KR20220096207A - 높은 기질 특이성을 갖는 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탈인산화 효소 단백질, 더욱 자세하게는 타가토스 6-포스페이트에 대해서만 기질특이성이 높은 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 균주, 상기 균주를 이용한 타가토스 생산용 조성물에 관한 것이다.

Description

높은 기질 특이성을 갖는 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소 및 이의 용도{Tagatose 6-phosphatase with high substrate specificity and use of the same}

본 발명은 탈인산화 효소 단백질, 더욱 자세하게는 타가토스 6-포스페이트에 대해서만 기질특이성이 높은 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 균주, 상기 균주를 이용한 타가토스 생산용 조성물에 관한 것이다.

산업적으로 과당을 원료로 하여 타가토스를 제조하고자 하는 경우에, 사용되는 효소는 산업적 생산조건, 특히 열안정성이 높으며, 최대한 높은 전환율을 가져야 하며, 또한 당을 기질로 사용하므로 당의 갈변화가 알칼리 조건에서 쉽게 일어나므로 가급적 당의 갈변이 방지되는 전환 반응 조건을 충족할 필요가 있다.

따라서, 산업적으로 사용하기에는 적합한 기질 전환율, 효소의 열안정성, 및 효소 반응조건을 적어도 하나 이상 만족하며, 과당을 원료로 하여 인산화 과당을 제조하는 효소 및 이를 이용한 인산화 과당의 생산 방법이 절실히 필요한 실정이다.

자연에 존재하는 대부분의 탈인산화효소는 특정 기질에 대한 특이성이 높지 않아서 반응 중간물질인 포도당 1-포스페이트, 포도당 6-포스페이트, 과당 6-포스페이트까지 동시에 모두 탈인산화시켜 높은 수율의 타가토스를 생산하기에 어려움이 있다.

본 발명에서는 타가토스 6-포스페이트에 대해서만 기질특이성이 높은 탈인산화효소를 확보함으로써 타가토스 생산 효율을 높이고자 하였다.

본 발명의 일 예는 높은 기질 특이성을 갖는 탈인산화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 높은 기질 특이성을 갖는 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 타가토스 6-포스페이트를 탈인산화하여 타가토스를 제조하는 방법, 및 타가토스 생산용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 추가 일 예는, 높은 기질 특이성을 갖는 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 타가토스 생산용 조성물 및 타가토스의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열과, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열 동일성(sequence identity)을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소 단백질에 관한 것이다.

상기 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성(sequence identity)을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

본 발명의 추가 예로서, 본 발명의 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산분자를 제공한다.

상기 수치의 서열 동일성 또는 상동성을 나타내는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열로서 실질적으로 상기 효소와 동일하거나 상응하는 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 서열동일성 또는 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소 기능을 나타내는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

상기에서 용어 "상동성", "일치성"또는 "동일성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성","% 일치성" 또는 "% 동일성"으로 표시된다.

본 발명에 따른 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소는, 타가토스 6-포스페이트(-tagatose 6-phosphate)의 6-포스페이트의 탈인산화 반응을 촉매하며, 타가토스로 전환할 수 있으나, 타가토스를 타가토스 6-포스페이트로 역반응을 촉매하지 않는 비가역적 효소 활성을 가진다.

본 발명에 따른 효소 단백질인 타가토스 6-포스페이트 기질에 대한 높은 특이성을 가지며, 포도당 1-포스페이트, 포도당 6-포스페이트 및 과당 6-포스페이트에 대한 전환특성이 없거나 매우 낮은 특징을 가진다. 따라서 어떠한 출발물질로부터 타가토스를 생산하더라도, 다양한 인산화당 혼합물 중에 타가토스 6-포스페이트를 선택적으로 탈인산화하여 타가토스 생산 효율을 높일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 효소는 과당 6-포스페이트에 비해 타가토스 6-포스페이트에 대한 높은 기질 특이성을 가지며, 예를 들면 과당 6-포스페이트와 타가토스 6-포스페이트를 함유하는 혼합 기질, 또는 포도당 1포스페이트, 포도당 6-포스페이트, 과당 6-포스페이트 및 타가토스 6-포스페이트를 함유하는 혼합 기질 에 본 발명에 따른 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소를 작용시킨 경우, 반응생성물에 포함된 전체 탈인산화당 조성 100중량%를 기준으로 50 중량%이상, 60 중량%이상, 65 중량%이상, 70 중량%이상, 75 중량%이상, 78중량%이상, 80중량%이상, 85중량%이상, 90중량%이상, 또는 95중량%이상의 함량으로 타가토스를 생성하는, 타가토스 6-포스페이트에 대한 높은 기질 특이성을 가진다. 상기 반응생성물에 포함된 전체 탈인산화당은 과당 및 타가토스로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소 단백질은 Ferroglobus placidus 유래된 유래의 효소일 수 있다.

본 발명에 따른 Ferroglobus placidus 유래 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소(FP_T6PP)는 60 내지 80℃ 조건에서는 높은 활성, 예컨대 효소 최대활성의 55%이상의 활성을 가지며, 구체적으로 65 내지 80℃ 조건에서는 높은 활성, 예컨대 효소 최대활성의 65%이상의 활성을 가지며, 70℃ 온도 조건에서 최대 활성을 가질 수 있다.

상기 FP_T6PP 효소는 pH 6.5 내지 7.5의 pH 범위에서 효소 최대활성의 55% 이상의 활성을 가지며, pH 7.0에서 최대활성을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 FP_T6PP 효소는 금속이온에 의해 효소 활성이 증가 또는 감소할 수 있다. 구체적으로, FP_T6PP 효소 단백질은 Mg, Co, 및 Ni를 첨가하였을 때 금속이온을 넣지 않은 대조군보다 더 높은 활성을 가지며, 예컨대 금속이온이 없는 조건의 효소 활성에 비해 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상 또는 2.5배 이상의 활성을 나타내며, 특히 Mg이온의 경우 2.5배 이상의 활성을 가진다.

본 발명의 추가 예로서, 본 발명의 -FP_T6PP 효소를 암호화하는 핵산분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성(sequence identity)을 가지는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명의 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 형질전환체를 제공한다.

본 명세서서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 핵산 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 발명의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.

상기 배양물은 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소를 생산하는 미생물의 균체를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다.

상기 균주의 배양물은 상기 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 미생물 균체를 포함하거나 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사용되는 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소를 생산하는 미생물은 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 이들의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 타가토스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경 친화적이며, 간단한 효소 반응으로부터 과당으로부터 타가토스 생산을 이전에 없던 방법으로 전환시키고, 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있다.

본 발명에 따른 타가토스 생산용 조성물은, Mg, Co, 및 Ni 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 금속이온, 바람직하게는 Mg 이온을 추가로 포함할 수 있다. 상기 금속이온의 농도는 0.5 mM 내지 20 mM일 수 있고, 예를 들어, 0.5 mM 내지 10 mM, 1.0 mM 내지 10 mM, 1.5 mM 내지 8.0mM, 2.0mM 내지 8.0mM, 3.0mM 내지 7.0mM, 4.0mM 내지 6.0mM, 또는 0.2 mM 내지 10 mM일 수 있다.

상기 타가토스 생산용 조성물을 이용하여 타가토스 생산하는 경우 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소 또는 효소를 생산하는 미생물을 이용한 반응 온도 및 반응 pH 조건은 상기 효소의 반응온도 및 반응 pH 조건에서 상술한 바와 같다.

본 발명에 따른 타가토스 생산용 조성물은, 과당 6-포스페이트에서 타가토스6-포스페이트를 생산하는 과당 6-포스페이트 4-에피머라제 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하여, 과당 6-포스페이트로부터 타가토스를 생산할 수 있다.

상기 과당 6-포스페이트 4-에피머라제 효소는 과당 6-포스페이트의 4-에피머화 반응을 촉매하며, 구체적으로 과당 6-포스페이트의 4-에피머화 반응을 수행하여 타가토스6-포스페이트으로 전환할 수 있는 효소라면 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 예는 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 Caldisericum exile 유래 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질(CE_FP4E), 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 Kosmotoga olearia 유래 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질(KO_FP4E), 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 Limnochorda pilosa 유래 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소(LP_FP4E)일 수 있다.

