KR102509561B1 - 높은 기질 특이성을 갖는 탈인산화 효소 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 탈인산화 효소 단백질, 더욱 자세하게는 알룰로스-6-인산에 대해서만 기질특이성이 높은 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 균주, 상기 균주를 이용한 알룰로스 생산용 조성물에 관한 것이다.

Description

높은 기질 특이성을 갖는 탈인산화 효소 단백질 및 이의 용도{Phosphatase with high substrate specificity and use of the same}
본 발명은 탈인산화 효소 단백질, 더욱 자세하게는 알룰로스-6-인산에 대해서만 기질특이성이 높은 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 균주, 상기 균주를 이용한 알룰로스 생산용 조성물에 관한 것이다.
산업적으로 과당을 원료로 하여 알룰로스를 제조하고자 하는 경우에, 사용되는 효소는 산업적 생산조건, 특히 열안정성이 높으며, 최대한 높은 전환율을 가져야 하며, 또한 당을 기질로 사용하므로 당의 갈변화가 알칼리 조건에서 쉽게 일어나므로 가급적 당의 갈변이 방지되는 전환 반응 조건을 충족할 필요가 있다.
따라서, 산업적으로 사용하기에는 적합한 기질 전환율, 효소의 열안정성, 및 효소 반응조건을 적어도 하나 이상 만족하며, 과당을 원료로 하여 인산화 과당을 제조하는 효소 및 이를 이용한 인산화 과당의 생산 방법이 절실히 필요한 실정이다.
자연에 존재하는 대부분의 탈인산화 효소는 특정 기질에 대한 특이성이 높지 않아서 반응 중간물질인 포도당-1-인산, 포도당-6-인산, 과당-6-인산까지 동시에 모두 탈인산화시켜 높은 수율의 알룰로스를 생산하기에 어려움이 있다.
본 발명에서는 알룰로스-6-인산에 대해서만 기질특이성이 높은 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소를 확보함으로써 알룰로스 생산 효율을 높이고자 하였다.
본 발명의 일 예는 높은 기질 특이성을 갖는 탈인산화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 높은 기질 특이성을 갖는 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 알룰로스-6-인산을 탈인산화하여 알룰로스를 제조하는 방법, 및 알룰로스 생산용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일 예는, 높은 기질 특이성을 갖는 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 알룰로스 생산용 조성물 및 알룰로스의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열 상동성이 30%이상, 40%이상, 50%이상, 60%이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소 단백질에 관한 것이다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명의 구체적인 일 예는 서열번호 1 아미노산 서열과 서열 상동성이 30%이상, 40%이상, 50%이상, 60%이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 제공한다. 상기 과당-6-인산 3-에피머화 효소는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 50%이상, 60%이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
상기 수치의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 효소와 동일하거나 상응하는 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소 기능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
상기에서 용어 "상동성" 또는 "일치성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다.
본 발명에 따른 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소는, 알룰로스-6-인산(allulose 6-phosphate)의 6-인산의 탈인산화 반응을 촉매하며, 알룰로스로 전환할 수 있으나, 알룰로스를 알룰로스-6-인산으로 역반응을 촉매하지 않는 비가역적 효소 활성을 가진다.
본 발명에 따른 효소 단백질인 알룰로스-6-인산 기질에 대한 높은 특이성을 가지며, 포도당-1-인산 및 포도당-6-인산에 대한 전환특성이 없거나 매우 낮은 특징을 가진다. 상기 효소는 포도당-6-인산 또는 포도당-1-인산의 포도당으로 전환하는 전환율에 대한 알룰로스-6-인산의 전환하는 전환율의 비율이 20배 이상, 50배 이상, 또는 100배 이상일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 효소는 과당-6-인산에 비해 알룰로스-6-인산에 대한 높은 기질 특이성을 가지며, 구체적으로 과당-6-인산과 알룰로스-6-인산을 함유하는 혼합 기질 또는 포도당-1인산, 포도당-6-인산, 과당-6-인산 및 알룰로스-6-인산을 함유하는 혼합 기질 에 작용시킨 경우, 반응생성물의 전체 탈인산화당 조성 100중량%를 기준으로 60 중량%이상, 65 중량%이상, 70 중량%이상, 75 중량%이상, 78중량%이상, 또는 80중량%이상으로 알룰로스를 생성하는, 알룰로스-6-인산에 대한 높은 기질 특이성을 가진다. 본 발명에 따른 효소는 과당-6-인산의 과당으로 전환하는 전환율에 대한 알룰로스-6-인산의 알룰로스로 전환하는 전환율의 비율이 6배 이상, 7배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상, 10 배 이상, 11 배 이상, 12 배 이상, 13 배 이상, 14 배 이상, 또는 15 배 이상, 예를 들면 6 내지 20배, 6 내지 18배, 6 내지 15배의 배로 높은 기질 전환 특성을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 효소는 과당-6-인산의 과당으로 전환하는 전환율과 포도당-1-인산 및 포도당-6-인산을 포도당으로 전환하는 전환율의 합계 전환율에 대한 알룰로스-6-인산의 알룰로스로 전환하는 전환율의 비율이 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상, 10 배 이상, 11 배 이상, 12 배 이상, 13 배 이상, 14 배 이상, 또는 15 배 이상, 예를 들면 6 내지 20배, 6 내지 18배, 6 내지 15배의 배로 높은 기질 전환 특성을 가질 수 있다. 구체적으로 상기 전환율 및 반응생성물의 전체 탈인산화당에 대한 알룰로스 생성량의 측정은 온도 50℃, 2시간 동안, pH 7.0조건, 효소량 0.1mg/ml으로 반응한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소 단백질은 Clostridiales 속 균주 유래의 HAD family hydrolase 효소 일 수 있다.
상기 Clostridiales 속 균주 유래 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소(CloA6PP)는 40 내지 55℃ 조건에서는 높은 활성, 예컨대 효소 최대활성의 70%이상의 활성을 가지며, 구체적으로 45 내지 55℃ 조건에서는 높은 활성, 예컨대 효소 최대활성의 80%이상의 활성을 가진다.
상기 CloA6PP 효소는 pH 5.5 내지 9.0의 넓은 pH 범위에서 효소 최대활성의 70% 이상, 75% 이상 또는 80%이상의 활성을 가진다.
본 발명에 따른 CloA6PP 효소는 금속이온에 의해 효소 활성이 증가 또는 감소할 수 있다. 구체적으로, CloA6PP 효소 단백질은 Mg, Mn, Co, Ca, 및 Ni를 첨가하였을 때 금속이온을 넣지 않은 대조군보다 더 높은 활성을 가지며, 예컨대 금속이온이 없는 조건의 효소 활성에 비해 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.5배 또는 2배 이상의 활성을 나타내며, 특히 Mn이온의 경우 11배 이상의 활성을 가진다. 또한 CloA6PP 효소는 금속 이온에 의해 효소 활성이 감소할 수 있으며, 예컨대 Cu, Fe, Zn에 의해 금속이온이 없는 조건의 효소 활성에 비해 감소한 활성을 가지며, Fe에 의해 가장 감소한 활성을 가진다.
본 발명에 따른 CloA6PP 효소는 Thermoleophilum album 유래 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소 (TalA6PP)의 아미노산 서열 동일성을 분석한 결과, 22.17% 아미노산 서열 동일성을 가지며, Acidobacteria bacterium 유래 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소 (AbaA6PP) 의 아미노산 서열 동일성을 분석한 결과, 23.11% 아미노산 서열 동일성을 가져, CloA6PP 효소와 아미노산 서열 상동성이 30%이하였다.
CbaA6PP와 ChbA6PP는 HPLC로 확인되는 생성물이 없어 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소 활성이 없음을 확인하였다. TalA6PP와 AbaA6PP를 첨가한 반응물에서는 첨가 효소의 활성은 있었으나 A6P에만 특이하게 작용하는 기질특이성이 매우 떨어져서 포도당, 과당, 알룰로스 모두 생성되는 결과를 확인할 수 있었다. 그에 비해 CloA6PP는 효소 활성과 기질 특이성이 모두 우수하여 알룰로스만 과량 생성된 것을 볼 수 있다. CloA6PP를 이용한 효소 반응 결과 총 생성물 중 알룰로스의 비율은 약 89.1%이며, 동시에 매우 소량의 과당이 전환되었고, 포도당은 확인되지 않았다.
