KR20170008367A - 글루코스 전이 활성을 가지는 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

글루코스 전이 활성을 가지는 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 화장품, 식품, 식품 첨가제, 건강기능식품 및 의약품에 관한 것이다.

Description

글루코스 전이 활성을 가지는 단백질 및 이의 용도{A protein having activity of glucose transfer and use thereof}
본 발명은 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스 전이 활성을 가지는 단백질; 아스코르브산의 3번 탄소 특이적 글리코실화를 통한, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염의 제조용 조성물; 상기 조성물을 이용하여 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염의 제조방법; 상기 제조방법으로 제조된 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염; 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00001
비타민 C(ascorbic acid)는 항산화제로서 의약품, 식품 및 화장품 소재로 광범위하게 사용되고 있다. 빛, 열의 외부환경과 구리이온 등의 산화물질에 안정성이 취약하여 쉽게 분해되는 비타민 C의 문제점을 개선하고자 개발된 다양한 비타민 C의 유도체들 중, 비타민 C의 2번 탄소에 글루코스 1 분자가 전이된 2-O-D-글루코피라노실-L-아스코르브산(2-O-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid, AA-2G)는 분자량이 작고 인체의 피부와 소화기에 널리 분포하는 아밀라아제(amylase)에 의해 쉽게 흡수되는 장점으로 화장품소재로 주목을 받았다(J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 3309-3316). 그러나 여전히 용매상에서의 안정성이 추가로 개선되어야 한다는 산업계의 요구가 있으며, 제조과정의 복잡성으로 인한 높은 가격은 시장의 확장에 걸림돌이 되고 있다.
일반적으로, 비타민 C 유도체는 화학적 합성 방법 또는 효소를 이용하는 생전환(bioconversion) 방법을 통해 제조될 수 있다. 상기 화학적 방법은 화학약품의 사용으로 인해 인체에 유해한 영향을 미칠 수 있다는 점, 화학약품의 사용에 대해 소비자가 부정적 인식을 가질 수 있다는 점과 효소와 달리 기질 특이성 및 위치 특이성이 없어 원하는 비타민 C 유도체 이외에 다른 화합물이 부산물로 생산된다는 점 등의 문제점이 존재한다. 그러나 이와 달리 효소를 이용하는 생전환 방법은 조작이 간편하며, 효소의 기질 특이성 및 위치 특이성으로 인해 원하는 비타민 C 유도체만을 생산할 수 있어 부산물이 적다는 장점이 있다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은, 비타민 C는 구조적으로 2번 혹은 3번 탄소가 산화에 취약하여 디하이드로아스코르브산(dehydroascorbic acid)을 거쳐 lyxosic acid와 xylosic acid로 비가역적으로 분해되며, 특히 전자이동이 3번 탄소의 수산화기로부터 비롯되므로 3번 탄소에 유도체화하여 안정성을 더욱 강화할 수 있음을 착안하여, 3번 탄소에 글루코스 1 분자 전이된 비타민 C 유도체를 화학적 합성법이 아닌 효소적 반응, 또는 미생물을 이용한 방법으로 제조하는 방법을 개발하고자 하였다.
비타민 C 유도체 및 이의 제조방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 수크로스 및 아스코르브산과 아스코르브산의 3번 탄소 특이적 글루코스 전이 활성을 갖는 단백질을 반응시키면 3번 탄소에 글루코스 1 분자가 전이된, 비타민 C 유도체를 제조할 수 있으며, 상기 제조된 비타민 C 유도체는 안정성이 개선됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스 전이 활성을 가지는 단백질(A); 상기 단백질을 생산하는 미생물 또는 이의 배양물(B); 상기 미생물을 파쇄한 후 수득한 조효소(C); 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, 아스코르브산의 3번 탄소 특이적 글리코실화를 통한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염의 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스 전이 활성을 가지는, 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase) 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 수크로스 및 아스코르브산을 (ii) 상기 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는, 아스코르브산의 3번 탄소가 특이적으로 글리코실화된, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스 전이 활성을 가지는 단백질(A); 상기 단백질을 생산하는 미생물 또는 이의 배양물(B); 상기 미생물을 파쇄한 후 수득한 조효소(C); 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, 아스코르브산의 3번 탄소 특이적 글리코실화를 통한, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염의 제조용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00002

본 발명의 조성물은 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스를 전이할 수 있어, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 효소를 이용한 생전환 방법으로 제조할 수 있으므로, 화학적 방법과 달리 효소의 기질 특이성 및 위치 특이성으로 인해 원하는 비타민 C 유도체만을 생산할 수 있어 부산물이 적으며, 조작이 간편하다는 장점이 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 비타민 C인 아스코르브산의 3번 탄소에 글루코스 1 분자가 전이된 3-O-글루코피라노실-L-아스코르브산 (3-O-glucopyranosyl-L-ascorbic acid)을 의미한다.