본 발명의 일 예는 서열번호의 3, 6, 또는 9의 아미노산 서열과 서열 상동성이 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소에 관한 것이다. 상기 수치의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 효소와 동일하거나 상응하는 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소를 이루는 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소 기능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

상기 효소 단백질은 서열번호 4,5,7,8,10 또는 11의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성(identify)을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

또한, 상기 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소 기능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명에 따른 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질는 과당 6-포스페이트 기질에서 4번째 탄소를 에피머화여 타가토스 6-포스페이트로 전환하는 반응을 촉매한다. 일 예에 따른 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소의 과당 6-포스페이트로부터 타가토스 6-포스페이트로의 전환율은 20 % 이상, 25 % 이상, 30 % 이상, 또는 35 % 이상이고, 상한은 60 % 이하, 50 % 이하, 또는 40 % 이하일 수 있으며, 예를 들면 상기 전환율의 하한값과 상한값의 조합에 따른 범위를 가질 수 있다.

상기 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소는 특정 금속이온의 존재하에서 활성이 증대될 수 있다. 상기 금속 이온이 농도는 바람직하게는 0.1 mM 내지 20 mM, 0.2 내지 20 mM, 0.5 내지 20 mM, 1 내지 20 mM, 0.1 mM 내지 15 mM, 0.2 내지 15 mM, 0.5 내지 15 mM, 1 내지 15 mM, 0.1 mM 내지 10 mM, 0.2 내지 10 mM, 0.5 내지 10 mM, 1 내지 10 mM, 0.1 mM 내지 5 mM, 0.2 내지 5 mM, 0.5 내지 5 mM, 또는 1 내지 5 mM일 수 있다.

CE_FP4E, KO_FP4E, 및 LP_FP4E의 3종 효소는 공통적으로 Co, Mg 및 Ni 이온에 의해 활성이 증가하고, Fe 이온에 의한 활성 감소가 가장 크고, Zn 이온에 의해 활성 감소 특성을 나타낸다. 구체적으로, CE_FP4E는 금속 이온을 첨가하지 않은 대조군에 비해, Ca, Co, Mg, Mn 및 Ni 이온에 의해 활성이 증가하고, Fe 및 Zn 이온에 의해 활성이 감소하는 특성을 나타낸다. KO_FP4E는 금속 이온을 첨가하지 않은 대조군에 비해, Co, Mg, Mn 및 Ni 이온에 의해 활성이 증가하고, Ca, Fe 및 Zn 이온에 의해 활성이 감소하는 특성을 나타낸다. LP_FP4E는 금속 이온을 첨가하지 않은 대조군에 비해, Co, Mg, 및 Ni 이온에 의해 활성이 증가하고, Ca, Fe, Mn 및 Zn 이온에 의해 활성이 감소하는 특성을 나타낸다.

상기 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소는 40 내지 75℃, 바람직하게는 45 내지 75℃ 또는 50 내지 75℃로 반응 온도 및/또는 pH 6.5 내지 8.0의 반응 pH에서 효소 활성을 가질 수 있다.

구체적으로, CE_FP4E는 40 내지 75℃에서 안정하며 55 내지 75℃의 온도 범위에서 효소 최대 활성의 75%이상의 활성을 가질 수 있으며, 70℃에서 최대 활성을 가진다. KO_FP4E는 40 내지 75℃에서 안정하며 온도가 증가할수록 활성도 함께 증가하며, 55 내지 75℃의 온도 범위에서 효소 최대 활성의 75%이상의 활성을 가질 수 있다. LP_FP4E는 40 내지 75℃에서 안정하며 55-80 ℃의 범위에서 최대 활성 대비 50% 이상의 활성을 가지거나, 또는 65-75℃의 범위에서 최대 활성 대비 75% 이상의 활성을 가지며, 65℃에서 최대 활성을 가진다.

상기 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소는 CE_FP4E는 pH 7.0에서, KOF6PE와 LPF6PE는 pH 7.5에서 최대 활성을 나타내고, 종 모두 상업화 공정에 적합한 pH 6.5-8.0의 범위에서 최대 활성 대비 75% 이상의 활성을 가진다.

본 발명에 따른 타가토스 생산용 조성물은, 과당에서 과당 6-포스페이트로 전환하는 헥소카이네이즈 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

상기 과당 6-포스페이트는 과당 또는 과당 함유 물질을 헥소카이네이즈 처리하여 얻은 것이 바람직하나 다른 화학적 합성방법 등에 의하여 제공되는 경우에도 본 발명의 보호범위에 포함된다.

상기 과당 6-포스페이트는 포도당 6-포스페이트로부터 제조될 수 있으며, 상기 타가토스 생산용 조성물은, 포도당 6-포스페이트를 이성화하여 과당 6-포스페이트로 전환하는 포도당 6-포스페이트 이성화 효소를 추가로 포함할 수 있다.

상기 포도당 6-포스페이트는 포도당을 직접 인산화하여 제조되거나, 포도당 1-포스페이트에서 전환될 수 있다. 포도당은 전분 또는 전분 가수분해물, 예를 들면 덱스트린 등에 포도당 생성 아밀라제를 처리하여 얻어진 포도당일 수 있고, 포도당 1-포스페이트는 상기 포도당에 인산화 효소를 처리하여 얻어지는 것일 수 있다. 상기 타가토스 생산용 조성물은, 포도당 6-포스페이트를 제조하기 위한 효소 시스템을 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 타가토스 생산용 조성물에 포함되는 효소 및 타가토스 생산에 이용되는 기질이 제한되지 않는다. 본 발명의 타가토스 생산용 조성물은 (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 포도당, 포도당 1-포스페이트, 포도당 6-포스페이트, 또는 과당 6-포스페이트; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소; (iv) 포도당 6-포스페이트-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및/또는 (vi) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 본 발명의 전분/말토덱스트린 포스포릴라아제(starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1) 및 α-글루칸 포스포릴라아제는, 포스페이트(phosphate)를 포도당에 전이시켜 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당 1-포스페이트를 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.

본 발명의 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7)는 포스페이트를 포도당에 전이시켜 수크로스로부터 포도당 1-포스페이트를 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.

본 발명의 전분 액당화 효소인 α-아밀라아제(α-amylase, EC 3.2.1.1), 풀루란아제(pullulanse, EC 3.2.1.41), 글루코아밀라아제(glucoamylase, EC 3.2.1.3) 및 이소아밀라아제(isoamylase)는 전분 또는 말토덱스트린을 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.

본 발명의 수크라제(sucrase, EC 3.2.1.26)는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 발명의 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2)는 포도당 1-포스페이트를 포도당 6-포스페이트로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 포도당인산화효소(glucokinase)는 포도당에 인산을 전이시켜 포도당 6-포스페이트로 전환하는 활성을 가지는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당 인산화효소는 폴리포스페이트 의존형 포도당인산화 효소일 수 있다.

본 발명의 포도당 6-포스페이트 이성화효소는 포도당 6-포스페이트를 과당 6-포스페이트로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.

본 발명의 일 예는, 타가토스 6-포스페이트를 타가토스로 전환시키는 활성을 가지며 타가토스 6-포스페이트에 대한 높은 기질 특이성을 갖는 효소 단백질로서 본 발명에 따른 Ferroglobus placidus 유래 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소(FP_T6PP), 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 접촉시켜 타가토스 6-포스페이트를 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소는 타가토스 6-포스페이트 기질에 특이적으로 높은 활성을 가지고 있기 때문에 타가토스를 높은 비율로 포함하는 최종 반응 생성물을 얻을 수 있다. 높은 타가토스 함량의 반응 생성물을 확보함으로써 기존에 여러 단계를 거쳤던 고농도 타가토스 생산 공정에서 분리, 농축 공정 단계를 생략하여 공정 과정의 간편화 및 생산 단가를 줄이는 이점이 있다. 이에, 상기 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소를 포함하는 타가토스 생산용 조성물은, 타가토스 6-포스페이트에서 탈인산화 반응을 수행하는 파이테이즈(phytase)를 이용한 경우에 비해, 높은 기질 특이성으로 인해 높은 타가토스 함량의 반응 생성물을 확보함으로써 기존에 여러 단계를 거쳤던 고농도 타가토스 생산 공정에서 분리, 농축 공정 단계를 생략하여 공정 과정의 간편화 및 생산 단가를 줄이는 이점이 있다.

