CN1668739A - 植物核苷酸糖焦磷酸酶 /磷酸二酯酶( n p p酶 )、及其生产方法、在制造测试装置中的用途、和在生产转基因植物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及NPP酶，它是催化具有磷酸硫酸酯和磷酸二酯键的广泛小分子水解的酶，特别是ADPG(腺苷二磷酸葡萄糖)和APS(腺苷5′磷酸硫酸酯)。将由植物提取物获得的这种酶用于测定装置，从而：(i)以释放的糖－1－磷酸或核苷单磷酸产物(它们都是通过由NPP酶催化的反应形成的)为基础测定核苷－二磷酸糖水平，并(ii)检测硫酸核苷酸，诸如3′－磷酸腺苷5′－磷酸硫酸酯(PAPS)和APS。此外，本发明涉及这种酶的氨基酸序列以及一种完整cDNA和另一种不完整cDNA的核苷酸序列。本发明还涉及过量表达NPP酶且含糖量高、淀粉和细胞壁多糖含量低、且对高盐浓度和高温抵抗力好的转基因植物的生产。
Description
发明所涉及的工业领域
本发明涉及核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(NPP酶)(尤其是稻和大麦的)多种同工型的生产、纯化、和鉴定领域，并且涉及这种酶在核苷酸糖和硫酸核苷酸(sulphonucleotide)水平的测定以及转基因植物的生产中的应用，在所述转基因植物中编码所述NPP酶同工型的基因cDNA过量表达，产生淀粉和细胞壁多糖含量降低且针对盐和温度抵抗力高的植株。
现有技术的描述
淀粉是植物中碳水化合物的主要贮存形式。它在诸如种子(小麦、大麦、玉米、豌豆、等)和块茎(特别是土豆和山药)等器官中大量积累，而且是人类饮食的基本成分。另一方面，淀粉是纸张、化妆品、药品、和食品工业中常常使用的聚合物，而且还用作制造生物可降解塑料和环境友好油漆的基本成分。另一种多糖即纤维素是植物细胞壁的基本成分，构成了这些重要加工过程诸如造纸中的基本原材料。因此，在工业生产的多个领域中优先对这些葡萄糖聚合物合成中所涉及的过程进行了研究。
UDP葡萄糖(UDPG)是纤维素和细胞壁多糖生物合成的基本前体。它还是蛋白质和脂质糖基化相关过程的前体分子。另一方面，ADP葡萄糖(ADPG)是植物储存组织中淀粉生物合成的通用前体。它在细胞中的浓度决定了植物所产生的淀粉的数量和质量。对控制植物细胞中内源ADPG和UDPG水平的因素的考虑基本上围绕着它们的合成酶，诸如ADPG焦磷酸酶、UDPG焦磷酸酶、和蔗糖合酶(Preiss，1988，“Biosynthesis of starchand its regulation”即淀粉的生物合成及其调控，《The Biochemistry ofPlants》即植物生物化学，第14卷，Academic出版社，纽约，第182-249页；Pozueta-Romero，J.、Perata，P.、Akazawa，T.，1999，“Sucrose-starchconversion in heterotrophic tissues”即异养组织中的蔗糖一淀粉转换，Crit.Rev.Plant Sci.，18，489-525)。然而，对于这些核苷酸糖降解机制的研究还很少(Feingold，D.S.，Avigad，G，1980，“Sugar transformation in plants”即植物中的糖转化，《The Biochemistry of Plants》即植物生物化学，第3卷，Stumpf，P.K.和Conn，E.E.编，Academic出版社，纽约，第101-170页)。有迹象表明，细菌和哺乳动物二者都具有能够水解ADPG和UDPG的酶促机制(Melo，A.、Glaser，L.，1966，“Nucleotide diphosphate hexosepyrophosphatases”即核苷酸二磷酸己糖焦磷酸酶，Biochem.Biophys.Res.Commun.，22，524-531；Bessman，M.J.、Frick，D.N.、O′Handley，S.F.，1996，“The MutT proteins or Nudix hydrolases，a family of versatile，widelydistributed housecleaning enzymes”即MutT蛋白或Nudix水解酶，通用的、分布广泛的清理酶家族，J.Biol.Chem.，271，25059-25062；Rodríguez，P.、Bass，S.T.、Hansen，R.G.，1968，“A pyrophosphatase from mammalian tissuesspecific for derivates of ADP”即来自哺乳动物组织且对ADP衍生物特异的焦磷酸酶，Biochim.Biophys.Acta，167，199-201；Gasmi，L.、Cartwright，J.L.、McLennan，A.G.，1999，“Cloning，expression and characterization ofYSA1H，a human adenosine 5′-diphosphosugar pyrophosphatase possessing aMutT motif”即一种具有MutT基元的人腺苷5′-二磷酸糖焦磷酸酶即YSA1H的克隆、表达、和鉴定，Biochem.J.，331-337；Moreno-Bruna，B.、Baroja-Fernández，E.、
F.J.、Bastarrica-Berasategui，A.、Zandueta-Criado，A.、Rodríguez-López，M.、Akazawa，T.、Pozueta-Romero，J.，2001，“Adenosine diphosphate sugar pyrophosphatase prevents glycogenbiosynthesis in Escherichia coli”即腺苷二磷酸糖焦磷酸酶阻止大肠杆菌中的糖原生物合成，Proc.Natl.Acad.Sci.，98，8128-8132)。在植物中，这类活性仅仅在文献中有所描述(Salvucci，M.E.、Crafts-Brandner，S.J.，1995，“Purification and properties of a unique nucleotidepyrophosphatase/phosphodiesterase I that accumulates in soybean leaves inresponse to fruit removal”即响应果实去除而在大豆叶片中积累的独特核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶I的纯化和特性，Plant Physiol.，108，1269-1276；Rodríguez-López，M.、Baroja-Fernández，E.、Zandueta-Criado，A.、Pozueta-Romero，J.，2000，“Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase：a plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis”即腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶：阻止淀粉生物合成的质体磷酸二酯酶，Proc.Natl.Acad.Sci.，97，8705-8710；Baroja-Fernández，E.、Zandueta-Criado，A.、Rodríguez-López，M.、Akazawa，T.、Pozueta-Romero，J.，2000，“Distinctisoforms of ADPglucose pyrophosphatase and ADPglucose pyrophosphorylaseoccur in the suspension-cultured cells of sycamore(Acer pseudoplatanus L.)”即在悬铃木悬浮培养细胞中存在ADP葡萄糖焦磷酸酶和ADP葡萄糖焦磷酸化酶独特同工酶，FEBS Lett.，480，277-282；Rodríguez-López，M.、Baroja-Fernández，E.、Zandueta-Criado，A.、Moreno-Bruna，B.、
F.J.、Akazawa，T.、Pozueta-Romero，J.，2001，“Two isoforms of a nucleotide-sugarpyrophosphatase/phosphodiesterase from barley leaves(Hordeum vulgate L.)are distinct oligomers of HvGLP1，a germin-like protein”即来自大麦叶片(Hordeum vulgare L.)的核苷酸糖焦磷酸酶/磷酸二酯酶的两种同工型是germin样蛋白质HvGLP1的独特寡聚物，FEBS Lett.，490，44-48)。
在多种工业中，淀粉作为增粘剂和胶凝剂是基本必需品。植物细胞中从ADPG开始的淀粉生物合成在称为质体的亚细胞区室中进行。ADPG既在此区室中合成又在其中利用，因此可以通过控制调控ADPG水平的过程来控制淀粉水平。植物中所产生的淀粉的多种应用以直链淀粉和支链淀粉的平衡为基础，它决定了淀粉颗粒的结构以及它在水性悬浮液中的粘性。直链淀粉与支链淀粉的比例取决于植物细胞中的ADPG浓度。迄今为止，还不知道任何方法可以通过控制ADPG的降解来调控植物中所产生淀粉的特性，其实可以提供本发明中描述的酶来实现这一目的。除了作为植物的储存物质以外，当植物处于不遭受水压的环境条件中时，淀粉也在植物细胞中积累。当植物处于高温或高盐浓度的环境条件中时，植物停止积累淀粉并产生大量可溶性糖类而在液泡中积累(Keeling，P.L.、Bacon，P.J.、Holt，D.C.，1993，“Elevated temperature reduces starch deposition in wheatendosperm by reducing the activity of soluble starch synthase”即温度升高通过降低可溶性淀粉合酶的活性而减少了小麦胚乳中的淀粉沉积，Planta，191，342-348；Geigenberger，P.、Geiger，M.、Stitt，M.，1998，“High-temperature perturbation of starch synthesis is attributable to inhibitionof ADP-glucose pyrophosphorylase by decreased levels ofglycerate-3-phosphate in growing potato tubers”即高温对淀粉合成的干扰可归于通过降低生长中土豆块茎中的甘油酸-3-磷酸水平而对ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的抑制，Plant Physiol.，117，1307-1316)。除了碳水化合物代谢对于水压的这些适应性改变以外，植物的硫代谢也经历了变化，避免了由腺苷5′-磷酸硫酸酯(APS)和3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸酯(PAPS)的转化所产生的腺苷-5′-磷酸(PAP)的积累(Gil-Mascarell，R.、López-Coronado，J.M.、Bellés，J.M.、Serrano，R.、Rodríguez，P.L.，1999，“The ArabidopsisHAL2-like gene family includes a novel sodium-sensitive phosphatase”即拟南芥属HAL2样基因家族包括一种新的钠敏感性磷酸酶，Plant J.，17，373-383)。根据这些观察结果，有可能是负责ADPG、APS、和PAPS水解的酶促反应负责植物对于水压条件的适应过程。