본 발명에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물인 3-O-글루코피라노실-L-아스코르브산은 아스코르브산-3-글루코시드 (ascorbic acid-3-glucoside), AA-3G 또는 AA3G와 혼용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물인, 3-O-글루코피라노실-L-아스코르브산은 글루코스가 아스코르브산의 3번 탄소에 글리코시딕 결합을 하는 입체적 위치에 따라, 이소머(isomer)가 존재할 수 있으며, 구체적으로, 3-O-알파-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 (3-O-alpha-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid) 또는 3-O-베타-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 (3-O-beta-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid)일 수 있으며, 더욱 구체적으로 3-O-베타-D-글루코피라노실-L-아스코르브산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
그 예로, 본 발명에서 상기 3-O-베타-D-글루코피라노실-L-아스코르브산은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이다.
[화학식 2]
Figure pat00003

또한, 본 발명에서 상기 3-O-알파-D-글루코피라노실-L-아스코르브산은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물이다.
[화학식 3]
Figure pat00004

이에, 본 발명에서 사용되는 용어인 "화학식 1로 표시되는 화합물"은 화학식 2 또는 3을 모두 포함하는 용어이다.
이와 같은 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물은 빛, 열의 외부환경과 구리 이온 등의 산화물질에 안정성이 취약하여 쉽게 분해되는 비타민 C 및 용매상에서의 안정성이 문제되는 비타민 C의 유도체인 2-O-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 (2-O-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid, AA-2G)보다 안정성이 매우 개선된 것을 특징으로 하는 화합물이나, 이와 같은 상기 화합물은 체내에 존재하는 아밀라아제(amylase)에 의해 아스코르브산과 글루코스로 분해되어 항산화제로서의 본래 효과를 기대할 수 있으므로, 의약품, 식품 및 화장품 등의 산업에 널리 적용될 수 있는 장점을 가진다. 특히, 체내의 아밀라아제에 의해 분해되어 체내 흡수력이 높아지는 장점이 있다. 또한 미백 효과 등으로 인하여 화장품 원료로 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "생리학적으로 허용 가능"은 생리학적으로 허용되고 생물체에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증, 발진 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않으면서, 투여되는 화합물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있는 통상적으로 사용되는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1, 구체적으로 화학식 2 또는 3으로 표시되는 화합물의 생리학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물 및 수화물을 모두 포함하고, 가능한 모든 입체이성체도 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스 전이 활성을 가지는 단백질"은 글리코실 공여자(glycosyl donor)로부터 글리코실 수용체 분자(glycosyl acceptor molecule)인 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스를 전달하는 활성을 지닌 효소를 의미한다. 상기 아스코르브산의 3번 탄소의 위치는 도 1에 나타나 있다.
본 발명에서 상기 단백질은 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스를 전이하는 활성을 가지는 한 제한이 없으나, 구체적으로 당전이 활성(glycosyltransferase)을 가지는 효소일 수 일 수 있으며, 더욱 구체적으로 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase) 활성을 가지는 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 상기 수크로스 포스포릴라아제는 헥소실트랜스퍼라아제(hexosyltransferase)에 속하는 당전이 효소의 일종으로, 기존에는 수크로스 분해에 사용되는 것으로, D-프럭토스(D-fructose) 및 글루코스-1-포스페이트(glucose-1-phosphate)로 수크로스의 분해를 촉매하는 효소이다. 상기 수크로스 포스포릴라아제가 수크로스의 글루코스를 아스코르브산의 3번 탄소에 당전이시킬 수 있음을 본 발명에서 처음으로 규명하였다.
또한, 본 발명에서 상기 수크로스 포스포릴라아제는 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스를 전이하는 활성을 가지는 한 제한이 없으나, 구체적으로 유산균 유래, 더욱 구체적으로 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium sp.) 또는 류코노스톡 속 (Leuconostoc sp.) 유래, 더욱더 구체적으로 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 또는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
또한, 이와 같은 본 발명의 수크로스 포스포릴라아제는 서열번호 1(비피도박테리움 롱검 유래) 또는 서열번호 3(류코노스톡 메센테로이데스 유래)으로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서, 실질적으로 아스코르브산의 3번 탄소에 글루코스를 전이할 수 있는 활성을 갖는 단백질이라면 제한 없이 포함하며, 또한 실질적으로 수크로스 포스포릴라아제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 3에 기재한 아미노산 서열에서 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 구체적으로 본 발명의 수크로스 포스포릴라아제는 서열번호 2(비피도박테리움 롱검 유래) 또는 서열번호 4(류코노스톡 메센테로이데스 유래)로 기재한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열로서, 실질적으로 아스코르브산의 3번 탄소에 글루코스를 전이할 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함하며, 또한 실질적으로 수크로스 포스포릴라아제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이라면, 상기 서열번호 2 또는 서열번호 4에 기재한 폴리뉴클레오티드 서열에서 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
상기 상동성은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench(CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있으나, 상동성을 결정할 수 있는 프로그램이라면 제한 없이 이용할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 3번 탄소 특이적으로 글리코실화된 아스코르브산을 제조함에 있어, 본 발명의 단백질을 생산하는 미생물 또는 이의 배양물; 또는 상기 미생물을 파쇄한 후 수득한 조효소를 이용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스 전이 활성을 가지는 단백질을 생산하는 미생물"은 본 발명의 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스 전이 활성을 가지는 단백질을 내재적으로 생산하거나, 아스코르브산의 3번 탄소 특이적인 글루코스 전이 활성이 내재적 활성에 비해 강화되도록 변형된 미생물을 의미한다.
