JP2022538230A - 操作されたスクロースホスホリラーゼバリアント酵素 - Google Patents

操作されたスクロースホスホリラーゼバリアント酵素 Download PDF

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Abstract

本発明は、操作されたスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）酵素、ＳＰ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＳＰ酵素を産生する方法もまた提供する。本発明はさらに、ＳＰ酵素を含む組成物および操作されたＳＰ酵素を使用する方法を提供する。本発明は、薬学的化合物の産生において特に有用である。

Description

本出願は、全ての目的に関してその全体が参照により組み込まれる、２０１９年７月２日に出願された米国特許仮出願第６２／８６９，６７０号の優先権を主張する。
本発明は、操作されたスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）酵素、ＳＰ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＳＰ酵素を産生する方法もまた提供する。本発明はさらに、ＳＰ酵素を含む組成物、操作されたＳＰ酵素を使用する方法を提供する。本発明は、薬学的化合物の産生において特に有用である。
配列表、表、またはコンピュータープログラムに対する参照
配列表の公式コピーは、本明細書と共にＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルとしてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、ファイル名は「ＣＸ２－１９２ＵＳＰ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日は２０１９年７月１日、サイズは２７８キロバイトである。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して出願された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と呼ばれるレトロウイルスは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体であり、これは罹患した個体の免疫系の進行性の破壊ならびに中枢および末梢神経系の変性を伴う複合疾患である。レトロウイルス複製の一般的特色は、ウイルスコード逆転写酵素によるウイルスＲＮＡゲノムの逆転写であり、ウイルス複製にとって必要なＨＩＶ配列のＤＮＡコピーを生成する。いくつかの化合物、例えばＭＫ－８５９１は、公知の逆転写酵素阻害剤であり、ＡＩＤＳおよび類似の疾患の処置において有用である。ＨＩＶ逆転写酵素を阻害することが公知であるいくつかの化合物が存在するが、この酵素の阻害においてより有効で、それによってＡＩＤＳの影響を改善する追加の化合物が当技術分野でなおも必要である。
ＭＫ－８５９１（Ｍｅｒｃｋ）などのヌクレオシドアナログは、ＤＮＡの合成に使用される天然のヌクレオシドとのその類似性によりＨＩＶの逆転写酵素の有効な阻害剤である。逆転写酵素がこれらのアナログに結合すると、逆転写酵素の進行性の性質を阻害することによりＤＮＡの合成を停止する。酵素の停止は、ＤＮＡ分子の早期の終了をもたらし、ＤＮＡ分子を無効にする。しかし、標準的な化学合成技術によるヌクレオシドアナログの産生は、その化学的な複雑さのために難題であり得る。
本発明は、操作されたスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）酵素、ＳＰ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＳＰ酵素を産生する方法もまた提供する。本発明はさらに、ＳＰ酵素を含む組成物および操作されたＳＰ酵素を使用する方法を提供する。本発明は、薬学的化合物の産生において特に有用である。
本発明は、配列番号２および／もしくは４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む操作されたスクロースホスホリラーゼであって、前記操作されたスクロースホスホリラーゼが、前記ポリペプチド配列において少なくとも１つの置換または置換セットを含むポリペプチドを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２および／または４を参照して番号付けられている、操作されたスクロースホスホリラーゼを提供する。一部の実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有し、操作されたスクロースホスホリラーゼのポリペプチドは、７、１０、４８、１３６、１５８、２０５、２０７、２１１、２１５、３０１、３３３、３７８、３９７、および４００から選択される前記ポリペプチド配列における１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたスクロースホスホリラーゼのポリペプチド配列は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有し、操作されたスクロースホスホリラーゼのポリペプチドは、７Ｍ、７Ｖ、７Ｙ、１０Ｗ、４８Ｄ、１３６Ｒ、１５８Ｒ、２０５Ｅ、２０５Ｌ、２０７Ｌ、２１１Ｖ、２１５Ｖ、３０１Ｇ、３３３Ｇ、３７８Ｆ、３９７Ｌ、３９７Ｓ、３９７Ｔ、および４００Ｇから選択される前記ポリペプチド配列における１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたスクロースホスホリラーゼのポリペプチド配列は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有し、操作されたスクロースホスホリラーゼのポリペプチドは、Ｌ７Ｍ、Ｌ７Ｖ、Ｌ７Ｙ、Ｙ１０Ｗ、Ｇ４８Ｄ、Ｐ１３６Ｒ、Ｐ１５８Ｒ、Ｃ２０５Ｅ、Ｃ２０５Ｌ、Ｍ２０７Ｌ、Ｔ２１１Ｖ、Ｉ２１５Ｖ、Ｑ３０１Ｇ、Ａ３３３Ｇ、Ｙ３７８Ｆ、Ｖ３９７Ｌ、Ｖ３９７Ｓ、Ｖ３９７Ｔ、およびＤ４００Ｇから選択される前記ポリペプチド配列における１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号２を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたスクロースホスホリラーゼは、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたスクロースホスホリラーゼは、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたスクロースホスホリラーゼは、配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、本発明は、配列番号４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性であるポリペプチド配列を有する操作されたスクロースホスホリラーゼであって、前記操作されたスクロースホスホリラーゼのポリペプチドが、１０／２１５／４００、１５８、１５８／２０７／２１５、１５８／２０７／２１５／３０１／４００、１５８／２０７／２１５／４００、１５８／２０７／４００、１５８／２１１／４００、１５８／２１５／３０１／４００、１５８／２１５／４００、１５８／３０１／４００、１５８／４００、２０５、２０７、２０７／２１５、２０７／２１５／４００、２０７／４００、２１５／３０１、２１５／４００、２４２／４００、３０１、３０１／４００、および４００から選択される前記ポリペプチド配列における１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号４を参照して番号付けられている、操作されたスクロースホスホリラーゼを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性であるポリペプチド配列を有する操作されたスクロースホスホリラーゼであって、前記操作されたスクロースホスホリラーゼのポリペプチドが、１０Ｗ／２１５Ｖ／４００Ｇ、１５８Ｒ、１５８Ｒ／２０７Ｌ／２１５Ｖ、１５８Ｒ／２０７Ｌ／２１５Ｖ／３０１Ｇ／４００Ｇ、１５８Ｒ／２０７Ｌ／２１５Ｖ／４００Ｇ、１５８Ｒ／２０７Ｌ／４００Ｇ、１５８Ｒ／２１１Ｖ／４００Ｇ、１５８Ｒ／２１５Ｖ／３０１Ｇ／４００Ｇ、１５８Ｒ／２１５Ｖ／４００Ｇ、１５８Ｒ／３０１Ｇ／４００Ｇ、１５８Ｒ／４００Ｇ、２０５Ｌ、２０７Ｌ、２０７Ｌ／２１５Ｖ、２０７Ｌ／２１５Ｖ／４００Ｇ、２０７Ｌ／４００Ｇ、２１５Ｖ／３０１Ｇ、２１５Ｖ／４００Ｇ、２４２Ｇ／４００Ｇ、３０１Ｇ、３０１Ｇ／４００Ｇ、および４００Ｇから選択される前記ポリペプチド配列における１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号４を参照して番号付けられている、操作されたスクロースホスホリラーゼを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性であるポリペプチド配列を有する操作されたスクロースホスホリラーゼであって、前記操作されたスクロースホスホリラーゼのポリペプチドが、Ｙ１０Ｗ／Ｉ２１５Ｖ／Ｄ４００Ｇ、Ｐ１５８Ｒ、Ｐ１５８Ｒ／Ｍ２０７Ｌ／Ｉ２１５Ｖ、Ｐ１５８Ｒ／Ｍ２０７Ｌ／Ｉ２１５Ｖ／Ｑ３０１Ｇ／Ｄ４００Ｇ、Ｐ１５８Ｒ／Ｍ２０７Ｌ／Ｉ２１５Ｖ／Ｄ４００Ｇ、Ｐ１５８Ｒ／Ｍ２０７Ｌ／Ｄ４００Ｇ、Ｐ１５８Ｒ／Ｔ２１１Ｖ／Ｄ４００Ｇ、Ｐ１５８Ｒ／Ｉ２１５Ｖ／Ｑ３０１Ｇ／Ｄ４００Ｇ、Ｐ１５８Ｒ／Ｉ２１５Ｖ／Ｄ４００Ｇ、Ｐ１５８Ｒ／Ｑ３０１Ｇ／Ｄ４００Ｇ、Ｐ１５８Ｒ／Ｄ４００Ｇ、Ｃ２０５Ｌ、Ｍ２０７Ｌ、Ｍ２０７Ｌ／Ｉ２１５Ｖ、Ｍ２０７Ｌ／Ｉ２１５Ｖ／Ｄ４００Ｇ、Ｍ２０７Ｌ／Ｄ４００Ｇ、Ｉ２１５Ｖ／Ｑ３０１Ｇ、Ｉ２１５Ｖ／Ｄ４００Ｇ、Ｅ２４２Ｇ／Ｄ４００Ｇ、Ｑ３０１Ｇ、Ｑ３０１Ｇ／Ｄ４００Ｇ、およびＤ４００Ｇから選択される前記ポリペプチド配列における１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号７０を参照して番号付けられている、操作されたスクロースホスホリラーゼを提供する。一部の実施形態では、操作されたスクロースホスホリラーゼは、配列番号４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたスクロースホスホリラーゼは、配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたスクロースホスホリラーゼは、配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
一部の追加の実施形態では、本発明は、表３－１および／または４－１に記載の少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、操作されたスクロースホスホリラーゼを提供する。
一部の追加の実施形態では、本発明は、配列番号２および／または４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、操作されたスクロースホスホリラーゼを提供する。一部の実施形態では、操作されたスクロースホスホリラーゼは、配列番号４に記載の、バリアントの操作されたスクロースホスホリラーゼを含む。
本発明はまた、配列番号４～８４の偶数番号の配列に記載の少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、操作されたスクロースホスホリラーゼも提供する。
本発明はさらに、野生型Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓスクロースホスホリラーゼと比べて少なくとも１つの改善された特性を含む、操作されたスクロースホスホリラーゼを提供する。一部の実施形態では、改善された特性は、基質に対する改善された活性を含む。一部のさらなる実施形態では、基質は、スクロースまたは関連する二糖または他の化合物および／または無機ホスフェートを含む。一部の追加の実施形態では、改善された特性は、化合物（１）および／または化合物（３）の改善された産生を含む。なお一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースホスホリラーゼは精製されている。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼを含む組成物も提供する。
本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１および／または３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１および／または３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、前記操作されたスクロースホスホリラーゼのポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換を含む。一部のさらなる実施形態では、少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１および／もしくは３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を含む。なお一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結されている。なお一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列はコドン最適化されている。なお一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３～８３の奇数番号の配列に記載のポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。本発明はさらに、本明細書に提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する。
本発明はまた、宿主細胞において操作されたスクロースホスホリラーゼを産生する方法であって、少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼが産生されるように、適した条件下で本明細書に提供される宿主細胞を培養することを含む方法も提供する。一部の実施形態では、方法はさらに、培養物および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼを回収することを含む。一部の追加の実施形態では、方法はさらに、前記少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼを精製するステップを含む。
本発明は、操作されたスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）酵素、ＳＰ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＳＰ酵素を産生する方法もまた提供される。本発明はさらに、ＳＰ酵素を含む組成物および操作されたＳＰ酵素を使用する方法を提供する。本発明は、薬学的化合物の産生において特に有用である。
特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、一般的に、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用される命名法、ならびに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学、および核酸化学の実験手順は、当技術分野において周知で一般に採用されるものである。そのような技術は周知であり、当業者に周知の多数のテキストおよび参考資料に記載されている。標準的な技術またはその改変は、化学合成および化学分析のために使用される。本明細書で上記および下記の両方で言及した全ての特許、特許出願、論文、および刊行物は、これにより参照により明白に本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の任意の適した方法および材料が、本発明の実践において有用であるが、一部の方法および材料を本明細書に記載する。本発明は、記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬が、当業者によって使用される文脈に応じて異なり得ることから、これらに限定されないと理解されるべきである。したがって、以下に直ちに定義する用語を、全体として本発明を参照してより十分に説明する。
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は両方とも例示的で単なる説明に過ぎず、本発明を制限するものではないと理解されるべきである。本明細書で使用される節の見出しは、単に構成目的のためであり、記載の主題を限定すると解釈してはならない。数値範囲はその範囲を定義する数字を含む。このように、本明細書に開示されるあらゆる数値範囲は、あたかもそのようなより狭い数値範囲が全て明白に本明細書に記されていたかのように、そのようなより広い数値範囲内に入るあらゆるより狭い数値範囲を包含すると意図される。同様に、本明細書で開示されるあらゆる最大の（または最小の）数値限定は、そのようなより低い（またはより高い）数値限定が本明細書に明白に記されているかのように、あらゆるより低い（またはより高い）数値限定を含むことも意図される。
略語および定義
遺伝子コードされるアミノ酸に関して使用される略語は慣例的であり、以下の通りである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸塩（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸塩（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。
三文字略記を使用する場合、具体的に「Ｌ」もしくは「Ｄ」がその前になければ、または略語を使用する文脈から明白でなければ、アミノ酸は、α－炭素（Ｃα）に関してＬ－またはＤ－立体配置のいずれかであり得る。例えば、「Ａｌａ」は、α－炭素に関する立体配置を指定しないアラニンを明確に示すが、「Ｄ－Ａｌａ」および「Ｌ－Ａｌａ」はそれぞれ、Ｄ－アラニンおよびＬ－アラニンを明確に示す。一文字略記を使用する場合、大文字はα－炭素に関してＬ－立体配置のアミノ酸を明確に示し、小文字はα－炭素に関してＤ－立体配置のアミノ酸を明確に示す。例えば、「Ａ」はＬ－アラニンを明確に示し、「ａ」はＤ－アラニンを明確に示す。ポリペプチド配列が、一連の一文字略記または三文字略記（またはその混合物）として提示される場合、配列は、一般的な慣例に従ってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）方向で表される。
遺伝子コードヌクレオシドに関して使用される略語は慣例的であり、以下の通りである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。具体的に描写していない限り、略語のヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドは、個々の基準または総計の基準でリボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかであると指定され得る。核酸配列が一連の一文字略記として表される場合、配列は一般的な慣例に従って５’から３’方向に表され、ホスフェートは指し示されない。
本発明を参照して、本明細書の記載に使用した科学技術用語は、具体的に特に定義されていない限り、当業者によって一般に理解される意味を有する。したがって、以下の用語は以下の意味を有すると意図される。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明白に指し示していない限り、複数形の指示対象を含む。このように、例えば「１つのポリペプチド」という参照は１つより多くのポリペプチドを含む。
同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換性があり、限定的でないと意図される。このため、本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同族語は、その包括的意味で使用される（すなわち、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同族語と等価である）。
様々な実施形態の説明が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、当業者は、一部の具体的な例において、ある実施形態を、「それから本質的になる」または「それからなる」という言語を使用して代替的に説明することができると理解するであろうとさらに理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、用語「約」は、特定の値に関する許容可能な誤差を意味する。一部の例では、「約」は、所定の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％、または２．０％以内を意味する。一部の例では、「約」は、所定の値の１、２、３、または４標準偏差以内を意味する。
本明細書で使用される場合、「ＥＣ」数は、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、それらが触媒する化学反応に基づく酵素の数値分類系である。
本明細書で使用される場合、「ＡＴＣＣ」は、そのバイオレポジトリコレクションが遺伝子および系統を含む、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを指す。
本明細書で使用される場合、「ＮＣＢＩ」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎおよびその中でスクロースホスホリラーゼを提供する配列データベースを指す。
本明細書で使用される場合、「スクロースホスホリラーゼ」（「ＳＰ」）酵素は、無機ホスフェートおよびスクロースおよび他の二糖類などの関連化合物の、フルクトースおよびグルコース－１－リン酸および／または関連化合物への変換を触媒する酵素である。ＳＰ酵素は、Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓの野生型ＳＰ酵素、またはヒト、細菌、真菌、植物、もしくは他の種において見出される他のスクロースホスホリラーゼもしくはヘキソシルトランスフェラーゼを含む、天然に存在し得るか、あるいはＳＰ酵素はヒトによる操作によって生成された操作されたポリペプチドであり得る。
本明細書で使用される場合、「ホスホペントムターゼ」（「ＰＰＭ」）酵素は、リボース１－リン酸をリボース５－リン酸および関連化合物、例えばデオキシリボースリン酸、ならびにリボースリン酸およびデオキシリボースリン酸のアナログへの可逆的異性化を触媒する酵素である。
