WO2005024008A1 - スクロースホスホリラーゼ（ｓｐ）の耐熱化方法 - Google Patents

スクロースホスホリラーゼ（ｓｐ）の耐熱化方法 Download PDF

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WO2005024008A1
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sucrose phosphorylase
amino acid
position corresponding
phosphorylase
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PCT/JP2004/012533
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kazutoshi Fujii
Masae Iiboshi
Michiyo Yanase
Hiroki Takata
Takeshi Takaha
Takashi Kuriki
Original Assignee
Ezaki Glico Co.,Ltd.
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)

Definitions

  • the present invention relates to a thermostable sucrose phosphorylase and a gene encoding the thermostable sucrose phosphorylase. Further, the present invention relates to a method for producing thermostable sucrose phosphorylase.
  • Sucrose phosphorylase (hereinafter, also referred to as SP, SP enzyme) is an enzyme used for, for example, ⁇ -glucan synthesis and G-11 synthesis.
  • ⁇ -glucan (especially insoluble amylose) is expected to function similarly to dietary fiber, and can be expected to be used in health foods.
  • amylose which is a linear ⁇ _glucan, has a feature that it can include, for example, iodine, fatty acids, and the like in a molecule, and thus is expected to be used in the fields of pharmaceuticals, cosmetics, and sanitary products.
  • Amylose can also be used as a raw material for producing cyclodextrin and cycloamylose, which have the same inclusion capacity as amylose.
  • films containing amylose have tensile strength comparable to general-purpose plastics and are very promising as a material for biodegradable plastics.
  • amylose is expected to have many uses. However, it is difficult to obtain substantially pure amylose and it is very expensive, so it is distributed only at the reagent level and is hardly used as an industrial material. Therefore, a method for stably and inexpensively producing amylose is desired.
  • G_1_P is used, for example, as an antibacterial agent for medical use, an antitumor agent (platinum complex), a therapeutic agent for heart disease (amine salt), or a substrate for the synthesis of human glucan.
  • Escherichia coli has amylase and phosphatase activities
  • Bacillus subtilis has amylase activity.
  • the enzymes of these hosts cannot be inactivated by heat treatment at 55 ° C, but they can be almost inactivated by heat treatment at 60 ° C. Can be. Therefore, an SP having heat resistance that does not lose much activity even at a heat treatment at 60 ° C. or an SP having higher heat resistance than amylase or phosphatase has been desired.
  • SPs having heat resistance particularly SPs that can maintain sufficient activity at high temperatures (for example, 60 ° C to 75 ° C) are well known.
  • SPs derived from other than bacteria have been reported (see Non-Patent Document 1).
  • SPs derived from mold have been reported (see Non-Patent Document 1).
  • SP derived from Monilia sitophila also known as Neurospora intermedia
  • the heat resistance was improved by immobilizing the enzyme.
  • the immobilized enzyme has drawbacks such as a change in substrate specificity, and is immobilized. Since there is a limit to the improvement in heat resistance due to conversion, it is desirable to improve the heat resistance of the SP enzyme itself. There is no report on improving the heat resistance by introducing a mutation into the SP enzyme.
  • Patent Document 1 International Publication No. 02/097077 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 C C.B.Pimentel et al., ⁇ SCREENING, THERMAL PROPER TIES AND PRODUCTION IN YAM EXTRAT OF FUNGAL SUC ROSE PHOSPHYRYLASEJ, Rev.Microbiol., Sao Paulo, 1992, 23 (3), pp. 199-205
  • Non-Patent Document 2 Martin Lehmann and Markus Wyss, ⁇ Engineering proteins for thermostability: the use of sequence alignments versus relative design and directed evolution, Current Opinion in Biotechnology, 2001, 12, pp. 371-375
  • Non-Patent Document 3 M. Lehmann et al., ⁇ The consensus concept for thermostability engineering of proteinsj, Biochemica Biophysica Acta, 2000, 1 543, pp. 408-415
  • Non-Patent Document 4 Junichi Miyazaki et al., ⁇ Ancestral Residues Stabilizing 3-1 sopropylmalate Dehydrogenase of an Extreme Thermophile: Experi mental Evidence Supporting the Thermophilic Common Ancestor Hypothesis J, J. Biochem, 2001, 129, pp. 777-782
  • the present invention is intended to solve the above problems, and an object of the present invention is to provide a sucrose phosphorylase having higher thermostability than conventional sucrose phosphorylase.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems by increasing the heat resistance of a known SP enzyme whose gene sequence is known, and as a result, the amino acid residue at a specific position in the SP sequence has been substituted. As a result, it was finally found that SP having improved heat resistance was obtained, and based on this, the present invention was completed.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention is sucrose phosphorylase having improved thermostability obtained by modifying natural sucrose phosphorylase.
  • sucrose phosphorylase having improved thermostability is the sucrose phosphorylase having improved thermostability.
  • Motif sequence 1 AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPID YHEVDS AFGDWDD VKRLGEKYYLMFDFMINHIS position corresponding to position 14, position corresponding to position 29, and position corresponding to position 44;
  • Motif sequence 2 RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTF Position corresponding to position 7, position corresponding to position 19, position corresponding to position 23 and position corresponding to position 34;
  • Motif sequence 3 position corresponding to position 19 in ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG;
  • At least one position selected from the group consisting of amino acid residues different from native sucrose phosphorylase.
  • the sucrose phosphorylase having increased thermostability at 37 ° C. after heating the sucrose phosphorylase having increased thermostability in a 20 mM Tris buffer ( ⁇ 70) at 55 ° C. for 20 minutes. It is 20% or more of the enzyme activity at ° C.
  • the amino acid sequence of the natural sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16.
  • An amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20 It may have at least 40% identity with the sequence.
  • the amino acid sequence of the natural sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 And at least 60% identity to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20.
  • the amino acid sequence of the natural sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16.
  • the amino acid sequence of the natural sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 , SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20.
  • the natural sucrose phosphorylase is Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae streptococcus sorbmus, Streptococcus mitis, Leuconostoc mesenteroides ⁇ Oenococcus oeni, a bacterium selected from the group consisting of Lactobacilli! S acidophilus and Listeria monocytogenes. It can be from.
  • the natural sucrose phosphorylase may be derived from Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae streptococcus sorbmus or ⁇ trept ococcus mitis.
  • the natural sucrose phosphorylase may be derived from Streptococcus mutans or Leuconostoc mesenteroid.es.
  • amino acid residue at a position corresponding to position 14 in the motif sequence 1 may be serine or isoleucine.
  • the amino acid residue at a position corresponding to position 29 in the motif sequence 1 may be proline, alanine, or lysine.
  • the amino acid at a position corresponding to position 44 in the motif sequence 1 is The no acid residue can be histidine, arginine or tryptophan.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 44 in the motif sequence 1 may be arginine.
  • amino acid residue at the position corresponding to position 7 in the motif sequence 2 is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-N-(2-aminoethyl)-2-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl
  • the amino acid residue at a position corresponding to position 19 in the motif sequence 2 may be methionine, cysteine, phenylalanine, isoleucine, valine or mouth synth.
  • amino acid residue at the position corresponding to position 19 in the motif sequence 2 may be norin or tyrosine.
  • the amino acid residue at a position corresponding to position 23 in the motif sequence 2 can be arginine, histidine, isoleucine, lysine or valine.
  • the amino acid residue at a position corresponding to position 23 in the motif sequence 2 may be histidine.
  • the amino acid residue at a position corresponding to position 34 in the motif sequence 2 may be serine or threonine.
  • the amino acid residue at a position corresponding to position 34 in the motif sequence 2 may be serine.
  • the amino acid residue at a position corresponding to position 19 in the motif sequence 3 is glycine, cysteine, histidine, lysine, leucine, asparagine, proline, glutamine, arginine or serine. possible.
  • amino acid residue at the position corresponding to position 19 in the motif sequence 3 may be glycine.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability is obtained by heating the sucrose phosphorylase having improved thermostability after heating at 57 ° C. for 20 minutes in a 20 mM Tris buffer (pH 7.0).
  • the enzymatic activity in C was that of sucrose phosphorylase having improved thermostability before the heating. It can be 10% or more of the enzyme activity in C.
  • sucrose phosphorylase having improved thermostability is added to a 20 mM Tris buffer.
  • sucrose phosphorylase with increased thermostability after heating at 57 ° C for 20 minutes in a liquid ( ⁇ 70)
  • the enzyme activity at ° C may be 20% or more of the enzyme activity at 37 ° C of sucrose phosphorylase having improved thermostability before the heating.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability is obtained by heating the sucrose phosphorylase having improved thermostability after heating at 65 ° C for 20 minutes in a 20 mM Tris buffer (pH 7.0) containing 20% sucrose.
  • the enzyme activity at 37 ° C may be 10% or more of the enzyme activity at 37 ° C of the sucrose phosphorylase having improved thermostability before the heating.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability was heated at 65 ° C. for 20 minutes in a 20 mM Tris buffer (pH 7.0) containing 20% sucrose.
  • the enzyme activity at 37 ° C may be 20% or more of the enzyme activity at 37 ° C of the sucrose phosphorylase having improved thermostability before heating.
  • thermostable sucrose phosphorylase of the present invention has at least at the position corresponding to position 14 in motif sequence 1, an amino acid residue different from the natural sucrose phosphorylase. obtain.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention has at least a different amino acid residue from the natural sucrose phosphorylase at a position corresponding to position 19 in motif sequence 3. obtain.
  • One method of the present invention is a method for preparing sucrose phosphorylase having improved thermostability, in which a first nucleic acid molecule containing a base sequence encoding the first sucrose phosphorylase is modified to convert the modified base sequence.
  • Obtaining a second nucleic acid molecule comprising:
  • thermostable sucrose phosphorylase
  • thermostable sucrose phosphorylase Recovering the expressed thermostable sucrose phosphorylase
  • sucrose phosphorylase having improved thermostability is the sucrose phosphorylase having improved thermostability.
  • Motif sequence 1 AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPID YHEVDS AFGDWDD Position corresponding to position 14 in VKRLGEKYYLMFDFMINHIS, position corresponding to position 29 Position, and a position corresponding to position 44;
  • Motif sequence 2 RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTF Position corresponding to position 7, position corresponding to position 19, position corresponding to position 23 and position corresponding to position 34;
  • Motif sequence 3 position corresponding to position 19 in ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG;
  • At least one position selected from the group consisting of an amino acid residue of the first sucrose phosphorylase
  • sucrose phosphorylase having increased thermostability at 37 ° C. after heating the sucrose phosphorylase having increased thermostability at 55 ° C. for 20 minutes in a 20 mM Tris buffer (pH 7.0). 20 for the enzyme activity at ° C. / o or more.
  • the amino acid sequence of the first sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, may have at least 40% identity to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20.
  • the amino acid sequence of the first sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, may have at least 60% identity to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20.
  • the amino acid sequence of the first sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20, which can be encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule consisting of a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the amino acid sequence of the first sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20.
  • the first sucrose phosphorylase is selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae streptococcus sorbmus, Streptococcus mitis, Leuconostoc mesenteroides ⁇ Oenococcus oeni, Lactobacilli! S acidophilus and Listeria monocytogenes. It can be from bacteria.
  • the first sucrose phosphorylase can be derived from Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae ⁇ streptococcus sorbmus mapu or ⁇ trept ococcus mitis.
  • the natural sucrose phosphorylase may be derived from Streptococcus mutans or Leuconostoc mesenteroid.es.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability was obtained by heating the sucrose phosphorylase having improved thermostability after heating at 57 ° C for 20 minutes in a 20 mM Tris buffer (pH 7.0).
  • the enzyme activity at 37 ° C may be 10% or more of the enzyme activity at 37 ° C of sucrose phosphorylase having improved thermostability before the heating.
  • the sucrose phosphorylase having increased thermostability is obtained by heating the sucrose phosphorylase having increased thermostability in a 20 mM Tris buffer ( ⁇ ⁇ ⁇ 70) at 57 ° C for 20 minutes.
  • the enzyme activity at ° C may be 20% or more of the enzyme activity at 37 ° C of sucrose phosphorylase having improved thermostability before the heating.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability may have an amino acid residue different from that of the first sucrose phosphorylase at least at a position corresponding to position 14 in the motif rooster sequence 1.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability may have an amino acid residue different from that of the first sucrose phosphorylase at least at a position corresponding to position 19 in the motif of rooster sequence 3.
  • the nucleic acid molecule of the present invention comprises a base sequence encoding the above-mentioned sucrose phosphorylase having improved thermostability.
  • the vector of the present invention contains the above-described nucleic acid molecule.
  • the cell of the present invention contains the nucleic acid molecule described above.
  • One method of the present invention is a method for synthesizing glucose-1 monophosphate, which comprises reacting a reaction solution containing sucrose phosphorylase having improved thermostability according to claim 1, sucrose, and inorganic phosphoric acid. Reacting to produce glucose-1-phosphate.
  • the reaction may be performed at a temperature between 50 ° C and 70 ° C.
  • One method of the present invention is a method for synthesizing a glucose polymer, the method comprising using a sucrose phosphorylase having improved thermostability according to claim 1 and a glucose-_1_phosphate as a substrate. Reacting a reaction solution containing the above phosphorylase, sucrose, a primer, and inorganic phosphate or dalcos_1_phosphate to produce a gnorecose polymer.
  • the glucose polymer may be hedarcan.
  • the second phosphorylase may be human glucan phosphorylase.
  • the second phosphorylase is selected from the group consisting of cellobiose phosphorylase, cellodextrin phosphorylase, laminaribiose phosphorylase, laminaridextrin phosphorylase, ⁇ -1,3-glucan phosphorylase and trehalose phosphorylase. Can be done.
  • the reaction may be performed at a temperature between 50 ° C and 70 ° C.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention is sucrose phosphorylase having improved thermostability obtained by modifying natural sucrose phosphorylase.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability is threonine at position 47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • T47 position At least one selected from the group consisting of a position corresponding to position 144, gnoretamin (Q144), a position corresponding to position 155 asasparagine (N155), and a position corresponding to position 249 asparaginic acid (D249).
  • position it has an amino acid residue that is different from the native sucrose phosphorylase, and the sucrose phosphorylase having improved thermostability was placed in a 20 mM Tris buffer (pH 7.0) at 55 ° C for 20 minutes.
  • Enzyme activity in 37 ° C heat sucrose phosphorylase after heating is 20% or more of the enzyme activity in 37 ° C of the heating prior to the heat sucrose phosphorylase It is.
  • the amino acid sequence of the natural sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 And at least 40% identity to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20.
  • the amino acid sequence of the natural sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 And at least 60% identity to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20.
  • the amino acid sequence of the natural sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16.
  • the base sequence is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 And SEQ ID NO: 19.
  • the amino acid sequence of the natural sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 , SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20.
  • the natural sucrose phosphorylase is selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae ⁇ streptococcus sorbmus, Streptococcus mitis, Leuconostoc mesenteroides, Oenococcus oeni, Lactobacilli! S acidophilus and Listeria monocytogenes. It can be from bacteria.
  • the natural sucrose phosphorylase may be derived from a bacterium selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae ⁇ streptococcus sorbmus mapuco and ⁇ trept ococcus mitis. [0079] In one embodiment, the natural sucrose phosphorylase is derived from and protected from Streptococcus mutans or Leuconostoc mesenteroiaes.
  • the amino acid residue at the position corresponding to T47 is serine or
  • the amino acid residue at the position corresponding to S62 may be proline, alanine, or lysine.
  • amino acid residue at the position corresponding to Y77 is histidine
  • the amino acid residue at the position corresponding to Y77 may be arginine.
  • amino acid residue at the position corresponding to V128 is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl
  • the amino acid residue at the position corresponding to K140 may be methionine, cysteine, phenylalanine, isoleucine, norrin or tyrosine.
  • the amino acid residue at the position corresponding to K140 above may be palin or tyrosine.
  • the amino acid residue at the position corresponding to Q144 can be arginine, histidine, isoleucine, lysine, or valine.
  • the amino acid residue at the position corresponding to Q144 may be histidine.
  • the amino acid residue at the position corresponding to N155 may be serine or threonine.
  • the amino acid residue at the position corresponding to N155 may be serine.
  • the amino acid residue at the position corresponding to D249 above can be glycine, cysteine, histidine, lysine, leucine, asparagine, proline, gnoletamine, arginine or serine.
  • amino acid residue at the position corresponding to D249 is glycine
  • the sucrose phosphorylase having increased thermostability of the present invention is obtained by heating the sucrose phosphorylase having improved thermostability at 37 ° C after heating at 57 ° C for 20 minutes in a 20 mM Tris buffer ( ⁇ 70). Force 10% or more of the enzyme activity of sucrose phosphorylase having improved thermostability before heating at 37 ° C.
  • the sucrose phosphorylase having increased thermostability of the present invention is obtained by heating the sucrose phosphorylase having improved thermostability at 37 ° C after heating at 57 ° C for 20 minutes in 20 mM Tris buffer (pH 7.0).
  • the force may be 20% or more of the enzyme activity at 37 ° C of sucrose phosphorylase having increased thermostability before the heating.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability was heated at 65 ° C for 20 minutes in a 20 mM Tris buffer (pH 7.0) containing 20% sucrose. Enzyme activity at ° C. It may be 10% or more of the enzyme activity at 37 ° C. of the sucrose phosphorylase having improved thermostability before heating.
  • the sucrose phosphorylase having increased thermostability was obtained by heating the sucrose phosphorylase having increased thermostability after heating at 65 ° C for 20 minutes in a 20 mM Tris buffer (pH 7.0) containing 20% sucrose. Enzyme activity at ° C. It may be 20% or more of the enzyme activity at 37 ° C. of the thermostable sucrose phosphorylase before heating.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention has an amino acid residue different from the natural sucrose phosphorylase at least at a position corresponding to T47.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention has an amino acid residue different from the natural sucrose phosphorylase at least at a position corresponding to T47.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention has an amino acid residue different from the natural sucrose phosphorylase at least at the position corresponding to D249.
  • the method of the present invention is a method for preparing a sucrose phosphorylase having improved thermostability, wherein the method comprises a first nucleic acid molecule comprising a base sequence encoding the first sucrose phosphorylase.
  • a step of preparing an expression vector containing the second nucleic acid molecule introducing the expression vector into cells to obtain a sucrose phosphorylase having improved thermostability;
  • the enzyme activity S at 37 ° C of sucrose phosphorylase having increased thermostability after heating at 20 ° C for 20 minutes is 20% or more of the enzyme activity at 37 ° C of sucrose phosphorylase having increased thermostability before heating.
  • the amino acid sequence of the first sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, may have at least 40% identity to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20.
  • the amino acid sequence of the first sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, may have at least 60% identity to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20.
  • the amino acid sequence of the first sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20, which can be encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule consisting of a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the amino acid sequence of the first sucrose phosphorylase is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 20.
  • the first sucrose phosphorylase is selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae streptococcus sorbmus, Streptococcus mitis, Leuconostoc mesenteroides, Oenococcus oeni, Lactobacilli! S acidophilus and Listeria monocytogenes. It can be from bacteria.
  • the first sucrose phosphorylase may be derived from a bacterium selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae ⁇ streptococcus sorbmus mapuco and ⁇ trept ococcus mitis.
  • the first sucrose phosphorylase can be derived from Streptococcus mutans or Leuconostoc mesenteroid.es.
  • the sucrose phosphorylase having increased thermostability after heating the sucrose phosphorylase having improved thermostability at 57 ° C for 20 minutes in a 20 mM Tris buffer ( ⁇ 70) at 37 ° C has the following activity: It may be 10% or more of the enzyme activity of the sucrose phosphorylase having improved thermostability before heating at 37 ° C.
  • the sucrose phosphorylase having increased thermostability after heating the sucrose phosphorylase having increased thermostability at 57 ° C. for 20 minutes in a 20 mM Tris buffer ( ⁇ 7.0) at 37 ° C. It may be 20% or more of the enzyme activity of the sucrose phosphorylase having improved thermostability before heating at 37 ° C.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention may have an amino acid residue different from the first sucrose phosphorylase at least at a position corresponding to T47.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention may have an amino acid residue different from the first sucrose phosphorylase at least at a position corresponding to D249.
  • the nucleic acid molecule of the present invention contains a base sequence encoding the above-mentioned sucrose phosphorylase having improved thermostability.
  • the vector of the present invention contains the nucleic acid molecule described above.
  • the cell of the present invention contains the above-described nucleic acid molecule.
