CN108395477B - 单克隆抗体FB9b在检测GAT转基因农作物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种单克隆抗体，该抗体由保藏编号为CGMCC NO.12276杂交瘤细胞株分泌得到。本发明还提供了该抗体在检测转GAT的转基因农作物中的用途以及一种检测转GAT的转基因农作物的方法。本发明的杂交瘤细胞株所分泌得到的单克隆抗体能够用于GAT蛋白的WESTERN BLOT检测，可检测到重组GAT蛋白及转GAT作物种子；对7种不同来源的各种非GAT转基因作物也不呈现交叉反应。

Description

单克隆抗体FB9b在检测GAT转基因农作物中的用途

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种杂交瘤细胞株、一种单克隆抗体及其在检测转GAT的转基因农作物中的用途和检测转GAT的转基因农作物的方法。

背景技术

草甘膦(glyphosate)是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，由于其具有低成本、高效率、易降解及环境影响小等特点而在农业生产中广泛使用。草甘膦通过抑制植物莽草酸代谢过程中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性，阻断芳香族氨基酸的生物合成，最终导致植物死亡。

草甘膦N-乙酰化为作物抗草甘膦提供了不同于EPSPS途径的全新作用机制：乙酰辅酶A作为乙酰基供体，草甘膦分子的次级胺则作为乙酰基的受体，在N－乙酰转移酶的作用下使草甘膦乙酰化而失去除草剂活性。2004年，Castle等首先在《Science》上发表了关于草甘膦N-乙酰化的研究成果，他们筛选到了一些有很低活性的草甘膦N-乙酰转移酶，并通过11轮DNA改组(shuffling)进化获得了具有较高草甘膦抗性的N-乙酰转移酶基因。由于乙酰化的草甘膦不是EPSPS的有效抑制剂，可以避免草甘膦在植物体内的积累，使得草甘膦在作物的整个生长周期都可应用，不受生长发育阶段的限制。但对草甘膦N-乙酰转移酶的研究尚处于起步阶段，迄今为止在自然界中未发现高抗草甘膦活性的N-乙酰转移酶基因。因此，草甘膦N-乙酰化为作物抗草甘膦提供了不同于EPSPS途径的全新作用机制。草甘膦作为抗除草剂转基因作物研究的首选对象，抗草甘膦转基因作物是目前全球播种面积最大的转基因作物。

面对巨大的市场化运用前景，抗草甘膦基因克隆、功能验证和转化运用成为各国农业生物技术研发的重点和热点。多种基因已经被发现对草甘膦具有分解作用。目前，抗草甘膦植物基因工程主要采用三种方法。第一，植物细胞通过EPSPS的超常表达对一定剂量的草甘膦产生抗性。第二，植物细胞通过EPSPS基因的作用活性位点变化对草甘膦产生抗性，即通常所说的EPSPS抗草甘膦基因。利用这种作用机理使植物具有草甘膦抗性的常用基因主要是CP4-EPSPS和AroA两种。第三，导入编码草甘膦氧化还原酶基因。该方法目前主要采用草甘膦N-乙酰转移酶(glyphosate N-acetyhransferase)基因，即gat基因。由于转EPSPS作物并不能对草甘膦起到解毒的效果，而是过量产生EPSPS来耐受高浓度的草甘膦，因此存在草甘膦在分生组织积累的情况，影响农作物的生长发育和产量。研究发现，草甘膦在GAT的作用下转化成对植物没有毒害的N-乙酰草甘膦(N-acetylglyphosate,NAG)。现在先锋公司的转gat4621抗草甘膦作物，已得到大面积商业种植。

近年来，随着转基因技术的不断发展和成熟，已在世界范围内掀起了生物技术发展的一个新浪潮。由于转基因作物的优良的特性，目前已经广泛进行了转基因植物的田间试验，越来越多的国家批准转基因作物的商业化种植，由此衍生而来的转基因食品的数量也在迅速增加。由于转基因食品不同于传统食品，引起了社会各界对转基因食品的广泛争议。因此，对转基因作物或转基因食品的检测和鉴定不仅是相关法规的必然要求，也是满足公众知情权的必要技术。建立有效、敏感、快速、准确的检测方法，既是转基因安全性评价的重要研究内容，也是进一步加强我国在转基因作物和产品监管方面的重要技术保障。

