KR20220028053A

KR20220028053A - 조작된 수크로스 포스포릴라제 변이체 효소

Info

Publication number: KR20220028053A
Application number: KR1020227003289A
Authority: KR
Inventors: 조나단 브룸; 산토쉬 시바라마크리쉬난; 난드히타 서브라마니안
Original assignee: 코덱시스, 인코포레이티드
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2022-03-08
Also published as: MX2021015614A; CN114072165A; CA3142636A1; SG11202113109YA; EP3993824A4; EP3993824A1; BR112021026326A2; US20220243183A1; AU2020300454A1; WO2021003132A1; IL289509A; JP2022538230A

Abstract

본 발명은 조작된 수크로스 포스포릴라제(SP) 효소, SP 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. SP 효소를 생산하는 방법 또한 제공된다. 본 발명은 추가로 SP 효소를 포함하는 조성물, 및 조작된 SP 효소를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 약제학적 화합물의 제조에서 특별한 용도를 발견한다.

Description

조작된 수크로스 포스포릴라제 변이체 효소

본 출원은 2019년 7월 2일 출원된 미국 특허 가출원 시리얼 제62/869,670호에 대한 우선권을 주장하고, 상기 출원은 그 전문이 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.

본 발명의 분야

본 발명은 조작된 수크로스 포스포릴라제(SP: sucrose phosphorylase) 효소, SP 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. SP 효소를 생산하는 방법 또한 제공된다. 본 발명은 추가로 SP 효소를 포함하는 조성물, 및 조작된 SP 효소를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 약제학적 화합물의 제조에서 특별한 용도를 발견한다.

서열 목록, 표 또는 컴퓨터 프로그램에 대한 언급

서열 목록의 공식 사본은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식의 텍스트 파일로 본 명세서와 동시에 제출되고, 파일명은 "CX2-192USP1_ST25.txt"이고, 그 작성일은 2019년 7월 1일이며, 파일 크기는 278 킬로바이트이다. EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록은 명세서의 일부이며, 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

본 발명의 배경

인간 면역결핍 바이러스(HIV: human immunodeficiency virus)로 지정된 레트로바이러스는 이환된 개체의 면역계의 점진적인 파괴 및 중추 및 말초 신경계의 퇴화를 수반하는 복합 질환인 후천성 면역결핍 증후군(AIDS: acquired immune deficiency syndrome)의 병인체이다. 레트로바이러스 복제의 일반적인 특징은 바이러스 복제에 필요한 HIV 서열의 DNA 카피를 생성하기 위해 바이러스에 의해 코딩되는 역전사 효소에 의한 바이러스 RNA 게놈의 역전사이다. MK-8591과 같은 일부 화합물은 역전사 효소 억제제로 알려져 있으며, AIDS 및 유사한 질환의 치료에 유용한 것으로 밝혀졌다. HIV 역전사 효소를 억제하는 것으로 알려진 일부 화합물이 있지만, 상기 효소를 억제시키고, 이로써, AIDS의 효과를 호전시키는 데 더욱 효과적인 추가의 화합물이 당업계에서 여전히 요구되고 있다.

MK-8591(Merck)과 같은 뉴클레오시드 유사체는 DNA 합성에 사용되는 천연 뉴클레오시드와의 유사성 때문에 HIV의 역전사 효소에 대한 효과적인 억제제이다. 역전사 효소에 의한 이러한 유사체의 결합은 역전사 효소의 점진적 특성을 억제함으로써 DNA 합성을 정지시킨다. 효소의 정지는 DNA 분자의 조기 종결을 초래하여 상기 분자를 효과적이지 못하도록 만든다. 그러나, 표준 화학 합성 기술에 의한 뉴클레오시드 유사체의 제조는 상기의 화학적 복잡성으로 인해 문제를 제기할 수 있다.

본 발명의 요약

본 발명은 서열 번호 2 및/또는 4와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열, 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 조작된 수크로스 포스포릴라제로서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제는 상기 폴리펩티드 서열에 기재된 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치는 서열 번호 2 및/또는 4를 기준으로 넘버링되는 것인, 조작된 수크로스 포스포릴라제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 조작된 수크로스 포스포릴라제의 폴리펩티드는 7, 10, 48, 136, 158, 205, 207, 211, 215, 301, 333, 378, 397, 및 400으로부터 선택되는, 상기 폴리펩티드 서열 중 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 상기 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치는 서열 번호 2를 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 포스포릴라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 조작된 수크로스 포스포릴라제의 폴리펩티드는 7M, 7V, 7Y, 10W, 48D, 136R, 158R, 205E, 205L, 207L, 211V, 215V, 301G, 333G, 378F, 397L, 397S, 397T, 및 400G로부터 선택되는, 상기 폴리펩티드 서열 중 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 상기 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치는 서열 번호 2를 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 포스포릴라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 조작된 수크로스 포스포릴라제의 폴리펩티드는 L7M, L7V, L7Y, Y10W, G48D, P136R, P158R, C205E, C205L, M207L, T211V, I215V, Q301G, A333G, Y378F, V397L, V397S, V397T, 및 D400G로부터 선택되는, 상기 폴리펩티드 서열 중 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 상기 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치는 서열 번호 2를 기준으로 넘버링된 것이다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 포스포릴라제는 서열 번호 2와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 포스포릴라제는 서열 번호 2와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 포스포릴라제는 서열 번호 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 4와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성이 있는 폴리펩티드 서열을 갖는 조작된 수크로스 포스포릴라제로서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제의 폴리펩티드는 10/215/400, 158, 158/207/215, 158/207/215/301/400, 158/207/215/400, 158/207/400, 158/211/400, 158/215/301/400, 158/215/400, 158/301/400, 158/400, 205, 207, 207/215, 207/215/400, 207/400, 215/301, 215/400, 242/400, 301, 301/400, 및 400으로부터 선택되는, 상기 폴리펩티드 서열 중 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 상기 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치는 서열 번호 4를 기준으로 넘버링되는 것인, 조작된 수크로스 포스포릴라제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 4와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성이 있는 폴리펩티드 서열을 갖는 조작된 수크로스 포스포릴라제로서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제의 폴리펩티드는 10W/215V/400G, 158R, 158R/207L/215V, 158R/207L/215V/301G/400G, 158R/207L/215V/400G, 158R/207L/400G, 158R/211V/400G, 158R/215V/301G/400G, 158R/215V/400G, 158R/301G/400G, 158R/400G, 205L, 207L, 207L/215V, 207L/215V/400G, 207L/400G, 215V/301G, 215V/400G, 242G/400G, 301G, 301G/400G, 및 400G로부터 선택되는, 상기 폴리펩티드 서열 중 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 상기 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치는 서열 번호 4를 기준으로 넘버링되는 것인, 조작된 수크로스 포스포릴라제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 4와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성이 있는 폴리펩티드 서열을 갖는 조작된 수크로스 포스포릴라제로서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제의 폴리펩티드는 Y10W/I215V/D400G, P158R, P158R/M207L/I215V, P158R/M207L/I215V/Q301G/D400G, P158R/M207L/I215V/D400G, P158R/M207L/D400G, P158R/T211V/D400G, P158R/I215V/Q301G/D400G, P158R/I215V/D400G, P158R/Q301G/D400G, P158R/D400G, C205L, M207L, M207L/I215V, M207L/I215V/D400G, M207L/D400G, I215V/Q301G, I215V/D400G, E242G/D400G, Q301G, Q301G/D400G, 및 D400G로부터 선택되는, 상기 폴리펩티드 서열 중 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 상기 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치는 서열 번호 70을 기준으로 넘버링되는 것인, 조작된 수크로스 포스포릴라제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 포스포릴라제는 서열 번호 4와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 포스포릴라제는 서열 번호 4와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 포스포릴라제는 서열 번호 4와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.

일부 추가의 실시양태에서, 본 발명은 하기 3-1 및/또는 4-1에 기재된 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제 변이체의 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 포스포릴라제를 제공한다.

일부 추가의 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 2 및/또는 4와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 포스포릴라제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 포스포릴라제는 서열 번호 4에 기재된 변이체 조작된 수크로스 포스포릴라제를 포함한다.

본 발명은 또한 조작된 수크로스 포스포릴라제가 서열 번호 4-84의 짝수 번호 서열에 기재된 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제 변이체의 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인, 조작된 수크로스 포스포릴라제를 제공한다.

본 발명은 조작된 수크로스 포스포릴라제가 야생형 알로스카르도비아 옴니콜렌스(Alloscardovia omnicolens) 수크로스 포스포릴라제와 비교하여 적어도 하나의 개선된 특성을 포함하는 것인, 조작된 수크로스 포스포릴라제를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 개선된 특성은 기질에 대한 개선된 활성을 포함한다. 일부 추가의 실시양태에서, 기질은 수크로스 또는 관련된 이당류 또는 다른 화합물 및/또는 무기 포스페이트를 포함한다. 일부 추가의 실시양태에서, 개선된 특성은 화합물(1) 및/또는 화합물(3)의 개선된 제조를 포함한다. 또 다른 일부 추가의 실시양태에서, 조작된 수크로스 포스포릴라제는 정제된다. 본 발명은 또한 본원에 제공된 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 제공된 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 및/또는 3과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 및/또는 3과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제의 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환을 포함한다. 일부 추가의 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 및/또는 3과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 것 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 또 다른 일부 추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 추가의 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다. 또 다른 일부 추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3-83의 홀수 번호 서열에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 본원에 제공된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명은 본원에 제공된 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제가 생산되도록 적합한 조건하에서 본원에 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 조작된 수크로스 포스포릴라제를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 배양물 및/또는 숙주 세포로부터 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 본 방법은 상기 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 설명

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 명명법 및 하기 기술되는 세포 배양, 분자 유전학, 미생물학, 유기 화학, 분석 화학 및 핵산 화학의 실험 절차는 당업계에 널리 공지되고, 일반적으로 사용되는 것이다. 이러한 기술은 널리 공지되어 있고, 당업자에게 널리 알려진 많은 교재 및 참고문헌에 기술되어 있다. 표준 기술, 또는 그의 변형이 화학적 합성 및 화학적 분석에 사용된다. 상기 및 하기 언급되는 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 공개문헌은 본원에서 참고로 명백하게 포함된다.

본원에서 기술되는 것과 유사하거나, 등가인 임의의 적합한 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용되지만, 일부 방법 및 물질이 본원에서 기술된다. 본 발명은 기술된 특정 방법론, 프로토콜, 및 시약으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 하는데, 이는 상기의 것이 당업자에 의해 사용되는 상황에 따라 달라질 수 있기 때문이다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 본 발명을 전체로서 참조하여 더욱 완전하게 설명된다.

상기 일반적인 설명과 하기의 상세한 설명은 모두 단지 예시적이고, 설명하기 위한 것으로서, 본 발명을 제한하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 섹션 표제는 단지 그 구성을 조직적으로 제시하기 위한 것이며, 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 따라서, 본원에 개시된 모든 수치 범위는, 마치 더 좁은 수치 범위가 모두 본원에 명시적으로 기재된 것처럼, 이러한 더 넓은 수치 범위 내에 속하는 모든 더 좁은 수치 범위를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 본원에서 개시되는 모든 최대(또는 최소) 수치 제한은, 마치 더 낮은(또는 더 높은) 수치 제한이 본원에 명시적으로 기재된 것처럼, 모든 더 낮은(또는 더 높은) 수치 한정을 포함하는 것으로 의도된다.

약어 및 정의

유전자에 의해 코딩되는 아미노산에 대해 사용되는 약어는 통상적이고, 하기와 같다: 알라닌(Ala 또는 A), 아르기닌(Are 또는 R), 아스파라긴(Asn 또는 N), 아스파르테이트(Asp 또는 D), 시스테인(Cys 또는 C), 글루타메이트(Glu 또는 E), 글루타민(Gln 또는 Q), 히스티딘(His 또는 H), 이소류신(Ile 또는 I), 류신(Leu 또는 L), 리신(Lys 또는 K), 메티오닌(Met 또는 M), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 프롤린(Pro 또는 P), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 트립토판(Trp 또는 W), 티로신(Tyr 또는 Y) 및 발린(Val 또는 V).

3문자 약어가 사용되는 경우, 구체로 "L" 또는 "D"가 앞에 나오지 않거나, 또는 약어가 사용된 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 아미노산은 α-탄소(C_α)에 대해 L- 또는 D-배열일 수 있다. 예를 들어, "Ala"는 α-탄소에 대한 배열을 명시하지 않은 알라닌을 나타내고, "D-Ala" 및 "L-Ala"는 각각 D-알라닌 및 L-알라닌을 나타낸다. 1문자 약어가 사용되는 경우, 대문자는 α-탄소에 대한 L-배열의 아미노산을 나타내고, 소문자는 α-탄소에 대한 D-배열의 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, "A"는 L-알라닌을 나타내고, "a"는 D-알라닌을 나타낸다. 폴리펩티드 서열이 한 줄의 1문자 또는 3문자 약어(또는 상기의 혼합)로 제시될 때, 서열은 통상적인 관례에 따라 아미노(N)에서 카복시(C) 방향으로 제시된다.

유전자에 의해 코딩되는 뉴클레오시드에 대해 사용된 약어는 통상적이며, 하기와 같다: 아데노신(A); 구아노신(G); 시티딘(C); 티미딘(T); 및 우리딘(U). 구체적으로 서술되지 않는 한, 약칭된 뉴클레오시드는 리보뉴클레오시드 또는 2'-데옥시리보뉴클레오시드일 수 있다. 뉴클레오시드는 개별적인 기준으로 또는 종합적인 기준으로 리보뉴클레오시드 또는 2'-데옥시리보뉴클레오시드인 것으로 특정될 수 있다. 핵산 서열이 1문자 약어로 제시될 때, 서열은 통상적인 관례에 따라 5'에서 3' 방향으로 제시되고, 포스페이트는 표시되지 않는다.

본 발명과 관련하여, 본원의 설명에 사용되는 기술 및 과학 용어는, 달리 명시적으로 정의되지 않는 한, 당업계의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 따라서, 하기 용어는 하기 의미를 갖는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바, 단수 형태 하나("a," "an") 및 "그" ("the")는 문맥상 달리 명확히 나타내지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "폴리펩티드"에 대한 언급은 하나 초과의 폴리펩티드를 포함한다.

유사하게, "포함하다(comprise)," "포함하다(comprises)," "포함하는(comprising)," "포함하다(include)," "포함하다(includes)," "포함하는(including)"은 상호교환 가능하며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, 용어 "포함하는(comprising)" 및 그의 동족어는 포괄적인 의미로 사용된다(즉, 용어 "포함하는(including)" 및 그의 상응하는 동족어와 등가).

다양한 실시양태의 설명이 용어 "포함하는"을 사용하는 경우, 당업자는 일부 특정 경우에, 실시양태가 "본질적으로 ~으로 구성된" 또는 "~으로 구성된"이라는 표현을 사용하여 대안적으로 설명될 수 있다는 것을 이해할 것임이 추가로 이해되어야 한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "약"은 특정 값에 대한 허용가능한 오차를 의미한다. 일부 경우에, "약"은 주어진 값 범위의 0.05%, 0.5%, 1.0%, 또는 2.0% 이내를 의미한다. 일부 경우에, "약"은 주어진 값의 1, 2, 3, 또는 4 표준 편차 이내를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "EC" 번호는 생화학 및 분자 생물학의 국제 연합의 명명 위원회(NC-IUBMB: Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)의 효소 명명법을 지칭한다. IUBMB 생화학 분류는 효소가 촉매작용을 하는 화학적 반응에 기초한, 효소에 대한 수치적 분류 시스템이다.

본원에서 사용되는 바, "ATCC"는 그의 생체 시료 저장(biorepository) 수집물이 유전자 및 균주를 포함하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "NCBI"는 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biological Information) 및 그 안에 제공된 서열 데이터베이스를 지칭한다. 수크로스 포스포릴라제

본원에서 사용되는 바, "수크로스 포스포릴라제"("SP") 효소는 무기 포스페이트 및 수크로스 및 관련 화합물, 예컨대, 다른 이당류의 프럭토스 및 글루코스-1-포스페이트 및/또는 관련 화합물로의 전환을 촉매화하는 효소이다. SP 효소는 알로스카르도비아 옴니콜렌스의 야생형 SP 효소 또는 다른 수크로스 포스포릴라제 또는 인간, 박테리아, 진균, 식물, 또는 다른 종에서 발견되는 헥소실트랜스퍼라제를 포함하는, 자연 발생된 것일 수 있거나, 또는 SP 효소는 인간 조작에 의해 생성된 조작된 폴리펩티드일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "포스포펜토뮤타제"("PPM") 효소는 리보스 1-포스페이트의 리보스 5-포스페이트 및 관련 화합물, 예컨대, 데옥시리보스 포스페이트 및 리보스 포스페이트 및 데옥시리보스 포스페이트의 유사체로의 가역적 이성질체화를 촉매화하는 효소이다.

본원에서 사용되는 바, "퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제"("PNP": purine nucleoside phosphorylase) 효소는 퓨린 리보뉴클레오시드 및 관련 화합물(예컨대, 데옥시리보뉴클레오시드 및 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드의 유사체)의 유리 퓨린 염기 및 리보스-1-포스페이트(및 그의 유사체)로의 가역적 인산분해를 촉매화하는 효소이다.

"데옥시리보스-포스페이트 알돌라제" 및 "DERA(deoxyribose-phosphate aldolase)"는 탄소-탄소 결합을 가역적으로 절단하거나, 생성하는 리아제 패밀리의 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 데옥시리보스-포스페이트 알돌라제는 자연 발생(야생형) 데옥시리보스-포스페이트 알돌라제 뿐만 아니라, 인간 조작에 의해 생성된 비자연 발생 조작된 폴리펩티드를 포함한다. 야생형 데옥시리보스-포스페이트 알돌라제는 2-데옥시-D-리보스 5-포스페이트의 D-글리세르알데히드 3-포스페이트 및 아세트알데히드로의 가역적 반응을 촉매화한다.

"단백질," "폴리펩티드" 및 "펩티드"는, 길이 또는 번역 후 변형(예컨대, 글리코실화 또는 인산화)과 상관없이, 아미드 결합에 의해 공유 결합된 적어도 2개의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이 정의에는 D- 및 L-아미노산, 및 D-아미노산과 L-아미노산의 혼합물뿐만 아니라, D- 및 L-아미노산을 포함하는 중합체, 및 D-아미노산과 L-아미노산의 혼합물이 포함된다.

"아미노산"은 그의 일반적으로 허용되는 3문자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명 심의회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권고된 1문자 기호에 의해 본원에서 언급된다. 유사하게, 뉴클레오티드는 그의 일반적으로 허용되는 1문자 코드에 의해 언급될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "친수성 아미노산 또는 잔기"는 문헌 [Eisenberg et al., (Eisenberg et al., J. Mol. Biol., 179:125-142 [1984])]의 정규화된 컨센서스 소수성 척도에 따라 0 미만의 소수성을 나타내는 측쇄를 갖는 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 유전자에 의해 코딩되는 친수성 아미노산으로는 L-Thr(T), L-Ser(S), L-His(H), L-Glu(E), L-Asn(N), L-Gln(Q), L-Asp(D), L-Lys(K) 및 L-Arg(R)을 포함된다.

본원에서 사용되는 바, 본원에서 사용되는 바, "산성 아미노산 또는 잔기"는 아미노산이 펩티드 또는 폴리펩티드에 포함될 때, 약 6 미만의 pK 값을 나타내는 측쇄를 갖는 친수성 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 산성 아미노산은 전형적으로 수소 이온의 손실로 인해 생리학적 pH에서 음으로 하전된 측쇄를 갖는다. 유전자에 의해 코딩되는 산성 아미노산에는 L-Glu(E) 및 L-Asp(D)가 포함된다.

본원에서 사용되는 바, "염기성 아미노산 또는 잔기"는 아미노산이 펩티드 또는 폴리펩티드에 포함될 때, 약 6 초과의 pKa 값을 나타내는 측쇄를 갖는 친수성 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 염기성 아미노산은 전형적으로 하이드로늄 이온과의 회합으로 인해 생리학적 pH에서 양으로 하전된 측쇄를 갖는다. 유전자에 의해 코딩되는 염기성 아미노산에는 L-Arg(R) 및 L-Lys(K)가 포함된다.

본원에서 사용되는 바, "극성 아미노산 또는 잔기"는 생리학적 pH에서 하전되어 있지 않지만, 2개의 원자에 의해 공유된 한 쌍의 전자가 원자 중 1개에 의해 더욱 가까이 유지된 적어도 하나의 결합을 갖는 측쇄를 갖는 친수성 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 유전자에 의해 코딩되는 극성 아미노산에는 L-Asn(N), L-Gln(Q), LSer(S) 및 L-Thr(T)이 포함된다.

본원에서 사용되는 바, "소수성 아미노산 또는 잔기"는 문헌 [Eisenberg et al., (Eisenberg et al., J. Mol. Biol., 179:125-142 [1984])]의 정규화된 컨센서스 소수성 척도에 따라 0 초과의 소수성을 나타내는 측쇄를 갖는 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 유전자에 의해 코딩되는 소수성 아미노산에는 L-Pro(P), L-Ile(I), L-Phe(F), L-Val(V), L-Leu(L), L-Trp(W), L-Met(M), L-Ala(A) 및 L-Tyr(Y)이 포함된다.

본원에서 사용되는 바, "방향족 아미노산 또는 잔기"는 적어도 하나의 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 측쇄를 갖는 친수성 또는 소수성 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 유전자에 의해 코딩되는 방향족 아미노산은 L-Phe(F), L-Tyr(Y) 및 L-Trp(W)를 포함한다. 그의 헤테로방향족 질소 원자 L-His(H)의 pKa로 인해, 이는 때때로 염기성 잔기로서 분류되거나, 그의 측쇄가 헤테로방향족 고리를 포함하기 때문에 방향족 잔기로서 분류되지만, 본원에서는 히스티딘을 친수성 잔기 또는 "구속형 잔기"로서 분류한다(하기 참조).

본원에서 사용되는 바, "구속형 아미노산 또는 잔기"는 구속형 기하형태를 갖는 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 본원에서, 구속형 잔기는 L-pro(P) 및 L-His(H)을 포함한다. 히스티딘은 구속형 기하형태를 갖는데, 이는 그가 비교적 작은 이미다졸 고리를 갖기 때문이다. 프롤린은 구속형 기하형태를 가지는데, 이는 그 또한 5원 고리를 갖기 때문이다.

본원에서 사용되는 바, "비극성 아미노산 또는 잔기"는 생리학적 pH에서 하전되어 있지 않고, 2개 원자에 의해 공유된 한 쌍의 전자가 일반적으로 2개 원자 각각에 의해 동일하게 유지된 결합을 갖는 측쇄를 갖는(즉, 측쇄는 극성이 아님) 소수성 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 유전자에 의해 코딩되는 비극성 아미노산에는 L-Gly(G), L-Leu(L), L-Val(V), L-Ile(I), L-Met(M) 및 L-Ala(A)가 포함된다.

