CN116240190A - 蔗糖磷酸化酶突变体、编码基因及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蔗糖磷酸化酶突变体、编码基因及应用。所述突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型蔗糖磷酸化酶第137位精氨酸经单点突变而得。本发明通过在来源于罗氏乳杆菌的野生型蔗糖磷酸化酶的第137位氨基酸残基位点引入点突变，显著提高了其在以蔗糖和甘油为原料生产2‑α‑葡萄糖基甘油的催化活性和糖基化位点的区域选择性，降低了副产物1‑α‑葡萄糖基甘油的合成。该酶突变体LreSP‑R137M在生产2‑α‑葡萄糖基甘油方面具有良好的应用价值。

Description

蔗糖磷酸化酶突变体、编码基因及应用
(一)技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种蔗糖磷酸化酶突变体、编码基因及应用。
(二)背景技术
蔗糖磷酸化酶(Sucrose Phosphorylase，SPase)是糖苷水解酶的GH13家族中的一类，EC号为2.4.1.7，属于转移酶类，其能够催化蔗糖磷酸解及其可逆反应，反应式为：
Figure BDA0003984185200000011
SPase具有广泛的受体特异性，能够将葡萄糖基转移至不同受体，包括水、无机磷酸、含醇羟基、酚羟基或羧基等小分子化合物。SPase在小分子化合物的糖基化应用中表现突出，可高效合成多种重要的糖苷化合物。
甘油葡萄糖苷是一种由葡萄糖基和甘油通过糖苷键连接而成的糖苷化合物，包括2-α-葡萄糖基甘油(2-O-α-D-glucosylglycerol，2-α-GG，又简称2-甘油糖苷，如式1所示)和1-α-葡萄糖基甘油(1-O-α-D-glucosylglycero，1-α-GG，又简称1-甘油糖苷，如式2所示)。其中，2-α-GG是植物和微生物在胁迫条件下自发合成的一种天然渗透保护物质，其可以保护细胞免受高渗透压、高温、干旱以及紫外线等恶劣环境的破坏，也对人体皮肤有保湿、防紫外线伤害等效果，在护肤化妆品、细胞冻干、蛋白保护等方面具有良好的应用价值。
Figure BDA0003984185200000012
通过蔗糖磷酸化酶催化甘油和蔗糖进行转糖基化反应，可以得到2-α-GG，但由于酶的糖基化位点的区域选择性问题，在生成2-α-GG的同时还有一定量的副产物1-α-GG的产生。前期我们筛选到了一个来源于罗氏乳杆菌的蔗糖磷酸化酶，具有十分高效的甘油糖基化活性，其催化甘油和蔗糖合成2-α-GG中具备良好的优点，包括反应速率快，热稳定性好等(International Journal of Biological Macromolecules 2022,209:376-384)。但是其缺点是该酶的区域选择性不高，需要对其进行酶分子改造，提高甘油糖基化时的区域选择性，从而提高其应用性能。随着酶分子改造技术的不断进步，基于生物信息学的计算模拟和酶的半理性设计，结合定向进化和筛选的方法，可有效改造酶的催化性能，从而创新酶的应用技术。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种区域选择性好的蔗糖磷酸化酶突变体及其编码基因，以及其在酶催化制备2-甘油糖苷中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种蔗糖磷酸化酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型蔗糖磷酸化酶第137位精氨酸经单点突变而得。
蔗糖磷酸化酶的活性位点残基，是在序列和结构上高度保守的两个天冬氨酸残基Asp和一个谷氨酸残基Glu组成的三联体。在蔗糖磷酸化酶转糖苷反应过程中，蔗糖的葡萄糖苷键首先被Glu质子化，同时Asp亲核攻击葡萄糖基上的异头碳原子，形成蔗糖-酶共价中间体，然后释放D-果糖；之后糖基受体底物亲核攻击葡糖基-酶共价中间体，发生葡萄糖基的转移反应，而得到糖苷化合物。常见的糖基受体底物包括水、磷酸、寡糖及一些含酚羟基、醇羟基及羧基的物质。通过改变活性口袋周围的残基，影响残基侧链效应，改变酶口袋的大小和动力学特性，从而提高酶对底物的催化活性和糖基化位点的区域选择性。
SEQ ID NO.2所示的野生型蔗糖磷酸化酶(LreSP)来源于罗氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)(GenBank：KRK51962.1)(International Journal ofBiological Macromolecules 2022,209:376-384)，可高效地对甘油实现糖基化，用于制备2-甘油糖苷，其糖基化速率快，对产物的水解活性低。但是，该酶催化过程中会生成副产物1-甘油糖苷。本发明针对野生型酶对甘油底物的催化活性和糖基化位点选择进行分子改造，从而得到催化活性提高且区域选择性显著提高的突变体。