본 발명의 추가 예로서, 본 발명의 CloA6PP 효소를 암호화하는 핵산분자를 제공한다. 본 발명에 따른 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산의 구체적인 일 예는, 상기 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명의 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 형질전환체를 제공한다.
본 명세서서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 핵산 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 발명의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 알룰로스 생산용 조성물을 제공한다.
상기 배양물은 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소를 생산하는 미생물의 균체를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다.
상기 균주의 배양물은 상기 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 미생물 균체를 포함하거나 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사용되는 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소를 생산하는 미생물은 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 이들의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 알룰로스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경 친화적이며, 간단한 효소 반응으로부터 과당으로부터 알룰로스 생산을 이전에 없던 방법으로 전환시키고, 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있다.
본 발명에 따른 알룰로스 생산용 조성물은, Mg, Mn, Co, Ca, 및 Ni 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 금속이온, 바람직하게는 Mn 이온을 추가로 포함할 수 있다. 상기 금속이온의 농도는 0.5 mM 내지 20 mM일 수 있고, 예를 들어, 0.5 mM 내지 10 mM, 1.0 mM 내지 10 mM, 1.5 mM 내지 8.0mM, 2.0mM 내지 8.0mM, 3.0mM 내지 7.0mM, 4.0mM 내지 6.0mM, 또는 0.2 mM 내지 10 mM일 수 있다.
상기 알룰로스 생산용 조성물을 이용하여 알룰로스 생산하는 경우 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소 또는 효소를 생산하는 미생물을 이용한 반응 온도 및 반응 pH 조건은 상기 효소의 반응온도 및 반응 pH 조건에서 상술한 바와 같다.
본 발명에 따른 알룰로스 생산용 조성물은, 과당-6-인산에서 알룰로스6-인산을 생산하는 과당-6-인산 3-에피머라제 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 과당-6-인산 3-에피머라제 효소는 과당-6-인산(fructose 6-phosphate)의 3-에피머화 반응을 촉매하며, 구체적으로 과당-6-인산의 3-에피머화 반응을 수행하여 알룰로스-6-인산으로 전환할 수 있는 효소라면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 서열번호 17의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 아미노산 서열 상동성 (identity)을 가지며, 과당-6-인산(Fructose-6-phosphate)를 알룰로스-6-인산(allulose-6-phosphate)로 전환시키는 과당-6-인산(fructose 6-phosphate) 에피머화 효소일 수 있다. 상기 효소는 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 뉴클레오타이드 서열 동일성 (identity)을 가지는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
상기 효소는 Clostridium lundense 구체적으로 Clostridium lundense DSM 17049 에서 유래되며, 40 내지 70 ℃의 효소 반응 온도 및 pH 6 내지 8의 효소 반응 pH을 가지며, 망간 이온, 코발트 이온 또는 니켈 이온에 의해 활성이 증가하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 Clostridium lundense 유래 과당-6-인산 3-에피머화 효소의 반응 온도 범위는 40 내지 70℃, 45 내지 75℃, 45 내지 77℃, 50 내지 70 ℃ 또는 50 내지 75 ℃일 수 있다. 상기 최적 온도는, 예컨대, pH 7.0 조건에서 5분간 반응 진행 시의 결과일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 과당-6-인산 3-에피머화 효소의 최적 온도 조건은 60 ℃이며 40~70 ℃조건에 걸친 넓은 온도조건 범위에서 효소 최대활성의 50% 이상의 활성을 가진다.
상기 Clostridium lundense 유래 과당-6-인산 3-에피머화 효소의 반응 pH 범위는 pH 6 내지 8, pH 6 내지 7.5, pH 6.5 내지 8, pH 6.5 내지 7.5, pH 7 내지 8, 또는 pH 7 내지 7.5일 수 있으며, pH 7.0~7.5 조건에서 최대 활성을 가지며, pH6.0~8.0 범위에서 효소 최대활성의 80% 이상의 활성을 가진다.
상기 Clostridium lundense 유래 과당-6-인산 3-에피머화 효소의 최대의 알룰로스 생성량은 16 중량% 이상, 18 중량% 이상, 20 중량% 이상, 25 중량% 이상, 27 중량% 이상, 30 중량% 이상 또는 32 중량% 이상일 수 있다. 구체적으로 상기 효소의 최대 알룰로스 생성량은, 효소 0.1mg/ml를 20g/L 과당-6-인산을 용해한 용해액에 첨가하여 반응을 수행한 것일 수 있으며, 더욱 자세하게는 상기 효소 0.1mg/ml를 20g/L 과당-6-인산을 용해한 용해액에 첨가하여 pH 7.0 및 50 ℃조건에서 효소 반응을 수행하여 측정한 것일 수 있다.
상기 알룰로스 최대 전환율은 하기 수학식 1에 의해서 계산될 수 있다. 상기 알룰로스 최대 전환율을 구하기 위한 효소 반응의 시간은 8시간 이상, 10시간 이상, 12시간 이상, 14시간 이상 또는 16시간 이상일 수 있으며, 상기 반응시간의 상항은 18시간 이하 또는 20시간 이하일 수 있으며, 구체적인 반응시간은 상기 하한과 상한을 조합한 범위일 수 있으며, 예를 들면 16시간 내지 20 시간일 수 있다.
Figure 112020139183045-pat00001
상기 효소 반응의 생성물의 당류중에서 알룰로스 생성 비율(중량 %)은 하기 수학식에 의해서 계산될 수 있다. 상기 알룰로스 생성 비율을 구하기 위한 효소 반응 시간은 2시간 내지 6시간, 3시간 내지 6시간, 또는 4시간 내지 6시간일 수 있으며, 예를 들어 4 시간 내지 6시간일 수 있다.
Figure 112020139183045-pat00002
본 발명에 따른 과당-6-인산 3-에피머화 효소 단백질은 금속이온에 의해 효소 활성이 증가 또는 감소할 수 있다. 구체적으로, 과당-6-인산 3-에피머화 효소 단백질은 Mn, Co 및 Ni 이온에 의해 효소 활성이 증가하며, 예컨대 금속이온이 없는 조건의 효소 활성에 비해 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 또는 1.5배 이상의 활성을 나타내며, 특히 Mn과 Co 이온은 2배 이상, 또는 3배 이상의 활성, 구체적으로 금속 이온 없는 조건 대비 2 배 내지 5 배 이하, 2 배 내지 4 배 이하, 3 배 내지 5 배 이하, 또는 3 배 내지 5 배 이하의 활성을 나타낸다. 과당-6-인산 3-에피머화 효소 단백질은 Ca, Cu, Fe, 또는 Zn 이온에 의해 활성이 감소하는 특성을 가진다. 따라서, 과당-6-인산 3-에피머화 효소 단백질을 이용하여 알룰로스를 생산하는 조건은 Ca, Cu, Fe, 및 Zn 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 금속이온을 포함하지 않는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 서열번호 18의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
다른 예에서, 상기 과당-6-인산 3-에피머화 효소 단백질은 Ruminococcus sp. AF14-10 유래 ribulose-phosphate 3-epimerase (RuFP3E: 서열번호 19의 아미노산 서열), Clostridium sp. DL-VIII 유래 ribulose-phosphate 3-epimerase (CDFP3E: 서열번호 20의 아미노산 서열), Paenibacillus kribbensis 유래 ribulose-phosphate 3-epimerase (PkFP3E: 서열번호 21의 아미노산 서열) 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에 따른 알룰로스 생산용 조성물은, 과당에서 과당-6-인산으로 전환하는 헥소카이네이즈 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 과당-6-인산은 과당 또는 과당 함유 물질을 헥소카이네이즈 처리하여 얻은 것이 바람직하나 다른 화학적 합성방법 등에 의하여 제공되는 경우에도 본 발명의 보호범위에 포함된다.
상기 과당-6-인산은 포도당-6-인산으로부터 제조될 수 있으며, 상기 알룰로스 생산용 조성물은, 포도당-6-인산을 이성화하여 과당-6-인산으로 전환하는 포도당-6-인산 이성화 효소를 추가로 포함할 수 있다.