  • glucose-11-phosphate is produced by reacting the reaction solution containing sucrose phosphorylase, sucrose and inorganic phosphoric acid having the above-mentioned thermostability.
  • the reaction may be performed at a temperature between 50 ° C and 70 ° C.
  • the method for synthesizing a glucose polymer according to the present invention comprises the above-mentioned sucrose phosphorylase having improved thermostability, a second phosphorylase having glucose-_1_phosphate as a substrate, sucrose, a primer, and an inorganic phosphate.
  • the method includes a step of reacting a reaction solution containing gnorecose-1 monophosphate to produce a dulose polymer.
  • the glucose polymer may be a human glucan.
  • the second phosphorylase may be human glucan phosphorylase.
  • the second phosphorylase is selected from the group consisting of cellobiose phosphorylase, cellodextrin phosphorylase, laminaribiose phosphorylase, laminaridextrin phosphorylase, ⁇ -1,3-glucan phosphorylase and trehalose phosphorylase. Can be done.
  • the reaction may be performed at a temperature between 50 ° C and 70 ° C.
  • an SP enzyme capable of reacting at a high temperature (for example, 60 ° C or higher) and having extremely high activity at a high temperature (for example, 60 ° C or higher) was obtained. Due to this heat resistance, it was possible to suppress the contamination of various bacteria and the aging of the haired alkane, thereby enabling efficient production of G-1-P or haired alkane.
  • the gene encoding the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention (eg, a gene encoding SP having improved thermostability obtained from SP derived from Streptocoecus mutans) is highly expressed using a mesophilic bacterium such as E. coli as a host.
  • a mesophilic bacterium such as E. coli as a host.
  • heating the cell extract containing the heat-resistant enzyme at 60 ° C has the advantage that contaminating enzymes derived from the host bacteria can be easily removed. Therefore, the method of the present invention is also advantageous in enzyme purification.
  • the method of the present invention comprises the steps of using SP and Leuconostoc me It is not necessarily effective only for SP derived from senteroides, but can be suitably applied to heat-resistance of other SPs showing high homology to the amino acid structure of SP derived from Streptococcus mutans.
  • motif sequence 1 AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSAFG DWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS, position corresponding to position 14, position corresponding to position 29, and position corresponding to position 44; motif sequence 2: position corresponding to position 7 corresponding to RPTQEDVDLIYKRK DRAPKQEIQFADGSVEHLWNTFGEEID At least one selected from the group consisting of: position corresponding to position 19, position corresponding to position 23 and position corresponding to position 34; and motif sequence 3: position corresponding to position 19 in ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG.
  • thermostable SPs from other species that have amino acid residues different from the amino acid residues of the natural sucrose phosphorylase can be obtained.
  • At least one position selected from the group consisting of), heat-resistant SPs derived from other species having an amino acid residue different from the amino acid residue of the natural sucrose phosphorylase can be obtained.
  • FIG. 1A is a diagram showing the amino acid sequences of sucrose phosphorylase derived from several organisms, which were aligned in the multiple alignment of GENETYX-WIN Ver. 4.0.
  • FIG. 1A follows FIG. 1B.
  • FIG. 1B is a continuation of FIG. 1A.
  • FIG. 1C is a continuation of FIG. 1B.
  • Figure 2 shows the residual activity (%) of phosphatase after heating various bacteria (E. coli TG-1 and E. coli BL21) at 50 ° C, 55 ° C, 60 ° C or 65 ° C for 30 minutes.
  • Figure 3 shows that various bacteria (E. coli TG-1, E. coli BL21 and Bacillus subtilis ANA-1) were heated at 50 ° C, 55 ° C, 60 ° C or 65 ° C for 30 minutes. It is a graph which shows residual activity (%) of amylase.
  • Rooster column number 4 Amino acid sequence of sucrose phosphorylase of Streptococcus pneumoniae
  • Rooster sequence No. 5 Base sequence of sucrose phosphorylase of Streptococcus sorbinus; Rooster sequence number 6: Amino acid sequence of sucrose phosphorylase of Streptococcus sorbinus Rooster sequence No. 7: Base sequence of sucrose phosphorylase of Leuconostoc mesenteroides;
  • Rooster column number 8 Amino acid sequence of sucrose phosphorylase of Leuconostoc mesenteroides
  • SEQ ID NO: 9 base sequence of sucrose phosphorylase of Oenococcus oeni
  • SEQ ID NO: 10 amino acid sequence of sucrose phosphorylase of Oenococcus oeni
  • SEQ ID NO: 11 base sequence of sucrose phosphorylase of Streptococcus mitis
  • SEQ ID NO: 12 amino acid of sucrose phosphorylase of Streptococcus mitis Sequence
  • rooster sequence number 13 nucleotide sequence of the second sucrose phosphorylase of Leuconostoc mesenteroides
  • Rooster column number 14 Amino acid sequence of the second sucrose phosphorylase of Leuconostoc mesenteroides
  • SEQ ID NO: 16 Lactobacillus acidophilus primary sucrose phosphorylase No acid sequence
  • SEQ ID NO: 17 base sequence of a second sucrose phosphorylase of Lactobacillus acidophilus
  • Rooster column number 19 Base sequence of sucrose phosphorylase of Listeria monocytogenes; Rooster column number 20: Amino acid rooster sequence of sucrose phosphorylase of Listeria monocytogenes;
  • SEQ ID NO: 21 Base sequence encoding sucrose phosphorylase having improved thermostability having all eight mutations (T47S, S62P, Y77H, V128L, K140M, Q144R, N155S and D249G) prepared in Example 2A (1) ;
  • SEQ ID NO: 22 Amino acid sequence of sucrose phosphorylase having improved thermostability having all eight mutations (T47S, S62P, Y77H, V128L, K140M, Q144R, N155S, and D249G) prepared in Example 2A (1);
  • SEQ ID NO: 23 Nucleotide sequence encoding sucrose phosphorylase having an amino acid substitution at the C-terminus and a sugar chain used in Example 7,
  • SEQ ID NO: 24 Amino acid sequence of sucrose phosphorylase having an amino acid substitution at the C-terminus and a sugar chain used in Example 7,
  • SEQ ID NO: 25 amino acid sequence of motif sequence 1;
  • SEQ ID NO: 26 amino acid sequence of motif sequence 2;
  • SEQ ID NO: 27 Amino acid sequence of motif sequence 3.
  • sucrose phosphorylase and “SP” are used interchangeably unless otherwise indicated, and refer to an enzyme having sucrose phosphorylase activity.
  • sucrose Phosphorylase is classified in EC 2.4.1.7. The reaction catalyzed by sucrose phosphorylase is described by the following equation:
  • Sucrose phosphorylase is included in various organisms in nature.
  • organisms that produce sucrose phosphorylase include bacteria belonging to the genus Streptococcus (e.g., Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae streptococcus sorbin us, Streptococcus thermophilus and Streptococcus mitis), Leuconost oc mesenteroides, Oenococcus luenibacteria (Eg, Bifidobacterium longum and Bifidobacterium ad olescentis) Agrobacterium sp. (Eg, Agrobacterium vitis), Pseudom onas sp.
  • Streptococcus e.g., Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae streptococcus sorbin us, Streptococcus thermophilus and Streptococcus mitis
  • Organisms producing sucrose phosphorylase are not limited to these
  • the first (eg, natural) sucrose phosphorylase used in the method of the present invention is more preferably derived from a mesophilic bacterium, which is preferably derived from a bacterium.
  • these sucrose phosphorylases are not thermostable. Therefore, high temperature (for example, about 50.
  • the reaction cannot be sufficiently catalyzed. Therefore, if the reaction is carried out at about 30 ° C to about 40 ° C in accordance with the optimal temperature for the reaction of bacterial SP, the problem of bacterial contamination or the aging and deterioration of hegnolecan may occur. Gnolecan or G-1-P cannot be produced efficiently.
  • the term "derived from” an organism does not only mean that the enzyme is directly isolated from the organism, but that the enzyme is obtained by utilizing the organism in some way. Means that For example, when a gene encoding the enzyme obtained from the organism is introduced into E. coli and the enzyme is isolated from the E. coli, the enzyme is also "derived” from the organism.
  • the nucleotide sequence encoding the natural sucrose phosphorylase of Streptococcus mutans is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Streptococcus mutans is also known to have a natural sucrose phosphorylase having an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid at position 47 is threonine
  • the amino acid at position 62 is serine
  • the amino acid at position 77 is tyrosine.
  • the amino acid at position 128 is valine
  • the amino acid at position 140 is lysine
  • the amino acid at position 144 is glutamine
  • the amino acid at position 155 is asparagine, so that any of these sucrose phosphorylases Also have almost the same heat resistance.
  • a ⁇ native '' sucrose phosphorylase is a sucrose phosphorylase obtained by genetic recombination having the same amino acid sequence as the native sucrose phosphorylase, which is different from a sucrose phosphorylase originally isolated from a bacterium that produces sucrose phosphorylase. Is also included.
  • nucleotide sequence encoding the natural sucrose phosphorylase of Streptococcus pneumoniae is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the base sequence IJ encoding the natural sucrose phosphorylase of Streptococcus sorbinus is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • nucleotide sequence encoding the natural sucrose phosphorylase of Leuconostoc mesenteroides is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
  • nucleotide sequence encoding the natural sucrose phosphorylase of Oenococcus oeni is shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • nucleotide sequence encoding the natural sucrose phosphorylase of Streptococcus mitis is shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • nucleotide sequence encoding the second natural sucrose phosphorylase of Leuconostoc mesenteroides is shown in SEQ ID NO: 13, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14.
  • nucleotide sequence encoding the first natural sucrose phosphorylase of Lactobacillus acidophilus is shown in SEQ ID NO: 15, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16.
  • nucleotide sequence encoding the second natural sucrose phosphorylase of Lactobacillus acidophilus is shown in SEQ ID NO: 17, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the base sequence encoding Listeria monocytogenes natural sucrose phosphorylase is shown in SEQ ID NO: 19, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 20.
  • the base sequence and amino acid sequence of these natural sucrose phosphorylases are examples, and it is not possible that a variant having a sequence slightly different from these sequences (a so-called allelic variant) can naturally exist. It is known. In the present invention, in addition to sucrose phosphorylase having the exemplified sequence, such a naturally occurring variant can be used for heat resistance.
  • the first (for example, natural) sucrose phosphorylase used in the method of the present invention includes Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae ⁇ Streptococcus sorbinus, Streptococcus mitis, Leuconostoc mesenteroides, Oenococcus oe ni, Lactobacillus acidophilus and It is more preferable that it is derived from Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae ⁇ Strepto coccus sorDinus or Streptococcus mitis. Natural skull 1 ⁇ sphosphofuri 1 ⁇ ze (or more preferably, derived from Leuconostoc mesenteroides).
  • a sucrose phosphorylase gene can be obtained by designing primers with reference to a known sucrose phosphorylase sequence, and performing PCR using a genomic library from which a sucrose phosphorylase gene is to be obtained as a ⁇ type.
  • a genomic library from which a sucrose phosphorylase gene is to be obtained as a ⁇ type.
  • SP gene sequence information it is also possible to directly produce an SP gene by chemical synthesis without using a genomic library. Gene synthesis methods are described, for example, in Te'o et al. (F EMS Microbiological Letters, volume 190, pages 13-19, 2000).
  • the obtained SP gene can be inserted into an appropriate vector by a method well known to those skilled in the art.
  • pMW118 manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.
  • pUC18 manufactured by Takara Bio Inc.
  • ⁇ mers233-2 manufactured by Amersham-Pharmacia-Biotech
  • pUBl 10 available from the American Type Culture Collection
  • pHY300PLK Teakara Bio Inc.
  • the method of the present invention comprises a step of modifying a first nucleic acid molecule containing a base sequence encoding a first sucrose phosphorylase to obtain a second nucleic acid molecule containing a modified base sequence; A step of preparing an expression vector; a step of introducing the expression vector into cells to express sucrose phosphorylase having improved thermostability; and a step of collecting the expressed sucrose phosphorylase having improved thermostability.
  • Nucleic acid molecules comprising a base sequence encoding the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention are also within the scope of the present invention. Such a nucleic acid molecule can be obtained based on the disclosure of the present specification using a method known in the art.
  • a nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding a natural sucrose phosphorylase can be directly isolated from a sucrose phosphorylase-producing bacterium existing in nature as described above.
  • sucrose phosphorylase is isolated from Streptococcus mutans and the like.
  • Streptococcus mutans is inoculated into an appropriate medium (for example, LB medium), and cultured overnight at 37 ° C with shaking.
  • an appropriate medium for example, LB medium
  • the culture is centrifuged to collect Streptococcus mutans cells.
  • the obtained cells are suspended in a 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.0), and then crushed by sonication to obtain a cell lysate.
  • sucrose is added to the cell lysate to obtain a cell lysate containing 10% sucrose.
  • the lysate is heated in a 55 ° C water bath for 30 minutes. After heating, the lysate is centrifuged using a centrifuge (AVANTI-251, manufactured by Beckman) to remove insoluble proteins and the like, thereby obtaining a supernatant.
  • the resulting supernatant is passed through a pre-equilibrated anion exchange resin, Q-Sepharose, to adsorb sucrose phosphorylase on the resin.
  • the resin is washed with a buffer containing 100 mM sodium chloride to remove impurities.
  • sucrose phosphorylase is eluted with a buffer containing 300 mM sodium chloride to obtain a sucrose phosphorylase enzyme solution derived from Streptococcus mutans.
  • a sucrose phosphorylase-containing solution that can be used for trypsin treatment may be required to be further purified in some cases.
  • sucrose phosphorylase-containing solution derived from Streptococcus mutans can be obtained by combining the fractions obtained by hydrophobic chromatography. Purification of sucrose phosphorylase from other bacterial species can be performed as well.
  • the purified sucrose phosphorylase thus obtained was treated with trypsin, the trypsin-treated fragment obtained was separated by HPLC, and the amino acid sequence at the N-terminal of the separated peptide fragment was compared with the peptide. Identify by sequencer. Subsequently, by using a synthetic oligonucleotide probe prepared based on the identified amino acid sequence to screen an appropriate genomic library or cDNA library, a nucleic acid molecule containing a base sequence encoding a natural sucrose phosphorylase (gene ). Basic strategies for preparing oligonucleotide probes and DNA libraries, and for screening them by nucleic acid hybridization, are well known to those skilled in the art.
  • degenerate primers corresponding to regions conserved in the amino acid sequences of various sucrose phosphorylases can be prepared, and the sucrose phosphorylase base sequence can be obtained by PCR. Such methods are known in the art.
  • the obtained nucleic acid molecule is well known to those skilled in the art. Can be subcloned using the method described above.
  • a plasmid containing the target gene can be easily obtained by mixing ⁇ phage containing the target gene, appropriate E. coli, and an appropriate helper phage. Then, the target gene can be subcloned by transforming appropriate E. coli using the solution containing the plasmid.
  • the obtained transformant is cultured to obtain a plasmid DN ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ by, for example, the alkaline SDS method, and the nucleotide sequence of the gene of interest can be determined.
  • the method for determining the nucleotide sequence is well known to those skilled in the art. Furthermore, the primers synthesized based on the base sequence of the DNA fragment are used as primers, genomic DNA such as Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae ⁇ Streptococcus sorbinus, and the like, and the sucrose phosphorylase gene is directly used using the polymerase chain reaction (PCR). Can also be amplified.
  • nucleic acid molecule may be composed of only natural nucleotides, may be composed of non-natural nucleotides, or may be composed of only non-natural nucleotides.
  • non-natural nucleotides include derivative nucleotides (also called nucleotide analogs). “Derivative nucleotides” and “nucleotide analogs” refer to those that are different from naturally occurring nucleotides, but that have functions similar to those of the original nucleotides. Such derivative nucleotides and nucleotide analogs are well-known in the art.
  • nucleotides and nucleotide analogs examples include phosphorothioate, phosphoramidate, methylphosphonate, chiral methylphosphonate, 2-0-methylribonucleotide, peptide-nucleic acid (PNA) Power is not limited to these.
  • the first nucleic acid molecule containing the nucleotide sequence encoding the first sucrose phosphorylase is modified to obtain a second nucleic acid molecule containing the modified nucleotide sequence.
  • the first nucleic acid molecule may be a nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding a natural sucrose phosphorylase, obtained as described in (2.1) above.
  • the first nucleic acid molecule also has one or more amino acids substituted, deleted or added to the native sucrose phosphorylase having an enzymatic activity substantially similar to that of the native sucrose phosphorylase.
  • Sucrose It may be a nucleic acid molecule containing a base sequence encoding phosphorylase.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 is shown as an example of such a nucleotide sequence encoding sucrose phosphorylase in which amino acids have been substituted and added to natural sucrose phosphorylase.
  • This base sequence is obtained by substituting 4 bases at the 3 'end with respect to the natural base sequence (ie, base sequence 1J of SEQ ID NO: 1), and further adding 18 bases at the 3' end.
  • the amino acid sequence encoded by this nucleotide sequence (amino acid sequence 1J of SEQ ID NO: 24) is the same as that of the natural amino acid sequence (namely, amino acid sequence 1J of SEQ ID NO: 2) except that two C-terminal amino acids are substituted.
  • sucrose phosphorylase has an additional 6 amino acids at the C-terminus, but its enzymatic activity is substantially the same as that of natural sucrose phosphorylase. "Having substantially the same enzyme activity” means that a sucrose phosphorylase having an amino acid substitution, deletion or addition to the amino acid sequence of natural sucrose phosphorylase is measured under the same conditions as natural sucrose phosphorylase. Enzyme activity of sucrose phosphorylase is within 20% of the enzyme activity of natural sucrose phosphorylase. Preferably it is within ⁇ 10%, more preferably within ⁇ 5%.
  • the modification may be performed by a method known in the art, for example, site-directed mutagenesis, mutagenesis using a mutagen (treatment of the target gene with a mutagen such as nitrite, ultraviolet light). Processing), performing error-prone PCR, and the like. It is preferable to use site-directed mutagenesis because the desired mutation is easily obtained. This is because, if site-directed mutagenesis is used, the desired modification can be introduced at the desired site. Alternatively, a nucleic acid molecule having a target sequence may be directly synthesized. Such methods of chemical synthesis are well known in the art.
  • the present inventors have found that the substitution of an amino acid residue at a specific position in the amino acid sequence of sucrose phosphorylase with another amino acid residue improves the heat resistance of the resulting modified sucrose phosphorylase.
  • Such a particular position can be determined by aligning the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the following motif sequence:
  • Motif sequence 1 AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPID YHEVDS AFGDWDD VKRLGEKYYLMFDFMINHIS (SEQ ID NO: 25);
  • Motif sequence 2 RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTF GEEQID (SEQ ID NO: 26); and (SEQ ID NO: 27).
  • the motif arrangements 1J1, 2 and 3 are present in the amino acid sequence of sucrose phosphorylase derived from Streptococcus mutans (SEQ ID NO: 2). These motif sequences are located at the following positions in the sucrose phosphorylase of Streptococcus mutans: mochief sequence 1: positions 34 to 89 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; motif sequence 2: the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Motif sequence 3: 231 to 268 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • native sucrose phosphorylase has these motif sequences or sequences with high homology to them. The location of these motif sequences for other sucrose phosphorylases can be easily determined by one skilled in the art.
  • the nucleic acid molecule containing the nucleotide sequence encoding the first sucrose phosphorylase has a sucrose phosphorylase having improved thermostability encoded by the modified nucleic acid molecule at position 14 in the motif sequence 1.
  • the nucleic acid molecule containing the nucleotide sequence encoding the first sucrose phosphorylase corresponds to threonine (T47) at position 47 of the amino acid sequence of sucrose phosphorylase having improved thermostability encoded by the modified nucleic acid molecule.
  • Position, position 62 corresponding to serine (S62), position 77 corresponding to tyrosine (Y77), position 128 corresponding to valine (VI 28), position 140 corresponding to lysine (K140), 144 Glutamine (Q144), 155 asparagine (N155) and 249 aspartic acid (D249) at least one position selected from the group consisting of It is modified to have an amino acid residue different from that of sucrose phosphorylase.
  • Smell in at least two positions More preferably in at least three positions, even more preferably in at least four positions, even more preferably in at least five positions, even more preferably in at least six positions, particularly preferably in at least seven positions. Most preferably at all eight positions it is modified differently from the natural sucrose phosphorylase described above.
