CN116987684B - 蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备甘油葡糖苷中的应用 - Google Patents
蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备甘油葡糖苷中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116987684B CN116987684B CN202310993438.3A CN202310993438A CN116987684B CN 116987684 B CN116987684 B CN 116987684B CN 202310993438 A CN202310993438 A CN 202310993438A CN 116987684 B CN116987684 B CN 116987684B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- sucrose phosphorylase
- mutant
- sucrose
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108020000005 Sucrose phosphorylase Proteins 0.000 title claims abstract description 155
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 31
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 30
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 30
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 21
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 19
- 101000919025 Xenopus laevis ATP-dependent RNA helicase ddx6 Proteins 0.000 claims description 17
- 102220098008 rs876661393 Human genes 0.000 claims description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 abstract description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 abstract description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 12
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 abstract description 11
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 abstract description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 abstract description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 abstract description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 abstract description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 abstract description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 abstract description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 abstract description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 abstract description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 abstract description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 abstract description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 abstract description 4
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 abstract description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 abstract description 4
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 abstract description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 abstract description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 abstract description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 abstract description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 abstract description 3
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 abstract description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 45
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 26
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 21
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 8
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 7
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- -1 glucosyl glycoside Chemical class 0.000 description 4
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 3
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000007036 catalytic synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 125000004383 glucosinolate group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 1
