CN117031019A - 一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心elisa试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用。双抗体夹心ELISA试剂盒包括：包被有鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4的酶标板、HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白另一单克隆抗体6G6，还包括封闭液、稀释液、洗涤液、显色液及终止液。该试剂盒最低病毒的检出量为102.9TCID50/mL，并且不与NDV、IBDV、IBV和FAdV‑4发生反应，批内和批间重复变异系数小于10％。与RT‑PCR方法比较，双抗体夹心ELISA试剂盒检测的符合率为93.33％。本发明的EDSV抗原双抗体夹心ELISA检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性，能用于EDSV的检测。

Description

一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用。
背景技术
鸡减蛋综合征病毒(egg drop syndrome virus,EDSV)能够使蛋鸡产软壳、薄壳、无壳蛋，产蛋率严重下降，从而给养鸡业带来巨大的经济损失。该病毒自1976年由荷兰科学家Van Eck首次发现并报道。EDSV现已成为世界范围内影响鸡产蛋的主要病因之一。尽管EDSV在鸭中通常看起来无害，但在先前的研究中表明，有一些EDSV菌株对鸭是具有潜在的致病性。
减蛋综合征病毒(egg drop syndrome virus,EDSV)是Ⅲ群禽腺病毒的唯一成员，同时又因该病毒基因组富含AT碱基而将其归到腺胸腺病毒属，鸭是其主要的自然宿主，所以EDSV又名鸭腺病毒1型(duck adenovirus 1)，简称Dad V-1。EDSV具有典型的腺病毒形态，五邻体、六邻体和纤维蛋白(fiber)是腺病毒的三个主要结构蛋白。240个六邻体构成了腺病毒的20个面，六邻体蛋白以三聚体的形式存在，三个六邻体形成一个六边形结构。二十面体的12个顶点由五邻体蛋白和纤维蛋白以非共价键连接形成的复合物构成，五邻体蛋白以五聚体的形式形成五邻体基体，纤维蛋白则以三聚体的形式存在，并向外伸展，形成纤突。纤维蛋白由一个N端尾区、多个三连β螺旋重复片段构成的柄区以及一个C端的球状头区组成。研究表明Fiber蛋白与EDSV入侵宿主细胞有关，此外，Fiber能够最高效地诱导机体产生病毒中和抗体，是最有效的保护性抗原以及血清学检测中的理想靶标。
目前，国内外针对EDSV的诊断检测技术主要通过血凝或血凝抑制以及核酸诊断技术，而酶联免疫吸附试验(ELISA)因具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优点，已经广泛应用于人畜疾病的检测。因此，有必要研发一种检测鸡减蛋综合征病毒的ELISA试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种以鸡减蛋综合征病毒Fiber蛋白的两种单克隆抗体5G4和6G6为基础制备的双抗体夹心ELISA试剂盒；
还提供了一种鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒的检测方法。
本发明的技术方案:
一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒,包括封闭液、稀释液、洗涤液、显色液及终止液，酶标板上包被有鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4、HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体6G6，
所述包被单克隆抗体5G4或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.2所示；
所述单克隆抗体6G6或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.3所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.4所示。
所述单克隆抗体5G4由保藏编号为CCTCC NO:C2023213的杂交瘤细胞株5G4分泌。
所述单克隆抗体6G6由保藏编号为CCTCC NO:C2023214的杂交瘤细胞株6G6分泌。
其中封闭液为5％脱脂乳，稀释液和洗涤液为PBST缓冲液；显色液为TMB，终止液为2M H2SO4。