상기 포도당-6-인산은 포도당을 직접 인산화하여 제조되거나, 포도당-1-인산에서 전환될 수 있다. 포도당은 전분 또는 전분 가수분해물, 예를 들면 덱스트린 등에 포도당 생성 아밀라제를 처리하여 얻어진 포도당일 수 있고, 포도당-1-인산은 상기 포도당에 인산화 효소를 처리하여 얻어지는 것일 수 있다. 상기 알룰로스 생산용 조성물은, 포도당-6-인산을 제조하기 위한 효소 시스템을 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 알룰로스 생산용 조성물에 포함되는 효소 및 알룰로스 생산에 이용되는 기질이 제한되지 않는다. 본 발명의 알룰로스 생산용 조성물은 (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 포도당, 포도당-1-인산, 포도당-6-인산, 또는 과당-6-인산; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및/또는 (vi) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 전분/말토덱스트린 포스포릴라아제(starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1) 및 α-글루칸 포스포릴라아제는, 포스페이트(phosphate)를 포도당에 전이시켜 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 발명의 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7)는 포스페이트를 포도당에 전이시켜 수크로스로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 발명의 전분 액당화 효소인 α-아밀라아제(α-amylase, EC 3.2.1.1), 풀루란아제(pullulanse, EC 3.2.1.41), 글루코아밀라아제(glucoamylase, EC 3.2.1.3) 및 이소아밀라아제(isoamylase)는 전분 또는 말토덱스트린을 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 발명의 수크라제(sucrase, EC 3.2.1.26)는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 발명의 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2)는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 포도당인산화효소(glucokinase)는 포도당에 인산을 전이시켜 포도당-6-인산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당인산화효소는 폴리포스페이트 의존형 포도당인산화 효소일 수 있다.
본 발명의 포도당-6-인산 이성화효소는 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 발명의 알룰로스 제조방법에서, 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환시키는 활성을 가지며 알룰로스-6-인산에 대한 높은 기질 특이성을 갖는 효소 단백질로서 본 발명에 따른 Clostridiales 속 균주 유래 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소(CloA6PP), 상기 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소는 넓은 pH범위에서 높은 활성 특성을 가지고 있기 때문에 조건의 제약 없이 효소 반응을 통해 생성물을 만들 수 있다. 또한 A6P 기질에 특이적으로 높은 활성을 가지고 있기 때문에 알룰로스를 높은 비율로 포함하는 최종 반응 생성물을 얻을 수 있다. 높은 알룰로스 함량의 반응 생성물을 확보함으로써 기존에 여러 단계를 거쳤던 고농도 알룰로스 생산 공정에서 분리, 농축 공정 단계를 생략하여 공정 과정의 간편화 및 생산 단가를 줄이는 이점이 있다. 이에, 상기 알룰로스-6-포스파타제를 포함하는 알룰로스 생산용 조성물은, 알룰로스-6-인산에서 탈인산화 반응을 수행하는 파이테이즈(phytase)를 이용한 경우에 비해, 효소 반응의 pH 조건에 거의 제약없이 반응을 수행할 수 있으며, 높은 기질 특이성으로 인해 높은 알룰로스 함량의 반응 생성물을 확보함으로써 기존에 여러 단계를 거쳤던 고농도 알룰로스 생산 공정에서 분리, 농축 공정 단계를 생략하여 공정 과정의 간편화 및 생산 단가를 줄이는 이점이 있다.
상기 알룰로스 생산용 조성물을 이용하여 알룰로스를 생산하는 효소 또는 효소를 생산하는 미생물을 이용한 반응 온도 및 반응 pH 조건은 상기 효소의 반응온도 및 반응 pH 조건에서 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 예는, 알룰로스-6-인산에서 탈인산화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환하는 단계를 포함하는 알룰로스 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 제조방법은 상기 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환하는 단계 이전, 과당-6-인산에 에피머화 효소, 상기 에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 에피머화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 과당-6-인산에 에피머화 효소에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 제조방법은 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산에 포도당-6-인산-이성화효소, 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법은 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 본 발명의 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 본 발명의 포도당을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 포도당에 4-α-글루카노트랜스퍼라아제, 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적 예는, 전분을 출발물질로 하여 알룰로스를 제조하는 방법으로서 하기 단계를 포함할 수 있다:
(1)전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계,
(2) 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계,
(3)포도당-6-인산에 포도당-6-인산-이성화효소, 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계,
(4)과당-6-인산에 에피머화 효소, 상기 에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 에피머화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 단계, 및
(5)알룰로스-6-인산에서 탈인산화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환하는 단계.
본 발명에 따른 알룰로스 제조방법에서, 상기 단계 (1) 내지 (5)에 각각 사용되는 효소반응을 순차적으로 수행하거나, 적어도 2종 이상의 효소를 함께 사용한 복합 반응으로 적어도 2이상의 단계를 하나의 반응기에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 상기 단계(1) 내지 (5)에 사용되는 효소를 모두 포함하는 복합 효소 반응을 하나의 반응기에서 수행할 수 있다. 위와 같은 효소반응단계를 동시효소반응(one-pot enzymatic conversions)으로 진행하여 과당에서 알룰로스를 생산하는 것보다 높은 전환율로 알룰로스를 생산할 수 있다. 이와 같은 방법으로 생산된 알룰로스는 기능성 식품 및 의약품에 첨가되어 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 탈인산화 효소 단백질, 더욱 자세하게는 알룰로스-6-인산에 대해서만 기질특이성이 높은 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소 단백질은 높은 효소 전환율과 기질 특이성, 산성 또는 중성의 반응 pH 조건 및 열안정성의 특성을 충족하므로, 산업적 규모로 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소를 이용한 알룰로스의 생산에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소의 후보군을 포도당-1-인산, 포도당-6-인산, 과당-6-인산, 및 알룰로스-6-인산을 포함하는 혼합 기질액에 반응하여 얻어진 반응액을 HPLC로 분석하여 확인한 알룰로스 생성비율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 과당-6-인산의 3-에피머화 효소 단백질의 BIO-LC 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따라 알룰로스-6-인산 포스파타제의 효소반응을 통해서 반응액의 인산화당을 탈인산화 시킨 후 LC로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따른 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소 (CloA6PP)의 활성에 온도가 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 예에 따른 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소 (CloA6PP)의 활성에 pH 조건이 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 예에 따른 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소 (CloA6PP)의 활성에 금속 이온이 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 예에 따른 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소 (CloA6PP) 또는 TalA6PP (Thermoleophilum album 유래 A6PP) 효소를 포함하는 복합 효소 반응을 이용하여, 전분 기질로 하여 알룰로스를 생산한 결과를 나타내는 HPLC 분석결과이다.
본 발명은 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예로 권리범위가 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1: 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소의 제조
알룰로스-6-인산 탈인산 효소로써 기능을 할 것으로 예상되는 후보군 효소의아미노산 정보를 NCBI로부터 확보하여, 각 효소의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 IDT gene 합성을 통해 유전자 합성 의뢰하여 확보하였다. 합성 유전자단편을 주형으로 한 PCR을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하여 모두 동일하게 pET21a vector에 NdeI/XhoI 제한효소 사이트로 cloning하였다.
상기 미생물 배양 및 단백질 정제 과정을 거쳐 후보군 효소를 확보하였으며, 후보 효소는 다음과 같으며, 각각 PCR에 사용된 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타낸다.
(1) CloA6PP: Clostridiales속 균주 유래 A6PP 후보 효소 (HAD family hydrolase)로 알려져 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 가짐.