- 241001468196 Leuconostoc pseudomesenteroides Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000179039 Paenibacillus Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 108010019589 Staphylococcus aureus glutamic acid-specific endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002357 osmotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229930195727 α-lactose Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01007—Sucrose phosphorylase (2.4.1.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本申请公开了一种蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备甘油葡糖苷中的应用，所述蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生一个或多个点突变而获得的氨基酸序列，蔗糖磷酸化酶突变体具有蔗糖磷酸化酶活性，其中，发生点突变的氨基酸包括SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中第42位的脯氨酸、第54位的脯氨酸、第137位的精氨酸、第138位的赖氨酸、第153位的苏氨酸、第199位的丙氨酸、第260位的亮氨酸、第298位的甘氨酸、第337位的亮氨酸、第339位的异亮氨酸、第355位的丙氨酸、第363位的苯丙氨酸、第380位的丙氨酸、第410位的谷氨酸以及第475位的缬氨酸中的一种或多种。
Description
技术领域
本申请涉及酶工程及合成生物学领域，具体涉及一种蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备甘油葡糖苷中的应用。
背景技术
甘油葡糖苷是由一分子甘油以及一分子葡萄糖通过糖苷键连接而形成的化合物。甘油葡糖苷是一些植物、藻类和细菌为适应盐胁迫和干旱而产生的渗透剂，甘油葡糖苷因具有滋润、锁水、保湿等生理效果而在化妆品、食品、医药、保健品等领域具有广阔的应用和市场前景。
目前，甘油葡糖苷的制备方法主要有化学合成法和生物合成法，其中，化学合成法具有合成反应复杂、产物产率低以及杂质含量较高等缺点。生物合成法是利用蔗糖磷酸化酶的催化特性来合成甘油葡糖苷，即以蔗糖和甘油为原料，在蔗糖磷酸化酶(SucrosePhosphorylase,SPase)的催化作用下合成甘油葡糖苷，具有反应条件温和、底物原料低廉、产物简单的优点。但是，采用野生型蔗糖磷酸化酶催化合成甘油葡糖苷存在催化活性低的问题，导致蔗糖转化率较低。
因此，如何改造野生型蔗糖磷酸化酶以提高其催化活性，对生物合成法制备甘油葡糖苷的发展具有重要意义。
发明内容
本申请提供了一种蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备甘油葡糖苷中的应用，以改善蔗糖磷酸化酶的催化活性，从而提高生物合成法制备甘油葡糖苷中蔗糖的转化率。
第一方面，本申请提供了一种蔗糖磷酸化酶突变体，所述蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生一个或多个点突变而获得的氨基酸序列；所述蔗糖磷酸化酶突变体具有蔗糖磷酸化酶活性；
其中，发生所述点突变的氨基酸包括SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中第42位的脯氨酸、第54位的脯氨酸、第137位的精氨酸、第138位的赖氨酸、第153位的苏氨酸、第199位的丙氨酸、第260位的亮氨酸、第298位的甘氨酸、第337位的亮氨酸、第339位的异亮氨酸、第355位的丙氨酸、第363位的苯丙氨酸、第380位的丙氨酸、第410位的谷氨酸以及第475位的缬氨酸中的一种或多种。
可选地，发生所述点突变的方式包括：A380L、L260A、L260D、A199V、T153I、P54H、P42V、R137W、R137E、R137F、V475F、V475H、F363T、F363N、K138R、K138Q、K138N、G298P、G298V、I339F、L337T、L337I、A355V以及E410D中的一种或多种。
可选地，发生所述点突变的方式为以下任意一种：
(1)I339F、L337T和A355V；
(2)R137E、K138N、T153I和A199V；
(3)R137E、K138N、T153I、A199V、I339F和L337T；
(4)L260D、P54H、P42V和V475F；
(5)L260D、P54H、P42V、V475F和F363T；
(6)L260D、P54H、P42V、V475F、F363T和E410D；
(7)L260D、P54H、P42V、V475F、F363T、R137E、K138N、T153I、A199V、I339F和L337T；
(8)L260D、P54H、P42V、V475F、F363T、E410D、R137E、K138N、T153I、A199V、I339F和L337T。
可选地，所述蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ IDNO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63或SEQID NO.65中任一个所示的氨基酸序列。
第二方面，本申请提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括用于编码如第一方面中任意一种所述的蔗糖磷酸化酶突变体的核苷酸序列。
可选地，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ IDNO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64或SEQ ID NO.66中任一个所示的核苷酸序列。
第三方面，本申请提供了一种重组表达载体，包括如第二方面中任意一种所述的核酸分子。
可选地，所述重组表达载体是将所述核酸分子插入至载体而获得的；所述载体选自质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒、酵母人工染色体或细菌人工染色体；
可选地，所述载体为pET24a质粒，所述重组表达载体是将所述pET24a质粒中Nde I酶切位点与BamH I酶切位点之间的片段替换为所述核酸分子。
第四方面，本申请还提供了一种重组微生物，包含宿主，以及位于所述宿主的体内的如第二方面中任意一种所述的核酸分子或如第三方面中任意一种所述的重组表达载体。
可选地，所述宿主为大肠杆菌。
第五方面，本申请还提供了一种蔗糖磷酸化酶突变体的制备方法，通过培养第四方面中任意一种所述的重组微生物，以及从培养物中获得所述的蔗糖磷酸化酶突变体。
第六方面，本申请还提供了一种甘油葡糖苷的制备方法，以如第一方面中任意一种所述的蔗糖磷酸化酶突变体作为催化剂，蔗糖和甘油接触反应生成甘油葡糖苷。
