CN110294803B

CN110294803B - Cry1Ah1蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN110294803B
Application number: CN201910445699.5A
Authority: CN
Inventors: 张�杰; 耿丽丽; 束长龙; 宋福平; 彭琦; 梁影屏
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-05-27
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2039-05-27
Also published as: CN110294803A

Abstract

本发明涉及Cry1Ah1蛋白的单克隆抗体及其应用。Cry1Ah1蛋白的单克隆抗体能够由保藏编号为CGMCC No.15797的杂交瘤细胞株产生。

Description

Cry1Ah1蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗原-抗体蛋白质的技术领域，特别涉及用于检测Cry1Ah1蛋白的单克隆抗体。

背景技术

随着转基因技术的发展，大量的转基因作物进入商品流通领域。目前以广泛用于玉米、大豆、棉花等农作物。Cry1Ah1基因来源于苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)，Cry1Ah1基因编码Cry1Ah1蛋白，该蛋白对棉铃虫和玉米螟、小菜蛾具有良好的杀虫活性。

对转基因农产品的管理，要从转基因农产品检测开始。目前，对于转基因产品的检测主要有以DNA为目标的检测方法，例如以DNA为目标的PCR法、Southern blot法和生物芯片法等；以及以蛋白为目标的检测方法，例如ELISA或胶体金快速检测试纸条等。但现有抗体存在特异性不强、灵敏度不高等问题，导致出现假阳性和/或假阴性率过高的问题。更重要的是，目前还没有一款能够灵敏特异性识别Cry1Ah1蛋白的单克隆抗体。

发明内容

本发明之一提供了一种Cry1Ah1蛋白的单克隆抗体，其能够由保藏编号为CGMCCNo.15797的杂交瘤细胞株产生。

所述单克隆抗体的效价为400000。因此，在待测样品量较低的情况下，降低了假阴性率。

此外，现有抗体因特异性低而能够与Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ab/c蛋白产生杂交信号，从而导致Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ab/c蛋白对Cry1Ah1检测干扰的问题。而本发明的单克隆抗体在特异性方面有了非常大的提高，避免了解决了与Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ab/c等蛋白杂交产生的假阳性，因而。提高了检测准确度。

因而，本发明的单克隆抗体比现有技术中的所述抗体的应用更具有优势。使用本发明的Cry1Ah1单克隆抗体作为检测含有Cry1Ah1基因的转基因植物时的灵敏度和特异性相当高，因而更容易检测到目标基因，而不至于漏检或错检。这将对鉴定含有Cry1Ah1基因的转基因植物具有重要的意义。

而且，利用Cry1Ah1蛋白抗原-抗体反应能够准确检测含有Cry1Ah1基因的转基因植物，并且能够节省时间，降低检测成本，操作更为简单。

本发明之二提供了一株保藏编号为CGMCC No.15797的杂交瘤细胞株。

本发明之三提供了本发明之一所述的单克隆抗体或本发明之二所述的杂交瘤细胞株在用于在与如SEQ ID No.2所示蛋白结合中的应用，即所述应用为使用所述单克隆抗体鉴定Cry1Ah1蛋白中的应用。

在一个具体的实施例中，所述单克隆抗体在检测待测样品中是否含有如SEQ IDNo.2所示蛋白的应用。

在一个具体的实施例中，先对所述待测样品提取总蛋白后，再进行所述单克隆抗体与所述总蛋白的结合。当所述单克隆抗体与所述总蛋白的结合产生阳性信号时，确定为所述待测样品含有如SEQ ID No.2所示蛋白，进一步地，在所述待测样品中没有外掺如SEQID No.2所示蛋白的情况下，如SEQ ID No.2所示蛋白应该是由其编码基因所产生的，因此，所述待测样品含有如SEQ ID No.2所示蛋白的编码基因。反之，所述待测样品不含如SEQ IDNo.2所示蛋白，进一步地，在所述待测样品中也不含如SEQ ID No.2所示蛋白的编码基因。

在一个具体的实施例中，所述待测样品选自农田土壤和/或农作物。

在一个具体的实施例中，所述农作物选自处于生长阶段的农作物、收获后的农作物和所述农作物的种子中的至少一种。其中，处于生长阶段的农作物和/或收获后的农作物的待测样品的选取可以为所述农作物的根、茎、叶、花、果实、籽粒中的至少一种，这可以根据本领域的需求或者Cry1Ah1蛋白的组织特异性表达部位进行合适的选择。