  • the nucleic acid molecule containing the nucleotide sequence encoding the first sucrose phosphorylase corresponds to at least position 14 in the motif sequence 1 of the sucrose phosphorylase having improved thermostability encoded by the modified nucleic acid molecule. (Or a position corresponding to threonine (T47) at position 47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2), which is different from the above-mentioned natural sucrose phosphorylase.
  • the nucleic acid molecule containing the nucleotide sequence encoding the first sucrose phosphorylase corresponds to at least position 19 in motif sequence 3 of the sucrose phosphorylase having improved thermostability encoded by the modified nucleic acid molecule. (Or a position corresponding to position 249 of aspartic acid (D249) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2), which is different from the above natural sucrose phosphorylase.
  • the nucleic acid molecule containing the nucleotide sequence encoding the first sucrose phosphorylase corresponds to at least position 34 in motif sequence 2 of the sucrose phosphorylase having improved thermostability encoded by the modified nucleic acid molecule. (Or a position corresponding to asparagine 155 (N155) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2). It is modified to be different from sulphophosphorylase.
  • the nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence encoding the first sucrose phosphorylase is at least the position of the following combination of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the thermostable sucrose phosphorylase encoded by the modified nucleic acid molecule. Is modified to differ from the natural sucrose phosphorylase at a position corresponding to:
  • Position corresponding to position 14 in motif sequence 1 and position 29 in motif sequence 1 A combination of a corresponding position, a position corresponding to position 19 in motif sequence 2, a position corresponding to position 34 in motif sequence 2, and a position corresponding to position 19 in motif sequence 3;
  • (22) a combination of a position corresponding to position 14 in motif sequence 1, a position corresponding to position 29 in motif sequence 1, and a position corresponding to position 7 in motif sequence 2;
  • the nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence encoding the first sucrose phosphorylase is at least the position of the following combination of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sucrose phosphorylase having improved thermostability encoded by the modified nucleic acid molecule. Is modified to differ from the natural sucrose phosphorylase at a position corresponding to:
  • (11) a combination of a position corresponding to $ 47, a position corresponding to S62, a position corresponding to $ 77, a position corresponding to Q144, a position corresponding to N155, and a position corresponding to D249;
  • (21) a combination of a position corresponding to $ 77, a position corresponding to K140, a position corresponding to Q144, and a position corresponding to D249;
  • (22) a combination of a position corresponding to $ 47, a position corresponding to S62, and a position corresponding to V128;
  • ⁇ the position corresponding to threonine 47 ( ⁇ 47) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 '' means that the amino acid sequence of interest has the highest homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the gap is not counted as the number of amino acid residues. More preferably, in the multiple alignment of GEN ETYX-WIN Ver.
  • R -4 0, ...- ⁇ ,--2,--3, 0 r -1,--1, 1, 2, 6,
  • the multiple alignment of GENETYX-WIN Ver.4.0 is based on the following algorithm.
  • this alignment program all arrays to be aligned are arrayed, and a total of 2 arrays are arrayed (pairwise alignment), and the conserved ratio of common sequences (score in pairwise alignment)
  • create a virtual sequence from the common sequence choose one sequence for the unmatched portion without changing the common portion.
  • the brute force of all the arrays except the arrays constituting the virtual array and the virtual array is repeated in the same procedure until the last virtual array is created.
  • information on GAP insertion and displacement when the virtual array is created is The multi-alignment is completed by applying to the columns to form the whole.
  • the formula for calculating this pairwise alignment is as follows.
  • arrays a and b having an array length of m and n, respectively.
  • E (i, j) max [G (i-1, j)-a, E (i-1, j) — ⁇ )
  • G (i, j) max ⁇ E (i, j), G (i-1. J -1) + s (ai, bj). F (i, j) ⁇
  • a is the penalty for GAP insertion
  • ⁇ is the penalty for GAP extension
  • E, F, and G are score matrices, from which a path matrix is created.
  • Position 62 corresponds to serine (S62); position 77 corresponds to tyrosine (Y77); position 128 corresponds to valine (V128); position 140 corresponds to lysine (K140); position 144 corresponds to dal
  • S62 serine
  • Y77 tyrosine
  • V128 valine
  • V128 valine
  • K140 lysine
  • position 144 corresponds to dal
  • Tamine Q144
  • N155 Asparagine 155
  • D249 Aspartic acid 249
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20 were aligned with SEQ ID NO: 2.
  • threonine, isoleucine, phenylalanine or serine was juxtaposed at a position corresponding to threonine 47 (T47) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Serine, alanine, proline or glutamic acid was juxtaposed at the position corresponding to serine 62 (S62).
  • tyrosine At the position corresponding to the position tyrosine (Y77), tyrosine, phosphoric acid, leucine, histidine, serine or alanine were juxtaposed. Phosphorus, isoleucine or leucine were juxtaposed at the position corresponding to valine 128 (V128). Lysine, methionine, threonine, isoleucine, phenylalanine, or glutamine were juxtaposed at the position corresponding to position 140 lysine (K140). Valine, threonine, arginine, aspartic acid, lysine, serine or glutamine were juxtaposed at the position corresponding to position 144 glutamine (Q144).
  • FIG. 1A indicates the amino acid sequence of sucrose phosphorylase derived from Streptococcus mutans.
  • StPSP indicates the amino acid sequence of sucrose phosphorylase derived from Streptococcus pneu moniae.
  • “StSSP” indicates the amino acid sequence of sucrose phosphorylase derived from Strep tococcus sorbinus.
  • “LeuS Pl” indicates the amino acid sequence of the first sucrose phosphorylase from Leuconostoc mesenteroides.
  • “LeuSP2” indicates the amino acid sequence of a second sucrose phosphorylase from Leuconostoc mesenteroides.
  • “OenSP” indicates the amino acid sequence of sucrose phosphorylase derived from Oenococcus oeni.
  • “LBSP1” indicates the amino acid sequence of the first sucrose phosphorylase derived from Lactobacillus acidophilus.
  • “LBSP2” indicates the amino acid sequence of the second sucrose phosphorylase derived from Lactobacillus acidophilus.
  • “ListSP2” indicates the amino acid sequence of sucrose phosphorylase derived from Listeria monocytogenes.
  • amino acid sequence of SP derived from Streptococcus mitis (SEQ ID NO: 12), amino acid sequence of SP derived from Leuconostoc mesenteroides IK SEQ ID NO: 14)
  • amino acid sequence of the first SP of Lactobacillus acidophilus (SEQ ID NO: 16)
  • amino acid sequence of the second SP of Lactobacillus acidophilus (SEQ ID NO: 18)
  • amino acid sequence of SP from Listeria monocytogenes SEQ ID NO: 20
  • the position corresponding to threonine 47 (T47) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 corresponds to SEQ ID NO: 2.
  • the position corresponding to position 47 in the amino acid sequence of No. 4 and the position corresponding to serine (S62) in position 62 is position 62 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the position corresponding to tyrosine 77 (Y77) in position No.
  • Position 155 and corresponding to position 249 aspartic acid (D249) is position 249 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the position corresponding to T47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is position 47 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and the position corresponding to S62 is SEQ ID NO: Position 62 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, the position corresponding to Y77 is position 77 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, the position corresponding to VI 28 is position 128 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, 140
  • the position corresponding to position lysine (K140) is position 140 in SEQ ID NO: 6, the position corresponding to Q144 is position 144 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and the position corresponding to N155 is SEQ ID NO: 6. Is position 155 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and the position corresponding to D249 is position 249 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the position corresponding to T47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is position 47 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
  • the position corresponding to S62 is SEQ ID NO: 8.
  • the position corresponding to Y77 is position 77 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
  • the position corresponding to V128 is the position 131 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and the position 140.
  • the position corresponding to lysine (K140) is position 143 of SEQ ID NO: 8
  • the position corresponding to Q144 is position 147 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
  • the position corresponding to N155 is SEQ ID NO: 8.
  • Position 158 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and the position corresponding to D249 is position 252 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the position corresponding to T47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is position 47 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • the position corresponding to S62 is SEQ ID NO: It is position 62 of the amino acid sequence of 10, and is not compatible with Y77.
  • the corresponding position is position 77 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • the position corresponding to V128 is position 128 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • the position corresponding to K140 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the position corresponding to Q144 is position 144 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • the position corresponding to N155 is the position 155 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • the position corresponding to T47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is position 47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • the position corresponding to S62 is SEQ ID NO: 12.
  • Position 62 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 a position corresponding to Y77 is position 77 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • a position corresponding to V128 is position 128 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and corresponding to K140.
  • the position corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 is position 140, the position corresponding to Q144 is position 144 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and the position corresponding to N155 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. At position 155 and corresponding to D249 is position 249 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the position corresponding to T47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is position 47 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and corresponds to S62.
  • the position is position 62 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14
  • the position corresponding to Y77 is position 77 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14
  • the position corresponding to V128 is position 131 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the position corresponding to K140 is position 143 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, the position corresponding to Q144 is position 147 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and the position corresponding to N155 is Position 158 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and the position corresponding to D249 is position 252 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the position corresponding to T47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is position 47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and the position corresponding to S62.
  • Is position 62 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 the position corresponding to Y77 is position 77 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and The corresponding position is position 128 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • the position corresponding to K140 is position 140 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • the position corresponding to Q144 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the position corresponding to N155 is position 155 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and the position corresponding to D249 is position 249 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the position corresponding to T47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is position 47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and corresponds to S62.
  • the position corresponding to is position 62 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, the position corresponding to Y77 is position 77 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and the position corresponding to V128 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the position corresponding to K140 is position 140 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, the position corresponding to Q144 is the position 144 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and the position corresponding to N155. Is at position 155 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and the position corresponding to D249 is at position 249 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the position corresponding to T47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is position 47 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, and the position corresponding to S62 is SEQ ID NO: 20
  • position corresponding to Y77 is position 77 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20
  • position corresponding to V128 is position 128 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20
  • the corresponding position is position 140 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20
  • the position corresponding to Q144 is position 144 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20
  • the position corresponding to N155 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • Position 155 of the sequence and corresponding to D249 is position 249 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the position of the amino acid residue that improves the heat resistance is selected from the group consisting of the motif sequences 1, 2, and 3 as well as being aligned with SEQ ID NO: 2 having a length of 481 amino acid residues. It can be determined by aligning with one or more sequences.
  • amino acid sequence of SP having high homology to SEQ ID NO: 2 for example, having a homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 of about 40% or more
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 6) 8 Ami No acid sequence, amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and amino acid sequence of SEQ ID NO: 20
  • the positions determined in this way are the same both when SEQ ID NO: 2 is used and when motif sequences 1, 2, and 3 are used.
  • Motif sequence 1 is well conserved in sucrose phosphorylase, and particularly well conserved in sucrose phosphorylase derived from the genus Streptococcus.
  • the position corresponding to threonine (T47) at position 47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be said to be the position corresponding to position 14 in motif sequence 1.
  • Motif sequence 2 is well conserved in sucrose phosphorylase.
  • the position corresponding to valine (V128) at position 128 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be said to be a position corresponding to position 7 in motif sequence 2.
  • Motif sequence 3 is conserved by sucrose phosphorylase.
  • the position corresponding to position 249 aspartic acid (D249) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be said to be the position corresponding to position 19 in motif sequence 3.
  • the position of an amino acid residue that improves heat resistance can also be identified by using a motif sequence.
  • the positions of amino acid residues that improve heat resistance are
  • motif sequence 2 positions corresponding to position 7, positions 19, and position 23 in RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFAD GSVEHLWNTFGEEQID. And a position corresponding to position 34; and motif sequence 3: at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to position 19 in ILPEIHEH YTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG.
  • the nucleic acid molecule containing the base sequence encoding the first sucrose phosphorylase is a sucrose phosphorylase having improved thermostability encoded by the modified nucleic acid molecule, the motif sequence 1: AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSA FGDWDD VKRLGEKYYLMFDFMINHIS Position corresponding to position 14, position corresponding to position 29, and position corresponding to position 44; motif sequence 2: RPTQEDVDLIYK At least one selected from the group consisting of a position corresponding to position 7, a position corresponding to position 19, a position corresponding to position 23 and a position corresponding to position 34 in RKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTFGEEQID; The position can be changed if it is modified to have an amino acid residue different from the amino acid residue of the natural sucrose phosphorylase.
  • motif sequence refers to a common or highly conserved partial sequence found between amino acid sequences of a plurality of proteins. In general, a motif sequence often has a specific function, but in the present specification, even if it does not have such a specific function, if it is conserved among a plurality of amino acid sequences, it will be regarded as a motif sequence. Call.
  • amino acid residue at position 14 in motif sequence 1 refers to the 14th amino acid residue when the amino acid residue at the N-terminal (left end) of motif sequence 1 is counted in order as position 1. .
  • Position 29 in motivation sequence 1 refers to the 14th amino acid residue when the amino acid residue at the N-terminal (left end) of motif sequence 1 is counted in order as position 1.
  • Position 44 in motif sequence 1 refers to the 14th amino acid residue when the amino acid residue at the N-terminal (left end) of motif sequence 1 is counted in order as position 1.
  • Position 29 in motivation sequence 1 refers to the 14th amino acid residue when the amino acid residue at the N-terminal (left end) of motif sequence 1 is counted in order as position 1.
  • Position 44 in motif sequence 1 refers to the 14th amino acid residue when the amino acid residue at the N-terminal (left end) of motif sequence 1 is counted in order as position 1.
  • Position 44 in motif sequence 1 refers to the 14th amino acid residue when the amino acid residue at the N
  • FIG. 1A shows the position of motif sequence 1, the position of motif sequence 2 and the position of motif sequence 3 (first half). The position of motif sequence 3 (the latter half) is shown in FIG. 1B.
  • motif sequence 1 position corresponding to position 14 in AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPI DYHEVDSAFGDWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS
  • motif sequence 1 so as to have the highest homology.
  • Tori system [J (Tori system [J number 4]), the amino acid sequence of the second SP from Streptococcus sorbinus; The amino acid sequence of SP derived from Oenococcus oeni (SEQ ID NO: 10), the amino acid sequence of SP from Streptococcus mitis (SEQ ID NO: 12), the amino acid sequence of the second SP of Leuconostoc mesenteroides (SEQ ID NO: 14) ), The amino acid sequence of the first SP of Lactobacillus acidophilus (SEQ ID NO: 16), the amino acid sequence of the second SP of Lactobacillus acidophilus (SEQ ID NO: 18) and the amino acid sequence of SP from Listeria monocytogenes (SEQ ID NO: 20) ).
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, sequence No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18 and SEQ ID No. 20 were aligned with the motif sequence (motif sequence 1, 2 or 3).
  • the position corresponding to position 14 in motif sequence 1 corresponds to threonine or asparagine force
  • the position corresponding to position 29 in motif sequence 1 corresponds to position 44 in serine, proline or alanine force motif sequence 1
  • the position corresponding to position 7 in motif sequence 2 is valine, isoleucine or leucine
  • the position corresponding to position 19 in motif sequence 2 is lysine, methionine, threonine, isoleucine, tyrosine or tyrosine.
  • Phenylalanine has glutamine, norin, threonine, lysine or glutamic acid at the position corresponding to position 23 in motif sequence 2, and asparagine force at position 34 corresponding to motif sequence 2 in motif sequence 3.
  • Aspartic acid or glycine were juxtaposed at positions corresponding to the positions.
  • Motif sequences 1, 2 and 3 are partial sequences of SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26
  • SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 30 For each of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 30, the result of alignment using the full length of SEQ ID NO: 2 was compared with the result of alignment using motif sequences 1, 2, and 3.
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: in each of 26, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 30, the position corresponding to position 47 of SEQ ID NO: 2 and the position corresponding to position 14 in motif sequence 1 were the same.
  • the position corresponding to position 62 in SEQ ID NO: 2 was the same as the position corresponding to position 29 in motif sequence 1.
  • the position corresponding to position 77 in SEQ ID NO: 2 was the same as the position corresponding to position 44 in motif sequence 1.
  • the position corresponding to position 128 in SEQ ID NO: 2 was the same as the position corresponding to position 7 in motif sequence 2.
  • the position corresponding to position 140 in SEQ ID NO: 2 was the same as the position corresponding to position 19 in motif sequence 2.
  • the position corresponding to position 144 in SEQ ID NO: 2 was the same as the position corresponding to position 19 in motif sequence 1.
  • the position corresponding to position 155 in SEQ ID NO: 2 was identical to the position corresponding to position 34 in motif sequence 2.
  • the position corresponding to position 249 in SEQ ID NO: 2 and the position corresponding to position 19 in motif sequence 3 were identical. As described above, it was confirmed that the same position as that when the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was used was identified even when the alignment was performed using the motif sequence.
  • amino acid represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 20 in the sequence listing Nucleic acid molecules containing a modified base sequence obtained by modifying a nucleic acid molecule containing a base sequence encoding an acid sequence are within the scope of the present invention.
  • a nucleic acid molecule containing a modified base sequence obtained by modifying a nucleic acid molecule containing a sequence is within the scope of the present invention.
  • SEQ ID NO: 2 From the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 20 in the sequence listing has at least 40% (preferably at least 60%) identity with the selected amino acid sequence IJ
  • Nucleic acid molecules containing a modified base sequence obtained by modifying a nucleic acid molecule containing a base sequence encoding an amino acid sequence are within the scope of the present invention.
  • identity refers to the same amino acid (base sequence when comparing base sequences) between two sequences ) Appears. Generally, it is determined by comparing the sequences of two amino acids or bases and comparing these two sequences, which are aligned in an optimal manner that may include additions or deletions. The percent identity determines the number of positions where the amino acid (or base, when comparing base sequences) is the same between the two sequences, divides the number of identical positions by the total number of positions compared, and It is calculated by multiplying the obtained result by 100 to get the percent identity between the two sequences.
  • the amino acid sequence of the first (eg, natural) sucrose phosphorylase used to obtain the thermostable sucrose phosphorylase of the present invention may be, in one embodiment, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20 (that is, a control amino acid sequence IJ) It may be identical, ie, 100% identical, and in another embodiment, the amino acid sequence may have a certain number of amino acid changes compared to a reference amino acid sequence.
  • Such alterations can be selected from the group consisting of deletions, substitutions, including conservative and non-conservative substitutions, or insertions of at least one amino acid. This change may occur at the amino or carboxy terminus of the reference amino acid sequence, or at any position other than these termini. Changes in amino acid residues may be scattered one residue at a time or may be several consecutive residues.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the first (for example, natural) sucrose phosphorylase used to obtain the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention encodes these control amino acid sequences. It may be up to a certain number compared to the nucleotide sequence 1J (ie, the control base sequence 1J). Such alterations can be selected from the group consisting of deletion of at least one nucleotide, substitutions including transitions and transversions, or insertions. This change may occur at the 5 'end or 3' end of the control base sequence or at any position other than these ends. Base changes are It may be scattered one base at a time, may be several bases in a row, may be.
  • Changes in bases can cause nonsense, missense or frameshift mutations in the coding sequence, and can cause changes in the SP encoded by the base sequence following such changes.
  • the amino acid sequence between the amino acid sequences is typically at least 20%, preferably at least 30%, more preferably at least 40%, and even more preferably at least 50%. %, Particularly preferably at least 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical.
  • the first (for example, natural) enzyme or nucleic acid molecule also includes a nucleotide sequence encoding the first sucrose phosphorylase or an amino acid sequence of the first sucrose phosphorylase specifically described herein. Those having sequences that are not identical but homologous to (eg, SEQ ID NOs: 1, 2 etc.) can also be used.
  • Such an enzyme or nucleic acid molecule having homology to a first (eg, natural) enzyme or nucleic acid molecule may include, for example, the above conditions in the GENETYX-WIN Ver. 4.0 maximum matching.
  • nucleic acid at least about 30%, about 35%, about 40%, about 45%, about 50%, about 55%, about 60%, about A nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence having 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, about 99% identity; and in the case of an enzyme, At least about 40%, about 45%, about 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95% or Examples include, but are not limited to, enzymes having an amino acid sequence having about 99% identity.
  • nucleic acid molecule containing a modified nucleotide sequence obtained by modifying a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid molecule consisting of the selected nucleotide sequence is within the scope of the present invention.
  • nucleic acid molecules consisting of Nucleic acid molecules containing a modified base sequence obtained by modifying a nucleic acid molecule to be hybridized are also included in the scope of the present invention.
  • nucleic acid molecules consisting of Nucleic acid molecules containing a modified base sequence obtained by modifying a nucleic acid molecule to be hybridized are also included in the scope of the present invention.
  • One skilled in the art can easily select a desired sucrose phosphorylase gene.
  • stringent conditions refers to conditions that hybridize to a specific sequence but do not hybridize to a non-specific sequence.