(2) CbaA6PP: Candidatus Bathyarchaeota archaeon 유래 A6PP 후보 효소 (HAD family hydrolase, Genbank accession no. TEU11455.1)로 알려져 있으며, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가짐
(3) TalA6PP: Thermoleophilum album 유래 A6PP 후보 효소 (HAD family hydrolase, Genbank accession no. NZ_FNWJ01000002.1) 로 알려져 있으며, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가짐
(4) AbaA6PP: Acidobacteria bacterium 유래 A6PP 후보 효소 (HAD family hydrolase, Genbank accession no. QHVS01000101.1) 로 알려져 있으며, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가짐
(5) ChbA6PP: Chloroflexi bacterium 유래 A6PP 후보 효소 (HAD family hydrolase, Genbank accession no. VBIC01000113.1) 로 알려져 있으며, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가짐
명명 서열(5’->3’) 서열번호
Forward primer in CloA6PP aaggagatatacatatgaacaactacaaagctgttttc 7
Reverse primer in CloA6PP ggtggtggtgctcgagctcttcgaagatgtccagcag 8
Forward primer in CbaA6PP aaggagatatacatatgcgtttcccggtcgttatc 9
Reverse primer in CbaA6PP ggtggtggtgctcgagagactgatcaatcagttcacc 10
Forward primer in TalA6PP aaggagatatacatatgcgtgcactggtattcgacc 11
Reverse primer in TalA6PP ggtggtggtgctcgagttcggctgcagtttccagg 12
Forward primer in AbaA6PP aaggagatatacatatgccagcgttaatctttgatctg 13
Reverse primer in AbaA6PP ggtggtggtgctcgagtggcagcacgcccagctc 14
Forward primer in ChbA6PP aaggagatatacatatgacaccggtacttttattc
 15
Reverse primer in ChbA6PP ggtggtggtgctcgagagatgaaggttcacgaacac
 16
제작 완료한 5종의 재조합 벡터는 각각 대장균 ER2566균주에 형질전환하였다. 효소의 단백질 발현을 위한 재조합 E. coli는 100 μg/ml의 ampicillin을 함유한 LB 배지로 제작된 agar 플레이트에서 콜로니로 확보하였다.
4ml LB 배지에서 종배양 후, 100ml LB 배지에서 본 배양을 수행하였으며, 배양조건은 37℃ 200rpm 조건으로 600nm에서 흡광도값 0.6이 될 때까지 배양 후 IPTG 0.1mM 첨가하여 목적단백질의 발현을 유도하였다. induction 후 25 ℃에서 약 16시간 정도 균주 배양 후, 원심분리하여 균체 회수하였다. 상기 회수된 균체는 lysis buffer (50 mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole)로 현탁하여, beadbeater를 이용하여 세포 파쇄하여 세포 파쇄 용액을 확보하였다.
세포 파쇄 용액에서 세포 pellet을 제거한 후 세포 상등액만을 얻어 Ni-NTA 컬럼(Ni-NTA superflow, Qiagen)에 binding 시킨 다음 washing buffer(50 mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole)으로 컬럼에 binding되지 않은 단백질을 제거해주고, 마지막 과정으로 elution buffer(50 mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer, 300 mM NaCl, 200 mM imidazole)로 목적 단백질을 용출하였다. 최종적으로 확보한 단백질은 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)으로 전환하여 이후 사용을 위해 보관하였다.
실시예 2: 과당-6-인산 에피머화(FP3E) 효소를 이용한 기질용액의 제조
2-1. 기질용액 제조를 위한 과당-6-인산 에피머화(FP3E) 효소의 평가
본 실험에서는 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소의 기질용액을 제조하기 위하여, 50mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer에 50g/L의 과당-6-인산을 녹인 후, 과당-6-인산 에피머화(FP3E) 효소(Clostridium lundense DSM 17049 균주로부터 유래한 효소(ClFP3E)로서 서열번호 17의 아미노산 서열과 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 효소의 아미노산 서열(서열번호 17))를 이용하여 알룰로스-6-인산 전환액을 확보하였다.
ClFP3E 효소가 과당-6-인산으로부터 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소의 기질을 만들어내는지 평가하기 위해, ClFP3E 효소 0.1mg/ml를, 50mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer에 20g/L 과당-6-인산을 용해한 용해액에 첨가하여 50 ℃에서 효소 반응을 수행함으로써 ClFP3E 효소의 전환 활성을 평가하였다.
효소 반응액의 분석은 Bio-LC 분석을 통해 기질과 비교하여 신규하게 생성된 물질을 확인하였으나 알룰로스-6-인산 표준물질이 존재하지 않아 정확한 확인이 불가하여 추가로 알룰로스-6-인산(A6PP)의 탈인산화 효소를 처리한 후 생성된 알룰로스를 최종적으로 확인하였다. Bio-LC 분석을 통해서는 ClFP3E 효소 반응 시, F6P의 감소와 A6P로 생각되는 새로운 peak가 생성되는 것을 확인하였다. 상기 Bio-LC 분석 결과를 하기 도 2에 나타낸다.
A6PP 효소반응을 통해서 반응액의 인산화당을 탈인산화시킨 후 LC로 분석한 결과는 다음과 같다. Aminex HPX-87C column을 사용하여 80℃ 온도에서 0.6ml/min의 유속 조건으로 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타낸다. 상기 분석결과 과당과 알룰로스를 확인할 수 있었다.
2-2: 혼합 기질용액 제조
효소 기질 용액으로서, 50mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer에 10g/L의 과당-6-인산을 녹인 후, 0.01mg/ml의 ClFP3E 정제 단백질을 첨가하여 온도 50℃, pH 7.0에서 2 시간 동안 전환반응을 수행하여, 과당6-인산과 알룰로스-6-인산을 포함하는 반응생성물을 얻었다. 과당6-인산과 알룰로스-6-인산의 중량비가 3:2로 포함된 반응생성물을 취하여, 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소의 활성 분석을 위한 혼합 기질액에 제조에 사용되었다.
효소 활성 분석을 위한 혼합 기질액을 제조하고자, 실시예 2에 따른 ClFP3E 효소를 이용한 과당-6-인산과 알룰로스-6-인산이 혼합되어있는 반응 생성액에 일정량의 포도당-1-인산, 포도당-6-인산을 추가하여 기질 혼합액을 제조하여 실험에 사용하였으며, 각 기질의 혼합 중량비율은 G-1-P: G-6-P : F-6-P : A-6-P = 2 : 2 : 3 : 2으로 하였으며 혼합 기질에 포함된 4가지 인산화당의 총 함량은 10g/L을 사용하였다.
실시예 3: 기질 반응을 이용한 효소 스크리닝
상기 혼합 기질에 기질특이성이 낮은 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소가 작용하면 포도당-1-인산과 포도당-6-인산은 탈인산화되어 포도당이 생성되고, 과당-6-인산은 과당, 알룰로스-6-인산은 알룰로스로 전환된다.
상기 제조된 혼합 기질액에 실시예 1-1에서 준비한 정제 효소 단백질을 0.1mg/ml양으로 첨가하여 50℃ 온도, pH 7.0 조건에서 2시간 동안 효소 반응 진행 후, 얻어진 효소 반응생성액을 HPLC 분석으로 효소 반응액에 포함된 당분석을 수행하고 실험결과를 도 1에 나타낸다. 상기 HPLC 분석은 Aminex HPX-87C column을 사용하여 80℃ 온도에서 0.6ml/min의 유속 조건으로 분석 진행하였다.
도 1은 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소의 후보군을 포도당-1-인산, 포도당-6-인산, 과당-6-인산, 및 알룰로스-6-인산을 포함하는 혼합 기질액에 반응하여 얻어진 반응액을 HPLC로 분석하여 확인한 알룰로스 생성비율을 나타내는 그래프이다. 도 1의 HPLC 그래프에 나타낸 각 생성물의 생성 비율을 수치화하여 하기 표 1에 나타낸다.
상기 기질 특이성은 총 생성물 중 알룰로스가 차지하는 비율 (알룰로스 생성 비율, 중량 %)로서 표시하였으며, 구체적으로 89.1%이었다. 상기 알룰로스 생성 비율(중량 %)은 알룰로스 생성량/ (포도당 생성량+과당 생성량+알룰로스 생성량) * 100의 계산식으로 산출하였다. 하기 산물의 생성량 단위는 (g/L)이다. 하기 표 2의 전환율은 혼합 기질에 포함된 해당 기질의 함량을 기준으로 생성된 탈인산화 산물의 함량 비율을 나타낸 것으로서, 예를 들면 혼합 기질에 포함된 알룰로스 기질 함량(g/L)에 대한 탈인산화로 생성된 알룰로스 함량 (g/L)의 중량비를 의미한다.