本发明之四提供了一种用于检测Cry1Ah1蛋白的试剂盒，其所述试剂盒包括如本发明之一所述的单克隆抗体。

本发明的用于检测Cry1Ah1蛋白的试剂盒包括但不限于ELISA试剂盒、酶免疫层析检测试剂盒、化学发光检测试剂盒以及免疫荧光检测试剂盒。

在一个具体的实施方式中，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒，该试剂盒中可以包括样品稀释液(包被液)、洗涤液、封闭液、底物溶液、终止液、阳性对照以及阴性对照。阳性对照例如可以是原核或真核表达的纯化的Cry1Ah1蛋白；阴性对照例如可以是非转基因大豆种子的全蛋白。

在一个具体的实施方式中，所述ELISA检测试剂盒中的所述样品稀释液为含有脱脂奶的磷酸盐缓冲液，优选为含有10％(W/V)脱脂奶的磷酸盐缓冲液；

所述洗涤液为含有Tween-20的磷酸盐缓冲液，优选为含有0.05％(V/V)Tween-20的磷酸盐缓冲液；

所述显色液包括显色液A和显色液B，所述显色液A含3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)20mg、无水乙醇10ml，并用ddH₂O定容至100ml；所述显色液B含柠檬酸2.1g、无水Na₂HPO₄ 2.82g、0.75％(V/V)的过氧化氢尿素0.64ml，并用ddH₂O定容至100ml；

所述终止液为0.5至2M H₂SO₄。

术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约pH 4至约pH 10的范围，优选约pH 5至pH 9的范围，更有选约pH 6至约pH 8的范围，最优选约pH 7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和/或氯化钾的磷酸盐缓冲液。

用于检测Cry1Ah1蛋白的ELISA检测试剂盒的制备方法可以包括以下步骤：

(1)克隆所述Cry1Ah1全蛋白(如SEQ ID NO:2所示的序列)的DNA(如SEQ ID NO:1所示的序列)，并进行蛋白质表达；

(2)利用所述蛋白免疫小鼠产生杂交瘤细胞，然后通过大量的筛选，得到性能优良的分泌抗Cry1Ah1蛋白的单克隆抗体；其中，单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.15797的杂交瘤细胞株分泌产生。

本发明之五提供了本发明之四所述的试剂盒在用于所述单克隆抗体与如SEQ IDNo.2所示蛋白结合中的应用，即所述应用为使用所述单克隆抗体鉴定Cry1Ah1蛋白中的应用。

在一个具体的实施例中，先对所述待测样品提取总蛋白后，再进行所述单克隆抗体与所述总蛋白的结合。当所述单克隆抗体与所述总蛋白的结合产生阳性信号时，所述待测样品含有如SEQ ID No.2所示蛋白，进一步地，在所述待测样品中没有外掺如SEQ IDNo.2所示蛋白的情况下，如SEQ ID No.2所示蛋白应该是由其编码基因所产生的，因此，所述待测样品含有如SEQ ID No.2所示蛋白的编码基因。反之，所述待测样品不含如SEQ IDNo.2所示蛋白，进一步地，在所述待测样品中也不含如SEQ ID No.2所示蛋白的编码基因。

在本发明中没有特殊说明的情况下，本发明中的术语均属于现有技术中所指的通用术语。

本发明的有益效果：

本发明的抗体效价高达400000，并且不能识别与其进化关系最接近的Cry1Ac1蛋白，因而其具有灵敏度高和特异性强的特点。

附图说明

图1显示了Cry1Ah1蛋白、Cry1Aa1蛋白、Cry1Ad1蛋白、Cry1Ab1蛋白、Cry1Ae1蛋白、Cry1Ai1蛋白和Cry1Ac1蛋白之间的相似性和进化关系。

图2显示了不同抗体细胞培养上清液样品在不同稀释度下的间接ELSIA测定结果(450nm处的吸光值)。其中，横坐标为稀释倍数(稀释度)，纵坐标为OD值(吸光值)。

图3显示了利用本发明实施例2制备的纯化后单克隆抗体Cry1Ah1抗体的SDS-PAGE结果。泳道1为Cry1Ah1抗体，其中，Cry1Ah1抗体稀释10倍后上样10μL；泳道2为Marker，Marker的浓度为0.1mg/ml，自上至下各条带的分子量大小为116、66.2、45、35、25、18.5、14.5kDa。经计算抗体的浓度约6.3mg/ml，纯度90％以上。

图4显示了Cry1Ah1蛋白和Cry1Ac1蛋白分别与系列稀释的Cry1Ah1蛋白抗体的间接ELSIA测定结果。

图5显示了Cry1Ah1蛋白和Cry1Ac1蛋白分别与Cry1Ah1蛋白单克隆抗体的Westernblot分析结果。泳道1的抗原为Cry1Ac1蛋白；泳道2的抗原为Cry1Ah1蛋白；泳道3为Marker，自上至下各条带的分子量大小为250、130、95、72、55、36kDa。