本明細書で使用される場合、「プリンヌクレオシドホスホリラーゼ」（「ＰＮＰ」）酵素は、プリンリボヌクレオシドおよび関連化合物（例えば、デオキシリボヌクレオシドならびにリボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドのアナログ）の遊離のプリン塩基およびリボース－１－リン酸（およびそのアナログ）への可逆的加リン酸分解を触媒する酵素である。
「デオキシリボース（ｄｅｘｙｒｉｂｏｓｅ）リン酸アルドラーゼ」および「ＤＥＲＡ」は、本明細書において互換的に使用され、炭素－炭素結合を可逆的に切断するかまたは作製するリアーゼファミリーのポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、デオキシリボースリン酸アルドラーゼは、天然に存在する（野生型）デオキシリボースリン酸アルドラーゼならびにヒトによる操作によって生成された天然に存在しない操作されたポリペプチドを含む。野生型デオキシリボースリン酸アルドラーゼは、２－デオキシ－Ｄ－リボース５－リン酸のＤ－グリセルアルデヒド３－リン酸およびアセトアルデヒドへの可逆的反応を触媒する。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、本明細書において互換的に使用され、長さまたは翻訳後改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）によらず、アミド結合によって共有結合された少なくとも２個のアミノ酸のポリマーを意味する。この定義には、Ｄ－およびＬ－アミノ酸、Ｄ－およびＬ－アミノ酸の混合物、ならびにＤ－およびＬ－アミノ酸、およびＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物を含むポリマーが含まれる。
「アミノ酸」は、本明細書においてその一般に公知の三文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される一文字記号のいずれかによって呼ばれる。同様にヌクレオチドは、その一般に許容される一文字表記によって呼ばれ得る。
本明細書で使用される場合、「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１７９：１２５－１４２ ［１９８４］）の正規化コンセンサス疎水性尺度に従ってゼロ未満の疎水性を呈する側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる親水性アミノ酸としては、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ－Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ－Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ－Ｌｙｓ（Ｋ）、およびＬ－Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「酸性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合に約６未満のｐＫａ値を呈する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は典型的に、水素イオンの喪失により生理的ｐＨで負電荷を持つ側鎖を有する。遺伝子コードされる酸性アミノ酸としては、Ｌ－Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ－Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「塩基性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合に約６より大きいｐＫａ値を呈する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合により生理的ｐＨで正電荷を持つ側鎖を有する。遺伝子コードされる塩基性アミノ酸としては、Ｌ－Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ－Ｌｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨで非荷電であるが、２つの原子によって共通に共有される電子対が原子の１つによってより緊密に保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる極性アミノ酸としては、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＬ－Ｔｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１７９：１２５－１４２ ［１９８４］）の正規化コンセンサス疎水性尺度に従ってゼロより大きい疎水性を呈する側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる疎水性アミノ酸としては、Ｌ－Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ－Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ－Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ－Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ－Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、およびＬ－Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香環またはヘテロ芳香環を含む側鎖を有する親水性または疎水性のアミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる芳香族アミノ酸としては、Ｌ－Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ－Ｔｙｒ（Ｙ）、およびＬ－Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。そのヘテロ芳香族窒素原子のｐＫａにより、Ｌ－Ｈｉｓ（Ｈ）はその側鎖がヘテロ芳香環を含むことから、塩基性残基または芳香族残基として分類されることもあるが、本明細書ではヒスチジンは、疎水性残基または「拘束された残基」（以下を参照されたい）と分類される。
本明細書で使用される場合、「拘束されたアミノ酸または残基」は、拘束された幾何学を有するアミノ酸または残基を指す。本明細書において、拘束された残基としては、Ｌ－Ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ－Ｈｉｓ（Ｈ）が挙げられる。ヒスチジンは、それが比較的小さいイミダゾール環を有することから、拘束された幾何学を有する。プロリンは、それが５員環も有することから拘束された幾何学を有する。
本明細書で使用される場合、「非極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨで非荷電であり、２つの原子によって共通に共有される電子対が一般的に２つの原子の各々によって等しく保持される結合を有する側鎖（すなわち、側鎖は非極性である）を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる非極性アミノ酸としては、Ｌ－Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ－Ｍｅｔ（Ｍ）、およびＬ－Ａｌａ（Ａ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる脂肪族アミノ酸としては、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、およびＬ－Ｉｌｅ（Ｉ）が挙げられる。システイン（または「Ｌ－Ｃｙｓ」または「［Ｃ］」）は、それが他のＬ－Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニルもしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができるという点においてまれであることに注意されたい。「システイン様残基」は、ジスルフィド架橋の形成にとって利用可能なスルフヒドリル部分を含有するシステインおよび他のアミノ酸を含む。Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）（およびＳＨ－含有側鎖を有する他のアミノ酸）が、還元型の遊離－ＳＨまたは酸化されたジスルフィド架橋型のいずれかでペプチド中に存在する能力は、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドに正味の疎水性または親水性特徴を与えるか否かに影響を及ぼす。Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、１９８４、上記）の正規化コンセンサス尺度に従って０．２９の疎水性を呈するが、本開示の目的に関して、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）は、それ自体の独自の群にカテゴリー化されると理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「小さいアミノ酸または残基」は、全体で３個またはそれより少ない炭素および／またはヘテロ原子（α－炭素および水素を除く）で構成される側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。小さいアミノ酸または残基は、上記の定義に従って脂肪族、非極性、極性、または酸性の小さいアミノ酸または残基としてさらにカテゴリー化され得る。遺伝子コードされる小さいアミノ酸としては、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）、およびＬ－Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（－ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を指す。遺伝子コードされるヒドロキシル含有アミノ酸としては、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）、およびＬ－Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共に共有結合される２つまたはそれより多くのヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、全てリボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ）で構成され得るか、全て２’デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）で構成され得るか、またはリボヌクレオチドおよび２’デオキシリボヌクレオチドの混合物で構成され得る。ヌクレオシドは典型的に、標準的なホスホジエステル連結を介して共に連結されるが、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準の連結を含み得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または一本鎖領域と二本鎖領域の両方を含み得る。その上、ポリヌクレオチドは典型的に、天然に存在するコードヌクレオ塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）で構成されるが、これは、例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどの１つまたは複数の改変および／または合成ヌクレオ塩基を含み得る。一部の実施形態では、そのような改変または合成ヌクレオ塩基は、アミノ酸配列をコードするヌクレオ塩基である。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」は、ヌクレオ塩基（すなわち、窒素塩基）および５炭糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含むグリコシルアミンを指す。ヌクレオシドの非限定的な例としては、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジン、およびイノシンが挙げられる。これに対し、用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオ塩基、５炭糖、および１つまたは複数のリン酸基を含むグリコシルアミンを指す。一部の実施形態では、ヌクレオシドは、キナーゼによってリン酸化されてヌクレオチドを産生することができる。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド二リン酸」は、ヌクレオ塩基（すなわち、窒素塩基）、５炭糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）、および二リン酸（すなわち、ピロリン酸）部分を含むグリコシルアミンを指す。本明細書における一部の実施形態では、「ヌクレオシド二リン酸」は、「ＮＤＰ」と省略される。ヌクレオシド二リン酸の非限定的な例としては、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、およびイノシン二リン酸（ＩＤＰ）が挙げられる。用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、一部の文脈では互換的に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。
本明細書で使用される場合、用語「生体触媒」、「生体触媒の」、「生体内変換」、および「生合成」は、有機化合物について化学反応を実施するための酵素の使用を指す。
本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、天然で見出される形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の供給源から単離することができ、ヒトによる操作によって意図的に改変されていない生物に存在する配列である。
本明細書で使用される場合、「組換え」、「操作された」、「バリアント」、および「天然に存在しない」とは、細胞、核酸、またはポリペプチドを参照して使用される場合、そうでなければ天然に存在しない様式で改変されている材料、または材料の天然もしくはネイティブ型に対応する材料を指す。一部の実施形態では、細胞、核酸、またはポリペプチドは、天然に存在する細胞、核酸、またはポリペプチドと同一であるが、合成材料および／または組換え技術を使用する操作によって産生されるかまたは由来する。非限定的な例としては、中でもネイティブ（非組み換え）型の細胞内で見出されない遺伝子を発現する組換え細胞、またはそうでなければ異なるレベルで発現されるネイティブ遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
用語「パーセント（％）配列同一性」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける比較を指し、２つの最適に整列させた配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に発生する位置の数を決定してマッチした位置の数を生じること、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で除算すること、および結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを生じることによって計算され得る。あるいは、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列に発生するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップと共に整列する位置の数を決定してマッチした位置の数を生じること、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で除算すること、および結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを生じることによって計算され得る。当業者は、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを認識している。比較のための配列の最適なアライメントは、当技術分野において公知であるように、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．、２：４８２ ［１９８１］）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジーアライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８：４４３ ［１９７０］）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ ［１９８８］）によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって、が挙げられるがこれらに限定されない任意の適した方法によって実行することができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの例としては、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムが挙げられるがこれらに限定されず、これらはＡｌｔｓｃｈｕｌら（それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５： ４０３－４１０ ［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３８９－３４０２ ［１９７７］を参照されたい）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通して公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、何らかの正の値の閾値スコアＴとマッチするかまたは満たす、クエリ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記を参照されたい）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見する検索を開始するためのシードとして作用する。次に、ワードヒットを、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各々の配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターＭ（マッチする残基の対のリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列の場合、スコア行列を使用して累積スコアを計算する。各々の方向へのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下する場合；１つまたは複数の負のスコアの残基アライメントの蓄積により、累積スコアがゼロまたはそれ未満となる場合；あるいはいずれかの配列の末端に達した場合に中止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関して）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５ ［１９８９］を参照されたい）を使用する。配列アライメントおよび％配列同一性の例示的な決定は、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを、提供されるデフォルトパラメーターを使用して採用することができる。
本明細書で使用される場合、「参照配列」は、配列および／または活性比較の基礎として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば全長の遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般的に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、少なくとも１００残基長、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは各々、（１）２つの配列間で類似である配列（すなわち、完全な配列の一部）を含み得る、および（２）２つの配列間で相違する配列をさらに含み得ることから、２つ（またはそれより多くの）ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって実施される。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づき得るが、参照配列は、一次配列において１つまたは複数の変化を有し得る配列である。
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントであって、配列が、少なくとも２０個連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得る、および比較ウィンドウにおける配列の部分が、２つの配列の最適なアライメントに関して参照配列（付加または欠失を含まない）と比べて２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る概念的セグメントを指す。比較ウィンドウは、２０連続残基より長くなり得、必要に応じて３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウィンドウを含む。
本明細書で使用される場合、「対応する」、「を参照して」、および「と比較して」は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比べる場合に指定された参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれば、所定のポリマーの残基番号または残基位置は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値位置ではなくて、参照配列に関して明確に示される。例えば、所定のアミノ酸配列、例えば、操作されたスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列を、２つの配列間の残基のマッチを最適にするようにギャップを導入することによって参照配列と整列させることができる。これらの場合では、ギャップが存在するが、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、それに対して整列されている参照配列に関して行う。