本申请提供了一种蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备甘油葡糖苷中的应用，具有如下技术效果：
本申请中蔗糖磷酸化酶突变体是在如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的野生型蔗糖磷酸化酶的基础上发生一个或多个点突变而形成的，所述蔗糖磷酸化酶突变体具有蔗糖磷酸化酶活性，所述蔗糖磷酸化酶突变体能够应用于制备甘油葡糖苷，以催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷(2-αGG)为例，底物蔗糖的转化率可达99.8％，相较于具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的野生型蔗糖磷酸化酶，所述蔗糖磷酸化酶突变体具有催化活性高的优点。
附图说明
下面结合附图，通过对本申请的具体实施方式详细描述，将使本申请的技术方案及其有益效果显而易见。
图1为实验例1的初筛实验中包含蔗糖磷酸化酶突变体M32的反应体系反应24h获得的反应产物的HPLC分析图谱；
图2为实验例1的初筛实验中包含对比例1的蔗糖磷酸化酶的反应体系反应24h获得的反应产物的HPLC分析图谱；
图3为实验例2的复筛实验中包含蔗糖磷酸化酶突变体M32的反应体系反应24h获得的反应产物的HPLC分析图谱；
图4为实验例2的复筛实验中包含对比例1的蔗糖磷酸化酶的反应体系反应24h获得的反应产物的HPLC分析图谱；
图5为实验例3的放大实验中包含蔗糖磷酸化酶突变体M32的反应体系反应48h获得的反应液的HPLC图谱。
附图标记：
1：甘油；2：果糖；3：甘油葡糖苷；4：蔗糖。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
术语定义：
“氨基酸”由单字母或三字母代码表示，具有如下含义：A：Ala(丙氨酸)；R：Arg(精氨酸)；N：Asn(天冬酰胺)；D：Asp(天冬氨酸)；C：Cys(半胱氨酸)；Q：Gln(谷氨酰胺)；E：Glu(谷氨酸)；G：Gly(甘氨酸)；H：His(组氨酸)；I：Ile(异亮氨酸)；L：Leu(亮氨酸)；K：Lys(赖氨酸)；M：Met(甲硫氨酸)；F：Phe(苯丙氨酸)；P：Pro(脯氨酸)；S：Ser(丝氨酸)；T：Thr(苏氨酸)；W：Trp(色氨酸)；Y：Tyr(酪氨酸)；V：Val(缬氨酸)。
“点突变”是指野生型蔗糖磷酸化酶(具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列)中特定位点氨基酸的取代、缺失或插入。其中，对于氨基酸取代的点突变方式，命名方法为：原始氨基酸，原始氨基酸的位点，取代氨基酸，例如：A380L表示在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中第380位点处采用亮氨酸取代原始的丙氨酸；T153I表示在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中第153位点处采用异亮氨酸取代原始的苏氨酸。
“同源性”是指两个核酸序列之间的“同一性”或两个氨基酸序列之间的“同一性”，其百分比表示在最佳比对(best alignment)后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸或氨基酸残基的统计学意义的百分比，两个序列之间的差异随机地分布在其整个长度上。同一性百分比或一致性百分比意指在最佳比对(best alignment)后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比，该百分比是纯粹统计学的，且两个序列之间的差异随机地分布并分布在其整个长度上。通常，最佳比对(best alignment)是待比较的两个序列之间的同一性百分比最高的比对，这种比对可以手动进行，也可以利用序列比对工具(例如Blast或其他在线序列比对软件)进行。
至少具有80％以上同源性可以理解为至少大于81％、或至少大于82％、或至少大于83％、或至少大于84％、或至少大于84％、或至少大于85％、或至少大于86％、或至少大于87％、或至少大于88％、或至少大于89％、或至少大于90％、或至少大于91％、或至少大于92％、或至少大于93％、或至少大于94％、或至少大于95％、或至少大于96％、或至少大于97％、或至少大于98％、或至少大于99％的序列同源性，示例为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性，对应同源性的数值为整数；也可以进一步理解为80.1％、81.2％、82.3％、83.4％、84.5％、85.6％、86.7％、87.8％、88.9％、89.8％、90.3％、91.7％、92.2％、93.5％、94.8％、95.9％、96.6％、97.5％、98.4％或99.9％，但小于100％的序列同源性，对应同源性的数值为小数。
“核酸分子”是指包含编码本申请实施例中蔗糖磷酸化酶突变体的核苷酸序列的生物大分子化合物。本申请实施例的核酸分子例如可以是通过聚合酶链式反应(PCR)合成的脱氧核糖核酸(DNA)片段，或者通过连接、切割、内切核酸酶作用以及外切核酸酶作用中的任意一种或多种产生的片段，可以是单链的或双链的。在本申请实施例中，核酸分子包括编码区和非编码区，非编码区任选地包括启动子、内含子、外显子、终止子、增强子或其他表达调控元件，核酸分子还可以包括酶切位点。
“重组表达载体”是指一种核酸分子构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的外源核酸片段，控制序列能够实现外源核酸片段在合适的宿主中表达。重组表达载体例如包括：(1)对外源核酸片段表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子、增强子、增强子、沉默子等；(2)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列。本领域技术人员能够使用广泛已知的方法来构建重组表达载体，包括但不限于是双酶切构建法或同源重组构建法；重组表达载体还可以包含一个或多个选择性标记基因。在本申请实施例中，外源核酸片段包含用于编码蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列。
“载体”是指利用基因工程重组技术将编码蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列转移至宿主中进行扩增和表达的工具，载体例如可以是质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒、酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosome,YAC)、细菌人工染色体(Bacterial artificialchromosome,BAC)、土壤杆菌属(Agrobacterium)pTi质粒等。在本申请的一些实施例中，未插入外源基因的pET24a质粒可以作为载体。需要说明的是，本领域技术人员可采用合适的载体来实现本申请的技术方案，但这些替代并未脱离本申请的范围，本申请应包括这些替代载体。
“宿主”是指一类能够通过特定方式接受外源核酸(例如编码蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列)的受体微生物，特定方式包括但不限于是接合、电穿孔、化学转化、转导、转染或超声波转化中的至少一种，可根据所选择的宿主选择适宜的方式，例如当宿主为酿酒酵母时，可选择醋酸锂转化法接受外源核酸。在本申请实施例中，宿主可以是野生型，也可以是野生型经过自然突变或人工改造之后获得的微生物；宿主例如可以是真核生物、原核生物、病毒等，其中，作为宿主的真核生物包括但不限于哺乳动物细胞、酵母、真菌、昆虫细胞和植物细胞，作为宿主的原核生物包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、乳酸菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌、假单胞菌属和类芽孢杆菌属。在本申请的一个实施例中，宿主为大肠杆菌。