상기 타가토스 생산용 조성물을 이용하여 타가토스를 생산하는 효소 또는 효소를 생산하는 미생물을 이용한 반응 온도 및 반응 pH 조건은, 상기 타가토스 제조방법에 관한 효소의 반응온도 및 반응 pH 조건에서 상술한 바와 같다.

구체적으로, 본 발명의 제조방법은 상기 타가토스 6-포스페이트를 타가토스로 전환하는 단계 이전, 과당 6-포스페이트 에피머화 효소, 상기 에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 에피머화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당 6-포스페이트를 타가토스 6-포스페이트로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 과당 6-포스페이트 에피머화 효소에 대한 설명은 상술한 바와 같다.

본 발명의 제조방법은 과당 6-포스페이트를 타가토스 6-포스페이트로 전환하는 단계 이전, 포도당 6-포스페이트에 포도당 6-포스페이트-이성화효소, 상기 포도당 6-포스페이트 이성화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당 6-포스페이트-이성화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당 6-포스페이트를 과당 6-포스페이트로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법은 포도당 6-포스페이트를 과당 6-포스페이트로 전환하는 단계 이전, 포도당 1-포스페이트(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당 1-포스페이트를 포도당 6-포스페이트로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 제조방법은 상기 포도당 1-포스페이트를 포도당 6-포스페이트로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당 1-포스페이트로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 제조방법은 상기 포도당을 포도당 1-포스페이트로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 제조방법은 포도당에 4-α-글루카노트랜스퍼라아제, 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적 예는, 전분을 출발물질로 하여 타가토스를 제조하는 방법으로서 하기 단계를 포함할 수 있다:

(1)전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당 1-포스페이트로 전환하는 단계,

(2) 포도당 1-포스페이트(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당 1-포스페이트를 포도당 6-포스페이트로 전환하는 단계,

(3)포도당 6-포스페이트에 포도당 6-포스페이트-이성화효소, 상기 포도당 6-포스페이트-이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당 6-포스페이트-이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당 6-포스페이트를 과당 6-포스페이트로 전환하는 단계,

(4)과당 6-포스페이트에 에피머화 효소, 상기 에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 에피머화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당 6-포스페이트를 타가토스 6-포스페이트로 전환하는 단계, 및

(5)타가토스 6-포스페이트에서 탈인산화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜 타가토스 6-포스페이트를 타가토스로 전환하는 단계.

본 발명에 따른 타가토스 제조방법에서, 상기 단계 (1) 내지 (5)에 각각 사용되는 효소반응을 순차적으로 수행하거나, 적어도 2종 이상의 효소를 함께 사용한 복합 반응으로 적어도 2이상의 단계를 하나의 반응기에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 상기 단계(1) 내지 (5)에 사용되는 효소를 모두 포함하는 복합 효소 반응을 하나의 반응기에서 수행할 수 있다. 위와 같은 효소반응단계를 동시효소반응(one-pot enzymatic conversions)으로 진행하여 과당에서 타가토스를 생산하는 것보다 높은 전환율로 타가토스를 생산할 수 있다. 이와 같은 방법으로 생산된 타가토스는 기능성 식품 및 의약품에 첨가되어 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 탈인산화 효소 단백질, 더욱 자세하게는 타가토스 6-포스페이트에 대해서만 기질특이성이 높은 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소 단백질은 높은 효소 전환율과 기질 특이성을 가지므로, 산업적 규모로 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소를 이용한 타가토스의 생산에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 예에 따른 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소의 전환활성을 확인하고자, 과당 6-포스페이트를 포함하는 기질액에 반응하여 얻어진 반응생성액을 HPLC로 분석하여 확인한 타가토스 생성비율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따라 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소 단백질의 온도 특성을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따라 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소 단백질의 pH 특성을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따라 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소 단백질의 금속 이온 영향을 나타낸 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5 내지 도 9는 다양한 효소의 탈인산화 활성 평가하고자, 과당 6-포스페이트를 포함하는 기질액에 반응하여 얻어진 반응생성액을 HPLC로 분석하여 확인한 타가토스 생성비율을 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정된 것이 아니다.

실시예 1. 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소의 제조

타가토스 6-포스페이트 탈인산화능을 가지는 효소를 스크리닝하기 위해 Genebank에 등록되어 있는 다양한 효소의 아미노산 서열을 기반으로 구조 모델링 및 기질 도킹을 실시하였다. 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 E.coli strain K-12의 codon usage를 기반하여 optimization한 후 IDT gene 합성을 통해 유전자 합성 의뢰하여 폴리뉴클레오타이드 샘플을 확보하였다. 아래와 같이 테스트한 결과, Ferroglobus placidus 유래된 서열번호 1의 아미노산과 상기 단백질 CDS를 암호화하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 선별하였다(FP_T6PP).

상기 합성된 유전자를 pET-28a 벡터에 삽입하였고, E. coli ER2566 균주에 형질전환하여 재조합 발현 벡터 제작하였다.

상기 형질 전환된 재조합 균주를 3 mL LB-kanamycine 배지(Difco)에 접종한 후 600 nm에서 흡광도가 1.5에 도달할 때까지 37℃, 200rpm에서 진탕 배양한 후, 이 배양액을 100 mL LB-kanamycine 배지에 접종하여 37℃, 200rpm에서 진탕 배양 하였다. 이 배양액의 600 nm에서 흡광도가 0.4 내지 0.6에 도달하면 0.1-0.5 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 목적 효소의 발현을 유도하였다.

단백질 발현이 완료된 배양액은 6000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 회수한 후, 0.85%(w/v) NaCl로 2회 세척 후 효소 정제에 사용하였다. 미생물 내에서 발현된 효소의 활성을 측정하기 위해서 먼저 단백질 정제를 실시하였다.

상기 회수한 균체를 lysis buffer(300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0)에 혼탁시킨 후 음파진동기(Ultrasonic prosessor, ColeParmer)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 이를 13,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였고, 미리 lysis buffer로 평형시킨 Ni-NTA컬럼(Ni-NTA Superflow, Qiagen)에 통액시킨 다음 300 mM NaCl 및 20 mM immidazole을 함유한 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)와 300 mM NaCl 및 200 mM immidazole을 함유한 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충 용액을 순차적으로 흘려주어 목적 단백질을 용출하였다.

각각 용출된 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액(50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0)으로 전환하여 실험에 사용하였다. 정제된 효소는 BCA protein assay를 이용하여 단백질을 정량하였다.

실시예 2: 효소 활성의 분석

타가토스 6-포스페이트에 대한 기질 특이적 탈인산화 활성을 나타내는 효소를 선별하기 위해, 10 mM 과당 6-포스페이트, 1 mM MgCl₂를 함유한 50 mM sodium phosphate(pH 7.0) 완충 용액에, 실시예 1에서 정제한 효소와 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소를 첨가한 후 60℃ 조건에서 12시간 동안 반응을 실시하였고, 100℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지하였다. 상기 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소는 Kosmotoga olearia (KO) 유래의 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해서 암호화되며, 과당 6-포스페이트를 타가토스 6-포스페이트로 전환화는 활성을 갖는 것이다. 상기 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소의 제조 및 정제는 상기 실시예 1의 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 수행하였다.

상기 반응산물액을 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)을 사용하여 타가토스 생성량으로 측정하였다. HPLC 분석 조건은 SUGAR SP0810 컬럼(Shodex)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 RID(Refractive Index Detector, Agilent 1260 RID)를 이용하여 이동상 용매는 물, 온도는 80℃, 유속은 0.6 mL/min로 수행하였다. 상기 HPLC를 이용한 효소 반응생성물의 분석 결과를 도 1에 나타내었다.