本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基位置の比較ウィンドウにわたって、しばしば少なくとも３０～５０残基のウィンドウにわたって参照配列と比べて少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性、少なくとも８９～９５パーセントの間の配列同一性、またはより通常、少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって参照配列の合計２０パーセントまたはそれ未満となる欠失または付加を含む配列と、参照配列を比べることによって計算される。ポリペプチドに適用される一部の具体的な実施形態では、用語「実質的な同一性」は、例えばデフォルトのギャップ加重を使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列させた場合に、２つのポリペプチド配列が、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれより高い同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。一部の実施形態では、比べられる配列において同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸の差」および「残基の差」は、参照配列における対応する位置でのアミノ酸残基と比較したポリペプチド配列の位置でのアミノ酸残基の差を指す。一部の例では、参照配列は、ヒスチジンタグを有するが、番号付けは、ヒスチジンタグを有しない同等の参照配列と比較して維持される。アミノ酸の差の位置は、一般的に本明細書において「Ｘｎ」と呼ばれ、式中ｎはそれに対して残基の差が基づく参照配列中の対応する位置を指す。例えば、「配列番号４と比べてＸ９３位での残基の差」とは、配列番号４の９３位に対応するポリペプチド位置でのアミノ酸残基の差を指す。このように、配列番号４の参照ポリペプチドが９３位でセリンを有する場合、「配列番号４と比べてＸ９３位での残基の差」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチドの位置でセリン以外の任意の残基のアミノ酸置換である。本明細書におけるほとんどの例では、ある位置での具体的なアミノ酸残基の差は「ＸｎＹ」として指し示され、式中「Ｘｎ」は、上記の対応する位置を指定し、「Ｙ」は操作されたポリペプチドにおいて見出されるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチドとは異なる残基）の一文字識別子である。一部の例（例えば、実施例に表される表）では、本発明はまた、従来の表記「ＡｎＢ」によって示される具体的なアミノ酸の差も提供し、式中Ａは参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、およびＢは操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である。一部の例では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸残基の差を含み得、これは参照配列と比較して残基の差が存在する指定された位置のリストによって指し示される。一部の実施形態では、１つより多くのアミノ酸をポリペプチドの具体的な残基位置で使用することができる場合、使用することができる様々なアミノ酸残基は、「／」によって隔てられる（例えば、Ｘ３０７Ｈ／Ｘ３０７ＰまたはＸ３０７Ｈ／Ｐ）。スラッシュはまた、所定のバリアント内の複数の置換を指し示すためにも使用され得る（すなわち、コンビナトリアルバリアントなどでは、所定の配列に１つより多くの置換が存在する）。一部の実施形態では、本発明は、保存的または非保存的アミノ酸置換を含む１つまたは複数のアミノ酸の差を含む操作されたポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、本発明は、保存的および非保存的アミノ酸置換の両方を含む操作されたポリペプチド配列を提供する。
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する異なる残基による残基の置換を指し、このため典型的にポリペプチド中のアミノ酸の、同じまたは類似の定義されたクラスのアミノ酸内のアミノ酸による置換を伴う。限定ではない例によって、一部の実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸を、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）により置換し、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸を、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびスレオニン）により置換し、芳香族側鎖を有するアミノ酸を、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）により置換し、塩基性側鎖を有するアミノ酸を、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）により置換し、酸性側鎖を有するアミノ酸を、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）により置換し、および／または疎水性もしくは親水性アミノ酸をそれぞれ、別の疎水性もしくは親水性アミノ酸に交換する。
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸の、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸による置換を指す。非保存的置換は、定義された群内ではなくて群の間でアミノ酸を使用してもよく、（ａ）置換領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、グリシンの代わりにプロリン）、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさに影響を及ぼす。限定ではない例として、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸により置換された酸性アミノ酸、小さいアミノ酸により置換された芳香族アミノ酸、および疎水性アミノ酸により置換された親水性アミノ酸であり得る。
本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドから１個または複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドに対する改変を指す。欠失は、１個もしくはそれより多くのアミノ酸、２個もしくはそれより多くのアミノ酸、５個もしくはそれより多くのアミノ酸、１０個もしくはそれより多くのアミノ酸、１５個もしくはそれより多くのアミノ酸、または２０個もしくはそれより多くのアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸総数の最大１０％、またはアミノ酸の総数の最大２０％の除去を含み得るが、酵素活性を保持し、および／または操作されたスクロースホスホリラーゼ酵素の改善された特性を保持する。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とし得る。様々な実施形態では、欠失は連続するセグメントを含み得るか、または不連続であり得る。欠失は、典型的にアミノ酸配列において「－」によって指し示される。
本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドから１個または複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分における挿入であり得るか、またはカルボキシもしくはアミノ末端に対する挿入であり得る。本明細書で使用される挿入は、当技術分野で公知の融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の連続するセグメントであるか、または天然に存在するポリペプチド中のアミノ酸の１個または複数によって隔てられ得る。
用語「アミノ酸置換セット」または「置換セット」は、参照配列と比べてポリペプチド配列におけるアミノ酸置換の群を指す。置換セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多くのアミノ酸置換を有し得る。一部の実施形態では、置換セットは、実施例に提供される表に記載されるバリアントスクロースホスホリラーゼのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。
「機能的断片」および「生物活性断片」は、本明細書において互換的に使用され、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失および／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、それが比べられる配列（例えば、本発明の全長の操作されたスクロースホスホリラーゼ）中の対応する位置と同一であり、全長のポリペプチドの活性の実質的に全てを保持するポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、それが天然で付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞内またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を介して）から除去または精製されているポリペプチドを包含する。組換えスクロースホスホリラーゼポリペプチドは、細胞内に存在し得るか、細胞培地中に存在し得るか、または様々な形態で、例えば溶解物もしくは単離された調製物として調製され得る。そのため、一部の実施形態では、組換えスクロースホスホリラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」または「精製されたタンパク質」は、そのポリペプチド種が、存在する主な種である（すなわち、モル濃度または重量基準で、組成物中の他の任意の個々の高分子種より豊富に存在する）組成物を指し、一般的に目的の種が、存在する高分子種のモルまたは％重量で少なくとも約５０パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。しかし、一部の実施形態では、スクロースホスホリラーゼを含む組成物は、５０％未満純粋（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％）であるスクロースホスホリラーゼを含む。一般的に、実質的に純粋なスクロースホスホリラーゼ組成物は、組成物に存在するモルまたは％重量によって、全ての高分子種の約６０％またはそれより多く、約７０％またはそれより多く、約８０％またはそれより多く、約９０％またはそれより多く、約９５％またはそれより多く、および約９８％またはそれより多くを構成する。一部の実施形態では、目的の種は、本質的に均一となるまで精製され（すなわち、夾雑物種は、従来の検出法では組成物中で検出することができない）、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、低分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は高分子種と見なされない。一部の実施形態では、単離された組換えスクロースホスホリラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」は、酵素の少なくとも１つの改善された特性を指す。一部の実施形態では、本発明は、参照スクロースホスホリラーゼポリペプチド、および／または野生型スクロースホスホリラーゼポリペプチド、および／または別の操作されたスクロースホスホリラーゼポリペプチドと比べて任意の酵素特性の改善を呈する操作されたスクロースホスホリラーゼポリペプチドを提供する。このように、「改善」レベルを決定し、野生型ならびに操作されたスクロースホスホリラーゼを含む様々なスクロースホスホリラーゼポリペプチドの間で比べることができる。改善された特性としては、増加したタンパク質発現、増加した熱活性（ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｖｉｔｙ）、増加した熱安定性、増加したｐＨ活性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性または親和性、増加した比活性、増加した基質または最終産物阻害に対する耐性、増加した化学安定性、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、増加した酸性ｐＨに対する耐性、増加したタンパク質分解活性に対する耐性（すなわち、低減されたタンパク質分解に対する感受性）、低減された凝集、増加した溶解度、および変更された温度プロファイルなどの特性が挙げられるがこれらに限定されない。追加の実施形態では、用語は、スクロースホスホリラーゼ酵素の少なくとも１つの改善された特性を参照して使用される。一部の実施形態では、本発明は、参照スクロースホスホリラーゼポリペプチドおよび／または野生型スクロースホスホリラーゼポリペプチド、および／または別の操作されたスクロースホスホリラーゼポリペプチドと比べて任意の酵素特性の改善を呈する操作されたスクロースホスホリラーゼポリペプチドを提供する。このため、「改善」レベルを決定し、野生型ならびに操作されたスクロースホスホリラーゼを含む様々なスクロースホスホリラーゼポリペプチドの間で比べることができる。
本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」および「増強された触媒活性」は、操作されたポリペプチドの改善された特性を指し、これは、参照酵素と比べた比活性の増加（例えば、産生された産物／時間／重量タンパク質）、または基質の産物へのパーセント変換の増加（例えば、指定された量の酵素を使用して指定された期間での基質の開始量の産物へのパーセント変換）によって表され得る。一部の実施形態では、用語は、本明細書に提供される操作されたスクロースホスホリラーゼポリペプチドの改善された特性を指し、これは、参照スクロースホスホリラーゼ酵素と比べて比活性の増加（例えば、産生された産物／時間／重量タンパク質）、または基質の産物へのパーセント変換の増加（例えば、指定された量のスクロースホスホリラーゼを使用して指定された期間での基質の開始量の産物へのパーセント変換）によって表され得る。一部の実施形態では、用語は、本明細書に提供される改善されたスクロースホスホリラーゼ酵素を参照して使用される。本発明の操作されたスクロースホスホリラーゼの酵素活性を決定する例示的な方法を実施例に提供する。Ｋｍ、Ｖｍａｘ、またはｋｃａｔの古典的酵素特性を含む、その変化が増加した酵素活性を導き得る酵素活性に関する任意の特性が影響を受け得る。例えば、酵素活性の改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、天然に存在するスクロースホスホリラーゼゼまたはスクロースホスホリラーゼポリペプチドが由来する別の操作されたスクロースホスホリラーゼの２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍もの酵素活性、またはそれより高い酵素活性であり得る。
本明細書で使用される場合、「変換」は、基質の対応する産物への酵素的変換（または生体内変換）を指す。「パーセント変換」は、指定された条件下で一定期間内に産物に変換された基質のパーセントを指す。このように、スクロースホスホリラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、指定された期間内での基質の産物への「パーセント変換」として表現され得る。
「ゼネラリスト（ｇｅｎｅｒａｌｉｓｔ）特性」を有する酵素（または「ゼネラリスト酵素」）は、親配列と比べて広範囲の基質に関して改善された活性を呈する酵素を指す。ゼネラリスト酵素は必ずしもあらゆる可能性がある基質に関して改善された活性を実証する必要はない。一部の実施形態では、本発明は、それらが広範囲の立体的および電子的に多様な基質に関して親遺伝子と比較して類似または改善された活性を実証するという点において、ゼネラリスト特性を有するスクロースホスホリラーゼバリアントを提供する。加えて、本明細書に提供されるゼネラリスト酵素は、代謝物／産物の産生を増加させるために広範囲の多様な分子にわたって改善されるように操作された。
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本明細書で使用される場合、核酸ハイブリッドが安定である条件を指す。当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般的に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含有量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値は、融解温度の予測に関する公知の方法を使用して計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１６８：７６１－７７７ ［１９８９］； Ｂｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：１３９０ ［１９６２］； Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：８８９３－８８９７ ［１９８６］； Ｆｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：９３７３－９３７７ ［１９８６］； Ｋｉｅｒｚｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５：７８４０－７８４６ ［１９８６］； Ｒｙｃｈｌｉｋ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８：６４０９－６４１２ ［１９９０］ （ｅｒｒａｔｕｍ、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：６９８ ［１９９１］）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、ｓｕｐｒａ）； Ｓｕｇｇｓ ｅｔ ａｌ．、１９８１、ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ． ［ｅｄｓ．］、ｐｐ． ６８３－６９３、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ ［１９８１］；およびＷｅｔｍｕｒ、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６：２２７－２５９ ［１９９１］を参照されたい）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示のポリペプチドをコードし、定義された条件、例えば中等度にストリンジェントなまたは高ストリンジェント条件下で本発明の操作されたスクロースホスホリラーゼ酵素をコードする配列の相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にハイブリダイズする。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件を指す。一般的に、ハイブリダイゼーション反応は、低ストリンジェンシー条件下で実施した後、様々な、しかしより高いストリンジェンシーでの洗浄を実施する。用語「中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性、標的ポリヌクレオチドに対して約９０％より高い同一性を有する相補的核酸に標的ＤＮＡが結合するのを可能にする条件を指す。例示的な中等度のストリンジェント条件は、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーションの後に、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃での洗浄と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は一般的に、定義されたポリヌクレオチド配列に関する溶液条件下で決定された熱融解温度Ｔｍより約１０℃またはそれ未満である条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成するそれらの核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中、６５℃で安定でない場合、本明細書で企図されるように高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃と同等の条件下でのハイブリダイゼーションの後に、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄によって提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（重量／体積）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６５℃でのハイブリダイゼーションと同等の条件でのハイブリダイゼーション、および０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中、６５℃での洗浄である。他の高ストリンジェンシー条件、ならびに中等度のストリンジェント条件は上で引用した参考文献に記載されている。
本明細書で使用される場合、「コドン最適化」は、コードされるタンパク質が目的の生物において効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを特定の生物において優先的に使用されるコドンに変化させることを指す。遺伝子コードは、ほとんどのアミノ酸が、「同義」または「同義的」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点において縮重しているが、特定の生物によるコドン使用が非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることは周知である。このコドン使用バイアスは、所定の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、低いコピー数のタンパク質との比較での高度に発現されたタンパク質、および生物のゲノムの総タンパク質コード領域に関して、より高くなり得る。一部の実施形態では、スクロースホスホリラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物における最適な産生に関してコドン最適化され得る。