在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。而单克隆抗体的使用是实施免疫学检测技术的必要条件，高敏感性和特异性的单克隆抗体则是进一步优化反应的重要保证。

发明内容

本发明的目的是提供一种较高的敏感度和特异性的抗GAT蛋白的单克隆抗体FB9b。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12276。

再一方面，本发明还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CGMCCNO.12276的杂交瘤细胞株产生。

再一方面，本发明还提供了如上所述的单克隆抗体FB9b在检测转GAT的转基因农作物中的用途。

另一方面，本发明还提供了一种检测转GAT的转基因农作物的方法，其中，该方法包括如下步骤：S1、从待检测的农作物中提取全蛋白；S2、对所述全蛋白使用如上所述的单克隆抗体进行免疫杂交；S3、如果免疫杂交结果中出现GAT的阳性条带，则指示待检测的农作物为转GAT的转基因农作物。

通过上述技术方案，本发明能够通过WESTERN BLOT方法对GAT蛋白进行检测，并且对7种不同来源的各种非GAT转基因作物也不呈现交叉反应。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物材料保藏

本发明中分泌单克隆抗体FB9b的杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编号为CGMCC NO.12276，保藏日期为2016年04月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为抗GAT单克隆抗体杂交瘤细胞株。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是实施例1中GAT融合蛋白纯化结果图

图2是实施例2中单克隆抗体亲和层析纯化的结果图。

图3是实施例2中单克隆抗体FB9b低倍稀释应用在Western Blot检测里的结果图。

图4是实施例2中单克隆抗体FB9b高倍稀释应用在Western Blot检测里的结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.12276。

再一方面，本发明还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CGMCCNO.12276的杂交瘤细胞株产生。

其中，由保藏编号为CGMCC NO.12276的杂交瘤细胞株产生单克隆抗体的方法可以为本领域常规的方法，例如小鼠腹水法。

再一方面，本发明还提供了如上所述的单克隆抗体在检测转GAT的转基因农作物中的用途。

其中，所述GAT蛋白是指GAT基因所编码的蛋白，GAT基因是利用免培养技术提取草甘膦污染土壤的总DNA，构建了约含16,000个重组子的宏基因组文库。用20mM的草甘膦筛库，得到一株具有草甘膦抗性的重组菌株。提取质粒测序分析发现此片段中含有一个441bp的ORF序列。网上BLAST结果表明，此基因与已知N-乙酰转移酶基因具有较高的同源性。利用原核表达系统对其功能进行了分析验证，发现含有gat基因的菌株EGAT在300mM草甘膦浓度下仍能够生长；而且在37℃条件下，EGAT菌株经0.75mM IPTG诱导后，GAT蛋白也得到了高效表达，说明获得的gat基因具有高抗草甘膦特性，为N-乙酰转移酶基因的同源基因，将其命名为gat。GAT蛋白由146个氨基酸组成，分子量约16kDa。GAT蛋白质氨基酸序列在NCBI数据库中进行同源比对。结果显示，一致性最高的序列信息为来自Bacillus licheniformis菌株的glyphosate N-acetyltransferase蛋白(草甘膦N-乙酰基转移酶，蛋白ID:2JDC_A)，比对序列一致性为98％。具体地，GAT基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，可以使用本领域常规的蛋白免疫检测方法将如上所述的单克隆抗体用于检测转GAT基因农作物。例如，可以从待检测的农作物中提取全蛋白，然后用免疫杂交(WESTERN BLOT)的方法进行检测，如果待检测的农作物的全蛋白用如上所述的单克隆抗体进行免疫杂交后出现GAT的阳性条带，则指示待检测的农作物为转GAT的转基因农作物。

可选地，其中，所述农作物为棉花、玉米、水稻或大豆。

另一方面，本发明还提供了一种检测转GAT的转基因农作物的方法，其中，该方法包括如下步骤：S1、从待检测的农作物中提取全蛋白；S2、对所述全蛋白使用如上所述的单克隆抗体进行免疫杂交；S3、如果免疫杂交结果中出现GAT的阳性条带，则指示待检测的农作物为转GAT的转基因农作物。