본원에서 사용되는 바, "지방족 아미노산 또는 잔기"는 지방족 탄화수소 측쇄를 갖는 소수성 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 유전자에 의해 코딩되는 지방족 아미노산에는 L-Ala(A), L-Val(V), L-Leu(L) 및 LIle(I)이 포함된다. 시스테인(또는 "L-Cys" 또는 "[C]")은 그가 다른 L-Cys(C) 아미노산 또는 다른 술파닐 함유 또는 술프히드릴 함유 아미노산과 디술피드 브릿지를 형성할 수 있다는 점에서 특이하다는 사실에 유의해야 한다. "시스테인 유사 잔기"는 시스테인, 및 디술피드 브릿지의 형성에 이용할 수 있는 술프히드릴 모이어티를 함유하는 다른 아미노산을 포함한다. L-Cys(C)(및 -SH 함유 측쇄를 갖는 다른 아미노산)이 환원된 유리 -SH 또는 산화된 디술피드 브릿지 형태의 펩티드에 존재하는 능력은, L-Cys(C)가 펩티드에 대한 순 소수성 또는 친수성 특성에 기여하는지의 여부에 영향을 미친다. L-Cys(C)이 (Eisenberg)의 정규화된 컨센서스 척도(문헌 [(Eisenberg et al., 1984, 상기 문헌 동일)])에 따라 0.29의 소수도를 나타내긴 하지만, 본 개시내용의 목적을 위해 L-Cys(C)은 그의 자체의 고유한 기로 분류됨을 이해하여야 한다.

본원에서 사용되는 바, "소형 아미노산 또는 잔기"는 총 3개 이하의 탄소 및/또는 헤테로원자(α-탄소 및 수소 제외)로 이루어지는 측쇄를 갖는 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 소형 아미노산 또는 잔기는 상기 정의에 따라 지방족, 비극성, 극성 또는 산성 소형 아미노산 또는 잔기로 추가로 분류될 수 있다. 유전자에 의해 코딩되는 소형 아미노산은 L-Ala(A), L-Val(V), L-Cys(C), L-Asn(N), L-Ser(S), L-Thr(T) 및 L-Asp(D)를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "하이드록실 함유 아미노산 또는 잔기"는 하이드록실(-OH) 모이어티를 함유하는 아미노산을 지칭한다. 유전자에 의해 코딩되는 하이드록실 함유 아미노산에는 L-Ser(S), L-Thr(T) 및 LTyr(Y)이 포함된다.

본원에서 사용되는 바, "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 서로 공유 결합된 2개 이상의 뉴클레오티드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 전체으로 리보뉴클레오티드(즉, RNA)로 이루어지거나, 전체으로 2' 데옥시리보뉴클레오티드(즉, DNA)로 이루어지거나, 또는 리보- 및 2' 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물로 이루어질 수 있다. 뉴클레오시드는 전형적으로 표준 포스포디에스테르 결합을 통해 서로 연결될 것이지만, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 비표준 결합을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 또는 단일 가닥 영역 및 이중 가닥 영역 둘 모두를 포함할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 자연 발생 코딩 핵염기(즉, 아데닌, 구아닌, 우라실, 티민 및 시토신)로 이루어질 것이지만, 이는 하나 이상의 변형된 핵염기 및/또는 합성 핵염기, 예컨대, 이노신, 크잔틴, 히포크잔틴 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 변형된 핵염기 또는 합성 핵염기는 아미노산 서열을 코딩하는 핵염기이다.

본원에서 사용되는 바, "뉴클레오시드"는 핵염기(즉, 질소 염기) 및 5-탄소 당(예컨대, 리보스 또는 데옥시리보스)을 포함하는 글리코실아민을 지칭한다. 뉴클레오시드의 비제한적인 예는 시티딘, 우리딘, 아데노신, 구아노신, 티미딘 및 이노신을 포함한다. 이와 대조적으로, 용어 "뉴클레오티드"는 핵염기, 5-탄소 당 및 하나 이상의 포스페이트 기를 포함하는 글리코실아민을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드는 뉴클레오티드를 생성하기 위해 키나제에 의해 인산화될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "뉴클레오시드 디포스페이트"는 핵염기(즉, 질소 염기), 5-탄소 당(예컨대, 리보스 또는 데옥시리보스), 및 디포스페이트(즉, 피로포스페이트) 모이어티를 포함하는 글리코실아민을 지칭한다. 본원의 일부 실시양태에서, "뉴클레오시드 디포스페이트"는 "NDP"로 약칭된다. 뉴클레오시드 디포스페이트의 비제한적인 예는 시티딘 디포스페이트(CDP), 우리딘 디포스페이트(UDP), 아데노신 디포스페이트(ADP), 구아노신 디포스페이트(GDP), 티미딘 디포스페이트(TDP) 및 이노신 디포스페이트(IDP)를 포함한다. 용어 "뉴클레오시드" 및 "뉴클레오티드"는 일부 문맥에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "코딩 서열"은 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(예컨대, 유전자) 부분을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "생체촉매반응," "생체촉매," "생체변환," 및 "생합성"은 유기 화합물에 대한 화학 반응을 수행하는 효소의 사용을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "야생형" 및 "자연 발생"은 자연계에서 발견되는 형태를 지칭한다. 예를 들어, 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연계의 공급원으로부터 단리될 수 있으며, 인간 조작에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체 내에 존재하는 서열이다.

본원에서 사용되는 바, 세포, 핵산, 또는 폴리펩티드와 함께 사용될 때 "재조합," "조작된" 및 "비자연 발생"은 자연계에 존재하지 않을 방식으로 변형된 물질, 또는 상기 물질의 자연 또는 천연 형태에 상응하는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포, 핵산 또는 폴리펩티드는 자연 발생 세포, 핵산 또는 폴리펩티드와 동일하지만, 합성 물질로부터 및/또는 재조합 기술을 사용한 조작에 의해 제조되거나 유래된다. 비제한적인 예는 특히 세포의 천연(비재조합)) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하는 재조합 세포 또는 상이한 수준으로 발현되는 천연 유전자를 발현하는 재조합 세포를 포함한다.

용어 "서열 동일성 비율(%)"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 비교를 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 비교 윈도우에서 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서, 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 개수를 산출하고, 매칭된 위치의 개수를 비교 윈도우 내의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 대안적으로, 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에 존재하거나, 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 갭과 정렬되는 위치의 개수를 결정하여 매칭된 위치의 개수를 산출하는 단계, 매칭된 위치의 개수를 비교 윈도우 내의 위치의 총 개수로 나누고 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 당업자는 두 서열을 정렬하는 데 이용가능한 많은 확립된 알고리즘이 있다는 것을 이해한다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 당업계에 공지된 바와 같이, (Smith) 및 (Waterman)의 국소 상동성 알고리즘(문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]]), (Needleman) 및 (Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘(문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]]), (Pearson) 및 (Lipman)의 유사성 검색 방법(문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]]), 상기 알고리즘의 컴퓨터에 의한 실행(예컨대, GCG GCG Wisconsin Software Package 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 육안 검사를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 서열 동일성 비율(%)및 서열 유사성 비율(%)을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 예는 각각 문헌 [Altschul et al. (See Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990]]; 및 [Altschul et al., Nucl. Acids Res., 3389-3402 [1977]]에 기술된, BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터 웹사이트를 통해 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드와 정렬될 때 일부 양의 값의 역치 스코어 T와 매칭되거나, 또는 이를 충족하는, 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 스코어링 서열 쌍(HSP: high scoring sequence pair)을 먼저 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 워드 스코어 역치로도 불린다(문헌 [Altschul et al., 상기 문헌 동일] 참조). 상기 초기 이웃 워드 히트는 이를 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하는 씨드로서 작용한다. 이후, 워드 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있을 때까지 각각의 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라미터 M(매칭 잔기 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 >0) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 누적 스코어를 계산하기 위해 스코어링 매트릭스가 사용된다. 각각의 방향에서 워드 히트의 연장은 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성 값으로부터 양 X만큼 떨어질 때; 누적 스코어가 하나 이상의 음의 스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하가 될 때; 또는 하나의 서열의 말단에 도달할 때 중지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 워드 길이(W) 11, 기대값(E) 10, M=5, N=-4, 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 길이(W) 3, 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한다(문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989]] 참조). 서열 정렬 및 서열 동일성(%)의 예시적인 결정은 제공된 디폴트 파라미터를 사용하여, GCG 위스콘신 소프트웨어 패키지(Accelrys, 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 내의 BESTFIT 또는 GAP 프로그램을 사용할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "기준 서열"은 서열 및/또는 활성 비교를 위한 기준으로서 사용되는 정의된 서열을 지칭한다. 기준 서열은 더 큰 서열의 서브세트, 예를 들어, 전장 유전자 또는 폴리펩티드 서열의 세그먼트일 수 있다. 일반적으로, 기준 서열은 어도 20개 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 길이, 적어도 25개 잔기 길이, 적어도 50개 잔기 길이, 적어도 100개 잔기 길이 또는 전장의 핵산 또는 폴리펩티드이다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 각각 (1) 두 서열 사이에 유사한 서열(즉, 완전한 서열의 일부)을 포함할 수 있고, 및 (2) 두 서열 사이에 상이한 서열을 추가로 포함할 수 있으므로, 2개(또는 그 초과)의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 서열 비교는 전형적으로 "비교 윈도우"에서 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열을 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, "기준 서열"은 1차 아미노산 서열에 기초할 수 있으며, 여기서, 기준 서열은 1차 서열에서 하나 이상의 변화를 가질 수 있는 서열이다.

본원에서 사용되는 바, "비교 윈도우"는 적어도 약 20개의 인접한 뉴클레오티드 위치 또는 아미노산 잔기의 개념적 세그먼트를 지칭하며, 여기서, 서열은 적어도 20개의 인접한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 기준 서열과 비교될 수 있고, 여기서, 비교 윈도우 내의 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 기준 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 윈도우는 20개 초과의 인접한 잔기일 수 있고, 임의적으로, 30, 40, 50, 100개 또는 그 초과의 윈도우를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 넘버링의 측면에서 사용될 때, "~에 상응하는," "에 대한" 및 "대비"는 주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 비교될 때 특정 기준 서열의 잔기의 넘버링을 지칭한다. 즉, 주어진 중합체의 잔기 번호 또는 잔기 위치는 주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내의 잔기의 실제 수치적 위치에 의해서가 아니라 기준 서열에 대해 지정된다. 예를 들어, 조작된 수크로스 포스포릴라제의 아미노산 서열과 같은 주어진 아미노산 서열은 두 서열 사이의 잔기 매치를 최적화하기 위해 갭을 도입함으로써 기준 서열에 정렬될 수 있다. 이 경우, 비록 갭이 존재하지만, 주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 잔기의 넘버링은 그것이 정렬된 기준 서열에 대해 이루어진다.

본원에서 사용되는 바, "실질적인 동일성"은 적어도 20개 잔기 위치의 비교 윈도우에서, 흔히 적어도 30-50개 잔기의 윈도우에서 기준 서열과 비교하여 적어도 80%의 서열 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 89 내지 95%의 서열 동일성, 또는 더욱 일반적으로, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 지칭하며, 여기서, 서열 동일성의 백분율은 비교 윈도우에서 기준 서열을 기준 서열의 총 20% 이하의 결실 또는 부가를 포함하는 서열과 비교함으로써 계산된다. 폴리펩티드에 적용된 일부 구체적인 실시양태에서, 용어 "실질적인 동일성"은 2개의 폴리펩티드 서열이 예컨대, 디폴트 갭 가중치를 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때, 적어도 80%의 서열 동일성, 바람직하게, 적어도 89%의 서열 동일성, 적어도 95%의 서열 동일성 또는 그 초과의 서열 동일성(예컨대, 99%의 서열 동일성)을 공유하는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 비교되는 서열에서 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 달라진다.

본원에서 사용되는 바, "아미노산 차이" 및 "잔기 차이"는 기준 서열 내의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기와 비교하여 폴리펩티드 서열의 위치에서의 아미노산 잔기의 차이를 지칭한다. 일부 경우에, 기준 서열에는 히스티딘 태그가 있지만, 넘버링은 히스티딘 태그가 없는 등가의 기준 서열에서와 같이 유지된다. 아미노산 차이의 위치는 일반적으로 본원에서 "Xn"으로 지칭되며, 여기서, n은 잔기 차이의 기초가 되는 기준 서열 내의 상응하는 위치를 지칭한다. 예를 들어, "서열 번호 4와 비교하여 위치 X93에서의 잔기 차이"는 서열 번호 4의 위치 93에 상응하는 폴리펩티드 위치에서의 아미노산 잔기의 차이를 지칭한다. 따라서, 서열 번호 4의 기준 폴리펩티드가 위치 93에 세린을 갖는다면, "서열 번호 4와 비교하여 위치 X93에서의 잔기 차이"는 서열 번호 4의 위치 93에 상응하는 폴리펩티드의 위치에 세린 이외의 임의의 다른 잔기의 아미노산 치환을 지칭한다. 본원에서 대부분의 경우, 위치에서의 특정 아미노산 잔기 차이는 "XnY"로 표시되며, 여기서, "Xn"은 전술한 바와 같이 상응하는 위치를 특정하고, "Y"는 조작된 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산(즉, 기준 폴리펩티드와 상이한 잔기)의 단일 문자 식별자이다. 일부 경우에(예컨대, 실시예에 제시된 표에서), 본 발명은 또한 종래의 표기법 "AnB"에 의해 표시된 특정 아미노산 차이를 제공하며, 여기서, A는 기준 서열에서의 잔기의 단일 문자 식별자이고, "n"은 기준 서열에서의 잔기 위치의 번호이며, B는 조작된 폴리펩티드의 서열에서의 잔기 치환의 단일 문자 식별자이다. 일부 경우에, 본 발명의 폴리펩티드는 기준 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기 차이를 포함할 수 있고, 이는 기준 서열과 비교하여 잔기 차이가 존재하는 특정 위치의 목록에 의해 표시된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 아미노산이 폴리펩티드의 특정 잔기 위치에서 사용될 수 있는 경우, 사용될 수 있는 다양한 아미노산 잔기는 "/"에 의해 분리된다(예컨대, X307H/X307P 또는 X307H/P). 슬래시는 또한 주어진 변이체 내의 다수의 치환을 나타내기 위해 사용될 수 있다(즉, 조합 변이체에서와 같이, 주어진 서열에 하나 이상의 치환이 존재한다). 일부 실시양태에서, 본 발명은 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환을 포함하는 하나 이상의 아미노산 차이를 포함하는 조작된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 추가의 실시양태에서, 본 발명은 보존적 및 비보존적 아미노산 치환, 둘 모두를 포함하는 조작된 폴리펩티드 서열을 제공한다.

본원에서 사용되는 바, "보존적 아미노산 치환"은 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 상이한 잔기로 치환하는 것을 지칭하며, 따라서, 전형적으로 폴리펩티드 내의 아미노산을 동일하거나, 유사한 정의된 아미노산 부류 내의 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 비제한적인 예로서, 일부 실시양태에서, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신)으로 치환되고/거나; 하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산은 하이드록실 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예컨대, 세린 및 트레오닌)으로 치환되고/거나; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산은 방향족 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예컨대, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 및 히스티딘)으로 치환되고/거나; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 염기성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예컨대, 리신 및 아르기닌)으로 치환되고/거나; 산성 측쇄를 갖는 아미노산은 산성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예컨대, 아스파르트산 또는 글루탐산)으로 치환되고/거나; 소수성 또는 친수성 아미노산은 각각 또 다른 소수성 또는 친수성 아미노산으로 대체된다.

본원에서 사용되는 바, "비보존적 치환"은 폴리펩티드 내의 아미노산을 유의적으로 상이한 측쇄 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 비보존적 치환은 정의된 기 내에서보다는 정의된 기 사이에서 아미노산을 사용할 수 있고, (a) 치환 영역 내의 펩티드 백본의 구조(예컨대, 글리신을 프롤린으로), (b) 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피에 영향을 미친다. 비제한적인 예로서, 예시적인 비보존적 치환은 염기성 또는 지방족 아미노산으로 치환된 산성 아미노산; 작은 아미노산으로 치환된 방향족 아미노산; 및 소수성 아미노산으로 치환된 친수성 아미노산일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "결실"은 기준 폴리펩티드로부터 하나 이상의 아미노산의 제거에 의한 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. 결실은 조작된 수크로스 포스포릴라제 효소의 효소 활성을 유지하고/거나, 개선된 특성을 유지하면서, 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산, 또는 기준 효소를 구성하는 아미노산의 총 개수의 최대 10%, 또는 아미노산의 총 개수의 최대 20%의 제거를 포함할 수 있다. 결실은 폴리펩티드의 내부 부위 및/또는 말단 부위에 관한 것일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 결실은 연속적인 세그먼트를 포함할 수 있거나, 불연속적일 수 있다. 결실은 전형적으로 아미노산 서열에 "-"로 표시된다.

본원에서 사용되는 바, "삽입"은 기준 폴리펩티드로부터 하나 이상의 아미노산의 부가에 의한 폴리펩티드에 대한 변형을 지칭한다. 삽입은 폴리펩티드의 내부 부분, 또는 카르복시 또는 아미노 말단에 있을 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 삽입은 당업계에 공지된 바와 같은 융합 단백질을 포함한다. 삽입은 아미노산의 인접한 세그먼트일 수 있거나, 또는 자연 발생 폴리펩티드 내의 아미노산 중 하나 이상에 의해 분리될 수 있다.

용어 "아미노산 치환 세트" 또는 "치환 세트"는 기준 서열과 비교하여 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 치환 군을 지칭한다. 치환 세트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환 세트는 실시예에서 제공되는 표에 열거된 임의의 변이체 수크로스 포스포릴라제에 존재하는 아미노산 치환 세트를 지칭한다.

"기능적 단편" 및 "생물학적 활성 단편"은 아미노 말단 및/또는 카복시 말단 결실(들) 및/또는 내부 결실을 갖지만, 나머지 아미노산 서열은 비교되는 서열(예컨대, 본 발명의 조작된 전장 수크로스 포스포릴라제) 내의 상응하는 위치와 동일하고, 전장 폴리펩티드의 활성을 실질적으로 모두 유지하는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

본원에서 사용되는 바, "단리된 폴리펩티드"는 자연적으로 동반되는 다른 오염물질(예컨대, 단백질, 지질, 및 폴리뉴클레오티드)로부터 실질적으로 분리된 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 용어는 상기의 자연 발생 환경 또는 발현 시스템(예컨대, 숙주 세포내에서 또는 시험관내 합성을 통해)으로부터 제거되거나, 정제된 폴리펩티드를 포함한다. 재조합 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드는 세포 내에 존재하거나, 세포 배지에 존재하거나, 또는 예컨대, 용해물 또는 단리된 제제와 같은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 재조합 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "실질적으로 순수한 폴리펩티드" 또는 "정제된 단백질"은 폴리펩티드 종이 존재하는 우세한 종인 조성물(즉, 몰 또는 중량 기준으로, 조성물 내의 임의의 다른 개별적인 거대분자 종보다 더 풍부한 것)을 지칭하며, 일반적으로 대상 종이 존재하는 거대분자 종의 몰 또는 중량% 기준으로 적어도 약 50%를 포함할 때 실질적으로 정제된 조성물이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 수크로스 포스포릴라제를 포함하는 조성물은 50% 미만으로 순수한(예컨대, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50%) 수크로스 포스포릴라제를 포함한다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 수크로스 포스포릴라제 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 몰 또는 중량% 기준으로 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 및 약 98% 이상를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상 종은 본질적인 균질성까지 정제되며(즉, 오염 종은 종래의 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없다), 여기서, 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진다. 용매 종, 작은 분자(<500 달톤), 및 원소 이온 종은 거대분자 종으로 간주되지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 재조합 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드 조성물이다.

본원에서 사용되는 바, 본원에서 사용되는 바, "개선된 효소 특성"은 효소의 적어도 하나의 개선된 특성을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 기준 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드 및/또는 야생형 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드, 및/또는 또 다른 조작된 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드와 비교하여 임의의 효소 특성의 개선을 나타내는 조작된 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, "개선"의 수준은 야생형 뿐만 아니라, 조작된 수크로스 포스포릴라제를 포함하는, 다양한 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드 사이에서 측정되고, 비교될 수 있다. 개선된 특성은 단백질 발현 증가, 열활성 증가, 열안정성 증가, pH 활성 증가, 안정성 증가, 효소 활성 증가, 기질 특이성 또는 친화성 증가, 특이적 활성 증가, 기질 또는 최종 생성물 억제에 대한 내성 증가, 화학적 안정성 증가, 화학적 선택성 개선, 용매 안정성 개선, 산성 pH에 대한 내성 증가, 단백질 분해 활성에 대한 내성 증가(즉, 단백질 분해에 대한 민감성 감소), 응집 감소, 용해도 증가, 및 온도 프로파일 변경과 같은 특성을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가의 실시양태에서, 상기 용어는 수크로스 포스포릴라제 효소의 적어도 하나의 개선된 특성과 관련하여 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 기준 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드 및/또는 야생형 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드, 및/또는 또 다른 조작된 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드와 비교하여 임의의 효소 특성의 개선을 나타내는 조작된 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, "개선" 수준은 야생형 뿐만 아니라, 조작된 수크로스 포스포릴라제을 포함한 다양한 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드 사이에서 측정되고, 비교할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "효소 활성 증가" 및 "촉매 활성 증진"은 조작된 폴리펩티드의 개선된 특성을 지칭하며, 이는 기준 효소와 비교하여 특이적 활성(예컨대, 생성된 생성물/시간/중량 단백질)의 증가 또는 기질로부터 생성물로의 전환율(%)(예컨대, 효소의 특정 양을 사용하여 특정 시간 내에 기질의 출발 양에서 생성물로의 전환율(%))의 증가에 의해 표시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 본원에서 제공되는 조작된 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드의 개선된 특성을 지칭하며, 이는 수크로스 포스포릴라제 효소와 비교하여 특이적 활성(예컨대, 생성된 생성물/시간/중량 단백질)의 증가 또는 기질로부터 생성물로의 전환율(%)(예컨대, 수크로스 포스포릴라제의 특정 양을 사용하여 특정 시간 내에 기질의 출발 양에서 생성물로의 전환율(%))의 증가에 의해 표시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 본원에 제공된 개선된 수크로스 포스포릴라제 효소와 관련하여 사용된다. 본 발명의 조작된 수크로스 포스포릴라제의 효소 활성을 측정하는 예시적인 방법이 실시예에 제공되어 있다. Km, Vmax 또는 kcat의 고전적인 효소 특성을 포함하는 효소 활성과 관련된 임의의 특성은 영향을 받을 수 있고, 상기의 변화는 효소적 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 효소 활성의 개선은 상응하는 야생형 효소의 효소 활성의 약 1.1배로부터, 자연 발생 수크로스 포스포릴라제 또는 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드의 유래 기점이 된 또 다른 조작된 수크로스 포스포릴라제보다 2배, 5배, 10배, 20배, 25배, 50배, 75배, 100배, 150배, 200배 또는 그 초과의 효소 활성만큼 클 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "전환"은 기질(들)에서 상응하는 생성물(들)로의 효소에 의한 전환(또는 생체변환)을 지칭한다. "전환율(%)"은 특정 조건하에 일정 기간 내에 생성물로 전환되는 기질의 비율(%)을 지칭한다. 따라서, 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드의 "효소 활성" 또는 "활성"은 특정 시간 내에 기질의 생성물로의 "전환율(%)"로 표현될 수 있다.