本明細書で使用される場合、「好ましい」、「最適な」、および「高いコドン使用バイアス」のコドンは、単独でまたは組み合わせて使用する場合、同じアミノ酸をコードする他のコドンより高い頻度でタンパク質コード領域において使用されるコドンを互換的に指す。好ましいコドンは、単一の遺伝子におけるコドン使用、共通の機能または起源の遺伝子セット、高度に発現された遺伝子、生物全体の総タンパク質コード領域におけるコドン頻度、近縁の生物の総タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはその組合せに関連して決定され得る。その頻度が遺伝子発現レベルと共に増加するコドンは典型的に、発現に関して最適なコドンである。例えばクラスター解析または対応解析を使用する多変量解析を含む、コドン頻度（例えば、コドン使用、相対的同義コドン使用）、および具体的な生物におけるコドン選好性、および遺伝子において使用されるコドンの有効数を決定するための多様な方法が公知である（例えば、ＧＣＧ ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ； ＣｏｄｏｎＷ、Ｐｅｄｅｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ； ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．、１４：３７２－７３ ［１９９８］； Ｓｔｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２２４３７－４６ ［１９９４］；およびＷｒｉｇｈｔ、Ｇｅｎｅ ８７：２３－２９ ［１９９０］を参照されたい）。コドン使用表は、多くの異なる生物に利用可能である（例えば、Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：２１１１－２１１８ ［１９９２］； Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８：２９２ ［２０００］； Ｄｕｒｅｔ、ｅｔ ａｌ．、ｓｕｐｒａ； Ｈｅｎａｕｔ ａｎｄ Ｄａｎｃｈｉｎ、ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ、ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、ｐ． ２０４７－２０６６ ［１９９６］を参照されたい）。コドン使用を得るためのデータ供給源は、タンパク質をコードすることが可能な任意の利用可能なヌクレオチド配列に依存し得る。これらのデータセットは、発現されたタンパク質（例えば、完全なタンパク質コード配列－ＣＤＳ）、発現された配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の予測されるコード領域（例えば、Ｍｏｕｎｔ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ ８、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ． ［ ２００１］； Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６：２５９－２８１ ［１９９６］；およびＴｉｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．、１３：２６３－２７０ ［１９９７］を参照されたい）をコードすることが実際に公知の核酸配列を含む。
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現にとって必要または有利である全ての構成要素を含む。各々の制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブまたは外来であり得る。そのような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列、および転写ターミネーターが挙げられるがこれらに限定されない。少なくとも制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的のためにリンカーと共に提供され得る。
「作動可能に連結された」は、本明細書において制御配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を方向付けるまたは調節するように、目的のポリヌクレオチドと比較した位置に制御配列が適切に置かれる（すなわち、機能的な関係で）構成として定義される。
「プロモーター配列」は、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、切断型、およびハイブリッドプロモーターを含む、選ばれる宿主細胞において転写活性を示し、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る任意の核酸配列であり得る。
語句「適した反応条件」は、本発明のスクロースホスホリラーゼポリペプチドが、基質を所望の産物化合物に変換することが可能である酵素変換反応溶液中の条件（例えば、酵素負荷の範囲、基質負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒など）を指す。一部の例示的な「適した反応条件」を本明細書に提供する。
本明細書で使用される場合、「負荷」、例えば「化合物の負荷」または「酵素負荷」は、反応の開始時の反応混合物中の構成要素の濃度または量を指す。
本明細書で使用される場合、酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、本明細書に提供される操作された酵素（例えば、操作されたスクロースホスホリラーゼポリペプチド）によって作用する化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、反応からの産物（例えば、デオキシリボースリン酸アナログ）の収量の「増加」は、反応の間に存在する特定の構成要素（例えば、スクロースホスホリラーゼ酵素）が同じ基質および他の置換基による同じ条件下で行われた反応と比べてより多くの産物を産生させる場合に発生するが、目的の構成要素の非存在下では発生しない。
反応は、反応の触媒に関与する他の酵素と比べてその酵素の量が、約２％未満、約１％未満、または約０．１％（重量／重量）未満である場合、特定の酵素を「実質的に含まない」と言われる。
本明細書で使用される場合、液体（例えば、培養ブロス）を「分画する」とは、分離プロセス（例えば、塩析、カラムクロマトグラフィー、サイズ排除、および濾過）、またはそのようなプロセスの組合せを適用して、所望のタンパク質が最初の液体産物中より溶液中で高いパーセンテージの総タンパク質を含む溶液を提供することを意味する。
本明細書で使用される場合、「開始組成物」は、少なくとも１つの基質を含む任意の組成物を指す。一部の実施形態では、開始組成物は、任意の適した基質を含む。
本明細書で使用される場合、酵素変換プロセスの文脈における「産物」は、基質に及ぼす酵素ポリペプチドの作用に起因する化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、「平衡化」は、本明細書で使用される場合、化学または酵素反応の順方向速度定数および逆方向速度定数によって決定した場合に、立体異性体の相互変換を含む、化学または酵素反応（例えば、２つの種ＡおよびＢの相互変換）において化学種の定常状態濃度をもたらすプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、直鎖または分岐鎖のいずれかの１～１８個（両端の値を含む）の炭素原子、より好ましくは１～８個（両端の値を含む）の炭素原子、および最も好ましくは１～６個（両端の値を含む）の炭素原子の飽和炭化水素基を指す。指定された数の炭素原子を有するアルキルを括弧内に示す（例えば、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルは、炭素原子１～４個のアルキルを指す）。
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有するが、必要に応じて１つより多くの二重結合を含有する直鎖または分岐鎖のいずれかの２～１２個（両端の値を含む）の炭素原子の基を指す。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含有するが、必要に応じて１つより多くの三重結合を含有し、加えて必要に応じて１つまたは複数の二重結合部分を含有する直鎖または分岐鎖のいずれかの２～１２個（両端の値を含む）の炭素原子の基を指す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、およびヘテロアルキニル」は、１つまたは複数の炭素原子が各々独立して同じまたは異なるヘテロ原子またはヘテロ原子基に交換されている、本明細書で定義されるアルキル、アルケニル、およびアルキニルを指す。炭素原子を交換することができるヘテロ原子および／またはヘテロ原子基としては、その組合せを含む－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｏ－、－ＮＲα－、－ＰＨ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２、－Ｓ（Ｏ）ＮＲα－、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲα－などが挙げられるがこれらに限定されず、各々のＲαは、水素、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される。
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、Ｒβが上記で定義されたアルキル基であり、これには、やはり本明細書で定義される必要に応じて置換されたアルキル基が含まれる、－ＯＲβ基を指す。
本明細書で使用される場合、「アリール」は、単環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルまたはアンスリル）を有する６～１２個（両端の値を含む）の炭素原子の不飽和芳香族炭素環基を指す。例示的なアリールとしては、フェニル、ピリジル、ナフチルなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「アミノ」は、－ＮＨ２基を指す。置換されたアミノは、－ＮＨＲδ、ＮＲδＲδ、およびＮＲδＲδＲδ基を指し、各々のＲδは、置換または非置換のアルキル、シクロアルキル、シクロへテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから独立して選択される。典型的なアミノ基としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ、フラニル－オキシ－スルファミノなどが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「オキソ」は、＝Ｏを指す。
本明細書で使用される場合、「オキシ」は、二価の基－Ｏ－を指し、これは様々な置換基を有し、エーテルおよびエステルを含む異なるオキシ基を形成し得る。
本明細書で使用される場合、「カルボキシ」は、－ＣＯＯＨを指す。
本明細書で使用される場合、「カルボニル」は、多様な置換基を有し、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステル、およびケトンを含む異なるカルボニル基を形成し得る－Ｃ（Ｏ）－を指す。
本明細書で使用される場合、「アルキルオキシカルボニル」は、－Ｃ（Ｏ）ＯＲεを指し、Ｒεは、必要に応じて置換され得る本明細書で定義されるアルキル基である。
本明細書で使用される場合、「アミノカルボニル」は、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を指す。置換されたアミノカルボニルは、－Ｃ（Ｏ）ＮＲδＲδを指し、アミノ基ＮＲδＲδは本明細書で定義される通りである。
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」および「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシ」は、－ＯＨを指す。
本明細書で使用される場合、「シアノ」は、－ＣＮを指す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、１～１０個（両端の値を含む）の炭素原子、ならびに環内に酸素、窒素、および硫黄から選択される１～４個（両端の値を含む）のヘテロ原子の芳香族複素環式基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単環（例えば、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有し得る。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキル」は、好ましくはアルキル部分に１～６個（両端の値を含む）の炭素原子を有し、ヘテロアリール部分に５～１２個（両端の値を含む）の環原子を有する、ヘテロアリールによって置換されたアルキル（すなわち、ヘテロアリール－アルキル基）を指す。そのようなヘテロアリールアルキル基は、ピリジルメチルなどによって例示される。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルケニル」は、好ましくはアルケニル部分に２～６個（両端の値を含む）の炭素原子を有し、ヘテロアリール部分に５～１２個（両端の値を含む）の環原子を有する、ヘテロアリールによって置換されたアルケニル（すなわち、ヘテロアリール－アルケニル基）を指す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキニル」は、好ましくはアルキニル部分に２～６個（両端の値を含む）の炭素原子を有し、ヘテロアリール部分に５～１２個（両端の値を含む）の環原子を有する、ヘテロアリールによって置換されたアルキニル（すなわち、ヘテロアリール－アルキニル基）を指す。
本明細書で使用される場合、「複素環」、「複素環式」、および互換的に「ヘテロシクロアルキル」は、２～１０個（両端の値を含む）の炭素環原子および環内に窒素、硫黄、または酸素から選択される１～４個（両端の値を含む）のヘテロ環原子の単環または複数の縮合環を有する飽和または不飽和基を指す。そのような複素環式基は、単環（例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフラン、またはキヌクリジニル）を有し得る。複素環の例としては、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「員環」とは、任意の環状構造を包含することを意味する。用語「員」の前の数字は、環を構成する骨格原子の数を示す。このように、例えばシクロヘキシル、ピリジン、ピランおよびチオピランは６員環であり、シクロペンチル、ピロール、フラン、およびチオフェンは５員環である。
特に指定されない限り、前述の基において水素が占有している位置を、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換されたアルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換されたアルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換されたスルホンアミド、シアノ、アミノ、置換されたアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ（ａｍｉｄｏｘｉｍｏ）、ヒドロキサモイル、フェニル、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、複素環、（複素環）オキシ、および（複素環）アルキルによって例示されるがこれらに限定されない置換基によってさらに置換することができ；好ましいヘテロ原子は酸素、窒素、および硫黄である。これらの置換基にオープン価数（ｏｐｅｎ ｖａｌｅｎｃｅ）が存在する場合、それらをアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、および／または複素環式基によってさらに置換することができ、これらのオープン価数が炭素に存在する場合、それらをハロゲンおよび酸素、窒素、または硫黄結合置換基によってさらに置換することができ、ならびに複数のそのようなオープン価数が存在する場合、結合の直接形成によって、または新規ヘテロ原子、好ましくは酸素、窒素、もしくは硫黄に対する結合を形成することによってのいずれかで、これらの基を結び付けて環を形成することができると理解される。上記の置換は、水素を置換基に交換することによって、本発明の分子に対して許容されない不安定性が導入されず、それ以外は化学的に妥当であることを条件として行うことができるとさらに理解される。
本明細書で使用される場合、用語「培養する」は、任意の適した条件下で（例えば、液体、ゲル、または固体培地を使用して）微生物細胞の集団を成長させることを指す。
組換えポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の適した方法を使用して産生することができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子をベクター、例えばプラスミドにクローニングし、所望の宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉなどにおいて発現させることができる。組換えポリペプチドのバリアントは、当技術分野で公知の様々な方法によって生成することができる。実際に、当業者に周知の広く多様な異なる変異誘発技術がある。加えて、変異誘発キットもまた、多くの市販の分子生物学供給元から入手可能である。方法は、規定のアミノ酸での特異的置換（部位特異的）、遺伝子の局所領域における特異的またはランダム変異（領域特異的）、または遺伝子全体のランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を行うために利用可能である。酵素バリアントを生成するために多数の適した方法が当業者に公知であり、これらにはＰＣＲを使用する一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、および化学飽和変異誘発、または当技術分野で公知の他の任意の適した方法が挙げられるがこれらに限定されない。変異誘発および定向進化方法を酵素コードポリヌクレオチドに容易に適用してバリアントライブラリを生成することができ、これらを発現、スクリーニング、およびアッセイすることができる。任意の適した変異誘発および定向進化方法が、本発明において有用であり、当技術分野で周知である（例えば、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２６５，２０１号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３３７，１８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８３，０１１号、同第６，４８４，１０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５００，６１７号、同第６，５００，６３９号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１８，０６５号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６０５，４３０号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，６８６，５１５号、同第６，７０３，２４０号、同第６，７１６，６３１号、同第６，８２５，００１号、同第６，９０２，９２２号、同第６，９１７，８８２号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２２０，５６６号、同第７，２８８，３７５号、同第７，３８４，３８７号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，４６２，４６９号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，８７３，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９８１，６１４号、同第８，０１４，９６１号、同第８，０２９，９８８号、同第８，０４８，６７４号、同第８，０５８，００１号、同第８，０７６，１３８号、同第８，１０８，１５０号、同第８，１７０，８０６号、同第８，２２４，５８０号、同第８，３７７，６８１号、同第８，３８３，３４６号、同第８，４５７，９０３号、同第８，５０４，４９８号、同第８，５８９，０８５号、同第８，７６２，０６６号、同第８，７６８，８７１号、同第９，５９３，３２６号、および全ての関連する米国、ならびにＰＣＴおよび非米国対応物；Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５４（２）：１５７－７８ ［１９９７］； Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、５７：３６９－７４ ［１９９６］； Ｓｍｉｔｈ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．、１９：４２３－４６２ ［１９８５］； Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１１９３－１２０１ ［１９８５］； Ｃａｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２３７：１－７ ［１９８６］； Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、３８：８７９－８８７ ［１９８４］； Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、３４：３１５－３２３ ［１９８５］； Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．、３：２８４－２９０ ［１９９９］； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：２５９－２６４ ［１９９９］； Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：２８８－２９１ ［１９９８］； Ｃｒａｍｅｒｉ、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：４３６－４３８ ［１９９７］； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：４５０４－４５０９ ［１９９７］； Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：３１５－３１９ ［１９９６］； Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９－３９１ ［１９９４］； Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１：１０７４７－１０７５１ ［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７；およびＷＯ２００９／１５２３３６を参照されたい）。
