KR102513451B1 - 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 및 이의 용도 - Google Patents

프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산업적으로 유용한 범위의 pH, 온도에서 활성을 가지며, 전분 또는 말토덱스트린등의 경제적 원료를 사용하여 높은 수율의 케토헥소스를 생산할 수 있는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소, 케토헥소스 생산용 조성물, 및 이를 이용한 케토헥소스의 제조방법에 관한 것이다.

Description

프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 및 이의 용도{Fructose 6-phosphate 4-epimerase and use thereof}
본 발명은 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 및 이를 이용한 인산화 케토헥소스 제조에 관한 것으로서, 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소를 이용하여 케토헥소스를 제조할 수 있다.
인산화당의 에피머화 효소는 다양한 인산화 당에 있는 탄소에 결합된 에피머화 효소로서, 케토헥소오스-6-포스페이트 에피머화 효소는 C3 또는 C4를 에피머화 할 수 있다. 상기 케토헥소오스는 프럭토오스 (fructose), 알룰로스, 소르보오스 (sorbose), 및 타가토오스 (tagatose)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 케토헥소오스일 수 있다. 프럭토오스-6-포스페이트의 에피머화 효소는 3-에피머화 효소와 4-에피머화 효소를 포함한다.
구체적으로, 프럭토오스-6-포스페이트 4-에피머화 효소는 과당(D-fructose)을 4-에피머화(4-epimerization, 4번 탄소 에피머화)함으로써 타가토스 6-포스페이트를 생산할 수 있는 효소이다. 상기 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소는 일정 수준의 반응평형이 존재하여 최종 전환율이 20 내지 35% 수준밖에 되지 않는다. 따라서, 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소를 이용한 기질 전한 반응을 통해 고순도 타가토스를 제조하고자 할 경우, 최종 반응액에서 과당을 분리하여 제거하는 추가 공정이 필요하다.
산업적으로 전분, 말토덱스트린을 기질로 사용하여 케토헥소오스, 예를 들면 과당을 제조하고자 하는 경우에, 사용되는 효소는 산업적 생산조건, 특히 열안정성이 높으며, 최대한 높은 전환율을 가져야 하며, 또한 당을 기질로 사용하므로 당의 갈변화가 알칼리 조건에서 쉽게 일어나므로 가급적 당의 갈변이 방지되는 전환 반응 조건을 충족할 필요가 있다.
따라서, 산업적으로 사용하기에는 적합한 기질 전환율, 효소의 열안정성, 및 효소 반응조건을 적어도 하나 이상 만족하며, 과당을 원료로 하여 케토헥소오스를 제조하는 효소 및 이를 이용한 케토헥소오스의 생산 방법이 절실히 필요한 실정이다.
본 발명의 일 예는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스 6-포스페이트의 제조용 조성물 및 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 추가 일 예는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소를 암호화하는 핵산 분자. 상기 핵산분자를 도입한 벡터, 및 형질전환 원핵 세포을 제공한다.
본 발명의 추가 일 예는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질, 상기 효소를 발현하는 미생물, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 상기 균체, 배양물, 파쇄물 및 상등액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여 프럭토오스 6-포스페이트를 타가토스 6-포스페이트로 전환시키는 단계를 포함하는 타가토스-6-포스페이트의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 추가 일 예는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질, 상기 효소를 발현하는 미생물, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 상기 균체, 배양물, 파쇄물 및 상등액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 타가토스 6-포스페이트 제조용 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가 일 예는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질, 상기 효소를 발현하는 미생물, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 상기 균체, 배양물, 파쇄물 및 상등액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여 프럭토오스 6-포스페이트 을 타가토스-6-포스페이트로 전환시키는 단계, 및 상기 타가토스 6-포스페이트에서 인산기를 제거하는 단계를 포함하는, 타가토스의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 추가 일 예는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 상기 균체, 배양물, 파쇄물 및 상등액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과, 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소를 포함하는, 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 예는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 미생물에서 유래된 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 미생물, 및 이들을 이용한 인산화 포도당의 생산에 관한 것이다.
본 발명에 따른 타가토스 6-포스페이트 또는 타가토스 제조방법은 미생물 또는 이로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경 친화적이며, 간단한 효소 반응으로부터 프럭토오스로부터 타가토스 생산을 이전에 없던 방법으로 전환시키고, 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있다.
본 발명의 일 예는 미생물에서 유래된 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 또는 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물을 이용한 타가토스 6-포스페이트 제조용 조성물 또는 타가토스 생산용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 미생물에서 유래된 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 또는 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물을 이용한 타가토스 6-포스페이트 제조방법 또는 타가토스 생산방법에 관한 것이다.
상기 조성물의 유효성분은 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 배양물은 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 미생물 균체를를 포함하거나, 균체를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다.
상기 파쇄물은 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소를 생산하는 미생물의 균체를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 서열번호 1, 4, 또는7의 아미노산 서열과 서열 상동성이 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소에 관한 것이다. 상기 수치의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 효소와 동일하거나 상응하는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소를 이루는 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 기능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
상기 효소 단백질은 서열번호 3, 6 또는 9의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2, 5, 또는 8 의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있고, 또는 서열번호 3, 6 또는 9의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2, 5, 또는 8 의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성(identify)을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
상기에서 용어 "상동성", "일치성"또는 "동일성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성","% 일치성" 또는 "% 동일성"으로 표시된다.
본 발명의 구체적인 일 예는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 Caldisericum exile 유래 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질(CE_FP4E), 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 Kosmotoga olearia 유래 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질(KO_FP4E), 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 Limnochorda pilosa 유래 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소(LP_FP4E)일 수 있다.
본 발명에 따른 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질는 프럭토오스 6-포스페이트 기질에서 4번째 탄소를 에피머화여 타가토스 6-포스페이트로 전환하는 반응을 촉매한다. 일 예에 따른 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소의 프럭토오스 6-포스페이트로부터 타가토스 6-포스페이트로의 전환율은 20 % 이상, 25 % 이상, 30 % 이상, 또는 35 % 이상이고, 상한은 60 % 이하, 50 % 이하, 또는 40 % 이하일 수 있으며, 예를 들면 상기 전환율의 하한값과 상한값의 조합에 따른 범위를 가질 수 있다.
상기 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소는 특정 금속이온의 존재하에서 활성이 증대될 수 있다. 상기 금속 이온이 농도는 바람직하게는 0.1 mM 내지 20 mM, 0.2 내지 20 mM, 0.5 내지 20 mM, 1 내지 20 mM, 0.1 mM 내지 15 mM, 0.2 내지 15 mM, 0.5 내지 15 mM, 1 내지 15 mM, 0.1 mM 내지 10 mM, 0.2 내지 10 mM, 0.5 내지 10 mM, 1 내지 10 mM, 0.1 mM 내지 5 mM, 0.2 내지 5 mM, 0.5 내지 5 mM, 또는 1 내지 5 mM일 수 있다.