在如上所述的方法中，可选地，所述农作物为棉花、玉米、水稻或大豆。

以下，通过实施例进一步详细说明本发明。以下实施例中，所用的试剂均为商购获得。

实施例1

gat基因的PCR克隆：根据gat的ORF序列设计引物(两端带有BamHI与SacI位点)；Fgat：CGCGGATCCATGATTGACGTGAACCCAAT(SEQ ID NO.1)和Rgat：CGCGAGCTCTTATGCGATCCTCTTGTACA(SEQ ID NO.2)；PCR：以Fgat和Rgat为引物，抗性重组子质粒DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物连入pGEM-Tvector载体，转化大肠杆菌DH5α；挑选阳性克隆并测序，测序结果显示GAT基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.4为：MIDVNPINAEDTYELRHRILRPNQPIEACMFESDLLRGAFHLGGYYGGKLISIASFHQAEHSELQGQKQYQLRGMATLEGYREQKAGSSLIKHAEEILRKRGADLLWCNARTSASGYYKKLGFSEQGEVFDTPPVGPHILMYKRIA；具体参见序列表。

SEQ ID NO.3为：atgattgacgtgaacccaattaacgctgaggatacttacgagcttagacatagaattcttagaccaaaccaaccaatcgaggcttgcatgttcgagtctgatcttcttagaggagctttccatcttggaggttactacggaggtaagcttatttctattgcttctttccatcaagctgagcattctgagcttcaaggacaaaagcaataccaacttaggggaatggctactcttgagggatacagagagcaaaaggctggttcttctcttatcaagcatgccgaggagatcctcaggaagaggggcgccgaccttctttggtgcaacgctaggacttccgcctctggatactacaagaagcttggcttctctgagcagggagaggtgttcgacactccacctgtgggaccccatatccttatgtacaagaggatcgcataa；具体参见序列表。

gat基因大肠杆菌表达载体的构建：用BamHI与SacI酶切表达载体pET-28a(+)和pGAT，分别回收5.6kb和0.45kb的DNA片段；将回收得到的表达载体pET-28a酶切片段和gat回收片段连接；连接产物利用氯化钙转化法转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑选阳性克隆，命名为pEGAT。

gat基因在原核中的表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备：诱导表达：EGAT接种于3mL含卡那霉素100μg/mL的LB液体培养基中，37℃过夜培养，按1％接菌量加入到6mL含卡那霉素100μg/mL的LB液体培养基中，振荡培养至OD₆₀₀值为0.6，加入IPTG至终浓度为0.75mM，继续于37℃摇床培养，对其进行诱导表达，以IPTG诱导的含pET28a(+)空载体菌株、未经IPTG诱导的EGAT菌株以及BL21菌株为对照。离心收集菌体后加入100μL上样缓冲液，煮沸10min，12000×g离心10min，取上清置4℃备用，诱导产物经12％的SDS-PAGE电泳分析。