一部の実施形態では、変異誘発処理後に得られた酵素クローンを、酵素調製物を規定の温度（または他のアッセイ条件）に供すること、および熱処理または他の適したアッセイ条件後に残っている酵素活性の量を測定することによってスクリーニングする。次にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを、遺伝子から単離し、シーケンシングしてヌクレオチド配列変化（もしあれば）を同定し、宿主細胞において酵素を発現させるために使用する。発現ライブラリから酵素活性を測定することは、当技術分野で公知の任意の適切な方法（例えば、標準的な生化学技術、例えばＨＰＬＣ分析）を使用して実施することができる。
バリアントが産生された後、それらを任意の所望の特性（例えば、高いもしくは増加した活性、または低いもしくは低減された活性、増加した熱活性（ｔｈｅｒｍａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）、増加した熱安定性、および／または酸性ｐＨ安定性など）に関してスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換えスクロースホスホリラーゼポリペプチド」（本明細書において「操作されたスクロースホスホリラーゼポリペプチド」、「バリアントスクロースホスホリラーゼ酵素」、「スクロースホスホリラーゼバリアント」、および「スクロースホスホリラーゼコンビナトリアルバリアント」とも呼ばれる）は有用である。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドの適した宿主での発現をもたらすことが可能な、適した制御配列に作動可能に連結された発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を駆動するためにＤＮＡ配列（例えば、トランスジーン）に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、転写、転写後改変、翻訳、および翻訳後改変が挙げられるがこれらに限定されないポリペプチドの産生に伴う任意のステップを含む。一部の実施形態では、用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、用語「産生する」は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生を指す。用語は、転写、転写後改変、翻訳、および翻訳後改変が挙げられるがこれらに限定されないポリペプチドの産生に伴う任意のステップを包含する。一部の実施形態では、用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など）は、２つの配列が天然で会合していない場合、作動可能に連結された別の配列に対して「異種」である。例えば、「異種ポリヌクレオチド」は、実験技術によって宿主細胞に導入される任意のポリペプチドであり、宿主細胞から除去され、実験室における操作に供された後、宿主細胞に再導入されたポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書に提供されるＤＮＡ（例えば、スクロースホスホリラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド）を含む発現ベクターに適した宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターによって形質転換されているまたはトランスフェクトされている原核細胞または真核細胞である。
用語「アナログ」は、参照ポリペプチドと７０％より高い配列同一性であるが１００％未満の配列同一性（例えば、７５％より高い、７８％より高い、８０％より高い、８３％より高い、８５％より高い、８８％より高い、９０％より高い、９１％より高い、９２％より高い、９３％より高い、９４％より高い、９５％より高い、９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、９９％より高い配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンを含むがこれらに限定されない１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸残基ならびに天然に存在するアミノ酸を含有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログはまた、１つまたは複数のＤ－アミノ酸残基および２つまたはそれより多くのアミノ酸残基の間の非ペプチド連結も含む。
用語「有効量」は、所望の結果を生み出すための十分な量を意味する。当業者は、ルーチンの実験を使用することによって有効量がどれかを決定し得る。
用語「単離された」および「精製された」は、それが天然に会合する少なくとも１つの他の構成要素から除去された分子（例えば単離された核酸、ポリペプチドなど）または他の構成要素を指すために使用される。用語「精製された」は、絶対的な純度を必要とするのではなく、むしろ相対的な定義として意図される。
本明細書で使用される場合、「立体選択性」は、化学反応または酵素反応において１つの立体異性体が別の立体異性体より優先的に形成されることを指す。立体選択性は、１つの立体異性体の形成が他方より好ましい場合は部分的であり得るか、または１つのみの立体異性体が形成される場合には完全であり得る。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性はエナンチオ選択性と呼ばれ、これは両者の合計における１つのエナンチオマーの割合（典型的にはパーセンテージとして報告される）である。これは一般に当技術分野において代替的に、式［主エナンチオマー－副エナンチオマー］／［主エナンチオマー＋副エナンチオマー］に従って計算されるエナンチオマー過剰率（「ｅ．ｅ．」）として（典型的にパーセンテージとして）報告される。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性はジアステレオ選択性と呼ばれ、２つのジアステレオマーの混合物中の１つのジアステレオマーの割合（典型的にパーセンテージとして報告される）であり、一般にはジアステレオマー過剰率（「ｄ．ｅ．」）として代替的に報告される。エナンチオマー過剰率およびジアステレオマー過剰率は、ステレオマー過剰率のタイプである。
本明細書で使用される場合、「位置選択性」、および「位置選択的反応」は、結合を行うまたは切断する１つの方向が他の可能性がある全ての方向に対して優先的に発生する反応を指す。反応は、識別が完全である場合は完全に（１００％）位置選択的であり、１つの部位での反応産物が他の部位での反応産物より多い場合には、実質的に位置選択的（少なくとも７５％）、または部分的に位置選択的（ｘ％、ここでパーセンテージは目的の反応に応じて設定される）であり得る。
本明細書で使用される場合、「化学選択性」は、化学反応または酵素反応において１つの産物が別の産物より優先的に形成されることを指す。
本明細書で使用される場合、「ｐＨ安定な」は、高いまたは低いｐＨ（例えば、４．５～６または８～１２）に一定期間（例えば、０．５～２４時間）曝露された後に、処理されていない酵素と比べて類似の活性（例えば、６０％より多くから８０％）を維持するスクロースホスホリラーゼポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「熱安定な」は、上昇した温度（例えば、４０～８０℃）に一定期間（例えば、０．５～２４時間）曝露された後に、同じ上昇した温度に曝露された野生型酵素と比べて類似の活性（例えば、６０％より多くから８０％）を維持するスクロースホスホリラーゼポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「溶媒安定な」は、様々な濃度（例えば、５～９９％）の溶媒（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルなど）に一定期間（例えば、０．５～２４時間）曝露された後に、同じ濃度の同じ溶媒に曝露された野生型酵素と比べて類似の活性（例えば、６０％より多くから８０％）を維持するスクロースホスホリラーゼポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「熱および溶媒安定な」とは、熱安定かつ溶媒安定であるスクロースホスホリラーゼポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「必要に応じた」、および「必要に応じて」とは、その後に記載される事象または状況が発生してもよく発生しなくてもよいこと、および記載が、事象または状況が発生する場合と発生しない場合を含むことを意味する。当業者は、１つまたは複数の必要に応じた置換基を含有すると記載された任意の分子に関して、立体的に現実的でおよび／または合成的に実現可能な化合物のみが含まれることを意味すると理解するであろう。
本明細書で使用される場合、「必要に応じて置換された」とは、化学基の用語またはシリーズにおける全てのその後の修飾子を指す。例えば、「必要に応じて置換されたアリールアルキル」という用語では、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分は、置換されても置換されなくてもよく、シリーズの「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール」に関して、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール基は、他と独立して置換されても置換されなくてもよい。
発明の詳細な説明
本発明は、操作されたスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）酵素、ＳＰ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＳＰ酵素を産生する方法もまた提供される。本発明はさらに、ＳＰ酵素を含む組成物および操作されたＳＰ酵素を使用する方法を提供する。本発明は、薬学的化合物の産生において特に有用である。
一部の実施形態では、本発明は、ＭＫ－８５９１（Ｍｅｒｃｋ）などのヌクレオシドアナログの産生にとって適した酵素を提供する。本発明は、これらのヌクレオシドアナログを産生するための酵素の潜在的使用に取り組むために開発された。一部の実施形態では、本発明は、化合物（１）の非天然のヌクレオシドアナログのｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素的合成のための方法をもたらす化合物を産生するために役立つ酵素を提供する。
Figure 2022538230000001
非天然のヌクレオシドは、がんおよびウイルス感染症の処置のための薬物を含む多くの重要なクラスの薬物のための必須の構成要素である。少なくとも１ダースのヌクレオシドアナログ薬が市販されているか、または臨床試験中である（Ｊｏｒｄｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １２：４４７－４６４ ［２０１３］）。化合物（１）を作出する１つの方法は、スキームＩに示すように、エチニルリボース－１－リン酸、化合物（３）、およびフルオロアデニン、化合物（２）のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）触媒カップリングによる。
Figure 2022538230000002
デオキシリボース－１－リン酸化合物、例えば化合物（３）は、産生することは難しいことがある。しかし、対応するデオキシリボース－５－リン酸化合物は、酵素２－デオキシリボース－５－リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）によって触媒されるアセトアルデヒドおよびＤ－グリセルアルデヒド－３－リン酸（またはそのアナログ）のカップリングを介して産生することができる（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１２：２０１３－２０１４ ［１９９０］）。デオキシリボース－５－リン酸アナログ（４）が形成されると、これを、酵素ホスホペントムターゼ（ＰＰＭ）の作用によってスキームＩにとって必要な対応するデオキシリボース－１－リン酸アナログ（３）へと変換するか、または異性化させることができる。
スキームＩに示すＰＮＰおよびＰＰＭ反応の平衡位置は、典型的には、産物（化合物（Ｉ）および無機ホスフェート）ではなく、反応物（化合物（２）および（４））にとって有利である。反応をより高い変換へと駆動する１つのやり方は、カップリングステップにおいて形成される無機ホスフェートを除去することである。これは、酵素スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）によって触媒される、無機ホスフェートの、スクロースなどの二糖類との反応を行うことによって達成することができる（例えば、米国特許第７，２２９，７９７号を参照されたい）。グルコース－１－リン酸およびフルクトースを産生するこの反応は、非常に好ましく、以下のスキームＩＩに示される反応全体を駆動することができる。
Figure 2022538230000003
天然に存在するスクロースホスホリラーゼと比べて改善された特性を有する操作されたスクロースホスホリラーゼ酵素は、スキームＩＩＩに表される系を含む関連するプロセス条件下および／または多酵素系において生成され得る。これらの操作されたＳＰ酵素は、化合物（１）の改善された産生をもたらし得る、および／または他の改善された特性を有し得る。
Figure 2022538230000004
典型的な工業条件下で、および／または多酵素系の一部として作動する改善された活性を有する操作されたＳＰが必要である。本発明は、この必要性に取り組み、工業条件下でこれらおよび他の反応において使用するために適した操作されたＳＰを提供する。
一部の実施形態では、本開示の操作されたＳＰポリペプチドは、化合物（１）のヌクレオシドアナログなどの化合物を産生するための多酵素系の一部である。一部の実施形態では、操作されたＳＰポリペプチドは、以下の酵素：パントテン酸キナーゼ、ホスホペントムターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルドラーゼ、および／また酢酸キナーゼのうちの１つまたは複数を含む多酵素系の一部である。
操作されたＳＰポリペプチド
本発明は、操作されたＳＰポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを調製する方法、およびポリペプチドを使用する方法を提供する。説明がポリペプチドに関する場合、これはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも記載すると理解されるべきである。一部の実施形態では、本発明は、野生型ＳＰ酵素と比べて改善された特性を有する操作された天然に存在しないＳＰ酵素を提供する。任意の適した反応条件が本発明において有用である。一部の実施形態では、異性化反応を実施するために操作されたポリペプチドの改善された特性を分析するために方法を使用する。一部の実施形態では、反応条件は、以下および実施例に詳しく記載するように、操作されたＳＰの濃度または量、基質、緩衝液、溶媒、ｐＨ、温度および反応時間を含む条件、ならびに／または操作されたＳＰポリペプチドを固相支持体に固定する条件に関して改変されている。
一部の実施形態では、反応条件を補足するために追加の反応構成要素または追加の技術を利用する。一部の実施形態では、これらは、酵素を安定化するまたは不活化を防止する、産物阻害を低減する、反応の平衡を所望の産物形成へとシフトさせるための手段を講じることを含む。
一部のさらなる実施形態では、基質化合物を産物化合物に変換するための上記のプロセスのいずれかは、産物化合物の抽出、単離、精製、結晶化、濾過、および／または凍結乾燥から選択される１つまたは複数のステップをさらに含み得る。本明細書に提供されるプロセスによって産生された生物触媒反応混合物から産物を抽出、単離、精製、および／もしくは結晶化する方法、技術、およびプロトコールは当業者に公知であり、ならびに／またはルーチンの実験を通して手に入れることができる。加えて、実例となる方法を以下の実施例に提供する。
操作されたポリペプチドをコードする操作されたＳＰポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
本発明は、本明細書に記載の操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御してポリペプチドを発現することが可能な組換えポリヌクレオチドを作製する１つまたは複数の異種調節配列に作動可能に連結される。一部の実施形態では、操作された酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を、適切な宿主細胞に導入して、対応する酵素ポリペプチドを発現させる。
当業者に明らかであるように、タンパク質配列の利用可能性および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識により、本発明のポリペプチドをコードすることが可能な全てのポリヌクレオチドに関する説明が提供される。同じアミノ酸が代替または同義のコドンによってコードされる遺伝子コードの縮重により、その全てが操作された酵素（例えば、ＳＰ）ポリペプチドをコードする極めて多数の核酸を作出することができる。このように、本発明は、可能性があるコドン選択に基づいて組合せを選択することによって、作出することができ、本明細書に記載の酵素ポリペプチドをコードする酵素ポリヌクレオチドのありとあらゆる可能性がある変形形態を産生するための方法および組成物を提供し、そのような全ての変形形態は、実施例（例えば、様々な表）に提示するアミノ酸配列を含む本明細書に記載の任意のポリペプチドに関して具体的に開示されていると考えるべきである。
一部の実施形態では、コドンは、好ましくはタンパク質産生のために選んだ宿主細胞によって利用されるように最適化される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは典型的に、細菌における発現のために使用される。そのため、操作された酵素ポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長のコード領域におけるコドン位置のうち約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の、または９０％超で好ましいコドンを含有する。
一部の実施形態では、酵素ポリヌクレオチドは、本明細書で開示される特性を有する酵素活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、本明細書に提供される配列番号から選択される参照配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、もしくはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列、または任意のバリアント（例えば、実施例に提供されるバリアント）のアミノ酸配列、および参照ポリヌクレオチドまたは実施例に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列と比べて１つもしくは複数の残基の差（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのアミノ酸残基位置）を含む。一部の実施形態では、参照ポリペプチド配列は配列番号２および４から選択される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に提供される任意のポリヌクレオチド配列もしくはその相補鎖、または本明細書に提供されるバリアント酵素ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態では、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、参照配列と比べて１つまたは複数の残基の差を有するアミノ酸配列を含む酵素ポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、本明細書の操作された酵素ポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、酵素ポリペプチドの発現を容易にするために多様なやり方で操作される。一部の実施形態では、酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、酵素ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために１つまたは複数の制御配列が存在する発現ベクターを含む。そのベクターに挿入する前に単離されたポリヌクレオチドを操作することは、利用される発現ベクターに応じて望ましいまたは必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変する技術は、当技術分野で周知である。一部の実施形態では、制御配列は、中でもプロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを含む。一部の実施形態では、適したプロモーターは、宿主細胞選択に基づいて選択される。細菌宿主細胞に関して、本開示の核酸構築物の転写を方向付けるための適したプロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物ベータ－ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５： ３７２７－３７３１ ［１９７８］を参照されたい）から得られるプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２１－２５ ［１９８３］を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。糸状菌宿主細胞の例示的なプロモーターとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、ＷＯ９６／００７８７を参照されたい）の遺伝子から得られたプロモーター、ならびにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの変異体、切断型、およびハイブリッドプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞の他の役立つプロモーターは当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｙｅａｓｔ ８：４２３－４８８ ［１９９２］を参照されたい）。
一部の実施形態では、制御配列はまた、適した転写ターミネーター配列（すなわち、転写を終止させるために宿主細胞によって認識される配列）でもある。一部の実施形態では、ターミネーター配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選ばれる宿主細胞において機能的である任意の適したターミネーターが、本発明において有用である。糸状菌宿主細胞の例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞の例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞の他の役立つターミネーターは、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．、上記を参照されたい）。