其中鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体的制备方法为：通过PCR扩增获得EDSVFiber基因，将其与原核表达载体pET28a连接，构建重组质粒pET28a-Fiber，转化大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导表达获得Fiber蛋白，然后通过镍柱纯化获得纯化的Fiber蛋白，以此作为免疫原免疫小鼠，制备多株鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体。
进一步的，将纯化后的Fiber蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞，将细胞上清进行间接ELISA和间接免疫荧光验证，筛选得到阳性克隆细胞株，经过三次亚克隆后，将杂交瘤细胞株注射小鼠进行腹水的制备，最后将得到的腹水进行纯化，得到鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4、6G6。
一种鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)包被：纯化后的鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4稀释后包被酶标板，4℃过夜，捕获抗体5G4的包被浓度为219ng/孔；
(2)封闭：采用5％脱脂乳做封闭液，37℃封闭酶标板2h；
(3)加样：加入待检样品，37℃孵育1h进行反应；
(4)加酶标二抗：加入稀释后的HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白检测抗体即HRP-6G6，37℃作用1h；检测抗体HRP-6G6的稀释倍数为1:6400；
(5)显色：加入TMB底物避光显色，显色时间为15min；
(6)终止：加入2M H2SO4终止液，终止反应；
(7)读值：酶标仪测定OD450。
本发明的单克隆抗体5G4、6G6在检测鸡减蛋综合征病毒试剂中的应用。
本发明的单克隆抗体5G4、6G6在检测鸡减蛋综合征病毒的试剂盒中的应用。
本发明的双抗体夹心ELISA法的基本原理，将定量的捕获抗体以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待检标本，通过加入检测抗体(即酶标记第二抗体)后，用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。因本发明的双抗夹心ELISA法使用两个特异性抗体与靶标结合，该方法具有高度的特异性和灵敏度，并且适用于复杂的样品基质的检测。
本发明的有益效果：
1.本发明选择鸡减蛋综合征病毒(EDSV)高度保守的Fiber蛋白作为靶抗原，以鸡减蛋综合征病毒Fiber蛋白的两种单克隆抗体5G4和6G6为基础制备双抗体夹心ELISA试剂盒。
本发明的ELISA试剂盒使用纯化后的鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4作为捕获抗体，HRP标记的另一抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体6G6作为检测抗体，并通过一系列反应条件和试剂优化，建立了双抗体夹心ELISA试剂盒。
2.本发明的双抗体夹心ELISA试剂盒病毒的最低检出量为102.9TCID50/mL，灵敏度高，并且不与NDV、IBDV、IBV和FAdV-4反生反应，批内和批间重复变异系数小于10％，表明建立的双抗体夹心ELISA试剂盒具有良好的重复性。
3.与RT-PCR方法比较，本发明双抗体夹心ELISA试剂盒检测的符合率为93.33％，准确率较高。
4.本发明建立的双抗体夹心ELISA试剂盒可用于EDSV的临床检测，特异性强、灵敏度高，并且成本低、操作简便，可以实现大批量样本的快速检测，为EDSV感染的防控提供一种快速检测方法和监测手段。
附图说明
图1为重组Fiber蛋白的SDS-PAGE鉴定结果
其中，M：蛋白Marker；1：纯化后的重组Fiber蛋白；
图2为5G4、6G6的亲和层析纯化SDS-PAGE鉴定结果
其中，M：蛋白Marker；1：纯化的5G4；2：纯化的6G6。
图3ELISA检测单克隆抗体6G6的标记效果。
具体实施方式
下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式。
如无特别说明，在以下实施例中所涉及的仪器设备，均为常规仪器设备；所使用试剂为市售常规试剂；所涉及的试验方法均为常规方法。
实施例1、EDSV Fiber蛋白的表达及纯化