CE_FP4E, KO_FP4E, 및 LP_FP4E의 3종 효소는 공통적으로 Co, Mg 및 Ni 이온에 의해 활성이 증가하고, Fe 이온에 의한 활성 감소가 가장 크고, Zn 이온에 의해 활성 감소 특성을 나타낸다. 구체적으로, CE_FP4E는 금속 이온을 첨가하지 않은 대조군에 비해, Ca, Co, Mg, Mn 및 Ni 이온에 의해 활성이 증가하고, Fe 및 Zn 이온에 의해 활성이 감소하는 특성을 나타낸다. KO_FP4E는 금속 이온을 첨가하지 않은 대조군에 비해, Co, Mg, Mn 및 Ni 이온에 의해 활성이 증가하고, Ca, Fe 및 Zn 이온에 의해 활성이 감소하는 특성을 나타낸다. LP_FP4E는 금속 이온을 첨가하지 않은 대조군에 비해, Co, Mg, 및 Ni 이온에 의해 활성이 증가하고, Ca, Fe, Mn 및 Zn 이온에 의해 활성이 감소하는 특성을 나타낸다.
상기 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소는 40 내지 75℃, 바람직하게는 45 내지 75℃ 또는 50 내지 75℃로 반응 온도 및/또는 pH 6.5 내지 8.0의 반응 pH에서 효소 활성을 가질 수 있다.
구체적으로, CE_FP4E는 40 내지 75℃에서 안정하며 55 내지 75℃의 온도 범위에서 효소 최대 활성의 75%이상의 활성을 가질 수 있으며, 70℃에서 최대 활성을 가진다. KO_FP4E는 40 내지 75℃에서 안정하며 온도가 증가할수록 활성도 함께 증가하며, 55 내지 75℃의 온도 범위에서 효소 최대 활성의 75%이상의 활성을 가질 수 있다. LP_FP4E는 40 내지 75℃에서 안정하며 55-80 ℃의 범위에서 최대 활성 대비 50% 이상의 활성을 가지거나, 또는 65-75℃의 범위에서 최대 활성 대비 75% 이상의 활성을 가지며, 65℃에서 최대 활성을 가진다.
상기 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소는 CE_FP4E는 pH 7.0에서, KOF6PE와 LPF6PE는 pH 7.5에서 최대 활성을 나타내고, 종 모두 상업화 공정에 적합한 pH 6.5-8.0의 범위에서 최대 활성 대비 75% 이상의 활성을 가진다.
본 발명의 추가 예로서, 상기 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소를 암호화하는 핵산분자를 제공한다. 본 발명에 따른 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소를 암호화하는 핵산의 구체적인 일 예는, 서열번호 3, 6 또는 9의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2, 5, 또는 8 의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 3, 6 또는 9의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2, 5, 또는 8 의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성 (identity)을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 벡터 또는 형질전환체를 제공한다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 핵산 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 추가 일 예는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질, 상기 효소를 발현하는 미생물, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 상기 균체, 배양물, 파쇄물 및 상등액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 타가토스 6-포스페이트 제조용 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가 일 예는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 상기 균체, 배양물, 파쇄물 및 상등액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과, 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소를 포함하는, 타가토스 생산용 조성물을 제공한다. 이와 같은 방법으로 생산된 타가토스는 기능성 식품 및 의약품에 첨가되어 유용하게 사용될 수 있다.
상기 균주의 배양물은 상기 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소를 생산하는 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주를 포함하거나 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소를 생산하는 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로 상기 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소를 생산하는 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사용되는 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소를 생산하는 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 이들의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.
상기 타가토스 6-포스페이트 제조용 조성물 또는 타가토스 생산용 조성물을 이용하여 타가토스 생산하는 경우 효소 또는 효소를 생산하는 미생물을 이용한 반응 온도 및 반응 pH 조건은 상기 효소의 반응온도 및 반응 pH 조건에서 상술한 바와 같다.
상기 프럭토오스-6-포스페이트는 프럭토오스 또는 프럭토오스 함유 물질을 헥소카이네이즈 처리하여 얻은 것이 바람직하나 다른 화학적 합성방법 등에 의하여 제공되는 경우에도 포함된다.
예를 들면, 상기 타가토스 6-포스페이트 제조용 조성물 또는 타가토스 생산용 조성물은, 과당을 과당-6-포스페이트로 전환하는 헥소카이네이즈 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 과당-6-포스페이트는 포도당-6-포스페이트로부터 제조될 수 있으며, 상기 케토헥소오스 생산용 조성물은, 포도당-6-포스페이트를 이성화하여 과당-6-포스페이트로 전환하는 포도당-6-포스페이트 이성화 효소를 추가로 포함할 수 있다.
상기 포도당-6-포스페이트는 포도당을 직접 인산화하여 제조되거나, 포도당-1-포스페이트에서 전환될 수 있다. 포도당은 전분 또는 전분 가수분해물, 예를 들면 덱스트린 등에 포도당 생성 아밀라제를 처리하여 얻어진 포도당일 수 있고, 포도당-1-포스페이트는 상기 포도당에 인산화 효소를 처리하여 얻어지는 것일 수 있다. 상기 케토헥소오스 생산용 조성물은, 포도당-6-포스페이트를 제조하기 위한 효소 시스템을 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 타가토스 생산용 조성물에 포함되는 효소 및 타가토스 생산에 이용되는 기질이 제한되지 않는다. 본 발명의 타가토스 생산용 조성물은 (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 포도당, 포도당-1-인산, 포도당-6-포스페이트, 또는 과당-6-포스페이트; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 타가토스-6-포스페이트 탈인산화 효소; (iv) 포도당-6-포스페이트-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및/또는 (vi) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 전분/말토덱스트린 포스포릴라아제(starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1) 및 α-글루칸 포스포릴라아제는, 포스페이트(phosphate)를 포도당에 전이시켜 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-포스페이트을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 발명의 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7)는 포스페이트를 포도당에 전이시켜 수크로스로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 발명의 전분 액당화 효소인 α-아밀라아제(α-amylase, EC 3.2.1.1), 풀루란아제(pullulanse, EC 3.2.1.41), 글루코아밀라아제(glucoamylase, EC 3.2.1.3) 및 이소아밀라아제(isoamylase)는 전분 또는 말토덱스트린을 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 발명의 수크라제(sucrase, EC 3.2.1.26)는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 발명의 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2)는 포도당-1-포스페이트을 포도당-6-포스페이트로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 포도당인산화효소(glucokinase)는 포도당에 인산을 전이시켜 포도당-6-포스페이트로 전환하는 활성을 가지는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당인산화효소는 폴리포스페이트 의존형 포도당인산화 효소일 수 있다. 포도당-6-포스페이트 이성화효소는 포도당-6-포스페이트를 과당-6-포스페이트로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
상기 타가토스 6-포스페이트 제조용 조성물 또는 타가토스 생산용 조성물은, 타가토스-6-포스페이트에서 탈인산화 반응을 수행하는 파이테이즈(phytase), 또는 타가토스-6-포스페이트의 탈인산화 효소 (tagatose-6-phosphate phosphatase)를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에 사용 가능한 타가토스-6-포스페이트 탈인산화 효소는 타가토스 -6-포스페이트를 타가토스로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 타가토스-6-포스페이트 탈인산화 효소는 비가역적으로 타가토스-6-포스페이트를 타가토스로 전환시키는 활성을 갖는 단백질일 수 있다. 이에, 상기 타가토스 6-포스페이트 제조용 조성물 또는 타가토스 생산용 조성물은, 타가토스-6-포스페이트의 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase), 상기 타가토스-6-포스페이트의 탈인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 일 예는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질, 상기 효소를 발현하는 미생물, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 상기 균체, 배양물, 파쇄물 및 상등액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여 프럭토오스 6-포스페이트를 타가토스 6-포스페이트로 전환시키는 단계를 포함하는 타가토스-6-포스페이트의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 추가 일 예는 프럭토오스-6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질, 상기 효소를 발현하는 미생물, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 상기 균체, 배양물, 파쇄물 및 상등액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여 프럭토오스-6-포스페이트 를 타가토스-6-포스페이트로 전환시키는 단계, 및 상기 타가토스-6-포스페이트에서 인산기를 제거하는 단계를 포함하는, 타가토스의 제조방법을 제공한다.