一部の実施形態では、制御配列はまた、適したリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）でもある。一部の実施形態では、リーダー配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選ばれる宿主細胞において機能的である任意の適したリーダー配列が本発明において有用である。糸状菌宿主細胞の例示的なリーダーとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の適したリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
一部の実施形態では、制御配列はまた、ポリアデニル化配列（すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写されると、ポリアデノシン残基を転写されたｍＲＮＡに付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）でもある。選ばれる宿主細胞において機能的である任意の適したポリアデニル化配列が本発明において有用である。糸状菌宿主細胞の例示的なポリアデニル化配列としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼの遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞に関して役立つポリアデニル化配列は公知である（例えば、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、１５：５９８３－５９９０ ［１９９５］を参照されたい）。
一部の実施形態では、制御配列はまた、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路へと方向付けるコード領域）でもある。一部の実施形態では、核酸配列のコード配列の５’末端はもともと、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントとの翻訳読み取り枠で天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を含有する。あるいは、一部の実施形態では、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード領域を含有する。発現されたポリペプチドを選ばれる宿主細胞の分泌経路に方向付ける任意の適したシグナルペプチドコード領域が、操作されたポリペプチドの発現にとって有用である。細菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ １１８３７マルトジェニックアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ－アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ－ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から得られた領域が挙げられるがこれらに限定されない領域を含む、シグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドが当技術分野で公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．、５７：１０９－１３７ ［１９９３］を参照されたい）。一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード領域としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得たシグナルペプチドコード領域が挙げられるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞の役立つシグナルペプチドとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子からのシグナルペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもある。得られたポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」、または「酵素前駆体」と呼ばれる。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって成熟活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼ（例えば、ＷＯ９５／３３８３６を参照されたい）の遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない任意の適した供給源から得られ得る。シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
一部の実施形態では、調節配列もまた利用される。これらの配列は、宿主細胞の成長と比較してポリペプチドの発現の調節を容易にする。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにする系である。原核宿主細胞では、適した調節配列としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレーター系が挙げられるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞では、適した調節系としては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられるがこれらに限定されない。糸状菌では、適した調節配列としては、ＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
別の態様では、本発明は、それらが導入される宿主のタイプに応じて、操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および１つまたは複数の発現調節領域、例えばプロモーターおよびターミネーター、複製起点などを含む組換え発現ベクターを対象とする。一部の実施形態では、本明細書に記載される様々な核酸および制御配列を共に結び付け、そのような部位での酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にするために１つまたは複数の簡便な制限部位を含む組換え発現ベクターを産生する。あるいは、一部の実施形態では、本発明の核酸配列は、核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を発現のために適切なベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターの作製を伴う一部の実施形態では、コード配列は、コード配列が発現のために適切な制御配列と作動可能に連結されるようにベクターに配置される。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供され、酵素ポリヌクレオチド配列の発現を引き起こすことができる任意の適したベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とベクターとの適合性に依存する。ベクターは、線形または閉じた環状プラスミドであり得る。
一部の実施形態では、発現ベクターは、自律複製ベクター（すなわち、その複製が染色体複製とは無関係である染色体外実体として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有し得る。一部の代替の実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されるとそれがゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と共に複製するベクターである。さらに、一部の実施形態では、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入される総ＤＮＡを共に含有する２つもしくはそれより多くのベクターもしくはプラスミド、および／またはトランスポゾンが利用される。
一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１つまたは複数の選択可能マーカーを含有する。「選択可能マーカー」は、その産物が殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌選択可能マーカーの例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、もしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞の適したマーカーとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が挙げられるがこれらに限定されない。糸状菌宿主細胞において使用するための選択可能マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにその等価物が挙げられるがこれらに限定されない。
別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの操作された酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ポリヌクレオチドが宿主細胞における操作された酵素の発現のための１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現に使用するために適した宿主細胞は当技術分野で周知であり、細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な宿主細胞はまた、様々なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）も含む。細菌選択可能マーカーの例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、および もしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、本発明の発現ベクターは、ベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込みまたはゲノムとは無関係に細胞におけるベクターの自律複製を可能にするエレメントを含有する。宿主細胞ゲノムへの組み込みを伴う一部の実施形態では、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、または相同組換えもしくは非相同組換えによってベクターをゲノムに組み込むためのベクターの他の任意のエレメントに依存する。
一部の代替の実施形態では、発現ベクターは、相同組み替えによる宿主細胞のゲノムへの組み込みを方向付ける追加の核酸配列を含有する。追加の核酸配列は、染色体における正確な位置に宿主細胞ゲノムにベクターを組み込むことを可能にする。正確な位置での組み込みの可能性を増加させるために、組み込みエレメントは好ましくは十分数のヌクレオチド、例えば１００～１０，０００塩基対、好ましくは４００～１０，０００塩基対、および最も好ましくは８００～１０，０００塩基対を含有し、これは相同組み替えの確率を増強するために対応する標的配列と高度に相同である。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノムにおいて標的配列と相同である任意の配列であり得る。さらに、組み込みエレメントは、非コードまたはコード核酸配列であり得る。他方、ベクターは、非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
自律複製の場合、ベクターは、ベクターが当該宿主細胞において自律的に複製することを可能にする複製起点をさらに含み得る。細菌の複製起点の例としては、Ｐ１５Ａ ｏｒｉ、またはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣｌ７７（プラスミドがＰ１５Ａ ｏｒｉを有する）、もしくはｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、もしくはｐＴＡ１０６０である。酵母宿主細胞に使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せである。複製起点は、宿主細胞においてその機能を温度感受性にする変異を有する複製起点であり得る（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：１４３３ ［１９７８］を参照されたい）。
一部の実施形態では、遺伝子産物の産生を増加させるために、本発明の核酸配列の１つより多くのコピーを宿主細胞に挿入する。核酸配列のコピー数の増加は、宿主細胞ゲノムに配列の少なくとも１つの追加のコピーを組み込むこと、または核酸配列と共に増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を含めることによって得ることができ、選択可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピーおよびそれによって核酸配列の追加のコピーを含有する細胞を、適切な選択可能な作用剤の存在下で細胞を培養することによって選択することができる。
本発明において使用するための発現ベクターの多くは市販されている。適した市販の発現ベクターとしては、哺乳動物宿主細胞における発現のためのＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリアデニル化部位を含み、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのｐＢＲ３２２複製起点およびアンピシリン耐性マーカーを含む、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクター（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられるがこれらに限定されない。他の適した発現ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（－）およびｐＢＫ－ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはｐＰｏｌｙ（例えば、Ｌａｔｈｅ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ ５７：１９３－２０１ ［１９８７］を参照されたい）に由来するプラスミドが挙げられるがこれらに限定されない。
このように、一部の実施形態では、少なくとも１つのバリアントスクロースホスホリラーゼをコードする配列を含むベクターを、ベクターの増殖およびバリアントスクロースホスホリラーゼの発現を可能にするために宿主細胞に形質転換する。一部の実施形態では、バリアントスクロースホスホリラーゼを翻訳後改変してシグナルペプチドを除去し、一部の例では、分泌後切断してもよい。一部の実施形態では、上記の形質転換された宿主細胞を、スクロースホスホリラーゼの発現を可能にする条件下で適した栄養培地中で培養する。適切な補給剤を含有する最小培地または複合培地を含むがこれらに限定されない、宿主細胞を培養するために役立つ任意の適した培地が本発明において有用である。一部の実施形態では、宿主細胞を、ＨＴＰ培地中で成長させる。適した培地は様々な販売元から入手可能であるか、または公開されたレシピに従って調製してもよい（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。
別の態様では、本発明は、本明細書に提供される改善されたスクロースホスホリラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチドは、宿主細胞においてスクロースホスホリラーゼ酵素を発現させるために１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるスクロースホスホリラーゼポリペプチドの発現に使用するための宿主細胞は、当技術分野で周知であり、細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。上記の宿主細胞に関する適切な培養培地および成長条件は、当技術分野で周知である。
スクロースホスホリラーゼを発現させるためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の様々な方法によって細胞に導入され得る。技術としては、中でも電気穿孔、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するための様々な方法が当業者に公知である。
一部の実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。適した真核宿主細胞としては、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。適した真菌宿主細胞としては、子嚢菌門、担子菌門、不完全菌門、接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、不完全菌類が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、真菌宿主細胞は、酵母細胞および糸状菌細胞である。本発明の糸状菌宿主細胞は、ＥｕｍｙｃｏｔｉｎａおよびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門の全ての糸状菌形態を含む。糸状菌は、キチン、セルロース、および他の複合多糖類で構成される細胞壁を有する栄養菌糸によって特徴付けられる。本発明の糸状菌宿主細胞は酵母とは形態学的に異なる。
本発明の一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、および／またはＶｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、および／またはその有性世代もしくは無性世代、ならびにその同義語、バシオニム（ｂａｓｉｏｎｙｍ）、またはその分類学上の等価物が挙げられるがこれらに限定されない、任意の適した属および種の細胞である。
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ種の細胞が挙げられるがこれらに限定されない酵母細胞である。本発明の一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は藻類細胞、例えばＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）である。
一部の他の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。適した原核細胞としては、グラム陽性、グラム陰性、およびグラム不定細菌細胞が挙げられるがこれらに限定されない。任意の適した細菌生物が本発明において有用であり、これにはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、またはＺｙｍｏｍｏｎａｓの種である。一部の実施形態では、細菌宿主株は、ヒトに対して非病原性である。一部の実施形態では、細菌宿主株は工業用株である。多数の工業用細菌株が公知であり、本発明において適している。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主株は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、およびＡ．ｒｕｂｉ）である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒｑｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、およびＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含むがこれらに限定されない工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、および／またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓである。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、およびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＣ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、およびＥ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａおよびＰ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、およびＰ．ｓｐ．Ｄ－０ｌ １０）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、およびＳ．ｕｂｅｒｉｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、およびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓおよびＺ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
本発明において有用である多くの原核生物および真核生物株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などの複数の培養コレクションから公共に容易に入手可能である。