图6显示了Cry1Ah1蛋白和Cry1Ac1蛋白分别与Cry1Ac1蛋白单克隆抗体的Westernblot分析结果。泳道1的抗原为Cry1Ac1蛋白；泳道2的抗原为Cry1Ah1蛋白；泳道3为Marker，自上至下各条带的分子量大小为250、130、95、72、55、36kDa。

细胞保藏

小鼠骨髓杂交瘤细胞株IPPCAAS8A10-1Ah保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15797，保藏日期为2018年06月13日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。小鼠骨髓杂交瘤细胞株IPPCAAS8A10-1Ah产生的单克隆抗体为抗Cry1Ah1单克隆抗体。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做以下详细说明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、水1000ml，pH7.5，121℃灭菌15min。

LB液体培养基：胰蛋白胨1.0％，酵母提取物0.5％，NaCl 1.0％，121℃灭菌15min。

NaAc-HAc缓冲液(pH 4.5)：醋酸钠18g，冰醋酸9.8ml，加水稀释至1000ml。

用于ELSIA测定的包被液：50mM碳酸钠缓冲液，pH 9.6。

用于ELSIA测定的洗涤液：0.05％Tween-20，0.01M磷酸盐缓冲液，pH 7.4。

用于ELSIA测定的封闭液：1％脱脂奶粉，0.01M磷酸盐缓冲液配制。

用于ELSIA测定的底物溶液：TMB显色液(购自康为试剂)。

用于ELSIA测定的终止液：0.5M H₂SO₄。

用于Western测定的转移缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH₂O定容至1000ml。

用于Western测定的TBST缓冲液：0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na₂HPO₄1.44g；KH₂PO₄ 0.24g；加ddH₂O至1000ml。

用于Western测定的封闭液：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01M PBS中。

用于Western测定的显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H₂O₂1.0μl。

实施例1

将Cry1Ah1蛋白、Cry1Aa1蛋白(Genebank登录号：AAA22353.1)、Cry1Ad1蛋白(Genebank登录号：AAA22340.1)、Cry1Ab1蛋白(Genebank登录号：AAA22330.1)、Cry1Ae1蛋白(Genebank登录号：AAA22410.1)、Cry1Ai1蛋白(Genebank登录号：AY174873.1)和Cry1Ac1蛋白(Genebank登录号：AAA22331.1)氨基酸序列用MEGA 7.0软件MEGA 7.0软件进行分析，结果见图1。从结果可以看出，Cry1Ah1蛋白与Cry1Ac1的氨基酸相似程度最高，进化关系最为接近。

实施例2

抗原的制备

将基因序列Cry1Ah1(SEQ ID No.1)连接到大肠杆菌-苏云金芽胞杆菌穿梭表达载体pSTK上得到pSTK-Cry1Ah1。先将pSTK-Cry1Ah1转入到大肠杆菌菌株SCS110中，从而使pSTK-Cry1Ah1DNA去甲基化；然后将去甲基化的pSTK-Cry1Ah1导入Bt无晶体突变株HD73^-中，得到Bt表达菌株HD73-Cry1Ah1。

将Bt表达菌株HD73-Cry1Ah1种于牛肉膏蛋白胨培养基中，230rpm，30℃培养30小时左右，提取Cry1Ah1蛋白，然后进行SDS-PAGE检测蛋白表达情况，结果表明，HD73-Cry1Ah1可以大量表达135kDa的蛋白。

其中，Cry1Ah1蛋白的提取如下：

(1)挑取HD73-Cry1Ah1单菌落接种于装有5mL含相应抗性的LB液体培养基的试管中，30℃，230rpm活化培养约12h。

(2)按1％的接菌量转接到1L三角瓶(装有200mL牛肉膏蛋白胨培养基)中，30℃，230rpm培养至50％以上的菌体裂解。

(3)4℃，8000rpm离心10min，弃上清。

(4)先预冷的1mol/L NaCl洗涤沉淀，4℃，8000rpm离心10min后，再用预冷的无菌水洗涤一遍；

(5)每1L菌液沉淀悬于50mL裂解液，加入3％β-巯基乙醇，用NaOH将pH调到9.5～10，冰上震荡裂解8h；

(6)4℃，12000rpm离心15min，离心上清转移入新的离心管，加入1/7体积pH 4.5的3mol/L NaAc-HAc缓冲液，调pH至4.5，4℃放置4h沉淀蛋白；