  • the setting of stringent conditions is well known to those skilled in the art and is described, for example, in Moleculer Cloning (Sambrook et al., Supra).
  • a 0.1-fold concentration of SSC (saline-sodium citrate) solution refers to a polynucleotide that can be identified by using the condition that the filter is washed at 65 ° C.
  • the modified nucleic acid molecule used in the method of the present invention may be a nucleic acid molecule that is conservatively modified with respect to a nucleic acid molecule containing a base sequence encoding the first sucrose phosphorylase.
  • a conservatively modified nucleic acid molecule preferably has a conservative modification other than the modification intended for the present invention.
  • a nucleic acid molecule which is conservatively modified with respect to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding the first sucrose phosphorylase is a nucleotide sequence encoding the first sucrose phosphorylase.
  • J refers to an amino acid sequence having essentially the same enzymatic activity as the first sucrose phosphorylase. . Due to the degeneracy of the genetic code, a large number of functionally identical base sequences encode any given amino acid sequence. For example, the codons GCA, GCC, GCG and GCU all encode the amino acid alanine. Thus, at every position where an alanine is specified by a GCA codon, that codon is Without changing GCC, GCG or GCU can be changed.
  • the codon is an optional amino acid encoding the amino acid without altering the particular amino acid encoded. Can be changed to another codon.
  • Such variation in the base sequence is a “silent mutation” which is one type of conservatively modified mutation. Every nucleotide sequence herein which encodes a polypeptide also includes all possible silent modifications of the nucleic acid. Silent mutations include "silent substitution" in which the encoding nucleic acid does not change, and cases where the nucleic acid does not encode an amino acid in the first place. When a nucleic acid encodes an amino acid, silent mutation is synonymous with silent substitution.
  • silent substitution refers to a substitution of a base sequence encoding one amino acid with another base sequence encoding the same amino acid in the base sequence. Based on the phenomenon of degeneracy in the genetic code, such a silent substitution is possible when there are a plurality of base sequences encoding a certain amino acid (eg, glycine). Therefore, a polypeptide having the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence generated by silent substitution has the same amino acid sequence as the original polypeptide.
  • the desired modification of the present invention (position corresponding to position 14, position corresponding to position 29, and position corresponding to position 44 in motif sequence 1; motif A position corresponding to position 7, a position corresponding to position 19, a position corresponding to position 23, and a position corresponding to position 34 in sequence 2; and a group consisting of positions corresponding to position 19 in motif sequence 3.
  • each codon in a nucleic acid (AUG, which is usually the only codon encoding methionine, and usually encodes tryptophan) (Except for TGG, which is the only codon that does), can be modified to produce a functionally identical molecule. Accordingly, each silent variation of a nucleic acid which encodes a polypeptide is implicit in each described sequence. Preferably, such modifications can be made to avoid substitution of cysteine, an amino acid that greatly affects the conformation of a polypeptide.
  • the nucleotide sequence encoding the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention can be changed in accordance with the frequency of codon usage in an organism to be introduced for expression. Codon usage reflects the frequency of use in genes that are highly expressed in the organism. For example, if it is intended to be expressed in E. coli, it may be expressed in E. coli according to a published codon usage table (eg, Sharp et al., Nucleic Acids Research 16, No. 17, page 8207 (1988)). Can be optimized for
  • An expression vector is prepared using the nucleic acid molecule containing the nucleotide sequence modified as described above. Methods for producing an expression vector using a specific nucleic acid sequence are well known to those skilled in the art.
  • a "vector” refers to a nucleic acid molecule capable of transferring a target base sequence into a target cell.
  • a vector may be a promoter capable of autonomous replication in the target cell or a promoter capable of integrating into the chromosome of the target cell and suitable for transcription of the modified nucleotide sequence. What is contained is exemplified.
  • a vector can be a plasmid.
  • the term "expression vector” refers to a vector that can express a modified base sequence (ie, a base sequence 1J encoding a modified sucrose phosphorylase) in a target cell.
  • the expression vector contains, in addition to the modified nucleotide sequence, various regulatory elements such as a promoter that regulates its expression, and, if necessary, factors necessary for replication in the target cell and selection of recombinants. (Eg, origin of replication (ori), and selectable markers such as drug resistance genes).
  • the modified base sequence is operably linked so as to be transcribed and translated. Adjustment element Examples include promoters, terminators and enhancers.
  • the nucleotide sequence encoding the secretory signal peptide is bound by a correct reading frame upstream of the modified nucleotide sequence.
  • the type of expression vector used to introduce a particular organism eg, a bacterium
  • the types of regulatory elements and other factors used in the expression vector may vary depending on the cell of interest. Is a matter well known to those skilled in the art.
  • terminal 1 is a sequence located downstream of a protein coding region and involved in terminating transcription when a base sequence is transcribed into mRNA and adding a poly A sequence. . It is known that the terminator is involved in mRNA stability and affects the expression level of the gene.
  • promoter refers to a region on DNA that determines the transcription initiation site of a gene and that directly regulates the frequency of transcription, and to which RNA polymerase binds. To start transcription.
  • the promoter region is usually a region within about 2 kbp upstream of the first exon of the putative protein coding region.Therefore, if the DNA coding software is used to predict the protein coding region in the genomic nucleotide sequence,
  • the promoter region can be deduced.
  • the putative promoter region varies for each structural gene, but is usually upstream of the structural gene, but is not limited thereto, and may be downstream of the structural gene.
  • the putative promoter region is within about 2 kbp upstream of the first exon translation start site.
  • enhancer can be used to increase the expression efficiency of a target gene.
  • enhancers are well known in the art.
  • a plurality of enhancers may be used, but one may or may not be used.
  • operably linked refers to a transcriptional / translational regulatory sequence (eg, promoter, enhancer, etc.) that results in a desired nucleotide sequence, expression (ie, activation). Alternatively, it is placed under the control of a translation regulatory sequence.
  • a promoter to be operably linked to a gene, the promoter will usually be located immediately upstream of the gene, but need not necessarily be located next to it.
  • the close phosphorylase gene should be prepared.
  • processing methods include the use of restriction enzymes, restriction enzymes, nucleonucleases such as ExoIII, and the like, or introduction of site-directed mutagenesis using single-stranded DNA or PCR such as Ml3. .
  • thermostable sucrose phosphorylase (2.4 Expression of thermostable sucrose phosphorylase)
  • the expression vector prepared as described above is introduced into cells to express sucrose phosphorylase having improved thermostability.
  • the term "expression" of an enzyme means that the nucleotide sequence encoding the enzyme is transcribed and translated in vivo or in vitro to produce the encoded enzyme.
  • Cells into which the expression vector is introduced include prokaryotes and eukaryotes.
  • Cells into which the expression vector is introduced can be easily selected in consideration of various conditions such as ease of expression of sucrose phosphorylase, easiness of culture, speed of proliferation, and safety.
  • sucrose phosphorylase when sucrose phosphorylase is used for the synthesis of high-molecular-weight amylose, it is preferable that sucrose phosphorylase does not contain amylase as a contaminant.
  • examples of such cells include microorganisms such as bacteria and fungi. Examples of more preferred cells include mesophilic bacteria (eg, Escherichia coli, Bacillus subtilis).
  • the term “mesophilic bacteria” refers to microorganisms having a growth temperature in a normal temperature environment, and particularly refers to microorganisms having an optimum growth temperature of 20 ° C to 40 ° C.
  • the cells may be microbial cells, but may be cells of plants, animals, and the like.
  • the enzymes of the present invention may have undergone post-translational processing. Examples of plants include, but are not limited to, dicotyledonous plants, and monocotyledonous plants such as rice, wheat, oats, and corn.
  • a technique for introducing an expression vector into cells may be any technique known in the art. Examples of such techniques include, for example, transformation, transduction, transfection, and the like. Techniques for introducing such nucleic acid molecules are well known and commonly used in the art, and are described, for example, in Ausubel FA et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J et al.
  • transgenic plant thus obtained has a target gene introduced therein, and such a gene can be introduced by a known method such as Northern blot analysis, Western blot analysis or other well-known conventional techniques. Can be confirmed.
  • sucrose phosphorylase whose temperature has been increased can be expressed in the cells. it can.
  • Culture conditions for transformed cells It is appropriately selected according to the type of host cell to be used, the type of expression regulator in the expression vector, and the like. For example, a usual shaking culture method can be used.
  • the medium used for culturing the transformed cells is not particularly limited as long as the cells to be used can proliferate and express the desired thermostable sucrose phosphorylase.
  • the medium contains a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts such as phosphoric acid, Mg 2+ , Ca 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ , Zn 2+ , Co 2+ , Ni 2 Salts such as + , Na + , K + and the like can be used as needed, mixed appropriately or alone. If necessary, various inorganic or organic substances necessary for the growth of the transformed cells and the expression of the desired sucrose phosphorylase having improved thermostability can be added.
  • the temperature at which the transformed cells are cultured can be selected so as to be suitable for growing the transformed cells to be used. Usually 15 ° C 60 ° C. The culturing of the transformed cells is continued for a time sufficient for expressing sucrose phosphorylase having improved thermostability.
  • the expression can be controlled by adding an inducer, changing the culture temperature, adjusting the medium components, and the like.
  • an expression vector having a ratatose-inducible promoter when used, the expression can be induced by adding isopropyl-1- ⁇ -D-thiogalatatopyranoside (IPTG).
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability expressed in this manner can then be recovered.
  • the expressed thermostable sucrose phosphorylase accumulates in the transformed cells, the transformed cells are cultured under appropriate conditions, and the cells are collected by centrifugation or filtration, and then the appropriate cells are collected. Suspend in buffer. Next, after crushing the cells by ultrasonic treatment or the like, a supernatant is obtained by centrifugation or filtration.
  • the expressed thermostable sucrose phosphorylase is secreted outside the transformed cells, the transformed cells are cultured in this manner, and then the cells are separated by centrifugation or filtration to separate the supernatant. Get.
  • thermostable sucrose phosphorylase Regardless of whether the thermostable sucrose phosphorylase accumulates in the transformed cells or is secreted out of the transformed cells, the supernatant containing the thermostable sucrose phosphorylase thus obtained is subjected to a conventional method (for example, salting out). Method, solvent precipitation, ultrafiltration) to obtain a fraction containing sucrose phosphorylase having improved thermostability. This fraction is subjected to filtration, centrifugation, desalting and other treatments to remove the crude enzyme solution. obtain. Further, the crude enzyme solution is appropriately combined with ordinary enzyme purification means such as lyophilization, isoelectric focusing, ion exchange chromatography, crystallization, etc., to obtain a crude enzyme or a purified enzyme having improved specific activity. can get. If an enzyme that hydrolyzes ⁇ -gunolecan, such as ⁇ -amylase, is not included, the crude enzyme can be used as it is, for example, in the production of high-molecular-weight hy
  • sucrose phosphorylase having improved thermostability By producing sucrose phosphorylase having increased thermostability as described above, the heat resistance of natural sucrose phosphorylase can be significantly improved.
  • the expressed sucrose phosphorylase having improved thermostability can be easily purified by utilizing its thermostability. Briefly, by heating a cell extract containing sucrose phosphorylase having improved thermostability at about 60 ° C, contaminating enzymes are insolubilized. By removing the insolubilized material by centrifugation and performing dialysis, purified sucrose phosphorylase having improved thermostability can be obtained.
  • the sucrose phosphorylase is sucrose at any stage of the purification step (typically about 4% to about 30%, preferably about 8% to about 30%, more preferably about 8% —about 25%).
  • the temperature of the solution in this heating step is a temperature at which the activity of sucrose phosphorylase contained in the solution before heating remains at least 50%, more preferably at least 80%, when the solution is heated for 30 minutes. It is preferable that there is.
  • This temperature is preferably from about 50 ° C to about 70 ° C, more preferably from about 55 ° C to about 65 ° C.
  • the temperature is preferably about 50 ° C to about 70 ° C, more preferably about 55 ° C to 65 ° C.
  • the heating time can be set at any time in consideration of the reaction temperature, as long as the activity of sucrose phosphorylase is not significantly impaired.
  • the heating time is typically from about 10 minutes to about 90 minutes, more preferably from about 30 minutes to about 60 minutes.
  • thermostable sucrose phosphorylase (3.1 Characteristics of thermostable sucrose phosphorylase)
  • the enzyme of the present invention obtained by the method as described above has a position corresponding to position 14, a position corresponding to position 29, and a position corresponding to position 44 in motif sequence 1; Equivalent position, Equivalent position 19, Equivalent position 23 and 34 position And at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to position 19 in motif sequence 3 (or a position corresponding to threonine 47 (T47) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 62nd position corresponding to serine (S62), 77th position corresponding to tyrosine (Y77), 128th position corresponding to valine (VI 28), 140th position corresponding to lysine (K140), 144th position glutamine ( Q144), at least one position selected from the group consisting of position 155 asparagine (N1 55) and position 249 asparaginic acid (D249)) at the position corresponding to the natural sucrose phosphorylase.
  • the enzyme of the present invention is preferably a position corresponding to position 14, a position corresponding to position 29, and a position corresponding to position 44 in motif sequence 1; a position corresponding to position 7, position 19 in motif sequence 2 Positions corresponding to positions 23 and 34; and positions corresponding to position 19 in motif sequence 3 (or to threonine 47 (T47) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2).
  • Position, position 62, which corresponds to serine (S62), position 77, which corresponds to thiocin (Y77), position 128, which corresponds to valine (V128), position 140, which corresponds to lysine (K140), 144 Glutamine (Q144), 155 asparagine (N155) and 249 aspartic acid (D249) at least two positions selected from the group consisting of: Is in at least three positions More preferably at least four positions, even more preferably at least five positions, particularly preferably at least six positions, particularly preferably at least seven positions, and most preferably all eight positions It has different amino acid residues from natural sucrose phosphorylase.
  • sucrose phosphorylase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is shown in SEQ ID NO: 22, and the nucleotide sequence encoding this amino acid sequence is Shown at number 21.
  • the sucrose phosphorylase after the substitution has a higher thermostability than the sucrose phosphorylase before the substitution. You can see above.
  • one or several amino acids may be deleted, substituted or added to the amino acid sequence of natural sucrose phosphorylase in addition to the substitution of amino acid residues at these positions. Amino acid sequence.
  • the amino acid at the position corresponding to position 14 (or T47) in motif sequence 1 is obtained by substituting force N, which is N, for another amino acid. It has important significance. For example, when N is replaced with T, the sequence after substitution becomes a sequence similar to sucrose phosphorylase derived from Streptococcus mutans.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 14 in motif sequence 1 is other than the amino acid residue found in natural sucrose phosphorylase. Amino acids.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 14 in motif sequence 1 is most preferably serine.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 14 in motif sequence 1 is most preferably serine or isoleucine, particularly preferably isoleucine. .
  • the position corresponding to position 29 in motif sequence 1 is other than the amino acid residue found in natural sucrose phosphorylase. Amino acids.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 29 in motif sequence 1 is most preferably proline.
  • the amino acid residue at position corresponding to position 29 (or corresponding to S62) in motif sequence 1 is proline, alanine or lysine. Most preferred is alanine, which is particularly preferred.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 44 in motif sequence 1 is other than the amino acid residue found in natural sucrose phosphorylase. Amino acids.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 44 in the motif sequence 1 is most preferably histidine or histidine, which is particularly preferably histidine.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 44 in the motif sequence 1 is most preferably histidine or arginine, most preferably arginine. I like it.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 7 in motif sequence 2 is other than the amino acid residue found in natural sucrose phosphorylase. Amino acids.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 7 in motif sequence 2 is most preferably leucine.
  • the amino acid residue at position corresponding to position 7 in motif sequence 2 is leucine or isoleucine, which is particularly preferred to be leucine or isoleucine. Is most preferred.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 19 in motif sequence 2 is other than the amino acid residue found in natural sucrose phosphorylase. It can be an amino acid.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 19 in motif sequence 2 (or the position corresponding to K140) is most preferably methionine, which is particularly preferably methionine or cysteine.
  • the amino acid residue at position 19 in motif sequence 2 (or the position corresponding to K140) is methionine, cysteine, phenylalanine, isoleucine, norin or tyrosine.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 23 in motif sequence 2 is other than the amino acid residue found in natural sucrose phosphorylase. It can be an amino acid.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 23 in motif sequence 2 is most preferably arginine or arginine, which is particularly preferably arginine or lysine.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 23 in motif sequence 2 is preferably arginine, histidine, isoleucine, lysine or valinine. Histidine, more preferably histidine, isoleucine, lysine or valine, more preferably histidine, isoleucine or valine, most preferably histidine, more preferably histidine or isoleucine. Les,
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 34 in motif sequence 2 is other than the amino acid residue found in natural sucrose phosphorylase. It can be an amino acid.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 34 in the motif sequence 2 (or the position corresponding to N155) is most preferably serine or seron, which is particularly preferably seron or threonine.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 19 in motif sequence 3 is other than the amino acid residue found in natural sucrose phosphorylase. It can be an amino acid.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 19 in motif sequence 3 (or the position corresponding to D249) is most preferably glycine, which is particularly preferably glycine or alanine.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 19 in motif sequence 3 (or the position corresponding to D249) may be glycine, cystine, histidine, lysine, leucine, asparagine, proline, glutamine, arginine or serine. Most preferably glycine, more preferably glycine, histidine or asparagine, most preferably glycine, more preferably glycine or asparagine.
  • the objective modification of the present invention (the position corresponding to position 14 and the position corresponding to position 29 in motif sequence 1) was performed. , And a position corresponding to position 44; a position corresponding to position 7 in motif sequence 2, a position corresponding to position 19, a position corresponding to position 23 and a position corresponding to position 34; and 19 in motif sequence 3. At least one position selected from the group consisting of: a position corresponding to threonine (T47) at position 47, and a position corresponding to serine (S62) at position 47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Position 77 position corresponding to tyrosine (Y77), position 128, position corresponding to valine (V128), position 140, position corresponding to lysine (K140), position 144, position corresponding to gnoletamine (Q144), position 155, asparagine (N155 At position 249) and at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to aspartic acid (D249)) having an amino acid residue different from the amino acid residue of the natural sucrose phosphorylase. In addition to) be replaced by so that amino acid substitutions, additions, it is possible to perform the deletion or modification.
  • Amino acid substitution refers to replacing one amino acid with another one amino acid. Any number of amino acid substitutions can be made at any position, as long as the obtained sucrose phosphorylase mosquito S has an enzymatic activity substantially similar to that of natural sucrose phosphorylase.
  • the substitution may be preferably performed for 1 to 30, more preferably for 1 to 20, more preferably for 1 to 10 and particularly preferably for 1 to 5 and most preferably. Can be performed one to three times.
  • Amino acid substitutions may be interspersed with one residue or two or more residues. In particular, when the substitution is performed at the N-terminus or C-terminus, the activity is less affected as compared with other places, and therefore, more amino acid residues may be substituted than the substitution at other places. .
  • the position where the desired mutation is performed (the position corresponding to T47 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the position corresponding to S62, the position corresponding to Y77, the position corresponding to V128, the position corresponding to K140, and the position corresponding to Q144. (Positions corresponding to positions N155 and D249) are not preferred because they may affect the heat resistance.
  • the addition of an amino acid refers to the addition of one or more amino acids at any position in the original amino acid sequence, for example, one hundred and thirteen, more preferably one hundred and twenty, still more preferably one hundred and ten, Preferably, it refers to insertion of 115 amino acids, most preferably 113 amino acids.
  • the amino acids may also be scattered by one residue or two or more residues.
  • the addition of amino acids also In particular, when performed at the N-terminus or C-terminus, the effect on the activity is less than at other locations, so it may be possible to add more amino acid residues than at other locations, . For example, 11 to 100, more preferably 1 to 50, more preferably 1 to 30, especially 5 to 30, and most preferably 5 to 10 amino acid residues are added. May be. Addition near the position where the desired mutation is performed is not preferable because it may affect heat resistance.
  • Amino acid deletion refers to one or more amino acid sequences, for example, one to thirty, more preferably one to ten, particularly preferably one to five, and most preferably one to one from the original amino acid sequence. It refers to removing three amino acids. Amino acid deletions may be interspersed by one residue or may be continuous by two or more residues. In particular, if the deletion is made at the ⁇ -terminus or C-terminus, it is possible to delete more amino acid residues than to delete at other positions, since the activity is less affected than at other positions. Les ,. Deletion near the position where the desired mutation is performed is not preferred because it may affect heat resistance.