首先通过PCR扩增得到该蔗糖磷酸化酶LreSP基因，将其克隆至大肠杆菌BL21(DE3)的表达载体pET28a，进行酶的过量表达。结合酶三维结构计算模拟，针对蔗糖磷酸化酶LreSP底物结构口袋中对底物区域选择性起到关键作用的氨基酸位点进行定点突变，再进行酶学比较分析后筛选得到酶突变体。
优选的，所述的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还涉及编码所述对蔗糖磷酸化酶突变体的基因。
所述的蔗糖磷酸化酶突变体LreSP-R137M的编码基因，可以根据其氨基酸序列进行密码子优化后合成的基因序列，亦可从Lactobacillus reuteri菌种基因组上PCR扩增后定点突变改造的基因序列。优选的，所述酶突变体LreSP-R137M编码基因核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体和基因工程菌。
本发明还涉及所述蔗糖磷酸化酶突变体在微生物催化制备2-α-葡萄糖基甘油中的应用。
具体的，所述应用为：构建含有所述蔗糖磷酸化酶突变体编码基因的基因工程菌，以基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或菌体经破碎获得的含酶细胞破碎液为催化剂，以甘油为底物、以蔗糖为糖基供体，进行催化反应，制得所述2-α-葡萄糖基甘油。
可将该蔗糖磷酸化酶突变体的基因克隆到表达质粒，并转化到宿主细胞中，经过诱导发酵制作成酶制剂后，用于催化甘油糖基化制备2-甘油糖苷。所述的表达质粒和宿主细胞，优选pET28a质粒和大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，即构建重组菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-LreSP-R137M)。
优选的，全细胞催化反应体系中，菌体的添加量为10～100g/L(优选100g/L)，甘油的浓度控制1～3mol/L(优选1.5mol/L)，蔗糖的浓度控制0.5～2mol/L(优选1mol/L)，催化过程控制pH6.0～7.5(优选pH6.5)、温度30℃～60℃(优选50℃)。
本发明蔗糖磷酸化酶突变体，催化甘油糖基化制备，其2-甘油糖苷的生产速率较野生型提高了70.79％，产物2-甘油糖苷的占总糖苷产物的比值(又称糖苷产物的纯度)>95.44％，糖苷产物纯度的计算方法为2-甘油糖苷的浓度/(2-甘油糖苷的浓度+1-甘油糖苷的浓度)。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种高活性蔗糖磷酸化酶突变体，其甘油糖基化活性提供的同时，糖基化位点的区域选择性也显著提高，即2-α-GG的糖苷纯度>95.44％，表现出良好的工业应用性能。
(四)附图说明
图1为蔗糖磷酸化酶催化制备2-α-葡萄糖基甘油的反应式。
图2为受体甘油与野生型蔗糖磷酸化酶的对接图。
图3为2-α-葡萄糖基甘油标准样品的液相色谱图。
图4为蔗糖磷酸化酶野生型LreSP催化甘油糖基化的催化反应液的液相色谱图。
图5为蔗糖磷酸化酶突变体LreSP-R137M催化甘油糖基化的催化反应液的液相色谱图。
(五)具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。
LB培养基：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，溶剂为蒸馏水。
发酵培养基：酵母粉12.0g/L、蛋白胨15.0g/L、Na2HPO4·12H2O 8.9g/L、KH2PO43.4g/L、NH4Cl 2.67g/L、Na2SO4 0.71g/L、MgSO4·7H2O 0.49g/L、卡那霉素50μg/L、pH7.0，溶剂为蒸馏水。
实施例1：蔗糖磷酸化酶基因的克隆表达
利用PCR技术扩增从常见的益生菌Lactobacillus reuteri菌株的基因组上，比如Lactobacillus reuteri CICC 6118菌株的基因组，扩增蔗糖磷酸化酶LreSP基因，扩增引物为LreSP-F和LreSP-R。
LreSP-F：
GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCCAATCAAAAATGAAGCAATGT LreSP-R：
GTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCCTATTTTTGTTCCATCACTTTTTCAC