상기 방법은, 헥소키나제(hexokinase)를 이용하여, 프럭토오스 또는 프럭토오스 함유 물질로부터 프럭토오스-6-포스페이트를 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있거나, 및/또는 상기 효소를 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 프럭토오스-6-포스페이트를 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 상기 프럭토오스-6-포스페이트를 타가토스-6-포스페이트로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-포스페이트에 포도당-6-포스페이트-이성화효소, 상기 포도당-6-포스페이트-이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당-6-포스페이트-이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-포스페이트를 과당-6-포스페이트로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법은 상기 포도당-6-포스페이트를 과당-6-포스페이트로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-포스페이트(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-포스페이트을 포도당-6-포스페이트로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 상기 포도당-6-포스페이트를 과당-6-포스페이트로 전환하는 단계 이전, 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-포스페이트로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 본 발명의 포도당-1-포스페이트를 포도당-6-포스페이트로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-포스페이트로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 본 발명의 포도당을 포도당-6-포스페이트로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 포도당에 4-α-글루카노트랜스퍼라아제, 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 타가토스-6-포스페이트의 포스페이트를 제거하는 단계는, 타가토스-6-포스페이트 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase), 상기 타가토스-6-포스페이트 탈인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 타가토스-6-포스페이트 탈인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 이용하여 수행하여 타가토스를 제조할 수 있다. 또는, 상기 포스페이트를 제거하는 단계는, 타가토스-6-포스페이트에 phytase, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 타가토스-6-포스페이트를 타가토스로 전환하는 단계를 수행하여, 타가토스를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 타가토스 6-포스페이트로 전환시키는 단계는 40 내지 75 ℃의 반응 온도 및 pH 6.5 내지 8.0의 반응 pH에서 수행될 수 있으며, 상기 반응온도는 40 내지 75 ℃, 45 내지 75℃, 또는 50 내지 75℃ 에서 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 타가토스 6-포스페이트로 전환시키는 단계는 Co, Mg 및 Ni 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 금속이온의 존재 하에서 수행 될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 포스페이트를 제거하는 방법은 타가토스 6-포스페이트에 파이테이즈, 또는 타가토스-6-포스페이트의 탈인산화 효소를 작용시켜 타가토스로 전환하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 타가토스 6-포스페이트는 다른 효소 또는 화학적인 방법 등에 의하여 인산기가 제거될 수도 있다.
본 발명의 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소는 산업적으로 유용한 범위의 pH, 온도에서 안정성을 가지며, 전분 또는 말토덱스트린등의 경제적 원료를 사용하여 높은 수율의 타가토스를 생산할 수 있으므로, 기능성 당 관련 건강식품 및 의약 산업에서 폭넓게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따라 CE_FP4E, KO_FP4E, 및 LP_FP4E의 3종 효소에 대해 타가토스가 생성을 확인하는 HPLC 분석 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따라 반응 온도 변화에 따른 CE_FP4E 효소의 타가토스 생성의 상대 활성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따라 반응 온도 변화에 따른 KO_FP4E 효소의 타가토스 생성의 상대 활성을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따라 반응 온도 변화에 따른 LP_FP4E 효소의 타가토스 생성의 상대 활성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 예에 따라 반응 pH 조건 변화에 따른 CE_FP4E 효소의 타가토스 생성의 상대 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 예에 따라 반응 pH 조건 변화에 따른 KO_FP4E 효소의 타가토스 생성의 상대 활성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 예에 따라 반응 pH 조건 변화에 따른 LP_FP4E 효소의 타가토스 생성의 상대 활성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 예에 따라 다양한 금속 이온의 존재 조건에 따른 CE_FP4E 효소의 타가토스 생성의 상대 활성을 나타내는 그래프이다.
도 9는본 발명의 일 예에 따라 다양한 금속 이온의 존재 조건에 따른 KO_FP4E 효소의 타가토스 생성의 상대 활성을 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 예에 따라 다양한 금속 이온의 존재 조건에 따른 LP_FP4E 효소의 타가토스 생성의 상대 활성을 나타내는 그래프이다.
도 11은 Rubrobacter indicoceani (RI) 유래 D-tagatose bisphosphate aldolase의 효소, 및 Lachnospiraceae bacterium (LB) 유래 Fructose 1,6-bisphosphate aldolase 를 포함하는 2종 효소에 대해 타가토스를 생성하는 지 여부를 확인하는 HPLC 분석 결과이다.
이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정된 것이 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.
실시예 1. 재조합 균주를 이용한 효소 생산
타가토스 6-포스페이트 전환 활성을 가지는 효소를 스크리닝하기 위해 다양한 효소의 아미노산 서열을 기반으로 구조 모델링 및 기질 도킹을 실시하였다. 선택된 후보 효소들은 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 E.coli strain K-12의 codon usage를 기반하여 optimization한 후 IDT gene 합성을 통해 유전자 합성 의뢰하여 폴리뉴클레오타이드 샘플을 확보하였다.
상기 합성한 폴리뉴클레오타이드를, 제한효소 NheI과 HindIII(NEB)를 사용하여 pET-28a 벡터에 삽입하였고, E. coli ER2566 균주에 형질전환하여 재조합 발현벡터 제작하였다. 상기 형질 전환된 재조합 균주를 3 mL LB-kanamycine 배지(Difco)에 접종한 후 600 nm에서 흡광도가 1.5에 도달할 때까지 37℃, 200rpm에서 진탕 배양한 후, 이 배양액을 100 mL LB-kanamycine 배지에 접종하여 37℃, 200rpm에서 진탕 배양 하였다. 이 배양액의 600 nm에서 흡광도가 0.4 내지 0.6에 도달하면 0.1-0.5mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 목적 효소의 발현을 유도하였다. 단백질 발현이 완료된 배양액은 6000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 회수한 후, 0.85%(w/v) NaCl로 2회 세척 후 효소 정제에 사용하였다.