EDSV Fiber蛋白编码基因(GenBank登录号MK386577)交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，随后将Fiber基因经PCR扩增，上游引入BamHⅠ酶切位点，下游引入XhoⅠ酶切位点，循环参数为95℃预变性10min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环，最后72℃延伸10min，得到PCR产物.(上游引物：CGCGGATCCATGCTGAACGTGGAAACCCGTGGTGG；下游引物：CGCCTCGAGTATTGCGCACCAACATAGGTAAACGG)。将PCR产物及pET28a载体经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后回收，经DNA连接酶连接，转化大肠杆菌TOP10，经过基因测序鉴定，成功构建重组质粒pET28a-Fiber，由于pET28a载体XhoⅠ酶切位点后有His标签，因此利用重组质粒表达的Fiber蛋白羧基端引入了6×His标签。
将重组质粒pET28a-Fiber转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落于5mL卡纳抗性的LB中，待OD600约为0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达。诱导后5h，6000rpm离心10min收集沉淀，沉淀用适量的PBS重悬后，进行超声处理25min(每超声3s，停3s，共超声25min)，超声后在4℃、12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀。取上清液和沉淀加入5×(上样缓冲液)，煮沸10min，进行SDS-PAGE鉴定。
其中的上样缓冲液包括Tris-HCl 60mM(pH6.8)，甘油25％，SDS2％，2-巯基乙醇14.4mM，0.1％溴酚蓝。
SDS-PAGE鉴定Fiber蛋白表达后，取上述超声后的裂解上清，进行镍柱纯化。操作步骤如下：将上清通过经裂解液平衡的镍离子亲和柱(GE Healthcare)，经缓冲液Buffer A(20mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，20mM咪唑)进行漂洗，随后用缓冲液Buffer B(20mMTris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，200mM咪唑)进行洗脱，收集洗脱液即为蛋白粗纯溶液。将蛋白粗纯溶液通过分子筛Superdex 200Increase 10/30GL(GE Healthcare)进一步纯化，使用缓冲液Buffer C(20mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl)，收集蛋白峰组分并经SDS-PAGE检测蛋白样品的纯度，参见图1。纯化的Fiber蛋白将用于后续单抗筛选。
从图1可看出，经过分子筛纯化后得到纯度较高的重组Fiber蛋白，分子量约为25kD。
实施例2、鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体的制备和纯化
1.单克隆抗体的制备
用步骤1中纯化所得重组Fiber蛋白作为抗原，免疫3只8周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠，免疫剂量为20μg抗原蛋白/只，背部皮下分4～6点注射，共免4次，免疫间隔时间2周。首免，用无菌PBS稀释的重组Fiber蛋白，与等量弗氏完全佐剂(FCA)混合，充分乳化；加强免疫3次，用无菌PBS稀释的重组Fiber蛋白，与等量弗氏不完全佐剂(FIA)混合，充分乳化，第4次免疫7天后测定血清抗体效价，效价高于>1:10000后1周内进行腹腔冲击，直接将二倍免疫剂量的抗原溶于250μL的PBS缓冲液中。
腹腔冲击3天后，无菌取小鼠脾脏，制备成单细胞悬液；处于对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以1:5比例混合，用质量浓度为50％的PEG1500作用1min，以基础培养基DMEM稀释终止，低速离心后，再用含20％胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀，按照2×107/板铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于5％CO2，37℃下培养。细胞融合10天后，融合的杂交瘤细胞形成克隆并且占据一定面积的细胞培养孔。
阳性克隆的筛选：