상기 실시예 1에서 얻은 효소는 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 활성을 가지나 역반응을 수행하지 않는 비가역적 효소 활성을 나타냈다. 본 실시예에서는 효소의 기질 특이성과 함께 2가지 효소를 투입하여 2가지 반응을 함께 수행함으로써, 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소에 의해 넣어준 기질인 과당 6-포스페이트가 타가토스 6-포스페이트로 전환되고, 전환된 타가토스 6-포스페이트는 동시에 타가토스로 전환되어, 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소가 타가토스 6-포스페이트에 대한 기질특이성이 높을수록, 과당 6-포스페이트가 타가토스로 전환됨을 확인하였다.

실시예 3: 반응 온도 변화에 따른 효소 활성 분석

반응 온도 변화에 따른 효소 활성 변화를 확인하기 위해, 실시예 1에서 정제한 효소를, 10 mM 타가토스 6-포스페이트, 1 mM MgCl₂를 함유한 50 mM sodium phosphate(pH 7.0) 완충 용액에 첨가하고, 40-80℃ 조건에서 30분 동안 효소 반응을 실시하였고, 100℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지하였다.

상기 효소 반응액을 실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로, HPLC를 사용하여 타가토스 생성량을 측정하였다. 반응 온도에 따른 타가토스 생성의 상대 활성을 도 2에 나타낸다. 도 2의 그래프에 나타낸 바와 같이 FP_T6PP는 70℃에서 최대 활성을 나타내었다.

실시예 4: 반응 pH 변화에 따른 효소 활성 분석

반응 pH 변화에 따른 효소 활성 변화를 확인하기 위해, 실시예 1에서 정제한 효소를 다양한 pH의 50 mM 완충 용액(pH 6.0, Sodium citrate buffer; pH 6.5-8.5, Tris-HCl buffer; pH 8.5, Glycine-NaOH buffer)에 10 mM 타가토스 6-포스페이트, 1 mM MgCl₂와 함께 첨가한 후 60℃ 조건에서 30분 동안 반응을 실시하였고, 100℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지하였다. 이후 실시예 2와 같이 실질적으로 동일한 방법으로 HPLC를 사용하여 타가토스를 정량 분석하였다. 반응 온도에 따른 타가토스 생성의 상대 활성을 도 3에 나타낸다.

도 3의 그래프에 나타낸 바와 같이 FP_T6PP는 pH 7.0에서 최대 활성을 나타내었고, 상업화 공정에 적합한 pH 6.5-7.5의 범위에서 최대 활성 대비 80% 이상의 활성을 나타내었다.

실시예 5: 금속이온에 따른 효소 활성 분석

금속이온 종류에 따른 효소 활성 변화를 확인하기 위해 실시예 1에서 정제한 효소에 CaCl₂, CoCl₂, CuSO₄, FeSO₄, MgCl₂, MnCl₂, NiSO₄, 또는 ZnSO₄를 각각 1 mM씩 처리하고 10 mM 타가토스 6-포스페이트, 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0) 완충 용액을 첨가한 후 60℃ 조건에서 30분 동안 반응을 실시하였다. 효소 반응 정지를 위해 100℃에서 5분간 가열하였다. 이후 실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로, HPLC를 사용하여 타가토스를 정량 분석하였고, 금속이온의 종류에 따른 타가토스 생성의 상대 활성을 도 4에 나타낸다.

도 4에 나타낸 바와 같이, FP_T6PP의 경우 Mn, Co, Ni 및 Mg 이온에 의해 활성이 증가하는 특성을 나타낸다. 금속이온을 첨가하지 않은 대조군에서는 활성이 거의 나타내지 않았고, Mg 이온 첨가에 의해 가장 높은 활성 증가 특성을 나타낸다.

비교예 1: 다양한 효소의 탈인산화 활성 평가

(1)재조합 균주를 이용한 효소 생산

실시예 1에 기재된 방법과 실질적으로 동일한 방법으로, 구조 모델링 및 기질 도킹을 통해 선별한 다양한 효소의 활성을 평가하였다.

실험에 사용된 목적 효소 단백질의 아미노산 서열과 폴리뉴클레오타이드 서열, 미생물 유래를 하기 표 1에 나타낸다. CKT6PP 및 DST6PP는 Cof-type HAD-IIB family hydrolase로 알려져 있으며, ART6PP는 5-amino-6-uracil phosphatase로 알려져 있고, HST6PP / MeHT6PP는 Phosphoglycolate phosphatase로 알려져 있다.

효소명	유래 미생물	아미노산 서열	폴리뉴클레오타이드 서열
CKT6PP	Caldicellulosiruptor kronotskyensis	12	13
DST6PP	Desulfosporosinus sp.	14	15
ART6PP	Archaeon HR04	16	17
HST6PP	Halopelagius longus	18	19
MeHT6PP	Methanomethylovorans hollandica DSM 15978	20	21

구체적으로, 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 E.coli strain K-12의 codon usage를 기반하여 optimization한 후 IDT gene 합성을 통해 유전자 합성 의뢰하여 폴리뉴클레오타이드 샘플을 확보하고, 목적하는 단백질 CDS를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 선별하였다. 하기 합성된 유전자를 pET-28a 벡터에 삽입하였고, E. coli ER2566 균주에 형질전환하여 재조합 발현 벡터 제작하였다.

상기 형질 전환된 재조합 균주를 배양하고, 얻어진 배양액의 600 nm에서 흡광도가 0.4 내지 0.6에 도달하면 0.1-0.5 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 목적 효소의 발현을 유도하였다. 단백질 발현이 완료된 배양액은 원심분리하여 균체를 회수한 후, 0.85%(w/v) NaCl로 2회 세척 후 효소 정제에 사용하였다.

미생물 내에서 발현된 효소의 활성을 측정하기 위해서 먼저 단백질 정제를 실시하였다. 구체적으로, 상기 회수한 균체를 파쇄하고 원심분리하여 상등액을 회수하였고, 회수된 상등액을 Ni-NTA컬럼(Ni-NTA Superflow, Qiagen)을 이용하여 목적 단백질을 용출하여 정제된 효소 단백질을 얻었다. 각각 용출된 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액(50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0)으로 전환하여 실험에 사용하였다. 정제된 효소는 BCA protein assay를 이용하여 단백질을 정량하였다.

(2) 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 활성 평가

상기 정제된 효소 단백질의 타가토스 6-포스페이트에 대한 기질 특이적 탈인산화 활성을 갖는 지 여부를, 실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로 시험하였다. 즉 10 mM 과당 6-포스페이트, 1 mM MgCl₂를 함유한 50 mM sodium phosphate(pH 7.0) 완충 용액에, 상기 5종의 정제한 효소와 실시예 2에서 사용한 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소를 첨가한 후 60℃ 조건에서 12시간 동안 반응을 실시하였고, 100℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지하였다. 실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로 HPLC를 사용하여, 상기 반응산물액의 타가토스 생성량으로 측정하였다. 상기 HPLC 분석 결과를 도 5 내지 도 9에 각각 나타내고, HPLC 그래프에 나타낸 각 생성물의 생성 비율을 수치화하여 하기 표 2에 나타낸다. 상기 기질 특이성은 과당과 타가토스의 합계 생성물 중 타가토스가 차지하는 비율 (타가토스 생성 비율, 중량 %)로 표시하였다.