层析和放射线学技术是用于测定动物、植物、或微生物来源的粗提取物中诸如硫酸核苷酸(APS和PAPS等；Yoshida，H.、Fukui，S.、Yamashina，I.、Tanaka，T.、Sakano，T.、Usui，T.、Shimotsuji，T.、Yabuuchi，H.、Owada，M.、Kitagawa，T.，1982，“Elevation of nucleotide pyrophosphatase activity inskin fibroblasts from patients with Lowe′s syndrome”即来自Lowe氏综合症患者的皮肤成纤维细胞中核苷酸焦磷酸酶活性的升高，Biochem.Biophys.Res.Commun.，107，1144-1150)和核苷二磷酸糖(诸如葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、果糖、和半乳糖醛酸的衍生物)等核苷酸水平的有力工具。尽管应用非常普遍，但是它们需要在设备和测试样品的制备上进行相当可观的投资。不幸的是，除了少数例外之外(Puhakainen，E.、Saarinen，A.、Hnninen，O.，1977，“UDPglucuronic acid pyrophosphataseassay with the aid of alkaline phosphatase”借助碱性磷酸酶进行的UDP葡萄糖醛酸焦磷酸酶测定法，Acta Chem.Scandinavica，B31，125-129)，缺乏能够以简单且有效的方式检测并定量核苷酸糖和硫酸核苷酸的候选方法。血液、肌肉、肾、和肝中某些上述核苷酸糖的水平分析在临床实践中是重要的(Cortes，P.、Dumler，F.、Sastry，K.S.、Verghese，C.P.、Levin，N.W.，1982，“Effects of early diabetes on uridine diphosphosugar synthesis in the ratrenal cortex”即早期糖尿病对大鼠肾皮质中尿苷二磷酸糖合成的影响，Kidney Int.，21，676-682；Spiro，M.J.，1984，“Effect of diabetes on the sugarnucleotides in several tissues of the rat”即糖尿病对大鼠数种组织中糖核苷酸的影响，Diabetologia，26，70-75；Sochor，M.、Kunjara，S.、Baquer，N.Z.、McLean，P.，1991，“Regulation of glucose metabolism in livers and kidneysof NOD mice”即NOD小鼠的肝和肾中的葡萄糖代谢调控，Diabetes，40，1467-1471)。例如，由于UDPG是动物中糖原的前体，因此分析这种分子的水平对于研究和诊断与碳水化合物代谢有关的疾病诸如多种类型的糖尿病而言是重要的。另一方面，测定尿液中的PAPS水平对于诊断诸如Lowe氏综合症或抗磷脂综合征等严重疾病而言是必需的(Yoshida，H.、Fukui，S.、Yamashina，I.、Tanaka，T.、Sakano，T.、Usui，T.、Shimotsuji，T.、Yabuuchi，H.、Owada，M.、Kitagawa，T.，1982，“Elevation of nucleotidepyrophosphatase activity in skin fibroblasts from patients with Lowe′ssyndrome”即来自Lowe氏综合症患者的皮肤成纤维细胞中核苷酸焦磷酸酶活性的升高，Biochem.Biophys.Res.Commun.，107，1144-1150；Amigo，M.C.、García-Torres，T.，2000，“Morphology of vascular，renal，and heartlesions in the antiphospholipid syndrome：relationship to pathogenesis”即抗磷脂综合症中血管、肾脏、和心脏损伤的形态学：与发病机理的关系，Curr.Rheumatol.Rep.，2000，2，262-270)。显然，简单且廉价的分析样品中这些物质的水平可能是层析技术的有利候选方法。
本发明描述了我们命名为NPP酶的植物来源酶产品的纯化和应用，这种酶催化具有磷酸二酯键或磷酸硫酸酯键的小分子水解，特别是作为优选底物的ADPG和APS。在第一优先权(ES 200201647)中，根据那时能够获得的实验数据，发明者暂时将分离的酶产品命名为NSPP酶，但是，稍后，在第二优先权(ES 200202673)中，根据积累的资料，目前它的命名改为NPP酶。
本发明的植物酶在能够获得它的植物组织中具有多种同工型(Baroja-Fernández，E.、Zandueta-Criado，A.、Rodríguez-López，M.、Akazawa，T.、Pozueta-Romero，J.，2000，“Distinct isoforms of ADPglucosepyrophosphatase and ADPglucose pyrophosphorylase occur in thesuspension-cultured cells of sycamore(Acer pseudoplatanus L.)”即悬铃木(Acer pseudoplatanus L.)悬浮培养细胞中存在ADP葡萄糖焦磷酸酶和ADP葡萄糖焦磷酸化酶的独特同工型，FEBS Lett.，480，277-282)。最易于提取的同工型是可溶性的，而其它微粒状同工型则发现紧密粘附于淀粉颗粒上。
在本发明中，我们成功的纯化了大小约为70kDa的大麦和水稻NPP酶的多种可溶性同工型并进行了部分测序。根据这些序列，我们能够分离编码NPP酶的cDNA。在将它们的序列与能够在数据库中获得的序列比较后，发现水稻和大麦的NPP酶与PPD1具有同源性，PPD1是黄羽扇豆(Lupinus luteus)的一种核苷酸磷酸酶/磷酸二酯酶，与本发明的NPP酶相反，它的最佳底物是二磷酸核苷和三磷酸核苷，而不水解核苷酸糖(Olczak，M.、Olczak，T.，2002，“Diphosphonucleotidephosphatase/phosphodiesterase from yellow lupin(Lupinus luteus L.)belongsto a novel group of specific metallophosphatases”即来自黄羽扇豆(Lupinusluteus L.)的二磷酸核苷酸磷酸酶/磷酸二酯酶属于一类新的特异性金属磷酸酶，FEBS Lett.，519，159-163)。此外，它与编码诸如拟南芥(Arabidopsis)和鹰嘴豆(chickpea)等双子叶植物的未知或可能蛋白质的其它序列具有同源性。首先，本发明的一个目的是来自大麦(Hordeum vulgare)和水稻(Oryza sativa)植物组织、基本纯的NPP酶多种可溶性70kDa同工型的生产、鉴定、和测序。另一个目的是生成编码NPP酶的完整cDNA并将它们与可以在数据库中获得的序列比较。设计由可溶性NPP酶的cDNA衍生的构建物，意欲用于生产具有高NPP酶活性的转基因植物，在这些转基因植物中淀粉以及细胞壁多糖的含量和品质相对于对照植物有所改变，稍后详述。所述植物不积累渗透毒性标记物PAP，因而它们比对照植物更能抵抗高盐浓度。
本发明的另一个目的是用于制备以具有NPP酶活性的酶产品的使用为基础的用于测定核苷二磷酸糖和硫酸核苷酸的装置或试剂盒的方法。
发明详述
可以由任何物种的任何植物组织获得并纯化具有依照本发明的NPP酶酶活性的植物制品，即任何单子叶植物或双子叶植物，例如大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、水稻(Oryza sativa)、胡椒(Capsicum annuum)、番茄(Lycopersicon sculentum)、土豆(Solanumtuberosum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、或悬铃木(Acer pseudoplatanusL.)，列举的只是不同科和属的众多代表性范例中的一些。
NPP酶可溶性同工型的生产和纯化
用于获得并纯化本发明中所描述的可溶性植物NPP酶的通用方法包括下列步骤，其中容许基本上不改变提取和纯化方法大体框架的轻微变化。NPP酶在嫩叶中尤其丰富，而在诸如种子胚乳和块茎等储存组织中几乎没有，因此建议使用嫩叶来提取NPP酶。
1.用提取缓冲液将植物组织匀浆；
2.滤过四层Miracloth(在制作干酪时用作乳清滤布)；
3.将过滤后的匀浆液超速离心；
4.用硫酸铵沉淀上清液中的蛋白质；
5.将沉淀重悬于pH 4.2的缓冲液；
6.在60和65℃之间的温度加热至少15分钟；
7.离心；