蛋白纯化：样品的准备：准备细胞，在细胞OD₆₀₀≈0.5-0.8时，用0.75mM IPTG诱导4h，收集细胞，加入1/20细胞生长体积的NTA-O Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,PMSF的工作浓度为1mM。将细胞悬浮起来，加入溶菌酶(工作浓度为0.2-0.4mg/mL)，混匀，冰上放置30min，超声或匀浆破碎细胞，该步骤冰上操作；加入10％Triton X-100，使Triton终浓度为0.05％，充分混匀，冰上放置15min，间或混匀，冰上超声破碎细胞；加入1M MgCl₂，使MgCl₂终浓度为1mM。加入DNase，使DNase的终浓度为10μg/mL，混匀，室温放置10min；20,000×g，4℃离心15min以上。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。层析：将NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗；将步骤1)准备好的样品加到NTA层析柱中，流速控制在15mL/h，收集穿透部分，用SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况；层析用5倍NTA体积的NTA-0Buffer洗，流速控制在30mL/h左右；用5倍NTA体积的NTA-20Buffer(20mM Tris-HClpH 7.9,0.5M NaCl,10％Glycerol,20mM Imidazole)，NTA-40Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10％Glycerol,40mM Imidazole)，NTA-60Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10％Glycerol,60mM Imidazole)，NTA-80Buffer(20mM Tris-HCl pH 7.9,0.5MNaCl,10％Glycerol,80mM Imidazole)，NTA-100Buffer(20mM Tris-HCl pH 7.9,0.5MNaCl,10％Glycerol,100mM Imidazole)，NTA-200Buffer(20mM Tris-HCl pH 7.9,0.5MNaCl,10％Glycerol,200mM Imidazole)，NTA-1000Buffer(20mM Tris-HCl pH 7.9,0.5MNaCl,10％Glycerol,1000mM Imidazole)洗脱，流速控制在15mL/h左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积；SDS-PAGE确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况。GAT蛋白片段的理论大小为16.5kDa，但由于表达时在其N端加了His·Tag和T7·Tag，所以融合蛋白大小分别为20.5kDa与GAT分子量的理论值相符，如图1所示。图1中，泳道2为分子量标记，泳道3为诱导表达后的蛋白，泳道4-8为纯化后的His-Tag GAT融合蛋白，可见纯度较高。纯化的GAT蛋白可用于制备其单克隆抗体。

实施例2

GAT蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

将6-8W⁺的BALB/c雌小鼠按剂量分为四组，按剂量50、100、150、200μg/只(即实施例1得到的GAT蛋白)进行免疫，共免疫3次。初次免疫前取眼血作为阴性对照，初次免疫时加等体积福氏完全佐剂皮下多点注射；以后隔四周进行一次免疫，以相同剂量重组抗原加等体积福氏不完全佐剂皮下多点注射。第三次免疫结束后10天左右用重组抗原包被ELISA板，用间接ELISA测定小鼠血清的抗体效价；融合前三天对抗体效价最高的(1:10⁵以上)小鼠尾静脉注射50μg重组GAT蛋白加强免疫。加强免疫三天后进行细胞融合。

细胞融合前一天，按照以下方法制备饲养层细胞：1)将8W⁺健康雄性BALB/c小鼠，拉颈处死后，于75％乙醇浸泡3-5min；2)移至超净台内，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，并用75％乙醇消毒其腹膜；3)用止血钳轻轻拉起腹膜，将10mL预温的1640液体培养基用注射器注入腹腔，用棉球轻揉腹腔1-2min，吸出细胞悬液，放入离心管中；4)离心：1000×g，5min，弃上清；5)用10mL含血清HAT培养基将细胞混匀，细胞计数，调整细胞密度于2×10⁵/mL；6)将此细胞悬液按100μL/孔加入96孔细胞培养板，则细胞密度为2×10⁴/孔；7)置37℃，5％CO₂孵箱培养，供次日融合实验用。

骨髓瘤细胞SP2/0的制备：1)收获对数生长期SP2/0细胞，用1640液体培养基洗涤3次，1000×g离心5min，弃上清；2)用1640液体培养基重悬细胞。取100μL细胞悬液，以0.2％台盼蓝染色，进行细胞计数，要求细胞活力>95％，并调整细胞密度待用。

脾细胞悬液的制备：1)将3天前经过冲击免疫的BALB/c小鼠摘除眼球放血，断颈处死，于75％乙醇浸泡2min；2)移至超净台内，剪开腹部皮肤向两侧剥离，暴露腹壁；换剪刀、镊子，剪开腹膜，取出脾脏，去掉脂肪和结缔组织，用1640培养基冲洗；3)将脾脏置于200目的筛网上，一边用注射器芯轻轻地研磨；一边以培养液冲洗，收集脾细胞悬液，离心1000×g，5min，弃上清；4)用1640培养基重悬细胞，离心洗涤2次：1000×g，5min，弃上清；5)用10mL不完全培养基重悬。取100μL细胞悬液，以0.2％台盼蓝染色，要求细胞活力>95％，并计数脾细胞。剩余细胞调整细胞密度待用。