"일반종(generalist) 특성"을 갖는 효소(또는 "일반종 효소")는 모체 서열과 비교하여 광범위한 기질에 대해 개선된 활성을 나타내는 효소를 지칭한다. 일반종 효소는 반드시 모든 가능한 기질에 대해 개선된 활성을 나타내는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 광범위한 입체적으로 및 전자적으로 다양한 기질에 대해서 모체 유전자와 비교하여 유사하거나, 개선된 활성을 나타낸다는 점에서 일반종 특성을 갖는 수크로스 포스포릴라제 변이체를 제공한다. 추가로, 본원에 제공된 일반종 효소는 대사산물/생성물의 제조를 증가시키기 위해 광범위한 다양한 분자에 대해 개선되도록 조작되었다.

용어 "엄격한 하이브리드화 조건"은 핵산 하이브리드가 안정한 조건을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 하이브리드의 안정성은 하이브리드의 융점(Tm)에 반영된다. 일반적으로, 하이브리드의 안정성은 이온 강도, 온도, G/C 함량, 및 카오트로픽제의 존재의 함수이다. 폴리뉴클레오티드의 Tm 값은 공지된 융점 예측 방법을 사용하여 계산될 수 있다(예컨대, 문헌 [Baldino et al., Meth. Enzymol., 168:761-777 [1989]]; [Bolton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390 [1962]]; [Bresslauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8893-8897 [1986]]; [Freier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9373-9377 [1986]]; [Kierzek et al., Biochem., 25:7840-7846 [1986]]; [Rychlik et al., Nucl. Acids Res., 18:6409-6412 [1990]](erratum, Nucl. Acids Res., 19:698 [1991]); [Sambrook et al., 상기 문헌 동일]; [Suggs et al., 1981, in Developmental Biology Using Purified Genes, Brown et al. [eds.], pp. 683-693, Academic Press, Cambridge, MA [1981]]; 및 [Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227-259 [1991]] 참조). 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에서 개시되는 폴리펩티드를 코딩하며, 중간 정도로 엄격한 또는 고도로 엄격한 조건과 같은 정의된 조건하에 본 발명의 조작된 수크로스 포스포릴라제 효소를 코딩하는 서열의 상보체에 하이브리드화한다.

본원에서 사용되는 바, "하이브리드화 엄격성"은 핵산의 하이브리드화에서 예컨대, 세척 조건과 같은 하이브리드화 조건에 관한 것이다. 일반적으로, 하이브리드화 반응은 더 낮은 엄격성의 조건하에서 수행된 후, 다양하지만, 더 고도로 엄격한 세척이 수행된다. 용어 "중간 정도의 엄격한 하이브리드화"는 표적-DNA가 표적 DNA와 약 60%의 동일성, 바람직하게, 약 75%의 동일성, 약 85%의 동일성, 표적-폴리뉴클레오티드와 약 90% 초과의 동일성을 갖는 상보적인 핵산에 결합하게 하는 조건을 지칭한다. 예시적인 중간 정도의 엄격한 조건은 42℃에서 50% 포름아미드, 5x 덴하르트 용액, 5x SSPE, 0.2% SDS에서의 하이브리드화 후, 42℃에서 0.2ХSSPE, 0.2% SDS에서의 세척과 등가인 조건이다. "고도로 엄격한 하이브리드화"는 일반적으로 정의된 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 용액 조건하에서 결정된 바와 같은 열 융점 Tm으로부터 약 10℃ 이하인 조건을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 고도로 엄격한 조건은 65℃에서 0.018 M NaCl에서 안정한 하이브리드를 형성하는 핵산 서열만의 하이브리드화를 허용하는 조건을 지칭한다(즉, 본원에서 고려되는 바와 같이, 하이브리드가 65℃에서 0.018 M NaCll에서 안정하지 않으면, 이는 고도로 엄격한 조건하에서 안정하지 않을 것이다). 고도로 엄격한 조건은 예를 들어, 42℃에서 50% 포름아미드, 5x 덴하르트 용액, 5x SSPE, 0.2% SDS와 등가인 조건에서의 하이브리드화 후, 이어서, 65℃에서 0.1ХSSPE, 및 0.1% SDS에서의 세척에 의해 제공될 수 있다. 또 다른 고도로 엄격한 조건은 65℃에서 0.1% (w/v) SDS를 함유하는 5x SSC에서의 하이브리드화와 등가인 조건에서의 하이브리드화 및 65℃에서 0.1% SDS를 함유하는 0.1x SSC에서의 세척이다. 다른 고도로 엄격한 하이브리드화 조건 뿐만 아니라, 중간 정도의 엄격한 조건은 상기 인용된 참고문헌에 기술되어 있다.

본원에서 사용되는 바, "코돈 최적화"는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈이 코딩된 단백질이 관심 유기체에서 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 변화하는 것을 지칭한다. 유전자 코드는 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈으로 불리는 몇 개의 코돈에 의해 표시된다는 점에서 축퇴성이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 사용 빈도는 무작위적이 아니며, 특정 코돈 트리플렛으로 편향된다는 것이 널리 알려져 있다. 이 코돈 사용 빈도 편향은 주어진 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현된 단백질 대 낮은 카피수 단백질, 및 유기체 게놈의 전체적인 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다. 일부 실시양태에서, 수크로스 포스포릴라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현을 위해 선택된 숙주 유기체에서 최적의 생산을 위해 코돈 최적화될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "바람직한," "최적" 및 "높은 코돈 사용 빈도 편향" 코돈은 단독으로 또는 조합하여 사용될 때, 동일한 아미노산을 코딩하는 다른 코돈보다 단백질 코딩 영역에서 더 높은 빈도로 사용되는 코돈을 상호교환가능하게 지칭한다. 바람직한 코돈은 단일 유전자, 공통 기능 또는 기원의 유전자 세트, 고도로 발현된 유전자에서의 코돈 사용 빈도, 전체 유기체의 전체적인 단백질 코딩 영역에서의 코돈 빈도, 관련 유기체의 전체적인 단백질 코딩 영역에서의 코돈 빈도, 또는 상기의 조합과 관련하여 결정될 수 있다. 유전자 발현 수준에 따라 그 빈도가 증가하는 코돈은 전형적으로 발현을 위한 최적 코돈이다. 특정 유기체에서 코돈 빈도(예컨대, 코돈 사용 빈도, 상대적인 동의 코돈 사용 빈도) 및 코돈 선호도를 결정하기 위한 다양한 방법이 알려져 있으며, 이는 예를 들어. 클러스터 분석 또는 대응 분석, 및 유전자에 사용된 코돈의 유효 수를 사용하는 다변량 분석을 포함한다(예컨대, 문헌 [GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; CodonW, Peden, University of Nottingham; McInerney, Bioinform., 14:372-73 [1998]]; [Stenico et al., Nucl. Acids Res., 222437-46 [1994]]; 및 [Wright, Gene 87:23-29 [1990]] 참조). 많은 상이한 유기체에 대해 코돈 사용 빈도 표가 이용가능하다(예컨대, 문헌 [Wada et al., Nucl. Acids Res., 20:2111-2118 [1992]]; [Nakamura et al., Nucl. Acids Res., 28:292 [2000]]; [Duret, et al., 상기 문헌 동일]; [Henaut and Danchin, in Escherichia coli and Salmonella, Neidhardt, et al. (eds.), ASM Press, Washington D.C., p. 2047-2066 [1996]] 참조). 코돈 사용 빈도를 얻기 위한 데이터 소스는 단백질을 코딩할 수 있는 임의의 이용가능한 뉴클레오티드 서열에 의존할 수 있다. 상기 데이터 세트는 발현된 단백질(예컨대, 완전한 단백질 코딩 서열-CDS), 발현된 서열 태그(ESTS), 또는 게놈 서열의 예측된 코딩 영역을 코딩하는 것으로 실제 알려진 핵산 서열을 포함한다(예컨대, 문헌 [Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Chapter 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [2001]]; [Uberbacher, Meth. Enzymol., 266:259-281 [1996]]; 및 [Tiwari et al., Comput. Appl. Biosci., 13:263-270 [1997]] 참조).

본원에서 사용되는 바, "제어 서열"은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현에 필요하거나, 유리한 모든 성분을 포함한다. 각각의 제어 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 대해 천연 서열이거나, 외래 서열일 수 있다. 이러한 제어 서열은 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터 서열, 신호 펩티드 서열, 개시 서열 및 전사 종결인자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 최소한, 제어 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함한다. 제어 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 코딩 영역과 제어 서열의 라이게이션을 용이하게 하는 특정 제한 부위를 도입하기 위한 목적으로 링커와 함께 제공될 수 있다.

"작동가능하게 연결된"은 제어 서열이 관심 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현을 유도하거나, 조절하도록 제어 서열이 관심 폴리뉴클레오티드와 관련된 위치에 적절하게 배치되는(즉, 기능적 관계로) 배열로서 본원에서 정의된다.

"프로모터 서열"은 예컨대, 코딩 서열과 같은 관심 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 핵산 서열을 지칭한다. 프로모터 서열은 관심 폴리뉴클레오티드의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이체 프로모터, 절두된 프로모터, 및 하이브리드 프로모터를 포함하는, 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 이는 숙주 세포에 대해 동종 또는 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 수득될 수 있다.

어구 "적합한 반응 조건"은 본 발명의 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드가 기질을 원하는 생성물 화합물로 전환할 수 있는 효소 전환 반응 용액의 조건(예컨대, 효소 로딩, 기질 로딩, 온도, pH, 완충제, 공용매 등의 범위)을 지칭한다. 일부 예시적인 "적합한 반응 조건"이 본원에서 제공된다.

본원에서 사용되는 바, "화합물 로딩" 또는 "효소 로딩"에서와 같은 "로딩"은 반응 시작시 반응 혼합물 내의 성분의 농도 또는 양을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, 효소 전환 반응 프로세스와 관련하여 "기질"은 본원에 제공된 조작된 효소(예컨대, 조작된 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드)가 그에 대해 작용하는 화합물 또는 분자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, 반응으로부터 생성물(예컨대, 데옥시리보스 포스페이트 유사체)의 수율을 "증가시키는 것"은 동일한 기질 및 다른 치환기를 갖지만, 관심 성분이 존재하지 않는 동일한 조건하에서 수행된 반응과 비교하여, 반응 동안 존재하는 특정 성분(예컨대, 수크로스 포스포릴라제 효소)이 더 많은 생성물이 생산되게 할 때 발생한다.

특정 효소의 양이 반응을 촉매화하는 데 참여하는 다른 효소와 비교하여 약 2% (wt/wt), 약 1% (wt/wt), 또는 약 0.1% (wt/wt) 미만이면, 반응은 상기 특정 효소가 "실질적으로 없는 것"으로 언급된다.

본원에서 사용되는 바, 액체(예컨대, 배양 브로쓰)를 "분획화하는 것"은 분리 프로세스(예컨대, 염 침전, 칼럼 크로마토그래피, 크기 배제, 및 여과) 또는 상기 프로세스의 조합을 적용하여 원하는 단백질이 초기 액체 생성물보다 용액 중에서 더 큰 비율(%)로 총 단백질을 구성하는 용액을 제공하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "출발 조성물"은 적어도 하나의 기질을 포함하는 임의의 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 출발 조성물은 임의의 적합한 기질을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 효소 전환 프로세스와 관련하여 "생성물"은 기질에 대한 효소 폴리펩티드의 작용으로부터 생성되는 화합물 또는 분자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, 본원에서 사용되는 "평형화"는 화학 반응 또는 효소에 의한 반응의 정방향 속도 상수 및 역방향 속도 상수에 의해 측정되는 바와 같은, 입체이성질체의 상호전환을 포함하는, 화학 반응 또는 효소에 의한 반응(예컨대, 2개 종 A 및 B의 상호전환)에서 화학물질 종의 정상 상태 농도를 초래하는 프로세스를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "알킬"은 직쇄 또는 분지쇄의 1 내지 18개의 탄소 원자(1개 및 18개 포함), 더욱 바람직하게는 1 내지 8개의 탄소 원자(1개 및 8개 포함), 가장 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자(1개 및 6개 포함)로 이루어진 포화 탄화수소 기를 지칭한다. 특정 개수의 탄소 원자를 갖는 알킬은 괄호 안에 표시된다(예컨대, (C1-C4)알킬은 1 내지 4개의 탄소 원자로 이루어진 알킬을 지칭한다).

본원에서 사용되는 바, "알케닐"은 적어도 하나의 이중 결합을 함유하지만, 임의적으로 1개 초과의 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지쇄의 2 내지 12개의 탄소 원자(2개 및 12개 포함)로 이루어진 기를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "알키닐"은 적어도 하나의 삼중 결합을 함유하지만, 임의적으로 1개 초과의 삼중 결합을 함유하고, 추가로 임의적으로 하나 이상의 이중 결합 모이어티를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄의 2 내지 12개의 탄소 원자(2개 및 12개 포함)의 기를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "헤테로알킬," "헤테로알케닐" 및 "헤테로알키닐"은 하나 이상의 탄소 원자가 동일하거나, 상이한 헤테로원자 또는 헤테로원자 기로 각각 독립적으로 대체된, 본원에서 정의된 바와 같은 알킬, 알케닐 및 알키닐을 지칭한다. 탄소 원자를 대체할 수 있는 헤테로원자 및/또는 헤테로원자 기는 -O-, -S-, -S-O-, -NRα-, -PH-, -S(O)-, -S(O)2, -S(O) NRα-, -S(O)2NRα- 등(그의 조합을 포함)을 하지만 이로 제한되지 않고, 여기서, 각 Rα는 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택된다.

본원에서 사용되는 바, "알콕시"는 기 -ORβ을 지칭하며, 여기서, Rβ는 본원에서 또한 정의된 바와 같은 임의적으로 치환된 알킬 기를 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 알킬 기이다.

본원에서 사용되는 바, "아릴"은 단일 고리(예컨대, 페닐) 또는 다중 축합 고리(예컨대, 나프틸 또는 안트릴)를 갖는 6 내지 12개의 탄소 원자(6개 및 12개 포함)의 불포화 방향족 카보사이클릭 기를 지칭한다. 예시적인 아릴은 페닐, 피리딜, 나프틸 등을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "아미노"는 기 -NH2를 지칭한다. 치환된 아미노는 기 -NHRδ, NRδRδ 및 NRδRδRδ를 지칭하며, 여기서, 각각의 Rδ는 치환 또는 비치환된 알킬, 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아실, 알콕시카보닐, 술파닐, 술피닐, 술포닐 등으로부터 독립적으로 선택된다. 전형적인 아미노 기는 디메틸아미노, 디에틸아미노, 트리메틸암모늄, 트리에틸암모늄, 메틸술포닐아미노, 푸라닐-옥시-술파미노 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "옥소"는 =O를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "옥시"는 에테르 및 에스테르를 포함하는 상이한 옥시 기를 형성하기 위해 다양한 치환기를 가질 수 있는 2가 기 -O-를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "카복시"는 -COOH를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "카보닐"은 산, 산 할라이드, 알데하이드, 아미드, 에스테르 및 케톤을 포함하는 상이한 카보닐 기를 형성하기 위해 다양한 치환기를 가질 수 있는 -C(O)-를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "알킬옥시카보닐"은 -C(O)ORε를 지칭하고, 여기서, Rε는 임의적으로 치환될 수 있는 본원에서 정의된 바와 같은 알킬 기이다.

본원에서 사용되는 바, "아미노카보닐"은 -C(0)NH2를 지칭한다. 치환된 아미노카보닐은 -C(O)NRδRδ를 지칭하며, 여기서, 아미노 기 NRδRδ는 본원에서 정의된 바와 같다.

본원에서 사용되는 바, "할로겐" 및 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "하이드록시"는 -OH를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "시아노"는 -CN을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "헤테로아릴"은 1 내지 10개의 탄소 원자(1개 및 10개 포함) 및 고리 내의 산소, 질소 및 황으로부터 선택되는 1 내지 4개의 헤테로원자(1개 및 4개 포함)로 이루어진 방향족 헤테로사이클릭 기를 지칭한다. 상기 헤테로아릴 기는 단일 고리(예컨대, 피리딜 또는 푸릴) 또는 다중 축합 고리(예컨대, 인돌리지닐 또는 벤조티에닐)를 가질 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "헤테로아릴알킬"은 바람직하게는 알킬 모이어티에 1 내지 6개의 탄소 원자(1개 및 6개 포함) 및 헤테로아릴 모이어티에 5 내지 12개의 고리 원자(5개 및 12개 포함)를 포함하는, 헤테로아릴로 치환된 알킬(즉, 헤테로아릴-알킬 기)을 지칭한다. 상기 헤테로아릴알킬 기는 피리딜메틸 등으로 예시된다.

본원에서 사용되는 바, "헤테로아릴알케닐"은 바람직하게는 알케닐 모이어티에 2 내지 6개의 탄소 원자(2개 및 6개 포함) 및 헤테로아릴 모이어티에 5 내지 12개의 고리 원자(5개 및 12개 포함)를 포함하는, 헤테로아릴로 치환된 알케닐(즉, 헤테로아릴-알케닐 기)을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "헤테로아릴알키닐"은 바람직하게는 알키닐 모이어티에 2 내지 6개의 탄소 원자(2개 및 6개 포함) 및 헤테로아릴 모이어티에 5 내지 12개의 고리 원자(5개 및 12개 포함)를 포함하는, 헤테로아릴로 치환된 알키닐(즉, 헤테로아릴-알키닐 기)을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "헤테로사이클," "헤테로사이클릭" 및 상호 교환가능하게 "헤테로사이클로알킬"은 단일 고리 또는 다중 축합 고리, 2 내지 10개의 탄소 고리 원자(2개 및 10개 포함) 및 고리 내의 질소, 황 또는 산소로부터 선택되는 1 내지 4개의 헤테로 고리 원자(1개 및 4개 포함)를 포함하는 포화 또는 불포화 기를 지칭한다. 상기 헤테로사이클릭 기는 단일 고리(예컨대, 피페리디닐 또는 테트라하이드로푸릴) 또는 다중 축합 고리(예컨대, 인돌리닐, 디하이드로벤조푸란 또는 퀴누클리디닐)를 가질 수 있다. 헤테로사이클의 예로는 푸란, 티오펜, 티아졸, 옥사졸, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 이소인돌, 인돌, 인다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프틸피리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프테리딘, 카바졸, 카볼린, 페난트리딘, 아크리딘, 페난트롤린, 이소티아졸, 페나진, 이속사졸, 페녹사진, 페노티아진, 이미다졸리딘, 이미다졸린, 피페리딘, 피페라진, 피롤리딘, 인돌린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "원(membered) 고리"는 임의의 사이클릭 구조를 포함하는 것을 의미한다. 용어 "원" 앞의 숫자는 고리를 구성하는 골격 원자 개수를 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 사이클로헥실, 피리딘, 피란 및 티오피란은 6원 고리이고, 사이클로펜틸, 피롤, 푸란 및 티오펜은 5원 고리이다.

달리 명시되지 않는 한, 상기 기에서 수소가 점유하는 위치는 제한하는 것은 아니지만, 하이드록시, 옥소, 니트로, 메톡시, 에톡시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메톡시, 할로알콕시, 플루오로, 클로로, 브로모, 아이오도, 할로, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 알킬, 알케닐, 알키닐, 치환된 알킬, 트리플루오로메틸, 할로알킬, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 티오, 알킬티오, 아실, 카복시, 알콕시카보닐, 카복스아미도, 치환된 카복스아미도, 알킬술포닐, 알킬술피닐, 알킬술포닐아미노, 술폰아미도, 치환된 술폰아미도, 시아노, 아미노, 치환된 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아미노알킬, 아실아미노, 아미디노, 아미드옥시모, 하이드록사모일, 페닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴옥시, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 피리딜, 이미다졸릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알킬옥시, 피롤리디닐, 피페리디닐, 모르폴리노, 헤테로사이클, (헤테로사이클)옥시, 및 (헤테로사이클)알킬로 예시되는 치환기로 추가로 치환될 수 있고; 바람직한 헤테로원자는 산소, 질소 및 황이다. 개방 원자가가 상기 치환기에 존재하는 경우, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로사이클 기로 추가로 치환될 수 있고, 이러한 개방 원자가가 탄소에 존재하는 경우, 할로겐 및 산소-, 질소- 또는 황-결합 치환기에 의해 추가로 치환될 수 있고, 그러한 개방 원자가가 여러 개 존재하는 경우, 상기 기는 결합의 직접 형성 또는 새로운 헤테로 원자, 바람직하게는 산소, 질소 또는 황에의 결합 형성에 의해 결합되어 고리를 형성할 수 있다는 것을 이해한다. 수소를 치환기로 대체하는 것이 본 발명의 분자에 허용되지 않는 불안정성을 도입하지 않고, 화학적으로 합리적이라면 상기 치환이 이루어질 수 있다는 것을 추가로 이해한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "배양"은 임의의 적합한 조건(예컨대, 액체, 겔 또는 고체 배지의 사용)하에서 미생물 세포 집단의 성장을 지칭한다.