본 발명에서 상기 "내재적 활성"이란, 본래 미생물이 변형되지 않은 상태에서 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미한다.
또한, 본 발명에서 상기 "내재적 활성에 비해 강화"란, 효소 자체의 활성이 새로 도입되거나 증대되어 본래 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 의미하며, 구체적으로, 활성을 나타내는 유전자의 도입, 내재적 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자 증폭, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실, 당해 유전자 카피수 증가, 외부로부터의 당해 유전자 도입, 발현조절서열의 변형, 특히 프로모터 교체 또는 변형, 또는 유전자 내 돌연변이에 의한 효소 활성의 증가 등에 의해 그 활성이 증가되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스 전이 활성을 가지는 단백질을 내재적으로 생산하는 미생물은 구체적으로, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속, 루코노스톡(Leuconostoc) 속, 또는 이들의 조합일 수 있으며, 더욱 구체적으로 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 루테리(Bifidobacterium reuteri), 비피도박테리움 아톨레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 락티스 ( Bifidobacterium lactis), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 김치(Leuconostoc kimchii), 또는 이들의 조합일 수 있고, 더욱더 구체적으로 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 루테리, 류코노스톡 메센테로이데스, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 아스코르브산의 3번 탄소 특이적인 글루코스 전이 활성이 새로 도입된 미생물은 구체적으로, 에세리키아(Escherichia) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 용어, "배양물"은 본 발명의 미생물을 배양한 다음 수득한 산물을 의미한다. 상기 배양물은 미생물을 포함하는 형태 및 상기 미생물을 포함하는 배양액에서 원심분리 등으로 미생물을 제거한 형태도 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에서 용어 "조효소"는 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스 전이 활성을 가지는 단백질을 생산하는 미생물을 파쇄 후 수득할 수 있는 효소로서, 아스코르브산의 3번 탄소 특이적인 글루코스 전이 활성을 가지는 정제되지 않은 효소 혼합물을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는 수크로스 및 아스코르브산을 수크로스 포스포릴라아제와 반응시켜 생성된 물질을 질량 분석한 결과, 상기 물질의 분자량이 338로 측정되었으며(도 3), 상기 물질의 2-D 핵자기 공명분석을 수행하여 확보한 COSY 스펙트럼(도 5) 및 HMBC 스펙트럼(도 6)을 통하여 아스코르브산의 3번 탄소에 글루코스 1 분자가 전이된, 3-O-베타-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 (3-O-beta-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid)로서 비타민 C 유도체임을 확인하였다. 이 물질의 분자량은 도 3에서 측정한 분자량과 일치하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 아스코르브산-3-글루코시드(AA-3G), 비타민 C(AA) 및 아스코르브산-2-글루코시드(ascorbic acid-2-glucoside, AA-2G)를 사용하여, pH 3, 50℃ 또는 Cu2 +(10mM)의 3가지 조건으로, 90일에 걸쳐 가혹 테스트를 수행한 결과, 본 발명의 아스코르브산-3-글루코시드는 모든 가혹 조건에서 비타민 C 및 아스코르브산-2-글루코시드에 비해 안정성이 매우 개선되었음을 알 수 있었으며, 기존 비타민 C 또는 이의 유도체를 대체할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스 전이 활성을 가지는, 수크로스 포스포릴라아제 단백질을 제공한다.
상기 수크로스 포스포릴라아제는 전술한 바와 같다.
기존의 수크로스 포스포릴라아제 활성을 갖는 단백질은 수크로스 분해 활성을 갖는 것이 알려져 있었으나, 본 발명자들은 아스코르브산의 3번 탄소 특이적 글루코스 전이 활성을 본 발명에서 처음으로 규명하여 새로운 단백질을 제공한다.
상기 수크로스 포스포릴라아제가 수크로스의 글루코스를 아스코르브산의 3번 탄소에 당전이시킬 수 있음을 본 발명에서 처음으로 규명하였다.