细胞融合及培养：1)将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以5:1比例混合于50mL离心管中，1000×g离心5min，弃上清，轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散；2)一边均匀转动离心管，一边用吸管滴加37℃预温的50％PEG4000 1mL，于1min内完成；3)加37℃预热的1640培养基1mL，在1min内完成；4)加37℃预热的1640培养基10mL，在5min内完成；5)800×g离心8min；用100mL HAT培养基重悬细胞沉淀；6)按100μL/孔将细胞悬液转移到接种了饲养细胞的细胞培养板中，同时留2孔加未经融合的SP2/0细胞作对照，观察细胞对HAT的敏感性。培养板置于37℃、5％CO₂孵箱中培养；7)融合3天后，每孔补加100μL新鲜的HAT培养液。以后每3-5天半量更换HAT培养液一次；8)2周后，HT培养基半量换液；9)3-4周后，换完全培养基维持培养。

ELISA筛选阳性杂交瘤细胞：1)融合后的细胞生长到培养孔底面积的1/4时(培养约12-15天左右)，取上清用间接ELISA法检测特异性反应和交叉反应，对杂交瘤细胞进行筛选。重组蛋白GAT为包被抗原，包被浓度5μg/mL常规包被ELISA板。往包被ELISA板中加100μL/孔的细胞培养上清液，用PBS 1:100稀释的免疫鼠血清为阳性对照，SP2/0细胞孔培养上清为阴性对照。细胞上清与包被ELISA板37℃孵育30min，充分洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:10000稀释)100μL/孔，37℃孵育30min，弃二抗。充分洗板后每孔加TMB 100μL显色15min，每孔再加入50μL 1N H₂SO₄终止反应。测定OD₄₅₀值。2)ELISA筛选获得43株分泌GAT单抗的细胞株；上述43株GAT单抗的细胞株所分泌的单克隆抗体均对重组GAT蛋白具有阳性反应。选择其中阳性反应最强的15株细胞进一步亚克隆培养，其余细胞株直接扩大培养，冻存和少量生产腹水。

有限稀释法进行克隆化培养：1)用移液器将待克隆的细胞吹打混匀，用含20％血清的HT选择培养液稀释至1个细胞/孔的密度，加入已有饲养细胞的细胞板，置5％CO₂、37℃的培养箱中进行培养；2)培养至第4天时，在倒置显微镜下观察并记录细胞单克隆生长孔；培养1周左右，吸取100μL已变黄的细胞培养液上清，用上述ELISA法检测细胞培养上清；3)检测为强阳性的孔内细胞进行2-3次亚克隆，直到最后一次所有仅一个细胞集落生长的培养孔上清ELISA检测结果均为阳性为止；4)将最后一次有限稀释后ELISA检测结果最好的杂交瘤细胞克隆扩大培养，并冻存。

腹水的制备：1)选取10周龄BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡0.5mL/只；2)7天后，腹腔接种经PBS稀释的培养至对数期的阳性杂交瘤细胞，每只小鼠5×10⁵/mL杂交瘤细胞；3)5天后观察，当小鼠腹部明显膨胀时，用12号注射针头收集腹水，每隔3天收集一次，直到小鼠死亡；4)将腹水以7 000×g，离心10min；留上清分装后-80℃冰箱保存。

单克隆抗体的纯化(protein A亲和层析)：1)装柱：用Equilibration Buffer(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.6)湿润柱子，检查柱子是否堵塞，加5mL Protein AAgarose于柱中；2)加入10倍柱体积的Equilibration Buffer平衡柱子；3)缓慢将腹水上样；4)加入10倍柱体积的Equilibration Buffer，按4-5mL/管收集穿透液直至OD₂₈₀<0.1；5)准备收集管，收集洗脱液的试管按500μL/管加入中和缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.7)；6)用5倍柱体积的Elution Buffer(50mM glycine，0.5M NaCl，pH 2.3)洗脱，按1.5mL/管收集洗脱液直至OD₂₈₀<0.1；7)用5倍柱体积的Equilibration Buffer洗柱及平衡柱子。

适应于WESTERN BLOT的单克隆抗体筛选：

将所获得的15株纯化单抗，使用WESTERN BLOT方法，通过对GAT重组抗原和非GAT转基因作物的特异性筛选，最后筛选出只针对GAT高特异性高灵敏性的单克隆抗体。