“重组微生物”是指接受了外源遗传物质(如：质粒DNA)而使遗传特性发生变化的宿主。在本申请实施例中，接受了外源遗传物质(用于编码蔗糖磷酸化酶突变体的核酸分子或重组表达载体)的工程菌株属于重组微生物。
需要说明的是，在本申请的序列表中，核苷酸序列是按照5’端至3’端的顺序排列各个核苷酸，氨基酸序列是按照N端至C端的顺序排列各个氨基酸。
本申请实施例提供了一种蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备甘油葡糖苷中的应用，蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生一个或多个点突变而获得的氨基酸序列，蔗糖磷酸化酶突变体具有蔗糖磷酸化酶活性。可以理解的是，蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过取代至少一个氨基酸、和/或缺失至少一个氨基酸、和/或添加至少一个氨基酸而获得。
其中，发生点突变的氨基酸包括SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中第42位的脯氨酸、第54位的脯氨酸、第137位的精氨酸、第138位的赖氨酸、第153位的苏氨酸、第199位的丙氨酸、第260位的亮氨酸、第298位的甘氨酸、第337位的亮氨酸、第339位的异亮氨酸、第355位的丙氨酸、第363位的苯丙氨酸、第380位的丙氨酸、第410位的谷氨酸以及第475位的缬氨酸中的一种或多种。
在本申请的一些实施例中，发生点突变的方式包括A380L、L260A、L260D、A199V、T153I、P54H、P42V、R137W、R137E、R137F、V475F、V475H、F363T、F363N、K138R、K138Q、K138N、G298P、G298V、I339F、L337T、L337I、A355V以及E410D中的一种或多种。
在本申请的一些实施例中，发生点突变的方式为以下任意一种：
(1)I339F、L337T和A355V；
(2)R137E、K138N、T153I和A199V；
(3)R137E、K138N、T153I、A199V、I339F和L337T；
(4)L260D、P54H、P42V和V475F；
(5)L260D、P54H、P42V、V475F和F363T；
(6)L260D、P54H、P42V、V475F、F363T和E410D；
(7)L260D、P54H、P42V、V475F、F363T、R137E、K138N、T153I、A199V、I339F和L337T；
(8)L260D、P54H、P42V、V475F、F363T、E410D、R137E、K138N、T153I、A199V、I339F和L337T。
在本申请的一些实施例中，蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有不低于80％的同源性。蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列例如为SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO.49、SEQ IDNO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ IDNO.63或SEQ ID NO.65中任一个所示的氨基酸序列。
本申请实施例还提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括用于编码本申请实施例中任意一种所述的蔗糖磷酸化酶突变体的核苷酸序列。
在本申请的一些实施例中，用于编码蔗糖磷酸化酶突变体的核苷酸序列与SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列具有不低于80％的同源性。用于编码蔗糖磷酸化酶突变体的核苷酸序列例如为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQID NO.62、SEQ ID NO.64或SEQ ID NO.66中任一个所示的核苷酸序列。
为了便于理解，下表1示出了本申请实施例中涉及的蔗糖磷酸化酶突变体的具体信息，蔗糖磷酸化酶突变体相对于氨基酸序列为SEQ ID NO：1的野生型蔗糖磷酸化酶存在一个或多个突变位点，表1中提供的蔗糖磷酸化酶仅作为示例：
表1本申请实施例中涉及的蔗糖磷酸化酶突变体的具体信息一览表
本申请实施例还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括如前文中任意一种所述的核酸分子。
在本申请的一些实施例中，重组表达载体是将前文中任意一种所述的核酸分子插入至载体而获得的。作为示例，载体为pET24a质粒，重组表达载体是将pET24a质粒中Nde I酶切位点与BamH I酶切位点之间的片段替换为前文中任意一种所述的核酸分子。
本申请实施例还提供了一种重组微生物，所述重组微生物包含宿主，以及位于宿主的体内的如前文中任意一种所述的核酸分子或如前文中任意一种所述的重组表达载体。
在本申请的一些实施例中，宿主为大肠杆菌。
本申请实施例还提供了一种蔗糖磷酸化酶突变体的制备方法，具体是：通过培养如前文中任意一种所述的重组微生物，以及从培养物中获得所述的蔗糖磷酸化酶突变体。
本申请实施例还提供了一种甘油葡糖苷的制备方法，具体是：以前文中任意一种所述的蔗糖磷酸化酶突变体作为催化剂，蔗糖和甘油接触反应生成甘油葡糖苷。
可以理解的是，用于制备甘油葡糖苷的蔗糖磷酸化酶突变体可以是包含用于编码蔗糖磷酸化酶突变体的核苷酸序列的重组微生物的培养物(包括培养基)，也可以是通过将所述培养物分离纯化后获得的菌体细胞、菌体细胞提取物、菌体细胞破碎物或提纯的蔗糖磷酸化酶突变体。
在本申请的一些实施例中，在所述蔗糖磷酸化酶突变体催化蔗糖和甘油接触反应生成甘油葡糖苷的反应体系中，蔗糖磷酸化酶突变体：蔗糖：甘油的质量比值为1：(9.13～13.69)：(6.14～9.22)。若蔗糖磷酸化酶突变体的添加量过少，则对蔗糖和甘油的催化反应效果有限，从而出现底物过剩的现象；若蔗糖磷酸化酶突变体的添加量过多，则会造成蔗糖磷酸化酶突变体的浪费，提高了生产成本，并且为后续产物的分离纯化增加了难度。
在本申请的一些实施例中，所述反应体系的pH为6.8～7.2，反应温度为30℃～37℃。需要说明的是，催化反应可以在振荡或搅拌的条件下进行，反应时间例如以底物残留量低于5％为准；催化反应结束后，可以依照本领域常见的分离纯化方法提取甘油葡糖苷，常见的分离纯化方法包括但不限于是过滤、离心、沉淀或干燥中的至少一种。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。一、本申请实施例中涉及培养基的说明
(1)LB培养基
每100mL的LB液体培养基中包括：1.0g的蛋白胨，0.5g的酵母粉，以及1.0g的NaCl；
对于LB固体培养基，是在LB液体培养基配方的基础上添加20g/L的琼脂；
对于含有卡那霉素抗性的LB培养基，卡那霉素的总浓度为50μg/mL。
(2)自诱导培养基