본 발명에서 상기 수크로스 포스포릴라아제는 수크로스로부터 글루코스를 떼어내는 반응 및 떼어낸 글루코스를 아스코르브산에 붙이는 반응을 모두 수행하므로, 단일 효소에 의해 아스코르브산의 생전환 반응이 효과적으로 이루어지며, 아스코르브산 3번 탄소에 특이적으로 당전이 되는 장점을 가지므로, 다양한 산업에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스 전이 활성을 가지는, 수크로스 포스포릴라아제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
상기 수크로스 포스포릴라아제 및 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 폴리뉴클레오티드 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 작제물을 말한다. 상기 제조된 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 목적하는 단백질들을 수득할 수 있게 된다.
본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 아그로박테리움 매개 형질전환에 사용할 수 있는 Ti-플라스미드를 포함한다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스, 이중 가닥 식물 바이러스(예, CaMV), 단일가닥 바이러스 또는 게미니 바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터가 또한 사용될 수 있다.
아울러 본 발명의 벡터로서, 핵산 발현 활성화 단백질(예를 들어, B42같은)이 연결된 융합 플라스미드(fusion plasmid, 예를 들어, pJG4-5)가 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 회수되는 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 플라스미드 벡터는 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 융합 플라스미드에는 GST, GFP, His-tag, Myc-tag 등을 태그(tag)로 포함할 수 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 융합 플라스미드가 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 융합 단백질의 제조에 있어, 크로마토그래피 공정을 포함할 수 있으며, 상기 융합 단백질은 특히 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 헥사히스티딘이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼(Novagen, USA)을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 벡터로 삽입하기 위해, 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하여 적당한 벡터 DNA의 제한 부위 또는 클로닝 부위에 삽입하는 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 수크로스 포스포릴라아제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 발명의 벡터는 프로모터 및 본 발명의 핵산 외에 인핸서(enhancer)와 같은 시스 요소(cis element), 스플라이싱 시그널(splicing signal), 폴리 A 추가 시그널(poly A addition signal), 선택 마커(selection marker), 라이보좀 결합 서열(ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택 마커의 예로, 클로람페니콜 저항 핵산, 암피실린 저항 핵산, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 핵산 등이 사용될 수 있으나, 상기 예들에 의해 작동 가능하도록 연결되는 추가적 구성요소가 제한되는 것은 아니다.본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.
상기 형질전환으로 본 발명의 수크로스 포스포릴라아제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터의 일부를 숙주 세포 내에 도입할 수 있는데, 여기서 상기 발현 벡터의 일부란, 숙주 세포 내에 상기 수크로스 포스포릴라아제 단백질의 활성을 부여할 수 있도록 수크로스 포스포릴라아제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 발현 벡터의 부분을 의미한다. 예컨대, 아그로박테리아 매개 형질전환법에서 숙주 세포 내로 전달되는 Ti 플라스미드의 T-DNA를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 수크로스 포스포릴라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 형질전환체 제조에 사용될 수 있는 숙주 세포의 종류는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 동물세포, 식물세포 및 곤충 세포가 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 대장균 균주의 구체적인 예로는 CL41(DE3), BL21 또는 HB101이, 바실러스 서브틸리스 균주의 구체적인 예로는 WB700 또는 LKS87이 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 형질전환세포 또는 생물체의 형태일 수 있다.
본 발명의 프로모터는, 본 발명의 핵산을 숙주에서 발현하도록 하는 한 어떠한 프로모터도 사용될 수 있다. 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터 또는 PR 프로모터 같은 대장균 또는 파아지-유래 프로모터; T7 프로모터 같은 대장균 감염 파아지-유래 프로모터, CaMV35S, MAS 또는 히스톤 프로모터가 사용될 수 있다. 또한 tac 프로모터 같은 인공적으로 변형된 프로모터도 사용될 수 있다.
상기의 방법으로 형질전환된 본 발명의 수크로스 포스포릴라아제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 아스코르브산의 3번 탄소에 대하여 선택적인 글루코스 전이 활성을 가진다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염의 제조용 조성물; 또는 본 발명의 수크로스 포스포릴라아제 단백질에 의해 아스코르브산의 3번 탄소가 특이적으로 글리코실화된, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 제공한다. 구체적으로 본 발명에서 상기 화합물은 상기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 화합물일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염의 제조용 조성물; 또는 본 발명의 수크로스 포스포릴라아제 단백질에 의해 아스코르브산의 3번 탄소가 특이적으로 글리코실화된, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 구체적으로 본 발명에서 상기 화합물은 상기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 화합물일 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 화장품, 식품, 식품첨가제, 건강기능식품, 사료 및 의약품으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 화장품을 제공한다.
본 발명에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염은 항산화 및 미백 효과를 가진 비타민 C의 유도체로서, 안정성이 매우 개선된 화합물이므로, 이를 포함하는 화장품은 매우 안정적인 항산화 활성 및 미백 활성을 가진다.
상기 화장품의 제형은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 향수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 또는 스프레이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장품은 일반 피부 화장품에 배합되는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 무기염류, 색소, 산화방지제, 살균제, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생리학적으로 허용 가능한 담체는 상기 화장품의 제형에 따라 다양하다.