1)间接ELISA检测方法：将纯化的Fiber蛋白用包被液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至0.5μg/mL，100uL/孔加入ELISA板，37℃孵育1h；弃去包被液，PBST漂洗4次，加入5％的脱脂乳于37℃封闭1h；弃封闭液，按照每孔100μL的量加入按比例倍比稀释的杂交瘤细胞培养液上清，37℃孵育1h；弃去上清，PBST漂洗4次，按照每孔100μL的量加入1:1 000稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG，37℃孵育1h；弃去二抗，PBST漂洗4次，加入100μL TMB显色液，室温避光作用15min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应，酶标仪检测OD450nm值。
2)间接免疫荧光(IFA)检测方法：按每孔9×104个细胞将DEF细胞铺至96孔细胞培养板，37℃、5％CO2培养箱中培养至细胞铺满孔底80％，每孔接种200TCID50 EDSV，继续培养48h。以4％多聚甲醛固定细胞，随后加入0.1％Triton X-100通透，之后加入5％的脱脂乳于37℃封闭1h。弃封闭液，按照每孔50μL的量向细胞培养孔中加入按比例倍比稀释的杂交瘤细胞培养液上清，37℃孵育30min，弃去溶液，PBS洗6次，按照每孔50μL的量向细胞培养孔中加入1:1 000稀释的DyLight 488标记的兔抗鼠IgG，37℃孵育30min，弃去溶液，PBS洗6次，每孔加入100μL PBS，置于倒置荧光显微镜下观察。
经酶联免疫吸附试验(ELISA)及间接免疫荧光(IFA)检测鉴定后，将阳性杂交瘤细胞克隆转移到24孔细胞培养板中，通过有限稀释法进行单克隆化，确保获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将有效的阳性单克隆5G4、6G6进行小鼠腹水制备。
腹水制备：取经产BALB/c母鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，0.5mL/只。10天后，将生长对数期的单抗杂交瘤细胞经灭菌PBS洗2遍，PBS重悬后腹腔注射3×106个杂交瘤细胞，0.5mL/只。8～12天后，待小鼠腹部明显膨大，抽取腹水。4 500r/min离心10min，吸取上清于-20℃保存备用。利用间接ELISA及IFA方法分别检测5G4和6G6单克隆抗体腹水的效价，结果如表1所示，间接ELISA检测5G4和6G6单克隆抗体的腹水效价分别为2.56×105和1.02×106；IFA效价分别为4000和8000。
表1单克隆抗体腹水间接ELISA及IFA效价
2、鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体的纯化
按照PIERCE公司NAbTM Protein G Spin Purification Kit进行5G4、6G6的亲和层析纯化，纯化步骤：首先用20mM pH7.4的磷酸钠5倍柱体积平衡protein G柱；将经20mMpH7.4的磷酸钠稀释后的腹水上样至protein G柱；用20mM pH7.4的磷酸钠10倍柱体积漂洗proteinG柱；预先在每个收集管里加100μL的1M Tris-HCl pH 9.0，用0.1M甘氨酸溶液(pH2.7)进行洗脱，每个收集管收集900μL洗脱液，收集结束立刻上下颠倒收集管混匀。收集结束后将单克隆抗体浓缩，随后换液至PBS缓冲液中，经SDS-PAGE电泳鉴定单克隆抗体的纯度，如图2。
从图2可看出：纯化后的5G4、6G6仅有两条带，分别对应抗体的轻链和重链，纯度较高。
本申请的杂交瘤细胞株5G4、6G6已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2023年7月18日。其中杂交瘤细胞株5G4的保藏编号为CCTCC NO:C2023213，杂交瘤细胞株6G6的保藏编号为CCTCCNO:C2023214。
3、辣根过氧化物酶(HRP)标记鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体6G6
按照Abcam公司HRP偶联试剂盒对纯化后鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体6G6进行标记得到HRP-6G6，用ELISA检测单克隆抗体的标记效果。ELISA检测方法：将纯化的Fiber蛋白用包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6)稀释至0.5μg/mL，100uL/孔加入ELISA板，37℃孵育1h；弃去包被液，PBST漂洗4次，加入5％的脱脂乳于37℃封闭1h；弃去封闭液，PBST漂洗4次，按照每孔100μL的量加入相应稀释倍数的HRP-6G6，37℃孵育1h；弃去HRP-6G6，PBST漂洗4次，加入100μL TMB显色液，室温避光作用15min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应，酶标仪检测OD450nm值。结果如图3，HRP-6G6检测效价可达到12800，表明标记效果良好。