分别称取120g的酵母粉、32.25g的蛋白胨、0.75g的硫酸镁(MgSO4)、16.5g的硫酸铵((NH4)2SO4)、32.5g的磷酸二氢钾(KH2PO4)、35.5g的磷酸氢二钠(Na2HPO4)、2.5g的葡萄糖以及10g的α-乳糖，然后将各个称取好的组分全部加入至磨粉机内，充分研磨至粉状，获得粉末状的自诱导培养基。将50g粉末状的自诱导培养基溶于1L去离子水，充分混匀后调节pH至7.0，然后121℃灭菌30min。
二、本申请实施例中涉及质粒和感受态细胞的说明详见下表2:
表2本申请实施例中涉及质粒和感受态细胞的说明
/>
/>
三、本申请实施例中涉及的基因片段及试剂说明：
本申请实施例中涉及的基因片段，包括引物、SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列等由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本申请实施例中涉及的限制性内切酶(如：BamH I、Nde I和Dpn I)、T4连接酶、KOD高保真酶试剂盒、胶回收试剂盒、10×T4连接酶缓冲液(Buffer)、双蒸水(ddH2O)等分子试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。
下面结合实施例进一步说明本申请的技术方案和有益效果。
实施例1：构建重组表达载体pET24a-LpSP
运用基因挖掘技术，从NCBI数据库挖掘出源自假肠膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)的蔗糖磷酸化酶，所述蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。依据E.coli密码子偏好性进行密码子优化，以全基因合成的方法合成编码SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
选择未插入外源基因的pET24a质粒作为载体，pET24a质粒具有酶切位点BamH I和Nde I，重组表达载体pET24a-LpSP的构建方法包括如下步骤：
S1.1、在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的两端分别加入酶切位点BamH I和NdeI，人工合成基因片段后，其中，酶切位点BamH I添加至SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的3’端，酶切位点Nde I添加至SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的5’端，采用BamH I和Nde I限制性内切酶对合成的基因片段进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收目的基因片段，其中，双酶切后回收目的基因片段的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施；
S1.2、采用BamH I和Nde I限制性内切酶对pET24a质粒进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收载体骨架，其中，双酶切后回收载体骨架的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施；
S1.3、将步骤S1.1获得的目的基因片段与步骤S1.2获得的载体骨架相混合，在T4连接酶的作用下16℃连接过夜，然后将连接产物转化至DH5a感受态细胞内，挑取单克隆子测序验证，提取测序正确的重组质粒，获得包含SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的重组表达载体，命名pET24a-LpSP，其中，重组体系为20μL，具体是：2μL的10×T4连接酶缓冲液(Buffer)、5μL的目的基因片段、5μL的载体骨架、2μL的T4连接酶以及6μL的双蒸水(ddH2O)。
实施例2构建重组微生物的定向突变库
采用定点突变策略，以实施例1构建的pET24a-LpSP作为DNA模板，根据待突变的氨基酸位点利用Oligo7软件来设计点突变引物，通过在上下游突变引物的5’端以插入、替换或缺失碱基的方式引入突变，突变位点如表1所示。需要说明的是，本领域技术人员根据突变位点引入的方式，结合引物设计的基本原则可以获得突变引物的核苷酸序列。以构建A380L突变位点为例，上游突变引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：67所示，下游突变引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：68所示，共设计获得三十二组突变引物对，以分别引入表1所示的三十二种突变形式。
选择实施例1中构建的重组表达载体pET24a-LpSP为模板，分别以三十二组突变引物对作为PCR引物，采用KOD高保真酶试剂盒进行反向PCR，从而获得三十二种突变序列的PCR产物。其中，反向PCR的反应程序为：95℃预变性3min；98℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸3min，28个循环；72℃延伸5min，其中，反向PCR的反应体系如下表3所示：
表3反向PCR的反应体系一览表
| 试剂名称 | 用量/μL |
| KOD OneTM PCR Master Mix | 25 |
| 上游突变引物(10μM) | 1.5 |
| 下游突变引物(10μM) | 1.5 |
| 模板 | 1 |
| 双蒸水(ddH2O) | 21 |
| 总体系 | 50 |
将每一种突变序列的PCR产物分别使用Dpn I限制性内切酶处理，酶切产物经T4连接酶连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，随后涂布含卡那霉素的LB抗性平板，置于37℃倒置培养18h，挑选单菌落转接含卡那霉素的LB液体培养基中，挑选培养液送样测序，将测序正确的克隆子保存备用，从而获得以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主的重组微生物，即获得分别用于表达蔗糖磷酸化酶突变体M1至M32的重组微生物T1至T32。
实施例3重组微生物的诱导表达及后处理
将实施例2获得的重组微生物T1至T32分别接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、180r/min的条件下培养至OD600为0.6～0.8，获得种子菌液。将种子菌液以1％的体积浓度接种至新鲜的含终浓度为50μg/mL卡那霉素的自诱导培养基，置于30℃培养18h，获得培养液。将培养液在25℃、8000r/min的条件下离心10min，弃上清液以收集沉淀物，将沉淀物用pH为7.0的PB缓冲液清洗数遍，收集湿菌体备用。
通过超纯水重悬制得的湿菌体，获得菌体浓度(mg/L)为20％的菌液。采用超声波破碎法或高压均质破碎法处理菌液，破碎条件可依据实际需要自行选择。示例超声波破碎法的工作参数为：破碎1s；暂停2s；在180W的功率下，破碎10min。示例高压均质破碎法的工作参数为：在50HZ和800bar的条件下，破碎两次。
菌液破碎处理后，在4℃、12000r/min的条件下离心10min至15min，以除去细胞碎片和大分子杂质，收集上清液保存于-20℃和4℃以备用，上清液即为含有蔗糖磷酸化酶突变体的酶液。
对比例1
本对比例提供了一种蔗糖磷酸化酶，所述蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
将重组表达载体pET24a-LpSP转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态，随后涂布含卡那霉素的LB抗性平板，置于37℃倒置培养18h，挑选单菌落转接含卡那霉素的LB液体培养基中，挑选培养液送样测序，将测序正确的克隆子保存备用，从而获得重组微生物T0。