상기 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 식품, 식품첨가제, 사료 또는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염은 항산화 효과를 가진 비타민 C의 유도체로서, 안정성이 매우 개선된 화합물이므로, 이를 포함하는 식품, 식품첨가제 또는 건강기능식품은 매우 안정적인 항산화 활성을 가진다.
또한, 본 발명의 식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 항산화 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.
본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 항산화 효과를 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강기능식품은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품(health food), 건강보조식품의 용어는 호용된다.
구체적으로, 상기 건강기능식품은 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명에서 상기 식품은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품은 식품에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가제(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 식품첨가제로 사용하는 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품의 일 예로 건강음료는, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 글루코스, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 외에 건강음료는 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품은 항산화 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 식품 총중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 사료를 제공한다. 본 발명에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염은 항산화 효과를 가진 비타민 C의 유도체로서, 안정성이 매우 개선된 화합물이므로, 이를 포함하는 사료는 매우 안정적인 항산화 활성을 가진다.
또한, 본 발명의 사료는, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 항산화 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
본 발명에서 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분으로, 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 사료는 당업계의 공지된 다양한 형태의 사료로 제조가능하며, 구체적으로는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공한다. 본 발명에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염은 항산화 효과를 가진 비타민 C의 유도체로서, 안정성이 매우 개선된 화합물이므로, 이를 포함하는 의약품은 매우 안정적인 항산화 활성을 가진다.
상기 의약품은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 의약품은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
상세하게는, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 의약품은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식 1 또는 화화식 2로 표시되는 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염은 1일 0.0001 내지 1000mg/kg으로, 구체적으로는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여할 수 있다.
상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 의약품을 도입하는 것을 의미하며, 상기 의약품의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 의약품을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 의약품은 항산화 효과를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 개체란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미하며, 구체적으로는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 비타민 C 유도체의 제조용 조성물 및 이를 이용한 제조방법은 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스가 전이된 비타민 C 유도체를 효소를 이용한 생전환 방법으로 제조할 수 있으므로, 화학적 방법과 달리 효소의 기질 특이성 및 위치 특이성으로 인해 원하는 비타민 C 유도체만을 생산할 수 있어 부산물이 적으며, 조작이 간편하다는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 제조방법으로 제조된 비타민 C 유도체는 안정성이 효과적으로 증가되고, 피부 및 생체에 존재하는 아밀라아제(amylase)에 의해 분해되어 아스코르브산과 글루코스로 존재하여 항산화제로서의 본래 효과를 기대할 수 있으므로, 의약품, 화장품 및 식품의 기능성 소재로서 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 아스코르브산-3-글루코시드(ascorbic acid-3-glucoside)의 화학식을 나타낸 도이다.
도 2는 수크로스 및 아스코르브산과 수크로스 포스포릴라아제를 반응시킨 반응액의 HPLC 분석 결과를 나타낸 도이다(AA3G; 아스코르브산-3-글루코시드(ascorbic acid-3-glucoside)).
도 3은 실시예 3에서 제조된 아스코르브산-3-글루코시드의 질량분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 실시예 4에서 정제된 아스코르브산-3-글루코시드의 HPLC 분석 결과를 나타낸 도이다(AA-3G; 아스코르브산-3-글루코시드).
도 5는 아스코르브산-3-글루코시드의 2-D 핵자기 공명분석을 수행하여 확보한 COSY 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 6는 아스코르브산-3-글루코시드의 2-D 핵자기 공명분석을 수행하여 확보한 HMBC 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 7은 아스코르브산-3-글루코시드(AA-3G), 비타민 C(AA) 및 아스코르브산-2-글루코시드(AA-2G)의 안정성을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1. 재조합 수크로스 포스포릴라아제 제조
수크로스 포스포릴라아제를 생산하는 것으로 알려진 미생물 중에서, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 또는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)의 수크로스 포스포릴라아제 유전자(서열번호 2 또는 서열번호 4)로 형질전환된 재조합 대장균을 개발하여 재조합 수크로스 포스포릴라아제 생산에 사용하였다. 재조합 대장균을 25 mg/L의 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB 배지에 접종하여 37℃에서 배양하였고, 600nm에서의 흡광도가 약 0.5에 도달하였을 때, IPTG를 0.1mM의 농도로 투입 후 저온 발현하였다. 재조합 수크로스 포스포릴라아제 단백질 발현 여부는 SDS-PAGE로 확인하였고, 상기 단백질을 Ni-NTA법으로 His-tag 정제하였다.
실시예 2. 수크로스 포스포릴라아제에 의한 아스코르브산-3-글루코시드( ascorbic acid-3-glucoside, AA-3G)의 제조
100mM 인산 완충용액(pH 6)에 10%(w/v) 비타민 C(ascorbic acid)와 15%(w/v) 설탕을 용해시킨 후, NaOH로 pH 6으로 조정하였다. 이 용액에 상기 실시예 1에서 제조한 비피도박테리움 롱검 유래 수크로스 포스포릴라아제를 가하여 37℃에서 60시간 동안 효소반응을 수행한 후, 100℃로 가열하여 효소를 실활하고, 여과한 후 반응물의 생성과 분자량을 각각 측정하였다.