8.通过凝胶过滤层析浓缩并纯化上清液中的蛋白质。通过将样品与诸如UDPG或ADPG等底物一起温育并检测G1P和AMP产量来检测NPP酶的酶活性；
9.将NPP酶施加到伴刀豆球蛋白A型亲和层析柱上，这指示NPP酶是糖基化的；
10.使用pH范围3.5-9.5的PAG板(Amersham/Pharmacia)在Multiphor II系统中等电聚焦。可以以下列方式之一容易的测定NPP酶的位置：
a)洗脱蛋白质，随后在存在ADPG或UDPG的条件下检测G1P的产量；
b)将凝胶与二对硝基苯磷酸(bis-paranitrophenylphoshate，二-PNPP)溶液一起温育并在Nishimura和Beevers描述(Nishimura，M.、Beevers，H.，1978，Plant Physiol.，62，44-48)的碱性溶液中显影。
11.通过在诸如NuPAGE 4-12％Bis-Tris(Novex，圣迭戈，加利福尼亚州)等中性或弱酸性缓冲液系统中进行的电泳在变性凝胶中分离蛋白质。可以以下列方式之一容易的确定NPP酶的位置：
a)洗脱蛋白质，随后在存在ADPG的条件下检测G1P的产量；
b)将凝胶与二PNPP溶液在溶液中温育并在碱性溶液中显影。
具有NPP酶酶活性的制品的鉴定
通过下列功能标准的方式鉴定通过上述方法或其它等同方法获得的酶产品：
·它是催化ADPG水解成等摩尔量的G1P和AMP的焦磷酸酶/磷酸二酯酶(Rodríguez-López，M.、Baroja-Fernández，E.、Zandueta-Criado，A.、Pozueta-Romero，J.，2000，“Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase：a plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis”即腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶：阻止淀粉生物合成的质体磷酸二酯酶，Proc.Natl.Acad.Sci.，97，8705-8710)；
·除了ADPG以外，它识别具有磷酸二酯键和磷酸硫酸酯键的小分子，诸如UDPG、GDP-葡萄糖、GDP-甘露糖、ADP-甘露糖、二-PNPP、PAPS、和APS以及其它相似结构；
·它不水解具有磷酸单酯键的分子，诸如G1P、G6P、AMP、3-磷酸甘油酸、和其它相似分子。它也不水解环状AMP或长链核酸，诸如DNA或RNA，它们是文献中描述的其它磷酸二酯酶的底物；
·与细菌和动物中描述的ADP-糖焦磷酸酶(EC 3.6.1.13、EC 3.6.1.21)相反而且与其它磷酸二酯酶(EC 3.1.4)相反，它对离子的需求降低了，因此它能够在缺乏镁离子、锰离子、钴离子、和其它二价阳离子的条件下起作用；
·与细菌和动物的核苷二磷酸糖的焦磷酸酶相反，NPP酶水解二PNPP；
·它受磷酸化分子抑制，诸如AMP、ADP、ATP、3-磷酸甘油酸、正磷酸、无机焦磷酸、和具有相似特征的其它分子；
·它被钼酸盐和砷酸盐强烈抑制；
·它抵抗离子型洗涤剂，诸如SDS(十二烷基硫酸钠)；
·它抵抗广泛的蛋白酶的作用，诸如蛋白酶K和Pronase(Boehringer)；
·它的活性不受典型的磷酸二酯酶抑制剂作用的影响，诸如β-巯基乙醇、EDTA、还原性半胱氨酸、抗坏血酸、和其它还原剂和螯合剂；
·它对弱碱性pH敏感，而且在pH4-7.5之间非常稳定。
编码可溶性NPP酶的完整cDNA的生成
将纯化的多种NPP酶的一些已知内部氨基酸序列与数据库中存在的其它序列比较。这一分析的结果使得我们有可能设计两种引物，用于通过RT-PCR获得编码水稻和大麦NPP酶的cDNA。将获得的cDNA克隆到pGEM-T载体中，并作为探针用于在水稻嫩叶cDNA文库中搜寻完整cDNA。将获得的完整cDNA导入质粒pSK Bluescript(Stratagene)的EcoRV限制性位点，产生构建物pNPP(图1)，它在宿主细菌XL1 Blue中扩增。这种细菌的菌株于2002年10月15日保藏于位于巴伦西亚大学研究大楼的西班牙典型培养物收藏中心(Campus of Burjasot，46100 Burjasot，巴伦西亚)，保藏号CECT 5739。
过量表达可溶性NPP酶的cDNA的转基因植物的生产
用酶HindIII、T4 DNA聚合酶、和XbaI依次消化pNPP。将释放的片段(包含NPP酶的cDNA)克隆到经过酶NcoI、T4 DNA聚合酶、和XbaI依次消化的质粒pVT′BSP中。通过这种方法，我们获得了命名为p35SNPPNOS的质粒，它具有组成型启动子35S、NPP酶的cDNA、和Nos终止子。
为了能够将这一构建物通过根癌农杆菌转移到植物基因组中，必需将其事先克隆到二元质粒中。为此，用酶HindIII、T4 DNA聚合酶、和XbaI依次消化p35SNPPNOS，并克隆到事先经过酶HindIII、T4 DNA聚合酶、和XbaI依次消化的二元质粒pBIN20中(Hennegan，K.P.、Danna，K.J.，“pBIN20：An improved binary vector for Agrobacterium-mediatedtransformation”即pBIN20：用于由农杆菌介导的转化的改进型二元载体，Plant Mol.Biol.Rep.，16，129-131)。将由此获得的质粒命名为pBIN20-35S-NPP(图2)。在大肠杆菌(XL1 blue)中扩增后，将pBIN20-35S-NPP导入根癌农杆菌，用于转化诸如番茄、烟草、土豆等物种(Horsch，R.B.、Fry，J.E.、Hoffmann，N.L.、Eichholtz，D.、Rogers，S.G、Fraley，R.T.，1985，“A simple and general method for transferring genes intoplants”即用于将基因转移到植物中的简单且通用方法，Science，277，1229-1231)。根癌农杆菌菌株于2003年5月16日保藏于位于巴伦西亚大学的研究大楼中的西班牙典型培养物收藏中心(Campus of Burjasot，46100Burjasot，巴伦西亚，西班牙)，保藏号CECT 5799。
用于测定核苷二磷酸糖和硫酸核苷酸的装置(分析试剂盒)的制备
设计用于测定诸如核苷二磷酸糖和硫酸核苷酸等核苷酸的试剂盒以具有NPP酶活性的制品对小分子的磷酸二酯键和磷酸硫酸酯键的作用为基础，所述小分子水解后产生易于检测并定量的其它分子。
两种最适于制作这些试剂盒的策略开始于用依照本发明的酶即NPP酶水解核苷二磷酸糖，产生等摩尔量的糖-1-磷酸和相应的核苷单磷酸。由此时开始，正如下文详细说明的，可以考虑以测定所产生的糖-1-磷酸和核苷单磷酸数量为基础测定样品中最初存在的核苷酸数量：
·在糖-1-磷酸是葡萄糖-1-磷酸(G1P)的情况中，将所述化合物进行酶磷酸葡萄糖变位酶的作用，产生葡萄糖-6-磷酸，继而可以与NAD+一起通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用而经历偶联反应，获得6-磷酸葡萄糖酸和NADH，它是易于测定的。
·在糖-1-磷酸不是G1P的情况中，通过对在用碱性磷酸酶水解这些化合物后所产生的正磷酸(Pi)的比色测定来进行糖-1-磷酸和核苷单磷酸的测定。或者，作为偶联酶，有可能使用5′-核苷酸酶，它将核苷单磷酸水解成等摩尔量的相应核苷和Pi。在这两种情况中释放的Pi都易于通过已知的比色法定量。
用于测定诸如APS等的硫酸核苷酸水平的策略以这些核苷酸的水解及随后产生的等摩尔量的硫酸酯为基础，它们可以通过比浊法或比悬法测定(Srbo，B.，1987，“Sulfate：turbidimetric and nephelometric methods”即硫酸盐：比浊法或比悬法，Methods Enzymol.，143，3-6)。
对植物NPP酶特异的多克隆抗体的生成
在SDS-PAGE中分离2毫克纯NPP酶。洗脱后，将它与完全弗氏佐剂(以50/50的比例)混合，然后平均分成三等份，每隔两周将其中一份注射到兔子体内。在第一次注射后大约三个月，提取兔子血清，其中含有对AGPP酶特异的多克隆抗体。
通过Western印迹鉴定制品
通过SDS-PAGE分离来自野生植株和转基因植株的蛋白质样品，所述转基因植株过量表达编码水稻NPP酶的基因。然后将它们转移到硝酸纤维素膜上，并依照文献中描述的方法使用特异性抗NPP酶抗体检测NPP酶(Towbin，H.、Staehelin，T.、Gordon，J.，1979，“Electrophoretic transfer ofproteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets：procedures andsome applications”通过电泳将蛋白质由聚丙稀酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜：流程及一些应用，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，4350-4354)。
本发明应用的实施例
下文展示的实施例详细描述了由大麦嫩叶生产并纯化可溶性NPP酶的方法。相同方法在根据各种情况略微改变后可以应用于任何其它物种。其它实施例描述了NPP酶用于生产用于测定核苷酸糖和硫酸核苷酸的分析试剂盒的应用。另一个实施例显示了编码可溶性NPP酶的完整cDNA的生成。
实施例1：由大麦叶片获得的可溶性NPP酶的提取和纯化
除非另外说明，否则所有步骤都在4℃进行。使用Waring搅切器将植物组织(900g)在2900ml抽提缓冲液(Mes 50mM pH 6、EDTA 1mM、DTT 2mM)中匀浆。将匀浆液滤过四层Miracloth，以100,000g离心30分钟，并将上清液调成50％硫酸铵。将以30,000g(20℃)离心30分钟后获得的沉淀重悬于2900ml Mes 50mM pH 4.2，然后在62℃水浴中加热20分钟，在冰中冷却，并以30,000g离心20分钟。使用50％硫酸铵沉淀上清液中的蛋白质，并重悬于5.7ml Mes 50mM pH 6中。然后将样品在用Mes pH 6和NaCl 150mM预平衡的Superdex 200柱(Pharmacia LKBBiotechnology，Uppsala，瑞典)中进行凝胶过滤。合并具有NPP酶活性的级分，浓缩，并在天然凝胶中进行等电聚焦，将蛋白质纯化至同质(图3)。
实施例2：酶促测试