4、单克隆抗体5G4和6G6的可变区基因PCR扩增与序列测定
培养分泌单克隆抗体5G4和6G6的2株杂交瘤细胞，使其长满T25细胞培养瓶，弃去上清，使用TRizol法进行RNA提取，随后反转录(总体积20μL，37℃反应15min，85℃灭活5s)。
使用表2中的引物，单克隆抗体重链可变区和轻链可变区利用PCR技术扩增，总体积为50μL，扩增程序如下：98℃预变性，5min；98℃变性10s，退火温度为55℃，退火时间为10s，延伸温度为68℃时间为2min，这个过程进行30个循环；68℃，再延伸，2min。随后用琼脂糖凝胶(1％)电泳鉴定PCR扩增产物，根据目的条带的位置，切胶回收目的基因；测定目的基因的核酸序列，即单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区序列。
表2扩增单克隆抗体的可变区的引物序列
其中S＝C/G，W＝A/T，M＝A/C，R＝A/G。
实施例3、EDSV双抗体夹心ELISA方法的建立
1.确立捕获抗体和酶标抗体的最佳稀释浓度
使用棋盘法确定捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度，即用包被液将单克隆抗体5G4以7000、3500、1750、875、438、219、109、55ng/孔的比例稀释，横向加入ELISA板，每孔加入100μL，4℃包被过夜；PBST洗涤4次。然后每孔加入5％脱脂乳200μL，37℃封闭1h，PBST洗板3次。将病毒液或PBST稀释液(阴性对照)加入ELISA板，设置平行孔，每孔100μL，37℃孵育1h，用PBST洗板3次，将倍比稀释后的检测抗体即HRP-6G6按100μL/孔加入96孔板，37℃孵育1h，用PBST洗板5次；加入TMB显色液，室温避光作用15min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应，酶标仪检测OD450nm值。
结果如表3所示，当捕获抗体浓度降低时，阳性OD450nm值先保持不变，然后随着捕获抗体浓度的降低而降低，因此本实验选择阳性OD450nm值发生明显下降的捕获抗体的浓度作为最佳浓度；当检测抗体浓度降低时，阳性OD450nm值随之而下降，阴性OD450nm值降低幅度也较大，因此本实验选择阳性明显降低、阴性低于0.1的检测抗体对应的浓度作为最佳浓度(括号内为阴性值)。
如表3划线部分所示，捕获抗体5G4的最佳包被浓度为219ng/孔，检测抗体HRP 6G6酶标二抗的作用浓度为1:6400。
表3捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度的测定
表中括号外为阳性样品即病毒液OD450值，括号内为阴性对照即PBST稀释液OD450值。
2.双抗体夹心ELISA法最佳反应条件的选择
(1)最佳包被温度及时间的确定：以捕获抗体5G4包被浓度包被ELISA板。包被时间和温度分别选择37℃包被1h、2h、3h和4h，以及4℃过夜包被。根据OD450nm值以及P/N值确定最佳包被条件。结果4℃过夜包被时P/N值最高，因此将此条件确定为最佳包被条件。结果见表4。
表4最佳包被温度及时间的筛选
包被条件 37℃1h 37℃2h 37℃3h 37℃4h 4℃过夜
P/N值 14.58 15.65 15.47 15.89 17.07
(2)封闭液的选择：选择5％脱脂乳、10％脱脂乳、3％BSA、5％BSA作为封闭液，实验方法同步骤(1)。根据OD450nm值以及P/N值确定最佳封闭液。结果表明，用5％脱脂乳做封闭液时P/N值最高，而且脱脂乳粉成本低，因此选择5％脱脂乳做封闭液。结果见表5。
表5最佳封闭液的筛选
封闭液 P/N
5％脱脂乳 5.14
10％脱脂乳 4.26
3％BSA 3.81
5％BSA 4.65
(3)封闭时间和温度的选择：
选择脱脂乳37℃封闭1h、1.5h、2h、2.5h和3h，以及4℃过夜封闭，实验方法同步骤(1)。根据OD450nm值以及P/N值确定最佳封闭条件。结果表明37℃封闭2h时P/N值最大，且与4℃过夜封闭相差不大，因此选择37℃封闭2h为最佳封闭条件。结果见表6。
表6最佳封闭条件的筛选
封闭条件 P/N
37℃1h 4.12
37℃1.5h 4.56
37℃2h 5.41
37℃2.5h 5.07
37℃3h 4.87
4℃过夜 5.23