Enzyme	Fructose(g/L)	Tagatose(g/L)	합계 생성량 (g/L)	Tagatose 생성비율
ART6PP	0.1	0.1	0.3	47.7
CKT6PP	0.5	0.3	0.7	35.9
DST6PP	0.2	0.0	0.2	7.1
HST6PP	0.4	0.0	0.4	2.7
MeHT6PP	0.0	0.0	0.0	36.6

<110> SAMYANG COPORATION <120> Tagatose 6-phosphatase with high substrate specificity and use of the same <130> DPP20204579KR <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tagatose 6-phosphate phosphatase of Ferroglobus placidus <400> 1 Met Ile Lys Ala Ile Ala Val Asp Ile Asp Gly Thr Leu Thr Tyr Lys 1 5 10 15 Asp Arg Ser Leu Asn Cys Lys Ala Val Glu Ala Leu Arg Lys Val Asp 20 25 30 Ala Thr Ile Ile Leu Ala Thr Gly Asn Ile Ser Cys Phe Ala Arg Thr 35 40 45 Ala Ala Lys Leu Ile Gly Val Ser Asp Ile Ala Ile Cys Glu Asn Gly 50 55 60 Gly Val Val Arg Phe Asp Tyr Asp Gly Glu Asp Ile Ile Leu Gly Asp 65 70 75 80 Lys Ser Lys Cys Leu Lys Ala Val Glu Ile Leu Lys Lys His Tyr Arg 85 90 95 Val Glu Leu Leu Asp Asp Asp Tyr Arg Lys Ser Glu Val Cys Leu Arg 100 105 110 Arg Thr Phe Pro Ile Asp Glu Ala Lys Lys Leu Leu Pro Glu Asp Val 115 120 125 Arg Ile Ile Asp Ser Gly Phe Ala Tyr His Ile Thr Asp Arg Glu Val 130 135 140 Ser Lys Gly Lys Ala Leu Lys Phe Ile Ala Glu Lys Leu Gly Ile Lys 145 150 155 160 Leu Glu Glu Ile Val Ala Ile Gly Asp Ser Glu Asn Asp Ile Asp Met 165 170 175 Phe Glu Val Ala Gly Ile Gly Val Ala Val Ala Asn Ala Asp Val Arg 180 185 190 Leu Lys Arg Val Ala Asp Val Val Thr Ser Lys Pro Asn Gly Asp Gly 195 200 205 Val Val Glu Ala Leu Glu Phe Leu Gly Leu Ile 210 215 <210> 2 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tagatose 6-phosphate phosphatase of Ferroglobus placidus <400> 2 atgattaagg ccattgcagt ggatatcgat ggcacgctga catacaaaga tcgctcgtta 60 aattgcaaag cggttgaagc gttacgcaaa gtggatgcta ctatcatcct ggcgaccggt 120 aatattagtt gctttgcccg caccgcggcg aaactgattg gcgttagcga tattgcgatt 180 tgcgaaaacg gcggtgtggt acgctttgat tatgatggcg aagatattat tctgggggat 240 aaaagcaaat gcctgaaggc tgttgaaatt ttgaagaaac actaccgcgt agaactgtta 300 gatgacgact atcgtaaaag cgaagtatgt cttcgccgca cctttccgat tgatgaggcc 360 aagaaacttc tgccagagga cgttcgtatt attgatagtg gctttgccta ccatatcacg 420 gaccgcgagg tttcaaaggg caaagcgttg aaatttattg cggagaaact gggcattaaa 480 ttagaggaaa tcgttgccat cggcgactca gaaaatgata ttgacatgtt tgaggttgcg 540 ggaatcggtg ttgccgtggc caatgctgat gtacgtctga aacgcgttgc cgacgtggtg 600 acgagtaagc cgaatggtga tggcgttgtg gaggccttag aatttcttgg tttaatctaa 660 660 <210> 3 <211> 415 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fructose 6-phosphate epimerase of Caldisericum exile <400> 3 Met Trp Leu Asp Ser Asn Phe Leu Lys Asn Arg Gly Ile Phe Ser Ile 1 5 10 15 Cys Ser Ser Asn Glu Asn Val Leu Asp Ala Ser Ile Glu Phe Ala Lys 20 25 30 Glu Lys Glu Asp Phe Leu Leu Ile Glu Ala Thr Cys His Gln Val Asn 35 40 45 Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Lys Met Thr Pro Glu Ser Phe Ser Lys Lys 50 55 60 Ile Phe Lys Lys Ala Glu Glu Met Asn Phe Asn Pro Glu Arg Leu Leu 65 70 75 80 Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Glu Pro Trp Lys Asn Glu Asn Ala 85 90 95 Asp Thr Ala Met Asp Lys Ala Lys Gln Leu Val Ile Glu Phe Val Lys 100 105 110 Asn Gly Phe Asn Lys Ile His Leu Asp Cys Ser Met Pro Leu Lys Gly 115 120 125 Asp Ser Asp Phe Ser Thr Thr Leu Val Ala Asp Arg 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Fructose 6-phosphate epimerase of Caldisericum exile <400> 5 atgtggctgg attcaaattt cttgaagaat cgtggcatct tttcaatctg ttccagtaac 60 gaaaatgttc ttgatgcgtc gattgaattc gcgaaagaaa aagaggattt cctgttgatt 120 gaagcaacct gccatcaagt caatcagttc ggcgggtata ctaagatgac acctgagtca 180 ttctcgaaga aaatctttaa gaaggcggaa gaaatgaact ttaatcctga gcgcttattg 240 ttaggtgggg accatttagg tcccgaaccc tggaaaaacg aaaatgctga taccgcaatg 300 gataaagcaa aacagttggt catcgagttt gtgaagaatg gttttaacaa aatccactta 360 gactgtagca tgccacttaa aggggactcc gatttcagta cgaccttagt agcagatcgt 420 gaggcagaat tatgtgcagt tgctgaagaa acttatgaga aatatggagg gaaccgtcct 480 gtgtacgtgg tagggacgga agttccggca cctggaggaa gtactaacga agtaccagag 540 gttacttcta ttgaagagct ggatgaaatg attgaggagc ttcaaaacgc atttttacgc 600 ttaggcttga agaacgcttg ggaccgtgtg attgcgatcg tagtgcgcct tgggatcggc 660 tttggcggtg actcagtatc cgagtacgaa agtgaaaaaa cgaaagaact ttgcacctat 720 ttatcgcgct actatccgtc tctttacttt gaagctcact cgacagatta ccagaccgcc 780 ggctccctga aacagatggt caaagacgga atccgtatcc tgaaggtggg acctgcactg 840 acagacgctt atcgccgtgg catgtttgct ttgaatttta tcgaaaaaga gtccattgac 900 gaggaaaaac agtctcgtct ggtcgagaat gtcttaaaag taatggatga gtaccctcgt 960 tactgggaag actattacaa ttccgtaggt aaaacacttc gtttggacca aatgtactca 1020 tacttcgacc gtattcgcta ttattggggt tttgaagagg tagagaaaag caagaatcgt 1080 ctgattgaga acttgaagga tatgcagatg aacctgattc gtcaatatct tccagaacaa 1140 tacgaaaaga tccgcgaaaa caaattgaat aaggaccccc gtgccttgat caattatgag 1200 atcaaaaagg tccttaacga ctaccagaag tcggtcattc tggaataa 1248 <210> 6 <211> 435 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fructose 6-phosphate epimerase of Kosmotoga olearia <400> 6 Met Lys Lys His Pro Leu Gln Asp Ile Val Ser Leu Gln Lys Gln Gly 1 5 10 15 Ile Pro Lys Gly Val Phe Ser Val Cys Ser Ala Asn Arg Phe Val Ile 20 25 30 Glu Thr Thr Leu Glu Tyr Ala Lys Met Lys Gly Thr Thr Val Leu Ile 35 40 45 Glu Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Gly Met 50 55 60 Thr Pro Ala Asp Phe Arg Glu Met Val Phe Ser Ile Ala 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caacggttct tatagaggcc acctgcaatc aggtaaacca gttcggtggc 180 tacaccggta tgactcctgc tgatttcaga gaaatggttt tttctatcgc