반응물을 하기조건으로 HPLC 분석하여 도 2와 같이 원료인 아스코르브산 피크(R.T. 12분)와 생성된 물질의 피크(R.T. 17분)을 확인하였다.
이동상; Acetonitrile 90% : 66.7mM Ammonium acetate = 85 : 15
컬럼; Inertsil®HILIC(GL science)
유속; 0.7ml/min,
검출기; UV detector 260nm
질량분석 시스템은 LCQ MS(Thermo Finnigan사, 미국)를 사용하였으며, 분석모드는 negative로 진행하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 337.07([M-H]-)에 나타나는 이온 피크로부터 생성된 물질의 분자량이 338로 측정되었다.
실시예 3. 아스코르브산-3-글루코시드의 정제
실시예 3에서 제조된 효소반응액으로부터 아스코르브산-3-글루코시드를 순수하게 정제하기 위하여, 상기 반응액을 칼슘타입 컬럼을 통과시켜 미반응 당류를 제거한 후, 다시 hydrophilic diol 컬럼을 통과시켜 미반응 비타민 C와 아스코르브산-3-글루코시드를 분리하였다. 용리액을 하기 조건으로 HPLC 분석하여 도 4와 같이 고순도의 단일 물질임을 확인하였다.
이동상 : Acetonitrile 90% + DW 9.5% + Formic acid 0.5%
Column : Inertsil®HILIC(GL science)
유속 : 0.7ml/min
검출기 : UV detector 240nm
또한, 용리액을 감압 증발하여 획득한 물질의 2-D 핵자기 공명분석을 수행하여 확보한 COSY 스펙트럼(도 5)으로 물질의 proton positioning을 확인할 수 있었으며, 이를 바탕으로 HMBC 스펙트럼(도 6)을 분석한 결과, CI가 H2, H1, H3과 coupling하는 것으로 보아 상기 물질은 아스코르브산의 3번 탄소에 글루코스 1 분자가 전이된, 아스코르브산-3-글루코시드인 3-O-베타-D-글루코피라노실-L-아스코르브산(3-O-beta-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid)로서 비타민 C 유도체임을 확인하였다. 이는 실시예 2에서 분석한 질량과 일치하는 결과이었다.
이와 같은 결과들은 본 발명의 수크로스 포스포릴라아제를 생산하는 미생물의 조효소액 또는 정제된 수크로스 포스포릴라아제가 수크로스를 기질로 하여 아스코르브산-3-글루코시드를 특이적으로 제조할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
실험예 1. 아스코르브산-3-글루코시드의 화학적 안정성
실시예 3에 의해 제조된 아스코르브산-3-글루코시드(AA-3G)의 안정성 평가를 위하여, 아스코르브산-3-글루코시드, 비타민 C(AA, 대정화금) 및 아스코르브산-2-글루코시드(ascorbic acid-2-glucoside, AA-2G, 하야시바라)를 사용하여, 각각 2%(w/v) 수용액을 제조한 후, pH 3, 50℃ 또는 Cu2 +(10mM)의 아래 3가지 조건으로, 90일에 걸쳐 가혹 테스트를 수행하였다.