  • amino acid modifications include amidig, carboxylation, sulfation, halogenation, alkynolelation, glycosylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), and the like.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention may be synthesized by a peptide synthesis method.In such a case, the substituted or added amino acid may be a natural amino acid or an unnatural amino acid or amino acid analog. But it is. Natural amino acids are preferred.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention may be an enzyme analog having enzyme activity as sucrose phosphorylase.
  • the term ⁇ enzyme analog '' refers to a compound that is a compound different from the native enzyme, one that has at least one chemical or biological function equivalent to the native enzyme.
  • enzyme analogs include those in which one or more amino acid analogs have been added or replaced with the original natural enzyme. Enzyme analogs may be modified or added in such a way that their function (eg, sucrose phosphorylase activity) is substantially similar to or better than the function of the original native enzyme. I have.
  • Such enzyme analogs can be prepared using techniques well known in the field. Therefore, the enzyme analog , A polymer comprising an amino acid analog.
  • the term “enzyme” includes this enzyme analog unless otherwise specified.
  • amino acid may be a natural amino acid, an unnatural amino acid, a derivative amino acid, or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.
  • natural amino acid refers to the L-isomer of a natural amino acid. Natural amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, methionine, threonine, fenylalanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, gnoletamic acid, gnoletamine, and 7 — Carboxyglutamic acid, anoreginin, orditin, and lysine. Unless otherwise indicated, all amino acids referred to herein are L-forms, but forms using D-form amino acids are also within the scope of the present invention.
  • unnatural amino acid refers to an amino acid that is not normally found in nature in proteins.
  • unnatural amino acids include D- or L-forms of nonoleucine, para-nitrophenylalanine, homophenylalanine, para-fluorophenylalanine, 3-amino-2-benzylpropionic acid, homoarginine, and D- Phenylalanine.
  • Derivative amino acid refers to an amino acid obtained by derivatizing an amino acid.
  • amino acid analog refers to a molecule that is not an amino acid but has similar properties and / or functions as an amino acid.
  • amino acid analogs include, for example, etyonin, force napanin, 2-methylglutamine and the like.
  • sucrose phosphorylase having improved thermostability including modification by substitution, addition or deletion of one or more amino acids to the amino acid sequence of natural sucrose phosphorylase, It is within the scope of the present invention.
  • Such amino acid modifications other than the desired modification are preferably conservative modifications, more preferably conservative substitutions.
  • the addition or deletion of amino acids at the N-terminus or C-terminus of natural sucrose phosphorylase is considered to have less effect on the enzymatic activity of sucrose phosphorylase compared to the substitution, addition or deletion of other parts. . Therefore, amino acid substitutions, additions or deletions are preferably made at the N-terminus or C-terminus.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention can be produced using a method well known in the art. For example, deletion, substitution or addition of an amino acid for preparing the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention can be performed by site-directed mutagenesis, which is a well-known technique. Techniques for site-directed mutagenesis are well known in the art. See, for example, Nucl. Acid Research, Vol. 10, pp. 6487-6500 (1982).
  • sucrose phosphorylase having improved thermostability when sucrose phosphorylase having improved thermostability is used for purposes other than the intended modification, "substitution, addition or deletion of one or several or more amino acids" or “at least one amino acid""Amino acid substitution, addition or deletion” means that the enzyme activity of sucrose phosphorylase is not lost, preferably the enzyme activity is equal to or higher than that of a reference (eg, natural sucrose phosphorylase). A certain number of substitutions, additions or deletions.
  • a person skilled in the art can easily select sucrose phosphorylase having improved thermostability having desired properties.
  • the desired sucrose phosphorylase having improved thermostability may be directly chemically synthesized. Such methods of chemical synthesis are well known in the art. It is well known.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention thus produced is obtained by adding the amino acid sequence of the first (for example, natural) sucrose phosphorylase (preferably, sucrose phosphorylase derived from Streptococcus mutans or Streptococcus pneumoniae).
  • sucrose phosphorylase preferably, sucrose phosphorylase derived from Streptococcus mutans or Streptococcus pneumoniae.
  • sucrose phosphorylase derived from Streptococcus mutans or Streptococcus pneumoniae
  • sucrose phosphorylase preferably, sucrose phosphorylase derived from Streptococc
  • the hydropathic index of amino acids may be considered.
  • the importance of the hydrophobic amino acid index in conferring interactive biological functions on proteins is generally recognized in the art (Kyte. J and Doolittle, RFJ Mol. Biol. 157 (1): 105-132, 1982). Concentrates on the secondary structure of the protein produced, such as the amino acid sessile white matter, and then the protein and other molecules (eg, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.) ).
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on its hydrophobicity and charge properties.
  • One amino acid is replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index, and is still substantially equivalent to a protein having a similar biological function (eg, substantially reduced in terms of enzyme activity).
  • the hydrophobicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5. It is understood in the art that such amino acid substitutions based on hydrophobicity are efficient. As described in US Pat. No.
  • hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid ( + 3 0 ⁇ 1); glutamic acid (+3.0 ⁇ 1); serine (+0.3); asparagine (+0.2); gnoretamine (+0.2); glycine (0); threonine (1.0) ⁇ 4); Proline (1 05 ⁇ 1); Alanine (1 05 ⁇ ); Histidine (1 05 ⁇ ); Cysteine (_1) 0); Methionine (1-1 13); Valine (1 11 ⁇ ) 5); leucine (-1.8); isoloicin (-1.8); tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); and tryptophan (1.3.4).
  • an amino acid can be substituted for another that has a similar hydrophilicity index and still provide a biological equivalent.
  • the hydrophilicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • conservative substitution refers to a substitution in an amino acid substitution in which the original amino acid and the amino acid to be substituted have similar hydrophilicity indexes and / or hydrophobicity indexes as described above.
  • Examples of conservative substitutions are well known to those of skill in the art and include, but are not limited to, substitutions within each of the following groups: arginine and lysine; glutamic and aspartic acids; serine and threonine; Glutamine and asparagine; and palin, leucine, and isoleucine.
  • the enzyme activity of sucrose phosphorylase having improved thermostability at 37 ° C is 20% or more at 37 ° C.
  • the enzyme activity of the thermostable sucrose phosphorylase at 37 ° C is determined by the thermostability before the heating.
  • sucrose phosphorylase at 37 ° C, more preferably about 30% or more, more preferably about 40% or more, more preferably about 50% or more.
  • About 55 is more preferable.
  • About 60 is more preferred to be> 0 .
  • the enzyme activity of the sucrose phosphorylase having improved thermostability at 37 ° C is more preferably about 50% or more, most preferably about 60% or more, most preferably about 70% or more.
  • thermostable sucrose phosphorylase of the present invention After heating the thermostable sucrose phosphorylase of the present invention in a 20 mM Tris buffer ( ⁇ 70) containing 20% sucrose at 65 ° C. for 20 minutes, the enzyme activity of the thermostable sucrose phosphorylase at 37 ° C. It is more preferably about 20% or more, more preferably about 30% or more, more preferably 10% or more of the enzyme activity of the sucrose phosphorylase having improved thermostability before heating at 37 ° C. More preferably about 40% or more, more preferably about 50% or more, still more preferably about 55% or more, more preferably about 60% or more. More preferably about 65% or more, still more preferably about 70% or more, still more preferably about 80% or more, most preferably about 90% or more, most preferably. .
  • concentration of sucrose is Weight / Volume, that is,
  • the activity unit of sucrose phosphorylase can be measured by any method known in the art. Can be determined. For example, it is determined by the method described in 1.7 of the following example.
  • Heat resistance can be measured according to the following procedure.
  • the enzyme activity of the enzyme solution of (ii) is measured at 37 ° C. according to the SP activity measurement method.
  • the ratio of the enzyme activity A of sucrose phosphorylase having improved thermostability after heating to the enzyme activity A of sucrose phosphorylase having improved thermostability before heating is also referred to as residual activity.
  • Amylose can be synthesized under high temperature conditions using the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention.
  • "amylose can be synthesized under high temperature conditions” refers to 58.5 mM sucrose, ImM maltotetraose, 10 mM inorganic phosphate, 1 U / ml of ⁇ -glucan phosphorylase derived from Thermus aquatic us ( The yield of amylose synthesized when amylose was synthesized by incubating at 50 ° C for 18 hours using 1 U / ml of sucrose phosphorylase having improved thermostability and prepared according to 2.2 of the following Examples) 50% or more.
  • the amylose yield is preferably at least 60%, more preferably at least 70%, further preferably at least 80%, and most preferably at least 90%. It is.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention has a high specific activity at a high temperature (preferably 55 ° C).
  • the specific activity refers to the activity per weight of sucrose phosphorylase (U / g).
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention was prepared using 5% sucrose and 250 mM phosphate buffer.
  • the specific activity when reacted at 55 ° C for 15 minutes in (pH 7.0) is preferably at least 20 U / mg or more, more preferably at least 30 U / mg or more, and still more preferably at least 40 U / mg. mg, more preferably at least 50 U / mg, more preferably at least 60 UZmg, more preferably at least 70 UZmg, more preferably at least 80 UZmg, more preferably at least 90 UZmg, more preferably at least 90 UZmg.
  • At least 1 OOU / mg more preferably at least 11 OU / mg, more preferably at least 120 UZmg, more preferably at least 130 UZmg, more preferably at least 140 U / mg, and still more preferably at least 140 UZmg. Both are at least 150 U / mg, particularly preferably at least 160 U / mg, most preferably at least 180 U / mg It is.
  • the heat-resistant SP enzyme of the present invention preferably has a higher specific activity at a high temperature and a higher residual activity at a high temperature, as compared to a natural SP enzyme.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention can be advantageously used in a method for producing ⁇ -dalcan.
  • the method for producing glucan using the sucrose phosphorylase having improved thermostability according to the present invention is a method for simultaneously acting sucrose phosphorylase and ⁇ -glucan phosphorylase on sucrose and a primer, which can be any method for producing ⁇ -glucan known in the art. (Also referred to as the SP-GP method).
  • the SP-GP method has an advantage that a linear glucan can be produced using an inexpensive substrate.
  • the method for synthesizing ⁇ -gnolecan of the present invention comprises the sucrose phosphorylase having increased thermostability of the present invention, ⁇ -glucan phosphorylase, sucrose, a primer, an inorganic phosphate or Darcos-1-1 monophosphate. Reacting the reaction solution to produce hygnolecan.
  • Hi-glucan is a saccharide having D-glucose as a constitutional unit, wherein at least two saccharide units are linked by ⁇ -1,4-gnolecoside bonds.
  • Hi-glucan can be a linear, branched or cyclic molecule.
  • Straight-chain glucan and hi-1,4-glucan are synonyms.
  • saccharide units are linked only by a 1,4-gnolecoside bond.
  • HI_1, 6 Darcoside binding ⁇ -Gnolecan containing one or more combinations is a branched ⁇ -gnolecan.
  • ⁇ _glucan preferably contains some linear portion. Unbranched linear ⁇ -gnolecan is more preferred.
  • the number of branches ie, the number of 1,6-dalcoside bonds
  • the number of branches is typically from 0 to 10000, preferably from 0 to 1000, more preferably from 0 to 500, still more preferably from 0 to 100, and still more preferably from 0 to 50, The number is preferably 0 to 25, and more preferably 0.
  • the ratio of the number of the human 1,4 -darcoside bonds to the number of the human _1,6-glucoside bonds is: It is preferably 1 to 1,000,000, more preferably 105,000, still more preferably 50 to 1000, and still more preferably 100 to 500.
  • the 1,6-gnorecoside bonds may be distributed randomly or evenly in the hegnorecan. Preferably, the distribution is such that five or more linear moieties are formed in a sugar unit in ⁇ -glucan.
  • the ⁇ -glucan may be composed of only D-glucose, may be a derivative which does not impair the properties of ⁇ -glucan, or may be a derivative modified to a certain extent. It is preferred that you be qualified and qualify.
  • the ⁇ -glucan is typically about 8 ⁇ 10 3 or more, preferably about 1 ⁇ 10 4 or more, more preferably about 5 ⁇ 10 4 or more, even more preferably about IX 10 5 or more, Preferably it has a molecular weight of about 6 ⁇ 10 5 or more .
  • the human glucan typically has a molecular weight of about 1 ⁇ 10 8 or less, preferably about 1 ⁇ 10 7 or less, more preferably about 5 ⁇ 10 6 or less, more preferably about IX 10 6 or less.
  • sucrose phosphorylase having improved thermostability, Phosphorylase, sucrose, primers, inorganic phosphate or glucose_1_phosphate, a buffer, and a solvent in which it is dissolved are used as main materials. These materials are usually added at the start of the reaction. In the course of the reaction, any of these materials may be added to the reaction mixture.
  • an enzyme selected from the group consisting of a debranching enzyme, a blanchingenzyme, a 4_-glucanotransferase and a glycogen debranching genzym can be used.
  • An enzyme selected from the group consisting of a debranching enzyme, blanchingenzyme, 4_higlucanotransferase and glycogen debranching genzym is selected from the beginning of the production method of the present invention according to the structure of the target heguran. It may be added to the reaction solution at some point during or after the addition to the reaction solution.
  • the amount of sucrose phosphorylase contained in the solution at the start of the reaction is typically about 0.05-1, 000 U / g sucrose, preferably about 0.05 to sucrose in the solution at the start of the reaction. 0.1-500 U / g sucrose, more preferably about 0.5-100 U / g sucrose. If the weight of sucrose phosphorylase is too large, the denatured enzyme may easily aggregate during the reaction. If the amount is too small, the yield of ⁇ -glucan may decrease.
  • ⁇ -glucan phosphorylase means an enzyme having ⁇ -glucan phosphorylase activity.
  • ⁇ -Gnorecan phosphorylase is classified as EC 2.4.1.1.
  • the ⁇ - glucan phosphorylase activity, the inorganic phosphate 4 glucan, glucose _1 monophosphate and alpha _1 refers to an activity catalyzing a reaction or its reverse reaction makes the partial decomposition product of 4-Gunorekan.
  • ⁇ -Gnorecan phosphorylase is sometimes called phosphorylase, starch phosphorylase, glycogen phosphorylase, maltodextrin phosphorylase, or the like.
  • Hypnolecan phosphorylase can also catalyze the synthesis of 1,4-gnolecan, which is the reverse reaction of carophosphate degradation. Which direction the reaction proceeds depends on the amount of substrate. In the living body, the amount of inorganic phosphate is large, so that the reaction of hegnolecan phosphorylase proceeds in the direction of phosphorolysis. If the amount of inorganic phosphoric acid is small, the reaction proceeds in the direction of the synthesis of ⁇ -1,4 -Dalkan.
  • All known human glucan phosphorylases are pyridoxal 5'_ phosphorus for activity. It requires an acid and appears to share a similar catalytic mechanism. Enzymes from different sources have different substrate preferences and regulatory forms. All ⁇ -glucan phosphorylases belong to a large group that includes multiple ⁇ -glucan phosphorylases. This large group includes glycogen phosphorylase from bacteria, yeast and animals, starch phosphorylase from plants, and maltooligosaccharide phosphorylase from bacteria.
  • the minimum primer molecule for the human glucan synthesis reaction of human glucan phosphorylase is maltotetraose. It has also been reported that the minimum effective substrate for the degradation of Higglecan is maltopentaose. Generally, these were considered to be a common feature of hegnorecan phosphorylase. In recent years, however, it has been reported that Hi-glucan phosphorylase from Thermus thermophilus has a different substrate specificity from that of other human-glucan phosphorylases. ing. For these ⁇ -glucan phosphorylases, the minimum primer for ⁇ -glucan synthesis is maltotriose, and the minimum substrate for ⁇ -glucan degradation is maltotetraose.
  • ⁇ -glucan phosphorylase is considered to be universally present in a variety of plants, animals and microorganisms that can store starch or glycogen.
  • Examples of plants that produce ⁇ -glucan phosphorylase include potatoes such as potatoes (also called potatoes), sweet potatoes, potatoes, taros, and cassavas, vegetables such as cabbage, spinach, corn, rice, wheat, and wheat. And cereals such as rye and rye, beans such as faba bean, endum bean, soybean, azuki and pea, experimental plants such as Arabidopsis thaliana, citrus fruits and algae.
  • potatoes such as potatoes (also called potatoes), sweet potatoes, potatoes, taros, and cassavas
  • vegetables such as cabbage, spinach, corn, rice, wheat, and wheat.
  • cereals such as rye and rye, beans such as faba bean, endum bean, soybean, azuki and pea
  • experimental plants such as Arabidopsis thaliana, citrus fruits and algae.
  • Examples of animals that produce human glucan phosphorylase include mammals such as humans, egrets, rats, and pigs.
  • microorganisms that produce human glucan phosphorylase include thermus aquaticus and Bacillus stearothermophilus ⁇ E. Coli.
  • Hea-glucan phosphorylase is a naturally occurring human-glucan phosphorylase
  • An ⁇ -glucan phosphorylase having improved thermostability by introducing a mutation into phosphorylase may be used.
  • the ⁇ -gnolecan phosphorylase used in the method of the present invention is more preferably derived from a plant, which is preferably derived from a plant or an animal.
  • natural human-glucan phosphorylase from plants has the ability to synthesize high molecular weight amylose.
  • these gnorecan phosphorylases are not heat-resistant. Therefore, the reaction cannot be catalyzed at high temperatures (for example, above about 60 ° C). Therefore, if the reaction is carried out at about 30 ° C to about 40 ° C in accordance with the optimal reaction temperature of potato-derived SP, problems such as contamination of various bacteria or aging and deterioration of the potatoes may occur. —Gnorecan or G_1_P cannot be produced efficiently.
  • Human glucan phosphorylase can be derived from any organism that produces human glucan phosphorylase. It is preferable that the human glucan phosphorylase has a certain degree of heat resistance. The higher the heat resistance, the better the heat-resistant phosphorylase. For example, the enzyme activity of ⁇ -glucan phosphorylase at 37 ° C. after heating ⁇ -glucan phosphorylase in a 20 mM Tris buffer ( ⁇ m70) at 60 ° C. for 10 minutes Preferably, it is at least 20% of the enzyme activity at 37 ° C.
  • the ⁇ -glucan phosphorylase may be a natural ⁇ -glucan phosphorylase or a thermostable ⁇ -glucan phosphorylase in which a mutation has been introduced at a specific position in order to improve heat resistance. Good.
  • a position is the position corresponding to position 4 in the GP motif system IJ1L: H_A_E_F—T-P—V—F_S or the position corresponding to position 4 in the GP motif sequence 1H: H—A—Q_YSPHFS.
  • GP motif sequence 2 position corresponding to position 4 in A—L_G_N_G_G—L—G
  • GP motif sequence 3L position corresponding to position 7 in R_I_V_K_F_I_T-DV or GP motif sequence 3H: RIVKLVN _D—V
  • position 39 corresponding to phenylalanine (F39)
  • position 135 corresponding to asparagine (N135)
  • position 706 threonine Position corresponding to (T706).
  • the amino acid residue at position 4 in the GP motif system 1J1L or 1H or at a position corresponding to F39 is an aliphatic amino acid, which is preferably an aliphatic amino acid or a heterocyclic amino acid. Most preferred is a branched amino acid (i.e., norin, leucine or isoleucine), which is more preferred, is particularly preferred is isoleucine or leucine, and most preferred is leucine. ,.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 4 or N135 in GP motif sequence 2 is preferably an alanine, a cysteine, an aspartic acid, a glutamic acid, a glycine, preferably an aliphatic amino acid or a heterocyclic amino acid. It is more preferably histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, serine, threonine, phosphoric acid or tyrosine, particularly preferably cystine, glycine, serine or valine.
  • the amino acid residue at position 7 in the GP motif sequence 3L or 3H or at a position corresponding to T706 is a branched amino acid that is preferably an aliphatic amino acid (ie, norin, oral isine or isoleucine).
  • isoleucine which is particularly preferred.
  • the ⁇ -glucan phosphorylase is preferably modified at all three positions.
  • the human glucan phosphorylase is preferably derived from potato, sweet potato, broad bean, Arabidopsis thalia na, spinach, corn, rice, wheat or citrus. Potato, sweet potato, broad bean, Arabidopsis thaliana, spinach, Is most preferably derived from potato, which is more preferably derived from rice.
  • the human glucan phosphorylase is preferably derived from type L human glucan phosphorylase. Hea-glucan phosphorylase is available in potato type L, L2 or H, and sweet potato.