재조합 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 관심 야생형 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 플라스미드와 같은 벡터에서 클로닝될 수 있고, 예컨대, E. 콜라이(E. coli) 등과 같은 원하는 숙주에서 발현될 수 있다. 재조합 폴리펩티드의 변이체는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 실제로, 당업자에게 널리 알려진 광범위하게 다양한 상이한 돌연변이유발 기술이 존재한다. 추가로, 돌연변이유발 키트는 많은 상업용 분자 생물학 공급업체로부터 이용가능하다. 정의된 아미노산에서 특이적 치환(부위 지정), 유전자의 국소 영역에서 특이적 또는 무작위 돌연변이(영역 특이적) 또는 전체 유전자에 대한 무작위 돌연변이유발(예컨대, 포화 돌연변이유발)를 만드는 방법이 이용가능하다. PCR, 카세트 돌연변이유발, 유전자 합성, 오류 빈발 PCR, 셔플링을 사용한 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA의 부위 지정 돌연변이유발, 및 화학적 포화 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 효소 변이체를 생성하기 위한 다수의 적합한 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 돌연변이유발 및 유도 진화 방법은 발현, 스크리닝 및 검정할 수 있는 변이체 라이브러리를 생성하기 위해 효소 코딩 폴리뉴클레오티드에 쉽게 적용될 수 있다. 임의의 적합한 돌연변이유발 및 유도 진화 방법은 본 발명에서 유용하며, 당업계에 널리 알려져 있다(예컨대, 미국 특허 제5,605,793호, 제5,811,238호, 제5,830,721호, 제5,834,252호, 제5,837,458호, 제5,928,905호, 제6,096,548호, 제6,117,679호, 제6,132,970호, 제6,165,793호, 제6,180,406호, 제6,251,674호, 제6,265,201호, 제6,277,638호, 제6,287,861호, 제6,287,862호, 제6,291,242호, 제6,297,053호, 제6,303,344호, 제6,309,883호, 제6,319,713호, 제6,319,714호, 제6,323,030호, 제6,326,204호, 제6,335,160호, 제6,335,198호, 제6,344,356호, 제6,352,859호, 제6,355,484호, 제6,358,740호, 제6,358,742호, 제6,365,377호, 제6,365,408호, 제6,368,861호, 제6,372,497호, 제6,337,186호, 제6,376,246호, 제6,379,964호, 제6,387,702호, 제6,391,552호, 제6,391,640호, 제6,395,547호, 제6,406,855호, 제6,406,910호, 제6,413,745호, 제6,413,774호, 제6,420,175호, 제6,423,542호, 제6,426,224호, 제6,436,675호, 제6,444,468호, 제6,455,253호, 제6,479,652호, 제6,482,647호, 제6,483,011호, 제6,484,105호, 제6,489,146호, 제6,500,617호, 제6,500,639호, 제6,506,602호, 제6,506,603호, 제6,518,065호, 제6,519,065호, 제6,521,453호, 제6,528,311호, 제6,537,746호, 제6,573,098호, 제6,576,467호, 제6,579,678호, 제6,586,182호, 제6,602,986호, 제6,605,430호, 제6,613,514호, 제6,653,072호, 제6,686,515호, 제6,703,240호, 제6,716,631호, 제6,825,001호, 제6,902,922호, 제6,917,882호, 제6,946,296호, 제6,961,664호, 제6,995,017호, 제7,024,312호, 제7,058,515호, 제7,105,297호, 제7,148,054호, 제7,220,566호, 제7,288,375호, 제7,384,387호, 제7,421,347호, 제7,430,477호, 제7,462,469호, 제7,534,564호, 제7,620,500호, 제7,620,502호, 제7,629,170호, 제7,702,464호, 제7,747,391호, 제7,747,393호, 제7,751,986호, 제7,776,598호, 제7,783,428호, 제7,795,030호, 제7,853,410호, 제7,868,138호, 제7,783,428호, 제7,873,477호, 제7,873,499호, 제7,904,249호, 제7,957,912호, 제7,981,614호, 제8,014,961호, 제8,029,988호, 제8,048,674호, 제8,058,001호, 제8,076,138호, 제8,108,150호, 제8,170,806호, 제8,224,580호, 제8,377,681호, 제8,383,346호, 제8,457,903호, 제8,504,498호, 제8,589,085호, 제8,762,066호, 제8,768,871호, 제9,593,326호, 및 모든 관련 미국, 뿐만 아니라, PCT 및 미국 이외의 대응 특허; 문헌 [Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]]; [Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]]; [Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]]; [Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]]; [Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]]; [Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]]; [Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]]; [Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]]; [Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]]; [Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]]; [Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]]; [Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]]; [Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]]; [Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]]; [Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767; 및 WO 2009/152336(상기 문헌들 모두 본원에서 참조로 포함된다) 참조).

일부 실시양태에서, 돌연변이유발 처리 후 수득된 효소 클론은 효소 제제를 정의된 온도(또는 다른 검정 조건)에 적용하는 단계 및 열 처리 또는 다른 적합한 검정 조건 후 남아있는 효소 활성의 양을 측정하는 단계에 의해 스크리닝된다. 이어서, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 클론을 유전자로부터 단리시키고, 시퀀싱하여 뉴클레오티드 서열 변화(존재하는 경우)를 확인하고, 숙주 세포에서 효소를 발현하는 데 사용한다. 발현 라이브러리로부터 효소 활성을 측정하는 것은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법(예를 들어, 표준 생화학 기술, 예컨대, HPLC 분석)을 사용하여 수행될 수 있다.

변이체가 생성된 후, 이는 임의의 원하는 특성(예컨대, 높거나, 증가된 활성, 또는 낮거나, 감소된 활성, 증가된 열 활성, 증가된 열 안정성 및/또는 산성 pH 안정성 등)에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, "재조합 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드"(본원에서 "조작된 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드," "변이체 수크로스 포스포릴라제 효소," "수크로스 포스포릴라제 변이체" 및 "수크로스 포스포릴라제 조합 변이체"로도 지칭)가 유용하다.

본원에서 사용되는 바, "벡터"는 DNA 서열을 세포에 도입하기 위한 DNA 구성물이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 DNA 서열에서 코딩되는 폴리펩티드의 적합한 숙주에서 발현을 수행할 수 있는 적합한 제어 서열에 작동가능하게 연결된 발현 벡터이다. 일부 실시양태에서, "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현을 구도시키기 위해 DNA 서열(예컨대, 트랜스진)에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 갖고, 일부 실시양태에서, 전사 종결인자 서열 또한 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "발현"은 전사, 전사 후 변형, 번역 및 번역 후 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 폴리펩티드의 제조에 관여하는 임의의 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 또한 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "생산(제조)하다"라는 용어는 세포에 의한 단백질 및/또는 다른 화합물의 생산(제조)을 지칭한다. 상기 용어는 전사, 전사 후 변형, 번역 및 번역 후 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 폴리펩티드의 제조에 관여하는 임의의 단계를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 또한 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열(예컨대, 프로모터 서열, 신호 펩티드, 종결인자 서열 등)은 두 서열이 자연적으로는 회합되지 않는 경우, 그 서열이 작동가능하게 연결된 또 다른 서열에 대해 "이종성"이다. 예를 들어, "이종성 폴리뉴클레오티드"는 실험 기술에 의해 숙주 세포로 도입된 임의의 폴리뉴클레오티드이며, 숙주 세포에서 제거되고, 실험 조작을 거친 후, 숙주 세포로 재도입되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "숙주 세포" 및 "숙주 균주"는 본원에 제공된 DNA(예컨대, 수크로스 포스포릴라제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 발현 벡터에 적합한 숙주를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 당업계에 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 구성된 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 원핵 또는 진핵 세포이다.

용어 "유사체"는 기준 폴리펩티드와 70% 초과의 서열 동일성 내지 100% 미만의 서열 동일성(예컨대, 75%, 78%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과의 서열 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 실시양태에서, 유사체는 호모아르기닌, 오르니틴 및 노르발린을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 비자연 발생 아미노산 잔기 뿐만 아니라, 자연 발생 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 실시양태에서, 유사체는 또한 하나 이상의 D-아미노산 잔기 및 2개 이상의 아미노산 잔기 사이에 비펩티드 결합을 포함한다.

용어 "유효량"은 원하는 결과를 생성하는 데 충분한 양을 의미한다. 당업자는 통상의 실험을 사용하여 유효량을 결정할 수 있다.

용어 "단리된" 및 "정제된"은 자연적으로 회합되는 적어도 하나의 다른 성분으로부터 제거된 분자(예컨대, 단리된 핵산, 폴리펩티드 등) 또는 다른 성분을 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "정제된"은 절대적인 순도를 요구하지 않으며, 오히려 상대적인 정의로서 의도된다.

본원에서 사용되는 바, "입체선택성"은 하나의 입체이성질체가 또 다른 입체이성질체보다 화학적 또는 효소에 의한 반응에서 우선적으로 형성되는 것을 지칭한다. 입체선택성은 하나의 입체이성질체의 형성이 다른 입체이성질체보다 선호되는 경우, 부분적일 수 있거나, 또는 오직 하나의 입체이성질체가 형성되는 경우, 완전한 것일 수 있다. 입체이성질체가 거울상이성질체인 경우, 입체선택성은 두 거울상이성질체의 합에서 하나의 거울상이성질체의 분율(전형적으로 백분율로서 보고)인 거울상이성질체 선택성으로 지칭된다. 이는 식 [주요 거울상이성질체 - 소수 거울상이성질체]/[주요 거울상이성질체 + 소수 거울상이성질체]에 따라 계산된 거울상이성질체 과량("e.e.": enantiomeric excess)으로서 일반적으로 대안적으로 (전형적으로 백분율로서) 당업계에 보고된다. 입체이성질체가 부분입체이성질체인 경우, 입체선택성은 일반적으로 대안적으로 부분입체이성질체 과량("d.e.": diastereomeric excess)으로 보고되는, 2개의 부분입체이성질체의 혼합물에서 하나의 부분입체이성질체의 분율(전형적으로 백분율로서 보고)인 부분입체선택성으로 지칭된다. 거울상이성질체 과량 및 부분입체이성질체 과량은 입체이성질체 과량의 유형이다.

본원에서 사용되는 바, "위치선택성" 및 "위치선택적 반응"은 결합 형성 또는 절단에 대한 하나의 방향이 다른 모든 가능한 방향보다 우선적으로 발생하는 반응을 지칭한다. 반응은 구별이 완전하면 완전히(100%) 위치선택적일 수 있고, 하나의 부위에서의 반응 생성물이 다른 부위에서의 반응 생성물보다 우세한 경우, 실질적으로 위치선택적(적어도 75%)이거나, 부분적으로 위치선택적(X%, 여기서, 백분율은 관심 반응에 의존하여 설정)일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "화학선택성"은 화학적 또는 효소에 의한 반응에서 한 생성물이 다른 생성물에 비해 우선적으로 형성됨을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "pH 안정성"은 비처리된 효소와 비교하여 일정 시간(예컨대, 0.5-24 hr) 동안 높은 또는 낮은 pH(예컨대, 4.5-6 또는 8 내지 12)에 노출된 후, 유사한 활성(예컨대, 60% 내지 80% 초과)을 유지하는 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "열안정성"은 동일한 승온에 노출된 야생형 효소와 비교하여 일정 시간(예컨대, 0.5-24 h) 동안 승온(예컨대, 40-80℃)에 노출된 후, 유사한 활성(예를 들어, 60% 내지 80% 초과)을 유지하는 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "용매 안정성"은 동일한 농도의 동일한 용매에 노출된 야생형 효소와 비교하여 일정 시간(예컨대, 0.5-24 h) 동안 다양한 농도(예컨대, 5-99%)의 용매(에탄올, 이소프로필 알콜, 디메틸술폭시드[DMSO], 테트라하이드로푸란, 2-메틸테트라하이드로푸란, 아세톤, 톨루엔, 부틸 아세테이트, 메틸 tert-부틸 에테르 등)에 노출된 후, 유사한 활성(예컨대, 60% 내지 80% 초과)을 유지하는 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "열 및 용매 안정성"은 열안정성이고, 용매 안정성인 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 지칭하는 것이다.

본원에서 사용되는 바, "임의적" 및 "임의적으로"는 추후 기술되는 이벤트 또는 상황이 발생하거나, 발생하지 않을 수 있다는 것 및 상기 설명이 이벤트 또는 상황이 발생하는 경우 및 그것이 발생하지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다. 당업자는 하나 이상의 선택적인 치환기를 함유하는 것으로 기술된 임의의 분자와 관련하여, 입체적으로 실제적이고/이거나, 합성적으로 가능한 화합물만이 포함되는 것을 의미한다는 것을 이해할 것이다.

본원에서 사용되는 바, "임의적으로 치환된"은 화학적 기의 용어 또는 시리즈에서 모든 후속 변형자를 지칭한다. 예를 들어, "임의적으로 치환된 아릴알킬"이라는 용어에서, 분자의 "알킬" 부분 및 "아릴" 부분은 치환되거나, 치환되지 않을 수 있으며, 일련의 "임의적으로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴"의 경우, 알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴 기는 다른 기와 독립적으로 치환되거나, 치환되지 않을 수 있다.

본 발명의 상세한 설명

일부 실시양태에서, 본 발명은 예컨대, MK-8591(Merck)과 같은 뉴클레오시드 유사체의 제조에 적합한 효소를 제공한다. 본 발명은 이러한 뉴클레오시드 유사체를 제조하기 위한 효소의 잠재적인 사용을 다루기 위해 개발되었다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 화합물(1)의 비천연 뉴클레오시드 유사체의 시험관내 효소 합성 방법을 초래하는 화합물을 제조하는 데 유용한 효소를 제공한다.

비천연 뉴클레오시드는 암 및 바이러스 감염 치료용 약물을 비롯한 다수의 중요한 약물 부류의 필수 빌딩 블록이다. 시장에 또는 임상 시험 중인 뉴클레오시드 유사체 약물이 적어도 12가지 존재한다(문헌 [Jordheim et al., Nat. Rev. Drug Discovery 12:447-464 [2013]]). 화합물(1)을 제조하는 한 가지 방법은 반응식 I에 제시된 바와 같이 화합물(3)인 에티닐 리보스-1-포스페이트와 화합물(2)인 플루오로아데닌의 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제(PNP) 촉매화 커플링에 의한 것이다.

데옥시리보스-1-포스페이트 화합물, 예컨대, 화합물(3)은 제조하기 어려울 수 있다. 그러나, 상응하는 데옥시리보스-5-포스페이트 화합물은 효소 2-데옥시리보스-5-포스페이트 알돌라제(DERA)에 의해 촉매화되는 아세트알데히드 및 D-글리세르알데히드-3-포스페이트(또는 그의 유사체)의 커플링을 통해 제조될 수 있다(문헌 [Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 112:2013-2014 [1990]]). 일단 데옥시리보스-5-포스페이트 유사체(4)가 형성되고 나면, 효소 포스포펜토뮤타제(PPM)의 작용에 의해 반응식 I에 필요한 상응하는 데옥시리보스-1-포스페이트 유사체(3)로 전환되거나, 이성질체화될 수 있다.

반응식 I에 제시된 PNP 및 PPM 반응의 평형 위치는 전형적으로 생성물(화합물(1) 및 무기 포스페이트)이 아닌 반응물(화합물(2) 및 (4))을 선호한다. 더 높은 전환율로 반응을 유도하는 한 가지 방법은 커플링 단계에서 형성된 무기 포스페이트를 제거하는 것이다. 이는 효소 수크로스 포스포릴라제(SP)에 의해 촉매화되는 무기 포스페이트와 예컨대, 수크로스 같은 이당류와의 반응에 의해 달성될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제7,229,797호 참조). 글루코스-1-포스페이트 및 프럭토스를 생성하는 이 반응은 매우 유리하며, 하기 반응식 II에 제시된 바와 같이 전체 반응을 유도할 수 있다.

자연 발생 수크로스 포스포릴라제와 비교하여 개선된 특성을 갖는 조작된 수크로스 포스포릴라제 효소는 관련 프로세스 조건 및/또는 반응식 III에 도시된 시스템을 포함하는 다중 효소 시스템에서 생성될 수 있다. 이들 조작된 SP 효소는 화합물(1)의 개선된 제조를 초래할 수 있고/거나, 다른 개선된 특성을 가질 수 있다.

개선된 활성을 갖고, 전형적인 산업 조건하에 및/또는 다중 효소 시스템의 일부로서 작동하는 조작된 SP가 필요하다. 본 발명은 이러한 요구를 해결하고, 산업 조건하에서 상기 반응 및 다른 반응에 사용하기에 적합한 조작된 SP를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 SP 폴리펩티드는 화합물(1)의 뉴클레오시드 유사체와 같은 화합물을 제조하기 위한 다중 효소 시스템의 일부이다. 일부 실시양태에서, 조작된 SP 폴리펩티드는 하기 효소: 판토테네이트 키나제, 포스포펜토뮤타제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 알콜 옥시다제, 알돌라제, 및/또는 아세테이트 키나제 중 하나 이상을 포함하는 다중 효소 시스템의 일부이다.

조작된 SP 폴리펩티드

본 발명은 조작된 SP 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리펩티드의 제조 방법 및 상기 폴리펩티드의 사용 방법을 제공한다. 설명이 폴리펩티드에 관한 경우, 그 설명은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 설명하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 야생형 SP 효소에 비해 개선된 특성을 갖는 조작된 비자연 발생 SP 효소를 제공한다. 임의의 적합한 반응 조건이 본 발명에서 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 인산화 반응을 수행하는 조작된 폴리펩티드의 개선된 특성을 분석하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 반응 조건은 하기 및 실시예에서 추가로 기술되는 바와 같이, 조작된 SP의 농도 또는 양, 기질(들), 완충제(들), 용매(들), pH, 온도 및 반응 시간을 포함하는 조건, 및/또는 조작된 SP 폴리펩티드가 고체 지지체 상에 고정된 조건과 관련하여 변형된다.

일부 실시양태에서, 반응 조건을 보충하기 위해 추가의 반응 성분 또는 추가의 기술이 사용된다. 일부 실시양태에서, 이는 효소를 안정화시키고, 효소의 불활성화를 방지하고, 생성물 억제를 감소시키고, 반응 평형을 원하는 생성물 형성으로 이동시키기 위한 조치를 취하는 것을 포함한다.

일부 추가의 실시양태에서, 일부 추가의 실시양태에서, 기질 화합물을 생성물 화합물로 전환하기 위한 상기 기술된 프로세스 중 임의의 것은 생성물 화합물(들)의 추출, 단리, 정제, 결정화, 여과 및/또는 동결건조로부터 선택되는 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 제공된 프로세스에 의해 제조된 생체촉매 반응 혼합물로부터 생성물(들)을 추출, 단리, 정제 및/또는 결정화하기 위한 방법, 기술 및 프로토콜은 통상의 기술자에게 공지되어 있고/거나, 통상적인 실험을 통해 이용된다. 추가로, 예시적인 방법은 하기 실시예에서 제공된다.

조작된 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 SP 폴리뉴클레오티드,

발현 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 본원에서 기술된 조작된 효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 유전자 발현을 제어하는 하나 이상의 이종성 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 효소 폴리펩티드(들)를 코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 구성물은 상응하는 효소 폴리펩티드(들)를 발현하기 위해 적절한 숙주 세포 내로 도입된다.

당업자에게 자명한 바와 같이, 단백질 서열의 이용가능성 및 다양한 아미노산에 상응하는 코돈에 대한 지식은 대상 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드에 대한 설명을 제공한다. 동일한 아미노산이 대체 또는 동의 코돈에 의해 코딩되는 유전자 코드의 축퇴성은 극히 많은 수의 핵산이 제조될 수 있도록 하며, 상기 모두는 조작된 효소(예컨대, SP) 폴리펩티드를 코딩한다. 따라서, 본 발명은 가능한 코돈 선택에 기초하여 조합을 선택함으로써 본원에서 기술되는 효소 폴리펩티드를 코딩하는, 제조될 수 있는 효소 폴리뉴클레오티드의 각각의 모든 가능한 변이를 제조하기 위한 방법 및 조성물을 제공하고, 상기의 모든 변이는 실시예에서 (예컨대, 다양한 표에서) 제시되는 아미노산 서열을 포함하는, 본원에 기술된 임의의 폴리펩티드에 대해 구체적으로 개시된 것으로 간주되어야 한다.

코돈은 바람직하게는 단백질 제조를 위해 선택된 숙주 세포에 의한 이용을 위해 최적화된다. 예를 들어, 박테리아에서 사용되는 선호 코돈은 전형적으로 박테리아에서의 발현을 위해 사용된다. 결과적으로, 조작된 효소 폴리펩티드를 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드는 전장 코딩 영역에서 코돈 위치의 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 90% 초과의 위치에 바람직한 코돈을 포함한다.

일부 실시양태에서, 효소 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 특성을 갖는 효소 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 폴리펩티드는 본원에 제공된 서열 번호로부터 선택되는 기준 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 임의의 변이체의 아미노산 서열(예컨대, 실시예에서 제공되는 변이체), 및 기준 폴리뉴클레오티드(들)와 비교하여 하나 이상의 잔기 차이, 또는 실시예에서 개시된 것과 같은 임의의 변이체의 아미노산 서열(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산 잔기 위치)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기준 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2 및 4로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 매우 엄격한 조건하에서 본원에 제공된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보체로부터 선택된 기준 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 본원에 제공된 임의의 변이체 효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 하이브리드화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드는 기준 서열과 비교하여 하나 이상의 잔기 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소 폴리펩티드를 코딩한다.

일부 실시양태에서, 본원에서 임의의 조작된 효소 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 효소 폴리펩티드의 발현을 촉진하기 위해 다양한 방식으로 조작된다. 일부 실시양태에서, 효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제어 서열이 효소 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위해 존재하는 발현 벡터를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드를 벡터 내로 삽입하기 전에 조작하는 것은 이용되는 발현 벡터에 따라 바람직하거나, 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드 및 핵산 서열을 변형시키기 위한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 제어 서열은 다른 서열 중에서, 프로모터, 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적합한 프로모터는 선택된 숙주 세포에 기초하여 선택될 수 있다. 박테리아 숙주 세포의 경우, 본 개시내용의 핵산 구성물의 전사를 지시하기 위한 적합한 프로모터로는 E. 콜라이 lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor) 아가라제 유전자(dagA), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라제 유전자(sacB), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 알파-아밀라제 유전자(amyL), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 말토제닉 아밀라제 유전자(amyM), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 알파-아밀라제 유전자(amyQ), 바실러스 리케니포르미스 페니실리나제 유전자(penP), 바실러스 섭틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 및 원핵성 베타-락타마제 유전자(예컨대, 문헌 [Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 [1978]] 참조) 뿐만 아니라, tac 프로모터(예컨대, 문헌 [DeBoer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983]] 참조)로부터 선택되는 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 사상형 진균 숙주 세포를 위한 예시적인 프로모터는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라제, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르틱 프로테이나제, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 중성 알파-아밀라제, 아스퍼질러스 니거 산 안정성 알파-아밀라제, 아스퍼질러스 니거 또는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라제(glaA), 리조무코르 미에헤이 리파제, 아스퍼질러스 오리재 알칼리성 프로테아제, 아스퍼질러스 오리재 트리오스 포스페이트 이소머라제, 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 아세트아미다제, 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 트립신 유사 프로테아제(예컨대, WO 96/00787 참조)에 대한 유전자로부터 수득되는 프로모터 뿐만 아니라, NA2-tpi 프로모터(아스퍼질러스 니거 중성 알파-아밀라아제 및 아스퍼질러스 오리재 트리오스 포스페이트 이소머라아제에 대한 유전자로부터의 프로모터의 하이브리드), 및 그의 돌연변이체 프로모터, 절두된 프로모터, 및 하이브리드 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 효모 세포 프로모터는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지애 갈락토키나제(GAL1), 사카로마이세스 세레비지애 알콜 데하이드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(ADH2/GAP), 및 사카로마이세스 세레비지애 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 유전자로부터의 것일 수 있다. 효모 숙주 세포를 위한 다른 유용한 프로모터는 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌 [Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992]] 참조).

일부 실시양태에서, 제어 서열은 적합한 전사 종결인자 서열(즉, 전사를 종결시키기 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 서열)이다. 일부 실시양태에서, 종결인자 서열은 효소 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택되는 숙주 세포에서 기능적인 임의의 적어도 종결인자가 본 발명에서 사용된다. 사상형 진균 숙주 세포를 위한 예시적인 전사 종결인자는 아스퍼질러스 오리재 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 니둘란스 안트라닐레이트 신타제, 아스퍼질러스 니거 알파-글루코시다제, 및 푸사리움 옥시스포룸 트립신 유사 프로테아제에 대한 유전자로부터 수득될 수 있다. 효모 숙주 세포를 위한 예시적인 종결인자는 사카로마이세스 세레비지애 에놀라제, 사카로마이세스 세레비지애 시토크롬 C(CYC1), 및 사카로마이세스 세레비지애 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제에 대한 유전자로부터 수득될 수 있다. 효모 숙주 세포를 위한 다른 유용한 종결인자는 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌 [Romanos et al., 상기 문헌 동일] 참조).