산성조건 : pH 3으로 적정, 25℃
고온조건 : 50℃에 보관
산화조건 : Cu2 + 10mM 첨가
그 결과, 90일 후 측정된 잔류량을 초기값(100)과 비교하여, 도 7과 같이 나타내었다. 본 발명의 아스코르브산-3-글루코시드는 90일이 경과하더라도 모든 가혹 조건에서 잔류량이 가장 많으며, 시간의 경과에 따라 분해되는 속도가 가장 느림을 확인하였다. 또한, 비타민 C는 고온 및 산화 조건에서 잔류량이 0이나, 이에 반해 아스코르브산-3-글루코시드는 각각 83.4 및 63.8로 매우 많음을 확인하였다. 또한, 아스코르브산-2-글루코시드는 산화조건에서 잔류량이 37.4이나, 이에 반해 아스코르브산-3-글루코시드는 63.8로 매우 높음을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 아스코르브산-3-글루코시드는 모든 가혹 조건에서 비타민 C 및 아스코르브산-2-글루코시드에 비해 안정성이 매우 개선된 비타민 C 유도체임을 확인하여, 다양한 조건에서도 활성을 잃지 않고 항산화제 용도로 화장품, 식품, 식품 첨가제, 건강기능식품 및 의약품에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CHEILJEDANG Corporation <120> A protein having activity of glucose transfer and use thereof <130> KPA150463-KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 508 <212> PRT <213> Bifidobacterium longum sucrose phosphorylase <400> 1 Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp 1 5 10 15 Gly Thr Leu Ser Ser Met Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Phe Asp Gly 20 25 30 Val Tyr Asp Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Thr Pro Phe Asp Gly 35 40 45 Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ile Asp His Thr Lys Val Asp Glu Arg 50 55 60 Leu Gly Ser Trp Asp Asp Val Ala Glu Leu Ser Lys Thr His Asn Ile 65 70 75 80 Met Val Asp Ala Ile Val Asn His Met Ser Trp Glu Ser Lys Gln Phe 85 90 95 Gln Asp Val Leu Glu Lys Gly Glu Glu Ser Glu Tyr Tyr Pro Met Phe 100 105 110 Leu Thr Met Ser Ser Val Phe Pro Asn Gly Ala Thr Glu Glu Asp Leu 115 120 125 Ala Gly Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Thr His Tyr Lys 130 135 140 Phe Ala Gly Lys Thr Arg Leu Val Trp Val Ser Phe Thr Pro Gln Gln 145 150 155 160 Val Asp Ile Asp Thr Asp Ser Ala Lys Gly Trp Glu Tyr Leu Met Ser 165 170 175 Ile Phe Asp Gln Met Ala Ala Ser His Val Arg Tyr Ile Arg Leu Asp 180 185 190 Ala Val Gly Tyr Gly Ala Lys Glu Ala Gly Thr Ser Cys Phe Met Thr 195 200 205 Pro Lys Thr Phe Lys Leu Ile Ser Arg Leu Arg Glu Glu Gly Val Lys 210 215 220 Arg Gly Leu Glu Ile Leu Ile Glu Val His Ser Tyr Tyr Lys Lys Gln 225 230 235 240 Val Glu Ile Ala Ser Lys Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Leu Pro 245 250 255 Pro Leu Leu Leu His Ser Leu Phe Thr Gly His Val Glu Pro Val Ala 260 265 270 His Trp Thr Glu Ile Arg Pro Asn Asn Ala Val Thr Val Leu Asp Thr 275 280 285 His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Ile Gly Ser Asp Gln Leu Asp Arg 290 295 300 Ser Leu Lys Gly Leu Val Pro Asp Glu Asp Val Asp Asn Leu Val Asn 305 310 315 320 Thr Ile His Ala Asn Thr His Gly Glu Ser Gln Ala Ala Thr Gly Ala 325 330 335 Ala Ala Ser Asn Leu Asp Leu Tyr Gln Val Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser 340 345 350 Ala Leu Gly Cys Asn Asp Gln His Tyr Leu Ala Ala Arg Ala Val Gln 355 360 365 Phe Phe Leu Pro Gly Val Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Ala Leu Ala 370 375 380 Gly Arg Asn Asp Met Glu Leu Leu Arg Arg Thr Asn Asn Gly Arg Asp 385 390 395 400 Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser Thr Ala Glu Ile Asp Glu Asn Leu Glu 405 410 415 Arg Pro Val Val Lys Ala Leu Asn Ala Leu Ala Lys Phe Arg Asn Glu 420 425 430 Leu Pro Ala Phe Asp Gly Glu Phe Ser Tyr Glu Val Asp Gly Asp Thr 435 440 445 Ser Ile Thr Phe Arg Trp Thr Ala Ala Asp Gly Thr Ser Thr Ala Ala 450 455 460 Leu Thr Phe Glu Pro Gly Arg Gly Leu Gly Thr Asp Asn Ala Thr Pro 465 470 475 480 Val Ala Ser Leu Ala Trp Ser Asp Ala Ala Gly Asp His Glu Thr Arg 485 490 495 Asp Leu Leu Ala Asn Pro Pro Ile Ala Asp Ile Asp 500 505 <210> 2 <211> 1527 <212> DNA <213> Bifidobacterium longum sucrose phosphorylase <400> 2 atgaaaaaca aagtgcaact catcacatac gccgatcgtc tcggcgatgg cactcttagc 60 tcgatgaccg acatcctgcg cacccgcttc gacggcgtgt atgacggcgt gcatatcctg 120 ccgttcttca ctccgttcga tggtgcggat gcaggcttcg acccgatcga ccataccaaa 180 gtcgacgaac gtctcggcag ctgggacgac gtcgccgaac tctccaagac ccacaacatc 240 atggtcgacg ccatcgtcaa ccacatgagt tgggaatcca agcagttcca agacgtgctt 300 gaaaaaggtg aggaatccga gtattacccg atgttcctga ccatgagctc cgtcttcccg 360 aacggcgcca ccgaagaaga cctggccggc atctaccgcc cgcgcccggg cctgccgttc 420 acccactaca agttcgccgg caagacgcgc ttggtctggg tgagcttcac cccgcagcag 480 gtggacatcg acactgattc cgccaagggt