除非另外说明，否则所有的酶促反应均在37℃进行。使用Sowokinos(Sowokinos，1981，Plant Physiol.，68，924-929)描述的G1P分光光度法测定分两步进行NPP酶活性的测定。反应混合物含有Hepes 50mM pH7、指定数量的ADPG、和蛋白质提取物，总体积50微升。所有的测定都参照ADPG空白进行。温育20分钟后，通过在干浴中煮沸2分钟来终止反应。将混合物以20,000g离心5分钟，并回收上清液。第二步，通过分光光度法测定300微升混合物中的G1P，所述混合物含有Hepes 50mM pH7、EDTA 1mM、MgCl2 2mM、KCl 15mM、NAD+0.6mM、来自肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的1个单位磷酸葡萄糖变位酶和1个单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、和30微升步骤1产生的上清液。温育20分钟后，使用Multiskan EX分光光度计(Labsystems)在340nm处监测NADH产量。步骤1中缺乏ADPG条件下任何蛋白质提取物产生的NADH数量忽略不计。
通过凝胶过滤并绘制分配系数(Kav)相对于下列蛋白质标样的分子量的对数的图确定NPP酶的天然分子量：牛甲状腺球蛋白(670kDa)、牛γ-球蛋白(158kDa)、卵清蛋白(45kDa)、肌红蛋白(17kDa)、和维生素B-12(1.3kDa)。使用Bio-Rad制造的试剂和γ-球蛋白作为标准通过Bradford氏法测定蛋白质含量。
下面的表1显示了来自大麦叶片的可溶性NPP酶的纯化。单位(U)定义为每分钟催化1μmol产物产生的酶量。
表1
| 总体积(mL) | 总蛋白质(mg) | 总活性(mU) | 比活(mU/mg蛋白质) | 纯化(倍数) | |
| 上清液100,000xg | 2900 | 24 286 | 1 195 000 | 50 | - |
| pH 4.2/62℃ | 2900 | 778 | 1 067 000 | 1370 | 28 |
| Superdex 200 | 86 | 164 | 300 | 1820 | 37 |
| 等电聚焦 | 14 | 0.6 | 21 870 | 36 455 | 740 |
实施例3：所获得的具有酶活性的制品的鉴定
由此获得的具有NPP酶活性的制品具有下列特征：
·它催化ADPG水解产生等摩尔量的G1P和AMP；
·除了ADPG之外，NPP酶识别具有磷酸二酯键的其它小分子，诸如UDPG、GDP-葡萄糖、二-PNPP、其它相似结构。它还催化具有磷酸硫酸酯键的小分子诸如APS水解，释放等摩尔量的硫酸酯和AMP(表2-以相对于ADPG的百分比表示的Vmax-和表3)；
·它不水解具有磷酸单酯键的分子，诸如G1P、G6P、AMP、3-磷酸甘油酸酯、和其它相似分子。它也不水解环状AMP或核酸诸如DNA或RNA，它们是文献中所述其它磷酸二酯酶的底物；
·它对离子的需求降低了，因此NPP酶能够在缺乏镁、锰、钴、和其它二价阳离子的条件下起作用，这些离子是文献中所述其它磷酸二酯酶发挥功能的必需效应物；
·与细菌和动物的核苷二磷酸糖的焦磷酸酶相反，NPP酶水解二PNPP；
·它受到磷酸化分子抑制，诸如AMP、ADP、ATP、3-磷酸甘油酸酯、正磷酸、无机焦磷酸、和具有相似特征的其它磷酸化分子；
·它受到钼酸盐和砷酸盐强烈抑制；
·它抵抗离子型洗涤剂，诸如SDS(十二烷基硫酸钠)；
·它抵抗广泛蛋白酶的作用，诸如蛋白酶K和Pronase(Boehringer)；
·它的活性不受典型的磷酸二酯酶抑制剂的作用的影响，诸如β-巯基乙醇、EDTA、还原型半胱氨酸、抗坏血酸、和其它还原剂和鳌合剂；
·它对弱碱性pH敏感，而且在4至7.5之间的pH下非常稳定。这一特征使得NPP酶成为与文献中所述大多数磷酸二酯酶完全不同的酶，因为后者在弱碱性pH条件下稳定且有活性；
·它抵抗65℃的温度达30分钟，而且能够以下列数据表征：
·通过凝胶过滤测量的表观分子量为70kDa和270kDa左右，由此检测它具有70kDa的单体形式和另一种同聚物形式；
·反应的Keq′为110；
·标准自由能的增加(ΔG′)为-2.9kcal/mol；
·它是糖蛋白，因为它被伴刀豆球蛋白柱保持；
·纯化蛋白质在变性凝胶中的表观分子量为70kDa左右；
·获得的大麦NPP酶的氨基酸序列是：
-N末端：SEQ ID NO：1
-内部序列(用胰蛋白酶部分水解NPP酶后获得的)：SEQ ID NO：2、3、4、5、和6
·获得的水稻NPP酶的氨基酸序列是：
-N末端：SEQ ID NO：7
-内部序列(用胰蛋白酶部分水解NPP酶后获得的)：SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16和17
表2：来自大麦叶片的NPP酶的动力学参数和底物特异性
| 底物 | Km(mM) | Vmax |
| ADPGATPADPAPSPAPSPAPADP甘露糖GDP甘露糖CDPGUDPGADP核糖NAD+NADP+二-PNPPPNPP己糖单磷酸核苷酸单磷酸 | 0.53.53.50.5-n.q.0.40.42.82.12.42.5n.q.0.30.5n.q.n.q. | 1004040160-n.q.3030114114100100n.q.100100n.q.n.q. |
表3：来自水稻叶片的NPP酶的动力学参数和底物特异性
| 底物 | Km(mM) | Vmax(μmol min-1(mg蛋白质)-1) | kcat/Km(M-1s-1) |
| ADP-葡萄糖ADP-核糖UDP-葡萄糖CDP-葡萄糖GDP-葡萄糖GDP-甘露糖TDP-葡萄糖二-PNPPATPADPAMPPPiAPS | 0.601.431.470.920.930.800.601.302.064.33n.d.-3.04 | 183317242107119129106191356385n.d.176282 | 3.50×1052.48×1051.93×1051.93×1051.48×1051.90×1052.06×1051.71×1052.03×1051.00×105--1.09×105 |
实施例4：获得编码水稻可溶性NPP酶的完整cDNA和编码大麦可溶性
NPP酶的不完整cDNA
对于水稻NPP酶内部序列的了解使得我们有可能设计在5′-3′方向上为SEQ ID NO：18和19的引物。使用此引物，通过RT-PCR常规方法扩增cDNA，并作为探针用于由来自水稻和大麦嫩叶的cDNA文库获得cDNA。结果是，获得了水稻NPP酶的完整cDNA，并插入在宿主细菌XL1 Blue中扩增的pSK Bluescript质粒(Stratagene)。水稻NPP酶的完整cDNA序列是SEQ ID NO：20，而推导的氨基酸序列是SEQ ID NO：21。同样，获得了大麦NPP酶的不完整cDNA(SEQ ID NO：22)，而其推导的氨基酸序列是SEQ ID NO：23。为此，排除了由SEQ ID NO：24描述的引物。在与可以由数据库获得的序列比较后，发现水稻NPP酶与PPD1(编号AJ421009)具有60％的同源性，PPD1是水解核苷二磷酸和核苷三磷酸但不能水解核苷酸糖的一种黄羽扇豆核苷酸磷酸酶/磷酸二酯酶(Olczak，M.、Olczak，T.，2002，“Diphosphonucleotide phosphatase/phosphodiesterase from yellowlupin(Lupinus luteus L.)belongs to a novel group of specificmetallophosphases”即来自黄羽扇豆(Lupinus luteus L.)的二磷酸核苷酸磷酸酶/磷酸二酯酶属于一类新的特异性金属磷酸酶，FEBS Lett.，519，159-163)。此外，如图4所示，对双子叶植物诸如拟南芥(编号AY099570)和鹰嘴豆(编号AJ271664)中编码与水稻NPP酶具有高同源性的未知或可能蛋白质的cDNA进行测序。
实施例5：来自多种植物的具有NPP酶活性的制品
NPP酶广泛分布于植物中，因而可以由任何植物获得具有NPP酶活性的酶产品(product)，尤其是由幼小植物的组织诸如叶和根。例如，下面的表4显示了在多种单子叶植物和双子叶植物中获得的活性(mU/mg蛋白质)。
表4
| 比活(mU/mg蛋白质) | |
| (+ADPG) | |
| 单子叶植物 | |
| 大麦(Hordeum vulgare)叶片 | 113.7±3.5 |
| 小麦(Triticum aestivum)叶片 | 22.4±2.5 |
| 双子叶植物 | |
| 野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶片 | 5.2±0.6 |
| 胡椒(Capsicum annuum)叶片 | 5.0±0.6 |
| 番茄(Lycopersicon sculentum)叶片 | 5.6±0.5 |
| 悬铃木(Acer pseudoplatanus)细胞培养物 | 16.5±7.2 |
实施例6：用于测定葡萄糖-核苷二磷酸的酶试剂盒的制备
为了测定葡萄糖-核苷二磷酸诸如ADPG、UDPG、CDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖、和TMP-葡萄糖，制备包含下列成分的试剂盒：
a.NPP酶
b.NAD
c.磷酸葡萄糖变位酶(PGM)
d.G6P脱氢酶(G6PDH)
e.缓冲液
测试样品中存在的葡萄糖-核苷二磷酸数量的测定以依照下列偶联反应生成的NADH的分光光度法测定为基础：
(测试样品) NAD+ NADH
可以通过制备如下组成的混合液(1ml)来测试样品中的NDP-葡萄糖数量：
·测试样品
·1个单位NPP酶
·1个单位PGM
·1个单位G6PDH
·0.6mM NAD
·缓冲液Mes或Hepes 50mM pH 7
·水(补充至1ml)
于37℃温育20分钟，并观察样品在340nm处吸光度的变化。可以使用不含NPP酶的混合液作为阴性对照。
实施例7：用于测定葡萄糖以外其它糖类的核苷二磷酸的酶试剂盒的制备
制备用于测定下列核苷二磷酸糖类的试剂盒：
·核糖-核苷二磷酸(ADP-核糖、GDP-核糖、UDP-核糖、CDP-核糖、或TDP-核糖)
·甘露糖-核苷二磷酸(ADP-甘露糖、GDP-甘露糖、TDP-甘露糖、UDP-甘露糖、或CDP-甘露糖)
·半乳糖-核苷二磷酸(ADP-半乳糖、GDP-半乳糖、UDP-半乳糖、或CDP-半乳糖)