일부 실시양태에서, 제어 서열은 또한 적합한 리더 서열(즉, 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비번역된 영역)이다. 일부 실시양태에서, 리더 서열은 효소 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능적인 임의의 적합한 리더 서열이 본 발명에서 사용될 수 있다. 사상형 진균 숙주 세포에 대한 예시적인 리더는 아스퍼질러스 오리재 TAKA 아밀라제, 및 아스퍼질러스 니둘란스 트리오스 포스페이트 이소머라제에 대한 유전자로부터 수득된다. 효모 숙주 세포에 대한 적합한 리더는 사카로마이세스 세레비지애 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지애 3-포스포글리세레이트 키나제, 사카로마이세스 세레비지애 알파 인자, 및 사카로마이세스 세레비지애 알콜 데하이드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(ADH2/GAP)에 대한 유전자로부터 수득된다.

일부 실시양태에서, 제어 서열은 또한 폴리아데닐화 서열(즉, 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결되고, 전사될 때, 전사되는 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 부가하기 위한 신호로서 숙주 세포에 의해 인식되는 서열)이다. 선택된 숙주 세포에서 기능적인 임의의 적합한 폴리아데닐화 서열이 본 발명에 사용될 수 있다. 사상형 진균 숙주 세포에 대한 예시적인 폴리아데닐화 서열은 아스퍼질러스 오리재 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 니둘란스 안트라닐레이트 신타제, 푸사리움 옥시스포룸 트립신 유사 프로테아제, 및 아스퍼질러스 니거 알파-글루코시다제에 대한 유전자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 효모 숙주 세포에 대한 유용한 폴리아데닐화 서열은 공지되어 있다(예컨대, 문헌 [Guo and Sherman, Mol. Cell. Bio., 15:5983-5990 [1995]] 참조).

일부 실시양태에서, 제어 서열은 또한 신호 펩티드(즉, 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 코딩하고, 코딩되는 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 유도하는 코딩 영역)이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열의 코딩 서열의 5' 말단은 분비된 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역의 세그먼트와 번역 리딩 프레임 내에서 자연적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 영역을 본질적으로 함유한다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 코딩 서열의 5' 말단은 코딩 서열에 대해 외래 물질인 신호 펩티드 코딩 영역을 함유한다. 발현된 폴리펩티드를 선택된 숙주 세포의 분비 경로 내로 유도하는 임의의 적합한 신호 펩티드 코딩 영역이 조작된 폴리펩티드(들)의 발현에 사용될 수 있다. 박테리아 숙주 세포에 대한 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 바실러스 NClB 11837 말토제닉 아밀라제, 바실러스 스테아로써모필러스 알파-아밀라제, 바실러스 리케니포르미스 섭틸리신, 바실러스 리케니포르미스 베타-락타마제, 바실러스 스테아로써모필러스 중성 프로테아제(nprT, nprS, nprM), 및 바실러스 섭틸리스 prsA에 대한 유전자로부터 수득된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는 신호 펩티드 코딩 영역이다. 추가의 신호 펩티드가 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌 [Simonen and Palva, Microbiol. Rev., 57:109-137 [1993]] 참조). 일부 실시양태에서, 사상형 진균 숙주 세포에 대한 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 아스퍼질러스 오리재 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 니거 중성 아밀라제, 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라제, 리조무코르 미에헤이 아스파르틱 프로테이나제, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 셀룰라제, 및 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 리파제에 대한 유전자로부터 수득된 신호 펩티드 코딩 영역을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 효모 숙주 세포에 대한 유용한 신호 펩티드는 사카로마이세스 세레비지애 알파 인자 및 사카로마이세스 세레비지애 인버타제에 대한 유전자로부터의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 제어 서열은 또한 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 아미노산 서열을 코딩하는 프로펩티드 코딩 영역이다. 생성된 폴리펩티드는 "프로효소," "프로폴리펩티드" 또는 "자이모겐"으로 지칭된다. 프로폴리펩티드는 프로폴리펩티드로부터 프로펩티드의 촉매에 의한 또는 자가촉매에 의한 절단에 의해 성숙한 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 코딩 영역은 바실러스 섭틸리스 알칼리성 프로테아제(aprE), 바실러스 섭틸리스 중성 프로테아제(nprT), 사카로마이세스 세레비지애 알파 인자, 리조무코르 미에헤이 아스파르틱 프로테이나제, 및 미셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila) 락타제에 대한 유전자를 포함하나, 이에 제한되지 않는(예컨대, WO 95/33836 참조), 임의의 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 신호 펩티드 및 프로펩티드 영역 모두가 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역은 폴리펩티드의 아미노 말단 다음에 위치하고, 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 아미노 말단 다음에 위치한다.

일부 실시양태에서, 조절 서열 또한 이용된다. 상기 서열은 숙주 세포의 성장과 관련하여 폴리펩티드의 발현의 조절을 용이하게 한다. 조절 시스템의 예는 유전자의 발현이 조절 화합물의 존재를 포함하는 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여 작동이 시작되거나, 또는 중단되는 것이다. 원핵 숙주 세포에서, 적합한 조절 서열은 lac , tac, 및 trp 오퍼레이터 시스템을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 효모 숙주 세포에서, 적합한 조절 시스템은 ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 사상형 진균에서, 적합한 조절 서열은 TAKA 알파-아밀라제 프로모터, 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라제 프로모터, 및 아스퍼질러스 오리재 글루코아밀라제 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 조작된 효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그가 도입되는 숙주의 유형에 따라 하나 이상의 발현 조절 영역, 예컨대, 프로모터 및 종결인자, 복제 기점 등을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 다양한 핵산 및 제어 서열은 함께 연결되어, 하나 이상의 편리한 제한 부위에 효소 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 삽입 또는 치환을 허용하는 상기 제한 부위를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조한다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 서열은 핵산 서열 또는 상기 서열을 포함하는 핵산 구성물을 발현을 위한 적절한 벡터 내로 삽입함으로써 발현된다. 발현 벡터의 생성을 수반하는 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 발현을 위한 적절한 제어 서열과 작동가능하게 연결되도록 벡터에 위치한다.

재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 절차를 편리하게 거칠 수 있고, 효소 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 유도할 수 있는 임의의 적합한 벡터(예컨대, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입되는 숙주 세포에 대한 벡터의 적합성에 따라 결정된다. 벡터는 선형 또는 폐환형 플라스미드일 수 있다.

일부 실시양태에서, 발현 벡터는 자율 복제 벡터(즉, 예컨대, 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체, 또는 인공 염색체와 같이, 그의 복제가 염색체 복제와는 상관없는, 염색체외 엔티티로서 존재하는 벡터)이다. 벡터는 자가 복제를 보장하기 위한 임의의 수단을 함유할 수 있다. 일부 대안적인 실시양태에서, 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 때, 게놈 내로 통합되고, 그가 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 벡터이다. 추가로, 일부 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈 내로 도입되는 총 DNA를 함께 함유하는 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드, 및/또는 트랜스포존이 사용된다.

일부 실시양태에서, 발현 벡터는 형질전환된 세포가 용이하게 선별될 수 있도록 허용하는 하나 이상의 선별가능한 마커를 함유한다. "선별가능한 마커"는 그의 생성물이 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성, 영양요구성에 대한 원영양성 등을 제공하는 유전자이다. 박테리아 선별가능한 마커의 예는 바실러스 섭틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스로부터의 dal 유전자, 또는 예컨대, 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 마커를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 효모 숙주 세포를 위한 적합한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 사상형 진균 숙주 세포에서 사용하기 위한 선별가능한 마커는 amdS(아세트아미다제; 예컨대, A. 니둘란스(A. nidulans) 또는 A. 오리재(A. orzyae)로부터의 것), argB(오르니틴 카바모일트랜스퍼라제), bar(포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제; 예컨대, S. 하이그로스코피쿠스(S. hygroscopicus)로부터의 것), hph(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제), niaD(니트레이트 리덕타제), pyrG(오로티딘-5'-포스페이트 데카복실라제; 예컨대, A. 니둘란스 또는 A. 오리재로부터의 것), sC(술페이트 아데닐트랜스퍼라제), 및 trpC(안트라닐레이트 신타제) 뿐만 아니라, 그의 등가물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 폴리뉴클레오티드(들)는 숙주 세포에서 조작된 효소(들)의 발현을 위해 하나 이상의 제어 서열에 작동적으로 연결된 것인 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 발현 벡터에 의해 코딩되는 폴리펩티드 발현에서 사용하는 데 적합한 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있으며, 박테리아 세포, 예컨대, E. 콜라이, 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium ) 세포; 진균 세포, 예컨대, 효모 세포(예컨대, 사카로마이세스 세레비지애 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(ATCC 수탁 번호 201178)); 곤충 세포, 예컨대, 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9 세포; 동물 세포, 예컨대, CHO, COS, BHK, 293, 및 보우스 흑색종(Bowes melanoma) 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 숙주 세포는 또한 다양한 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주(예컨대, W3110(ΔfhuA) 및 BL21)를 포함한다. 박테리아 선별가능한 마커의 예는 바실러스 섭틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스로부터의 dal 유전자, 또는 예컨대, 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 및 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 마커를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 벡터를 숙주 세포의 게놈 내로의 통합 또는 게놈과 상관없이, 세포 내에서의 벡터의 자율 복제를 허용하는 요소(들)를 함유한다. 숙주 세포 게놈 내로의 통합을 포함하는 일부 실시양태에서, 벡터는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 상동성 또는 비상동성 재조합에 의해 벡터를 게놈 내로 통합하기 위한 벡터의 임의의 다른 요소에 의존한다.

일부 대안적 실시양태에서, 발현 벡터는 상동성 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈 내로 통합하도록 지시하기 위한 추가의 핵산 서열을 포함한다. 추가의 핵산 서열은 벡터가 염색체(들) 내의 정확한 위치(들)에서 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있게 한다. 정확한 위치에의 통합 가능성을 증가시키기 위해, 통합 요소는 바람직하게는 예컨대, 100 내지 10,000개의 염기쌍, 바람직하게, 400 내지 10,000개의 염기쌍, 가장 바람직하게. 800 내지 10,000개의 염기쌍과 같은 충분한 개수의 뉴클레오티드를 포함하는데, 이는 상동성 재조합 확률을 높이기 위해 상응하는 표적 서열과 고도로 상동성인 것이다. 통합 요소는 숙주 세포의 게놈 내의 표적 서열에 대해 상동성인 임의의 서열일 수 있다. 추가로, 통합 요소는 비코딩, 또는 코딩 핵산 서열일 수 있다. 다른 한편으로, 벡터는 비상동성 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈 내에 통합될 수 있다.

자율 복제의 경우, 벡터는 벡터가 해당 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있도록 하는 복제 기점을 추가로 포함할 수 있다. 박테리아 복제 기점의 예는 P15A ori 또는 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYC177(플라스미드가 P15A ori를 갖는 것) 또는 E. 콜라이에서 복제를 허용하는 pACYC184 및 바실러스에서 복제를 허용하는 pUB110, pE194 또는 pTA1060의 복제 기점이다. 효모 숙주 세포에서 사용하기 위한 복제 기점의 예는 2 미크론 복제 기점, ARS1, ARS4, ARS1과 CEN3의 조합, ARS4와 CEN6의 조합이다. 복제 기점은 그 기능을 숙주 세포에서 온도에 민감하게 만드는 돌연변이를 갖는 것일 수 있다(예컨대, 문헌 [Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1433 [1978]] 참조).

일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 서열의 하나 초과의 카피가 숙주 세포에 삽입되어 유전자 생성물의 제조를 증가시킨다. 핵산 서열의 카피수 증가는 서열의 적어도 하나의 추가의 카피를 숙주 세포 게놈에 통합하거나, 또는 증폭가능한 선별가능한 마커 유전자를 핵산 서열과 함께 포함시킴으로써 얻을 수 있으며, 여기서, 선별가능한 마커 유전자의 증폭된 카피, 및 이에 따라 핵산 서열의 추가의 카피를 함유하는 세포는 적절한 선별가능 제제의 존재하에 세포를 배양함으로써 선별될 수 있다.

본 발명에서 사용하기 위한 많은 발현 벡터는 상업적으로 이용가능하다. 적합한 상업적 발현 벡터는 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 위한 CMV 프로모터 및 hGH 폴리아데닐화 부위 및 E. 콜라이에서의 증폭을 위한 pBR322 복제 기점 및 암피실린 내성 마커를 포함하는 p3xFLAGTM™ 발현 벡터(Sigma-Aldrich Chemicals)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 적합한 발현 벡터는 pBluescriptII SK(-) 및 pBK-CMV(Stratagene), 및 pBR322(Gibco BRL), pUC(Gibco BRL), pREP4, pCEP4(Invitrogen) 또는 pPoly에서 유래된 플라스미드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌 [Lathe et al., Gene 57:193-201 [1987]] 참조).

따라서, 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 변이체 수크로스 포스포릴라제를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터는 벡터의 증식 및 변이체 수크로스 포스포릴라제(들)의 발현을 허용하기 위해 숙주 세포로 형질전환된다. 일부 실시양태에서, 변이체 수크로스 포스포릴라제는 번역 후에 변형되어 신호 펩티드를 제거하고, 일부 경우에, 분비 후에 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 기술된 형질전환된 숙주 세포는 변이체 수크로스 포스포릴라제(들)의 발현을 허용하는 조건하에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 적절한 보충제를 함유하는 최소 또는 복합 배지를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 숙주 세포 배양에 유용한 임의의 적합한 배지가 본 발명에서 유용하다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 HTP 배지에서 성장된다. 적절한 배지는 다양한 상업적 공급업체로부터 이용가능하거나, (예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션의 카탈로그에) 공개된 제조 방법에 따라 제조될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 개선된 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 수크로스 포스포릴라제 효소의 발현을 위해 하나 이상의 제어 서열에 작동적으로 연결된 것인 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 발현 벡터에 의해 코딩되는 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 발현하는 데 사용하기 위한 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있고, 박테리아 세포, 예컨대, E. 콜라이, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir), 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포; 진균 세포, 예컨대, 효모 세포(예컨대, 사카로마이세스 세레비지애 또는 피치아 파스토리스 (ATCC 수탁 번호 201178)); 곤충 세포, 예컨대, 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9 세포; 동물 세포, 예컨대, CHO, COS, BHK, 293, 및 보우스 흑색종 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 기술된 숙주 세포에 대한 적절한 배양 배지 및 성장 조건은 당업계에 널리 알려져 있다.

수크로스 포스포릴라제의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 기술로는 특히, 전기천공, 바이올리스틱 입자 충격, 리포솜 매개 형질감염, 염화칼슘 형질감염 및 원형질체 융합을 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 다양한 방법이 당업에게 공지되어 있다.

일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 적합한 진핵 숙주 세포는 진균 세포, 조류 세포, 곤충 세포 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 진균 숙주 세포는 아스코미코타(Ascomycota), 바시디오미코타(Basidiomycota), 듀테로미코타(Deuteromycota), 자이고미코타(Zygomycota), 펑가이 임페르펙티(Fungi imperfecti)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 진균 숙주 세포는 효모 세포 및 사상형 진균 세포이다. 본 발명의 사상형 진균 숙주 세포는 아문(subdivision) 유미코티나(Eumycotina) 및 오오미코타(Oomycota)의 모든 사상형 형태를 포함한다. 사상형 진균은 키틴, 셀룰로스 및 다른 복잡한 다당류로 이루어진 세포벽을 가진 영양 균사체를 특징으로 한다. 본 발명의 사상형 진균 숙주 세포는 형태학적으로 효모와 구별된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 사상형 진균 숙주 세포는 아클리아(Achlya), 아크레모늄(Acremonium), 아스퍼질러스, 아우레오바시디움(Aureobasidium), 브저르칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코클리오볼루스(Cochliobolus), 코리나스쿠스(Corynascus), 크로포넥트리아(Cryphonectria), 크립토코커스(Cryptococcus), 코프리누스(Coprinus), 콜리올루스(Coriolus), 디플로디아(Diplodia), 엔도티스(Endothis), 푸사리움(Fusarium), 지베렐라(Gibberella), 글리오클라디움(Gliocladium), 휴미콜라(Humicola), 하이포크레아(Hypocrea), 마이셀리오프토라(Myceliophthora), 무코르(Mucor), 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 포도스포라(Podospora), 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 피리쿨라리아(Pyricularia), 리조무코르(Rhizomucor), 리조푸스(Rhizopus), 쉬조필룸(Schizophyllum), 스키탈리디움(Scytalidium), 스포로트리쿰(Sporotrichum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 트라메테스(Trametes), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트리코데르마(Trichoderma), 베르티실리움(Verticillium), 및/또는 볼바리엘라(Volvariella), 및/또는 상기의 유성생식형, 또는 무성생식형 및 동의어, 기본명 또는 분류학적 등가물을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 속 및 종의 숙주 세포이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 피치아, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 또는 야로위아(Yarrowia) 종의 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는 효모 세포이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 효모 세포는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 사카로마이세스 세레비지애, 사카로마이세스 카를스페르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스, 피치아 핀란디카(Pichia finlandica), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피치아 코다마에(Pichia kodamae), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 오푼티아에(Pichia opuntiae), 피치아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피치아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피치아 퀘르쿠움(Pichia quercuum), 피치아 피이페리(Pichia pijperi), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 안구스타(Pichia angusta), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 조류 세포, 예를 들어 클라미도모나스(Chlamydomonas)(예컨대, C. 레인하르드티이(C. reinhardtii)) 및 포르미디움(Phormidium)(P. 종 ATCC29409)이다.

일부 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 적합한 원핵 세포는 그람 양성, 그람 음성 및 그람 가변형 박테리아 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 아그로박테리움(Agrobacterium), 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus), 아나바에나(Anabaena), 아나시스티스(Anacystis), 아시네토박터(Acinetobacter), 아시도써무스(Acidothermus), 아르트로박터(Arthrobacter), 아조박터(Azobacter), 바실러스, 비피도박테리움(Bifidobacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 부티리비브릭(Butyrivibrio), 부크네라(Buchnera), 캄페스트리스(Campestris), 캄플리오박터(Camplyobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 크로마티움(Chromatium), 코프로코쿠스(Coprococcus), 에스케리키아, 엔테로코쿠스(Enterococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 푸소박테리움(Fusobacterium), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 프란시셀라(Francisella), 플라보박테리움(Flavobacterium), 게오바실러스(Geobacillus), 해모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코쿠스(Lactococcus), 일리오박터(Ilyobacter), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 마이크로박테리움(Microbacterium), 메소리조븀(Mesorhizobium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 메틸로박테리움, 마이코박테리움(Mycobacterium), 네이세리아(Neisseria), 판토에아(Pantoea), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로클로로코쿠스(Prochlorococcus), 로도박터(Rhodobacter), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 로도슈도모나스, 로세부리아(Roseburia), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 로도코쿠스(Rhodococcus), 세네데스무스(Scenedesmus), 스트렙토마이세스, 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 시네코쿠스(Synecoccus), 사카로모노스포라(Saccharomonospora), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 세라티아(Serratia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium), 트로페리마(Tropheryma), 툴라렌시스(Tularensis), 테메쿨라(Temecula), 써모시네코코쿠스(Thermosynechococcus), 써모코쿠스(Thermococcus), 우레아플라스마(Ureaplasma), 크잔토모나스(Xanthomonas), 크자일렐라(Xylella), 예르시니아(Yersinia) 및 자이모모나스(Zymomonas)를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 적합한 박테리아 유기체는 본 발명에서 유용하다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 아그로박테리움, 아시네토박터, 아조박터, 바실러스, 비피도박테리움, 부크네라, 게오바실러스, 캄필로박터, 클로스트리듐, 코리네박테리움, 에스케리키아, 엔테로코쿠스, 에르위니아, 플라보박테리움, 락토바실러스, 락토코쿠스, 판토에아, 슈도모나스, 스타필로코쿠스, 살모넬라, 스트렙토코쿠스, 스트렙토마이세스, 또는 자이모모나스의 종이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 균주는 인간에게 비병원성이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 균주는 산업용 균주이다. 다수의 박테리아 산업용 균주가 알려져 있고, 본 발명에 적합하다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 아그로박테리움 종(예를 들어, A. 라디오박터(A. radiobacter), A. 리조게네스(A. rhizogenes), 및 A. 루비(A. rubi))이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 아르트로박터(Arthrobacter) 종(예컨대, A. 아우레센스(A. aurescens), A. 시트레우스(A. citreus), A. 글로비포르미스(A. globiformis), A. 하이드로카보글루타미쿠스(A. hydrocarboglutamicus), A. 미소렌스(A. mysorens), A. 니코티아나에(A. nicotianae), A. 파라피네우스(A. paraffineus), A. 프로토포니아에(A. protophonniae), A. 로세오파르크피누스(A. roseoparqffinus), A. 술푸레우스(A. sulfureus), 및 A. 우레아파시엔스(A. ureafaciens)이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 바실러스 종(예컨대, 예컨대, B. 투링겐시스(B. thuringensis), B. 안트라시스(B. anthracis), B. 메가테리움(B. megaterium), B. 섭틸리스(B. subtilis), B. 렌투스(B. lentus), B. 시르쿨란스(B. circulans), B. 푸밀루스(B. pumilus), B. 라우투스(B. lautus), B. 코아굴란스(B. coagulans), B. 브레비스(B. brevis), B. 피르무스(B. firmus), B. 알카오피우스(B. alkaophius), B. 리케니포르무스(B. licheniformis), B. 클라우시이(B. clausii), B. 스테아로써모필루스(B. stearothermophilus), B. 할로두란스(B. halodurans), 및 B. 아밀로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens))이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 B. 섭틸리스, B. 푸밀루스, B. 리케니포르무스, B. 메가테리움, B. 클라우시이, B. 스테아로써모필루스 또는 B. 아밀로리퀘파시엔스를 포함하나, 이에 제한되지 않는 산업용 바실러스 균주이다. 일부 실시양태에서, 바실러스 숙주 세포는 B. 섭틸리스, B. 리케니포르무스, B. 메가테리움, B. 스테아로써모필루스 및/또는 B. 아밀로리퀘파시엔스이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 클로스트리디움 종(예컨대, C. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum), C. 테타니(C. tetani E88), C. 리투세부렌세(C. lituseburense), C. 사카로부틸리쿰(C. saccharobutylicum), C. 페르프링겐스(C. perfringens), 및 C. 베이제링키이(C. beijerinckii))이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 코리네박테리움 종(예컨대, C. 글루타미쿰(C. glutamicum) 및 C. 아세토아시도필룸(C. acetoacidophilum))이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 에스케리키아 종(예컨대, E. 콜라이)이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이 W3110이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 에르위니아 종(예컨대, E. 우레도보라(E. uredovora), E. 카로토보라(E. carotovora), E. 아나나스(E. ananas), E. 헤르비콜라(E. herbicola), E. 푼크타타(E. punctata), 및 E. 테레우스(E. terreus))이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 판토에아 종(예컨대, P. 시트레아(P. citrea) 및 P. 아글로메란스(P. agglomerans))이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 슈도모나스 종(예컨대, P. 푸티다(P. putida), P. 아에루기노사(P. aeruginosa), P. 메발로니이이(P. mevalonii), 및 P. 종 D-01 10))이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 스트렙토코쿠스 종(예컨대, S. 에퀴시밀레스(S. equisimiles), S. 피오게네스(S. pyogenes), 및 S. 우베리스(S. uberis))이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 스트렙토마이세스 종(예컨대, S. 암보파시엔스(S. ambofaciens), S. 아크로모게네스(S. achromogenes), S. 아베르미틸리스(S. avermitilis), S. 코엘리콜로르(S. coelicolor), S. 아우레오파시엔스(S. aureofaciens), S. 아우레우스(S. aureus), S. 푼기시디쿠스(S. fungicidicus), S. 그리세우스(S. griseus), 및 S. 리비단스(S. lividans))이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 자이모모나스 종(예컨대, Z. 모빌리스(Z. mobilis), 및 Z. 리폴리티카(Z. lipolytica))이다.