tgggaatacc tgatgtcgat cttcgatcag 540 atggccgcca gccacgtgcg ctacatccgt ctcgacgccg tgggctacgg cgccaaggaa 600 gccggcacca gctgcttcat gacccccaag acctttaagc tcatctcccg tctgcgcgag 660 gagggcgtca agcgcggcct tgaaatcctc atcgaggttc acagctacta caagaagcag 720 gtggaaatcg cctccaaggt ggaccgcgtc tacgatttcg ccctgccgcc gctgcttctg 780 cactcgctgt tcaccggtca cgtcgaaccc gtggcccact ggaccgagat ccgcccgaac 840 aacgccgtca ccgtgctcga tacgcacgat ggcatcggcg tgatcgacat cggctccgac 900 cagctcgacc gctccctcaa gggcctcgtg cccgacgagg acgtcgacaa cctggtcaac 960 accatccatg ccaacaccca cggcgaatcc caggccgcca ccggtgccgc cgcgtccaac 1020 ctcgacctct accaggtcaa ctccacgtac tactcggccc tcggctgcaa 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<213> Leuconostoc mesenteroides sucrose phosphorylase <400> 4 gaattttgat tggatttaat gttggggtct tcgttgaacc aatgtttgtg gcgacttttg 60 ccagcttgat tggtcacggt ggtggcagtg ctgccgcatc agcgtatgct acaattcctt 120 atttgggatt agtactgctc attatcgcaa tcgttacagt tattactagc agaaaacagg 180 agaaataata atggaaattc aaaacaaagc aatgttgatc acttatgctg attcgttggg 240 caaaaactta aaagatgttc atcaagtctt gaaagaagat attggagatg cgattggtgg 300 ggttcatttg ttgcctttct tcccttcaac aggtgatcgc ggttttgcgc cagccgatta 360 tactcgtgtt gatgccgcat ttggtgattg ggcagatgtc gaagcattgg gtgaagaata 420 ctatttgatg tttgacttca tgattaacca tatttctcgt gaatcagtga tgtatcaaga 480 ttttaagaag aatcatgacg attcaaagta taaagatttc tttattcgtt gggaaaagtt 540 ctgggcaaag gccggcgaaa accgtccaac acaagccgat gttgacttaa tttacaagcg 600 taaagataag gcaccaacgc aagaaatcac ttttgatgat ggcacaacag aaaacttgtg 660 gaatactttt ggtgaagaac aaattgacat tgatgttaat tcagccattg ccaaggaatt 720 tattaagaca acccttgaag acatggtaaa acatggtgct aacttgattc gtttggatgc 780 ctttgcgtat gcagttaaaa 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gtgataattt gactcagaac taaactatat ttgaatcaat 1680 ttctaagaac tgtttcctga gggaagcagt ttttttgctg atagtgggaa atattatatt 1740 gacagacaaa gtaatttatt ttatactaaa ctcactgttc aaaagctt 1788

Claims (18)

  1. 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스 전이 활성을 가지는 단백질(A); 상기 단백질을 생산하는 미생물 또는 이의 배양물(B); 상기 미생물을 파쇄한 후 수득한 조효소(C); 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, 아스코르브산의 3번 탄소 특이적 글리코실화를 통한, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염의 제조용 조성물:

    [화학식 1]
    Figure pat00005
    .
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 화합물인, 조성물:

    [화학식 2]
    Figure pat00006

    [화학식 3]
    Figure pat00007
    .
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 당전이 활성(glycosyltransferase)을 가지는 효소인 것인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 당전이 활성 단백질은 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase) 활성을 나타내는 것인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 수크로스 포스포릴라아제는 유산균 유래인 것인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유산균은 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium sp.) 또는 류코노스톡 속 (Leuconostoc sp.)인 것인, 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 수크로스 포스포릴라아제는 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열인 것인, 조성물.
  8. 아스코르브산의 3번 탄소 특이적으로 글루코스 전이 활성을 가지는, 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase) 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 수크로스 포스포릴라아제는 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium sp.) 또는 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 유래인 것인, 단백질.
  10. 제8항에 있어서, 상기 수크로스 포스포릴라아제는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 또는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래인 것인, 단백질.
  11. 제8항에 있어서, 상기 수크로스 포스포릴라아제는 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열인 것인, 단백질.
  12. 제11항의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  14. 제13항의 발현 벡터를 포함하는, 인간을 제외한 형질전환체.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 단백질에 의해 아스코르브산의 3번 탄소가 특이적으로 글리코실화된, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure pat00008
    .
  16. 제15항의 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조성물은 하기 (i) 내지 (vi)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 사용되는 것인, 조성물;
    (i) 화장품,
    (ii) 식품,
    (iii) 식품첨가제,
    (iv) 건강기능식품,
    (v) 사료, 및
    (vi) 의약품.
  18. 제17항에 있어서, 상기 조성물은 항산화 용도를 포함하는 것인, 조성물.
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