·葡糖醛酸-核苷二磷酸(GDP-葡糖醛酸、UDP-葡糖醛酸、ADP-葡糖醛酸、CDP-葡糖醛酸、或TDP-葡糖醛酸)
·果糖-核苷二磷酸(GDP-果糖、ADP-果糖、CDP-果糖、UDP-果糖、或TDP-果糖)
·半乳糖醛酸-核苷二磷酸(UDP-半乳糖醛酸、GDP-半乳糖醛酸、CDP-半乳糖醛酸、TDP-半乳糖醛酸、或ADP-半乳糖醛酸)
试剂盒具有下列成分：
a.NPP酶
b.5′-核苷酸酶(或者备选地，碱性磷酸酶)
c.缓冲液
测试样品中存在的核苷二磷酸糖的量的测定以依照下列偶联酶促反应释放的正磷酸比色测定为基础：
(测试样品)
依照文献中和市场上能够获得的任何众多比色法测定Pi。
可以通过制备由如下各项组成的混合液(1ml)来测定测试样品中的NDP-糖数量：
·测试样品
·1个单位NPP酶
·1个单位5′-核苷酸酶(或者备选地，1个单位碱性磷酸酶)
·缓冲液Mes或Hepes 50mM pH 7.5
·水(补充至1ml)
于37℃温育20分钟，并依照常规方法测定释放的Pi产量。可以使用不含NPP酶的混合液作为阴性对照。
实施例8：用于测定PAPS和APS的酶试剂盒的制备
用于测定硫酸核苷酸诸如PAPS或APS水平的策略以依照下列反应的浊度或悬度测定为基础：
可以通过制备由如下各项组成的混合液(1ml)来测定测试样品中的硫酸核苷酸数量：
·测试样品
·1个单位NPP酶
·缓冲液Mes或Hepes 50mM pH 7.0
·水(补充至1ml)
于37℃温育20分钟，并依照常规方法测定释放的硫酸酯的产量。可以使用不含NPP酶的混合液作为阴性对照。
实施例9：过量表达NPP的烟草、土豆、和番茄转基因植物的生产
使用根癌农杆菌CECT 5799菌株，我们获得了在分析的所有器官(根、叶、果实、和茎)中具有高NPP酶活性的烟草(Nicotiana tabacum)、土豆(Solanum tuberosum)、和番茄(Lycopersicon sculentum)植株(图5)。这些植株大量积累受到针对NPP酶获得的多克隆抗体特异识别的蛋白质(图6)，并且具有下列特征：
1.淀粉和细胞壁碳水化合物含量低(依照以文献(Frehner，M.、Pozueta-Romero，J.、Akazawa，T.，1990，“Enzyme sets of glycolysis，gluconeogenesis，and oxidative pentose phosphate pathway are not complete innongreen highly purified amyloplasts of sycamore cell suspension cultures”即悬铃木细胞悬浮培养物的非绿色高度纯化造粉体中的糖酵解、葡糖异生、和氧化性戊糖磷酸途径的酶集合不完整，Plant Physiol.，94，538-544)中所述商品化试剂盒为基础的测量技术)；
2.可溶性糖类诸如蔗糖、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖、和果糖含量高；
3.组织中积累的PAP水平降低，相对于未转化植株而言，赋予了针对生长培养基中高浓度氯化钠的极大抵抗力；
4.抵抗高温。
附图描述
图1：pNPP的示意图
图2 A-C：pBIN20-35S-NPP的生成
图3：在阴性(negative)凝胶中通过等电聚焦(IEF)分离70kDa NPP酶：
a)将蛋白质通过IEF分开后的染色与它们的等电点(图顶部显示的数值)对应起来。阴极位于右边，而阳极位于左边。将含有1个单位AGPP酶的部分纯化样品施加到pH范围3.5-9的Ampholine PAG板上；
b)对应NPP酶活性图谱。测量由IEF凝胶洗脱的每个级分的NPP酶活性；
c)将由IEF凝胶洗脱的每个级分进行SDS-PAGE，然后用考马斯蓝染色。箭头指示富集70kDa蛋白质的级分，并且证明是酶促活性最高。
图4：由编码水稻NPP酶的cDNA推导的氨基酸序列与由编码黄羽扇豆PPD1(AJ421009)和拟南芥(AY099570)和鹰嘴豆(AJ271664)未知蛋白质的cDNA推导的那些氨基酸序列之间的氨基酸序列比较。
图5：野生型土豆(WT)和9种过量表达水稻NPP的转基因系中的ADP葡萄糖水解活性。
图6：5种过量表达水稻NPP的土豆转基因系的Western印迹。每条泳道加载50微克蛋白质，并进行SDS-PAGE。转移到硝酸纤维素滤膜上之后，使用在兔中获得的对NPP特异的多克隆抗体特异性免疫装饰NPP。
序列表
<110>纳瓦拉公立大学
<120>″植物核苷酸糖焦磷酸酶/磷酸二酯酶(NPP酶)及其生产方法、在制造测试装置中的用途、和在生成转基因植物中的应用″
<130>
<160>
<210>1
<211>16
<212>肽
<213>大麦cv.Scarlett
<220>
<223>可溶性NPP酶的N-末端
<400>
Ala Ala Val Arg Ala Ser Pro Asp Leu Leu Gly Ser Arg Gly Glu
5 10 15
Asp
<210>2
<211>11
<212>肽
<213>大麦cv.Scarlett
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列
<220>变体
<222>6
<223>/Nota＝Lys
<220>变体
<222>9
<223>/Nota＝Ile
<220>变体
<222>10
<223>/Nota＝Lys
<400>
Ala Ser Tyr Pro Gly Gln Thr Ser Leu Gln Arg
5 10
<210>3
<211>11
<212>肽
<213>大麦cv.Scarlett
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列
<220>变体
<222>9
<223>/Nota＝Met
<400>
His Ala Pro Ala Asp Thr Val Thr Phe Gly Arg
5 10
<210>4
<211>5
<212>肽
<213>大麦cv.Scarlett
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列
<400>
Ala Pro Pro Tyr Pro
5
<210>5
<211>8
<212>肽
<213>大麦cv.Scarlett
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列
<400>
Ala Trp Val Thr Val Glu Phe Lys
5
<210>6
<211>8
<212>肽
<213>大麦cv.Scarlett
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列
<220>变体
<222>1
<223>/Nota＝Lys
<220>变体
<222>3
<223>/Nota＝Ile
<220>变体
<222>6
<223>/Nota＝Ile
<400>
Gln Ser Leu Glu Gly Leu Trp Arg
5
<210>7
<211>15
<212>肽
<213>稻
<220>
<223>可溶性NPP酶的N-末端
<400>
Gly Ser Ala Phe Val Ser Ala Thr Pro Ala Leu Leu Gly Asp Gln
5 10 15
<210>8
<211>23
<212>肽
<213>稻
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列(MS/MS)
<400>
Phe Gln Leu Leu Asn Gln Arg Tyr Asp Phe Ser Phe Ala Leu Glu
5 10 15
Thr Gly Gly Leu Glu Asn Pro Lys
20
<210>9
<211>肽
<212>稻
<213>
<220>可溶性MPP酶的胰蛋白酶序列(MS/MS)
<223>
<400>
Leu Val Ala Val Ser Glu Ala Leu Ser Phe Lys
5 10
<210>10
<211>10
<212>肽
<213>稻
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列(Edman)
<400>
Leu Ala Gln Gly Lys Ser Tyr Asp Glu Met
5 10
<210>11
<211>10
<212>肽
<213>稻
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列(MS/MS)
<400>
Thr Ala Ala Gly Thr Leu Thr Phe Asn Arg
5 10
<210>12
<211>11
<212>肽
<213>稻
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列(MS/MS)
<400>
Asp Pro Gly Phe Leu His Thr Ala Phe Leu Arg
5 10
<210>13
<211>12
<212>肽
<213>稻
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列(MS/MS)
<400>
Ala Pro Asp Phe Pro Gly Gln Asn Ser Leu Gln Arg
5 10
<210>14
<211>9
<212>肽
<213>稻
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列(MS/MS)
<400>
Ile Ile Val Phe Gly Asp Met Gly Lys
5
<210>15
<211>12
<212>肽
<213>稻
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列(MS/MS)
<400>
Asp Trp Pro Asn Thr Gly Gly Phe Phe Asp Val Lys
5 10
<210>16
<211>11
<212>肽
<213>稻
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列(MS/MS)
<400>
Phe Ile Glu Gln Cys Leu Ser Thr Val Asp Arg
5 10
<210>17
<211>9
<212>肽
<213>稻
<220>