본 발명에서 유용한 많은 원핵 및 진핵 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC), 도이체 잠룽 폰 마이크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), 센트랄 뷰로 포르 쉼멜쿨투레스(CBS: Centraalbureau Voor Schimmelcultures) 및 애그리컬쳐럴 리서치 서비스 패턴트 컬쳐 콜렉션(Agricultural Research Service Patent Culture Collection), 노던 리져널 리서치 센터(NRRL: Northern Regional Research Center)와 같은 다수의 배양물 기탁 기관으로부터 공개적으로 쉽게 이용할 수 있다.

일부 실시양태에서, 숙주 세포는 단백질 분비, 단백질 안정성 및/또는 단백질의 발현 및/또는 분비에 바람직한 다른 특성을 개선하는 특징을 갖도록 유전적으로 변형된다. 유전자 변형은 유전공학 기술 및/또는 고전적인 미생물 기술(예컨대, 화학적 또는 UV 돌연변이유발 및 후속 선별)에 의해 달성될 수 있다. 실제로, 일부 실시양태에서, 재조합 변형 및 고전적인 선별 기술의 조합이 숙주 세포를 제조하는 데 사용된다. 재조합 기술을 사용하여, 핵산 분자는 숙주 세포 내에서 및/또는 배양 배지에서 수크로스 포스포릴라제 변이체(들)의 수율을 증가시키는 방식으로 도입, 결실, 억제 또는 변형될 수 있다. 예를 들어, Alp1 기능의 넉아웃은 프로테아제가 결핍된 세포를 생성하고, pyr5 기능의 넉아웃은 피리미딘 결핍 표현형을 가진 세포를 생성한다. 한 유전 공학 접근법에서, 상동성 재조합은 코딩된 단백질의 발현을 억제하기 위해 생체내에서 유전자를 특이적으로 표적화함으로써 표적화된 유전자 변형을 유도하기 위해 사용된다. 대안적 접근법에서, siRNA, 안티센스 및/또는 리보자임 기술이 유전자 발현 억제에 유용하다. 단백질을 코딩하는 유전자 모두 그 또는 일부의 결실 및 유전자 생성물의 발현 또는 활성을 파괴하기 위한 부위 특이적 돌연변이유발을 포함하나, 이에 제한되지 않는 세포에서 단백질의 발현을 감소시키는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌 [Chaveroche et al., Nucl. Acids Res., 28:22 e97 [2000]]; [Cho et al., Molec. Plant Microbe Interact., 19:7-15 [2006]]; [Maruyama and Kitamoto, Biotechnol Lett., 30:1811-1817 [2008]]; [Takahashi et al., Mol. Gen. Genom., 272: 344-352 [2004]]; 및 [You et al., Arch. Microbiol.,191:615-622 [2009]](상기 문헌 모두 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 무작위 돌연변이유발, 이어서, 원하는 돌연변이에 대한 스크리닝 또한 유용하다(예컨대, 문헌 [Combier et al., FEMS Microbiol . Lett., 220:141-8 [2003]]; 및 [Firon et al., Eukary . Cell 2:247-55 [2003]](상기 두 문헌 모두 참조로 포함된다) 참조)).

벡터 또는 DNA 구성물을 숙주 세포에 도입하는 것은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, PEG 매개 형질전환, 전기천공 또는 당업계에 공지된 다른 통상적인 기술을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 에스케리키아 콜라이 발현 벡터 pCK100900i(미국 특허 제9,714,437호(상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다) 참조)가 유용하다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 숙주 세포(즉, "재조합 숙주 세포")는 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선별하거나, 수크로스 포스포릴라제 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 데 적절하게 변형된 종래의 영양 배지에서 배양된다. 배양 조건, 예컨대, 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 당업자에게 널리 알려져 있다. 언급된 바와 같이, 박테리아, 식물, 동물(특히, 포유동물) 및 고세균 기원의 세포를 포함하는 많은 세포의 배양 및 제조에 대한 많은 표준 참고문헌 및 텍스트가 이용가능하다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 발현하는 세포는 배치 또는 연속 발효 조건하에서 성장된다. 고전적인 "배치 발효"는 폐쇄 시스템으로서, 배지의 조성은 발효 초기에 설정되고, 발효 동안 인공적으로 변경되지 않는다. 배치 시스템의 변형은 본 발명에서도 사용되는 "유가식 발효"이다. 이 변형에서, 기질은 발효가 진행됨에 따라 증분으로 첨가된다. 유가식 시스템은 이화대사물 억제가 세포의 대사를 억제할 가능성이 있고, 배지에 제한된 양의 기질이 존재하는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 배치 및 유가식 발효는 일반적이며, 당업계에 널리 알려져 있다. "연속 발효"는 개방 시스템으로서, 정의된 발효 배지가 생물반응기에 연속적으로 첨가되고, 동량의 조건화된 배지가 프로세싱을 위해 동시에 제거된다. 일반적으로 연속 발효는 배양물을 세포를 주로 로그 단계 성장에서 일정한 고밀도로 유지한다. 연속 발효 시스템은 항정 상태의 성장 조건을 유지하기 위해 노력한다. 연속 발효 프로세스를 위한 영양소 및 성장 인자를 조정하는 방법 및 생성물 형성 속도를 최대화하는 기술은 산업 미생물학 분야에 널리 알려져 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 무세포 전사/번역 시스템이 변이체 수크로스 포스포릴라제(들)를 제조하는 데 사용된다. 여러 시스템이 상업적으로 이용가능하며, 그 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다.

본 발명은 변이체 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 활성 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 서열 번호 2 및/또는 서열 번호 4와 적어도 약 70%(또는 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%)의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하고, 본원에 제공된 바와 같은 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 단계; 숙주 세포가 코딩되는 변이체 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 발현하는 조건하에, 형질전환된 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 임의적으로, 발현된 변이체 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 회수 또는 단리시키고/거나, 발현된 변이체 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 함유하는 배양 배지를 회수 또는 단리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 임의적으로, 코딩되는 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 발현한 후에 형질전환된 숙주 세포를 용해시키고, 임의적으로, 발현된 변이체 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 세포 용해물로부터 회수 및/또는 단리시키는 단계를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 변이체 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드의 생산에 적합한 조건하에서 변이체 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 변이체 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 변이체 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드의 생산 방법을 추가로 제공한다. 전형적으로, 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드의 회수 또는 단리는 본원에서 기술되는 것을 포함하여 당업계에 널리 알려진 단백질 회수 기술을 사용하여 숙주 세포 배양 배지, 숙주 세포 또는 둘 모두로부터 이루어진다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원심분리에 의해 수거되고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴되고, 생성된 조 추출물은 추가의 정제를 위해 유지된다. 단백질 발현에 사용되는 미생물 세포는 냉동-해동 사이클링, 초음파 처리, 기계적 파괴 및/또는 세포 용해제의 사용을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 편리한 방법 뿐만 아니라, 당업자에게 널리 알려진 많은 다른 적합한 방법에 의해 파괴될 수 있다.

숙주 세포에서 발현되는 조작된 수크로스 포스포릴라제 효소는 특히, 리소자임 처리, 초음파 처리, 여과, 염석, 초원심분리 및 크로마토그래피를 포함하는, 단백질 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 하나 이상의 기술을 사용하여 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. E. 콜라이와 같은 박테리아로부터 단백질을 용해시키고, 고효율로 추출하기에 적합한 용액은 상표명 셀라이틱 B(CelLytic B)™(Sigma-Aldrich)로 상업적으로 이용가능하다. 따라서, 일부 실시양태에서, 생성된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다수의 방법 중 임의의 것에 의해 회수/단리되고, 임의적으로 정제된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발, 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화도, 소수성 상호작용, 크로마토포커싱 및 크기 배제) 또는 침전을 포함하나, 이에 제한되지 않는 통상적인 방법에 의해 영양 배지로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 단백질 리폴딩 단계가 성숙 단백질의 구성을 완료할 때 필요에 따라 사용된다. 추가로, 일부 실시양태에서, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC: high performance liquid chromatography)가 최종 정제 단계에서 사용된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 당업계에 공지된 방법이 본 발명에서 유용하다(예컨대, 문헌 [Parry et al., Biochem. J., 353:117 [2001]]; 및 [Hong et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 73:1331 [2007]](상기 무 문헌 모두 본원에서 참조로 포함된다). 실제로, 당업계에 공지된 임의의 적합한 정제 방법이 본 발명에서 유용하다.

수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드의 단리를 위한 크로마토그래피 기술은 역상 크로마토그래피 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 친화도 크로마토그래피를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 효소를 정제하기 위한 조건은 부분적으로는, 예컨대, 순 전하, 소수성, 친수성, 분자량, 분자 형상 등과 같은 인자에 따라 달라질 것이며, 이는 당업자에게 공지되어 있다.

일부 실시양태에서, 친화도 기술은 개선된 수크로스 포스포릴라제 효소를 단리하는 데 유용하다. 친화도 크로마토그래피 정제를 위해, 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 임의의 항체가 사용될 수 있다. 항체 생산을 위해, 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 숙주 동물이 수크로스 포스포릴라제 주사에 의해 면역화될 수 있다. 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드는 측쇄 작용기 또는 측쇄 작용기에 부착된 링커에 의해 BSA와 같은 적합한 캐리어에 부착될 수 있다. 프로인트(완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄, 계면 활성 물질, 예컨대, 리솔레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 애주번트, 예컨대, BCG(바실러스 칼메테 구에린(Bacillus Calmette Guerin)) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)을 포함하나, 이로 제한되지 않는 다양한 애주번트가 숙주 종에 따라 면역 반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 수크로스 포스포릴라제 변이체는 효소를 발현하는 세포의 형태로, 조 추출물로서, 또는 단리되거나, 정제된 제제로서 제조되고 사용된다. 일부 실시양태에서, 수크로스 포스포릴라제 변이체는 동결건조물, 분말 형태(예를 들어, 아세톤 분말)로 제조되거나, 효소 용액으로 제조된다. 일부 실시양태에서, 수크로스 포스포릴라제 변이체는 실질적으로 순수한 제제의 형태로 존재한다.

일부 실시양태에서, 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드는 임의의 적합한 고체 기재에 부착된다. 고체 기재는 고체상, 표면 및/또는 막을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 고체 지지체는 유기 중합체, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리플루오로에틸렌, 폴리에틸렌옥시 및 폴리아크릴아미드뿐만 아니라, 상기의 공중합체 및 그래프트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 고체 지지체는 또한 무기물, 예컨대, 유리, 실리카, 제어된 공극 유리(CPG: controlled pore glass), 역상 실리카 또는 금속, 예컨대, 금 또는 백금일 수 있다. 기재의 구조는 비드, 구체, 입자, 과립, 겔, 막 또는 표면의 형태일 수 있다. 표면은 평면형, 실질적으로 평면형 또는 비평면형일 수 있다. 고체 지지체는 다공성 또는 비다공성일 수 있으며, 팽윤성 또는 비팽윤 성특징을 가질 수 있다. 고체 지지체는 웰, 침하부 또는 다른 컨테이용기, 베쓸, 특징부 또는 구획 형태로 구성될 수 있다. 복수의 지지체는 시약의 로봇에 의한 전달을 위해 또는 검출 방법 및/또는 기기에 의해 주소 지정가능한 다양한 위치의 어레이에 구성될 수 있다.

일부 실시양태에서, 수크로스 포스포릴라제 변이체를 정제하기 위해 면역학적 방법이 사용된다. 한 접근법에서, 종래 방법을 사용하여 변이체 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드에 대해 (예컨대, 서열 번호 2 및/또는 서열 번호 4 중 임의의 것을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 그의 면역원성 단편에 대해) 생성된 항체를 비드에 고정시키고, 변이체 수크로스 포스포릴라제가 결합되어 침전되는 조건하에서 세포 배양 배지와 혼합한다. 관련 접근 방식에서, 면역크로마토그래피가 유용하다.

일부 실시양태에서, 변이체 수크로스 포스포릴라제는 비효소 부분을 포함하는 융합 단백질로서 발현된다. 일부 실시양태에서, 변이체 수크로스 포스포릴라제 서열은 정제 촉진 도메인에 융합된다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "정제 촉진 도메인"은 그가 융합되는 폴리펩티드의 정제를 매개하는 도메인을 지칭한다. 적합한 정제 도메인으로는 금속 킬레이팅 펩티드, 고정된 금속 상에서의 정제를 허용하는 히스티딘-트립토판 모듈, 글루타티온(예컨대, GST)에 결합하는 서열, 헤마글루티닌(HA) 태그(인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응; 예컨대, 문헌 [Wilson et al., Cell 37:767 [1984]] 참조), 말토스 결합 단백질 서열, FLAGS 연장/친화성 정제 시스템(예컨대, Immunex Corp에서 이용가능한 시스템)에서 사용되는 FLAG 에피토프 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기술된 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 고려되는 하나의 발현 벡터는 엔테로키나제 절단 부위에 의해 분리된 폴리히스티딘 영역에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 IMIAC(고정된 금속 이온 친화도 크로마토그래피: immobilized metal ion affinity chromatography; 예컨대, 문헌 [Porath et al., Prot. Exp. Purif., 3:263-281 [1992]] 참조)에서 정제를 촉진하는 반면, 엔테로키나제 절단 부위는 융합 단백질로부터 변이체 수크로스 포스포릴라제 폴리펩티드를 분리하기 위한 수단을 제공한다. pGEX 벡터(Promega)는 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 융합 단백질은 가용성이며, 리간드-아가로스 비드(예컨대, GST-융합의 경우, 글루타티온-아가로스)에의 흡착 후, 유리 리간드의 존재하에서의 용출에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다.

따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 조작된 효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 조작된 효소 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 본원에 기술된 바와 같이, 효소 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함한다.

숙주 세포에 적절한 배양 배지 및 성장 조건은 당업계에 널리 알려져 있다. 효소 폴리펩티드의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 임의의 적합한 방법이 본 발명에서 유용할 것으로 고려된다. 적합한 기술은 전기천공, 바이올리스틱 입자 충격, 리포솜 매개 형질감염, 염화칼슘 형질감염 및 원형질체 융합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다양한 특징 및 실시양태는 하기 대표적인 실시예에서 예시되며, 이 실시예는 제한하는 것이 아니라, 예시적인 것으로 의도된 것이다.

실험부

실험 및 달성된 결과를 포함하는 하기 실시예는 단지 예시 목적으로만 제공되는 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 실제로, 하기 기술되는 다수의 시약 및 장비에 적합한 다양한 공급처가 존재한다. 본 발명은 임의의 시약 또는 장비 품목에 대한 임의의 특정 공급처로 제한되도록 의도되지 않는다.

하기 실험 개시내용에서, 하기 약어가 적용된다: M(몰); mM(밀리몰), uM 및 μM(마이크로몰); nM(나노몰); mol(몰); gm 및 g(그램); mg(밀리그램); ug 및 ㎍(마이크로그램); L 및 l(리터); ml 및 mL(밀리리터); cm(센티미터); mm(밀리미터); um 및 ㎛(마이크로미터); sec(초); min(s)(분); h(s) 및 hr(s)(시간); U(단위); MW(분자량: molecular weight); rpm(분당 회전수: rotations per minute); psi 및 PSI(제곱인치당 파운드: pounds per square inch); ℃(섭씨 온도); RT 및 rt(실온: room temperature); CV(변동 계수: coefficient of variability); CAM 및 cam(클로람페니콜); PMBS(폴리믹신 B 술페이트); IPTG(이소프로필 β-D-1-티오 갈락토피라노시드); LB(용원성 브로쓰: lysogeny broth); TB(테리픽 브로쓰: terrific broth); SFP(진탕 플라스크 분말: shake flask powder); CDS(코딩 서열: coding sequence); DNA(데옥시리보핵산: deoxyribonucleic acid); RNA(리보핵산: ribonucleic acid); nt(뉴클레오티드; 폴리뉴클레오티드); aa(아미노산: 아미노 acid; 폴리펩티드); E. 콜라이 W3110(일반적으로 사용되는 실험용 E. 콜라이 균주, Coli Genetic Stock Center[CGSC](미국 코네티컷주 뉴 헤이븐 소재)로부터 이용가능); HTP(고처리량: high throughput); HPLC (고압 액체 크로마토그래피: high pressure liquid chromatography); HPLC-UV(HPLC-자외선 가시광선 검출기); 1H NMR(양성자 핵자기 공명 분광법); FIOPC(양성 대조군 대비 개선 배수); 시그마(Sigma) 및 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재); 디프코(Difco)(Difco Laboratories, BD Diagnostic Systems, 미국 미시건주 디트로이트 소재); 마이크로플루이딕스(Microfluidics)(Microfluidics, 미국 매사추세츠주 웨스트우드 소재); 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(Life Technologies, Fisher Scientific의 자회사, 미국 매사추세츠주 월담 소재); 암레스코(Amresco)(Amresco, LLC, 미국 오하이오주 솔론 소재); 카르보신트(Carbosynth)(Carbosynth, Ltd, 영국 버크셔 소재); 바리안(Varian)(Varian Medical Systems, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재); 애질런트(Agilent)(Agilent Technologies, Inc, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재); 인포르스(Infors)(Infors USA Inc, 미국 메릴랜드주 아나폴리스 정션 소재); 및 써모트론(Thermotron)(Thermotron, Inc, 미국 미시건주 홀란드 소재).

실시예 1

재조합 수크로스 포스포릴라제 유전자를 함유하는 E. 콜라이 발현 숙주

본 발명의 변이체를 생성하기 위해 사용된 초기 수크로스 포스포릴라제(SP) 효소는 알로스카르도비아 옴니콜렌스 종으로부터의 야생형 서열(NCBI 참조 서열: WP_021617468.1)로부터 수득하였다. 야생형 SP 단백질 서열은 E. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화하고, DNA는 발현 벡터 pCK110900(미국 특허 출원 공개 제2006/0195947호의 도 3 참조)에 클로닝하고, lacI 리프레서 제어하에 lac 프로모터에 작동적으로 연결하였다. 발현 벡터는 또한 P15a 복제 기점 및 클로람페니콜 내성 유전자를 함유한다. 생성된 플라스미드를 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 E. 콜라이 W3110으로 형질전환시켰다. 당업계에 공지된 바와 같이 세포를 클로람페니콜에 대해 선별하여 형질전환체를 단리시켰다(예컨대, 미국 특허 제8,383,346호 및 WO2010/144103 참조).

실시예 2

HTP SP 함유 습윤 세포 펠릿의 제조

W3110 E. 콜라이 세포를 SP 코딩 유전자를 함유하는 각각의 플라스미드로 형질전환시키고, 1% 글루코스 및 30 ㎍/ml 클로람페니콜(CAM)을 함유하는 LB 한천 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새도록 성장시켰다. 단일클론 콜로니를 채취하고, 1% 글루코스 및 30 ㎍/mL 클로람페니콜을 함유하는 180 ㎕ LB에 접종하고, 96 웰 얕은 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 넣었다. 플레이트를 O₂ 투과성 씰로 밀봉하고, 배양물을 30℃, 200 rpm 및 85% 습도에서 밤새도록 성장시켰다. 이어서, 각 세포 배양액 10 ㎕를 390 ㎕ TB 및 30 ㎍/mL CAM을 포함하는 96 웰 깊은 웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 깊은 웰 플레이트를 O₂ 투과성 씰로 밀봉하고, OD₆₀₀이 0.6-0.8에 도달할 때까지, 30℃, 200 rpm 및 85% 습도에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 이소프로필 티오글리코시드(IPTG)를 최종 농도 1mM으로 첨가하여 세포 배양물을 유도하고, 250 rpm으로 진탕하면서, 30℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 4,000 rpm으로 10 min 동안 원심분리를 사용하여 세포를 펠릿화하였다. 상청액을 폐기하고, 용해 전에 펠릿을 -80℃에서 냉동시켰다.

실시예 3

화합물(1)의 제조를 위한 서열 번호 2의 개선된 수크로스 포스포릴라제 변이체

서열 번호 2의 수크로스 포스포릴라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 1)를 사용하여 표 3-1의 조작된 폴리펩티드를 생성하였다. 상기 폴리펩티드는 원하는 조건하에서 출발 폴리펩티드와 비교하여 개선된 수크로스 포스포릴라제 활성(예컨대, 반응식 III에 제시된 바와 같이 조작된 DERA, PPM, 및 PNP 효소의 존재하에 화합물(1)의 제조를 통해 측정된 바, 유리 포스페이트 및 수크로스로부터 글루코스-1-포스페이트를 제조할 수 있는 능력)을 나타내었다.

짝수 번호 서열 식별자의 아미노산 서열을 갖는 조작된 폴리펩티드는 하기 기술되는 바와 같이 서열 번호 2의 "백본" 아미노산 서열로부터 생성되었다. 유도 진화는 서열 번호 1에 기재된 폴리뉴클레오티드로 시작되었다. 널리 공지된 다양한 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 앞서 확인된 유익한 아미노산 차이의 재조합)을 사용하여 조작된 폴리펩티드의 라이브러리를 생성하고, 폴리펩티드 SP 활성을 측정한 HTP 검정법 및 분석 방법을 사용하여 스크리닝하였다. 이 경우, 표 3-2의 분석 방법을 사용하여, 상기 반응식 III에 제시된 바와 같이 조작된 데옥시리보스-포스페이트 알돌라제(DERA), 포스포펜토뮤타제(PPM) 및 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(PNP) 효소의 존재하에 화합물(1)의 제조를 통해 활성을 측정하였다. 본원 제공된 방법은 본 발명을 사용하여 제조된 변이체를 분석하는 데 유용하다. 그러나, 다른 적합한 방법이 본 발명에서 유용한 바, 본원에 기술된 방법이 본원에 제공되고/거나, 본원에 제공된 방법을 사용하여 제조된 변이체의 분석에 적용가능한 유일한 방법인 것으로 의도되지 않는다.

고처리량 용해물을 하기와 같이 제조하였다. 클론 SP 변이체로부터의 냉동 펠릿을 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하고, 100 mM 트리에탄올아민 완충제(pH 7.5), 1 mg/mL 리소자임 및 0.5 mg/mL 폴리믹신 b 술페이트(PMBS)를 함유하는 400 ㎕ 용해 완충제로 용해시켰다. 용해 혼합물을 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 이어서, 플레이트를 4000 rpm으로, 및 4℃에서 15 min 동안 원심분리하였다.