WESTERN BLOT单克隆抗体筛选的操作步骤：12％SDS-PAGE电泳分离蛋白。泳道1为蛋白Marker；泳道2为重组GAT蛋白(1mg/mL)；泳道3为转GAT棉花种子抽提物(0.2g/mL)；泳道4为转CP4-EPSPS大豆种子提取物(0.2g/mL)；泳道5为转G2-EPSPS玉米种子抽提物(0.2g/mL)；泳道6为转BT Cry1Ac玉米种子抽提物(0.2g/mL)；泳道7为转phy玉米种子抽提物(0.2g/mL)；泳道8为转PAT/bar玉米种子抽提物(0.2g/mL)；泳道9为转BT/CPTI棉花种子提取物(0.2g/mL)。泳道10为转NPTII水稻种子抽提物(0.2g/mL)；半干转移凝胶中的蛋白至硝酸纤维膜(NC膜)，20伏恒压1h；将PBST中加入5％脱脂奶粉作为以封闭液，电转完成后取出NC膜放入封闭液中，4℃封闭过夜，PBST洗涤5min×3次；以筛选出的15株抗GAT单抗为一抗，用封闭液分别按1:200比例稀释，室温振荡孵育2h后弃反应液，PBST洗涤NC膜5min×3次；以HRP标记羊抗鼠IgG为二抗，用封闭液按1:10000比例稀释，室温下摇床孵育2h后弃反应液，PBST洗涤5min×4次；DAB显色液显色，观察结果。

单克隆抗体亚类的鉴定：利用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒(Sigma公司)对各株单抗进行亚类鉴定，具体试验方法如下：在酶标板中分别加入1:1000倍PBS稀释的羊抗鼠IgG(IgM、IgA、IgG₁、IgG_2a、IgG_2b和IgG₃)，100μL/孔，37℃放置1h；弃去酶标板中液体，用PBST洗涤3次；100μL/孔加入PBS稀释后的纯化单克隆抗体(抗体浓度2-5μg/mL)，室温孵育1h；PBST洗涤3次；加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:10000稀释)100μL/孔，室温孵育30min；充分洗板后每孔加100μL TMB，显色15min，再加入1N H₂SO₄ 50μL/孔终止反应。测定OD₄₅₀值。

单克隆抗体纯度及亚类的鉴定结果：实验证明单克隆抗体FB9b适用于WESTERNBLOT，单抗FB9b纯化结果如图2示，纯度大于95％。

单抗FB9b亚类鉴定结果为IgG1亚型。

单克隆抗体特异性和灵敏度评价：WESTERN BLOT实验筛选到的单克隆抗体FB9b按1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:5000稀释时，对重组GAT蛋白进行检测。检测结果(如表1)显示，不同稀释倍数的单克隆抗体FB9b均能够检测到重组GAT蛋白，说明单抗FB9b有良好的检测灵敏度。表1中，+代表具有阳性条带(+的数量代表条带的浓度)，-代表条带不可见，±代表条带与背景差异不显著或有杂条带，难以判断；以下相同。

表1

将产FB9b单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.12276。

将单克隆抗体FB9b按1:200稀释，对重组GAT蛋白、转GAT作物种子和7种不同来源的各种非GAT转基因作物进行WESTERN BLOT检测。结果如表2显示，单克隆抗体FB9b能够特异性检测到重组GAT蛋白及转GAT作物种子，结果如图3所示。将单抗FB9b按1:1000稀释，仍能检测到重组GAT蛋白及转GAT作物种子，说明单抗FB9b有良好的检测灵敏度，结果如图4所示。

表2

	FB9b(1:200稀释)	FB9b(1:1000稀释)
			重组GAT蛋白(1mg/mL)	+++	++
转GAT棉花种子抽提物(0.2g/mL)	++	+
			转CP4-EPSPS大豆种子提取物(0.2g/mL)	-	-
转G2-EPSPS玉米种子抽提物(0.2g/mL)	-	-
			转BT Cry1Ac玉米种子抽提物(0.2g/mL)	-	-
转phy玉米种子抽提物(0.2g/mL)	-	-
			转PAT/bar玉米种子抽提物(0.2g/mL)	-	-
转BT/CPTI棉花种子提取物(0.2g/mL)	-	-
			转NPTII水稻种子抽提物(0.2g/mL)	-	-