　 효소 CloA6PP TalA6PP AbaA6PP
포도당 생성량(g/L) - 1.4 1.4
전환율(%) -　 63.0 63.0　
과당 생성량(g/L) 0.2 0.6 0.8
전환율(%) 6.1 18.0 24.0
알룰로스 생성량(g/L) 2.1 2.2 2.2
전환율(%) 95.5 99.0　 99.0　
반응생성물의 알룰로스 비율 (%) 89.1 51.5 51.3
도 1에 나타낸 바와 같이, CbaA6PP와 ChbA6PP는 HPLC로 확인되는 알룰로스생성물이 없어 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소 활성이 없음을 확인하였다. 또한, CloA6PP, TalA6PP와 AbaA6PP는 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소 나타내며 이를 더욱 자세히 정량 결과를 표 2에 나타낸다. 또한, CloA6PP는 알룰로스-6-인산 탈인산화 활성을 가지나 역반응을 수행하지 않는 비가역적 효소 활성을 나타냈다.
도 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, TalA6PP와 AbaA6PP를 첨가한 효소 반응물에서는 첨가 효소의 활성은 있었으나 A6P에만 특이하게 작용하는 기질특이성이 매우 떨어져서 포도당, 과당, 알룰로스 모두 생성되며, 과당, 포도당 및 알롤로스 순으로 생성비율이 증가하는 경향을 나타냈다. 또한, 반응생성물의 알룰로스 비율 (%)은 TalA6PP와 AbaA6PP는 각각 51.5%, 및 51.3%로서 알룰로스 생성 비율이 낮아 산업적으로 활용 가치가 낮다.
도 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, CloA6PP는 효소 활성과 기질 특이성이 모두 우수하여 알룰로스만 과량 생성된 것을 볼 수 있다. CloA6PP를 이용한 효소 반응 결과 총 생성물 중 알룰로스의 비율은 약 89.1%이며, 동시에 매우 소량의 과당이 전환되었고, 포도당은 확인되지 않아 생성되지 않음을 확인하였다. 자세하게는, CloA6PP효소는 과당 전환율에 대한 알룰로스 전환율의 비율이 15.7배로 매우 높게 알룰로스를 생성하나, TalA6PP는 5.5배, AbaA6PP는 4.3배로 낮은 전환율 비를 나타낸다. 또한, 과당과 포도당의 전환율 합계에 대한 알룰로스 전환율의 비율을 살펴보면, CloA6PP효소는 포도당을 생성하지 않으므로 과당에 대한 알룰로스 전환비율과 동일하게 15.7배로 매우 높으나, 생성물 중 포도당 생성량이 높은 TalA6PP 및 AbaA6PP는 1.2배로 낮은 전환율 비를 나타낸다.
실시예 4: 효소의 온도 및 pH 특성 분석
4-1: 온도에 따른 효소 활성 확인
CloA6PP 효소 활성에 온도가 미치는 영향을 확인하기 위해 여러 온도조건에서 효소 반응 실험 진행하였다.
상기 실시예 2에서 제조한 50mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer에 50g/L의 과당-6-인산을 녹인 후 과당-6-인산 에피머화(FP3E) 효소를 이용하여 알룰로스-6-인산 전환액을 확보하여 기질로 사용하였다. 실시예 1-1에서 제조한 CloA6PP 효소 0.1mg/ml로 각 온도조건에서 30min 반응하여 조건으로 효소 반응 진행하였고, 얻어진 반응액을 HPLC로 분석하여 알룰로스 생성량을 정량 분석하여, 상대적 효소 활성을 구하였다. 상기 실험결과를 도 4에 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, CloA6PP의 최적 온도 조건은 55℃로 확인되었으며, 40~55℃ 조건에서는 높은 활성을 보이지만 60℃에서 급격하게 활성이 감소하는 것을 볼 수 있다.
4-2: pH에 조건에 따른 효소 활성 확인
CloA6PP의 pH 영향성을 확인하기 위해 다양한 pH 조건에서 효소 반응 실험 진행하였다.
상기 실시예 2에서 제조한 멸균수에 50g/L의 과당-6-인산을 녹인 후 과당-6-인산 에피머화(FP3E) 효소를 이용하여 알룰로스-6-인산 전환액을 확보하여 기질로 사용하였다. pH 5.0~8.5 사이의 완충용액 (pH 5.5~6.5, 시트르산 나트륨 / pH 6.5~9, Tris-HCl)에 10g/L의 농도로 FP3E 전환 반응액을 희석한 후, 0.1mg/ml의 CloA6PP 정제 단백질을 첨가하여 50℃, 60min 조건으로 효소 반응 진행하였고, 얻어진 반응액을 HPLC로 분석하여 알룰로스 생성량을 정량 분석하여, 상대적 효소 활성을 구하였다. 상기 실험결과를 도 5에 나타낸다.
도 5에 나타낸 바와 같이, pH 5.5~9.0의 넓은 범위에서 80% 이상의 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, pH에 의한 반응 저해는 없는 것으로 확인하였다.
실시예 5: 효소의 금속이온 특성 분석
효소 반응에 첨가하는 금속이온의 종류에 따른 CloA6PP의 활성을 확인하고자실험을 수행하였다.
상기 실시예 2에서 제조한 50mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer에 50g/L의 과당-6-인산을 녹인 후 과당-6-인산 에피머화(FP3E) 효소를 이용하여 알룰로스-6-인산 전환액을 확보하여 기질로 사용하였다.
상기 기질을 1/2배로 희석한 후에, 각각의 금속이온(MgSO4, MnCl2, CaCl2, CoCl2, CuCl2, NiSO4, FeSO4, ZnSO4) 5mM을 첨가하였다.
각 금속이온을 포함하는 반응 버퍼에 0.1mg/ml의 CloA6PP 정제 단백질을 첨가하여 50℃, 60min 조건으로 효소 반응 진행하였고, 얻어진 반응액을 HPLC로 분석하여 알룰로스 생성량을 정량 분석하여, 상대적 효소 활성을 구하였다. 상기 실험결과를 도 6에 나타낸다.
도 6에 나타낸 바와 같이, MgSO4, MnCl2, CoCl2, CaCl2, NiSO4를 첨가하였을 때 금속이온을 넣지 않은 대조군보다 더 높은 활성을 확인할 수 있었고, 특히 MnCl2를 넣었을 때 11배 이상의 활성을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 복합효소 반응을 통한 알룰로스 생산
말토덱스트린 기질로부터 알룰로스를 생산하기 위해 전체 반응 단계에 필요한 효소 5종을 동시에 반응시켰다. 사용한 효소는 GP, PGM, PGI, FP3E, CloA6PP이며, 각 0.1mg/ml의 농도로 사용하였다. 대조군으로 기질특이성이 낮은 A6PP를 첨가한 실험도 동일한 조건으로 동시에 실험 진행하였다.
Corynebacterium glutamicum 유래의 알파-글루칸 인산화효소(αGP)(CAF20007.1)와 Geobacillus thermocatenulatus 유래의 포도당인산무타아제(PGM)(AST00503.1), 포도당인산이성화효소(PGI)(ASS98370.1), 실시예 2에 따른 Clostridium sp. 유래의 과당-6-인산-3-에피머화제 (FP3E), 그리고 실시예1에 따른 Clostridiales 유래의 CloA6PP를 이용하여 말토덱스트린→포도당-6-인산→과당-6-인산→알룰로스-6-인산→알룰로스로 순차적 효소전환반응을 진행하였다.
각각의 효소에 대한 유전자를 pET21a vector 또는 pET28a vector에 클로닝한 후 대장균 ER2566균주에 형질전환하였다. 효소의 단백질 발현을 위한 재조합 E. coli는 100 μg/ml의 ampicillin 또는 30ug/ml의 kanamycine을 함유한 LB 배지로 제작된 agar 플레이트에서 콜로니로 확보하였다.