tgaggatatt 240 ggacttccca aaaataaaat catccttggt ggcgaccatc ttggcccaaa tccctggaag 300 ggtcagccgt cagatcaggc tatgcgtaac gccattgaaa tgattcgaga atacgctaaa 360 gctgggttta ccaagcttca tctggatgcc agcatgcgtc ttgcagacga tccggggaac 420 gaaaacgagc cgctgaaccc ggaagttata gcggaaagaa cagctcttct ctgtcttgaa 480 gccgagaggg cttttaaaga atccgccggt tctctccggc ctgtttacgt tattggtacg 540 gatgttccgc caccgggtgg agcgcaaaac gaaggtaaat cgattcatgt aaccagtgtt 600 caggattttg agcgtaccgt tgagttgacc aaaaaggcat ttttcgacca tggtttgtat 660 gaagcctggg gaagggtgat tgcggttgtt gtgcaaccgg gagtagaatt cgggaatgaa 720 catatattcg aatatgatag aaatcgagcg agagaactta ctgaggcgat aaaaaagcat 780 ccaaatatag tttttgaagg tcactcgaca gattatcaaa cggcaaaagc attgaaagaa 840 atggtagaag acggtgtagc catactcaag gttgggccag ctctaacatt tgcgctcaga 900 gaggcttttt ttgcgttgag cagcattgaa aaagagttat tttatgatac acccgggctt 960 tgttcaaact ttgttgaagt 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tccgggtaac 420 gagaacgagc ccctgaaccc ggaagtgatc gccgaacgca ccgcgttact ttgtctggaa 480 gcggaacgtg cctttaaaga aagcgcaggc tccttgcgcc cggtgtatgt gatcggcact 540 gatgttccac cacctggtgg tgcccaaaat gagggcaaat caattcatgt gacctctgta 600 caggactttg agcgcacggt agaattaaca aaaaaagcgt ttttcgatca cgggctgtat 660 gaagcgtggg gccgcgttat tgcagtggta gtccagcccg gtgttgaatt cggaaacgaa 720 cacattttcg aatacgatcg caatcgtgcg cgtgaactta ccgaagcaat taagaagcac 780 ccgaatatcg tctttgaagg ccattcaacc gactaccaga ccgcaaaggc gctgaaagaa 840 atggtggagg atggcgttgc catcctgaaa gtcggcccag cgttgacgtt tgcgctgcgt 900 gaagctttct tcgctttaag ctccattgag aaagagctgt tctatgatac tccgggatta 960 tgctcgaact ttgtcgaagt tgttgaacgc gcgatgcttg acaatccgaa gcactgggag 1020 aaatactatc agggtgagga acgtgaaaat cgcctggccc gcaagtatag ctttttggac 1080 cgtctgcgct actattggaa cctgcccgag gttcgtacgg cggtaaacaa actgattacg 1140 aaccttgaaa ccaaagaaat tccactgacc ttgatttctc aatttatgcc tatgcagtac 1200 cagaagattc gcaacgggct tttgcgcaaa gatccaattt ctcttatcaa ggatcgcatc 1260 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fructose 6-phosphate epimerase of Limnochorda pilosa <400> 11 atgcgtcaag taatttgggg ccaaggaaca cgtgatccgc gtggaatcta tagtgtgtgt 60 actgcggatc cactggtctt gcgtgcagcg cttaagcagg cggttgaaga cgggagccct 120 gcgttaatcg aagcgacctc aaaccaggtg aaccaatttg gtgggtacac cggtatggaa 180 cctcctgcct tcgtggaatt cgtactgggt ctggcgcgtg aaatgggctt accgccagaa 240 cgcctgatct tgggcggtga tcacttggga ccaaatccat ggcaacgtct ggcggcggaa 300 gaagccatgc gccatgcatg tgatctggtg gaagcgtttg tcgcttgcgg attcactaaa 360 attcatctgg atgcttccat gccacttggt gaagaacgtg caggtggtgc actgtctaaa 420 cgtgtggttg cggaacgtac cgctcagtta tgtgaggccg cggaagcagc gttccgtaag 480 cgtagtcaag cggaaggcgc aagtgcgcca ccgttatacg ttatcgggtc cgatgttcct 540 ccccctggcg gagaaacctc tggctcacag ggccctaaag tcactactcc ggaggaattt 600 gaagaaaccg ttgcactgac acgtgccacg tttcatgacc gcggtcttga tgatgcatgg 660 ggtcgtgtta ttgcggtggt tgtccaaccg ggcgtggatt ttggcgaatg gcaggtgcat 720 ccctacgatc gtgcggcagc agcctcatta actcgcgctc tgacgcagca tccgggatta 780 gcttttgaag ggcacagcac cgattatcag accccgggtc gcctgcgtca aatggcagag 840 gacggtattg cgattcttaa agttggccct gcactgacct tcgcaaaacg cgaagcactc 900 ttcgcactga atgccttgga aagcgaggta ttgggaacag atggccgtgc gcgtcgttcc 960 aatgtcgaag cagcattgga agaagcgatg ttagctgacc cgcgccattg gagtgcctat 1020 tacagcggag atgaacacga actgcgcttg aaacgcaagt atggtctgag tgatcgctgc 1080 cgctactatt ggcctgtacc gtcagttcag gaggcggttc aacgtttact gggtaatctg 1140 cgtgaagcag gcatcccttt acctcttctg agccagtttc tgccgcgcca gtatgaacgt 1200 gtacgtgagg gtgttttacg caacgaccct gaagaacttg tcttggatcg tattcgtgac 1260 gtccttcgtg gctatgctgc agccgttgga acaggtgcac gtcgcgcaga accgtctcca 1320 gcataa 1326 <210> 12 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tagatose 6-phosphatase of Caldicellulosiruptor kronotskyensis <400> 12 Met Tyr Lys Leu Ile Ala Ile Asp Leu Asp Met Thr Leu Leu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Lys Asn Ile Ser Ser Arg Asn Lys Arg Ala Ile Glu Leu Val Lys 20 25 30 Gln Lys Gly Val Gln Ile Val Leu Cys Ser Gly Arg Ile Leu Lys Gly 35 40 45 Val Met Tyr Phe Ala Lys Val Leu Gly Leu Tyr Asp Gln Val Ile Val 50 55 60 Ala Cys Asn Gly Ala Ile Val Arg Asp Leu Lys Lys Asn Lys Asp Ile 65 70 75 80 Tyr Tyr Ile Gly Leu Glu Asn Ser Lys Ser Leu Glu Ile Ala Arg Ile 85 90 95 Cys Lys Glu Asn Asp Ile Tyr Tyr His Tyr Tyr Phe Gln Asp Thr Met 100 105 110 Ile Ala Arg Arg Leu Asp Tyr Ser Ser Lys Phe Tyr Tyr Glu Lys Asn 115 120 125 Lys Glu Leu Pro Glu Glu Glu Arg Ile Asn Ile Ile Ile Asp Asp Ser 130 135 140 Glu Asn Thr Ile Lys Ala Cys Gly Asp Leu Ile Thr Lys Phe Val Ile 145 150 155 160 Ile Asp Lys Asp Leu Glu Lys Val Asn Tyr Val Arg Lys Ile Ile Glu 165 170 175 Ser Lys Ile Pro Gly Ile Glu Thr Thr Lys Ser Asp Ile Asn Ile Leu 180 185 190 Glu Val Met Lys Glu Gly Val Asn Lys Lys Arg Ala Leu Glu Phe Val 195 200 205 Ile Ser Tyr Leu Gly Ile Ala Pro Glu Glu Val Met Ala Ile Gly Asp 210 215 220 Asn Glu Asn Asp Leu Glu Met Val Glu Phe Ala Gly Leu Gly Val Ala 225 230 235 240 Met Gly Asn Ala Ile Glu Glu Leu Lys Lys Ile Ala Asp Tyr Val Thr 245 250 255 Ser Ser Tyr Glu Asn Asp Gly Val Ala Arg Ala Ile Glu Lys Phe Val 260 265 270 Leu Gly Glu Thr Ile Asn Val 275 <210> 13 <211> 840 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tagatose 6-phosphatase of Caldicellulosiruptor kronotskyensis <400> 13 atgtacaaac ttatcgctat tgatttggac atgacgctgt tggacaagaa caagaacatc 60 agttctcgca acaagcgtgc catcgaactg gttaagcaaa aaggggtcca aattgttctg 120 tgctcgggac gtatcttaaa aggcgttatg tattttgcca