진탕 플라스크 분말(진탕 플라스크 배양물로부터 동결건조된 용해물)을 하기와 같이 제조하였다. 원하는 변이체의 세포 배양물을 1% 글루코스 및 30 ㎍/ml CAM을 포함하는 LB 아가 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새도록 성장시켰다. 각 배양물로부터의 단일 콜로니를 1% 글루코스 및 30 ㎍/ml CAM을 포함하는 6 ml의 LB로 옮겼다. 배양물을 30℃에서, 250 rpm으로 18 h 동안 성장시키고, 최종 OD₆₀₀이 0.05가 되도록 30 ㎍/ml CAM을 함유하는 TB 250 ml에 대략 1:50으로 계대배양하였다. 배양물을 30℃, 250 rpm으로 대략 195분 동안 최종 OD₆₀₀이 0.6-0.8 사이가 되도록 성장시키고, 1 mM IPTG로 유도하였다. 이어서, 배양물을 30℃에서, 250 rpm으로 20 h 동안 성장시켰다. 배양물을 4000 rpm으로 10 min 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 30 ml의 20 mM 트리에탄올아민(pH 7.5)에 재현탁시키고, 18,000 psi으로 마이크로플루다이저(Microfluidizer)^® 프로세서 시스템(Microfluidics)을 사용하여 용해시켰다. 용해물을 펠릿화하고(60 min 동안 10,000 rpm), 상청액을 냉동 및 동결건조시켰다.

총 부피 100 ㎕로, 2 mL 깊은 웰 플레이트에서 96 웰 포맷으로 DERA/PPM/PNP/SP 효소를 포함하는 탠덤 4-효소 캐스케이드 셋업에서 반응을 수행하였다. 반응은 진탕 플라스크 분말로서 DERA, PPM, 및 PNP(30 wt% PPM 서열 번호 86, 0.5 wt% DERA 서열 번호 88, 및 0.5 wt% PNPh-4007 - PNP 서열 번호 90), 26 g/L 또는 124 mM의 거울상 순수한 (R)-2-에티닐-글리세르알데히드 기질, 99 mM F-아데닌(0.8 eq.), 186 mM 아세트알데히드(이소프로판올 중 40 wt%, 1.5 eq.), 372 mM 수크로스(3.0 eq.), 5 mM MnCl₂ 및 50 mM TEoA(pH 7.5)를 포함하였다. 반응은 하기와 같이 설정하였다: (i) SP를 제외한 모든 반응 성분을 단일 용액에 미리 혼합하고, 이어서, 상기 용액 90 ㎕를 96 웰 플레이트의 각 웰에 분취하고, (ii) 이어서, 50 mM TEoA 완충제를 사용하여 미리 100배 희석된 SP 용해물 10 ㎕를 웰에 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응 플레이트를 가열 밀봉하고, 35℃에서 600 rpm으로 진탕시키면서 18-20시간 동안 인큐베이션시켰다.

반응물을 1 M KOH 및 DMSO의 1:1 혼합물 300 ㎕로 켄칭하였다. 켄칭된 반응물을 탁상용 진탕기에서 10 min 동안 진탕시킨 후, 4℃에서 5 min 동안 4000 rpm으로 원심분리하여 임의의 침전물을 펠릿화하였다. 이어서, 10 ㎕의 상청액을 0.1 M TEoA(pH 7.5) 완충제 중 190 ㎕의 25% MeCN으로 미리 충전된 96 웰 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다. 샘플을 써모(Thermo) U3000 UPLC 시스템에 주입하고, 실시예 3-2에 기술된 바와 같이 0.1% TFA로 보충된, 75:25 물:아세토니트릴을 함유하는 이동상과 함께 아틀란티스(Atlantis) T3 C18, 3 ㎛, 2.1 x 100 mm 칼럼을 사용하여 등용매 분리하였다. 서열 번호 2 대비 활성은 특정 반응 조건하에 서열 번호 2에 의해 형성된 화합물(1)의 피크 면적과 비교하여 변이체 효소에 의해 형성된 화합물(1)의 피크 면적으로서 계산하였다.

실시예 4

화합물(1)의 제조를 위한 서열 번호 4의 개선된 수크로스 포스포릴라제 변이체

서열 번호 4의 수크로스 포스포릴라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 3)를 사용하여 표 4-1의 조작된 폴리펩티드를 생성하였다. 상기 폴리펩티드는 원하는 조건하에서 출발 폴리펩티드와 비교하여 개선된 수크로스 포스포릴라제 활성(예컨대, 반응식 III에 제시된 바와 같이 조작된 DERA, PPM, 및 PNP 효소의 존재하에 화합물(1)의 제조를 통해 측정된 바, 유리 포스페이트 및 수크로스로부터 글루코스-1-포스페이트를 제조할 수 있는 능력)을 나타내었다.

짝수 번호 서열 식별자의 아미노산 서열을 갖는 조작된 폴리펩티드는 하기 기술되는 바와 같이 서열 번호 4의 "백본" 아미노산 서열로부터 생성되었다. 유도 진화는 서열 번호 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 시작되었다. 널리 공지된 다양한 기술(예컨대, 포화 돌연변이유발법, 앞서 확인된 유익한 아미노산 차이의 재조합)을 사용하여 조작된 폴리펩티드의 라이브러리를 생성하고, 폴리펩티드 SP 활성을 측정한 HTP 검정법 및 분석 방법을 사용하여 스크리닝하였다. 이 경우, 표 3-2의 분석 방법을 사용하여, 상기 반응식 III에 제시된 바와 같이 조작된 DERA, PPM 및 PNP 효소의 존재하에 화합물(1)의 제조를 통해 활성을 측정하였다. 본원 제공된 방법은 본 발명을 사용하여 제조된 변이체를 분석하는 데 유용하다. 그러나, 다른 적합한 방법이 본 발명에서 유용한 바, 본원에 기술된 방법이 본원에 제공되고/거나, 본원에 제공된 방법을 사용하여 제조된 변이체의 분석에 적용가능한 유일한 방법인 것으로 의도되지 않는다.

진탕 플라스크 분말(진탕 플라스크 배양물로부터 동결건조된 용해물)을 하기와 같이 제조하였다. 원하는 변이체의 세포 배양물을 1% 글루코스 및 30 ㎍/ml CAM을 포함하는 LB 아가 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새도록 성장시켰다. 각 배양물로부터의 단일 콜로니를 1% 글루코스 및 30 ㎍/ml CAM을 포함하는 6 ml의 LB로 옮겼다. 배양물을 30℃에서, 250 rpm으로 18 h 동안 성장시키고, 최종 OD₆₀₀이 0.05가 되도록 30 ㎍/ml CAM을 함유하는 TB 250 ml에 대략 1:50으로 계대배양하였다. 배양물을 30℃, 250 rpm으로 대략 195분 동안 최종 OD₆₀₀이 0.6-0.8 사이가 되도록 성장시키고, 1 mM IPTG로 유도하였다. 이어서, 배양물을 30℃에서, 250 rpm으로 20 h 동안 성장시켰다. 배양물을 4000 rpm으로 10 min 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 30 ml의 20 mM 트리에탄올아민(pH 7.5)에 재현탁시키고, 18,000 psi으로 마이크로플루다이저^® 프로세서 시스템(Microfluidics)을 사용하여 용해시켰다. 용해물을 펠릿화하고(60 min 동안 10,000 rpm), 상청액을 냉동 및 동결건조시켰다.

총 부피 100 ㎕로, 2 mL 깊은 웰 플레이트에서 96 웰 포맷으로 DERA/PPM/PNP/SP 효소를 포함하는 탠덤 4-효소 캐스케이드 셋업에서 반응을 수행하였다. 반응은 진탕 플라스크 분말로서 DERA, PPM, 및 PNP(30 wt% PPM 서열 번호 86, 0.5 wt% DERA 서열 번호 88, 및 0.5 wt% PNP 서열 번호 90), 26 g/L 또는 124 mM의 거울상 순수한 (R)-2-에티닐-글리세르알데히드 기질, 99 mM F-아데닌(0.8 eq.), 186 mM 아세트알데히드(이소프로판올 중 40 wt%, 1.5 eq.), 372 mM 수크로스(3.0 eq.), 5 mM MnCl₂ 및 50 mM TEoA(pH 7.5)를 포함하였다. 반응은 하기와 같이 설정하였다: (i) SP를 제외한 모든 반응 성분을 단일 용액에 미리 혼합하고, 이어서, 상기 용액 90 ㎕를 96 웰 플레이트의 각 웰에 분취하고, (ii) 이어서, 50 mM TEoA 완충제를 사용하여 미리 100배 희석된 SP 용해물 10 ㎕를 웰에 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응 플레이트를 가열 밀봉하고, 35℃에서 600 rpm으로 진탕시키면서 18-20시간 동안 인큐베이션시켰다.

반응물을 1 M KOH 및 DMSO의 1:1 혼합물 300 ㎕로 켄칭하였다. 켄칭된 반응물을 탁상용 진탕기에서 10 min 동안 진탕시킨 후, 4℃에서 5 min 동안 4000 rpm으로 원심분리하여 임의의 침전물을 펠릿화하였다. 이어서, 10 ㎕의 상청액을 0.1 M TEoA(pH 7.5) 완충제 중 190 ㎕의 25% MeCN으로 미리 충전된 96 웰 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다. 샘플을 써모 U3000 UPLC 시스템에 주입하고, 실시예 3-2에 기술된 바와 같이 0.1% TFA로 보충된, 75:25 물:아세토니트릴을 함유하는 이동상과 함께 아틀란티스 T3 C18, 3 ㎛, 2.1 x 100 mm 칼럼을 사용하여 등용매 분리하였다. 서열 번호 4 대비 활성은 특정 반응 조건하에 서열 번호 4에 의해 형성된 화합물(1)의 피크 면적과 비교하여 변이체 효소에 의해 형성된 화합물(1)의 피크 면적으로서 계산하였다.

본 출원에서 인용된 모든 공개문헌, 특허, 특허 출원 및 다른 문헌은 그 전문이 마치 각각의 개별 공개문헌, 특허, 특허 출원 또는 다른 문헌이 모든 목적을 위해 참조로 포함되는 것으로 개별적으로 명시된 것과 같은 정도로 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.