하나의 콜로니를 4ml LB 배지에서 종배양 후, 100ml LB 배지에서 본 배양을 수행하였으며, 배양조건은 37℃ 200rpm 조건으로 600nm에서 흡광도값 0.6이 될 때까지 배양 후 IPTG 0.1mM 첨가하여 목적단백질의 발현을 유도하였다. induction 후 25 ℃에서 약 16시간 정도 균주 배양 후, 원심분리하여 균체 회수하였다. 상기 회수된 균체는 lysis buffer (50 mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole)로 현탁하여, beadbeater를 이용하여 세포 파쇄하여 세포 파쇄 용액을 확보하였다.
세포 파쇄 용액에서 세포 pellet을 제거한 후 세포 상등액만을 얻어 Ni-NTA 컬럼(Ni-NTA superflow, Qiagen)에 binding시킨 다음 washing buffer(50 mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole)으로 컬럼에 binding되지 않은 단백질을 제거해주고, 마지막 과정으로 elution buffer(50 mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer, 300 mM NaCl, 200 mM imidazole)로 목적 단백질을 용출하였다. 최종적으로 확보한 단백질은 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)으로 전환하여 이후 효소 전환 반응에 이용하였다.
구체적으로, 20g/L 말토덱스트린 기질 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)에 녹여서 준비한 후, 효소 반응을 위해 각각 0.1mg/ml로 정량한 5종의 효소와 5mM MnCl2를 첨가하여 50℃, 5시간 동안 효소 반응을 진행하였고, 얻어진 반응액을 HPLC로 분석하여 반응생성물을 분석하였다. 상기 정량 분석 결과를 도 8에 나타낸다.
HPLC 분석 조건은 Aminex HPX-87C (Bio-rad사) column을 사용하였으며, 80℃ 조건에서 이동상을 0.6ml/min 유속으로 흘려주었고, Reractive Index Detector(RID)로 생산 물질을 검출하였다.
비교예 1: 복합효소 반응을 통한 알룰로스 생산
실시예 6과 실질적으로 동일한 방법으로 수행하나, 복합효소반응에서 4종 효소(Corynebacterium glutamicum 유래의 알파-글루칸 인산화효소(αGP)(CAF20007.1)와 Geobacillus thermocatenulatus 유래의 포도당인산무타아제(PGM)(AST00503.1), 포도당인산이성화효소(PGI)(ASS98370.1), 및 실시예 2에 따른 Clostridium sp. 유래의 과당-6-인산-3-에피머화제 (FP3E))는 동일하고, CloA6PP를 대신하여 실시예 1-1에서 사용한 TalA6PP 효소를 이용하여 반응을 수행하고, 얻어진 반응액을 HPLC로 분석하여 반응생성물을 분석하였다. 상기 정량 분석 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7의 HPLC 분석 결과에 나타낸 바와 같이, 상기 5종 복합효소반응을 통해 순차적으로 전분, G1P, G6P, F6P, A6P 및 알룰로스의 5개 전환 반응이 한 반응기 내에서 이루어졌음을 확인하였다.
또한 CloA6PP를 탈인산효소로 사용함으로써 A6P에만 기질특이적으로 빠른 반응이 이루어져 포도당이나 과당의 생성을 최소한으로 하면서 알룰로스를 과량 생성되는 것을 확인할 수 있었고, 반면에 TalA6PP를 탈인산효소로 사용한 경우에는 기질특이성 없이 모든 인산화당을 탈인산화 하여 반응 단계의 초기 물질인 글루코오스-1-인산(G-1-P)나 글루코오스-6-인산(G-6-P)가 탈인산화되어 과량의 포도당이 생성된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 도 8의 그래프에서 TalA6PP를 이용한 반응액과 CloA6PP를 이용한 반응액의 분석결과를 통해 볼 수 있었다.
효소 포도당
생성량(g/L)		 과당생성량 (g/L) 알룰로스
생성량(g/L)		 알룰로스
기질특이성 (%)		 알룰로스
전환율 (%)
TalA6PP 6.51 1.6 0.5 5.8 2.5
CloA6PP 0.6 1.8 12.9 84.3 64.5
<110> SAMYANG CORPORATION <120> Phosphatase with high substrate specificity and use of the same <130> DPP20204013KR <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CloA6PP <400> 1 Met Asn Asn Tyr Lys Ala Val Phe Phe Asp Phe Asp Tyr Thr Leu Ala 1 5 10 15 Asp Ser Ser Lys Gly Val Ile Glu Cys Ile Asn Tyr Ala Leu Gln Lys 20 25 30 Met Gly Tyr Pro Lys Ser Ser Pro Glu Ser Ile Cys Arg Thr Ile Gly 35 40 45 Leu Thr Leu Thr Asp Ala Tyr Arg Gln Leu Ser Lys Asp Thr Ser Asp 50 55 60 Ser Asn Ala Ile Leu Phe Arg Gln His Phe Lys Glu Arg Ala Asp Val 65 70 75 80 Val Met Cys Asp Ser Thr Ile Ile Tyr Asn Thr Val Glu Ser Val Leu 85 90 95 Lys Arg Leu Lys Ser Met Asn Val Lys Val Gly Ile Val Ser Thr Lys 100 105 110 Tyr Arg Tyr Arg Ile Glu Asp Ile Leu Lys Arg Asp Gly Leu Leu Gln 115 120 125 Tyr Phe Asp Ile Ile Ile Gly Gly Glu Asp Val Val Ala His Lys Pro 130 135 140 Asp Pro Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ile Ser Arg Leu Glu Cys Gln Lys 145 150 155 160 Lys Asp Thr Leu Tyr Val Gly Asp Ser Thr Val Asp Ala Lys Thr Ala 165 170 175 Glu Asn Ala Gly Val Asp Phe Ala Ala Val Leu Thr Gly Thr Thr Glu 180 185 190 Trp Asn Glu Phe Leu Lys Tyr Ser Ser Arg Ala Val Ile Lys Asp Leu 195 200 205 Ser Gly Leu Leu Asp Ile Phe Glu Glu 210 215 <210> 2 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CloA6PP <400> 2 atgaacaact acaaagctgt tttcttcgat ttcgactata ccctggctga ctcttcgaaa 60 ggcgttatcg aatgcatcaa ctatgcattg cagaaaatgg gttacccaaa aagcagccca 120 gaaagcattt gtcgtaccat tggcctgaca ctgaccgatg cgtatcgcca gctgagcaaa 180 gacacctctg actctaacgc aatcctcttc cgtcagcact tcaaagaacg tgcagatgtg 240 gtcatgtgcg attcaaccat tatttataac actgtggaat ccgttctcaa acgtctgaaa 300 tcaatgaacg ttaaagttgg cattgtgtct actaaatacc gttaccgtat tgaggacatc 360 ctcaaacgtg atggtctgct gcagtacttt gacattatca tcggtggtga agatgtagtc 420 gctcacaaac cggatccgga aggcctgttg gaagcaatct cccgcttgga atgtcagaaa 480 aaagatactc tgtacgttgg ggattccacc gtggatgcca aaaccgcgga gaacgccggt 540 gtggatttcg cggcggttct gaccggtacc accgaatgga acgaattcct gaaatactcc 600 tcgcgtgcgg ttatcaaaga cctgagcggt ctgctggaca tcttcgaaga gtaa 654 <210> 3 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CbaA6PP <400> 3 Met Arg Phe Pro Val Val Ile Phe Asp Phe Asp Tyr Thr Leu Ala Asp 1 5 10 15 Ser Ser Arg Gly Val Leu Glu Cys Ile Asn His Ala Phe Lys Gly Met 20 25 30 Gly Leu Pro Lys Val Val Ala Glu Asp Ala Gln Arg Thr Ile Gly Leu 35 40 45 Ser Leu Pro Asn Ile Leu Val Thr Leu Ala Gly Arg Glu His Glu Gly 50 55 60 Arg Gly Gly Glu Phe Gly Arg Leu Phe Val Glu Lys Ala Asn Glu Val 65 70 75 80 Met Thr Asp Leu Thr Phe Val Phe Glu Glu Val Pro Glu Val Ile Arg 85 90 95 Arg Leu Lys Asp Glu Gly Leu Thr Leu Gly Ile Val Ser Thr Lys Phe 100 105 110 Arg Arg Arg Ile Glu Glu Ile Leu Gly Arg Glu Asp Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Phe Asp Val Ile Val Gly Gly Glu Asp Val Ser Arg His Lys Pro Asp 130 135 140 Pro Glu Gly Leu Leu Ala Ala Ile Glu Arg Leu Gly Gly Ser Pro Ser 145 150 155 160 Gly Ser Leu Tyr Val Gly Asp Ser Val Thr Asp Ala Glu Thr Ala Arg 165 170 175 Arg Ala Gly Val Pro Phe Ala Ala Val Leu Asn Gly Val Thr Pro Arg 180 185 190 Glu Ala Phe Lys Asp Tyr Pro Ala Tyr Lys Ile Leu Asp Asn Leu Gly 195 200 205 Glu Leu Ile Asp Gln Ser 210 <210> 4 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TalA6PP <400> 4 Met Arg Ala Leu Val Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Val