将PCR扩增得到的LreSP基因，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，用于连接反应。提取质粒pET-28a，用限制性核酸内切酶Ncol/BamHI对质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离纯化后用于连接反应。采用诺维赞公司一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step CloningKit)，对纯化的LreSP基因片段和纯化的线性化pET-28a质粒进行连接反应。取10μL连接产物，与100μL大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞混合，冰浴放置30min后，在42℃水浴中热击90s。将热击后的感受态细胞涂布于LB(含50μg/mL Kana)平板。在37℃培养箱中生长12h后。将转化子用于菌落PCR验证，划线纯化后，接种LB液体培养基中培养，并提取质粒，测序验证，最终获得表达野生型蔗糖磷酸化酶LreSP重组菌株E.coli BL21(DE3)(pET-28a-LreSP)，简称E.coli LreSP。
蔗糖磷酸化酶LreSP的诱导表达。将菌株E.coli LreSP从保藏的甘油管中划线培养过夜后，取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。按照0.5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，37℃，培养2.5h；加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，调整培养温度25℃，继续发酵5h，得到过量表达野生型蔗糖磷酸化酶E.coli LreSP的菌剂。
实施例2：野生型蔗糖磷酸化酶LreSP催化甘油糖基化得到2-甘油糖苷的活性分析
取上述方法制备的野生型蔗糖磷酸化酶菌剂LreSP 2mL，10000×g，10min离心收集细胞，将细胞重新悬浮于1mL的pH6.5的0.1mmol/L MES缓冲液中；加入1mL含有1.0mol/L蔗糖和1.5mol/L甘油的反应母液，在50℃、1200rpm条件下金属浴振荡催化2h，催化液用于液相色谱分析。
催化液的液相色谱如图4所示，在反应2h后，可以得到39.28g/L的2-甘油糖苷，占总甘油糖苷产生量的84.75％。反应10h后，2-甘油糖苷的浓度为128g/L，占总甘油糖苷产生量的84.35％。
催化液取样的液相分析方法：
1)样品前处理：催化反应液12000×g离心1min，取上清200μL加入800μL的超纯水进行稀释用于液相色谱分析。
2)液相色谱检测条件：色谱柱：YMC-Pack Polyamine II；流动相：乙腈：水＝75:25；柱温：30℃；进样量：10μL；等度洗脱流速：1mL/min；检测器：岛津RID-20A；2-甘油糖苷的出峰时间约10.8min，1-甘油糖苷的出峰时间约11.8min，标准品的液相色谱图如图3所示，从左到右分别为果糖(fructose)、2-甘油糖苷(2-αGG)、1-甘油糖苷(1-αGG)、葡萄糖(glucose)。
实施例3：蔗糖磷酸化酶突变位点的设计和突变体的构建与筛选
为了提高野生型蔗糖磷酸化酶对甘油2位羟基的区域选择性，采用计算机辅助设计选择LreSP的定点突变位点。以BadSP的晶体结构(PDB号：1R7A)作为模板(模板与目标蛋白序列一致度均大于30％)，将目标酶的蛋白质序列通过SWISS-MODEL进行蛋白质三维结构建模。利用蛋白质三维结构分析软件和分子对接软件，进行模拟分析。综合考虑蔗糖磷酸化酶与底物对接结果、酶的底物结合口袋特点、酶识辨底物区域选择的结构特点、酶的催化机制，最终对氨基酸序列SEQ ID NO.2的第137位点的精氨酸残基功能预测：该位点处于酶催化口袋入口处的Loop环上，而Loop环是影响区域选择性的关键因素，对接结果显示137位点的精氨酸会与甘油的1位羟基产生相互作用(如图2所示)。因此，SEQ ID NO.2第137位的氨基酸被优先作为突变分析位点。
根据SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，设计第137位氨基酸的饱和突变引物，见表1所示。以载体pET-28a-LreSP为模板，进行PCR扩增整个质粒，经过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小正确的扩增条带。用限制性内切酶DpnI酶消化处理PCR产物1h，即消化甲基化的质粒模板。将消化后的PCR产物进行一步克隆法进行连接反应，随后转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，经过菌落PCR验证和测序验证，即获得了目标位点发生突变的蔗糖磷酸化酶突变体。