효소 정제를 위해, 상기의 회수한 균체를 lysis buffer(300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0)에 혼탁시킨 후 음파진동기(Ultrasonic prosessor, ColeParmer)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 이를 13,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였고, 미리 lysis buffer로 평형시킨 Ni-NTA컬럼(Ni-NTA Superflow, Qiagen)에 통액시킨 다음 300 mM NaCl 및 20 mM immidazole을 함유한 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)와 300 mM NaCl 및 200 mM immidazole을 함유한 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충 용액을 순차적으로 흘려주어 목적 단백질을 용출하였다.
선택된 후보 효소와 그 유래 균주는 하기의 표 1과 같다.
유래 미생물 아미노산
서열번호		 폴리뉴클레오타이드서열번호
Wild /codon optimization
Caldisericum exile (CE) 1 2 / 3
Kosmotoga olearia (KO) 4 5 / 6
Limnochorda pilosa (LP) 7 8 / 9
실시예 2: 효소 활성의 분석
프럭토오스 6-포스페이트로부터 타가토스 6-포스페이트로의 전환 활성을 분석하기 위해, 실시예 1에서 정제한 효소를 20 mM 프럭토오스 6-포스페이트, 5 mM MgCl2를 함유한 50 mM sodium phosphate(pH 7.0) 완충 용액에 첨가한 후 60℃ 조건에서 1시간 동안 반응을 실시하였고, 100℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지하였다.
상기 효소 반응액에 phytase를 처리하여, 생성된 타가토스 6-포스페이트에서 인산기를 제거하여 타가토스를 제조하였다. 상기 반응 산물액을 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)을 사용하여 타가토스 생성량으로 측정하였다.
HPLC 분석 조건은 SUGAR SP0810 컬럼(Shodex)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 RID(Refractive Index Detector, Agilent 1260 RID)를 이용하여 이동상 용매는 물, 온도는 80℃, 유속은 0.6 mL/min로 수행하였다. 그 결과, 도 1과 같이, Caldisericum exile 유래의 효소 (이하, CE_FP4E), Kosmotoga olearia 유래의 효소 (이하, KO_FP4E), Limnochorda pilosa 유래의 효소 (이하, LP_FP4E)의 3종 효소에 대해 타가토스가 생성됨을 확인하였다. 상기 3종의 효소는 각각, Caldisericum exile, Kosmotoga olearia 및 Limnochorda pilosa 유래된 아미노산 서열(서열번호 1, 4, 7)과 상기 단백질 CDS를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (서열번호 2, 5, 8)를 갖고, 효소의 생산을 위해 유전자 합성을 의뢰하여 E.coli strain K-12의 codon usage 사용된 폴리뉴클레오타이드는 각각 서열번호 3, 6, 및 9를 갖는다.
실시예 3: 반응 온도 변화에 따른 효소 활성 분석
반응 온도 변화에 따른 효소 활성 변화를 확인하기 위해, 실시예 1에서 정제한 효소를, 20 mM 프럭토오스 6-포스페이트, 5 mM MgCl2를 함유한 50 mM sodium phosphate(pH 7.0) 완충 용액에 첨가하고, 50-80℃ 조건에서 1시간 동안 효소 반응을 실시하였고, 100℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지하였다.
상기 효소 반응액에 phytase를 처리하여, 생성된 타가토스 6-포스페이트에서 인산기를 제거하여 타가토스를 제조하였다. 실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로, 상기 반응산물액을 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)을 사용하여 타가토스 생성량으로 측정하였다. CE_FP4E, KO_FP4E, 및 LP_FP4E의 3종 효소에 대해, 반응 온도에 따른 타가토스 생성의 상대 활성을 도 2, 도 3, 및 도 4에 각각 나타낸다.
도 2의 그래프에 나타낸 바와 같이 CE_FP4E는 70℃에서 최대 활성을 보였고, 도 3의 그래프에 나타낸 바와 같이 KO-FP4E는 온도가 증가할수록 활성도 함께 증가하였다. CE_FP4E 및 KO-FP4E는 모두 55-75℃의 넓은 범위에서 최대 활성 대비 75% 이상의 활성을 나타내었다. 도 4의 그래프에 나타낸 바와 같이, LP-FP4E는 65℃에서 최대 활성을 보였고, 55-80℃의 범위에서 최대 활성 대비 50% 이상을 보이고, 65-75℃의 범위에서 최대 활성 대비 75% 이상의 활성을 나타내었다.
실시예 4: 반응 pH 변화에 따른 효소 활성 분석
반응 pH 변화에 따른 효소 활성 변화를 확인하기 위해 실시예 2에서 정제한 효소를 다양한 pH의 50 mM 완충 용액(pH 6.0, Sodium citrate buffer; pH 6.5-8.5, Tris-HCl buffer; pH 8.5-9.0, Glycine-NaOH buffer)에 20 mM 프럭토오스 6-포스페이트, 5 mM MgCl2와 함께 첨가한 후 60℃ 조건에서 1시간 동안 반응을 실시하였고, 100℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지하였다. 이후 실시예 3과 같이 타가토스를 정량 분석하였다. CE_FP4E, KO_FP4E, 및 LP_FP4E의 3종 효소에 대해, 반응 온도에 따른 타가토스 생성의 상대 활성을 도 5, 도 6, 및 도 7에 각각 나타낸다.
도 5 내지 도 7의 그래프에 나타낸 바와 같이 CE_FP4E는 pH 7.0에서, KOF6PE와 LPF6PE는 pH 7.5에서 최대 활성을 나타내었고, 3종 모두 상업화 공정에 적합한 pH 6.5-8.0의 범위에서 최대 활성 대비 75% 이상의 활성을 나타내었다.
실시예 5: 금속이온에 따른 효소 활성 분석
금속이온 종류에 따른 효소 활성 변화를 확인하기 위해 실시예 2에서 정제한 효소에 CaCl2, CoCl2, FeSO4, MgCl2, MnCl2, NiSO4, ZnSO4를 각각 1 mM씩 처리하고 20 mM 프럭토오스 6-포스페이트, 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0) 완충 용액을 첨가한 후 60℃ 조건에서 1시간 동안 반응을 실시하였다. 효소 반응 정지를 위해 100℃에서 5분간 가열하였다. 이후 실시예 3과 같이 타가토스를 정량 분석하였다. CE_FP4E, KO_FP4E, 및 LP_FP4E의 3종 효소에 대해, 금속이온의 종류에 따른 타가토스 생성의 상대 활성을 도 8, 도 9, 및 도 10에 각각 나타낸다.