将重组微生物T0按照实施例3的方法进行诱导表达及后处理，将获得的酶液保存于-20℃和4℃以备用。
实验例1初步比较蔗糖磷酸化酶突变体M1至M32的催化反应活性
配制100mL的母液：将浓度为0.01mol/L的PB缓冲液(pH为7.0)、27.38g的蔗糖和18.43g的甘油混合，待底物蔗糖和甘油充分溶解后使用10％NaOH调整体系pH为7.0，获得100mL的母液。
将5μL含有单种蔗糖磷酸化酶突变体的酶液(实施例3制得)或含有蔗糖磷酸化酶的酶液(对比例1制得)，与1mL的母液混合以获得测活体系，一共制得三十三组测活体系，三十三组测活体系分别对应为包含蔗糖磷酸化酶突变体M1的测活体系至包含蔗糖磷酸化酶突变体M32的测活体系，以及包含对比例1的蔗糖磷酸化酶的测活体系(作为对照)。其中，第一组测活体系为包含蔗糖磷酸化酶突变体M1的测活体系，第二组测活体系为包含蔗糖磷酸化酶突变体M2的测活体系，依次类推，第三十二组测活体系为包含蔗糖磷酸化酶突变体M32的测活体系，第三十三组测活体系为包含对比例1的蔗糖磷酸化酶的测活体系。
将各组测活体系分别置于30℃、180r/min的摇床反应24h，然后置于95℃下恒温处理10min以终止反应，获得反应产物，然后利用高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography,HPLC)法对反应产物进行检测分析，反应产物中目标产物为2-O-α-D-甘油葡糖苷。每组测活体系设置三个平行样，检测结果取三个平行样的平均值。
其中，HPLC的仪器为岛津牌示差折光检测器，HPLC的工作条件如下：
(1)进样液的制备：取100μL的反应产物与900μL的纯水混合，充分混匀后置于14000r/min的转速下离心1min，收集第一上清液；取100μL的第一上清液，向其中加入900μL的流动相，震荡混匀后采用型号为0.22μm的滤膜过滤，将滤液进样，每次进样量10μL；
(2)色谱柱：dikma polyamino hilic，250*4.6mm，5μm。
(3)流动相的制备：将乙腈和水按照乙腈：水的体积比为80：20混合配制而成。
(4)流速：1mL/min。
(5)分析时间：35min；其中，甘油的出峰时间为5.527min，蔗糖的出峰时间为30.685min，果糖的出峰时间为12.200min，2-O-α-D-甘油葡糖苷的出峰时间为13.181min；
(6)柱温：30℃。
根据底物蔗糖的减少量计算底物蔗糖的转化率，蔗糖转化率(％)的计算公式如下式(Ⅱ):
在式(Ⅱ)中，A0为反应初始时蔗糖的峰面积，A1为反应24h时蔗糖的峰面积。
作为示例，图1示出了初筛实验中包含蔗糖磷酸化酶突变体M32的反应体系反应24h获得的反应产物的HPLC分析图谱，以及图2示出了初筛实验中包含对比例1的蔗糖磷酸化酶的反应体系反应24h获得的反应产物的HPLC分析图谱。
各个蔗糖磷酸化酶突变体(M1至M32)以及对比例1的蔗糖磷酸化酶的初筛测活数据详见下表4：
表4蔗糖磷酸化酶突变体M1至蔗糖磷酸化酶突变体M32以及对比例1的蔗糖磷酸化酶的初筛测活数据一览表
/>
由表4可知，蔗糖磷酸化酶突变体M1至M32是在对比例1的蔗糖磷酸化酶的基础上作出一个或多个位点突变而获得的突变体，相较于对比例1的蔗糖磷酸化酶，M1至M32对底物蔗糖的转化率显著提升。以蔗糖磷酸化酶突变体M32为例，M32对底物蔗糖的转化率可达75.7％，其是对比例1的蔗糖磷酸化酶对底物蔗糖的转化率的2.66倍。
此外，对于采用单一位点突变方式获得的蔗糖磷酸化酶突变体来说，采用L260D点突变方式获得的蔗糖磷酸化酶突变体对底物蔗糖的转化率最高，其次是A355V；对于多位点组合突变方式获得的蔗糖磷酸化酶突变体来说，采用L260D、P54H、P42V、V475F、F363T、E410D、R137E、K138N、T153I、A199V、I339F和L337T组合突变方式获得的蔗糖磷酸化酶突变体的综合催化性能最佳。
实验例2复筛比较蔗糖磷酸化酶突变体M1至M32的催化反应活性
参照实验例1配制100mL的母液。将15mL含有单种蔗糖磷酸化酶突变体的酶液(实施例3制得)或含有蔗糖磷酸化酶的酶液(对比例1制得)，与85mL的母液混合以获得测活体系，一共制得三十三组测活体系，三十三组测活体系分别对应为包含蔗糖磷酸化酶突变体M1的测活体系至包含蔗糖磷酸化酶突变体M32的测活体系，以及包含对比例1的蔗糖磷酸化酶的测活体系(作为对照)。其中，第一组测活体系为包含蔗糖磷酸化酶突变体M1的测活体系，第二组测活体系为包含蔗糖磷酸化酶突变体M2的测活体系，依次类推，第三十二组测活体系为包含蔗糖磷酸化酶突变体M32的测活体系，第三十三组测活体系为包含对比例1的蔗糖磷酸化酶的测活体系。
将各组测活体系分别置于30℃、180r/min的摇床反应24h，然后置于95℃下恒温处理10min以终止反应，获得反应产物，然后采用HPLC分析获得的反应产物。相较于实验例1中HPLC的工作条件，本实验例中HPLC的工作条件的区别之处仅在于：将进样液的制备修改为“将反应产物置于14000r/min的条件下离心1min，收集第二上清液并弃去变性蛋白沉淀；取100μL的第二上清液，向其中加入900μL的流动相，震荡混匀后采用型号为0.22μm的滤膜过滤，将滤液进样，每次进样量10μL”。每组测活体系设置三个平行样，检测结果取三个平行样的平均值。
作为示例，图3示出了复筛实验中包含蔗糖磷酸化酶突变体M32的反应体系反应24h获得的反应产物的HPLC分析图谱，以及图4示出了复筛实验中包含对比例1的蔗糖磷酸化酶的反应体系反应24h获得的反应产物的HPLC分析图谱。
各个蔗糖磷酸化酶突变体(M1至M32)以及对比例1的蔗糖磷酸化酶的复筛测活数据详见下表5：
表5蔗糖磷酸化酶突变体M1至蔗糖磷酸化酶突变体M32以及对比例1的蔗糖磷酸化酶的复筛测活数据一览表
由表5可知，在复筛实验中，蔗糖磷酸化酶突变体M1至蔗糖磷酸化酶突变体M32对底物蔗糖的转化率仍明显优于对比例1的蔗糖磷酸化酶。以蔗糖磷酸化酶突变体M32为例，蔗糖磷酸化酶突变体M32对底物蔗糖的转化率可达99.3％，比对比例1的蔗糖磷酸化酶对底物蔗糖的转化率高11.7％。
实验例3放大反应比较蔗糖磷酸化酶突变体M1至M32的催化反应活性
挑选实验例1和实验例2中蔗糖转化率较高的蔗糖磷酸化酶突变体进行放大反应，具体的，进行放大反应的蔗糖磷酸化酶突变体为M7、M8、M10、M27、M30、M31和M32。放大反应的实验流程如下：
首先，配制10L的母液：将浓度为0.01mol/L的PB缓冲液(pH为7.0)、2738g的蔗糖和1843g的甘油混合，待底物蔗糖和甘油充分溶解后使用10％NaOH调整体系pH为7.0，获得10L的母液。
然后，将1L含有单种蔗糖磷酸化酶突变体(蔗糖磷酸化酶)的酶液与9L的母液混合以获得测活体系，一共制得八组测活体系，八组测活体系分别对应为包含蔗糖磷酸化酶突变体M7的测活体系、包含蔗糖磷酸化酶突变体M8的测活体系、包含蔗糖磷酸化酶突变体M10的测活体系、包含蔗糖磷酸化酶突变体M27的测活体系、包含蔗糖磷酸化酶突变体M30的测活体系、包含蔗糖磷酸化酶突变体M31的测活体系和包含蔗糖磷酸化酶突变体M32的测活体系，以及包含对比例1的蔗糖磷酸化酶的测活体系(作为对照)。其中，第一组测活体系为包含蔗糖磷酸化酶突变体M7的测活体系，第二组测活体系为包含蔗糖磷酸化酶突变体M8的测活体系，依次类推，第七组测活体系为包含蔗糖磷酸化酶突变体M32的测活体系，第八组测活体系为包含对比例1的蔗糖磷酸化酶的测活体系。