aagtgctggg cttgtatgac 180 caggttattg tcgcctgtaa tggggcaatt gtgcgcgatc ttaagaaaaa caaggacatc 240 tactatatcg ggttggaaaa ctcaaaatct ttagagattg cccgtatctg caaagaaaat 300 gatatttatt atcattatta ctttcaggac acaatgatcg cccgccgcct tgattactca 360 tcaaaattct actacgaaaa gaacaaagag ctgccggaag aggaacgcat caacatcatt 420 attgacgatt cggagaatac aatcaaagca tgtggagatc tgattaccaa gttcgtcatc 480 attgacaaag accttgagaa agtgaactat gtgcgtaaga ttattgagtc aaaaatcccc 540 ggtattgaga ctacaaaaag cgatattaac attttagagg taatgaagga aggtgttaac 600 aaaaagcgcg ccttggaatt tgtcattagt tacttgggaa tcgcacctga agaggtaatg 660 gcaattggag ataatgagaa cgacttagag atggtggagt tcgccggttt gggtgtggca 720 atgggtaacg ctattgagga gcttaaaaag attgctgact atgttacgtc gagctatgag 780 aacgatggtg ttgcccgtgc aatcgaaaaa ttcgtcttgg gcgagacgat caatgtataa 840 840 <210> 14 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Desulfosporosinus sp. <400> 14 Met Thr Ile Arg Leu Val Ala Met Asp Leu Asp Asp Thr Leu Leu Arg 1 5 10 15 Asn Asp Trp Thr Ile Ser Pro Arg Val Val Lys Ala Ile Arg Lys Ala 20 25 30 Gln Asp Gln Gly Val Lys Met Thr Ile Ala Thr Gly Arg Met Pro Ile 35 40 45 Ser Ala Arg Pro Tyr Val Glu Gln Leu Gly Val Asp Val Pro Val Ile 50 55 60 Thr Tyr His Gly Ala Met Ile Gln Gln Val Leu Ser Gly Asp Ile Leu 65 70 75 80 Phe Arg Arg Val Ile Pro Ser Ala Leu Ala Thr Glu Ile Val Gln Asp 85 90 95 Leu Ala Lys Arg Gly Val Tyr Val Gln Ile Tyr Leu Lys Asp Arg Val 100 105 110 Ile Thr Ala Glu Leu Asn Asp Leu Ser Tyr Glu Tyr Ala Arg Ile Ser 115 120 125 Ser Val His Ile Glu Glu Ala Asp Leu Ser Ile Val Leu Ser Arg Glu 130 135 140 Pro Glu Gly Val Glu Lys Ile Leu Leu Met Gly Glu Glu Ala Ala Leu 145 150 155 160 Asp Gln Leu Ala Pro Leu Leu Gln Gln Cys Tyr Gly Glu Lys Val His 165 170 175 Leu Thr Lys Ser Lys Pro Cys Phe Leu Glu Met Thr Asp Gly Ser Val 180 185 190 Asn Lys Gly Val Ala Leu Ala Ala Leu Ala Asp His Phe Gly Ile Asp 195 200 205 Arg Ala Glu Val Met Ala Ile Gly Asp Ser Phe Asn Asp Leu Glu Met 210 215 220 Ile Gln Tyr Ala Gly Leu Gly Val Ala Met Gly Asn Ala Arg Pro Glu 225 230 235 240 Ile Gln Glu Gln Ala Asp Ile Val Thr Val Thr Asn Glu Glu Asp Gly 245 250 255 Val Ala Glu Ala Ile Glu Arg Tyr Val Leu Glu Ile Gly 260 265 <210> 15 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Desulfosporosinus sp. <400> 15 atgacaatcc gtttggtcgc gatggacctt gatgacacac ttcttcgtaa tgattggacg 60 attagtcccc gcgtagtcaa agccatccgc aaggcgcagg accagggagt caaaatgacg 120 atcgctactg ggcgtatgcc aatctcagca cgtccatatg tggaacaact gggtgtggat 180 gtccccgtca tcacctatca tggcgcaatg attcagcaag tcttgtcagg ggacatctta 240 ttccgtcgtg taatcccgag cgcgttggca acggaaattg ttcaagacct ggcgaagcgc 300 ggggtttacg tgcaaattta cttaaaggac cgtgtgatca ctgcggagct taatgacctg 360 agctatgagt acgctcgcat cagttccgtc catatcgaag aagcagattt gtccattgtt 420 ttaagtcgtg agcccgaagg tgtagaaaag attttattaa tgggtgagga ggctgcgttg 480 gaccaattgg ctccacttct tcaacaatgt tatggcgaaa aagtacattt aacaaagagt 540 aagccctgct ttttggagat gacagatggg tctgtaaata agggggttgc gcttgcggct 600 ttagctgacc acttcggcat cgatcgtgct gaagtaatgg caatcgggga ttcatttaat 660 gaccttgaga tgatccagta tgcaggttta ggtgtcgcaa tgggtaatgc tcgtcctgag 720 attcaagaac aggcagacat cgtgacagtg acaaatgagg aggatggtgt tgctgaggcc 780 atcgaacgct atgttcttga aatcggctaa 810 <210> 16 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Archaeon HRO4 <400> 16 Met Ser Ile Lys Gln His Asn Tyr Leu Phe Phe Ile Lys Leu Glu Val 1 5 10 15 Gly Arg Met Lys Val Arg Ala Phe Ala Ile Asp Ile Asp Gly Thr Leu 20 25 30 Thr Glu Asn Gly Ser Arg Val His Leu Gln Ser Leu Ser Met Leu Arg 35 40 45 Ala Leu Glu Arg Ser Gly Tyr Arg Val Leu Phe Val Thr Gly Arg Ser 50 55 60 Ser Ile Glu Ala Tyr Ile Leu Ala Met Phe Leu Gly Thr Thr Arg Val 65 70 75 80 Ala Ile Gly Glu Asn Gly Gly Val Ile Thr Thr Ser Pro Thr Glu His 85 90 95 Met Leu Leu Val Asp Lys Cys Tyr Ser Glu Arg Ala Tyr Glu Leu Leu 100 105 110 Arg Ser Arg Ile Ala Asp Val Arg Leu Lys Pro Val Phe Pro Arg Met 115 120 125 Thr Glu Val Val Leu Glu Arg Thr Phe Ser Ile Asp Asp Ala Met Asp 130 135 140 Ile Ile Arg Lys Glu Gly Leu Pro Val Val Ile Val Asp Ser Met Tyr 145 150 155 160 Ala Tyr His Ile Asn His Glu Ser Ile Asn Lys Ala Val Gly Leu Gly 165 170 175 Val Ala Leu Asp Asn Leu Gly Ile Arg Leu Glu Glu Cys Ile Ala Ile 180 185 190 Gly Asp Ser Ala Thr Asp Ile Pro Leu Phe Leu Ser Cys Gly Tyr Ser 195 200 205 Ile Ala Ile Gly Asn Ala Asp Asp Gly Val Lys Ser Met Ala Lys Val 210 215 220 Ser Val Lys Gly Lys Asn Gly Asn Gly Leu Ile Glu Ala Leu Gln Tyr 225 230 235 240 Val Val Asp Asn Met Val Glu Met Val Asp Asp Cys Asp Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Asn Ser Asn Ser Asn Ser Asn Ser Asn Lys 260 265 <210> 17 <211> 804 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Archaeon HRO4 <400> 17 atgtcaatta aacaacacaa ctatttattc ttcattaagc tggaagttgg ccgcatgaaa 60 gtgcgtgcct ttgccattga tattgatggc actttgaccg aaaatggcag tcgcgtccac 120 ctgcagagct taagcatgct gcgcgcgctc gaacgtagtg gctaccgcgt actgttcgtg 180 accggccgta gcagcatcga agcctatatt ctggcgatgt ttctgggcac cactcgcgtg 240 gcaattggcg aaaacggtgg cgtcatcact acctcaccga ccgaacatat gctgttggtg 300 gataaatgct actcggaacg cgcatacgaa ctgctccgca gccgcattgc cgatgtccgc 360 ctgaaacctg tttttcctcg catgaccgag gtggttttgg agcgcacgtt ttcgatcgat 420 gacgccatgg atattattcg taaggaaggc ctgccggttg ttattgtgga ttcgatgtat 480 gcctatcaca ttaatcacga aagcattaac aaagccgttg gcttgggcgt tgcgctggat 540 aacctgggca ttcgtctgga ggaatgtatt gccattggtg atagcgccac cgatatccct 600 cttttcttga gctgcggata tagcatcgcg