<223>可溶性NPP酶的胰蛋白酶序列(MS/MS)
<400>
Val Tyr Asp Ser Phe Tyr Val Glu Arg
5
<210>18
<211>18
<212>ADN
<213>稻
<220>
<223>NPP酶51区域的引物
<400>
ggcgttgctc ggcgacca
<210>19
<211>19
<212>ADN
<213>稻
<220>
<223>NPP酶3′区域的引物
<400>
gaggcgagcg tggtgggga
<210>20
<211>2186
<212>ADN
<213>稻
<220>
<223>稻NPP酶的完整cDNA
<400>
ttt gaa tta gct agc tgt aga aag cta gcc 30
atg gtt agt agg aag aga gga gga gga gga 60
ggc gtg gca atg gcg gtg gcg atg ctg ctg 90
gcg gcg gcg agc gcg tcg cgg ccg tcg tcg 120
tcg ctg gaa ggg ttc cag ccg ctg tcg aag 150
atc gcc gtc cac aag gcc acc gtc gac ctc 180
cac ggc tcc gcg ttc gtc agc gcc acg ccg 210
gcg ttg ctc ggc gac cag gga gaa gac aca 240
gag tgg gtc acg gtg aaa tac ggc tgg gca 270
aac cct tcc gct gac gac tgg att gct gtc 300
ttc tct ccg gcc gat ttc atc tcg ggt tct 330
tgc cct aat cct tcc aga tac ccg gat gag 360
ccg ctg ctc tgc act gca cca ata aag tat 390
caa ttc gca aac tac tcg gcg aac tac gtg 420
tac tgg ggc aag ggc agc atc cgg ttc cag 450
ctc atc aac cag cgc tac gac ttc tcc ttc 480
gcc ctg ttc acc ggc ggc ctg gaa aac cct 510
aag ctg gtg gcg gtg tcg gag gcg ata tcg 540
ttc aag aac ccc aag gcg ccg gtg tac cct 570
cgg ctg gcg cag ggc aag tcg tac gac gag 600
atg acc gtc aca tgg acc agc ggc tac gac 630
atc agc gag gcg tac ccg ttc gtc gag tgg 660
ggc atg gtc gtc gcc ggc gcc gcc gct cca 690
acc cgc acc gcc gcc ggc acg ctc acc ttc 720
aac cgc ggc agc atg tgc ggt gac ccg gac 750
cgc act gtt ggg tgg aga gac ccc ggg ttc 780
atc cac aca gct ttc ctg aga gac ctg tgg 810
ccc aac aaa gag tac tac tac aag att ggg 840
cat gaa ctt tct gac gga tca att gtc tgg 870
ggc aag caa tac act ttc cgg gcg cca ccc 900
ttc cct ggc cag aac tcg ctg caa cgc atc 930
atc gtc ttc ggc gac atg ggc aag gcg gag 960
aga gac gga tca aac gag ttc gcc aac tac 990
cag cca gga tct ctg aac acg acg gac agg 1020
ctg gtc gag gat ctg gac aac tac gac att 1050
gtc ttc cac atc ggt gat ctt ccg tac gcc 1080
aat ggc tac atc tcc cag tgg gac cag ttc 1110
acc gcc cag gtc gcc ccc atc acc gcc aag 1140
aag ccc tac atg att gca agc ggt aac cat 1170
gag agg gac tgg ccc aac acc gga ggg ttc 1200
ttc gac gtc aag gac tcc ggc ggc gag tgc 1230
ggc gtt ccg gca gag acc atg tac tac tac 1260
ccg gcc gag aat cga gcc aac ttc tgg tac 1290
aag gtg gac tac ggg atg ttc cgg ttc tgc 1320
atc gcg gac tcg gag cac gac tgg agg gag 1350
ggt acc gac cag tac aag ttc atc gag cag 1380
tgc ctg tcg acg gtg gac cgg aag cac cag 1410
ccg tgg ctc atc ttc gcg gcg cac cgc gtg 1440
ctg ggc tac tcc tcc aac tgg tgg tac gcc 1470
gac cag ggc tcc ttc gag gag ccc gaa ggg 1500
agg gag agc ctg cag cgg ctg tgg cag cgc 1530
cac cgc gtc gac gtc gcc ttc ttc ggc cac 1560
gtc cac aac tac gag cgg acg tgc ccg atg 1590
tac cag agc cag tgc gtc tcc ggc gag agg 1620
cgc cgc tac tcc ggc acc atg aac ggc acc 1650
atc ttc gtc gtc gcc ggc ggc ggc ggg agc 1680
cac ctc tcg gac tac acc tcg gcg atc ccc 1710
aag tgg agc gtt ttc agg gac cgg gac ttc 1740
ggg ttc gtc aag ctc acc gcg ttc aac cac 1770
tcg tcg ctg ctg ttc gag tac aag aag agc 1800
agc gat ggg aag gtg tat gac tcc ttc acc 1830
gtg gag agg gat tac cgc gac gtg ctc agc 1860
tgc gtg cac gac agc tgc ctc ccc acc acg 1890
ctc gcc tcc tga tga atg aaa caa ggg aaa 1920
gga tca tta tta gga tgc atg agt tga tgc 1950
ctc atc gtc aaa atg ctg gca gct gag aaa 1980
gag tga tcg gtc ggt cga tcg agt tgg gtt 2010
tta ttt ttt ttc ttc ttc ttc aac cat ttc 2040
gat cag gtg tgg tag tgg tcg atc gct tgg 2070
ctc gat cgt gtt tct ctt cct cat gga tgg 2100
tga tgt tgt gca ata aaa ttg ctt agc tgc 2130
tcg ggc aca aat gtc taa aaa aaa aaa aaa 2160
aaa aaa aaa aaa aaa aaa aaa aaa aa 2186
<210>21
<211>623
<212>肽
<213>稻
<220>
<223>稻NPP酶的氨基酸序列
<400>
Met Val Ser Arg Lys Arg Gly Gly Gly Gly Gly Val Ala Met Ala Val Ala Met Leu Leu
5 10 15 20
Ala Ala Ala Ser Ala Ser Arg Pro Ser Ser Ser Leu Glu Gly Phe Gln Pro Leu Ser Lys
25 30 35 40
Ile Ala Val His Lys Ala Thr Val Asp Leu His Gly Ser Ala Phe Val Ser Ala Thr Pro
45 50 55 60
Ala Leu Leu Gly Asp Gln Gly Glu Asp Thr Glu Trp Val Thr Val Lys Tyr Gly Trp Ala
65 70 75 80
Asn Pro Ser Ala Asp Asp Trp Ile Ala Val Phe Ser Pro Ala Asp Phe Ile Ser Gly Ser
85 90 95 100
Cys Pro Asn Pro Ser Arg Tyr Pro Asp Glu Pro Leu Leu Cys Thr Ala Pro Ile Lys Tyr
105 110 115 120
Gln Phe Ala Asn Tyr Ser Ala Asn Tyr Val Tyr Trp Gly Lys Gly Ser Ile Arg Phe Gln
125 130 135 140
Leu Ile Asn Gln Arg Tyr Asp Phe Ser Phe Ala Leu Phe Thr Gly Gly Leu Glu Asn Pro
145 150 155 160
Lys Leu Val Ala Val Ser Glu Ala Ile Ser Phe Lys Asn Pro Lys Ala Pro Val Tyr Pro
165 170 175 180
Arg Leu Ala Gln Gly Lys Ser Tyr Asp Glu Met Thr Val Thr Trp Thr Ser Gly Tyr Asp
185 190 195 200