  • Type L or H broad bean type L or H, Arabidopsis thaliana type L or H, spinach type L, maize type L, rice type L or H, wheat type H or citrus type H
  • ⁇ -glucan phosphorylase potato type L or L2, sweet potato type L, broad bean type: L, Ar abidopsis thaliana type L, spinach type L, corn type L or rice More preferably derived from type L human glucan phosphorylase, type L human glucan phosphorylase or type Ha from Arabidopsis thaliana More preferably derived from type glucan phosphorylase Most preferably, it is derived from phosphorylase. It is preferable that the higlucan phosphorylase is heat-resistant.
  • the higlucan phosphorylase used in the method of the present invention can be prepared, for example, as follows. First, a microorganism (eg, a bacterium, a fungus, etc.) that produces human glucan phosphorylase is cultured. This microorganism may be a microorganism that directly produces ⁇ -gnorecan phosphorylase. In addition, a gene encoding ⁇ -glucan phosphorylase is cloned, and a microorganism that is advantageous for ⁇ _glucan phosphorylase expression (eg, a bacterium, a fungus, etc.) is recombined with the obtained gene, and a recombinant microorganism is used.
  • a microorganism eg, a bacterium, a fungus, etc.
  • the ⁇ -glucan phosphorylase may be obtained from the obtained microorganism.
  • the obtained gene is modified to include the modification at a specific amino acid position as described above, and then a microorganism (eg, a bacterium, a fungus, etc.) that is advantageous for ⁇ -gnorecan phosphorylase expression is genetically modified. It is also possible to obtain a microorganism which has been recombined by heat treatment and obtain ⁇ -glucan phosphorylase having improved thermostability from the obtained microorganism.
  • Microorganisms used for genetic recombination with the human glucan phosphorylase gene should be prepared in consideration of various conditions such as the ease of expression and cultivation, the speed of proliferation, and the safety of human gnorecan phosphorylase. And can be easily selected. Since human glucan phosphorylase preferably does not contain amylase as a contaminant, it is preferable to use a microorganism that does not produce amylase or expresses it only at a low level (eg, bacteria, fungi, etc.). Used for recombination Is preferred.
  • ⁇ -glucan phosphorylase For gene recombination of ⁇ -glucan phosphorylase, it is preferable to use a mesophilic bacterium such as Escherichia coli or Bacillus subtilis.
  • ⁇ -Glucan phosphorylase produced using a microorganism that does not produce amylase or expresses it only at low levels (eg, bacteria, fungi, etc.) is substantially free of amylase and is therefore used in the method of the present invention. Preferred for
  • the gene encoding the first (eg, natural) human glucan phosphorylase can be modified by a method known in the art to change an amino acid residue at a specific position that contributes to heat resistance.
  • modification methods include, for example, site-directed mutagenesis, mutagenesis (treatment of the target gene with a mutagen such as nitrite, UV treatment), error Performing prone PCR is an example.
  • microorganisms eg, bacteria, fungi, etc.
  • this gene be operably linked to a constitutive or inducible promoter.
  • operably linked means that the promoter and the gene are linked so that expression of the gene is regulated by the promoter.
  • the culturing is preferably performed under inducing conditions.
  • inducible promoters are known to those of skill in the art.
  • a base sequence encoding a signal peptide can be ligated to this gene so that the produced ⁇ -gnorecan phosphorylase is secreted outside the cells.
  • the nucleotide sequence encoding the signal peptide is known to those skilled in the art.
  • a person skilled in the art can appropriately set conditions for culturing microorganisms (for example, bacteria, fungi, and the like) in order to produce ⁇ -gnorecan phosphorylase.
  • Suitable media for culturing microorganisms, induction conditions suitable for each inducible promoter, and the like are known to those skilled in the art.
  • human glucan phosphorylase is recovered from the culture.
  • the bacterial cells are removed by centrifugation, and the supernatant is obtained with the hegnolecan phosphorylase.
  • the human glucan phosphorylase produced in the cells is not secreted out of the cells, the microorganisms are crushed by sonication, mechanical crushing, chemical crushing, etc. to obtain a cell lysate.
  • the cell lysate may be used without purification. Then, the cell lysate is centrifuged to remove cell debris, and the supernatant can be obtained.
  • the enzyme of the present invention was subjected to ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography. It can be recovered by well-known methods including chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography. The recovered product can be purified if necessary.
  • the hegnorecan phosphorylase may be heated at any stage of the purification step.
  • the temperature of the solution in the heating step is a temperature at which, when the solution is heated for 30 minutes, the activity of 50% or more, more preferably 80% or more of the activity of the human glucan phosphorylase contained in the solution before heating remains. It is preferable that This temperature is preferably from about 50 ° C to about 70 ° C, more preferably from about 55 ° C to about 65 ° C. For example, in the case of potato-derived type L ⁇ -glucan phosphorylase having improved heat resistance, this temperature is preferably about 50 ° C to about 60 ° C.
  • the heating time can be set at any time in consideration of the reaction temperature, as long as the activity of ⁇ _glucan phosphorylase is not significantly impaired.
  • the heating time is typically from about 10 minutes to about 90 minutes, more preferably from about 30 minutes to about 60 minutes.
  • the amount of ⁇ -glucan phosphorylase contained in the solution at the start of the reaction is typically about 0.05-1,000 U / g sucrose, preferably about sucrose in the solution at the start of the reaction. Or about 0.1-500 U / g sucrose, more preferably about 0.5-100 U / g sucrose. If the weight of ⁇ -gnorecan phosphorylase is too large, the denatured enzyme may easily aggregate during the reaction. If the amount used is too low, the yield of Higgle can declines.
  • Sucrose is a disaccharide with a molecular weight of about 342, represented by C ⁇ . Sucrose is
  • sucrose may be isolated from plants or chemically synthesized. From the viewpoint of cost, it is preferable to isolate sucrose from plants. Examples of plants containing a large amount of sucrose include sugarcane, sugar cane, and the like. Sugar cane contains about 20% sucrose in the juice. Sato Radish contains about 10-15% sucrose in the juice. The sucrose may be provided at any of the purification stages from sucrose-containing plant sap to purified sugar.
  • sucrose phosphorylase having improved thermostability and the ⁇ -gnorenol phosphorylase used in the production method of the present invention can be used in the reaction regardless of whether they are purified enzymes or crude enzymes, even if they are immobilized. May be a batch type or a continuous type.
  • a carrier binding method for example, a covalent bonding method, an ionic bonding method, or a physical adsorption method
  • a cross-linking method or an entrapping method (lattice type or microcapsule type) can be used.
  • primers examples include maltooligosaccharide, amylose, amylopectin, glycogen, dextrin, pullulan, coupling sugar, starch and derivatives thereof.
  • inorganic phosphoric acid refers to a substance capable of providing a phosphate substrate in the reaction of SP.
  • the phosphate substrate refers to a substance that is a raw material of a phosphate moiety (moiety) of glucose_1_phosphate.
  • sucrose phosphorylase degradation catalyzed by sucrose phosphorylase inorganic phosphate is thought to act as a substrate in the form of phosphate ions.
  • this substrate is conventionally referred to as inorganic phosphate, and therefore, this substrate is referred to herein as inorganic phosphate.
  • Inorganic phosphoric acid includes phosphoric acid and inorganic salts of phosphoric acid.
  • inorganic phosphoric acid is used in water containing cations such as alkali metal ions.
  • cations such as alkali metal ions.
  • the inorganic phosphoric acid is preferably any metal salt of phosphoric acid, more preferably an alkali metal salt of phosphoric acid.
  • Preferred specific examples of the inorganic phosphoric acid include sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, trisodium phosphate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, tripotassium phosphate, phosphoric acid (HPO ), Ammonium dihydrogen phosphate,
  • Diammonium hydrogen phosphate and the like Diammonium hydrogen phosphate and the like.
  • the inorganic phosphoric acid may contain only one kind or a plurality of kinds.
  • Inorganic phosphoric acid is obtained by separating a phosphate condensate such as polyphosphoric acid (for example, pyrophosphoric acid, triphosphate and tetraphosphate) or a salt thereof by a physical, chemical or enzymatic reaction. It can be provided by adding the solution to the reaction solution.
  • a phosphate condensate such as polyphosphoric acid (for example, pyrophosphoric acid, triphosphate and tetraphosphate) or a salt thereof by a physical, chemical or enzymatic reaction. It can be provided by adding the solution to the reaction solution.
  • glucose_1_phosphate is glucose_1_phosphate (CHOP)
  • the gnorecose-11-monophosphate is preferably any metal salt of gnorecose-11-monophosphate (CHOP) in a narrow sense, more preferably glucose_1_phosphate (CHP).
  • CHOP gnorecose-11-monophosphate
  • CHP glucose_1_phosphate
  • O P is any alkali metal salt.
  • Preferred examples of glucose_1_phosphate are glucose_1_phosphate
  • glucose-1-sodium phosphate examples thereof include glucose-1-sodium phosphate, glucose-1-dipotassium phosphate, glucose-1-phosphate (CHOP), and the like.
  • glucose-1-sodium phosphate examples thereof include glucose-1-sodium phosphate, glucose-1-dipotassium phosphate, glucose-1-phosphate (CHOP), and the like.
  • a chemical formula is written in parentheses.
  • Unillustrated glucose_1_phosphate refers to glucose_1_phosphate in a broad sense, that is, glucose_1_phosphate (CHOP) and its salts in a narrow sense.
  • gnorecose-11-monophosphate may contain only one type or a plurality of types.
  • a branching enzyme that can be used in the present invention is an enzyme that can cleave a-1, 6-darcoside bond.
  • Debranching enzymes are isoamylase (EC 3.2.1.68), which acts well on both amylopectin and glycogen, and ⁇ -dextrin endo-1,6- ⁇ , which acts on amylopectin, glycogen and pullulan.
  • isoamylase EC 3.2.1.68
  • ⁇ -dextrin endo-1,6- ⁇ acts on amylopectin, glycogen and pullulan.
  • Darcosidase also called pullulanase
  • Debranching enzymes are present in microorganisms, bacteria, and plants.
  • microorganisms that produce debranching enzymes include Saccnaromyces cerevisiae and Chlamydomonas sp.
  • bacteria that produce a debranching enzyme include Bacillus brevis, Bacillus acido pullulyticus ⁇ Bacillus macerans, Bacillus stearothermophilus ⁇ Bacillus circulans, Thermus aquaticus, Klebsiella pneumoniae ⁇ Thermoactinomy ces thalpophilus ⁇ Thermoanaerosa bacterium, etc.
  • Examples of plants that produce a debranching enzyme include potato, sweet potato, corn, rice, wheat, oats, oats, sugar beet, and the like.
  • the organism that produces the debranching enzyme is not limited to these.
  • a branching enzyme can be used as necessary.
  • the branching enzyme that can be used in the present invention transfers a part of a-1,4-glucan chain to the 6-position of a certain gnorecose residue in this 1,4-glucan chain. It is an enzyme that can make branches. Branching enzym is also called 1,4-higlucan branching enzyme, branching enzyme or Q enzyme.
  • Branchengensim is present in microorganisms, animals, and plants.
  • microorganisms that produce branching gem are Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus caldolyticus ⁇ Bacillus lichemformis, Bacillus amylol iquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus caldovelox, Bacillus thermocaususac, Bacillus thermocaususus, Bacillus thermocaususacusus, sp., Streptomyces coelicolor, Aquifex aeolicus, Syne chosystis sp., E.
  • branchesengenzyme examples include mammals such as humans, egrets, rats, and pigs.
  • plants that produce brunchenzym include algae, potatoes such as potatoes, sweet potatoes, potatoes, potatoes such as cassava, vegetables such as spinach, corn, rice, wheat, oats, rye, and aa. Cereals, peas, soybeans, red beans, quail beans and other beans. Organisms that produce branchengenzyme are not limited to these.
  • the 4-hidalkanotransferase that can be used in the present invention is also referred to as a disposable yeast onetingenzyme, a D-enzyme, an amyloid maltase, a disproportionating enzyme, and the like. It is an enzyme capable of catalyzing a sugar transfer reaction (heterogeneization reaction).
  • 4-a-Glucanotransferase is an enzyme that transfers a dalcosyl group or maltocinole or maltooligosinole unit from the non-reducing end of a donor molecule to the non-reducing end of an acceptor molecule. Therefore, the enzymatic reaction also leads to the heterogeneity of the degree of polymerization of the maltooligosaccharide initially given. Sprinkle. If the donor molecule and the acceptor molecule are the same, an intramolecular rearrangement occurs, resulting in a product having a cyclic structure.
  • 4_ ⁇ _darcanotransferase is present in microorganisms and plants.
  • microorganisms that produce 4_ ⁇ _ dalcanotransferase include Aquifex aeolicus, Strept ococcus pneumoniae ⁇ and lostridmm buty ⁇ icum, Demococcus radiodurans, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis, Thermococcus litralis ⁇ I hermotoga maritima ⁇ , Pyrococcus sp., Dictyoglomus thermophilum ⁇ Borrelia burgdor feri, Synechosystis sp., E.
  • plants that produce 4_hi-darcanotransferase include potatoes such as potatoes, sweet potatoes, yams, cassavas, cereals such as corn, rice and wheat, and beans such as peas and soybeans.
  • Organisms that produce 4-hi-dalcanotransferase are not limited to these.
  • glycogen debranching gentzim when a cyclic structure is to be formed in the product, glycogen debranching gentzim can be used, if necessary.
  • Glycogen debranching genzyme which can be used in the present invention is an enzyme having two kinds of activities, ⁇ -1,6-dalcosidase activity and 4-a-gnorecanotransferase activity.
  • the product having a cyclic structure is obtained by the 4_ ⁇ _darcanotransferase activity of glycogen debranchingenzyme.
  • Glycogen debranchingenzymes are present in microorganisms and animals.
  • microorganisms that produce glycogen debranching genzym include yeast and the like.
  • animals that produce glycogen debranching genzaim include humans, egrets
  • Organisms that produce glycogen debranching genzaim are not limited to these.
  • the solvent used in the production method of the present invention may be any solvent that does not impair the enzymatic activity of sucrose phosphorylase and glucan-phosphorylase.
  • the solvent does not need to completely dissolve the materials used in the production method of the present invention as long as the reaction for producing the higglecan can proceed.
  • the enzyme is supported on a solid support If so, the enzyme need not dissolve in the solvent.
  • a representative solvent is water.
  • the solvent may be water contained in the cell lysate obtained in association with sucrose phosphorylase or monogolecan phosphorylase when preparing the sucrose phosphorylase or hydulcan phosphorylase.
  • sucrose phosphorylase The interaction between sucrose phosphorylase and sucrose in a solution containing sucrose phosphorylase, human glucan phosphorylase, sucrose, a primer, and inorganic phosphate or glucose-monophosphate. And any other substance that does not interfere with the interaction between the glucan phosphorylase and the primer. Examples of such substances include buffers, components of microorganisms that produce sucrose phosphorylase (eg, bacteria, fungi, etc.), components of microorganisms that produce hignolecan phosphorylase (eg, bacteria, fungi, etc.), Salts, medium components and the like can be mentioned.
  • a reaction solution is prepared.
  • the reaction solution is prepared, for example, by adding sucrose phosphorylase, ⁇ -glucan phosphorylase, solid sucrose, a primer, and inorganic phosphate or gnorecose_1_phosphate to a suitable solvent.
  • the reaction solution may be prepared by mixing a solution containing sucrose phosphorylase, ⁇ -dulline phosphorylase, sucrose, a primer, or a solution containing inorganic phosphate or gnorecose-1-phosphate, respectively.
  • the reaction solution may be a solid solution containing another component of sucrose phosphorylase, ⁇ -glucan phosphorylase, sucrose, a primer, and some of the following: inorganic phosphate or glucose_1_phosphate. It may be prepared by mixing the components. Any buffer may be added to this reaction solution, if necessary, for the purpose of adjusting ⁇ ⁇ ⁇ , as long as the enzyme reaction is not inhibited. If necessary, an enzyme selected from the group consisting of a debranching enzyme, branching genzym, 4-hydarcanotransferase and glycogen debranching genzym may be added to this reaction solution. Les ,.
  • reaction solution is optionally heated by a method known in the art. More react.
  • the reaction temperature can be any temperature as long as the effects of the present invention can be obtained.
  • the reaction temperature can typically be from about 40 ° C to about 70 ° C.
  • the temperature of the solution in this reaction step is preferably about 50% or more, more preferably about 80% or more of the activity of at least one of sucrose phosphorylase and that of Higglecan phosphorylase contained in the solution before the reaction after a predetermined reaction time.
  • the temperature is preferably a temperature at which the activity of not less than% remains. This temperature is preferably from about 50 ° C to about 70 ° C, more preferably from about 55 ° C to about 70 ° C, and even more preferably from about 55 ° C to about 65 ° C.
  • the reaction time can be set to an arbitrary time in consideration of the reaction temperature, the molecular weight of the higlucan produced by the reaction, and the remaining activity of the enzyme. Reaction times are typically about 1 hour to about 100 hours, more preferably about 1 hour to about 72 hours, even more preferably about 2 hours to about 36 hours, and most preferably about 2 hours to about 24 hours. It is.
  • the heat-resistant SP of the present invention is preferably an SP having a higher amylose yield than natural SP when reacted at 55 ° C under the same conditions as in Example 4.
  • the yield of amylose is preferably 5% or more, more preferably 10% or more, more preferably 20% or more, most preferably 30% or more.
  • the heat-resistant SP satisfying such conditions can be selected by performing a reaction under the same conditions as in Example 4 and determining the amylose yield.
  • the sucrose phosphorylase having increased thermostability of the present invention can be advantageously used in a method for synthesizing gnorecose_ ⁇ -phosphate.
  • the method of synthesizing glucose-1-phosphate using the sucrose phosphorylase having increased thermostability of the present invention may be any method of synthesizing glucose-1-phosphate known in the art.
  • the method for synthesizing glucose-1-phosphate of the present invention comprises reacting a reaction solution containing sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention, sucrose, and inorganic phosphate to produce glucose-1-phosphate.
  • a reaction solution is prepared.
  • the reaction solution can be prepared, for example, by adding sucrose phosphorylase, sucrose, and inorganic phosphoric acid to a suitable solvent.
  • the reaction solution may be prepared by mixing solutions each containing sucrose phosphorylase, sucrose, or inorganic phosphate.
  • the reaction solution may be prepared by mixing other components in a solid state with a solution containing some components of sucrose phosphorylase, sucrose, and inorganic phosphate. If necessary, any buffer may be added to the reaction solution for the purpose of adjusting pH, as long as the enzyme reaction is not inhibited.
  • the reaction solution is reacted by heating as necessary by a method known in the art.
  • the reaction temperature can be any temperature as long as the effects of the present invention can be obtained.
  • the temperature of the solution in this reaction step is preferably a temperature at which an activity of about 50% or more, more preferably 80% or more, of the sucrose phosphorylase activity contained in the solution before the reaction remains after a predetermined reaction time. This temperature is preferably between about 50 ° C and 70 ° C, more preferably between about 55 ° C and 70 ° C, and even more preferably between about 55 ° C and 65 ° C.
  • reaction time can be set to an arbitrary time in consideration of the reaction temperature and the residual activity of the enzyme. Reaction times are typically from about 1 hour to about 100 hours, more preferably from about 1 hour to about 72 hours, even more preferably from about 2 hours to about 36 hours, and most preferably from about 2 hours to about 24 hours. is there.
  • the heat-resistant SP of the present invention is preferably a SP having a higher yield of gnorecose_1_phosphoric acid than natural SP when reacted at 55 ° C under the same conditions as in Example 5.
  • the yield of glucose-11-phosphate is preferably 5% or more, more preferably 10% or more, even more preferably 20% or more30. more preferably at least 40%, more preferably at least 40%, even more preferably at least 50%. It is even more preferred that it be at least / ⁇ 70. It is particularly preferred that it be at least / ⁇ 80. / ⁇ or less Most preferably above.
  • the heat-resistant SP satisfying such conditions can be selected by reacting under the same conditions as in Example 5 and determining the yield of glucose-1-phosphate.
  • the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention can be used in any production method known in the art using sucrose phosphorylase, in addition to the production method described above.
  • a method for synthesizing a glucose polymer comprises the sucrose phosphorylase having increased thermostability of the present invention, a second phosphorylase having polyphenol-1_1-phosphate as a substrate, sucrose, a primer, and inorganic phosphate or glucose-1-phosphate. Reacting the reaction solution to produce a glucose polymer.
  • the term "glucose polymer” refers to a polymer containing a gnorecose residue in a part of the polymer.