도 8, 도 9, 및 도 10에 나타낸 바와 같이, CE_FP4E, KO_FP4E, 및 LP_FP4E의 3종 효소는 공통적으로 Co, Mg 및 Ni 이온에 의해 활성이 증가하고, Fe 이온에 의한 활성 감소가 가장 크고, Zn 이온에 의해 활성 감소 특성을 나타낸다.
구체적으로, 도 8의 그래프에 나타낸 바와 같이, CE_FP4E는 금속 이온을 첨가하지 않은 대조군에 비해, Ca, Co, Mg, Mn 및 Ni 이온에 의해 활성이 증가하고, Fe 및 Zn 이온에 의해 활성이 감소하는 특성을 나타낸다. 도 9의 그래프에 나타낸 바와 같이, KO_FP4E는 금속 이온을 첨가하지 않은 대조군에 비해, Co, Mg, Mn 및 Ni 이온에 의해 활성이 증가하고, Ca, Fe 및 Zn 이온에 의해 활성이 감소하는 특성을 나타낸다. 도 10의 그래프에 나타낸 바와 같이, LP_FP4E는 금속 이온을 첨가하지 않은 대조군에 비해, Co, Mg, 및 Ni 이온에 의해 활성이 증가하고, Ca, Fe, Mn 및 Zn 이온에 의해 활성이 감소하는 특성을 나타낸다.
비교예 1: 금속이온에 따른 효소 활성 분석
Rubrobacter indicoceani (RI) 유래 D-tagatose bisphosphate aldolase (Genbank accession no. WP_119069933)의 효소, Lachnospiraceae bacterium (LB) 유래 Fructose 1,6-bisphosphate aldolase, class II (Genbank accession no. HCT64551효소를 암호화하는 유전자 합성 의뢰하여 확보하였다. 상기 D-tagatose bisphosphate aldolase (RI), Fructose 1,6-bisphosphate aldolase (LB), 의 합성된 폴리뉴클레오타이드 서열은 각각 SEQ ID NO 10, 또는 SEQ ID NO 11에 나타낸다.
상기 D-tagatose bisphosphate aldolase (RI)의 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6의 KO_FP4E 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 9의 LP_FP4E의 폴리뉴클레오티드 서열과 각각 서열비교를 한 결과, 폴리뉴클레오티드 서열 동일성이 56.47% 또는 53.12%이었다. 또한, 상기 D-tagatose bisphosphate aldolase (RI)의 아미노산 서열은 서열번호 4의 KO_FP4E 아미노산 서열 또는 서열번호 7의 LP_FP4E의 아미노산 서열과 각각 서열비교를 한 결과, 아미노산 서열 동일성이 48.64, 47.87%이었다.
상기 얻어진 서열번호 10, 및 11의 폴리뉴클레오타이드 서열을 기본으로 하여, 상기 실시예 1와 실질적으로 동일한 방법으로 대량으로 유전자를 얻었다. 실시예 1와 실질적으로 동일한 방법으로, 상기 얻어진 유전자를 E.coli에 도입하여 발현시킨 후에 목적 단백질을 용출하였다. 최종적으로 확보한 단백질은 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)으로 전환하여 이후 사용을 위해 보관하였다.
프럭토오스 6-포스페이트로부터 타가토스 6-포스페이트로의 전환 활성을 분석하기 위해, 실시예 2와 동일한 방법으로, 상기 얻어진 효소를 이용하여 프럭토오스-6-포스페이트를 기질로 사용한 효소 반응을 수행하였다. 상기 효소 반응액에 탈인산화효소(phosphatase)를 처리하여, 생성된 타가토스 6-포스페이트에서 인산기를 제거하여 타가토스를 제조하였다. 상기 반응 산물액을 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)을 사용하여 타가토스 생성량으로 측정하였다. HPLC 분석 조건은 실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로 수행하였다. 상기 HPLC 분석 조건을 도 11에 나타낸다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, Rubrobacter indicoceani (RI) 유래 D-tagatose bisphosphate aldolase 및 Lachnospiraceae bacterium (LB) 유래 Fructose 1,6-bisphosphate aldolase는 타가토스 피크가 확인되지 않음을 확인하였다. 특히, Rubrobacter indicoceani (RI) 유래 D-tagatose bisphosphate aldolase는 KO_FP4E 및 LP_FP4E 효소가 원래 알려진 효소 기능이 동일함에도 불구하고, 프럭토오스 6-포스페이트로부터 타가토스 6-포스페이트로의 전환 활성이 없음을 확인하였다.
<110> SAMYANG COOPERATION <120> Fructose 6-phosphate 4-epimerase and use thereof <130> DPP20202974 <150> KR 10-2019-0137586 <151> 2019-10-31 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 415 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fructose 6-phosphate epimerase of Caldisericum exile <400> 1 Met Trp Leu Asp Ser Asn Phe Leu Lys Asn Arg Gly Ile Phe Ser Ile 1 5 10 15 Cys Ser Ser Asn Glu Asn Val Leu Asp Ala Ser Ile Glu Phe Ala Lys 20 25 30 Glu Lys Glu Asp Phe Leu Leu Ile Glu Ala Thr Cys His Gln Val Asn 35 40 45 Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Lys Met Thr Pro Glu Ser Phe Ser Lys Lys 50 55 60 Ile Phe Lys Lys Ala Glu Glu Met Asn Phe Asn Pro Glu Arg Leu Leu 65 70 75 80 Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Glu Pro Trp Lys Asn Glu Asn Ala 85 90 95 Asp Thr Ala Met Asp Lys Ala Lys Gln Leu Val Ile Glu Phe Val Lys 100 105 110 Asn Gly Phe Asn Lys Ile His Leu Asp Cys Ser Met Pro Leu Lys Gly 115 120 125 Asp Ser Asp Phe Ser Thr Thr Leu Val Ala Asp Arg Glu Ala Glu Leu 130 135 140 Cys Ala Val Ala Glu Glu Thr Tyr 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ttggcacaga agtgcctgct ccaggaggaa gtacgaatga agttccagaa 540 gtaacttcta ttgaagaatt agacgaaatg atcgaagaac ttcagaatgc tttcttaaga 600 ttaggtctga aaaatgcatg ggacagagtc atagcaatag ttgtaaggct tggaatagga 660 tttggtggag acagtgtatc tgaatatgaa agtgaaaaga caaaagaatt gtgtacctat 720 ctgagcagat attacccatc tttatatttt gaggcccatt caacagatta tcaaactgct 780 ggatctctaa aacaaatggt taaagacggt ataagaatat taaaggttgg gcccgcattg 840 acagatgctt atagaagagg catgtttgcc ttgaacttta tagaaaaaga atcaatagat 900 gaagaaaaac aatcaagatt agttgaaaac gtgcttaaag taatggatga atatcccaga 960 tactgggaag attattataa cagcgtcgga aagactctta gattagatca aatgtacagt 1020 tattttgaca gaattagata ttactgggga tttgaagagg ttgaaaaatc taagaatcgt 1080 cttattgaaa atcttaaaga tatgcaaatg aatttaattc gacagtatct tccagaacaa 1140 tacgaaaaaa taagggaaaa caaattgaac aaggatcccc gtgcgctaat aaactatgaa 1200 ataaaaaaag tattgaatga ttatcaaaaa agcgttattt tagaataa 1248 <210> 3 <211> 1248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized Polynucleotide sequence of Fructose 6-phosphate epimerase of Caldisericum exile <400> 3 atgtggctgg attcaaattt cttgaagaat cgtggcatct tttcaatctg