다양한 구체적 실시양태가 예시되고, 기술되었지만, 본 발명(들)의 정신 및 범주를 벗어남 없이 다양하게 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> CODEXIS, INC. <120> ENGINEERED SUCROSE PHOSPHORYLASE VARIANT ENZYMES <130> CX2-192USP1 <140> <141> 2019-07-02 <160> 90 <210> 1 <211> 1500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Sucrose phosphorylase from Alloscardovia omnicolens <400> 1 atgaagaaca aagttcaact gattacctac gcggatcgtc tgggtgacgg caccctgaag 60 agcatgaccg agaccctgcg taaacacttc gagggtgttt atgaaggcgt gcacatcctg 120 ccgttcttta ccccgttcga tggtgcggac gcgggctttg atccggttga ccacaccaaa 180 gtggacccgc gtctgggtag ctgggacgat gtggcggaac tgagcaccac ccacgatatc 240 atggttgaca ccattgtgaa ccacatgagc tgggagagcg aacagttcca agatgttatg 300 gcgaagggcg aggacagcga atactatccg atgttcctga ccatgagcag catttttccg 360 gatggtgtga ccgaggaaga cctgaccgcg atctatcgtc cgcgtccggg tctgccgttc 420 acccactata actggggtgg caaaacccgt ctggtttgga ccacctttac cccgcagcaa 480 gtggacattg ataccgacag cgagatgggt tggaactacc tgctgagcat cctggatcag 540 ctgagccaaa gccacgttag ccaaattcgt ctggacgcgg tgggttatgg cgcgaaggag 600 aaaaacagca gctgcttcat gaccccgaag acctttaaac tgatcgaacg tattaaggcg 660 gagggtgaaa aacgtggcct ggagaccctg atcgaagttc acagctacta taagaaacag 720 gtggagattg cgagcaaggt ggatcgtgtt tacgactttg cgatcccggg tctgctgctg 780 catgcgctgg aatttggcaa aaccgatgcg ctggcgcaat ggattgacgt tcgtccgaac 840 aacgcggtga acgttctgga tacccacgac ggtatcggcg ttatcgatat tggtagcgat 900 cagatggacc gtagcctggc gggtctggtg ccggatgagg aagttgacgc gctggttgag 960 agcatccacc gtaacagcaa gggtgaaagc caggaagcga ccggcgcggc ggcgagcaac 1020 ctggacctgt accaagttaa ctgcacctac tatgcggcgc tgggtagcga cgatcagaaa 1080 tatattgcgg cgcgtgcggt gcagttcttt atgccgggcg tgccgcaagt ttactatgtg 1140 ggtgcgctgg cgggcagcaa cgatatggac ctgctgaagc gtaccaacgt gggtcgtgat 1200 atcaaccgtc actactatag cgcggcggaa gtggcgagcg aggtggaacg tccggtggtt 1260 caggcgctga acgcgctggg ccgtttccgt aacaccctga gcgcgttcga tggtgaattt 1320 agctacagca acgcggacgg cgttctgacc atgacctggg cggatgatgc gacccgtgcg 1380 accctgacct ttgcgccgaa ggcgaacagc aacggtgcga gcgtggcgcg tctggagtgg 1440 accgatgcgg cgggtgaaca tgcgaccgac gatctgatcg cgaacccgcc ggtggttgcg 1500 <210> 2 <211> 500 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Sucrose phosphorylase from Alloscardovia omnicolens <400> 2 Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp 1 5 10 15 Gly Thr Leu Lys Ser Met Thr Glu Thr Leu Arg Lys His Phe Glu Gly 20 25 30 Val Tyr Glu Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Thr Pro Phe Asp Gly 35 40 45 Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Val Asp His Thr Lys Val Asp Pro Arg 50 55 60 Leu Gly Ser Trp Asp Asp Val Ala Glu Leu Ser Thr Thr His Asp Ile 65 70 75 80 Met Val Asp Thr Ile Val Asn His Met Ser Trp Glu Ser Glu Gln Phe 85 90 95 Gln Asp Val Met Ala Lys Gly Glu Asp Ser Glu Tyr Tyr Pro Met Phe 100 105 110 Leu Thr Met Ser Ser Ile Phe Pro Asp Gly Val Thr Glu Glu Asp Leu 115 120 125 Thr Ala Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Thr His Tyr Asn 130 135 140 Trp Gly Gly Lys Thr Arg Leu Val Trp Thr Thr Phe Thr Pro Gln Gln 145 150 155 160 Val Asp Ile Asp Thr Asp Ser Glu Met Gly Trp Asn Tyr Leu Leu Ser 165 170 175 Ile Leu Asp Gln Leu Ser Gln Ser His Val Ser Gln Ile Arg Leu Asp 180 185 190 Ala Val Gly Tyr Gly Ala Lys Glu Lys Asn Ser Ser Cys Phe Met Thr 195 200 205 Pro Lys Thr Phe Lys Leu Ile Glu Arg Ile Lys Ala Glu Gly Glu Lys 210 215 220 Arg Gly Leu Glu Thr Leu Ile Glu Val His Ser Tyr Tyr Lys Lys Gln 225 230 235 240 Val Glu Ile Ala Ser Lys Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Ile Pro 245 250 255 Gly Leu Leu Leu His Ala Leu Glu Phe Gly Lys Thr Asp Ala Leu Ala 260 265 270 Gln Trp Ile Asp Val Arg Pro Asn Asn Ala Val Asn Val Leu Asp Thr 275 280 285 His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Ile Gly Ser Asp Gln Met Asp Arg 290 295 300 Ser Leu Ala Gly Leu Val Pro Asp Glu Glu Val Asp Ala Leu Val Glu 305 310 315 320 Ser Ile His Arg Asn Ser Lys Gly Glu Ser Gln Glu Ala Thr Gly Ala 325 330 335 Ala Ala Ser Asn Leu Asp Leu Tyr Gln Val Asn Cys Thr Tyr Tyr Ala 340 345 350 Ala Leu Gly Ser Asp Asp Gln Lys Tyr Ile Ala Ala Arg Ala Val Gln 355 360 365 Phe Phe Met Pro Gly Val Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Ala Leu Ala 370 375 380 Gly Ser Asn Asp Met Asp Leu Leu Lys Arg Thr Asn Val Gly Arg Asp 385 390 395 400 Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser Ala Ala Glu Val Ala Ser Glu Val Glu 405 410 415 Arg Pro Val Val Gln Ala Leu Asn Ala Leu Gly Arg Phe Arg Asn Thr 420 425 430 Leu Ser Ala Phe Asp Gly Glu Phe Ser Tyr Ser Asn Ala Asp Gly Val 435 440 445 Leu Thr Met Thr Trp Ala Asp Asp Ala Thr Arg Ala Thr Leu Thr Phe 450 455 460 Ala Pro Lys Ala Asn Ser Asn Gly Ala Ser Val Ala Arg Leu Glu Trp 465 470 475 480 Thr Asp Ala Ala Gly Glu His Ala Thr Asp Asp Leu Ile Ala Asn Pro 485 490 495 Pro Val Val Ala 500 <210> 3 <211> 1500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Sucrose phosphorylase from Alloscardovia omnicolens <400> 3 atgaagaaca aagttcaact gattacctac gcggatcgtc tgggtgacgg caccctgaag 60 agcatgaccg agaccctgcg taaacacttc gagggtgttt atgaaggcgt gcacatcctg 120 ccgttcttta ccccgttcga tggtgcggac gcgggctttg atccggttga ccacaccaaa 180 gtggacccgc gtctgggtag ctgggacgat gtggcggaac tgagcaccac ccacgatatc 240 atggttgaca ccattgtgaa ccacatgagc tgggagagcg aacagttcca agatgttatg 300 gcgaagggcg aggacagcga atactatccg atgttcctga ccatgagcag catttttccg 360 gatggtgtga ccgaggaaga cctgaccgcg atctatcgtc cgcgtccggg tctgccgttc 420 acccactata actggggtgg caaaacccgt ctggtttgga ccacctttac cccgcagcaa 480 gtggacattg ataccgacag cgagatgggt tggaactacc tgctgagcat cctggatcag 540 ctgagccaaa gccacgttag ccaaattcgt ctggacgcgg tgggttatgg cgcgaaggag 600 aaaaacagca gctgcttcat gaccccgaag acctttaaac tgatcgaacg tattaaggcg 660 gagggtgaaa aacgtggcct ggagaccctg atcgaagttc acagctacta taagaaacag 720 gtggagattg cgagcaaggt ggatcgtgtt tacgactttg cgatcccggg tctgctgctg 780 catgcgctgg aatttggcaa aaccgatgcg ctggcgcaat ggattgacgt tcgtccgaac 840 aacgcggtga acgttctgga tacccacgac ggtatcggcg ttatcgatat tggtagcgat 900 cagatggacc gtagcctggc gggtctggtg ccggatgagg aagttgacgc gctggttgag 960 agcatccacc gtaacagcaa gggtgaaagc caggaagcga ccggcgcggc ggcgagcaac 1020 ctggacctgt accaagttaa ctgcacctac tatgcggcgc tgggtagcga cgatcagaaa 1080 tatattgcgg cgcgtgcggt gcagttcttt atgccgggcg tgccgcaagt ttactatgtg 1140 ggtgcgctgg cgggcagcaa cgatatggac ctgctgaagc gtaccaacag tggtcgtgat 1200 atcaaccgtc actactatag cgcggcggaa gtggcgagcg aggtggaacg tccggtggtt 1260 caggcgctga acgcgctggg ccgtttccgt aacaccctga gcgcgttcga tggtgaattt 1320 agctacagca acgcggacgg cgttctgacc atgacctggg cggatgatgc gacccgtgcg 1380 accctgacct ttgcgccgaa ggcgaacagc aacggtgcga gcgtggcgcg tctggagtgg 1440 accgatgcgg cgggtgaaca tgcgaccgac gatctgatcg cgaacccgcc ggtggttgcg 1500 <210> 4 <211> 500 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Sucrose phosphorylase from Alloscardovia omnicolens <400> 4 Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp 1 5 10 15 Gly Thr Leu Lys Ser Met Thr Glu Thr Leu Arg Lys His Phe Glu Gly 20 25 30 Val Tyr Glu Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Thr Pro Phe Asp Gly 35 40 45 Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Val Asp His Thr Lys Val Asp Pro Arg 50 55 60 Leu Gly Ser Trp Asp Asp Val Ala Glu Leu Ser Thr Thr His Asp Ile 65 70 75 80 Met Val Asp Thr Ile Val Asn His Met Ser Trp Glu Ser Glu Gln Phe 85 90 95 Gln Asp Val Met Ala Lys Gly Glu Asp Ser Glu Tyr Tyr Pro Met Phe 100 105 110 Leu Thr Met Ser Ser Ile Phe Pro Asp Gly Val Thr Glu Glu Asp Leu 115 120 125 Thr Ala Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Thr His Tyr Asn 130 135 140 Trp Gly Gly Lys Thr Arg Leu Val Trp Thr Thr Phe Thr Pro Gln Gln 145 150 155 160 Val Asp Ile Asp Thr Asp Ser Glu Met Gly Trp Asn Tyr Leu Leu Ser 165 170 175 Ile Leu Asp Gln Leu Ser Gln Ser His Val Ser Gln Ile Arg Leu Asp 180 185 190 Ala Val Gly Tyr Gly Ala Lys Glu Lys Asn Ser Ser Cys Phe Met Thr 195 200 205 Pro Lys Thr Phe Lys Leu Ile Glu Arg Ile Lys Ala Glu Gly Glu Lys 210 215 220 Arg Gly Leu Glu Thr Leu Ile Glu Val His Ser Tyr Tyr Lys Lys Gln 225 230 235 240 Val Glu Ile Ala Ser Lys Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Ile Pro 245 250 255 Gly Leu Leu Leu His Ala Leu Glu Phe Gly Lys Thr Asp Ala Leu Ala 260 265 270 Gln Trp Ile Asp Val Arg Pro Asn Asn Ala Val Asn Val Leu Asp Thr 275 280 285 His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Ile Gly Ser Asp Gln Met Asp Arg 290 295 300 Ser Leu Ala Gly Leu Val Pro Asp Glu Glu Val Asp Ala Leu Val Glu 305 310 315 320 Ser Ile His Arg Asn Ser Lys Gly Glu Ser Gln Glu Ala Thr Gly Ala 325 330 335 Ala Ala Ser Asn Leu Asp Leu Tyr Gln Val Asn Cys Thr Tyr Tyr Ala 340 345 350 Ala Leu Gly Ser Asp Asp Gln Lys Tyr Ile Ala Ala Arg Ala Val Gln 355 360 365 Phe Phe Met Pro Gly Val Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Ala Leu Ala 370 375 380 Gly Ser Asn Asp Met Asp Leu Leu Lys Arg Thr Asn Ser Gly Arg Asp 385 390 395 400 Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser Ala Ala Glu Val Ala Ser Glu Val Glu 405 410 415 Arg Pro Val Val Gln Ala Leu Asn Ala Leu Gly Arg Phe Arg Asn Thr 420 425 430 Leu Ser Ala Phe Asp Gly Glu Phe Ser Tyr Ser Asn Ala Asp Gly Val 435 440 445 Leu Thr Met Thr Trp Ala Asp Asp Ala Thr Arg Ala Thr Leu Thr Phe 450 455 460 Ala Pro Lys Ala Asn Ser Asn Gly Ala Ser Val Ala Arg Leu Glu Trp 465 470 475 480 Thr Asp Ala Ala Gly Glu His Ala Thr Asp Asp Leu Ile Ala Asn Pro 485 490 495 Pro Val Val Ala 500 <210> 5 <211> 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tacgactttg cgatcccggg tctgctgctg 780 catgcgctgg aatttggcaa aaccgatgcg ctggcgcaat ggattgacgt tcgtccgaac 840 aacgcggtga acgttctgga tacccacgac ggtatcggcg ttatcgatat tggtagcgat 900 cagatggacc gtagcctggc gggtctggtg ccggatgagg aagttgacgc gctggttgag 960 agcatccacc gtaacagcaa gggtgaaagc caggaagcga ccggcgcggc ggcgagcaac 1020 ctggacctgt accaagttaa ctgcacctac tatgcggcgc tgggtagcga cgatcagaaa 1080 tatattgcgg cgcgtgcggt gcagttcttt atgccgggcg tgccgcaagt ttactatgtg 1140 ggtgcgctgg cgggcagcaa cgatatggac ctgctgaagc gtaccaacgt gggtcgtgat 1200 atcaaccgtc actactatag cgcggcggaa gtggcgagcg aggtggaacg tccggtggtt 1260 caggcgctga acgcgctggg ccgtttccgt aacaccctga gcgcgttcga tggtgaattt 1320 agctacagca acgcggacgg cgttctgacc atgacctggg cggatgatgc gacccgtgcg 1380 accctgacct ttgcgccgaa ggcgaacagc aacggtgcga gcgtggcgcg tctggagtgg 1440 accgatgcgg cgggtgaaca tgcgaccgac gatctgatcg cgaacccgcc ggtggttgcg 1500 <210> 6 <211> 500 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Sucrose phosphorylase from Alloscardovia omnicolens <400> 6 Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp 1 5 10 15 Gly Thr Leu Lys Ser Met Thr Glu Thr Leu Arg Lys His Phe Glu Gly 20 25 30 Val Tyr Glu Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Thr Pro Phe Asp Gly 35 40 45 Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Val Asp His Thr Lys Val Asp Pro Arg 50 55 60 Leu Gly Ser Trp Asp Asp Val Ala Glu Leu Ser Thr Thr His Asp Ile 65 70 75 80 Met Val Asp Thr Ile Val Asn His Met Ser Trp Glu Ser Glu Gln Phe 85 90 95 Gln Asp Val Met Ala Lys Gly Glu Asp Ser Glu Tyr Tyr Pro Met Phe 100 105 110 Leu Thr Met Ser Ser Ile Phe Pro Asp Gly Val Thr Glu Glu Asp Leu 115 120 125 Thr Ala Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Thr His Tyr Asn 130 135 140 Trp Gly Gly Lys Thr Arg Leu Val Trp Thr Thr Phe Thr Arg Gln Gln 145 150 155 160 Val Asp Ile Asp Thr Asp Ser Glu Met Gly Trp Asn Tyr Leu Leu Ser 165 170 175 Ile Leu Asp Gln Leu Ser Gln Ser His Val Ser Gln Ile Arg Leu Asp 180 185 190 Ala Val Gly Tyr Gly Ala Lys Glu Lys Asn Ser Ser Cys Phe Met Thr 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cctgaccgcg atctatcgtc cgcgtccggg tctgccgttc 420 acccactata actggggtgg caaaacccgt ctggtttgga ccacctttac cccgcagcaa 480 gtggacattg ataccgacag cgagatgggt tggaactacc tgctgagcat cctggatcag 540 ctgagccaaa gccacgttag ccaaattcgt ctggacgcgg tgggttatgg cgcgaaggag 600 aaaaacagca gcgagttcat gaccccgaag acctttaaac tgatcgaacg tattaaggcg 660 gagggtgaaa aacgtggcct ggagaccctg atcgaagttc acagctacta taagaaacag 720 gtggagattg cgagcaaggt ggatcgtgtt tacgactttg cgatcccggg tctgctgctg 780 catgcgctgg aatttggcaa aaccgatgcg ctggcgcaat ggattgacgt tcgtccgaac 840 aacgcggtga acgttctgga tacccacgac ggtatcggcg ttatcgatat tggtagcgat 900 cagatggacc gtagcctggc gggtctggtg ccggatgagg aagttgacgc gctggttgag 960 agcatccacc gtaacagcaa gggtgaaagc caggaagcga ccggcgcggc ggcgagcaac 1020 ctggacctgt accaagttaa ctgcacctac tatgcggcgc tgggtagcga cgatcagaaa 1080 tatattgcgg cgcgtgcggt gcagttcttt atgccgggcg tgccgcaagt ttactatgtg 1140 ggtgcgctgg cgggcagcaa cgatatggac ctgctgaagc gtaccaacgt gggtcgtgat 1200 atcaaccgtc actactatag cgcggcggaa gtggcgagcg aggtggaacg tccggtggtt 1260 caggcgctga acgcgctggg ccgtttccgt aacaccctga gcgcgttcga tggtgaattt 1320 agctacagca acgcggacgg cgttctgacc atgacctggg cggatgatgc gacccgtgcg 1380 accctgacct ttgcgccgaa ggcgaacagc aacggtgcga gcgtggcgcg tctggagtgg 1440 accgatgcgg cgggtgaaca tgcgaccgac gatctgatcg cgaacccgcc ggtggttgcg 1500 <210> 8 <211> 500 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Sucrose phosphorylase from Alloscardovia omnicolens <400> 8 Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp 1 5 10 15 Gly Thr Leu Lys Ser Met Thr Glu Thr Leu Arg Lys His Phe Glu Gly 20 25 30 Val Tyr Glu Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Thr Pro Phe Asp Gly 35 40 45 Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Val Asp His Thr Lys Val Asp Pro Arg 50 55 60 Leu Gly Ser Trp Asp Asp Val Ala Glu Leu Ser Thr Thr His Asp Ile 65 70 75 80 Met Val Asp Thr Ile Val Asn His Met Ser Trp Glu Ser Glu Gln Phe 85 90 95 Gln Asp Val Met Ala Lys Gly Glu Asp Ser Glu Tyr Tyr Pro Met Phe 100 105 110 Leu Thr Met Ser Ser Ile 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tattacctac gcggatcgtc tgggtgacgg caccctgaag 60 agcatgaccg agaccctgcg taaacacttc gagggtgttt atgaaggcgt gcacatcctg 120 ccgttcttta ccccgttcga tggtgcggac gcgggctttg atccggttga ccacaccaaa 180 gtggacccgc gtctgggtag ctgggacgat gtggcggaac tgagcaccac ccacgatatc 240 atggttgaca ccattgtgaa ccacatgagc tgggagagcg aacagttcca agatgttatg 300 gcgaagggcg aggacagcga atactatccg atgttcctga ccatgagcag catttttccg 360 gatggtgtga ccgaggaaga cctgaccgcg atctatcgtc cgcgtccggg tctgccgttc 420 acccactata actggggtgg caaaacccgt ctggtttgga ccacctttac cccgcagcaa 480 gtggacattg ataccgacag cgagatgggt tggaactacc tgctgagcat cctggatcag 540 ctgagccaaa gccacgttag ccaaattcgt ctggacgcgg tgggttatgg cgcgaaggag 600 aaaaacagca gctgcttcat gaccccgaag acctttaaac tgatcgaacg tattaaggcg 660 gagggtgaaa aacgtggcct ggagaccctg atcgaagttc acagctacta taagaaacag 720 gtggagattg cgagcaaggt ggatcgtgtt tacgactttg cgatcccggg tctgctgctg 780 catgcgctgg aatttggcaa aaccgatgcg ctggcgcaat ggattgacgt tcgtccgaac 840 aacgcggtga acgttctgga tacccacgac ggtatcggcg 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atctatcgtc cgcgtccggg tctgccgttc 420 acccactata actggggtgg caaaacccgt ctggtttgga ccacctttac ccgtcagcaa 480 gtggacattg ataccgacag cgagatgggt tggaactacc tgctgagcat cctggatcag 540 ctgagccaaa gccacgttag ccaaattcgt ctggacgcgg tgggttatgg cgcgaaggag 600 aaaaacagca gctgcttcct gaccccgaag acctttaaac tgatcgaacg tattaaggcg 660 gagggtgaaa aacgtggcct ggagaccctg atcgaagttc acagctacta taagaaacag 720 gtggagattg cgagcaaggt ggatcgtgtt tacgactttg cgatcccggg tctgctgctg 780 catgcgctgg aatttggcaa aaccgatgcg ctggcgcaat ggattgacgt tcgtccgaac 840 aacgcggtga acgttctgga tacccacgac ggtatcggcg ttatcgatat tggtagcgat 900 cagatggacc gtagcctggc gggtctggtg ccggatgagg aagttgacgc gctggttgag 960 agcatccacc gtaacagcaa gggtgaaagc caggaagcga ccggcgcggc ggcgagcaac 1020 ctggacctgt accaagttaa ctgcacctac tatgcggcgc tgggtagcga cgatcagaaa 1080 tatattgcgg cgcgtgcggt gcagttcttt atgccgggcg tgccgcaagt ttactatgtg 1140 ggtgcgctgg cgggcagcaa cgatatggac ctgctgaagc gtaccaacag tggtcgtggc 1200 atcaaccgtc actactatag cgcggcggaa gtggcgagcg 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ttatcgatat tggtagcgat 900 cagatggacc gtagcctggc gggtctggtg ccggatgagg aagttgacgc gctggttgag 960 agcatccacc gtaacagcaa gggtgaaagc caggaagcga ccggcgcggc ggcgagcaac 1020 ctggacctgt accaagttaa ctgcacctac tatgcggcgc tgggtagcga cgatcagaaa 1080 tatattgcgg cgcgtgcggt gcagttcttt atgccgggcg tgccgcaagt ttactatgtg 1140 ggtgcgctgg cgggcagcaa cgatatggac ctgctgaagc gtaccaacag tggtcgtggc 1200 atcaaccgtc actactatag cgcggcggaa gtggcgagcg aggtggaacg tccggtggtt 1260 caggcgctga acgcgctggg ccgtttccgt aacaccctga gcgcgttcga tggtgaattt 1320 agctacagca acgcggacgg cgttctgacc atgacctggg cggatgatgc gacccgtgcg 1380 accctgacct ttgcgccgaa ggcgaacagc aacggtgcga gcgtggcgcg tctggagtgg 1440 accgatgcgg cgggtgaaca tgcgaccgac gatctgatcg cgaacccgcc ggtggttgcg 1500 <210> 52 <211> 500 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Sucrose phosphorylase from Alloscardovia omnicolens <400> 52 Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp 1 5 10 15 Gly Thr Leu Lys Ser Met Thr Glu Thr Leu Arg Lys His 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cggcgacaaa 660 gccggtaact tccaacgtac cggtaaccgt cgtgacctgg ctatagagcc gggggcaccg 720 accgtgctgc agaaactggt tgatgaaaaa cacggccagg tggtttcggc gggtaaaatt 780 gccgacatct acgccaaccg cggtatcacc aaaaaagtga aagcgactgg cctggacgcg 840 ctgtttgacg ccaccatcaa agagatgaaa gaagcgggtg ataacaccat cgtcttcacc 900 tgcttcgttg acttcgactc ttcctggggc caccgtcgcg acgtcgccgg ttatgccgcg 960 ggtctggaac tgttcgaccg ccgtctgccg gagctgatgt ctctgctgcg cgatgacgac 1020 atcctgatcc tcaccgctga ccacggttgc gatccgacct ggaccggtca tgaccacacg 1080 cgtgaacaca ttccggtact ggtatatggc ccgaaagtaa aaccgggctc actgggtcat 1140 cgtgaaacct tcgcggatat cggccagact ctggcaaaat attttggtac ctctgatatg 1200 gaatatggca aagccatgtt c 1221 <210> 86 <211> 407 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ENGINEERED PHOSPHOPENTOMUTASE VARIANT ENZYMES <400> 86 Met Lys Arg Ala Phe Ile Met Val Leu Asp Ser Phe Gly Ile Gly Ala 1 5 10 15 Thr Glu Asp Ala Glu Arg Phe Gly Asp Val Gly Ala Asp Thr Leu Gly 20 25 30 His Ile Ala Glu Ala Cys Ala Lys Gly Glu Ala Asp Asn 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245 250 255 Ala Gly Lys Ile Ala Asp Ile Tyr Ala Asn Arg Gly Ile Thr Lys Lys 260 265 270 Val Lys Ala Thr Gly Leu Asp Ala Leu Phe Asp Ala Thr Ile Lys Glu 275 280 285 Met Lys Glu Ala Gly Asp Asn Thr Ile Val Phe Thr Cys Phe Val Asp 290 295 300 Phe Asp Ser Ser Trp Gly His Arg Arg Asp Val Ala Gly Tyr Ala Ala 305 310 315 320 Gly Leu Glu Leu Phe Asp Arg Arg Leu Pro Glu Leu Met Ser Leu Leu 325 330 335 Arg Asp Asp Asp Ile Leu Ile Leu Thr Ala Asp His Gly Cys Asp Pro 340 345 350 Thr Trp Thr Gly His Asp His Thr Arg Glu His Ile Pro Val Leu Val 355 360 365 Tyr Gly Pro Lys Val Lys Pro Gly Ser Leu Gly His Arg Glu Thr Phe 370 375 380 Ala Asp Ile Gly Gln Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gly Thr Ser Asp Met 385 390 395 400 Glu Tyr Gly Lys Ala Met Phe 405 <210> 87 <211> 771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Deoxyribose Phosphate Aldolase From Shewanella Halifaxensis <400> 87 atgtgtgatc tgaagaaggc ggcgcagcgg gcgattagcc tgatggatct gaccaccctg 60 aacgacgatg acaccgacca gaaagtgatt gagctgtgcc acaaagcgaa aaccccggcg 120 ggtgacaccg cggcgatcgt gatttacccg cgtttcatcc cgattgcgcg taagaccctg 180 aacgaaatcg gtggcctgga catcaaaatt gtcaccgtta ccaactttcc gcacggtaac 240 gatgacattg cgattgcggt gctggagacc cgtgcggcgg ttgcgtacgg cgcggatgaa 300 gtggacgtgg ttttcccgta tcgtgcgctg atggaaggta acgaaaccgt gggctttgag 360 ctggttaagg cgtgcaaaga ggcgtgcggt gaagatacca ttctgaaggt gatcattgaa 420 agtggcgtac tgaaagaccc ggcgctgatt cgtaaagcga gcgaaattag catcgatgcg 480 ggtgcggact tcattaagac cagcaccggc aaagttgcgg ttaacgcgac cctggaggcg 540 gcggaaatca ttatgaccgt tattagcgag aagaacccga aagtgggttt caagccggcg 600 ggtggcatta aagatgctgc ggcggcggcg gaatttctgg gtgtggcggc gcgtctgctg 660 ggcgatgact gggcgacccc ggcgaccttc cgttttggtg cgaccgacct gctgaccaac 720 ctgctgcaca ccctggaact ggcggacgcg ccgcagggtg cgcaaggcta t 771 <210> 88 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Deoxyribose Phosphate Aldolase From Shewanella Halifaxensis <400> 88 Met Cys Asp Leu Lys Lys Ala Ala Gln Arg Ala Ile Ser Leu Met Asp 1 5 10 15 Leu Thr Thr Leu Asn Asp Asp Asp Thr Asp Gln Lys Val Ile Glu Leu 20 25 30 Cys His Lys Ala Lys Thr Pro Ala Gly Asp Thr Ala Ala Ile Val Ile 35 40 45 Tyr Pro Arg Phe Ile Pro Ile Ala Arg Lys Thr Leu Asn Glu Ile Gly 50 55 60 Gly Leu Asp Ile Lys Ile Val Thr Val Thr Asn Phe Pro His Gly Asn 65 70 75 80 Asp Asp Ile Ala Ile Ala Val Leu Glu Thr Arg Ala Ala Val Ala Tyr 85 90 95 Gly Ala Asp Glu Val Asp Val Val Phe Pro Tyr Arg Ala Leu Met Glu 100 105 110 Gly Asn Glu Thr Val Gly Phe Glu Leu Val Lys Ala Cys Lys Glu Ala 115 120 125 Cys Gly Glu Asp Thr Ile Leu Lys Val Ile Ile Glu Ser Gly Val Leu 130 135 140 Lys Asp Pro Ala Leu Ile Arg Lys Ala Ser Glu Ile Ser Ile Asp Ala 145 150 155 160 Gly Ala Asp Phe Ile Lys Thr Ser Thr Gly Lys Val Ala Val Asn Ala 165 170 175 Thr Leu Glu Ala Ala Glu Ile Ile Met Thr Val Ile Ser Glu Lys Asn 180 185 190 Pro Lys Val Gly Phe Lys Pro Ala Gly Gly Ile Lys Asp Ala Ala Ala 195 200 205 Ala Ala Glu Phe Leu Gly Val Ala Ala Arg Leu Leu Gly Asp Asp Trp 210 215 220 Ala Thr Pro Ala Thr Phe Arg Phe Gly Ala Thr Asp Leu Leu Thr Asn 225 230 235 240 Leu Leu His Thr Leu Glu Leu Ala Asp Ala Pro Gln Gly Ala Gln Gly 245 250 255 Tyr <210> 89 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Purine Nucleoside Phosphorylase from E. Coli <400> 89 atgacgaccc cacacattaa tgcagaaatg ggcgatttcg ctgacgtagt tttgatgcca 60 ggcgacccgc tgcgtgcgaa gtatattgct gaaactttcc ttgaagatgc ccgtgaagtg 120 aacaacgttc gcggtatgct gggcttcacc ggtacttaca aaggccgcaa aatttccgta 180 atgggtcacg gtgctggtat cccgagctgc tccatctaca ccaaagaact gatcaccgac 240 ttcggcgtga agaaaattat ccgcgtgggt acttgtggcg cagttctgcc gcacgtaaaa 300 ctgcgcgacg tcgttatcgg tatgggtgcc tgcaccgatt ccaaagttaa ccgcatccgt 360 tttaaagacc atgactttgc cgctatcgct gacttcgaca tggtgcgtaa cgcagtagat 420 gcagctaaag cactgggtat tgatccgcgc gtgggtaacc tgcattccgc tgacctgttc 480 tactctccgg acggcgaaat gttcgacgtg atggaaaaat acggcattgt gggcgtggaa 540 atggaagcgg ctggtatcta cggcgtcgct gcagaatttg gcgcgaaagc cctgaccatc 600 tgcaccgtat ctgaccacat ccgcactcac gaggctacca ctgcggctga gcgtcagact 660 accttcaacg acatgatcaa aatcgcactg gaatccgttc tgctgggcga taaagag 717 <210> 90 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Purine Nucleoside Phosphorylase from E. Coli <400> 90 Met Thr Thr Pro His Ile Asn Ala Glu Met Gly Asp Phe Ala Asp Val 1 5 10 15 Val Leu Met Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Tyr Ile Ala Glu Thr 20 25 30 Phe Leu Glu Asp Ala Arg Glu Val Asn Asn Val Arg Gly Met Leu Gly 35 40 45 Phe Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Arg Lys Ile Ser Val Met Gly His Gly 50 55 60 Ala Gly Ile Pro Ser Cys Ser Ile Tyr Thr Lys Glu Leu Ile Thr Asp 65 70 75 80 Phe Gly Val Lys Lys Ile Ile Arg Val Gly Thr Cys Gly Ala Val Leu 85 90 95 Pro His Val Lys Leu Arg Asp Val Val Ile Gly Met Gly Ala Cys Thr 100 105 110 Asp Ser Lys Val Asn Arg Ile Arg Phe Lys Asp His Asp Phe Ala Ala 115 120 125 Ile Ala Asp Phe Asp Met Val Arg Asn Ala Val Asp Ala Ala Lys Ala 130 135 140 Leu Gly Ile Asp Pro Arg Val Gly Asn Leu His Ser Ala Asp Leu Phe 145 150 155 160 Tyr Ser Pro Asp Gly Glu Met Phe Asp Val Met Glu Lys Tyr Gly Ile 165 170 175 Val Gly Val Glu Met Glu Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Val Ala Ala Glu 180 185 190 Phe Gly Ala Lys Ala Leu Thr Ile Cys Thr Val Ser Asp His Ile Arg 195 200 205 Thr His Glu Ala Thr Thr Ala Ala Glu Arg Gln Thr Thr Phe Asn Asp 210 215 220 Met Ile Lys Ile Ala Leu Glu Ser Val Leu Leu Gly Asp Lys Glu 225 230 235

Claims

서열 번호 2 및/또는 4와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열, 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 조작된 수크로스 포스포릴라제로서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제의 폴리펩티드 서열은 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 상기 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치는 서열 번호 2 및/또는 4를 기준으로 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드 서열이 서열 번호 2와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제의 폴리펩티드 서열은 397, 7, 10, 48, 136, 158, 205, 207, 211, 215, 301, 333, 378, 및 400으로부터 선택되는 상기 폴리펩티드 서열 중의 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 상기 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치는 서열 번호 2를 기준으로 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제1항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제의 상기 폴리펩티드 서열이 서열 번호 4와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제의 상기 폴리펩티드 서열은 10/215/400, 158, 158/207/215, 158/207/215/301/400, 158/207/215/400, 158/207/400, 158/211/400, 158/215/301/400, 158/215/400, 158/301/400, 158/400, 205, 207, 207/215, 207/215/400, 207/400, 215/301, 215/400, 242/400, 301, 301/400, 및 400으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환 또는 치환 세트를 포함하고, 상기 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치는 서열 번호 4를 기준으로 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제1항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제가 표 3-1 및/또는 4-1에 기재된 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제 변이체의 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제1항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제가 서열 번호 2 및/또는 4와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제1항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제가 서열 번호 4에 기재된 변이체 조작된 수크로스 포스포릴라제를 포함하는 것인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제1항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제가 서열 번호 4-84의 짝수 번호 서열에 기재된 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제 변이체의 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제1항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제가 서열 번호 4-84의 짝수 번호 서열 중 적어도 하나에 기재된 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제가 야생형 알로스카르도비아 옴니콜렌스(Alloscardovia omnicolens) 수크로스 포스포릴라제와 비교하여 적어도 하나의 개선된 특성을 포함하는 것인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제9항에 있어서, 상기 개선된 특성이 기질에 대한 개선된 활성을 포함하는 것인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제10항에 있어서, 상기 기질이 수크로스 및/또는 무기 포스페이트를 포함하는 것인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개선된 특성이 화합물(1) 및/또는 화합물(3)의 개선된 생산을 포함하는 것인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제가 정제된 것인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제가 뉴클레오시드 유사체를 생산하기 위한 다중 효소 시스템의 일부인 조작된 수크로스 포스포릴라제.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열.
적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 및/또는 3과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함하고, 상기 조작된 수크로스 포스포릴라제의 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 서열.
서열 번호 1 및/또는 3과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함하는, 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제, 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 제어 서열에 작동가능하게 연결된 것인 폴리뉴클레오티드 서열.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 코돈 최적화된 것인 폴리뉴클레오티드 서열.
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 번호 3-83의 홀수 번호 서열에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 서열.
제16항 내지 제21항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
제22항의 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제16항 내지 제21항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포.
적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제가 생산되도록 적합한 조건하에서 제23항 및/또는 제24항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 조작된 수크로스 포스포릴라제를 생산하는 방법.
제25항에 있어서, 배양물 및/또는 숙주 세포로부터 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제25항 및/또는 제26항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조작된 수크로스 포스포릴라제를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.