(7)4℃，12000rpm离心15min，预冷的无菌水洗涤沉淀2次，离心后用50mmol/LNa₂CO₃(pH 9.6)溶解沉淀，得到Cry1Ah1蛋白溶液。

Cry1Ah1蛋白的活化条件为蛋白：胰蛋白酶＝10:1的质量比37℃水浴2h。

Cry1Ah1蛋白的纯化：

使用Avant 150型蛋白质快速纯化系统对Cry1Ah1蛋白进行纯化，具体流程如下所示：

1)使用HiTrap Q FF色谱柱进行离子交换层析：将活化的Cry1Ah1蛋白以18,500×g离心10min，上清加载到已经用50mmol/L Na₂CO₃(pH 9.5)缓冲液预平衡的HiTrap Q FF色谱柱上，然后通过用3倍柱体积的Na₂CO₃缓冲液洗涤除去未结合的杂质，再使用0-1.0mol/LNaCl的梯度以2.0mL/min流速反向洗脱蛋白质，基于280nm处的UV吸光度收集洗脱峰对应组分，得到Cry1Ah1蛋白第一次洗脱液。

2)使用HiLoad 26/600Superdex 75pg色谱柱进行凝胶过滤层析除去前一步骤中HiTrapQ FF色谱柱结合的小分子杂质，以进一步纯化Cry1Ah1蛋白质：在1.0mL/min的流速下，将Cry1Ah1蛋白第一次洗脱液加载到预平衡的HiLoad 26/600Superdex 75pg色谱柱上，使用含有50mmol/L Na₂CO₃(pH 9.5)的缓冲液，流速为2.6mL/min，基于280nm处的UV吸光度收集目标蛋白质，得到Cry1Ah1蛋白第二次洗脱液。

3)使用离子交换层析中更高分辨率Resource Q色谱柱来分离Cry1Ah1蛋白和非Cry1Ah1蛋白，以有效分离纯化Cry1Ah1蛋白质：在1.0mL/min的流速下，将Cry1Ah1蛋白第二次洗脱液加载到预平衡的Resource Q色谱柱上。接下来，用0-1.0mol/L NaCl梯度洗脱20个柱体积，基于280nm处的UV吸光度收集目标蛋白质，得到Cry1Ah1蛋白第三次洗脱液。

4)使用用于凝胶过滤层析的HiLoad 26/600Superdex 75pg色谱柱进一步纯化Cry1Ah1蛋白质：在1.0mL/min的流速下，将Cry1Ah1蛋白第三次洗脱液加载到预平衡的HiLoad 26/600Superdex 75pg色谱柱上，使用200mmol/L NH₄HCO₃(pH 8.0)的缓冲液，流速为2.6mL/min，基于280nm处的UV吸光度收集目标蛋白，得到Cry1Ah1蛋白第四次洗脱液，用于下面实施例的免疫。

实施例3

单克隆抗体的制备

1)动物免疫

用实施例2纯化的Cry1Ah1蛋白按50μg/只小鼠的量，皮下初次免疫4只SPF BALB/c雌性小鼠，编号依次为：1至4。皮下第一次加强免疫；皮下第二次加强免疫，蛋白的免疫量为40μg/只；皮下第三次加强免疫，蛋白的免疫量为40μg/只；皮下第四次加强免疫，蛋白的免疫量为30μg/只；眼眶取血，测血清效价。

2)免疫效价检测

步骤：将Cry1Ah1蛋白用包被液，2μg/ml，4℃包被过夜；2％脱脂牛奶，37℃封闭2h；血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。结果：选取免疫效价最高4号小鼠，做腹腔冲击细胞融合实验。

3)细胞融合实验

用上述纯化的Cry1Ah1蛋白免疫原55μg，腹腔冲击4号小鼠。取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。

实验器材

灭菌的手术器械：三把剪刀、三把镊子、一个细胞筛、一个注射器的内芯、一个平皿、湿盒、2个500ml烧杯、2个50ml离心管、3个15ml离心管。

实验试剂

IMDM培养基

IMDM完全培养基(含15％血清)

2.2％甲基纤维素：厂家：SIGMA；货号：M0262-100G

新生牛血清：10ml

PEG1500：厂家：Roche；货号：78364

HAT：厂家：Sigma；货号：H0262-10VL

HT：厂家：Sigma；货号：H0137-10VL

融合实验步骤：

i.将状态良好的sp2/0细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50ml离心管中。

ii.小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min。

iii.在平皿中倒入少量无血清的IMDM培养基，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装sp2/0的离心管中，离心1500rad/min，5min。

iv.用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞到15ml离心管中，再加入2ml的HAT，2ml的HT放在孵箱中备用。

v.将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的IMDM培养基将细胞小心轻柔地吹匀，离心(1500rad/min，5min)。

vi.将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG，加完后，在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2ml的无血清的IMDM培养基，接着2min内缓慢加入8ml无血清的IMDM培养基。离心1000rad/min，5min。

vii.倒掉上清，加入10ml的血清，小心的将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞。再加入25ml灭过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。