attggtaatg ccgatgatgg cgtgaaatct 660 atggcgaaag tatcggtgaa gggcaaaaat ggcaacggct tgattgaagc gctgcagtac 720 gtggtggata atatggtgga aatggtggat gattgcgact catccagttc taacagcaac 780 agcaattcta attccaataa gtaa 804 <210> 18 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Halopelagius longus <400> 18 Met Glu Thr Ala Val Pro Pro Ile Val Leu Asp Ile Asp Gly Thr Leu 1 5 10 15 Thr Asp Ala Pro Gly Arg Leu Asp Pro Arg Val Phe Asp Val Leu Pro 20 25 30 Thr Trp Asp Ala Pro Val Val Leu Ala Thr Gly Lys Ala Phe Pro Tyr 35 40 45 Pro Val Ser Leu Cys His Tyr Ile Gly Ile Glu Gln Thr Val Val Ala 50 55 60 Glu Asn Gly Gly Val Val Leu Ala Ala Gly Glu Val Ser Tyr Asn Ala 65 70 75 80 Asp Arg Asp Ala Ala Gln Ala Ala Ala Glu Glu Phe Glu Ala Arg Gly 85 90 95 Gly Asp Val Gly Trp Gly Glu Phe Asp Pro Val Asn Lys Trp Arg Glu 100 105 110 Thr Glu Val Ala Val Asn Leu Ser Ala Asp Glu Asp Leu Leu Arg Glu 115 120 125 Val Ala Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Val Leu Asp Thr Gly Tyr Ala Tyr 130 135 140 His Val Lys Thr Pro Gly Ile Glu Lys Gly Asp Gly Leu Arg Ala Ile 145 150 155 160 Cys Glu Thr Leu Asp Leu Asp Pro Ala Glu Phe Val Ala Ile Gly Asp 165 170 175 Ser Glu Asn Asp Ala Ser Thr Phe Glu Val Ala Gly Arg Ser Tyr Ala 180 185 190 Val Ala Asn Ala Asp Asp Val Ala Lys Ala Ala Ala Asp Glu Val Leu 195 200 205 Glu Glu Ser Tyr Met Asp Gly Thr Leu Ser Val Leu Asp Ser Leu Arg 210 215 220 Glu 225 <210> 19 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Halopelagius longus <400> 19 atggagacag cggtgccccc cattgttctt gatattgatg gaactttaac cgatgctcct 60 ggacgcttag atccccgcgt tttcgatgta ttaccaactt gggacgcacc tgtcgtatta 120 gctaccggca aagcctttcc ctaccctgtg tccctttgcc attatattgg aattgaacaa 180 actgtagtcg cagaaaatgg aggggtagtg cttgcagcag gagaagtcag ctacaatgca 240 gatcgcgacg cggctcaagc cgccgcggag gaattcgaag ctcgtggggg tgacgtgggg 300 tggggcgaat ttgatcctgt taataagtgg cgcgagacgg aggtcgccgt taacttgtct 360 gcggatgagg atcttcttcg cgaggtggca gcggagtacg atcttgaagt gctggacact 420 ggctacgcat accacgttaa gactccgggc atcgagaagg gtgacggatt acgcgccatt 480 tgtgagacgc tggatttgga ccctgctgag tttgtggcaa ttggagattc agaaaacgat 540 gcctctactt tcgaggttgc aggtcgctcg tacgcggtag caaatgccga tgacgtggcg 600 aaggccgcag cagacgaagt tcttgaggag tcgtatatgg acggcaccct gagtgttctg 660 gactcacttc gtgagtag 678 <210> 20 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Methanoregulaceae archaeon PtaB.Bin009 <400> 20 Met Asn Arg Ser Phe Cys Leu Lys Gly Leu Val Thr Asp Ile Asp Gly 1 5 10 15 Thr Ile Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ile His Thr Gly Ala Ile Glu Ile 20 25 30 Leu Arg Asp Leu Met Glu Lys Gly Val Tyr Val Val Leu Ala Ser Gly 35 40 45 Asn Thr Ser Cys Phe Met Asp Ala Val Ser Lys Met Ile Gly Thr Pro 50 55 60 Gly Thr Tyr Ile Gly Glu Asn Gly Gly Ile Ile Arg Asn Gly Tyr Gly 65 70 75 80 Gln Asp Ile Thr Leu Leu Gly Asp Gly Ala Ala Pro Arg Lys Ala Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Val Glu Ala Tyr Gln Arg Lys Gly Ile Ser Ile Glu His 100 105 110 Tyr Ser Leu Pro Tyr Arg Phe Val Asp Val Ala Phe Ala Arg Thr Leu 115 120 125 Pro Val Asp Glu Val Arg Gly Ile Leu Glu His His Pro Val Glu Val 130 135 140 Leu Asp Thr Gly Phe Ala Ile His Ile His Pro Pro Gly Val Asn Lys 145 150 155 160 Gly Val Ser Phe Ser Glu Leu Ala Arg Ala Met Gly Leu Asp Thr Arg 165 170 175 Asp Phe Leu Ala Val Gly Asp Ala Glu Asn Asp Ile Glu Leu Leu Arg 180 185 190 Arg Ala Gly Ile Gly Val Ala Val Ala Asn Ala His Pro Gln Leu Val 195 200 205 Leu Tyr Ala Asp His Val Thr Glu Arg Glu Cys Gly Asp Gly Phe Ile 210 215 220 Glu Gly Val Lys Lys Tyr Met Ala Tyr Phe Leu Glu Arg 225 230 235 <210> 21 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methanoregulaceae archaeon PtaB.Bin009 <400> 21 atgaaccgca gtttctgtct taagggcctg gtgaccgata ttgatggcac catcacggat 60 ccccgtcgcc gcatccacac cggagcgatc gagatcctgc gcgatctgat ggaaaaaggt 120 gtgtatgtgg tcctggcatc tggtaacacc agctgtttta tggatgcagt ctcgaaaatg 180 attggcaccc cgggtactta cattggtgaa aacgggggca tcattcgcaa tggttacggc 240 caggatatta cattacttgg agatggtgcg gcaccccgta aggcactctg tgatttagta 300 gaagcgtacc aacgtaaagg tatctcaatc gaacattact cgttgcccta tcgtttcgtc 360 gatgtggcgt tcgctcgtac gctcccggtc gatgaggttc gcggtatcct ggaacatcat 420 cctgtagagg ttcttgatac cggttttgcg atccatatcc atccaccggg ggttaacaaa 480 ggcgtaagct tcagcgaact ggcccgcgcg atggggctgg atacccgcga ctttcttgcg 540 gttggtgacg ccgaaaacga tatcgaatta ctgcgccgtg ccggcattgg ggtagctgtg 600 gcgaatgcgc atccgcaact tgtgctgtat gcagatcatg ttaccgaacg cgaatgcggc 660 gatggcttca tcgaaggcgt taaaaaatac atggcttatt ttctggaacg ttaa 714

Claims (7)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열과 75% 이상의 아미노산 서열 상동성 (identity)을 가지며, 타가토스 6-포스페이트 (tagatose 6-phosphate)를 탈인산화하여 타가토스로 전환시키는 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소 단백질.
2. 제1항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열과 85% 이상의 뉴클레오타이드 서열 동일성 (identity)을 가지는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 것인 효소 단백질.
3. 제1항에 있어서, 상기 효소는 과당 6-포스페이트와 타가토스 6-포스페이트를을 함유하는 혼합 기질을 이용한 반응생성물의 전체 탈인산화당 100중량%를 기준으로 50 중량%이상의 타가토스 함량을 갖는 것인 효소 단백질.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 타가토스 6-포스페이트 탈인산화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과 타가토스 6-포스페이트를 접촉하여 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는, 타가토스의 제조방법.
7. 제6항에 있어서, 과당 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과 과당 6-포스페이트를 접촉하여 타가토스 6-포스페이트를 제조하는 단계를 추가로 수행하는 것인 제조방법.

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