ttccagtaac 60 gaaaatgttc ttgatgcgtc gattgaattc gcgaaagaaa aagaggattt cctgttgatt 120 gaagcaacct gccatcaagt caatcagttc ggcgggtata ctaagatgac acctgagtca 180 ttctcgaaga aaatctttaa gaaggcggaa gaaatgaact ttaatcctga gcgcttattg 240 ttaggtgggg accatttagg tcccgaaccc tggaaaaacg aaaatgctga taccgcaatg 300 gataaagcaa aacagttggt catcgagttt gtgaagaatg gttttaacaa aatccactta 360 gactgtagca tgccacttaa aggggactcc gatttcagta cgaccttagt agcagatcgt 420 gaggcagaat tatgtgcagt tgctgaagaa acttatgaga aatatggagg gaaccgtcct 480 gtgtacgtgg tagggacgga agttccggca cctggaggaa gtactaacga agtaccagag 540 gttacttcta ttgaagagct ggatgaaatg attgaggagc ttcaaaacgc atttttacgc 600 ttaggcttga agaacgcttg ggaccgtgtg attgcgatcg tagtgcgcct tgggatcggc 660 tttggcggtg actcagtatc cgagtacgaa agtgaaaaaa cgaaagaact ttgcacctat 720 ttatcgcgct actatccgtc tctttacttt gaagctcact cgacagatta ccagaccgcc 780 ggctccctga aacagatggt caaagacgga atccgtatcc tgaaggtggg acctgcactg 840 acagacgctt atcgccgtgg catgtttgct ttgaatttta tcgaaaaaga gtccattgac 900 gaggaaaaac agtctcgtct ggtcgagaat gtcttaaaag taatggatga gtaccctcgt 960 tactgggaag actattacaa ttccgtaggt aaaacacttc gtttggacca aatgtactca 1020 tacttcgacc gtattcgcta ttattggggt tttgaagagg tagagaaaag caagaatcgt 1080 ctgattgaga acttgaagga tatgcagatg aacctgattc gtcaatatct tccagaacaa 1140 tacgaaaaga tccgcgaaaa caaattgaat aaggaccccc gtgccttgat caattatgag 1200 atcaaaaagg tccttaacga ctaccagaag tcggtcattc tggaataa 1248 <210> 4 <211> 435 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fructose 6-phosphate epimerase of Kosmotoga olearia <400> 4 Met Lys Lys His Pro Leu Gln Asp Ile Val Ser Leu Gln Lys Gln Gly 1 5 10 15 Ile Pro Lys Gly Val Phe Ser Val Cys Ser Ala Asn Arg Phe Val Ile 20 25 30 Glu Thr Thr Leu Glu Tyr Ala Lys Met Lys Gly Thr Thr Val Leu Ile 35 40 45 Glu Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Gly Met 50 55 60 Thr Pro Ala Asp Phe Arg Glu Met Val Phe Ser Ile Ala 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gttcggtggc tacaccggta 120 tgactcctgc tgatttcaga gaaatggttt tttctatcgc tgaggatatt ggacttccca 180 aaaataaaat catccttggt ggcgaccatc ttggcccaaa tccctggaag ggtcagccgt 240 cagatcaggc tatgcgtaac gccattgaaa tgattcgaga atacgctaaa gctgggttta 300 ccaagcttca tctggatgcc agcatgcgtc ttgcagacga tccggggaac gaaaacgagc 360 cgctgaaccc ggaagttata gcggaaagaa cagctcttct ctgtcttgaa gccgagaggg 420 cttttaaaga atccgccggt tctctccggc ctgtttacgt tattggtacg gatgttccgc 480 caccgggtgg agcgcaaaac gaaggtaaat cgattcatgt aaccagtgtt caggattttg 540 agcgtaccgt tgagttgacc aaaaaggcat ttttcgacca tggtttgtat gaagcctggg 600 gaagggtgat tgcggttgtt gtgcaaccgg gagtagaatt cgggaatgaa catatattcg 660 aatatgatag aaatcgagcg agagaactta ctgaggcgat aaaaaagcat ccaaatatag 720 tttttgaagg tcactcgaca gattatcaaa cggcaaaagc attgaaagaa atggtagaag 780 acggtgtagc catactcaag gttgggccag ctctaacatt tgcgctcaga gaggcttttt 840 ttgcgttgag cagcattgaa aaagagttat tttatgatac acccgggctt tgttcaaact 900 ttgttgaagt tgtcgagaga gcgatgcttg acaatccaaa acattgggaa aaatattacc 960 agggagaaga gagagaaaat agattagccc gtaaatacag ctttctcgat cgcttgaggt 1020 attactggaa tcttcctgag gttagaacag cggtgaataa gctgataacc aaccttgaaa 1080 caaaagaaat cccgttaacg cttataagcc agttcatgcc gatgcagtac caaaaaatca 1140 gaaacggttt gctaagaaag gatccaataa gccttataaa agatcgaatt acccttgttc 1200 ttgatgacta ctatttcgca actcaccctg aatgttga 1238 <210> 6 <211> 1308 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized Polynucleotide sequence of Fructose 6-phosphate epimerase of Kosmotoga olearia <400> 6 atgaagaaac atccactgca ggatatcgtg agccttcaga agcaaggcat tcctaagggc 60 gtattcagcg tgtgttctgc caatcgtttt gtgattgaga ccaccctcga gtatgccaaa 120 atgaaaggta cgacagtttt gatcgaggcg acgtgtaacc aggtaaatca gtttggcggt 180 tacaccggaa tgacccccgc tgatttccgc gagatggtgt tttcgatcgc cgaagacatc 240 ggtctgccga aaaacaagat catcctggga ggcgatcact tgggtccgaa cccatggaaa 300 ggtcagccca gcgatcaagc aatgcgtaat gctattgaaa tgatccgcga atacgccaag 360 gcgggtttta ccaagttgca tctggatgcc agcatgcgtt tagcggacga tccgggtaac 420 gagaacgagc ccctgaaccc ggaagtgatc gccgaacgca ccgcgttact ttgtctggaa 480 gcggaacgtg cctttaaaga aagcgcaggc tccttgcgcc cggtgtatgt gatcggcact 540 gatgttccac cacctggtgg tgcccaaaat gagggcaaat caattcatgt gacctctgta 600 caggactttg agcgcacggt agaattaaca aaaaaagcgt ttttcgatca cgggctgtat 660 gaagcgtggg gccgcgttat tgcagtggta gtccagcccg gtgttgaatt cggaaacgaa 720 cacattttcg aatacgatcg caatcgtgcg cgtgaactta ccgaagcaat taagaagcac 780 ccgaatatcg tctttgaagg ccattcaacc gactaccaga ccgcaaaggc gctgaaagaa 840 atggtggagg atggcgttgc catcctgaaa gtcggcccag cgttgacgtt tgcgctgcgt 900 gaagctttct tcgctttaag ctccattgag aaagagctgt tctatgatac tccgggatta 960 tgctcgaact ttgtcgaagt tgttgaacgc