一部の実施形態では、宿主細胞は、タンパク質分泌、タンパク質安定性、ならびに／またはタンパク質の発現および／もしくは分泌にとって望ましい他の特性を改善する特徴を有するように遺伝子改変される。遺伝子改変は、遺伝子操作技術および／または古典的な微生物学技術（例えば、化学的またはＵＶ変異誘発およびその後の選択）によって達成することができる。実際に、一部の実施形態では、組換え改変および古典的選択技術の組合せを使用して宿主細胞を産生する。組換え技術を使用して、宿主細胞内および／または培養培地中でのスクロースホスホリラーゼバリアントの収量の増加をもたらすように、核酸分子を導入、欠失、阻害、または改変することができる。例えば、Ａｌｐ１機能のノックアウトは、プロテアーゼ欠損である細胞をもたらし、ｐｙｒ５機能のノックアウトはピリミジン欠損表現型を有する細胞をもたらす。１つの遺伝子操作アプローチでは、相同組換えを使用して、遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで特異的に標的化することによって標的化遺伝子改変を誘導し、コードされるタンパク質の発現を抑制する。代替のアプローチでは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよび／またはリボザイム技術は、遺伝子発現を阻害するために有用である。細胞におけるタンパク質発現を低減させるために多様な方法が当技術分野で公知であり、これらには、タンパク質をコードする遺伝子の全てまたは一部の欠失、および遺伝子産物の発現または活性を破壊するための部位特異的変異誘発が挙げられるがこれらに限定されない（例えば、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８：２２ ｅ９７ ［２０００］； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃ． Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．、１９：７－１５ ［２００６］； Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｋｉｔａｍｏｔｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．、３０：１８１１－１８１７ ［２００８］； Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｏｍ．、２７２： ３４４－３５２ ［２００４］；およびＹｏｕ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９１：６１５－６２２ ［２００９］を参照されたい）。ランダム変異誘発後の所望の変異に関するスクリーニングもまた有用である（例えば、その両方が参照により組み込まれる、Ｃｏｍｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．、２２０：１４１－８ ［２００３］；およびＦｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｋａｒｙ． Ｃｅｌｌ ２：２４７－５５ ［２００３］を参照されたい）。
ベクターまたはＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入することは、当技術分野で公知の任意の適した方法を使用して達成することができ、これらの方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ＰＥＧ－媒介形質転換、電気穿孔、または当技術分野で公知の他の一般的な技術が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ発現ベクターｐＣＫ１００９００ｉ（これにより参照により組み込まれる、米国特許第９，７１４，４３７号を参照されたい）が有用である。
一部の実施形態では、本発明の操作された宿主細胞（すなわち、「組換え宿主細胞」）は、プロモーターを活性化するため、形質転換体を選択するため、またはスクロースホスホリラーゼポリヌクレオチドを増幅するために適切となるように改変された従来の栄養培地中で培養される。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞に関して以前に使用された条件であり、当業者に周知である。記載したように、細菌、植物、動物（特に哺乳動物）および古細菌（ａｒｃｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌ）起源の細胞を含む多くの細胞の培養および産生に関して、多くの標準的な参考文献およびテキストが利用可能である。
一部の実施形態では、本発明のバリアントスクロースホスホリラーゼポリペプチドを発現する細胞は、回分発酵または連続発酵条件下で成長する。古典的な「回分発酵」は、閉鎖系であり、培地の組成を発酵の始めに設定し、発酵の間、人為的な変更に供されない。回分系の変形形態は、本発明において有用である「流加培養発酵」である。この変形形態では、基質は発酵が進行するにつれて徐々に添加される。流加系は、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性がある場合、および培地中の基質の量を限定することが望ましい場合に役に立つ。回分発酵および流加発酵は、一般的であり当技術分野で周知である。「連続発酵」は、規定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、等量の馴化培地が処理のために同時に除去される開放系である。連続発酵は一般的に、細胞が主に対数成長期にある場合に一定の高密度での培養を維持する。連続発酵系は、定常状態成長条件を維持するように努める。連続発酵プロセスのために栄養および増殖因子をモジュレートする方法ならびに産物の形成速度を最大限にするための技術は、工業微生物学の分野において周知である。
本発明の一部の実施形態では、無細胞転写／翻訳系は、スクロースホスホリラーゼを産生するために有用である。いくつかの系が市販されており、その方法は当業者に周知である。
本発明は、バリアントスクロースホスホリラーゼポリペプチドまたはその生物活性断片を作出する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、配列番号２および／または４と少なくとも約７０％（または少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の配列同一性を含み、本明細書に提供される少なくとも１つの変異を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドによって形質転換された宿主細胞を提供すること；宿主細胞がコードされたバリアントスクロースホスホリラーゼポリペプチドを発現する条件下で、形質転換された宿主細胞を培養培地中で培養すること；ならびに必要に応じて発現されたバリアントスクロースホスホリラーゼポリペプチドを回収または単離すること、および／もしくは発現されたバリアントスクロースホスホリラーゼポリペプチドを含有する培養培地を回収または単離することを含む。一部の実施形態では、方法はさらに、必要に応じてコードされたスクロースホスホリラーゼポリペプチドを発現させた後、形質転換された宿主細胞を溶解すること、ならびに必要に応じて発現されたバリアントスクロースホスホリラーゼポリペプチドを細胞溶解物から回収および／または単離することを提供する。本発明はさらに、バリアントスクロースホスホリラーゼポリペプチドによって形質転換された宿主細胞をバリアントスクロースホスホリラーゼポリペプチドの産生にとって適した条件下で培養すること、およびバリアントスクロースホスホリラーゼポリペプチドを回収することを含む、バリアントスクロースホスホリラーゼポリペプチドを作出する方法を提供する。典型的には、スクロースホスホリラーゼポリペプチドの回収または単離は、本明細書に記載する技術を含む当技術分野で周知であるタンパク質回収技術を使用して、宿主細胞培養培地から、宿主細胞から、またはその両方から行う。一部の実施形態では、宿主細胞は、遠心分離によって採取され、物理的または化学的手段によって破壊され、得られた粗製抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に採用される微生物細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、および／または細胞溶解剤の使用、ならびに当業者に周知の他の多くの適した方法を含むがこれらに限定されない任意の簡便な方法によって破壊することができる。
宿主細胞において発現された操作されたスクロースホスホリラーゼ酵素は、中でもリゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製に関して当技術分野で公知の技術の任意の１つまたは複数を使用して細胞および／または培養培地から回収することができる。細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉからのタンパク質を溶解して高い効率で抽出するための適した溶液は、商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）として市販されている。このように、一部の実施形態では、得られたポリペプチドは、当技術分野で公知の多くの方法のいずれかによって回収／単離され、必要に応じて精製される。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）または沈殿を含むがこれらに限定されない従来の手順によって栄養培地から単離される。一部の実施形態では、望ましければ成熟タンパク質の立体配置を完成させるためにタンパク質の再フォールディングステップを使用する。加えて、一部の実施形態では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製ステップにおいて採用する。例えば一部の実施形態では、当技術分野で公知の方法が本発明において有用である（例えば、その両方が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、３５３：１１７ ［２００１］；およびＨｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７３：１３３１ ［２００７］を参照されたい）。実際に、当技術分野で公知の任意の適した精製方法が、本発明において有用である。
スクロースホスホリラーゼポリペプチドを単離するためのクロマトグラフィー技術としては、逆相クロマトグラフィー 高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および親和性クロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない。特定の酵素を精製するための条件は、部分的に正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの要因に依存し、これらは当業者に公知である。
一部の実施形態では、親和性技術は、改善されたスクロースホスホリラーゼ酵素を単離するために有用である。親和性クロマトグラフィー精製に関して、スクロースホスホリラーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が使用され得る。抗体を産生するために、ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられるがこれらに限定されない様々な宿主動物を、スクロースホスホリラーゼの注射によって免疫してもよい。スクロースホスホリラーゼポリペプチドを、側鎖官能基によって、または側鎖官能基に付着するリンカーによって適した担体、例えばＢＳＡに付着させてもよい。フロイント（完全および不完全）、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に役立つヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが挙げられるがこれらに限定されない様々なアジュバントを使用して、宿主種に応じて免疫応答を増加させてもよい。
一部の実施形態では、スクロースホスホリラーゼバリアントは、粗製抽出物として、または単離もしくは精製された調製物として酵素を発現する細胞の形態で調製および使用される。一部の実施形態では、スクロースホスホリラーゼバリアントは、凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）、粉末形態（例えば、アセトン粉末）として調製され、または酵素溶液として調製される。一部の実施形態では、スクロースホスホリラーゼバリアントは、実質的に純粋な調製物の形態である。
一部の実施形態では、スクロースホスホリラーゼポリペプチドは、任意の適した固体基材に付着する。固体基材としては、固相、表面、および／または膜が挙げられるがこれらに限定されない。固相支持体としては、有機ポリマー、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにそのコポリマーおよびグラフトが挙げられるがこれらに限定されない。固相支持体はまた、無機、例えばガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカ、または金属、例えば金または白金でもあり得る。基材の構成は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜、または表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固相支持体は多孔性または非多孔性であり得、膨張または非膨張特徴を有し得る。固相支持体は、ウェル、へこみ、または他の容器、器、特色、または位置の形態で構成され得る。複数の支持体を、試薬のロボット送達のために指定可能な、または検出方法および／もしくは機器によって、様々な位置にアレイ上に構成することができる。
一部の実施形態では、免疫学的方法を使用して、スクロースホスホリラーゼバリアントを精製する。１つのアプローチでは、従来の方法を使用して野生型またはバリアントスクロースホスホリラーゼポリペプチドに対して（例えば、配列番号２および／または４のいずれかを含むポリペプチド、および／またはそのバリアント、および／またはその免疫原性断片に対して）惹起された抗体をビーズ上に固定し、バリアントスクロースホスホリラーゼが結合する条件下で細胞培養培地と混合し、そして沈殿させる。関連するアプローチでは、免疫クロマトグラフィーは有用である。
一部の実施形態では、バリアントスクロースホスホリラーゼは、非酵素部分を含む融合タンパク質として発現される。一部の実施形態では、バリアントスクロースホスホリラーゼ配列を、精製促進ドメインに融合する。本明細書で使用される場合、用語「精製促進ドメイン」は、それが融合されるポリペプチドの精製を媒介するドメインを指す。適した精製ドメインとしては、金属キレートペプチド、固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン－トリプトファンモジュール、グルタチオンに結合する配列（例えば、ＧＳＴ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ（インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する；例えば、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ３７：７６７ ［１９８４］を参照されたい）、マルトース結合タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐから入手可能なシステム）において利用されるＦＬＡＧエピトープなどが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載の組成物および方法において使用することが企図される１つの発現ベクターは、エンテロキナーゼ切断部位によって隔てられたポリヒスチジン領域に融合される本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定された金属イオン親和性クロマトグラフィー；例えば、Ｐｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔ． Ｅｘｐ． Ｐｕｒｉｆ．、３：２６３－２８１ ［１９９２］を参照されたい）上での精製を容易にするが、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質からのバリアントスクロースホスホリラーゼポリペプチドを分離する手段を提供する。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）はまた、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるためにも使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、リガンド－アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ－融合体の場合ではグルタチオン－アガロース）への吸着後に、遊離リガンドの存在下での溶出によって溶解した細胞から容易に精製することができる。
したがって、別の態様では、本発明は、操作された酵素ポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの発現にとって適した条件下で操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することが可能な宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法はさらに、本明細書に記載の酵素ポリペプチドを単離および／または精製するステップを含む。
宿主細胞にとって適切な培養培地および成長条件は当技術分野で周知である。酵素ポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドを細胞に導入するための任意の適した方法が本発明において有用であると企図される。適した技術としては、電気穿孔、微粒子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の様々な特色および実施形態を、以下の代表的な実施例において例証するが、これらは例証するためであって限定しないと意図される。
実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例証目的に限って提供され、本発明を限定すると解釈してはならない。実際に、以下に記載される試薬および装置の多くに関して様々な適した供給源が存在する。本発明は、任意の試薬または装置項目に関して任意の特定の供給源に限定されないと意図される。
以下の実験の開示において、以下の省略語を適用する：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμΜ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（回転数／分）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（ポンド／平方インチ）；℃（セ氏）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＣＶ（変動係数）；ＣＡＭおよびｃａｍ（クロラムフェニコール）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－ｌ－チオガラクトピラノシド）；ＬＢ（溶原ブロス）；ＴＢ（ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス）；ＳＦＰ（振とうフラスコ粉末）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ｎｔ（ヌクレオチド；ポリヌクレオチド）；ａａ（アミノ酸；ポリペプチド）；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（一般に使用される実験用Ｅ．ｃｏｌｉ株、Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴから入手可能）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＨＰＬＣ－ＵＶ（ＨＰＬＣ－紫外可視検出器）；１Ｈ ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴分光法）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する改善倍率）；ＳｉｇｍａおよびＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＭＡ）；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡの一部）；Ａｍｒｅｓｃｏ（Ａｍｒｅｓｃｏ，ＬＬＣ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）；Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ，Ｌｔｄ．、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）；Ｖａｒｉａｎ（Ｖａｒｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）；Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｉｎｆｏｒｓ（Ｉｎｆｏｒｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ．、Ａｎｎａｐｏｌｉｓ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＭＤ）；およびＴｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｌｌａｎｄ、ＭＩ）。
（実施例１）
組換えスクロースホスホリラーゼ遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ発現宿主
本発明のバリアントを産生するために使用した最初のスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）酵素は、Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ種（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０２１６１７４６８．１）の野生型配列から得た。野生型ＳＰタンパク質配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に関してコドン最適化し、ＤＮＡを、ｌａｃＩリプレッサーの制御下でｌａｃプロモーターに作動可能に連結された発現ベクターｐＣＫ１１０９００（米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号の図３を参照されたい）にクローニングした。発現ベクターはまた、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有する。得られたプラスミドを、当技術分野で公知の標準的な方法を使用してＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０に形質転換した。細胞を、当技術分野で公知のようにクロラムフェニコール選択に供することによって、形質転換体を単離した（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号およびＷＯ２０１０／１４４１０３を参照されたい）。
（実施例２）
ＨＴＰ ＳＰを含有する湿潤細胞ペレットの調製