表1：基于多序列比对结果的突变引物设计表
Figure BDA0003984185200000071
Figure BDA0003984185200000081
实施例4：第137位氨基酸的饱和突变体库的筛选
在SEQ ID NO.2所述第137氨基酸位点通过定点突变获得19种突变体，且在相同催化条件下评价突变酶的催化活性和对底物区域选择性的差异。将平板上的转化子转移到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养至对数生长中期。再按1％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，37℃，培养3h；加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，控制发酵温度25℃，继续发酵12h，得到诱导表达后的菌剂。
取培养好的含酯酶突变体的菌剂2mL，10000×g，10min离心收集细胞，将细胞重新悬浮于1mL的pH6.5的0.05M MES缓冲液中；加入1ml的1mol/L蔗糖和1.5mmol/L甘油的反应母液，在50℃、1200rpm条件下金属浴振荡催化2h，催化液用于液相色谱分析。
分析反应2h时合成2-甘油糖苷的浓度用于酶活比较，其中2-甘油糖苷浓度占总糖苷产物的比值作为酶区域选择性的比较。野生型LreSP和19个LreSP突变体的酶活和糖基化位点区域选择性的分析结果如表2所示。综合考虑底物选择性与酶的催化速率，LreSP-R137M突变株为最优的突变体。
表2：野生型LreSP和19个LreSP突变体催化反应2h的产物浓度和糖苷产物纯度的比较
Figure BDA0003984185200000091
实施例5：突变株蔗糖磷酸化酶LreSP-R137M催化甘油糖基化得到2-甘油糖苷的活性分析
将菌株E.coli LreSP-R137M从保藏的甘油管中划线培养过夜后，取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm过夜培养。按照0.5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，37℃，培养2.5h；加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，调整培养温度25℃，继续发酵5h，得到过量表达蔗糖磷酸化酶突变体的重组菌E.coli LreSP-R137M的菌剂。
取上述方法制备的蔗糖磷酸化酶突变体LreSP-R137M的菌剂2mL，10000×g，10min离心收集细胞，将细胞重新悬浮于1mL的pH6.5的0.1mol/L MES缓冲液中；加入1mL含有1.0mol/L蔗糖和1.5mol/L甘油的反应母液，在50℃、1200rpm条件下金属浴振荡催化2h，催化液用于液相色谱分析。
催化液的液相色谱如图5所示，在反应两个小时后，可以得到70.77g/L的2-甘油糖苷，占总甘油糖苷产生量的95.58％。反应10h后，转糖基反应接近平衡，2-甘油糖苷的浓度为221g/L，占总甘油糖苷产生量的95.65％。

Claims (8)

1.一种蔗糖磷酸化酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型蔗糖磷酸化酶第137位精氨酸经单点突变而得。
2.如权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在所述的突变体氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
3.编码权利要求1所述蔗糖磷酸化酶突变体的基因。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.含有权利要求3所述编码基因的重组载体。
6.含有权利要求3所述编码基因的基因工程菌。
7.权利要求1所述蔗糖磷酸化酶突变体在微生物催化制备2-α-葡萄糖基甘油中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用为：构建含有所述蔗糖磷酸化酶突变体编码基因的基因工程菌，以基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或菌体经破碎获得的含酶细胞为催化剂，以甘油为底物、以蔗糖为糖基供体，进行催化反应，制得所述2-α-葡萄糖基甘油。
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