gcgatgcttg acaatccgaa gcactgggag 1020 aaatactatc agggtgagga acgtgaaaat cgcctggccc gcaagtatag ctttttggac 1080 cgtctgcgct actattggaa cctgcccgag gttcgtacgg cggtaaacaa actgattacg 1140 aaccttgaaa ccaaagaaat tccactgacc ttgatttctc aatttatgcc tatgcagtac 1200 cagaagattc gcaacgggct tttgcgcaaa gatccaattt ctcttatcaa ggatcgcatc 1260 accctggttc ttgacgatta ctactttgca actcatccgg aatgctaa 1308 <210> 7 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fructose 6-phosphate epimerase of Limnochorda pilosa <400> 7 Met Arg Gln Val Ile Trp Gly Gln Gly Thr Arg Asp Pro Arg Gly Ile 1 5 10 15 Tyr Ser Val Cys Thr Ala Asp Pro Leu Val Leu Arg Ala Ala Leu Lys 20 25 30 Gln Ala Val Glu Asp Gly Ser Pro Ala Leu Ile Glu Ala Thr Ser Asn 35 40 45 Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Gly Met Glu Pro Pro Ala Phe 50 55 60 Val Glu Phe Val Leu Gly Leu Ala Arg Glu Met Gly Leu Pro Pro Glu 65 70 75 80 Arg Leu Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Asn Pro Trp Gln Arg 85 90 95 Leu Ala Ala Glu Glu Ala Met Arg His Ala Cys Asp Leu Val Glu Ala 100 105 110 Phe Val Ala Cys Gly Phe Thr Lys Ile His Leu Asp Ala Ser Met Pro 115 120 125 Leu Gly Glu Glu Arg Ala Gly Gly Ala Leu Ser Lys Arg Val Val Ala 130 135 140 Glu Arg Thr Ala Gln Leu Cys Glu Ala Ala Glu Ala Ala Phe Arg Lys 145 150 155 160 Arg Ser Gln Ala Glu Gly Ala Ser Ala Pro Pro Leu Tyr Val Ile Gly 165 170 175 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Pro Leu Pro Leu Leu Ser Gln Phe Leu Pro Arg Gln Tyr Glu Arg 385 390 395 400 Val Arg Glu Gly Val Leu Arg Asn Asp Pro Glu Glu Leu Val Leu Asp 405 410 415 Arg Ile Arg Asp Val Leu Arg Gly Tyr Ala Ala Ala Val Gly Thr Gly 420 425 430 Ala Arg Arg Ala Glu Pro Ser Pro Ala 435 440 <210> 8 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence for Fructose 6-phosphate epimerase of Limnochorda pilosa <400> 8 atgaggcagg tcatttgggg tcaagggacg agggaccccc gcggcatcta ctcggtctgt 60 accgcagacc ccctcgtcct tcgggccgcc ctcaagcagg cggtggagga tggctccccc 120 gcgctgatcg aggcgacgtc caaccaggtg aaccagttcg gcgggtatac ggggatggag 180 cccccggcgt tcgtggagtt cgtgctggga cttgcccgcg agatgggact cccgcccgag 240 cggctgatcc tcgggggcga tcacctcggc cccaacccat ggcagcggct ggcggccgaa 300 gaggccatgc ggcatgcctg cgacctcgtc gaggccttcg tggcctgcgg cttcaccaag 360 attcacctgg acgccagcat gcccctgggg gaggaacggg caggcggtgc gctttcgaaa 420 cgggtggtgg ccgaacggac cgcccagctc tgcgaggcgg ccgaggcggc cttcaggaag 480 cggtcccagg cggagggggc gtcggcgcct ccgctctacg tcatcggctc cgacgtgcct 540 ccgcccggcg gcgagacctc cgggagccag gggcccaagg tgaccacgcc ggaggagttc 600 gaggagacgg tcgcgctgac gcgggcgacc tttcacgatc ggggcctgga cgacgcctgg 660 ggacgggtga tcgccgtggt ggtccagccg ggggtggact tcggcgagtg gcaggttcac 720 ccctacgatc gggccgccgc ggcgagcctt acccgagcct tgacgcagca tccggggctg 780 gccttcgaag ggcactccac cgactaccag acgccggggc ggcttcgcca gatggcggaa 840 gacggcatcg ccatcctgaa ggtggggccg gccctcacct tcgccaagcg ggaagcgctc 900 ttcgccctga acgccctgga gtccgaagtg ctggggacgg acggccgagc acggcgctcc 960 aacgtcgaag ccgccctcga agaggcgatg ctcgccgatc cccgtcactg gagcgcctac 1020 tacagcgggg acgagcacga gctccgtctc aagcggaagt acggcctctc cgaccggtgt 1080 cgctactact ggcccgtccc ttcggtgcag gaggccgtcc agcgcctcct tggcaacctg 1140 cgcgaggcgg ggatcccctt gcccctgctg agccagttcc tgccgcgcca gtacgagcgg 1200 gtgcgggagg gcgtcctgcg caacgacccg gaggagctgg tcctggaccg gattcgtgac 1260 gtgttgcggg gatatgcggc ggccgtgggg acgggcgcta ggcgggcgga gccatcaccc 1320 gcgtga 1326 <210> 9 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized Polynucleotide sequence of Fructose 6-phosphate epimerase of Limnochorda pilosa <400> 9 atgcgtcaag taatttgggg ccaaggaaca cgtgatccgc gtggaatcta tagtgtgtgt 60 actgcggatc cactggtctt gcgtgcagcg cttaagcagg cggttgaaga cgggagccct 120 gcgttaatcg aagcgacctc aaaccaggtg aaccaatttg gtgggtacac cggtatggaa 180 cctcctgcct tcgtggaatt cgtactgggt ctggcgcgtg aaatgggctt accgccagaa 240 cgcctgatct tgggcggtga tcacttggga ccaaatccat ggcaacgtct ggcggcggaa 300 gaagccatgc gccatgcatg tgatctggtg gaagcgtttg tcgcttgcgg attcactaaa 360 attcatctgg atgcttccat gccacttggt gaagaacgtg caggtggtgc actgtctaaa 420 cgtgtggttg cggaacgtac cgctcagtta tgtgaggccg cggaagcagc gttccgtaag 480 cgtagtcaag cggaaggcgc aagtgcgcca ccgttatacg ttatcgggtc cgatgttcct 540 ccccctggcg gagaaacctc tggctcacag ggccctaaag tcactactcc ggaggaattt 600 gaagaaaccg ttgcactgac acgtgccacg tttcatgacc gcggtcttga tgatgcatgg 660 ggtcgtgtta ttgcggtggt tgtccaaccg ggcgtggatt ttggcgaatg gcaggtgcat 720 ccctacgatc gtgcggcagc agcctcatta actcgcgctc tgacgcagca tccgggatta 780 gcttttgaag ggcacagcac cgattatcag accccgggtc gcctgcgtca aatggcagag 840 gacggtattg cgattcttaa agttggccct gcactgacct tcgcaaaacg cgaagcactc 900 ttcgcactga