Ｗ３１１０ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ＳＰコード遺伝子を含有するそれぞれのプラスミドによって形質転換し、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するＬＢ寒天プレート上に播種し、３７℃で一晩成長させた。モノクローナルコロニーを採集し、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢ １８０μｌに接種し、９６ウェル浅型ウェルマイクロタイタープレートのウェルに置いた。プレートをＯ２透過性シールで密封し、培養物を３０℃、２００ｒｐｍ、および湿度８５％で成長させた。次いで、細胞培養物各１０μｌを、ＴＢ ３９０μｌおよび３０μｇ／ｍＬ ＣＡＭを含有する９６ウェル深型ウェルプレートのウェルに移した。深型ウェルプレートをＯ２透過性シールで密封し、３０℃、２５０ｒｐｍ、および湿度８５％でＯＤ６００が０．６～０．８に達するまでインキュベートした。次いで、細胞培養物を、イソプロピルチオグリコシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭとなるように添加することによって誘導し、２５０ｒｐｍで振とうさせながら３０℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞を、４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を使用してペレットにした。上清を捨て、ペレットを－８０℃で凍結した後、溶解した。
（実施例３）
化合物（１）を産生するための配列番号２の改善されたスクロースホスホリラーゼバリアント
配列番号２のスクロースホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号１）を使用して、表３－１の操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、開始ポリペプチドと比べて所望の条件下で改善されたスクロースホスホリラーゼ活性（例えば、スキームＩＩＩに示すように操作されたＤＥＲＡ、ＰＰＭ、およびＰＮＰ酵素の存在下での化合物（１）の産生を介して測定された遊離ホスフェートおよびスクロースからグルコース－１－リン酸を産生する能力）を示した。
偶数番号の配列識別子のアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドを、以下に記載するように配列番号２の「骨格」アミノ酸配列から生成した。定向進化を、配列番号１に記載のポリヌクレオチドから開始した。操作されたポリペプチドのライブラリを様々な周知の技術（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸の差の組換え）を使用して生成し、ＨＴＰアッセイおよびポリペプチドのＳＰ活性を測定する分析方法を使用してスクリーニングした。この場合、活性は、表３－２の分析方法を使用して上記のスキームＩＩＩに示すように、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）、ホスホペントムターゼ（ＰＰＭ）、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）酵素の存在下での化合物（１）の産生を介して測定した。本明細書に提供する方法は、本発明を使用して産生されたバリアントの分析において有用である。しかし、本明細書に記載の方法は、本明細書に提供され、および／または本明細書に提供される方法を使用して産生されるバリアントの分析に適用可能な唯一の方法であると意図されない。なぜなら、他の適した方法も本発明において有用だからである。
ハイスループット溶解物を以下のように調製した。クローンのＳＰバリアントからの凍結ペレットを、実施例２に記載するように調製し、ｐＨ７．５の１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、および０．５ｍｇ／ｍＬ硫酸ポリミキシンｂ（ＰＭＢＳ）を含有する溶解緩衝液４００μｌによって溶解した。溶解混合物を室温で２時間振とうさせた。次いでプレートを、４０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心分離した。
振とうフラスコ粉末（振とうフラスコ培養物からの凍結乾燥溶解物）を以下のように調製した。所望のバリアントの細胞培養物を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを有するＬＢ寒天プレートに播種し、３７℃で一晩成長させた。各培養物からの単一コロニーを、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを有するＬＢ ６ｍｌに移した。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間成長させ、３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを含有するＴＢ２５０ｍｌ中に、最終ＯＤ６００が０．０５となるようにおよそ１：５０で継代培養した。培養物を、ＯＤ６００が０．６～０．８となるように３０℃、２５０ｒｐｍでおよそ１９５分間成長させ、１ｍＭ ＩＰＴＧによって誘導した。次いで、培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間成長させた。培養物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットをｐＨ７．５の２０ｍＭトリエタノールアミン３０ｍｌ中に再懸濁させ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）プロセッサーシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を１８，０００ｐｓｉで使用して溶解した。溶解物を沈降させ（１０，０００ｒｐｍで６０分間）、上清を凍結し、凍結乾燥した。
反応を、２ｍＬ深型ウェルプレートにおいて９６ウェルフォーマットで、総体積１００μＬでＤＥＲＡ／ＰＰＭ／ＰＮＰ／ＳＰ酵素を伴うタンデムの４－酵素カスケード設定で実施した。反応は、振とうフラスコ粉末としてのＤＥＲＡ、ＰＰＭ、およびＰＮＰ（３０重量％ＰＰＭ 配列番号８６、０．５重量％ＤＥＲＡ 配列番号８８、および０．５重量％ＰＮＰｈ－４００７－ＰＮＰ 配列番号９０）、２６ｇ／Ｌまたは１２４ｍＭエナンチオピュアな（Ｒ）－２－エチニル－グリセルアルデヒド基質、９９ｍＭ Ｆ－アデニン（０．８当量）、１８６ｍＭアセトアルデヒド（イソプロパノール中で４０重量％、１．５当量）、３７２ｍＭスクロース（３．０当量）、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、および５０ｍＭ ＴＥｏＡ、ｐＨ７．５を含んだ。反応を、以下のように設定した：（ｉ）ＳＰを除く全ての反応構成要素を、単一の溶液に予め混合し、次いでこの溶液９０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルにアリコートにした。（ｉｉ）次いで５０ｍＭ ＴＥｏＡ緩衝液を使用して予め１００倍希釈したＳＰ溶解物１０μＬをウェルに添加し、反応を開始した。反応プレートをヒートシールし、６００ｒｐｍで振とうさせながら３５℃で１８～２０時間インキュベートした。
反応を、１Ｍ ＫＯＨおよびＤＭＳＯの１：１混合物３００μＬによってクエンチした。クエンチした反応を、卓上型シェーカー上で１０分間振とうさせた後、４℃、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、あらゆる沈殿物をペレットにした。次いで上清１０マイクロリットルを、ｐＨ７．５の０．１Ｍ ＴＥｏＡ緩衝液中の２５％ＭｅＣＮ １９０μＬを予め充填した９６ウェル丸底プレートに移した。試料を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｕ３０００ ＵＰＬＣシステムに注入し、ＡｔｌａｎｔｉｓＴ３ Ｃ１８、３μｍ、２．１×１００ｍｍカラムを使用して、実施例３－２に記載のように０．１％ＴＦＡを追加補充した７５：２５の水：アセトニトリルを含有する移動相によって均一濃度で分離した。配列番号２と比較した活性を、指定された反応条件下で配列番号２によって形成された化合物（１）のピーク面積と比べた、バリアント酵素によって形成された化合物（１）のピーク面積として計算した。
Figure 2022538230000005
Figure 2022538230000006
Figure 2022538230000007
（実施例４）
化合物（１）を産生するための配列番号４の改善されたスクロースホスホリラーゼバリアント
配列番号４のスクロースホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を使用して、表４－１の操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、開始ポリペプチドと比べて所望の条件下で改善されたスクロースホスホリラーゼ活性（例えば、スキームＩＩＩに示すように、操作されたＤＥＲＡ、ＰＰＭ、およびＰＮＰの存在下での化合物（１）の産生を介して測定された、遊離ホスフェートおよびスクロースからグルコース－１－リン酸を産生する能力）を示した。
偶数番号の配列識別子のアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドを、以下に記載するように配列番号４の「骨格」アミノ酸配列から生成した。定向進化を、配列番号３に記載のポリヌクレオチドから開始した。操作されたポリペプチドのライブラリを様々な周知の技術（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸の差の組換え）を使用して生成し、ＨＴＰアッセイおよびポリペプチドのＳＰ活性を測定する分析方法を使用してスクリーニングした。この場合、活性は、表３－２の分析方法を使用して、スキームＩＩＩに示すように操作されたＤＥＲＡ、ＰＰＭ、およびＰＮＰ酵素の存在下での化合物（１）の産生を介して測定した。本明細書に提供する方法は、本発明を使用して産生されたバリアントの分析において有用である。しかし、本明細書に記載の方法は、本明細書に提供され、および／または本明細書に提供される方法を使用して産生されるバリアントの分析に適用可能な唯一の方法であると意図されない。なぜなら、他の適した方法も本発明において有用だからである。
ハイスループット溶解物を以下のように調製した。クローンのＳＰバリアントからの凍結ペレットを、実施例２に記載するように調製し、ｐＨ７．５の１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、および０．５ｍｇ／ｍＬ硫酸ポリミキシンｂ（ＰＭＢＳ）を含有する溶解緩衝液４００μｌによって溶解した。溶解混合物を室温で２時間振とうさせた。次いで、プレートを、４０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心分離した。
振とうフラスコ粉末（振とうフラスコ培養物からの凍結乾燥溶解物）を以下のように調製した。所望のバリアントの細胞培養物を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを有するＬＢ寒天プレートに播種し、３７℃で一晩成長させた。各培養物からの単一コロニーを、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを有するＬＢ ６ｍｌに移した。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間成長させ、３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを含有するＴＢ２５０ｍｌ中に、最終ＯＤ６００が０．０５となるようにおよそ１：５０で継代培養した。培養物を、ＯＤ６００が０．６～０．８となるように３０℃、２５０ｒｐｍでおよそ１９５分間成長させ、１ｍＭ ＩＰＴＧによって誘導した。次いで、培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間成長させた。培養物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットをｐＨ７．５の２０ｍＭトリエタノールアミン３０ｍｌ中に再懸濁させ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）プロセッサーシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を１８，０００ｐｓｉで使用して溶解した。溶解物をペレットにし（１０，０００ｒｐｍで６０分間）、上清を凍結し、凍結乾燥した。
反応を、２ｍＬ深型ウェルプレートにおいて９６ウェルフォーマットで、総体積１００μＬでＤＥＲＡ／ＰＰＭ／ＰＮＰ／ＳＰ酵素を伴うタンデムの４－酵素カスケード設定で実施した。反応は、振とうフラスコ粉末としてのＤＥＲＡ、ＰＰＭ、およびＰＮＰ（３０重量％ＰＰＭ 配列番号８６、０．５重量％ＤＥＲＡ 配列番号８８、および０．５重量％ＰＮＰ 配列番号９０）、２６ｇ／Ｌまたは１２４ｍＭエナンチオピュアな（Ｒ）－２－エチニル－グリセルアルデヒド基質、９９ｍＭ Ｆ－アデニン（０．８当量）、１８６ｍＭアセトアルデヒド（イソプロパノール中で４０重量％、１．５当量）、３７２ｍＭスクロース（３．０当量）、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、および５０ｍＭ ＴＥｏＡ、ｐＨ７．５を含んだ。反応を、以下のように設定した：（ｉ）ＳＰを除く全ての反応構成要素を、単一の溶液に予め混合し、次いでこの溶液９０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルにアリコートにした。（ｉｉ）次いで５０ｍＭ ＴＥｏＡ緩衝液を使用して予め１００倍希釈したＳＰ溶解物１０μＬを、ウェルに添加し、反応を開始した。反応プレートをヒートシールし、６００ｒｐｍで振とうさせながら３５℃で１８～２０時間インキュベートした。
反応を、１Ｍ ＫＯＨおよびＤＭＳＯの１：１混合物３００μＬによってクエンチした。クエンチした反応を、卓上型シェーカー上で１０分間振とうさせた後、４℃、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、あらゆる沈殿物をペレットにした。次いで上清１０マイクロリットルを、ｐＨ７．５の０．１Ｍ ＴＥｏＡ緩衝液中の２５％ＭｅＣＮ １９０μＬを予め充填した９６ウェル丸底プレートに移した。試料を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｕ３０００ ＵＰＬＣシステムに注入し、ＡｔｌａｎｔｉｓＴ３ Ｃ１８、３μｍ、２．１×１００ｍｍカラムを使用して、実施例３－２に記載のように０．１％ＴＦＡを追加補充した７５：２５の水：アセトニトリルを含有する移動相によって均一濃度で分離した。配列番号４と比較した活性を、指定された反応条件下で配列番号４によって形成された化合物（１）のピーク面積と比べた、バリアント酵素によって形成された化合物（１）のピーク面積として計算した。
Figure 2022538230000008
本出願で引用した全ての刊行物、特許、特許出願、および他の文書は、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文書が全ての目的に関して個別に参照により組み込まれることが指し示されているのと同程度に、全ての目的に関してその全体がこれにより参照により組み込まれる。
様々な具体的な実施形態を例証および説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変化を行うことができると認識される。

Claims (27)

  1. 配列番号２および／もしくは４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む操作されたスクロースホスホリラーゼであって、前記操作されたスクロースホスホリラーゼの前記ポリペプチド配列が少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２および／または４を参照して番号付けられている、操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  2. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたスクロースホスホリラーゼの前記ポリペプチド配列が、３９７、７、１０、４８、１３６、１５８、２０５、２０７、２１１、２１５、３０１、３３３、３７８、および４００から選択される前記ポリペプチド配列における１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  3. 前記操作されたスクロースホスホリラーゼの前記ポリペプチド配列が、配列番号４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたスクロースホスホリラーゼの前記ポリペプチド配列が、１０／２１５／４００、１５８、１５８／２０７／２１５、１５８／２０７／２１５／３０１／４００、１５８／２０７／２１５／４００、１５８／２０７／４００、１５８／２１１／４００、１５８／２１５／３０１／４００、１５８／２１５／４００、１５８／３０１／４００、１５８／４００、２０５、２０７、２０７／２１５、２０７／２１５／４００、２０７／４００、２１５／３０１、２１５／４００、２４２／４００、３０１、３０１／４００、および４００から選択される１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号４を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  4. 表３－１および／または４－１に記載の少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  5. 配列番号２および／または４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  6. 配列番号４に記載の、バリアントの操作されたスクロースホスホリラーゼを含む、請求項１に記載の操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  7. 配列番号４～８４の偶数番号の配列に記載の少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  8. 配列番号４～８４の偶数番号の配列の少なくとも１つに記載のポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  9. 野生型Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓスクロースホスホリラーゼと比べて少なくとも１つの改善された特性を含む、請求項１～８のいずれかに記載の操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  10. 前記改善された特性が、基質に対する改善された活性を含む、請求項９に記載の操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  11. 前記基質がスクロースおよび／または無機ホスフェートを含む、請求項１０に記載の操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  12. 前記改善された特性が、化合物（１）および／または化合物（３）の改善された産生を含む、請求項９～１１のいずれかに記載の操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  13. 精製されている、請求項１～１２のいずれかに記載の操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  14. ヌクレオシドアナログを産生するための多酵素系の一部である、請求項１～１３のいずれかに記載の操作されたスクロースホスホリラーゼ。
  15. 請求項１～１４のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼを含む組成物。
  16. 請求項１～１４のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼをコードするポリヌクレオチド配列。
  17. 少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼをコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１および／または３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を含み、前記操作されたスクロースホスホリラーゼの前記ポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換を含む、ポリヌクレオチド配列。
  18. 配列番号１および／もしくは３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を含む、少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列。
  19. 制御配列に作動可能に連結されている、請求項１６～１８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
  20. コドン最適化されている、請求項１６～１９のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
  21. 配列番号３～８３の奇数番号の配列に記載されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１６～２０のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
  22. 請求項１６～２１のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
  23. 請求項２２に記載の少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞。
  24. 請求項１６～２１のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
  25. 宿主細胞において操作されたスクロースホスホリラーゼを産生する方法であって、請求項２３および／または２４に記載の宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼが産生されるように、適した条件下で培養することを含む方法。
  26. 少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼを培養物および／または宿主細胞から回収することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記少なくとも１つの操作されたスクロースホスホリラーゼを精製するステップをさらに含む、請求項２５および／または２６に記載の方法。
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