Ile Ser Glu Ala Tyr Pro Phe Val Glu Trp Gly Met Val Val Ala Gly Ala Ala Ala Pro
205 210 215 220
Thr Arg Thr Ala Ala Gly Thr Leu Thr Phe Asn Arg Gly Ser Met Cys Gly Asp Pro Asp
225 230 235 240
Arg Thr Val Gly Trp Arg Asp Pro Gly Phe Ile His Thr Ala Phe Leu Arg Asp Leu Trp
245 250 255 260
Pro Asn Lys Glu Tyr Tyr Tyr Lys Ile Gly His Glu Leu Ser Asp Gly Ser Ile Val Trp
265 270 275 280
Gly Lys Gln Tyr Thr Phe Arg Ala Pro Pro Phe Pro Gly Gln Asn Ser Leu Gln Arg Ile
285 290 295 300
Ile Val Phe Gly Asp Met Gly Lys Ala Glu Arg Asp Gly Ser Asn Glu Phe Ala Asn Tyr
305 310 315 320
Gln Pro Gly Ser Leu Asn Thr Thr Asp Arg Leu Val Glu Asp Leu Asp Asn Tyr Asp Ile
325 330 335 340
Val Phe His Ile Gly Asp Leu Pro Tyr Ala Asn Gly Tyr Ile Ser Gln Trp Asp Gln Phe
345 350 355 360
Thr Ala Gln Val Ala Pro Ile Thr Ala Lys Lys Pro Tyr Met Ile Ala Ser Gly Asn His
365 370 375 380
Glu Arg Asp Trp Pro Asn Thr Gly Gly Phe Phe Asp Val Lys Asp Ser Gly Gly Glu Cys
385 390 395 400
Gly Val Pro Ala Glu Thr Met Tyr Tyr Tyr Pro Ala Glu Asn Arg Ala Asn Phe Trp Tyr
405 410 415 420
Lys Val Asp Tyr Gly Met Phe Arg Phe Cys Ile Ala Asp Ser Glu His Asp Trp Arg Glu
425 430 435 440
Gly Thr Asp Gln Tyr Lys Phe Ile Glu Gln Cys Leu Ser Thr Val Asp Arg Lys His Gln
445 450 455 460
Pro Trp Leu Ile Phe Ala Ala His Arg Val Leu Gly Tyr Ser Ser Asn Trp Trp Tyr Ala
465 470 475 480
Asp Gln Gly Ser Phe Glu Glu Pro Glu Gly Arg Glu Ser Leu Gln Arg Leu Trp Gln Arg
485 490 495 500
His Arg Val Asp Val Ala Phe Phe Gly His Val His Asn Tyr Glu Arg Thr Cys Pro Met
505 510 515 520
Tyr Gln Ser Gln Cys Val Ser Gly Glu Arg Arg Arg Tyr Ser Gly Thr Met Asn Gly Thr
525 530 535 540
Ile Phe Val Val Ala Gly Gly Gly Gly Ser His Leu Ser Asp Tyr Thr Ser Ala Ile Pro
545 550 555 560
Lys Trp Ser Val Phe Arg Asp Arg Asp Phe Gly Phe Val Lys Leu Thr Ala Phe Asn His
565 570 575 580
Ser Ser Leu Leu Phe Glu Tyr Lys Lys Ser Ser Asp Gly Lys Val Tyr Asp Ser Phe Thr
585 590 595 600
Val Glu Arg Asp Tyr Arg Asp Val Leu Ser Cys Val His Asp Ser Cys Leu Pro Thr Thr
605 610 615 620
Leu Ala Ser
<210>22
<211>1268
<212>ADN
<213>Hordeum vulgare cv.Scarlett
<220>
<223>
<400>大麦NPP酶的不完全cDNA
ctc cga cgg aag cgt ggt gtg ggc caa gcc 30
cta cac ttt ccg ggc acc gcc aac ccc cgg 60
gca gaa ctc gct gca gcg tat cat cgt ctt 90
cgg tga cat ggg aaa ggc gga gag gga cgg 120
atc aaa cga gtt cgc caa cta cca gcc ggg 150
gtc gct caa cac gac gga cag gct gat tga 180
aga tct gga caa cta cga cat cgt ctt cca 210
cat cgg cga cat gcc cta cgc caa cgg gta 240
cct ctc cca gtg gga cca gtt cac cgc aca 270
ggt cgc ccc cat cag cgc caa gaa acc cta 300
cat ggt tgc aag cgg caa cca cga gag gga 330
ctg gcc caa cac cgg cgg gtt ctt cga cgt 360
caa gga ctc cgg cgg cga atg cgg cgt gcc 390
ggc cga gac cat gta cta cta ccc cgc cga 420
aaa cag ggc aaa ctt ctg gta caa ggt gga 450
cta cgg gat gtt ccg gtt ctg cgt ggg gga 480
ctc gga gca cga ctg gag gga ggg cac ccc 510
gca gta caa gtt cat cga gga gtg cct gtc 540
gac ggt gga ccg gaa gca cca gcc gtg gct 570
cat ctt cac ggc gca ccg ggt gct ggg cta 600
ctc ctc caa ctc gtg gta cgc cga cca ggg 630
ctc ctt cga gga gcc cga ggg acg gga gag 660
cct gca gaa gct gtg gca gcg cta ccg cgt 690
cga cat cgc ctc ctt cgg cca cgt cca caa 720
cta cga gcg cac atg ccc gct cta cca gag 750
cca gtg cgt caa cgc cga caa gac cca cta 780
ctc ggg cac cat gaa cgg cac cat ctt cgt 810
cgt cgc cgg cgg ggg cgg cag cca cct gtc 840
gtc cta cac cac cgc cat ccc caa gtg gag 870
cat att cag gga cca tga cta cgg gtt cac 900
caa gct cac cgc att caa cca ctc ctc gct 930
tct ctt cga gta cat gaa gag cag cga cgg 960
caa ggt cta cga ctc ctt cac cat cca cag 990
gga tta ccg cga cgt gct cag ctg cgt gca 1020
cga cag ctg ctt ccc cac cac gct cgc tag 1050
cta gct cat atc gtc cgg ccg tca tgt caa 1080
tgt aat gga ggg tca tcc atc caa taa aat 1110
tgt ggg cat gtg ttg agt aat aaa att ggt 1140
cag ctg cac aat tta tat gtg cta gta aaa 1170
aga tca tgc aag agg tgg gtg tat gct cgt 1200
tat ata tgc ttt gta act cct tca tgt cat 1230
att att atg ggt taa taa aaa cat cct tta 1260
tta aaa aa 1268
<210>23
<211>350
<212>肽
<213>Hordeum vulgare cv.Scarlett
<220>
<223>从大麦NPP酶的CDNA推断的氨基酸序列
<400>
Ser Asp Gly Ser Val Val Trp Ala Lys Pro Tyr Thr Phe Arg Ala Pro Pro Thr Pro Gly
5 10 15 20
Gln Asn Ser Leu Gln Arg Ile Ile Val Phe Gly Asp Met Gly Lys Ala Glu Arg Asp Gly
25 30 35 40
Ser Asn Glu Phe Ala Asn Tyr Gln Pro Gly Ser Leu Asn Thr Thr Asp Arg Leu Ile Glu
45 50 55 60
Asp Leu Asp Asn Tyr Asp Ile Val Phe His Ile Gly Asp Met Pro Tyr Ala Asn Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Ser Gln Trp Asp Gln Phe Thr Ala Gln Val Ala Pro Ile Ser Ala Lys Lys Pro Tyr