(4)抗原孵育时间的确定：选择37℃孵育0.5h、1h、1.5h和2h，实验方法同步骤(1)。根据OD450nm值以及P/N值确定最佳抗原孵育时间。结果表明37℃孵育1h时P/N值最大，因此确定37℃孵育1h为抗原最佳孵育时间。结果见表7。
表7最佳抗原孵育时间的确定
孵育时间 P/N
0.5h 3.37
1h 4.51
1.5h 4.21
2h 3.98
(5)酶标抗体HRP-6G6作用时间的确定：选择37℃作用0.5h、1h、1.5h和2h，实验方法同步骤(1)。根据OD450nm值以及P/N值确定最佳酶标抗体作用时间。结果表明37℃作用1h时P/N值最大，因此确定37℃作用1h为最佳酶标抗体作用时间。结果见表8。
表8酶标抗体最佳作用时间的确定
作用时间 P/N
0.5h 3.25
1h 4.31
1.5h 3.76
2h 3.07
(6)显色时间的确定：选择37℃显色5min、10min、15min和20min，实验方法同步骤(1)。根据OD450nm值以及P/N值确定TMB显色液的最佳显色时间。结果表明，37℃显色15min时P/N值最大，因此确定TMB显色液的最佳作用时间为15min。结果见表9。
表9最佳显色时间的确定
显色时间 P/N
5min 3.47
10min 3.97
15min 4.21
20min 3.84
实施例4、鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)包被：纯化后的鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4稀释后包被酶标板，4℃过夜，捕获抗体5G4的包被浓度为219ng/孔；
(2)封闭：采用5％脱脂乳做封闭液，37℃封闭酶标板2h；
(3)加样：加入待检样品，37℃孵育1h进行反应；
(4)加酶标二抗：加入稀释后的HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白检测抗体即HRP-6G6，37℃作用1h；检测抗体HRP-6G6的稀释倍数为1:6400；
(5)显色：加入TMB底物避光显色，显色时间为15min；
(6)终止：加入2M H2SO4终止液，终止反应；
(7)读值：酶标仪测定OD450。
其中，酶标二抗为HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体6G6，封闭液为5％脱脂乳，稀释液为PBST；洗涤液同稀释液，显色液为TMB，终止液为2M H2SO4。
稀释液PBST：将0.27gKH2PO4、1.42g Na2HPO4·12H2O、8.0gNaCl、0.2g KCl、0.5mLTween 20，定容于1L去离子水中，pH调至7.4后得到。
实施例5.性能试验
1.临界值的确定
采用实施例4的双抗体夹心ELISA方法检测35份EDSV阴性的样本，并计算35份样品OD450nm，计算出其平均值(Mean)和标准差(SD)，根据公式计算阴阳性样品的临界值(阴阳性临界值＝Mean+3SD)。结果为0.099+3×0.031＝0.192。
2.敏感性试验
根据筛选的ELISA反应条件，将EDSV TCID50为10-6.4/mL的病毒从1:100开始2倍比稀释检测建立的双抗体夹心ELISA试剂盒的敏感性。当病毒以1:3200稀释时其OD450nm值为0.234，大于临界值。因此，本方法最低病毒检测量为102.9TCID50/mL。
表10敏感性试验结果
稀释度 OD450nm
1:100 4.317
1:200 2.484
1:400 1.342
1:800 0.687
1:1600 0.382
1:3200 0.234
1:6400 0.132
3.特异性试验
采用优化后的双抗体夹心ELISA方法检测NDV、IBDV、IBV和FAdV-4。每份样品设置3个重复，同时以EDSV作为阳性对照，以PBS作为阴性对照。结果发现只有EDSV呈阳性，其余均不反应，说明本发明的方法可以鉴别诊断EDSV。
表11特异性试验
4.重复性试验
用同一批次繁殖的EDSV病毒液作为检测抗原，阴性尿囊液作为阴性对照，各进行批内和批间30次重复检测，根据OD450nm的值计算批内和批间差异值。变异系数(CV)＝(标准差/平均值)×100％。
结果表明，批内变异系数为8.07％，批间变异系数为8.16％，因此，重复性试验的变异系数均在10％以下，表明本发明的双抗体夹心ELISA法具有良好的重复性。
实施例6.本发明的双抗体夹心ELISA检测方法与RT-PCR的对比试验