atgccttgga aagcgaggta ttgggaacag atggccgtgc gcgtcgttcc 960 aatgtcgaag cagcattgga agaagcgatg ttagctgacc cgcgccattg gagtgcctat 1020 tacagcggag atgaacacga actgcgcttg aaacgcaagt atggtctgag tgatcgctgc 1080 cgctactatt ggcctgtacc gtcagttcag gaggcggttc aacgtttact gggtaatctg 1140 cgtgaagcag gcatcccttt acctcttctg agccagtttc tgccgcgcca gtatgaacgt 1200 gtacgtgagg gtgttttacg caacgaccct gaagaacttg tcttggatcg tattcgtgac 1260 gtccttcgtg gctatgctgc agccgttgga acaggtgcac gtcgcgcaga accgtctcca 1320 gcataa 1326 <210> 10 <211> 770 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D-tagatose bisphosphate aldolase of Rubrobacter indicoceani <400> 10 atgagttcat tattagcgga tattctgcgt cgtcacgacc gcggtgaagc agttggcatc 60 tattccgtat gttcggccca cccattggtg attgaaaccg cggtcattca agcgctcgaa 120 gatggctcgc cgctgttagt cgaagcgacc tcgaatcagg tggatcagtt cggcggatac 180 acggggatga aaccggaaga tttccgtgat ctggtcttag agattgcccg tgaacatgga 240 ctggaaccgg atcgtatcat cctgggaggc gatcatttag gcccaaacac ctggcaagcc 300 gaaccagctg agcaggcaat gaaaaaggca gaagcgctga ttgaaagtta tgttcgcgcg 360 ggttttacca aaattcattt ggattgtagt atgccttgcg cagatgatcc gaccactctc 420 gatgatagcg ttaccgcaga acgtgcggca cgtttagcgg ccgtttctga gaaagcggcg 480 acagaggtgg ccctgactga aaaaccttta tacattgtag gtaccgaagt tccagtaccg 540 ggaggagcgt cggaaaccct gactgaagtc gaaccaacag atgaagcggc agcccgtgct 600 accattggtg cacacgaacg tgcgtttcgt gatgctgggg tgggtgaagc ttgggaacgt 660 gtggttggct tggtagtgca gccgggggtg gagtttgatc acacccgcgt cattgcctac 720 gaacgtggct tagcccgtgg actgagtcag gtgactgaag atcacgatgg 770 <210> 11 <211> 930 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fructose 1,6-bisphosphate aldolase, class II of Lachnospiraceae bacterium <400> 11 atgcccttgg tgacgagtaa ggagatgttt aaaaaagcct acgaaggacg ttatgcggtc 60 ggggctttta acgtaaacaa catggaaatc attcagggaa ttgtagatgc agcaaaagag 120 gagaatgctc ctcttatctt gcaggtctca gcaggtgctc gcaaatatgc taaacatatt 180 tatttgacta agcttgtaga ggcggcggtg gaggatacgg gccttccgat tgtcttacac 240 ttagaccatg gagacgattt tgaaatttgt aaacagtgca tcgacggggg gtttactagc 300 gtgatgattg atggatcaaa acacgcattt gcggaaaaca ttgagttgac gaaacgtgta 360 gttgactacg cacatgagcg tggagtcgta gtggaggctg aacttgggaa actggcgggt 420 atcgaggacg ccgttaatat ttccgcagct gacgctactt tcactgaccc cgaccaggct 480 gtcgaatttg tcgagcgcac gggcgttgat agcttagcga ttgctatcgg gacgagccat 540 ggagctttca agtttaaagg cgagccacgc cttgacttcg atcgtttaga aaagattagc 600 atcctgttac cagggtttcc cattgtgctt cacggagcct cgtcagtccc acaacagttc 660 gtggaagaat gcaacaaata cgggggtcat gttccggggg cgcagggagt cccggagagc 720 atgcttaagc gtgctggtac gatgggagtg tgtaagatca atatcgatac tgatttgcgt 780 ttggctatga ctacgtcaat ccgcaagtac tatgttgagc atcctgaaga attcgatcca 840 cgtaaatatc tggccccagc ccgcgatgcg attaaagcaa tggtccagca taaaatgcgc 900 gacgtattaa attgcagtgg caaagcgtaa 930

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질, 상기 효소를 발현하는 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 상기 균체, 배양물, 파쇄물 및 상등액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과, 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소를 포함하는, 타가토스 생산용 조성물로서,
    상기 효소 단백질은 Ca 이온에 의해 활성이 증가하는 특성을 갖는 것인, 타가토스 생산용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 2 또는 3의 폴리뉴클레오타이드 서열을 가지는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 것인, 타가토스 생산용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 효소는 Caldisericum exile 유래인, 타가토스 생산용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 타가토스 생산용 조성물과 프럭토오스 6-포스페이트를 접촉하여 타가토스 6-포스페이트를 제조하는 단계, 및 상기 타가토스 6-포스페이트에서 인산기를 제거하는 단계를 포함하는, 타가토스의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 타가토스 6-포스페이트로 전환시키는 단계는 40 내지 75℃의 반응 온도 및 pH 6.5 내지 8.0의 반응 pH에서 수행되는 것인 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 타가토스 6-포스페이트로 전환시키는 단계는 Co, Mg 및 Ni 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 금속이온의 존재 하에서 수행되는 것인 제조방법.
  9. 제6항에 있어서, 헥소키나제(hexokinase)를 이용하여, 프럭토오스 또는 프럭토오스 함유 물질로부터 프럭토오스-6-포스페이트를 제조하는 단계를 추가로 수행하는 것인 제조방법.
  10. 삭제
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은, Co, Mg 및 Ni 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 금속이온을 추가로 포함하는 것인 타가토스 생산용 조성물.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 타가토스 6-포스페이트의 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 포도당 6-포스페이트를 프럭토오스-6-포스페이트로 전환하는 이성화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합; (ii) 포스페이트 (phosphate); (iii) 타가토스-6-포스페이트 탈인산화 효소; (iv) 포도당-6-포스페이트-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 (vi) α-글루카노포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는
    (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
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