Asp Thr Val 1 5 10 15 Tyr Ala His Val Leu Ala Trp Gln Leu Ala Leu Glu Glu Ala Gly Leu 20 25 30 Pro Ile Asp Gly Trp Arg Ile His Arg Arg Ile Gly Met Ser Gly Gly 35 40 45 Leu Phe Thr Arg Ala Val Ala Arg Glu Ile Gly Arg Pro Leu Arg Pro 50 55 60 Asp Glu Ala Glu Arg Leu Arg Asp Arg His Ser Gln Leu Phe Arg Ala 65 70 75 80 Leu Leu Pro Arg Arg Arg Pro Leu Pro Gly Ala Arg Glu Leu Leu Ala 85 90 95 Thr Leu Arg Arg Ala Gly Val Pro Phe Ala Ile Ala Thr Ser Gly Arg 100 105 110 Arg Pro Glu Ile Asp Ala Ser Leu Glu Val Leu Gly Ile Asp His Glu 115 120 125 Val Ala Val Val Glu Arg Gly Asp Val Pro Arg Ala Lys Pro Glu Pro 130 135 140 Asp Leu Phe Leu Ala Ala Ala Glu Arg Leu Gly Ile Glu Ala Gly Ala 145 150 155 160 Cys Tyr Ala Val Gly Asp Ala Val Trp Asp Leu Leu Ala Ala Arg Arg 165 170 175 Ala Gly Met Leu Gly Ile Gly Leu Leu Ser Gly Gly Tyr Gly Glu Asp 180 185 190 Glu Leu Val Arg Thr Gly Ala Phe Arg Val Tyr Arg Asp Pro Ala Glu 195 200 205 Leu Leu Arg Ser Ile Asp Glu Leu Gly Ile Asp Leu Glu Thr Ala Ala 210 215 220 Glu 225 <210> 5 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AbaA6PP <400> 5 Met Pro Ala Leu Ile Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Val Asp Thr Val 1 5 10 15 Tyr Ala His Val Phe Ala Trp Gln Arg Ala Leu Ala Glu Ala Gly Leu 20 25 30 Ala Val Asp Gly Trp Arg Ile His Arg Arg Ile Gly Met Ser Gly Gly 35 40 45 Leu Phe Thr Arg Ala Val Ala Arg Glu Leu Gly Arg Glu Ile Thr Ser 50 55 60 Asp Glu Ala Glu Ala Leu Gln Arg Arg His Gly Glu Leu Phe Gln Gln 65 70 75 80 Phe Leu Pro Asn Arg Arg Ala Leu Pro Gly Ala Val Glu Leu Leu Arg 85 90 95 Ala Leu Arg Ser Ala Gly Val Pro His Gly Ile Ala Thr Ser Gly Arg 100 105 110 Arg Pro Glu Ile Asp Arg Ser Leu Glu Val Leu Gly Val Gly Ala Glu 115 120 125 Thr Ile Val Val Asp Arg Gly Asp Val Gln Arg Ala Lys Pro Ala Pro 130 135 140 Asp Leu Phe Leu Asn Cys Gln Gln Arg Leu Gly Val Pro Val Glu Asp 145 150 155 160 Cys Tyr Val Val Gly Asp Ala Val Trp Asp Leu Leu Ala Ala Arg Arg 165 170 175 Ala Arg Met Leu Cys Ile Gly Leu Leu Ser Gly Gly Tyr Gly Asp Asp 180 185 190 Glu Leu Thr Arg Val Gly Ala Phe Arg Val Tyr Arg Asp Ala Ala Glu 195 200 205 Leu His Ala Ser Leu Asp Glu Leu Gly Val Leu Pro 210 215 220 <210> 6 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChbA6PP <400> 6 Met Thr Pro Val Leu Leu Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Val Asp Ser 1 5 10 15 Val Tyr Gln His Val Leu Ala Trp Arg Glu Val Leu Glu Thr Met Ser 20 25 30 Ile Gln Leu Ser Val Trp Lys Ile His Arg Arg Ile Gly Met Ser Gly 35 40 45 Gly Leu Phe Val Asn Ala Leu Leu Arg Glu Thr Gly Ser Arg Leu Asp 50 55 60 Pro Gln Ala Ile Glu Arg Leu Arg Gln Leu His Val Glu Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Arg Arg Phe Asp Gln Val Arg Pro Leu Pro Gly Ala Ser Glu Leu Leu 85 90 95 Ala Arg Leu Thr Ala Ala Ala Val Pro Trp Ala Ile Ala Thr Ser Gly 100 105 110 Ser Leu Arg Thr Ala Arg Pro Ala Val Asp Leu Leu Gly Val Pro Pro 115 120 125 Ser Ala Val Leu Val Thr Arg Glu Asp Val Ala Arg Ala Lys Pro Asp 130 135 140 Pro Asp Leu Phe Leu Ala Ala Ala Thr Arg Leu Arg Ile Ser Ile Thr 145 150 155 160 Asp Ala Phe Val Val Gly Asp Ser Val Trp Asp Leu Leu Ala Ala Gln 165 170 175 Arg Ala Arg Ala Leu Gly Val Gly Val Leu Ser Gly Gly Tyr Gly Arg 180 185 190 Glu Glu Leu Gln Gln Ala Gly Ala Tyr Arg Val Tyr Asp Asp Pro Ala 195 200 205 Asp Leu Leu Arg His Leu Asp Glu Val Gly Val Arg Glu Pro Ser Ser 210 215 220 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer in CloA6PP <400> 7 aaggagatat acatatgaac aactacaaag ctgttttc 38 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer in CloA6PP <400> 8 ggtggtggtg ctcgagctct tcgaagatgt ccagcag 37 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer in CbaA6PP <400> 9 aaggagatat acatatgcgt ttcccggtcg ttatc 35 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer in CbaA6PP <400> 10 ggtggtggtg ctcgagagac tgatcaatca gttcacc 37 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer in TalA6PP <400> 11 aaggagatat acatatgcgt gcactggtat tcgacc 36 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer in TalA6PP <400> 12 ggtggtggtg ctcgagttcg gctgcagttt ccagg 35 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer in AbaA6PP <400> 13 aaggagatat acatatgcca gcgttaatct ttgatctg 38 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer in AbaA6PP <400> 14 ggtggtggtg ctcgagtggc agcacgccca gctc 34 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer in ChbA6PP <400> 15 aaggagatat acatatgaca ccggtacttt tattc 35 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer in ChbA6PP <400> 16 ggtggtggtg 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Gln Leu Lys Glu Ala Gly Ala Glu 180 185 190 Val Phe Val Val Gly Ser Ser Gly Leu Phe Asn Lys Asp Glu Asp Leu 195 200 205 Glu Lys Ala Trp Glu Met Met Met Ser Asp Phe Asn Tyr Ser Leu Ser 210 215 220 Tyr Lys Glu 225 <210> 18 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fructose 6-phosphate 3-epimerase <400> 18 atgaaatacg gcttcgcacc gtccctgatg tgcatgaaca tcctgaaact ggaagaacaa 60 atcaaaattc tgaacaaaaa agcggatttc taccacgtag acattatgga tgggcactat 120 gttaaaaaca tcacgctgtc tccgttcttt atccaacaga tccgcccgct ggcgaccatt 180 ccaatcgacg cgcatctgat ggtcgagaac ccgaacgact ttctggacga actgaaaaaa 240 gctggtactg actacgtgtc tctgcacgta gaaaccatta acaaagatgt tttccgcatc 300 acgaacaaaa tcaaatcgtt aggtatgaaa gttggcgtgg ttctgaaccc tgcgactccg 360 atcgacgaaa tcaaacatta catcaaccgt ctggacaaaa tcactgttat gactgttgac 420 cctggtttcg ctggccaagc gttcatcccg gaaatgctgg acaaaatccg tgaactcaag 480 gaaatcaaag aaaaagaggg