将各组测活体系分别置于30℃、180r/min的摇床反应48h，然后置于95℃下恒温处理10min以终止反应，获得反应产物，然后采用HPLC分析获得的反应产物。相较于实验例1中HPLC的工作条件，本实验例中HPLC的工作条件的区别之处仅在于：将进样液的制备修改为“将反应产物置于14000r/min的条件下离心1min，收集第三上清液并弃去变性蛋白沉淀；取100μL的第三上清液，向其中加入900μL的流动相，震荡混匀后采用型号为0.22μm的滤膜过滤，将滤液进样，每次进样量10μL”。每组测活体系设置三个平行样，检测结果取三个平行样的平均值。
作为示例，图5示出了放大实验中包含蔗糖磷酸化酶突变体M32的反应体系反应48h获得的反应产物的HPLC分析图谱。
各个蔗糖磷酸化酶突变体以及对比例1的蔗糖磷酸化酶的放大实验测活数据详见下表6：
表6放大实验测活数据一览表
/>
由表6可知，在放大实验中，蔗糖磷酸化酶突变体M7、M8、M10、M27、M30、M31和M32对底物蔗糖的转化率仍明显优于对比例1的蔗糖磷酸化酶。以蔗糖磷酸化酶突变体M32为例，蔗糖磷酸化酶突变体M32对底物蔗糖的转化率可达99.8％，比对比例1的蔗糖磷酸化酶对底物蔗糖的转化率高9.3％。
以上对本申请所提供的一种蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备甘油葡糖苷中的应用，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生点突变而获得的氨基酸序列；所述蔗糖磷酸化酶突变体具有蔗糖磷酸化酶活性；
其中，发生所述点突变的方式为以下任意一种：
(1) I339F、L337T和A355V；
(2) R137E、K138N、T153I和A199V；
(3) R137E、K138N、T153I、A199V、I339F和 L337T；
(4) L260D、P54H、P42V和V475F；
(5) L260D、P54H、P42V、V475F和F363T；
(6) L260D、P54H、P42V、V475F、F363T和 E410D；
(7) L260D、P54H、P42V、V475F、F363T、R137E、K138N、T153I、A199V、I339F和L337T；
(8) L260D、P54H、P42V、V475F、F363T、E410D、R137E、K138N、T153I、A199V、 I339F和L337T。
2.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ IDNO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63或SEQ ID NO.65中任一个所示的氨基酸序列。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1或2所述的蔗糖磷酸化酶突变体。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列为SEQ IDNO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.64或SEQ ID NO.66中任一个所示的核苷酸序列。
5.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求3或4所述的核酸分子。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是将pET24a质粒中Nde I酶切位点与BamH I酶切位点之间的片段替换为所述核酸分子而获得的。
7.一种重组微生物，其特征在于，包含宿主，以及位于所述宿主的体内的如权利要求3或4所述的核酸分子或如权利要求5或6所述的重组表达载体。
8.根据权利要求7所述的重组微生物，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌。
9.一种蔗糖磷酸化酶突变体的制备方法，其特征在于，通过培养如权利要求7或8所述的重组微生物，以及从培养物中获得所述的蔗糖磷酸化酶突变体。
10.一种甘油葡糖苷的制备方法，其特征在于，以如权利要求1或2所述的蔗糖磷酸化酶突变体作为催化剂，蔗糖和甘油接触反应生成甘油葡糖苷。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310993438.3A CN116987684B (zh) | 2023-08-08 | 2023-08-08 | 蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备甘油葡糖苷中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310993438.3A CN116987684B (zh) | 2023-08-08 | 2023-08-08 | 蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备甘油葡糖苷中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116987684A CN116987684A (zh) | 2023-11-03 |
| CN116987684B true CN116987684B (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=88521114
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310993438.3A Active CN116987684B (zh) | 2023-08-08 | 2023-08-08 | 蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备甘油葡糖苷中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116987684B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20110006162A (ko) * | 2009-07-13 | 2011-01-20 | 한국생명공학연구원 | 류코노스톡 락티스 유래의 신규 수크로오스 포스포릴라아제 |
| CN110358750A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-10-22 | 江苏诚信药业有限公司 | 新型蔗糖磷酸化酶突变体及其在合成甘油葡糖苷中的应用 |
| CN111690624A (zh) * | 2020-06-04 | 2020-09-22 | 江南大学 | 一种利用微生物合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法 |
| CN114703158A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-07-05 | 浙江工业大学 | 一种蔗糖磷酸化酶突变体、编码基因及其应用 |
| CN116240190A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-06-09 | 浙江工业大学 | 蔗糖磷酸化酶突变体、编码基因及应用 |
| CN116396946A (zh) * | 2023-01-17 | 2023-07-07 | 黑龙江新和成生物科技有限公司 | 一种糖基转移酶变体及其在aa-2g制备中的应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK1661985T3 (en) * | 2003-09-04 | 2018-01-08 | Ezaki Glico Co | PROCEDURE FOR PREPARING HEAT STABLE SUCROSE PHOSPHORYLASE (SP) |