根据实施例2可以看出，本发明筛选到了一种单克隆抗体FB9b，能够用于WESTERNBLOT检测。可检测到重组GAT蛋白及转GAT作物种子；对7种不同来源的各种非GAT转基因作物也不呈现交叉反应。单克隆抗体FB9b相比其它单克隆抗体具有非常优异的敏感性和特异性。

对比例1

将实施例2所获得的15株纯化单抗中除FB9b以外的其余14株，使用WESTERN BLOT方法，按1:200稀释，进行特异性和灵敏性的检测，结果如表3所示。

表3

根据表3可以看出，单克隆抗体FB9b相比其它单克隆抗体具有非常优异的敏感性和特异性。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 单克隆抗体FB9b在检测GAT转基因农作物中的用途

<130> 8987CAAS_B

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcggatcca tgattgacgt gaacccaat 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcgagctct tatgcgatcc tcttgtaca 29

<210> 4

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgattgacg tgaacccaat taacgctgag gatacttacg agcttagaca tagaattctt 60

agaccaaacc aaccaatcga ggcttgcatg ttcgagtctg atcttcttag aggagctttc 120

catcttggag gttactacgg aggtaagctt atttctattg cttctttcca tcaagctgag 180

cattctgagc ttcaaggaca aaagcaatac caacttaggg gaatggctac tcttgaggga 240

tacagagagc aaaaggctgg ttcttctctt atcaagcatg ccgaggagat cctcaggaag 300

aggggcgccg accttctttg gtgcaacgct aggacttccg cctctggata ctacaagaag 360

cttggcttct ctgagcaggg agaggtgttc gacactccac ctgtgggacc ccatatcctt 420

atgtacaaga ggatcgcata a 455

<210> 3

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ile Asp Val Asn Pro Ile Asn Ala Glu Asp Thr Tyr Glu Leu Arg

1 5 10 15

His Arg Ile Leu Arg Pro Asn Gln Pro Ile Glu Ala Cys Met Phe Glu

20 25 30

Ser Asp Leu Leu Arg Gly Ala Phe His Leu Gly Gly Tyr Tyr Gly Gly

35 40 45

Lys Leu Ile Ser Ile Ala Ser Phe His Gln Ala Glu His Ser Glu Leu

50 55 60

Gln Gly Gln Lys Gln Tyr Gln Leu Arg Gly Met Ala Thr Leu Glu Gly

65 70 75 80

Tyr Arg Glu Gln Lys Ala Gly Ser Ser Leu Ile Lys His Ala Glu Glu

85 90 95

Ile Leu Arg Lys Arg Gly Ala Asp Leu Leu Trp Cys Asn Ala Arg Thr

100 105 110

Ser Ala Ser Gly Tyr Tyr Lys Lys Leu Gly Phe Ser Glu Gln Gly Glu

115 120 125

Val Phe Asp Thr Pro Pro Val Gly Pro His Ile Leu Met Tyr Lys Arg

130 135 140

Ile Ala

145

Claims (7)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12276。

2.一种单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.12276的杂交瘤细胞株产生。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测转GAT的转基因农作物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述农作物为棉花、玉米、水稻或大豆。

5.根据权利要求3或4所述的用途，其中，如果待检测的农作物的全蛋白用权利要求2所述的单克隆抗体进行免疫杂交后出现GAT的阳性条带，则指示待检测的农作物为转GAT的基因农作物。

6.一种检测转GAT的转基因农作物的方法，其中，该方法包括：

S1、从待检测的农作物中提取全蛋白；

S2、对所述全蛋白使用权利要求2所述的单克隆抗体进行免疫杂交；

S3、如果免疫杂交结果中出现GAT的阳性条带，则指示待检测的农作物为转GAT的转基因农作物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述农作物为棉花、玉米、水稻或大豆。

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