ttacaaatac attattgaaa tcgatggcag ctgcaacgaa 540 aagactttcg cccaactgaa agaagcgggt gcggaagttt tcgtagtcgg ctctagcggc 600 ctgtttaaca aagatgaaga cctggaaaaa gcctgggaaa tgatgatgtc cgacttcaat 660 tacagcctga gctacaaaga atag 684 <210> 19 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ribulose-phosphate 3-epimerase (RuFP3E) <400> 19 Met Lys Val Glu Phe Ser Pro Ser Leu Met Cys Met Asp Phe Leu Lys 1 5 10 15 Met Glu Glu Gln Phe Asn Ile Leu Asn Asp Lys Val Asp Met Tyr His 20 25 30 Ile Asp Ile Met Asp Gly His Phe Cys Lys Asn Ile Thr Leu Ser Pro 35 40 45 Asp Leu Val Lys Thr Phe Ser Lys Val Ala Lys Lys Pro Met Asp Val 50 55 60 His Leu Met Thr Thr Asn Pro Thr Asp Trp Ile Glu Lys Val Ala Ala 65 70 75 80 Ala Gly Ala Glu Tyr Ile Ser Pro His Ala Glu Thr Ile Asn Gly Asp 85 90 95 Ala Phe Arg Val Met Asn Met Ile Lys Ser Leu Gly Cys Lys Thr Gly 100 105 110 Val Val Leu Asn Pro Ala Thr Pro Leu Ser Tyr Val Lys His Tyr Leu 115 120 125 Asn Arg Ile Asp Leu Leu Thr Ile Met Thr Val Asp Val Gly Phe Ala 130 135 140 Gly Gln Pro Phe Ile Glu Glu Met Leu Asp Lys Ile Lys Glu Ala Lys 145 150 155 160 Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Gly Tyr Thr Tyr Lys Ile Gln Ile Asp Gly 165 170 175 Ser Cys Asn Pro Lys Thr Tyr Lys Arg Met Tyr Asp Ala Gly Ala Glu 180 185 190 Val Leu Ile Val Gly Ser Ser Gly Leu Phe Gly Leu Asn Glu Asp Leu 195 200 205 Asn Lys Ala Cys Asp Gln Met Phe Glu Asp Phe Asn Arg Ala Ile Ala 210 215 220 Glu 225 <210> 20 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ribulose-phosphate 3-epimerase (CDFP3E) <400> 20 Met Lys Pro Met Phe Ala Pro Ser Leu Met Cys Ala Asn Phe Leu Asp 1 5 10 15 Leu Lys Asn Gln Ile Glu Ile Leu Asn Glu Arg Ala Asp Ile Phe His 20 25 30 Val Asp Ile Met Asp Gly His Tyr Val Lys Asn Phe Ser Leu Ser Pro 35 40 45 Ala Met Met Glu Gln Leu Lys Thr Ile Thr Lys Ile Pro Met Asp Ala 50 55 60 His Leu Met Val Glu Asn Pro Ala Asp Phe Leu Glu Gly Ile Ala Lys 65 70 75 80 Ala Gly Ala Thr Tyr Ile Ser Pro His Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp 85 90 95 Ala Phe Arg Ile Met Arg Thr Ile Lys Ala Leu Gly Cys Lys Thr Gly 100 105 110 Val Val Leu Asn Pro Ala Thr Pro Val Glu Tyr Ile Lys His Tyr Leu 115 120 125 Gly Met Leu Asp Lys Ile Thr Ile Leu Thr Val Asp Ala Gly Phe Ala 130 135 140 Gly Gln Thr Phe Ile Glu Glu Met Leu Asp Lys Ile Glu Glu Val Lys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Glu Glu Asn Gly Tyr Ser Tyr Leu Ile Glu Val Asp Gly 165 170 175 Ser Cys Asn Glu Lys Thr Phe Lys Lys Leu Ala Glu Ala Gly Thr Glu 180 185 190 Val Phe Ile Val Gly Ser Ser Gly Leu Phe Asn Leu Asp Ala Asp Leu 195 200 205 Lys Val Ser Trp Asp Lys Met Met Asn Met Phe Asn Lys Cys Ile Asn 210 215 220 Asn 225 <210> 21 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ribulose-phosphate 3-epimerase (PkFP3E) <400> 21 Met Lys Lys His Leu Phe Ser Pro Ser Leu Met Cys Met Asn Leu Met 1 5 10 15 Asp Ile Glu Asn Gln Leu Lys Val Leu Asn Gln Arg Ala Asp Met Val 20 25 30 His Ile Asp Ile Met Asp Gly His Tyr Val Lys Asn Ile Thr Leu Ser 35 40 45 Pro Tyr Phe Met Glu Gln Ile Arg Glu Ser Leu Thr Ile Pro Met Asp 50 55 60 Val His Leu Met Val Glu Lys Pro Ser Glu Phe Ile Lys Met Ile Ile 65 70 75 80 Asp Ala Gly Ala Thr Tyr Ile Ser Pro His Ala Glu Val Ile Asn Ser 85 90 95 Glu Ala Phe Arg Met Ile Asp Thr Ile Lys Ser Ala Gly Cys Lys Ala 100 105 110 Gly Ile Ala Leu Asn Pro Ala Thr Pro Leu Ser His Ile Gln His Tyr 115 120 125 Ile His His Leu Asp Lys Ile Thr Phe Met Ser Val Asp Pro Gly Phe 130 135 140 Ala Gly Gln Lys Phe Ile Pro Glu Val Leu Asp Lys Ile Arg Glu Ala 145 150 155 160 Arg Ala Leu Lys Glu Lys His Gly Tyr Asn Tyr Leu Ile Glu Ile Asp 165 170 175 Gly Ser Cys Asn Glu Lys Thr Phe Lys Ile Leu Glu Glu Ala Gly Val 180 185 190 Glu Val Phe Ile Val Gly Thr Ser Gly Leu Phe Asn Leu Asp Ser Asp 195 200 205 Leu Asn Lys Ala Trp Asp Gln Met Met Glu His Phe Asn Ser Gln Val 210 215 220 Asn Ala Glu Val 225

Claims (13)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며, 알룰로스-6-인산(allulose-6-phosphate)를 탈인산화하여 알룰로스로 전환시키고,
    Mn 이온에 의해 활성이 증가하고,
    과당-6-인산과 알룰로스-6-인산을 함유하는 혼합 기질에 대해, 반응생성물의 전체 탈인산화당 100중량%를 기준으로 60 중량%이상의 알룰로스 생성량을 갖는 것인, 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 것인, 효소 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 효소는 알룰로스를 알룰로스-6-인산으로 전환하는 역반응을 촉매하지 않는 비가역적 효소 활성을 가지는 것인, 효소 단백질.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 효소는 과당-6-인산의 과당으로 전환하는 전환율에 대한 알룰로스-6-인산의 알룰로스로 전환하는 전환율의 비율이 6배 내지 20배인 효소 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 효소는 Clostridium lundense에서 유래되며, 40 내지 55℃의 효소 반응 온도 및 pH 5.5 내지 9.0의 효소 반응 pH을 갖는 것인, 효소 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 효소는 Mg, Co, Ca, 또는 Ni 이온에 의해 활성이 증가하는 것인, 효소 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 효소는 Cu, Fe 또는 Zn 이온에 의해 활성이 감소하는 것인, 효소 단백질.
  9. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 알룰로스 생산용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, Mg, Mn, Co, Ca, 및 Ni 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 금속이온을 추가로 포함하는, 알룰로스 생산용 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 과당 6-인산 에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가로 포함하는, 알룰로스 생산용 조성물.
  12. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여, 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환시키는 단계를 포함하는, 알룰로스를 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 과당 6-인산 에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 과당 6-인산과 접촉시켜, 과당 6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
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