| KR20220028053A (ko) * | 2019-07-02 | 2022-03-08 | 코덱시스, 인코포레이티드 | 조작된 수크로스 포스포릴라제 변이체 효소 |
| CN110734899B (zh) * | 2019-10-31 | 2021-06-18 | 江南大学 | 一种酶活提高的蔗糖磷酸化酶突变体及其构建方法和应用 |
-
2023
- 2023-08-08 CN CN202310993438.3A patent/CN116987684B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20110006162A (ko) * | 2009-07-13 | 2011-01-20 | 한국생명공학연구원 | 류코노스톡 락티스 유래의 신규 수크로오스 포스포릴라아제 |
| CN110358750A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-10-22 | 江苏诚信药业有限公司 | 新型蔗糖磷酸化酶突变体及其在合成甘油葡糖苷中的应用 |
| CN111690624A (zh) * | 2020-06-04 | 2020-09-22 | 江南大学 | 一种利用微生物合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法 |
| CN114703158A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-07-05 | 浙江工业大学 | 一种蔗糖磷酸化酶突变体、编码基因及其应用 |
| CN116240190A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-06-09 | 浙江工业大学 | 蔗糖磷酸化酶突变体、编码基因及应用 |
| CN116396946A (zh) * | 2023-01-17 | 2023-07-07 | 黑龙江新和成生物科技有限公司 | 一种糖基转移酶变体及其在aa-2g制备中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Efficient Whole-Cell Biotransformation for α-Arbutin Production through the Engineering of Sucrose Phosphorylase Combined with Engineered Cell Modification;Juwei Ao等;《J. Agric. Food Chem.》;20230208;第71卷(第5期);第2438-2445页 * |
| Transglucosylation potential of six sucrose phosphorylases toward different classes of acceptors;Dirk Aerts等;《Carbohydrate Research》;20110927;第346卷(第13期);第1860-1867页 * |
| 蔗糖磷酸化酶的研究进展;杨林莉 等;《微生物学通报》;20211120;第48卷(第12期);第4904−4917页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116987684A (zh) | 2023-11-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112375750B (zh) | 一种糖基转移酶突变体及其催化合成莱鲍迪苷a的方法 | |
| CN110257315B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 | |
| CN110452919B (zh) | 一种截短的褐藻胶裂解酶Aly7B-CDII基因及其应用 | |
| CN112725319B (zh) | polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶FaAly7及其应用 | |
| CN111836900A (zh) | 从海藻生产葡萄糖及昆布多糖寡糖的新型β-葡萄糖苷酶 | |
| CN111534493A (zh) | 一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体、基因及应用 | |
| CN113025542B (zh) | 产l-谷氨酰胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 | |
| CN111826363A (zh) | 一种右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法与应用 | |
| CN113151203B (zh) | 一种生物催化合成香兰素的单加氧酶的突变体及应用 | |
| CN107937372B (zh) | 一种耐酸性提高的纳豆激酶 | |
| CN116536297B (zh) | 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用 | |
| CN116987684B (zh) | 蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备甘油葡糖苷中的应用 | |
| CN114181288B (zh) | 制备l-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质 | |
| CN107779443B (zh) | 纤维二糖水解酶突变体及其应用 | |
| CN113736762B (zh) | 一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其在制备普鲁宁中的应用 | |
| CN113817697A (zh) | 苯丙氨酸脱氢酶突变体及其在l-高苯丙氨酸合成中的应用 | |
| CN109182286B (zh) | 一种改进的氰基还原酶及其在合成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用 | |
| CN108165538B (zh) | 一种催化活性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体 | |
| CN110656054A (zh) | 一种胞外分泌褐藻胶裂解酶的重组里氏木霉菌及其应用 | |
| CN110951716A (zh) | 一种外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D及其重组菌株和应用 | |
| CN116676300B (zh) | 一种高温度稳定性的d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶及其应用 | |
| CN111187799A (zh) | 一种生产红藻糖苷的方法及其专用工程菌 | |
| CN115044568B (zh) | 高稳定型的蔗糖磷酸化酶突变体及其应用 | |
| CN104087604A (zh) | 一种菊糖果糖转移酶基因表达序列 | |
| CN114249803B (zh) | 一种高产精氨酸的工程菌及其构建方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |