttggcttct ctgagcaggg agaggtgttc gacactccac ctgtgggacc ccatatcctt 420

atgtacaaga ggatcgcata a 441

<210> 4

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ile Asp Val Asn Pro Ile Asn Ala Glu Asp Thr Tyr Glu Leu Arg

1 5 10 15

His Arg Ile Leu Arg Pro Asn Gln Pro Ile Glu Ala Cys Met Phe Glu

20 25 30

Ser Asp Leu Leu Arg Gly Ala Phe His Leu Gly Gly Tyr Tyr Gly Gly

35 40 45

Lys Leu Ile Ser Ile Ala Ser Phe His Gln Ala Glu His Ser Glu Leu

50 55 60

Gln Gly Gln Lys Gln Tyr Gln Leu Arg Gly Met Ala Thr Leu Glu Gly

65 70 75 80

Tyr Arg Glu Gln Lys Ala Gly Ser Ser Leu Ile Lys His Ala Glu Glu

85 90 95

Ile Leu Arg Lys Arg Gly Ala Asp Leu Leu Trp Cys Asn Ala Arg Thr

100 105 110

Ser Ala Ser Gly Tyr Tyr Lys Lys Leu Gly Phe Ser Glu Gln Gly Glu

115 120 125

Val Phe Asp Thr Pro Pro Val Gly Pro His Ile Leu Met Tyr Lys Arg

130 135 140

Ile Ala

145

Claims

1.一种杂交瘤细胞对，其特征在于，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12277；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12278。

2.一种单克隆抗体对，其特征在于，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12277；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12278。

3.权利要求2所述的单克隆抗体对在检测转GAT的转基因农作物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述农作物为棉花、玉米、水稻或大豆。

5.一种免疫胶体金试纸条，该免疫胶体金试纸条包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述T线上包被有第一单克隆抗体；所述金标垫中含有胶体金标记的第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体构成单克隆抗体对，其特征在于，所述单克隆抗体对为权利要求2所述的单克隆抗体对。

6.根据权利要求5所述的免疫胶体金试纸条，其中，所述金标垫中所含有胶体金标记的第二单克隆抗体是由5-100μg/mL胶体金标记的第二单克隆抗体溶液以0.5-5μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在金标垫上干燥后得到的。

7.根据权利要求5或6所述的胶体金检测试纸条，其中，所述T线上包被的第一单克隆抗体是由0.2-5mg/mL的第一单克隆抗体溶液以0.2-4μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在T线上干燥后得到的。

8.根据权利要求5所述的胶体金检测试纸条，其中，所述C线上包被的羊抗鼠IgG的抗体是由0.2-5mg/mL的羊抗鼠IgG的抗体溶液以0.2-4μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在C线上干燥后得到的。

9.一种检测转GAT的转基因农作物的方法，其中，该方法包括如下步骤：

S1、从待检测的农作物中提取全蛋白；

S2、对所述全蛋白使用权利要求2所述的单克隆抗体对进行免疫胶体金试纸检测或双抗夹心酶连免疫检测；

S3、如果免疫胶体金试纸检测或双抗夹心酶连免疫检测的结果中出现GAT的阳性结果，则指示待检测的农作物为转GAT的转基因农作物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述农作物为棉花、玉米、水稻或大豆。