4)筛选杂交瘤细胞

待融合的细胞培养至第7天时，即细胞培养至覆盖10％孔底时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清(不同细胞株的编号如表1所示)，用间接ELISA法选择效价较高的细胞株。以从空白血中获得的样品作为空白对照(ck)。

间接ELSIA测定的具体步骤如下：

1)抗原包被：用包被液稀释抗原Cry1Ah1到1μg/ml，100μL/孔加入聚苯乙烯酶标96孔反应板中，4℃放置过夜。

2)洗涤：次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗15min。

3)封闭：加200μL/孔封闭液，37℃放置2h.。

4)洗涤：用洗涤液洗3次，每次15min。

5)加待测抗体样品(一抗细胞培养上清液)：以每孔100μL加入表1浓度的待测抗体细胞培养上清液样品，37℃温育1h。

6)洗涤：弃掉待测样品，用洗涤液洗3次，每次15min。

7)加酶标二抗抗体：加入HRP标记羊抗鼠IgG(1:10000，酶稀稀释)，100μl/孔，37℃孵育40min。

8)洗涤：用洗涤液洗5次，每次15min。

9)显色：加新鲜配制的底物溶液90μL/孔，37℃暗处放置15min。

10)终止反应、比色：加50μL/孔终止液，颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。

表1

稀释度	1	2	3	4	5	6	7	8	ck
										1/1000	2.7564	2.6645	2.5668	2.6391	2.4295	2.5495	2.4158	2.3794	0.0372
1/2000	2.6579	2.8965	2.5884	2.8007	2.5564	2.5449	2.3489	2.1798	0.0441
										1/4000	2.7067	2.7263	2.4599	2.6798	2.3301	2.4307	2.3996	1.5066	0.0349
1/8000	2.8967	2.4064	2.4248	2.3366	2.3661	2.0319	1.8953	0.8675	0.0050
										1/16000	2.3905	1.9385	1.8152	2.0334	1.9834	1.5613	1.2175	0.2779	0.0012
1/32000	2.0493	1.1023	1.1160	1.3273	1.5339	0.8778	0.7152	0.0308	0.0068
										1/64000	1.1550	0.4373	0.4218	0.5835	0.8173	0.2574	0.2147	0.0073	0.0005
1/128000	0.5067	0.0808	0.0556	0.1634	0.2672	0.0296	0.0226	0.0292	0.0049

结果见表1和图2。根据结果可知，抗体细胞培养上清液样品“1”的效价达128000，灵敏度最高，因此选择编号“1”对应的杂交瘤细胞进行亚克隆，扩大培养，冻存细胞株，将其命名为IPPCAAS8A10-1Ah，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15797。

将IPPCAAS8A10-1Ah杂交瘤扩大培养之后进行Cry1Ah1的抗体纯化，纯化条件见表2。将纯化的抗体进行SDS-PAGE，结果见图3。

表2

实施例4

Cry1Ah单克隆抗体灵敏度和效价的测定

采用实施例3的方式提纯抗体，用间接ELSIA测定抗体的灵敏度和效价。具体如下：

1)抗原包被：用包被液分别稀释抗原Cry1Ah1和Cry1Ac1到1μg/ml，100μL/孔加入聚苯乙烯酶标96孔反应板中，4℃放置过夜。

2)洗涤：次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗15min。

3)封闭：加200μL/孔封闭液，37℃放置2h.。

4)洗涤：用洗涤液洗3次，每次15min。

5)加待测抗体样品(一抗)：以每孔100μL加入表3浓度的待测抗体样品，37℃温育1h。

6)洗涤：弃掉待测样品，用洗涤液洗3次，每次15min。

8)洗涤：用洗涤液洗5次，每次15min。

9)显色：加新鲜配制的底物溶液90μL/孔，37℃暗处放置15min。

10)终止反应、比色：加50μL/孔终止液，颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值，结果见表3和图4。从结果可以明显的看出，本发明的Cry1Ah抗体的灵敏度可达到15.625ng/ml，效价达到400000(6.3×10⁶/15.625≈400000)，且不识别Cry1Ac1蛋白。

表3

一抗浓度	包被Cry1Ah1(OD值)	包被Cry1Ac1(OD值)
			1μg/ml	2.3499	0.2101
0.5μg/ml	2.0559	0.2073
			0.25μg/ml	1.8673	0.1978
0.125μg/ml	1.5193	0.2124
			62.5ng/ml	1.0984	0.1923
31.25ng/ml	0.7363	0.2101
			15.625ng/ml	0.5925	0.1916
7.813ng/ml	0.2107	0.1846