选10周龄SPF鸡15只，分为两组，13只攻毒作为实验组，2只作为阴性对照。实验组鸡只进行攻毒，每只200μl EDSV病毒(106.4TCID50/mL)肌肉注射攻毒，在攻毒后第5天进行剖杀，采集肝脏样品，进行组织研磨，收集部分组织研磨液上清，用实施例4的EDSV双抗体夹心ELISA法检测；另一部分提取其组织DNA，用RT-PCR检测肝脏含毒量，检测引物根据EDSVpenton基因序列设计，P1：5′-CGTTCGCCTAATGACT-3′，P2：5′-CTGCCTTCCAACTTTC-3′。然后计算EDSV双抗体夹心ELISA法与RT-PCR法检测结果的符合率。
ELISA检测结果：阳性样品为12份，阴性为3份。RT-PCR结果显示，15份样品13份为阳性，2份为阴性。二者均检出阳性12份，阴性2份，符合率为93.33％(14/15)(表12)。
表12本发明的双抗体夹心ELISA法和RT-PCR比对结果
AGCAGAGTGGAGGGGGAAGATGCTGCCCCTTTTTACTGC
CAGCAGTGGAGTAGTAACCCACACGTTCGGAGGGGGCACCAAGCTGGAAA
TTTCAAACGG。

Claims (9)

1.一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，包括封闭液、稀释液、洗涤液、显色液及终止液，酶标板上包被有鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4、HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体6G6，
所述包被单克隆抗体5G4或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.2所示；
所述单克隆抗体6G6或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.3所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体5G4由保藏编号为CCTCCNO:C2023213的杂交瘤细胞株5G4分泌。
3.根据权利要求1所述的一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体6G6由保藏编号为CCTCC NO:C2023214的杂交瘤细胞株6G6分泌。
4.根据权利要求1所述的一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，其中封闭液为5％脱脂乳，稀释液和洗涤液为PBST缓冲液；显色液为TMB，终止液为2M H2SO4。
5.根据权利要求1所述的一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体的制备方法为：通过PCR扩增获得EDSV Fiber基因，将其与原核表达载体pET28a连接，构建重组质粒pET28a-Fiber，转化大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导表达获得Fiber蛋白，然后通过镍柱纯化获得纯化的Fiber蛋白，以此作为免疫原免疫小鼠，制备多株鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，将纯化后的Fiber蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞，将细胞上清进行间接ELISA和间接免疫荧光验证，筛选得到阳性克隆细胞株，经过三次亚克隆后，将杂交瘤细胞株注射小鼠进行腹水的制备，最后将得到的腹水进行纯化，得到鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4、6G6。
7.一种权利要求1所述鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)包被：纯化后的鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4稀释后包被酶标板，4℃过夜，捕获抗体5G4的包被浓度为219ng/孔；
(2)封闭：采用5％脱脂乳做封闭液，37℃封闭酶标板2h；
(3)加样：加入待检样品，37℃孵育1h进行反应；
(4)加酶标二抗：加入稀释后的HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白检测抗体即HRP-6G6，37℃作用1h；检测抗体HRP-6G6的稀释倍数为1:6400；
(5)显色：加入TMB底物避光显色，显色时间为15min；
(6)终止：加入2M H2SO4终止液，终止反应；
(7)读值：酶标仪测定OD450。
8.单克隆抗体5G4、6G6在检测鸡减蛋综合征病毒试剂中的应用。
9.单克隆抗体5G4、6G6在检测鸡减蛋综合征病毒的试剂盒中的应用。
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