85 90 95 100
Met Val Ala Ser Gly Asn His Glu Arg Asp Trp Pro Asn Thr Gly Gly Phe Phe Asp Val
105 110 115 120
Lys Asp Ser Gly Gly Glu Cys Gly Val Pro Ala Glu Thr Met Tyr Tyr Tyr Pro Ala Glu
125 130 135 140
Asn Arg Ala Asn Phe Trp Tyr Lys Val Asp Tyr Gly Met Phe Arg Phe Cys Val Gly Asp
145 150 155 160
Ser Glu His Asp Trp Arg Glu Gly Thr Pro Gln Tyr Lys Phe Ile Glu Glu Cys Leu Ser
165 170 175 180
Thr Val Asp Arg Lys His Gln Pro Trp Leu Ile Phe Thr Ala His Arg Val Leu Gly Tyr
185 190 195 200
Ser Ser Asn Ser Trp Tyr Ala Asp Gln Gly Ser Phe Glu Glu Pro Glu Gly Arg Glu Ser
205 210 215 220
Leu Gln Lys Leu Trp Gln Arg Tyr Arg Val Asp Ile Ala Ser Phe Gly His Val His Asn
225 230 235 240
Tyr Glu Arg Thr Cys Pro Leu Tyr Gln Ser Gln Cys Val Asn Ala Asp Lys Thr His Tyr
245 250 255 260
Ser Gly Thr Met Asn Gly Thr Ile Phe Val Val Ala Gly Gly Gly Gly Ser His Leu Ser
265 270 275 280
Ser Tyr Thr Thr Ala Ile Pro Lys Trp Ser Ile Phe Arg Asp His Asp Tyr Gly Phe Thr
285 290 295 300
Lys Leu Thr Ala Phe Asn His Ser Ser Leu Leu Phe Glu Tyr Met Lys Ser Ser Asp Gly
305 310 315 320
Lys Val Tyr Asp Ser Phe Thr Ile His Arg Asp Tyr Arg Asp Val Leu Ser Cys Val His
325 330 335 340
Asp Ser Cys Phe Pro Thr Thr Leu Ala Ser
345 350
<210>24
<211>39
<212>ADN
<213>大麦cv.Scarlett
<220>
<223>可溶性NPP酶5′区域的引物
<400>
gcagcagtac gagcatcacc agatctacta gcatcacga 39
Claims (33)
1.用于获得其可溶性同工型具有核苷酸糖焦磷酸酶/磷酸二酯酶活性(NPP酶)的植物来源的酶产品的方法，其特征在于对植物来源材料进行使用缓冲液对蛋白质级分的提取，将提取液过滤，随后是通过连续离心和沉淀的纯化方法，其中调整介质的pH和离子强度这两项，优选包括将蛋白质加热至60℃以上并在冰中冷却，并且通过凝胶过滤、等电聚焦、变性-凝胶电泳、或其它等同纯化方法纯化由植物组织提取的蛋白质。
2.权利要求1中要求的方法，其包括下列步骤：(1)将植物组织在提取缓冲液中匀浆，该缓冲液为type Mex 50mM pH6、EDTA 1mM、DTT 2mM；(2)过滤；(3)以100,000g超速离心；(4)在硫酸铵中沉淀上清液中的蛋白质；(5)将沉淀重悬于pH4.2的缓冲液；(6)于60至65℃之间的温度加热至少15分钟，随后在冰中冷却；(7)以30,000g离心；(8)通过在硫酸铵中沉淀并在pH6下重悬浮来浓缩上清液中的蛋白质；并(9)通过凝胶过滤层析、等电聚焦、和变性-凝胶电泳进行纯化。
3.通过权利要求1和2中要求的方法可获得的植物来源的酶产品，称为NPP酶，其特征在于它是催化核苷酸糖在等摩尔条件下水解成糖-磷酸和相应的核苷单磷酸、不水解具有磷酸单酯键的分子、能够水解二-PNPP、受到钼酸盐、砷酸盐、和磷酸化分子抑制的磷酸二酯酶，它的活性不受作为磷酸二酯酶抑制剂的还原剂和螯合剂的影响，它对弱碱性pH敏感而且在4至7.5之间的pH下非常稳定，能够糖基化，这使之抵抗SDS型离子洗涤剂和蛋白酶作用，并且除核苷酸糖以外识别具有磷酸二酯和磷酸硫酸酯键的其它小分子。
4.依照权利要求3的酶产品，其特征在于它特别不水解G1P、G6P、AMP、3-磷酸甘油酸、AMPc、或核酸。
5.权利要求3和4之任一项中要求的酶产品，其特征在于它不需要特别是二价阳离子，镁、锰、或钴作为效应物。
6.权利要求3至5之任一项中要求的酶产品，其特征在于它受正磷酸酯、无机焦磷酸酯、和磷酸酯的抑制，特别是诸如ANP、ADP、ATP、或3-磷酸甘油酯。
7.权利要求3至6之任一项中要求的酶产品，其特征在于其活性特别是不受β-巯基乙醇、EDTA、还原型半胱氨酸、或抗坏血酸的影响。
8.权利要求3至7之任一项中要求的酶产品，其特征在于它特别抵抗蛋白酶K或Pronase。
9.权利要求3至8之任一项中要求的酶产品，其特征在于它特别识别ADPG、UDPG、GDP-葡萄糖、ADP-甘露糖、APS、PAPS、或二-PNPP作为底物，优选的底物是ADPG。
10.权利要求3至9之任一项中要求的酶产品，其特征在于它抵抗65℃的温度达30分钟，而且它的单体和同聚物同工型所具有的通过凝胶过滤测定的表观分子量分别是70和270kDa左右，并且展示反应的Keq′是110，其ΔG′是-2.9kcal/mol，且其对ADPG的Km是0.5mmol。
11.权利要求3至10之任一项中要求的酶产品，其特征在于它是从任何植物物种中分离的。
12.权利要求3至11之任一项中要求的酶产品，其特征在于其序列包含至少一种由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、和SEQ ID NO：17表示的多肽片段。
13.权利要求3至12之任一项中要求的酶产品，其特征在于它是由编码包含至少一种权利要求12的多肽序列的蛋白质的cDNA获得的。
14.由SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：24表示的引物。
15.由SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：24表示的引物以及来自水稻或大麦叶片的mRNA用于通过RT-PCR获得cDNA的应用，所述cDNA在作为探针用于水稻和大麦叶片cDNA文库后容许分离其序列分别由SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22表示的cDNA。
16.由SEQ ID NO：20表示的编码具有NPP酶活性的酶产品的cDNA。
17.由SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：24表示的引物以及来自大麦叶片的mRNA用于通过RT-PCR获得cDNA的应用，所述cDNA在作为探针用于大麦叶片cDNA文库后容许分离其序列由SEQ ID NO：22表示的cDNA。
18.由SEQ ID NO：22表示的编码具有NPP酶活性的酶产品的cDNA。
19.酶产品，其特征在于它包含由SEQ ID NO：21表示的具有NPP酶活性的序列。
20.酶产品，其特征在于它包含由SEQ ID NO：23表示的具有NPP酶活性的序列。
21.权利要求3至13和19或20的酶产品在制备用于测定核苷二磷酸糖的测定装置和/或组合物中的应用。
22.用于测定核苷二磷酸糖的测定装置，其特征在于它包括权利要求3至13和19或20的酶产品，使得测定以由NPP酶催化的反应过程中释放的糖-1-磷酸为基础。
23.权利要求22中要求的测定装置，其特征在于测定以释放的葡萄糖-1-磷酸为基础，将其提交给酶磷酸葡萄糖变位酶以生成葡萄糖-6-磷酸，继而将其与NAD+和NADP+一起提交给通过酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用的偶联反应，获得6-磷酸葡萄糖和NADH或NADPH，二者可以通过常规分光光度学方法或一些其它种类的方法测定。
24.用于测定核苷二磷酸糖的测定装置，其特征在于它包括权利要求3至13和19或20的酶产品，使得测定以由NPP酶催化的反应过程中产生的核苷单磷酸为基础。
25.权利要求24中要求的测定装置，其特征在于测定以核苷单磷酸为基础，它能够通过酶诸如5′-核苷酸酶的作用在相应碱基以外释放正磷酸，正磷酸易于通过常规方法例如比色法测定。
26.权利要求22至25之任一项中要求的测定装置，其特征在于测定以糖-1-磷酸和核苷-单磷酸能够通过酶诸如碱性磷酸酶或5′-核苷酸酶的作用释放正磷酸的事实为基础，正磷酸易于通过常规方法例如比色法测定。
27.权利要求3至13和19或20的酶产品在制备用于测定3′-磷酸-腺苷5′-磷酸硫酸酯(PAPS)和腺苷5′磷酸硫酸酯(APS)的存在的测定装置和/或组合物中的应用。
28.权利要求14的引物和权利要求16或18的cDNA在生产表达或过量表达编码NPP酶的cDNA的转基因植物中的应用。
29.生产表达或过量表达编码NPP酶的基因的转基因植物的方法，其特征在于使用包含质粒的转化载体，所述质粒包含所述NPP酶基因的由SEQ ID NO：19表示的cDNA。
30.生产表达或过量表达编码NPP酶的基因的转基因植物的方法，其特征在于使用包含质粒的转化载体，所述质粒包含所述NPP酶基因的由SEQ ID NO：22表示的cDNA。
31.权利要求29或30中要求的生产转基因植物的方法，其特征在于转化载体是根癌农杆菌CECT 5799。
32.可以通过权利要求29至31中要求的方法获得的转基因植物，其特征在于它们表达或过量表达权利要求3至13和19或20的酶产品，具有降低的淀粉和/或细胞壁多糖含量，而且抵抗高温和高盐。
33.用于测定硫酸核苷酸的测定装置，其特征在于它包括权利要求3至13和19或20的酶产品，使得测定以释放的硫酸酯为基础。
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