实施例5

Cry1Ah单克隆抗体的Western特异性分析

1)将纯化后Cry1Ac1和Cry1Ah1蛋白样品进行SDS-PAGE；

2)转膜：电泳后将载有蛋白的凝胶用转移缓冲液漂洗，按照萨姆布鲁克，2002年的方法用湿式转膜仪将蛋白从聚丙烯凝胶转移至PVDF膜；

3)封闭：将膜放入TBST缓冲液中漂洗，然后转入封闭液中室温封闭2h；

4)第一抗体反应：按1000﹕1的比例在封闭液中加入一抗，室温结合1.5h，洗膜三次，每次15min；

5)第二抗体反应：按500﹕1的比例在TBST加入IgG-AP(二抗)，室温结合1h，洗膜三次，每次15min；

6)显色：将PVDF膜置于含有NBT和BCIP的显色液中显色至条带清晰，将膜放入蒸馏水中漂洗终止反应。将膜取出凉干，拍照，结果见图5。

从图5可以看出，Cry1Ah1单克隆抗体不能识别Cry1Ac1蛋白，只能识别Cry1Ah1，说明其具有特异性。

实施例6

Cry1Ac1单克隆抗体的Western特异性分析

Cry1Ac1单克隆抗体购自深圳华大基因股份有限公司。

Western Blot检测步骤同实施例5，仅使用的抗体不同。结果见图6。

从图6可以看出，Cry1Ac1单克隆抗体既可以识别Cry1Ac1蛋白，还可以识别Cry1Ah1，说明其不具有特异性。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> Cry1Ah1蛋白的单克隆抗体及其应用

<130> LHA1960237

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3549

<212> DNA

<213> 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 1

atgaaaaaca gtatcaaatt atcagaactt tggtatttca atgaaagaaa atggaggtat 60

tttatggaga tagtgaataa tcagaatcaa tgcgtgcctt ataattgttt gaataatccc 120

gaaatcgaaa tattagaagg cggaagaata tcagttggta ataccccaat tgatatttct 180

ctttcgctta ctcagtttct tttgagtgaa tttgtcccag gtgcggggtt tgtattagga 240

ttaattgatt taatatgggg atttgtaggt ccttcccaat gggacgcatt tcttgctcaa 300

gtggaacagt taattaacca aagaatagca gaagctgtaa gaaatacagc aattcaggaa 360

ttagagggaa tggcacgggt ttatagaacc tatgctactg cttttgctga gtgggaaaaa 420

gctcctgatg acccagagct aagagaagca ctacgtacac aatttacagc aactgagact 480

tatataagtg gaagaatatc cgttttaaaa attcaaactt ttgaagtaca gctgttatca 540

gtgtttgccc aagctgcaaa tttacattta tctttattaa gagacgttgt gttttttggg 600

caaagatggg gtttttcaac gacaaccgta aataattact acaatgattt aacagaaggg 660

attagtacct atacagatta tgctgtacgc tggtacaata cgggattaga acgtgtatgg 720

ggaccggatt ctagagattg ggtaaggtat aatcaattta gaagagaatt aacactaact 780

gtattagata tcgttgctct gttcccgaat tatgatagta gaagatatcc aattcgaaca 840

gtttcccaat taacaagaga aatttataca aacccagtat tagaaaattt tgatggtagt 900

tttcgaggct cggctcaggg catagaaaga agtattagga gtccacattt gatggatata 960

cttaacagta taaccatcta tacggatgct cataggggtt attattattg gtcagggcat 1020

caaataatgg cttctcctgt cggtttttcg gggccagaat tcacgtttcc gctatatgga 1080

accatgggaa atgcagctcc acaacaacgt attgttgctc aactaggtca gggcgtgtat 1140

agaacattat cctctacttt ttatagaaga ccttttaata tagggataaa taatcaacaa 1200

ctatctgttc ttgacgggac agaatttgct tatggaacct cctcaaattt gccatccgct 1260

gtatacagaa aaagcggaac ggtagattcg ctggatgaaa taccaccaca gaataacaac 1320

gtgccaccta ggcaaggatt tagtcatcga ttaagccatg tttcaatgtt tcgttcaggc 1380

tctagtagta gtgtaagtat aataagagct cctatgttct cttggataca tcgtagtgct 1440

gaatttaata atataattgc atcggatagt attactcaaa tccctgcagt gaagggaaac 1500

tttcttttta atggttctgt aatttcagga ccaggattta ctggtgggga cttagttaga 1560

ttaaatagta gtggaaataa cattcagaat agagggtata ttgaagttcc aattcacttc 1620

ccatcgacat ctaccagata tcgagttcgt gtacggtatg cttctgtaac cccgattcac 1680

ctcaacgtta attggggtaa ttcatccatt ttttccaata cagtaccagc tacagctacg 1740

tcattagata atctacaatc aagtgatttt ggttattttg aaagtgccaa tgcttttaca 1800

tcttcattag gtaatatagt aggtgttaga aattttagtg ggactgcagg agtgataata 1860

gacagatttg aatttattcc agttactgca acactcgagg ctgaatataa tctggaaaga 1920

gcgcagaagg cggtgaatgc gctgtttacg tctacaaacc aactagggct aaaaacaaat 1980

gtaacggatt atcatattga tcaagtgtcc aatttagtta cgtgtttatc ggatgaattt 2040

tgtctggatg aaaagcgaga attgtccgag aaagtcaaac atgcgaagcg actcagtgat 2100

gaacgcaatt tactccaaga ttcaaatttc aaagacatta ataggcaacc agaacgtggg 2160

tggggcggaa gtacagggat taccatccaa ggagtggatg acgtatttaa agaaaattac 2220

gtcacactat caggtacctt tgatgagtgc tatccaacat atttgtatca aaaaatcgat 2280

gaatcaaaat taaaagcctt tacccgttat caattaagag ggtacatcga agatagtcaa 2340

gatttagaag tttatttgat ccgttacaat gcaaaacacg aaacgttaaa cgtgccaggt 2400

acgggttcct tatggccact tgcagttaaa agtccaattg gaaggtgcgg tgaaccgaat 2460

cgatgtgcac atcattccca tcatttctcc ttggacattg atgtaggatg tacagactta 2520

aatgaggatt taggcgtatg ggtgatattc aagattaaga cacaagatgg ccatgcgaaa 2580

ataggaaatc tagaatttct cgaagagaag cttttattag gagaagcatt agcacgtgtg 2640

aagaaagcgg agaaaaaatg gagagacaaa cgcgaaaaat tggaatggga aacaaatatt 2700

gtttataaag aggcaaaaga atctgtagat gctttattcg tagattctca atataataga 2760

ttacaaacgg atacgaacat tgcgatgatt catgcggcag ataaacgcgt tcatcgaatc 2820

cgagaagcgt atttgccaga gttatctgtg attccgggtg tcaatgcggc tattttcgaa 2880

gaattagaag gtcttatttt caccgcattc tccctatatg atgcgagaaa tgtcattaaa 2940

aacggagatt tcaattatgg tttatcatgc tggaatgtga aagggcatgt agatgtagaa 3000

gaacaaaaca accaccgttc cgtccttgtt atcccagaat gggaagcaga agtgtcccaa 3060

gaagttcgtg tctgtccagg tcgtggctat atccttcgtg ttacagcgta caaagaggga 3120

tatggagagg gctgcgtaac gatccatgag atcgaagaca atacagacga actgaaattc 3180

agcaactgtg tagaagagga agtatatcca aacaacacgg taacgtgtaa tgattatact 3240

gcgactcaag aagaatatga gggtacgtac acttctcgta atcgaggata tgacggagcc 3300

tatgaaagca attcttctgt accagctgat tatgcatcag cctatgaaga aaaagcgtat 3360

acagatggac gaagagacaa tccttgtgaa tctaacagag gatataggga ttacacacca 3420

ctaccagctg gctatgtgac aaaagaatta gagtacttcc cagaaaccga taaggtatgg 3480

attgagatcg gagaaacgga aggaacattc attgtggata gcgtggaatt actccttatg 3540

gaggaatag 3549

<210> 2

<211> 1182

<212> PRT

<213> 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 2

Met Lys Asn Ser Ile Lys Leu Ser Glu Leu Trp Tyr Phe Asn Glu Arg

1 5 10 15

Lys Trp Arg Tyr Phe Met Glu Ile Val Asn Asn Gln Asn Gln Cys Val

20 25 30

Pro Tyr Asn Cys Leu Asn Asn Pro Glu Ile Glu Ile Leu Glu Gly Gly

35 40 45

Arg Ile Ser Val Gly Asn Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr

50 55 60

Gln Phe Leu Leu Ser Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly

65 70 75 80

Leu Ile Asp Leu Ile Trp Gly Phe Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala

85 90 95

Phe Leu Ala Gln Val Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Ala Glu Ala

100 105 110

Val Arg Asn Thr Ala Ile Gln Glu Leu Glu Gly Met Ala Arg Val Tyr

115 120 125

Arg Thr Tyr Ala Thr Ala Phe Ala Glu Trp Glu Lys Ala Pro Asp Asp

130 135 140

Pro Glu Leu Arg Glu Ala Leu Arg Thr Gln Phe Thr Ala Thr Glu Thr

145 150 155 160

Tyr Ile Ser Gly Arg Ile Ser Val Leu Lys Ile Gln Thr Phe Glu Val

165 170 175

Gln Leu Leu Ser Val Phe Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu

180 185 190

Leu Arg Asp Val Val Phe Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Ser Thr Thr

195 200 205

Thr Val Asn Asn Tyr Tyr Asn Asp Leu Thr Glu Gly Ile Ser Thr Tyr

210 215 220

Thr Asp Tyr Ala Val Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp

225 230 235 240

Gly Pro Asp Ser Arg Asp Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu

245 250 255

Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp

260 265 270

Ser Arg Arg Tyr Pro Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile

275 280 285

Tyr Thr Asn Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser

290 295 300

Ala Gln Gly Ile Glu Arg Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile

305 310 315 320

Leu Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Tyr Tyr Tyr

325 330 335

Trp Ser Gly His Gln Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro

340 345 350

Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln

355 360 365

Gln Arg Ile Val Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser

370 375 380

Ser Thr Phe Tyr Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln

385 390 395 400

Leu Ser Val Leu Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn

405 410 415

Leu Pro Ser Ala Val Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp

420 425 430

Glu Ile Pro Pro Gln Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser

435 440 445

His Arg Leu Ser His Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser

450 455 460

Val Ser Ile Ile Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala

465 470 475 480

Glu Phe Asn Asn Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala

485 490 495

Val Lys Gly Asn Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly

500 505 510

Phe Thr Gly Gly Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile

515 520 525

Gln Asn Arg Gly Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser

530 535 540

Thr Arg Tyr Arg Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His

545 550 555 560

Leu Asn Val Asn Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro

565 570 575

Ala Thr Ala Thr Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly Tyr

580 585 590

Phe Glu Ser Ala Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile Val Gly

595 600 605

Val Arg Asn Phe Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu

610 615 620

Phe Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr Asn Leu Glu Arg

625 630 635 640

Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly

645 650 655

Leu Lys Thr Asn Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu

660 665 670

Val Thr Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu

675 680 685

Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu

690 695 700

Leu Gln Asp Ser Asn Phe Lys Asp Ile Asn Arg Gln Pro Glu Arg Gly

705 710 715 720

Trp Gly Gly Ser Thr Gly Ile Thr Ile Gln Gly Val Asp Asp Val Phe

725 730 735

Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Ser Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro

740 745 750

Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Phe Thr

755 760 765

Arg Tyr Gln Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Val

770 775 780

Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Leu Asn Val Pro Gly

785 790 795 800

Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ala Val Lys Ser Pro Ile Gly Arg Cys

805 810 815

Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp

820 825 830

Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val

835 840 845

Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Lys Ile Gly Asn Leu

850 855 860

Glu Phe Leu Glu Glu Lys Leu Leu Leu Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val

865 870 875 880

Lys Lys Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp

885 890 895

Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu

900 905 910

Phe Val Asp Ser Gln Tyr Asn Arg Leu Gln Thr Asp Thr Asn Ile Ala

915 920 925

Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Arg Ile Arg Glu Ala Tyr

930 935 940

Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu

945 950 955 960

Glu Leu Glu Gly Leu Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg

965 970 975

Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Tyr Gly Leu Ser Cys Trp Asn

980 985 990

Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn His Arg Ser Val

995 1000 1005

Leu Val Ile Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val

1010 1015 1020

Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly

1025 1030 1035 1040

Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asp Asn Thr Asp

1045 1050 1055

Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn Asn

1060 1065 1070

Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Ala Thr Gln Glu Glu Tyr Glu Gly

1075 1080 1085

Thr Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Gly Ala Tyr Glu Ser Asn

1090 1095 1100

Ser Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Ala Tyr Glu Glu Lys Ala Tyr

1105 1110 1115 1120

Thr Asp Gly Arg Arg Asp Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg Gly Tyr Arg

1125 1130 1135

Asp Tyr Thr Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr

1140 1145 1150

Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly

1155 1160 1165

Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu

1170 1175 1180

Claims

1.一种Cry1Ah1蛋白的单克隆抗体，其由保藏编号为CGMCC No. 15797的杂交瘤细胞株产生。

2.一株保藏编号为CGMCC No. 15797的杂交瘤细胞株。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体在用于检测氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的蛋白中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述单克隆抗体在检测待测样品中是否含有如SEQ ID No. 2所示蛋白的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，先对所述待测样品提取总蛋白后，再进行所述单克隆抗体与所述总蛋白的结合。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述待测样品选自农田土壤和/或农作物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述农作物选自处于生长阶段的农作物、收获后的农作物和所述农作物的种子中的至少一种。

8.一种用于检测Cry1Ah1蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的单克隆抗体。

9.根据权利要求8所述的试剂盒在用于所述单克隆抗体检测氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述单克隆抗体在检测待测样品中是否含有如SEQ ID No. 2所示蛋白的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，先对所述待测样品提取总蛋白后，再进行使用所述单克隆抗体与所述总蛋白的结合。

12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述待测样品选自农田土壤和/或农作物。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述农作物选自处于生长阶段的农作物、收获后的农作物和所述农作物的种子中的至少一种。