  • glucose polymers examples include glucans (eg, human glucan and j3_1,3-glucan), cellobiose, cellooligosaccharides, laminaribiose, laminarioligosaccharides, and trehalose.
  • glucans eg, human glucan and j3_1,3-glucan
  • cellobiose cellooligosaccharides
  • laminaribiose laminarioligosaccharides
  • trehalose trehalose.
  • Examples of the method for producing a gnorecose polymer other than ⁇ _glucan include the following: For example, production of cellobiose and cellooligosaccharide in combination with cellobiose phosphorylase and cellodextrin phosphorylase (Japanese Patent No. 2815023) Production of laminaribiose and laminarioligosaccharide in combination with laminaribiose phosphorylase and laminaridextrin phosphorylase (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-343484, "Method of producing laminarioligosaccharide").
  • ⁇ -Gnolecan obtained by the production method of the present invention can be used for applications known in the art.
  • insoluble amylose among ⁇ -gnorecan is expected to work similarly to dietary fiber, and can be expected to be used in health foods.
  • amylose has a feature of being able to include, for example, iodine, fatty acid and the like in a molecule, and thus is expected to be used in the fields of pharmaceuticals, cosmetics, and sanitary products.
  • Amylose can also be used as a raw material for producing cyclodextrin and cycloamylose, which have the same inclusion capacity as amylose.
  • films containing amylose have a tensile strength comparable to general-purpose plastics, and are very promising as a material for biodegradable plastics.
  • High molecular weight amylose is also suitable for chiral fractionation.
  • amylose is expected to have many uses.
  • the gnorecose-1-monophosphate obtained by the synthesis method of the present invention can be used for applications known in the art for glucose-11-monophosphate.
  • Glucose-1-phosphate is, for example, an antibacterial agent for medical use, an antitumor agent (platinum complex), a therapeutic agent for heart disease (amine salt), a substrate for the synthesis of gnorecan (for example, 4-gunolecan or 3-gunorecan), It is used as a substrate for cellobiose synthesis, a substrate for cellooligosaccharide synthesis, a substrate for laminaribiose synthesis, a substrate for laminarioligosaccharide synthesis, and a substrate for trehalose synthesis.
  • Glucose was quantified using a commercially available measurement kit. It is measured using a glucose AR-II color reagent (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • Fructose was quantified using a commercially available measurement kit. Measure using F-kit D-Dalcose / D-fructose (Roche).
  • Glucose_1_phosphate was quantified by the following method. 300 ⁇ measurement reagent (200 mM Tris-HCl (pH 7.0), 3 mM NADP, 15 mM magnesium chloride, 3 mM EDTA, 15 ⁇ M glucose-1,6_diphosphate, 6 ⁇ g / ml phosphodalcomtase , 6 ⁇ g / ml glucose-6-phosphate dehydrogenase), add 600 ⁇ l of a solution containing appropriately diluted glucose-1-phosphate, stir and add the resulting reaction mixture at 30 ° C. Incubate for 30 minutes. Thereafter, the absorbance at 340 nm is measured using a spectrophotometer.
  • the absorbance is measured in the same manner using sodium gnorecose-1-phosphate with a known concentration, and a standard curve is prepared. Apply the absorbance obtained for the sample to this standard curve, and determine the concentration of Dalkose-1-phosphate in the sample. In this assay, only gnorecose-1 monophosphate is quantified, not the amount of inorganic phosphate.
  • Inorganic phosphoric acid was determined as a phosphate ion by the following method.
  • a solution containing inorganic phosphoric acid (200 ⁇ l) was mixed with 800 ⁇ 1 molybdenum reagent (15 mM ammonium molybdate, 100 mM zinc acetate), and then mixed with 200 ⁇ l of 568 mM ascorbic acid ( ⁇ 500 ) And stirred, and the resulting reaction mixture is reacted at 30 ° C. for 30 minutes. Then, measure the absorbance at 850 nm using a spectrophotometer. Measure the absorbance in the same manner using inorganic phosphoric acid with a known concentration, and create a standard curve. Apply the absorbance obtained for the sample to this standard curve to determine the inorganic phosphoric acid in the sample. In this assay, the amount of inorganic phosphate is determined, but not the amount of glucose_1_phosphate.
  • reaction (A) represented by the following formula can occur.
  • sucrose phosphorylase This reaction is catalyzed by sucrose phosphorylase.
  • sucrose and inorganic phosphate react to produce the same molar amounts of glucose monophosphate and fructose.
  • the resulting fructose does not react with other substances any more, so measuring the molar amount of fructose gives the molar amount of gnorecose_1-phosphate generated.
  • sucrose phosphorylase can also catalyze the hydrolysis of sucrose in the following reaction (B) as a side reaction.
  • the amount of glucose taken into gnorecan is calculated as follows.
  • the yield of gnorecan produced using glucose-1-phosphate as a starting material was From the amount of glucose-1-phosphate and the amounts of glucose, fructose and glucose-1-phosphate in the solution after the reaction is completed.
  • dalcose-1-phosphate is produced by reaction A in addition to the initial glucose-11-phosphate.
  • the initial gnorecose 1-phosphate and the generated darucose 1-phosphate can be used for glucan synthesis.
  • the amount of glucose-1-monophosphate used in the reaction is subtracted from the amount of glucose-1-monophosphate remaining in the reaction solution after the reaction is completed, from the amount of gnorecose-1-monophosphate that can be used in the synthesis of glucan. , That is, the amount of gnorecose incorporated into gnorecan. Therefore, the amount of glucose incorporated into glucan can be determined by the above equation. This formula can also be applied to a case where inorganic phosphoric acid and glucose-11-monophosphate are used as starting materials in the SP_GP reaction system.
  • the yield of gnorecan when produced using inorganic phosphoric acid as a starting material can be determined by the following equation.
  • the yield of glucan when produced using glucose-1-phosphate as a starting material is determined by the following formula.
  • this formula shows that inorganic phosphoric acid and glucose- 1 Can be applied when used in combination with phosphoric acid.
  • the activity unit of sucrose phosphorylase can be determined, for example, by the following method.
  • the activity unit of the phosphatase can be determined, for example, by the following method. After holding the reaction solution containing the enzyme solution ⁇ appropriately diluted with 20mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.0) and 100 ⁇ l of 50mM glucos-1-phosphate aqueous solution at 37 ° C for 60 minutes It is measured by quantifying free inorganic phosphoric acid generated from gnorecose-1 phosphoric acid in the reaction solution. The amount of the enzyme that produces 1 ⁇ mol of inorganic phosphate per minute was defined as 1 unit.
  • the activity unit of amylase can be determined, for example, by the following method.
  • a reaction solution containing 25 ⁇ l of enzyme solution appropriately diluted with 20 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 7.0) and 25 ⁇ l of 0.5% amylose (weight average molecular weight approx. 70,000: Azinoki) aqueous solution was used.
  • the amount of enzyme that reduces the absorbance at 660 nm by 10% per minute was defined as 1 unit.
  • sucrose phosphorylase gene was incorporated into PKK388-1 together with the selectable marker genes Ampr and Tet f to obtain plasmid pKK388-SMSP.
  • the sucrose phosphorylase gene was replaced with isopropyl-D-thiogalatatopyranoside. (PTG) operably linked under the control of an inducible promoter.
  • PTG isopropyl-D-thiogalatatopyranoside.
  • This plasmid was introduced into E. coli TG-1 (manufactured by STRATAGENE) by the competent cell method. The E.
  • coli was plated on an LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 50 zg / ml ampicillin, 1.5% agar) containing the antibiotic ampicillin, and incubated at 37 ° C. Overnight.
  • Escherichia coli grown on this plate Escherichia coli into which the sucrose phosphorylase gene was introduced was obtained. It was confirmed that the obtained Escherichia coli contained the sucrose phosphorylase gene by analyzing the sequence of the introduced gene. It was confirmed by activity measurement that the obtained Escherichia coli expressed sucrose phosphorylase.
  • the obtained Escherichia coli was cultured in 5 ml of LB liquid medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 50 ⁇ g / ml ampicillin) for 18 hours, and the total amount was changed to another 1 L of LB liquid medium. And cultured with shaking at 120 rpm for 6-7 hours at 37 ° C. Thereafter, IPTG was added to this medium to a concentration of 0.04 mM, and sucrose phosphorylase was expressed by further culturing with shaking at 30 ° C for 18 hours. The culture was then incubated at 5, OOOrpm for 5 minutes. The cells of Escherichia coli were collected by centrifugation.
  • LB liquid medium 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 50 ⁇ g / ml ampicillin
  • the obtained cells were suspended in 50 ml of 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer ( ⁇ 70) and then disrupted by sonication to obtain 50 ml of a cell disrupted solution. Then, sucrose was added to the cell lysate to obtain a cell lysate containing 20% sucrose. The cell lysate was heated in a 55 ° C water bath for 20 minutes. After heating, the mixture was centrifuged at 8,500 rpm for 20 minutes using a centrifugal machine (AVANTI J-25I, manufactured by Beckman) to remove insoluble proteins and the like, thereby obtaining a supernatant.
  • AVANTI J-25I manufactured by Beckman
  • the obtained supernatant was passed through a roughly equilibrated anion exchange resin Q-Sepharose (manufactured by Amersham Pharmacia) to adsorb sucrose phosphorylase to the resin.
  • the resin was washed with a buffer containing 100 mM sodium chloride to remove impurities.
  • sucrose phosphorylase was eluted with a buffer containing 300 mM sodium chloride to obtain a heat-resistant sucrose phosphorylase enzyme solution.
  • thermostable sucrose phosphorylase enzyme solution containing 1.5 M ammonium sulfate was flowed and adsorbed to a previously equilibrated phenol TOYOPEARL resin (manufactured by Tosoh Corporation). The resin was washed with a buffer containing 1.0 M ammonium sulfate to remove impurities. Subsequently, 0.75M ammonium sulfate The sucrose phosphorylase was eluted with a buffer solution containing to obtain purified sucrose phosphorylase. At this stage, a glucan phosphorylase-containing solution that can be used in the present invention is obtained. If further purification is required, gel filtration chromatography using Sephacryl S-200HR (manufactured by Amersham Pharmacia) or the like can be used. The purified enzyme solution can be obtained by performing fractionation by the above method.
  • SDS_PAGE SDS-polyacrylamide electrophoresis
  • Thermus aquaticus hikunorecan phosphorifolide (J. Appl. Glycosci., 48 (1) (2001) 71) was incorporated into pKK388_l (manufactured by CLONTECH) together with selectable marker genes Amp and Tet r to obtain plasmid pKK388_GP. .
  • the a-gnorecantholylase gene was operably linked under the control of an isopropyl-1- ⁇ -D-thiogalatatopyranoside (IPTG) inducible promoter.
  • IPTG isopropyl-1- ⁇ -D-thiogalatatopyranoside
  • This plasmid was introduced into Escherichia coli MC1061 (manufactured by Pharmacia) by the competent cell method. This E.
  • coli was plated on an LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 50 / ig / ml ampicillin, 1.5% agar) containing the antibiotic ampicillin, and incubated at 37 ° C. Overnight.
  • Escherichia coli grown on this plate Escherichia coli to which the human glucan phosphorylase gene was introduced was obtained. It was confirmed that the obtained Escherichia coli contained the ⁇ -glucan phosphorylase gene by analyzing the sequence of the introduced gene. Further, it was confirmed by activity measurement that the obtained Escherichia coli expressed human glucan phosphorylase.
  • the obtained E. coli was transformed into an LB liquid medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, l% NaCl,
  • the cells were cultured in 5 ml of 50 ⁇ g / ml ampicillin) for 18 hours. The whole amount was inoculated into another 1 L of LB liquid medium, and cultured at 37 ° C. with shaking at 120 rpm for 45 hours at 37 ° C. Thereafter, IPTG was added to this medium so as to have a concentration of 0.4 lmM, and the cells were shake-cultured at 37 ° C for another 20 hours. Then The culture was centrifuged at 5, OOCkprn for 5 minutes to collect E. coli cells. The obtained cells were suspended in 50 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), and then disrupted by ultrasonic treatment to obtain 50 ml of a cell disrupted liquid.
  • Tris-HCl buffer pH 7.0
  • the cell lysate was heated at 70 ° C for 30 minutes. After heating, the lysate was centrifuged at 850 rpm for 20 minutes to remove insoluble proteins and the like, thereby obtaining a supernatant. The resulting supernatant was used as a recombinant Thermus aquaticus human glucan phosphorylase solution.
  • sucrose phosphorylase gene derived from Streptococcus mutans
  • the gene into which the random mutation was introduced was introduced into Escherichia coli
  • the sucrose phosphorylase into which the random mutation was introduced was expressed, and the expressed sucrose was expressed.
  • Escherichia coli expressing sucrose phosphorylase having thermostability capable of synthesizing glucan was selected, and a thermostable sucrose phosphorylase gene was isolated from the Escherichia coli and the gene was isolated. The sequence was determined.
  • a random mutation was introduced into the natural Streptococcus mutans-derived sucrose phosphorylase gene shown in SEQ ID NO: 1 by an error-blown PCR method known to those skilled in the art, and the SP gene into which the random mutation was introduced was introduced. Got. Under these conditions, there are generally one to two random mutations per sucrose phosphorylase gene.
  • the SP gene into which the random mutation was introduced was incorporated into pKK388-1 together with the selectable marker genes Amp and Te to obtain a plasmid library pKK388_SMSP.
  • the sucrose phosphorylase gene was operably linked under the control of an isopropyl_j3-D-thiogalata topyranoside (IPTG) inducible promoter.
  • IPTG isopropyl_j3-D-thiogalata topyranoside
  • This plasmid library was introduced into Escherichia coli TG-1 by the competent cell method.
  • the E. coli was plated on an LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 50 xg / ml ampicillin, 1.5% agar) containing the antibiotic ampicillin and incubated at 37 ° C. Cultured overnight. By selecting Escherichia coli grown on this plate, a plurality (about 100,000) Escherichia coli into which the sucrose phosphorylase gene was introduced was obtained. [0408] Each of these Escherichia coli was inoculated into 150 ⁇ l of a TERRIFICBROTH liquid medium (manufactured by GIBCO BRL) containing 50 / ig / ml ampicillin, and left to stand at 37 ° C for 18 hours.
  • a TERRIFICBROTH liquid medium manufactured by GIBCO BRL
  • a lysate (10 mg / ml egg white lysozyme, 1 U / ml deoxyribonuclease, 200 mM salted magnesium, 0.5% triton ⁇ _100) was added to this culture solution, and then 8080.
  • the mixture was frozen at 37 ° C for 1 hour and thawed at 37 ° C for 1 hour to obtain a bacterial cell extract.
  • the obtained bacterial cell extract was centrifuged at 13, OOOrpm for 10 minutes using a centrifuge (CT-13R, manufactured by Hitachi, Ltd.) to remove insoluble proteins and the like, and a supernatant was obtained.
  • sucrose phosphorylase is present in the supernatant, amylose is synthesized from sucrose during incubation, and amylose develops a blue color with iodine, but does not develop sucrose. It contains sucrose phosphorylase. Screening was performed by the above method, and Escherichia coli (about 100) containing the sucrose phosphorylase gene having improved thermostability was obtained from transformed Escherichia coli (about 80,000) containing the sucrose phosphorylase gene having a random mutation.
  • the plasmid was recovered from Escherichia coli containing the sucrose phosphorylase gene having improved thermostability obtained by the above screening according to a method known in the art, and the sucrose phosphorylase having improved thermostability in this plasmid was determined using a DNA sequencer (ABI). The sequence of the gene was determined.
  • sucrose phosphorylase gene having improved thermostability was compared with the amino acid sequence of natural sucrose phosphorylase (amino acid sequence IJ of SEQ ID NO: 2). , 128, 140, 144, 155, and 249, mutations were introduced at T47 ⁇ S, S62 ⁇ P, Y77 ⁇ H, V128 ⁇ L, K140 ⁇ M, Q144 ⁇ Amino acid substitutions were made at R, N155 ⁇ S, and D249 ⁇ G. Thus, sucrose phosphorylase is effective for improving the thermostability. Eight kinds of amino acid positions which seemed to have fruit were confirmed.
  • the mutations T47 ⁇ S and V128 ⁇ L are so-called conservative substitutions.
  • a conservative substitution shows heat resistance
  • this position is presumed to be a position that is particularly relevant to heat resistance. It is expected that further heat resistance will be observed when substituted with other amino acids that have not been used.
  • mutations affecting heat resistance were not found in any of these 8 positions, and mutations at other positions are considered to have no effect on heat resistance.
  • amino acids other than S in T47 amino acids other than P in S62, amino acids other than H in Y77, amino acids other than L in V128, amino acids other than M in K140, and amino acids other than R in Q144 Amino acids, amino acids other than S in N155, or D2
  • sucrose phosphorylase having improved thermostability by site-directed mutagenesis a library was prepared by combining the above eight mutations. The library was screened to obtain sucrose phosphorylase with further improved heat resistance.
  • an expression vector for sucrose phosphorylase having improved thermostability was prepared in the same manner as in Example 1.
  • a gene encoding a heat-resistant SP having only one substitution at a position found to contribute to heat-resistance in Example 1 and a heat-resistant SP having a combination of any two of the seven SPs The gene encoding and the gene encoding the thermostable SP having all eight were prepared.
  • the base sequence encoding the heat-resistant SP having all eight mutations (T47S, S62P, Y77H, VI 28L, K140K, Q144R, N155S, and D249G) is shown in SEQ ID NO: 21 and this heat-resistant.
  • the amino acid sequence of the modified SP is shown in SEQ ID NO: 22. These amino acid substitutions were made using site-specific mutagenesis methods known in the art.
  • sucrose phosphorylase enzyme solution having improved thermostability was prepared by the method described in 2.1.
  • a natural sucrose phosphorylase enzyme solution was prepared according to the method described in 2.1.
  • sucrose phosphorylase No. la, 2a, 3a, 4a, 5a and 6a having substitution and addition at the C-terminus of mutant SP
  • each SP enzyme solution was appropriately diluted with a 20 mM Tris buffer (pH 7.0) at 37 ° C to 2.5-3.5 U / ml. 50 ⁇ l of the diluted enzyme solution was heated at 55 ° C. for 20 minutes, or at 57 ° C. for 20 minutes, or at 60 ° C. for 20 minutes. Immediately after the heating was completed, the mixture was kept on ice for 10 minutes and cooled. The activity of the enzyme solution after cooling and the activity of the enzyme solution before heating were measured at 37 ° C. according to the SP activity measurement method described in 1.7. The heat resistance of each enzyme was measured by determining the ratio of the enzyme activity of sucrose phosphorylase after heating to the enzyme activity of sucrose phosphorylase before heating (residual activity).
  • each SP enzyme night was appropriately diluted with 5.0–7. OU / m corn (20 mM Tris fn3 ⁇ 4 (pH 7.0).
  • the diluted enzyme solution (25 ⁇ l) and 40 mM sucrose in 20 mM T ris buffer (pH 7.0) was mixed with 25 ⁇ 1.
  • the mixed solution 50 ⁇ 1 was heated for 20 minutes at 65 ° C.
  • the mixture was kept on ice for 10 minutes and cooled.
  • the activity of the enzyme solution and the activity of the enzyme solution before heating were measured at 37 ° C according to the SP activity measurement method described in 1.7.
  • the heat resistance of each enzyme was determined by comparing the enzyme activity of sucrose phosphorylase before heating with that of heating.
  • WT means sucrose derived from unmutated natural Streptococcus mutan s. 1 shows phosphorylase.
  • the variant of No. 33 is a natural Streptococc A sucrose phosphorylase in which two amino acids FE at the C-terminus of sucrose phosphorylase derived from us mutans are substituted with SL, and methionine, isoleucine, serine, cystine, glutamine and threonine are added in this order.
  • ⁇ indicates that there is a mutation at that position. For example, the No.
  • the " ⁇ " for the C-terminal modification means that phenylalanine at position 480 is replaced with leucine, glutamic acid at position 481 is replaced with serine, and methionine, isoleucine, serine, cysteine, gnoletamine, and threonine. Is added after that (482th to 487th).
  • Example 2B Production of sucrose phosphorylase having improved thermostability substituted with various amino acid residues, and measurement of thermostability
  • T47S represents a mutant in which threonine at position 47 of SP derived from Streptococcus mutans was substituted with serine. The same applies to other cases.
  • WT indicates native SP from Streptococcus mutans.
  • A62 is a position corresponding to S62 in SEQ ID NO: 2.
  • V128 is a position corresponding to V128 in SEQ ID NO: 2.
  • N155 is a position corresponding to N155.
  • sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention at 55 ° C was examined.
  • the purified enzyme solution of heat-resistant sucrose phosphorylase of No. 2, 3, 4, 5 or 6 in Table 4A or the control (natural (WT) Streptococcus mutans sucrose phosphorylase enzyme solution) was used. 37. The mixture was appropriately diluted with 20 mM Tris buffer (pH 7.0) to 1 U / ml in C. The activity of the diluted enzyme solution was measured according to the SP activity measurement method described in 1.7 except that the reaction temperature was 55 ° C.
  • sucrose phosphorylase in the same amount of enzyme solution as that used in the reaction was measured using a protein assay kit (manufactured by Bio-Rad) according to the manufacturer's instructions.
  • a calibration curve for measurement was prepared using IgG.
  • the amylose yield in amylose synthesis using the sucrose phosphorylase having improved thermostability of the present invention was examined.
  • sucrose phosphorylase having improved thermostability various thermostable SPs prepared in Example 3 (Nos. 1 to 6, 25 and 32) were used.
  • amylose synthesis reaction was carried out at 50 ° C or 5 ° C using a reaction system having the composition shown in Table 6 below.
  • ⁇ -glucan phosphorylase recombinant Thermusaquaticus-derived glucan phosphorylase prepared in 2.2 was used.
  • the heat-resistant SP of the present invention can synthesize amine under high temperature conditions (for example, 50 ° C to 55 ° C). It was found that when the heat-resistant SP of the present invention was used, amylose could be synthesized at a yield of about 2 times to about 18 times higher than when wild-type SP was used.
  • Example 5 Synthesis of glucose_1_phosphate using sucrose phosphorylase having improved thermostability
  • sucrose phosphorylase having increased thermostability various sucrose phosphorylases having improved thermostability (Nos. 1 to 6, 25 and 32) prepared in Example 3 above were used.
  • natural (SEQ ID NO: 2) sucrose phosphorylase derived from Streptococcusmutans was used as a control.
  • Glucose_1_phosphate synthesis reaction was carried out at 50 ° C or 55 ° C for 18 hours using a reaction system having the composition shown in Table 8 below.
  • the heat-resistant SP of the present invention can synthesize glucose monophosphate under high temperature conditions.
  • glucose is obtained at a yield of about 1.5 to about 16 times higher than that of the case of using wild-type SP. It was found that acid could be synthesized.
  • sucrose phosphorylase having improved thermostability could be easily purified by heat treatment.
  • Escherichia coli expressing sucrose phosphorylase having improved thermostability of Nos. 1, 2, 3, 4 and 5 shown in Table 4A, and Escherichia coli expressing sucrose phosphorylase derived from natural (SEQ ID NO: 2) Streptococcus mutans were used as controls.
  • Each was cultured in the same manner as in the method described in Example 2A (1). The cells were collected by centrifuging the culture, and the cells were suspended in a buffer and subjected to ultrasonic treatment to obtain a cell extract. Sucrose was added to the cell extract to obtain a mixture having a sucrose concentration of 20% . The mixture was heated at 65 ° C for 20 minutes, and centrifuged to remove insoluble proteins. An enzyme solution was obtained.
  • Heating the enzyme solution containing SP at 65 ° C to remove denatured proteins improved the specific activity of the obtained purified enzyme solution by about 3 times to about 5 times before heating. . This indicates that the heat-resistant SP did not denature and most of the contaminating proteins were denatured and removed. In comparison, the specific activity of native (WT; SEQ ID NO: 2) SP was reduced by a factor of about 100. This indicates that not only the contaminating proteins but also the SP proteins are denatured. Furthermore, by heating at 65 ° C, the phosphatase activity and amylase activity derived from the host bacteria could be reduced to about 3.0% or less and about 1.0% or less before heating, respectively. As described above, it was found that heat-treating the heat-resistant SP can easily purify the heat-resistant SP.
  • the present invention provides thermostable sucrose phosphorylase that can be used for efficient production of glucan, G-11P and the like at high temperatures.

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Abstract

　天然のスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）を改変して得られる耐熱化ＳＰおよびこの耐熱化ＳＰの調製方法が提供される。この耐熱化ＳＰは、モチーフ配列１中の１４位に相当する位置、２９位に相当する位置、および４４位に相当する位置；モチーフ配列２中の７位に相当する位置、１９位に相当する位置、２３位に相当する位置および３４位に相当する位置；ならびにモチーフ配列３中の１９位に相当する位置；からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつ該耐熱化ＳＰを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５５°Cで２０分間加熱した後の耐熱化ＳＰの３７°Cにおける酵素活性が、該加熱前の耐熱化ＳＰの３７°Cにおける酵素活性の２０％以上である。

Description

明 細 書
スクロースホスホリラーゼ（SP)の耐熱化方法
技術分野
[0001] 本発明は、耐熱性スクロースホスホリラーゼぉよびこの耐熱性スクロースホスホリラ ーゼをコードする遺伝子に関する。さらに本発明は、耐熱性スクロースホスホリラーゼ の製造方法に関する。
背景技術
[0002] スクロースホスホリラーゼ（以下、 SP、 SP酵素ともいう）は、例えば、 α—グルカン合 成、 G— 1一 Ρ合成などに利用されている酵素である。
[0003] α—グルカン（特に不溶性のアミロース）には、食物繊維と同様の働きが予想され、 健康食品への利用も期待できる。さらに、直鎖状 α _グルカンであるアミロースは、例 えばヨウ素、脂肪酸などを分子内に包接し得る特徴を持つことから、医薬品、化粧品 、サニタリー製品分野での用途が期待される。アミロースはまた、アミロースと同様の 包接能力を持つシクロデキストリンおよびシクロアミロースの製造用原料に利用できる 。さらに、アミロースを含有したフィルムは、汎用プラスチックに劣らない引張強度を持 ち、生分解性プラスチックの素材として非常に有望である。このようにアミロースには、 多くの用途が期待されている。しかし、実質的に純粋なアミロースは得ることが困難で あり、非常に高価であるので、試薬レベルで流通しているだけであり、産業用素材とし てはほとんど利用されていなレ、。そのため、安定的かつ安価にアミロースを製造する 方法が望まれている。
[0004] G_1_Pは例えば、医療用抗菌剤、抗腫瘍剤（白金錯体）、心臓病の治療薬 (ァミン 塩）、 ひ—グルカン合成の基質として利用されている。
[0005] SPは、いくつかの細菌（Streptococcus属の細菌、 Leuconostoc属の糸田菌、大腸 菌、乳酸菌など）に存在することが報告されており、これらの細菌の有する SPのァミノ 酸配列および塩基配列は公知である。
[0006] α—グルカンまたは G—1—Pの製造には、種々の SPが用いられ得、 Leuconostoc 属の細菌由来の SPが用いられることが多い。なぜなら、比較的大量の酵素が得やす いからである。
[0007] α—ダルカンの工業的な生産においては、夾雑する他の酵素活性、特にホスファタ ーゼ活性およびアミラーゼ活性をできるだけ除去する必要がある。 SPおよび GPを用 いてひ—グノレカンを合成する場合、ホスファターゼが存在すると、反応中間体として合 成される G— 1一 Ρが分解され、 ひ—グノレカンの収率が低下するからである。アミラーゼ が存在すると、合成されたひ—グルカンが分解され、分子量の低下を引き起こすから である。このためにこれらの夾雑酵素を除去する必要がある。 SPを大量に製造する ために、 SP遺伝子を発現させる宿主としては、大腸菌および枯草菌が望ましい。とこ ろ力 図 2および図 3に示したように、大腸菌はアミラーゼ活性およびホスファターゼ 活性を、枯草菌はアミラーゼ活性をそれぞれ菌体内に有している。し力 ながら、図 2 および図 3に示したように、これら宿主の有する酵素は、 55°Cの熱処理で失活させる ことはできないが、熱処理温度を 60°Cにすると、ほぼ失活させることができる。したが つて、 60°Cの熱処理でもそれほど活性を失わない耐熱性を有する SP、あるいは、ァ ミラーゼまたはホスファターゼよりも耐熱性が高い SPが望まれていた。
[0008] 参考として、種々の細菌（大腸菌 TG-1株、大腸菌 BL21株、および枯草菌 ANA— 1株）の菌体抽出液中の加熱前および加熱後のアミラーゼ活性およびホスファターゼ 活性の具体的な数値を以下の表 1に示す。
[0009] [表 1] ホスファタ一ゼ活性 （％) アミラーゼ活性 （％)
TG- 1 B L 2 1 TG- 1 B L 2 1 ANA— 1 加熱前 1 00 1 00 1 00 1 00 1 00
50°C 99. 1 98. 6 2 1. 6 28. 6 33. 8
55°C 60. 9 74. 5 9. 1 9. 7 1 9. 8
6 OuC 2. 9 3. 1 0. 4 0 3. 0 65°C 2. 5 2. 0 0. 9 0 2. 4
[0010] しかし、 SPで耐熱性を有するもの、特に高温 (例えば、 60°C— 75°C)で充分な活 性を維持できる SPは知られてレヽなレ、。
[0011] α—ダルカンまたは G—1—Pの製造においてはまた、反応をできるだけ高温で行うこ とが好ましい。なぜなら、一般的に酵素反応を高温で行うほど、反応速度が上昇し、 ひ—ダルカンの操作性が上昇するためである。 ひ—グノレカン、特にアミロースは老化し て不溶化し、沈澱またはゲルを形成する。この老化速度は、温度に依存することが周 知である。反応温度が低い場合には、製造後のアミロース溶液がゲルィ匕するなど、そ の後の段階で操作性に問題が生じる。反応を高温で行うためには、酵素が耐熱性で あることが必要である。
[0012] しかし、上記の細菌は、いずれも中温菌であり、細菌由来の SPで耐熱性を有する S P、特に高温 (例えば、 50°C 60°C)で充分な活性を維持できる SPは知られていな レ、。そのため、従来の SPの場合には、加熱処理によって精製コストを低下させること はできず、高温で反応を行うこともできない。
[0013] 細菌（原核生物）以外に由来する SPについては、カビ (真核生物）由来の SPが報 告されている（非特許文献 1を参照）。この文献によれば、 Monilia sitophila (Neur ospora intermediaとしても公知）由来の SPは、 70°Cで 30分間加熱した後に、 90 %以上の活性が残存する。
[0014] しかし、この文献で報告された実験結果は、非常に精製度の低い SPを用いての実 験結果であり、観察している SP活性も本当に SP活性を定量的に測定できているか 疑問が残る。さらに、カビの多くは菌体外にアミラーゼを分泌するので、 SP酵素を利 用するためには高度の精製が必要となり、 SP酵素を精製するために時間およびコス トが非常にかかる。精製を容易にするために、ホスファターゼおよびアミラーゼの分泌 量が少ない宿主に遺伝子組換え技術を用いてこのカビ由来の SP酵素を導入するこ とは不可能である。なぜなら、このカビ由来の SPについては、アミノ酸配列も塩基配 歹 IJも公知ではなレ、からである。
[0015] SP酵素については、酵素を固定化することによって耐熱性が向上したとの報告は あるが、固定化酵素は基質特異性が変化することがあるなどの欠点を有し、かつ固 定化による耐熱性向上には限界があるので、 SP酵素自体の耐熱性を向上させること が望ましい。 SP酵素に変異を導入することによって耐熱化することについての報告 はない。
[0016] SP酵素は、高濃度スクロースの存在下では見かけの耐熱性が向上する（特許文献
1を参照のこと）。しかし、高濃度スクロースの存在による耐熱性の上昇は限界がある ので、 SP酵素自体の耐熱性が上昇することが望まれている。 [0017] これらの問題を解決するために、工業的利用に有利な、耐熱性が高い SPが必要と されている。
[0018] 一方、一般的な酵素の耐熱化にっレ、ては、プロリンセオリー、酵素の立体構造情報 に基づくアミノ酸置換などの理論的方法が試みられているが、必ずしも成功していな レ、。そのため、現在でも依然として、ランダム変異による方法またはランダム変異と理 論的方法との組み合わせによる方法が主に行われている。いずれの方法でも、それ ぞれのタンパク質ごとに試行錯誤的に試す必要がある。
[0019] SP以外の酵素に関しては、耐熱化にかかわる特定のアミノ酸の位置を決定できれ ば、特定した 1箇所または複数箇所の位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換 することによって、酵素を耐熱化できることが報告されている（例えば、非特許文献 2 一 4を参照のこと）。
特許文献 1：国際公開第 02/097077号パンフレット
非特許文献 1 : Μ· C. B. Pimentelら、「SCREENING, THERMAL PROPER TIES AND PRODUCTION IN YAM EXTRAT OF FUNGAL SUC ROSE PHOSPHYRYLASEJ、 Rev. Microbiol. , Sao Paulo, 1992、 23 (3) 、 pp. 199-205
非特許文献 2 : Martin Lehmannおよび Markus Wyss著、「Engineering prot eins for thermostability： the use of sequence alignments versus ra tional design and directed evolutionj、 Current Opinion in Biotechn ology、 2001、 12、 pp. 371-375
非特許文献 3 : M. Lehmannり著、「The consensus concept for thermosta bility engineering of proteinsj、 Biochemica Biophysica Acta、 2000、 1 543、 pp. 408-415
非特許文献 4 : Junichi Miyazakiら著、「Ancestral Residues Stabilizing 3—1 sopropylmalate Dehydrogenase of an Extreme Thermophile： Experi mental Evidence Supporting the Thermophilic Common Ancestor HypothesisJ、 J. Biochem、 2001、 129、 pp. 777-782
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0020] 本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、従来のスクロースホスホリラー ゼよりも耐熱性が高レ、スクロースホスホリラーゼを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0021] 本発明者らは、遺伝子配列が公知の SP酵素を耐熱化することによって上記の課題 を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 SPの配列中の特定の位置のアミノ酸残基を 置換することによって、耐熱性が向上した SPが得られることを最終的に見出し、これ に基づいて本発明を完成させた。
[0022] 本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、天然のスクロースホスホリラーゼを改 変して得られる耐熱化スクロースホスホリラーゼであって、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、
モチーフ配列 1： AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPID YHEVDS AFGDWDD VKRLGEKYYLMFDFMINHIS中の 14位に相当する位置、 29位に相当する位 置、および 44位に相当する位置；
モチーフ配列 2： RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTF GEEQID中の 7位に相当する位置、 19位に相当する位置、 23位に相当する位置お よび 34位に相当する位置；ならびに
モチーフ配列 3： ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG 中の 19位に相当する位置；
力 なる群より選択される少なくとも 1つの位置において、天然のスクロースホスホリラ 一ゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを 20mM Tris緩衝液（ρΗ7· 0)中で 55°Cで 2 0分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性力 該 加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20%以上であ る。
[0023] 1つの実施形態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸 配列と少なくとも 40%の同一性を有し得る。
[0024] 1つの実施形態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸 配列と少なくとも 60%の同一性を有し得る。
[0025] 1つの実施形態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸 配列をコードする塩基配列からなる核酸分子とストリンジ工ントな条件下でハイブリダ ィズする核酸分子によってコードされ得る。
[0026] 1つの実施形態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択され得る。
[0027] 1つの実施形態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼは、 Streptococcus m utans、 Streptococcus pneumoniae streptococcus sorbmus、 Streptococ cus mitis、 Leuconostoc mesenteroides^ Oenococcus oeni、 Lactobacilli! s acidophilusおよび Listeria monocytogenesからなる群より選択される細菌由 来であり得る。
[0028] 1つの実施形態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼは、 Streptococcus m utans、 Streptococcus pneumoniae streptococcus sorbmusまブこ ίま： ^trept ococcus mitisに由来し得る。
[0029] 1つの実施开態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼは、 Streptococcus m utansま 7こ fま Leuconostoc mesenteroid.esに由来し得 >。
[0030] 1つの実施形態では、上記モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置におけるアミ ノ酸残基は、セリンまたはイソロイシンであり得る。
[0031] 1つの実施形態では、上記モチーフ配列 1中の 29位に相当する位置におけるアミ ノ酸残基は、プロリン、ァラニンまたはリジンであり得る。
[0032] 1つの実施形態では、上記モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置におけるアミ ノ酸残基は、ヒスチジン、アルギニンまたはトリプトファンであり得る。
[0033] 1つの実施形態では、上記モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置におけるアミ ノ酸残基は、アルギニンであり得る。
[0034] 1つの実施形態では、上記モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置アミノ酸残基は
Figure imgf000008_0001
[0035] 1つの実施形態では、上記モチーフ配列 2中の 19位に相当する位置におけるアミ ノ酸残基は、メチォニン、システィン、フエ二ルァラニン、イソロイシン、バリンまたはチ 口シンであり得る。
[0036] 1つの実施形態では、上記モチーフ配列 2中の 19位に相当する位置におけるアミ ノ酸残基は、ノ リンまたはチロシンであり得る。
[0037] 1つの実施形態では、上記モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置におけるアミ ノ酸残基は、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジンまたはバリンであり得る。
[0038] 1つの実施形態では、上記モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置におけるアミ ノ酸残基は、ヒスチジンであり得る。
[0039] 1つの実施形態では、上記モチーフ配列 2中の 34位に相当する位置におけるアミ ノ酸残基は、セリンまたはトレオニンであり得る。
[0040] 1つの実施形態では、上記モチーフ配列 2中の 34位に相当する位置におけるアミ ノ酸残基はセリンであり得る。
[0041] 1つの実施形態では、上記モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置におけるアミ ノ酸残基は、グリシン、システィン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、ァスパラギン、プロリ ン、グルタミン、アルギニンまたはセリンであり得る。
[0042] 1つの実施形態では、上記モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置におけるアミ ノ酸残基は、グリシンであり得る。
[0043] 1つの実施形態では、上記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20mM Tris緩衝 液（pH7. 0)中で 57°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37
。Cにおける酵素活性は、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37。Cにおけ る酵素活性の 10%以上であり得る。
[0044] 1つの実施形態では、上記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20mM Tris緩衝 液（ρΗ7· 0)中で 57°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37
°Cにおける酵素活性は、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおけ る酵素活性の 20%以上であり得る。
[0045] 1つの実施形態では、上記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20%スクロースを含 む 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 65°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロー スホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性は、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリ ラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 10%以上であり得る。
[0046] 1つの実施形態では、上記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20%スクロースを含 む 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 65°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロー スホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性は、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリ ラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20%以上であり得る。
[0047] 1つの実施形態では、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、少なくとも、モ チーフ配列 1中の 14位に相当する位置において、前記天然のスクロースホスホリラー ゼとは異なるアミノ酸残基を有し得る。
[0048] 1つの実施形態では、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、少なくとも、モ チーフ配列 3中の 19位に相当する位置において、前記天然のスクロースホスホリラー ゼとは異なるアミノ酸残基を有し得る。
[0049] 本発明の 1つの方法は、耐熱化スクロースホスホリラーゼを調製する方法であって、 第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改 変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程；
該第二の核酸分子を含む発現ベクターを作製する工程；
該発現ベクターを細胞に導入して耐熱ィヒスクロースホスホリラーゼを発現させるェ 程；および
該発現された耐熱化スクロースホスホリラーゼを回収する工程
を包含し、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、
モチーフ配列 1： AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPID YHEVDS AFGDWDD VKRLGEKYYLMFDFMINHIS中の 14位に相当する位置、 29位に相当する位 置、および 44位に相当する位置；
モチーフ配列 2： RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTF GEEQID中の 7位に相当する位置、 19位に相当する位置、 23位に相当する位置お よび 34位に相当する位置；ならびに
モチーフ配列 3： ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG 中の 19位に相当する位置；
力、らなる群より選択される少なくとも 1つの位置において、該第一のスクロースホスホリ ラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 55°Cで 2 0分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性力 該 加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20。/o以上であ る。
[0050] 1つの実施形態では、上記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸 配列と少なくとも 40%の同一性を有し得る。
[0051] 1つの実施形態では、上記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸 配列と少なくとも 60%の同一性を有し得る。
[0052] 1つの実施形態では、上記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸 配列をコードする塩基配列からなる核酸分子とストリンジ工ントな条件下でハイブリダ ィズする核酸分子によってコードされ得る。
[0053] 1つの実施形態では、上記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択され得る。 [0054] 1つの実施形態では、上記第一のスクロースホスホリラーゼは、 Streptococcus m utans、 Streptococcus pneumoniae streptococcus sorbmus、 Streptococ cus mitis、 Leuconostoc mesenteroides^ Oenococcus oeni、 Lactobacilli! s acidophilusおよび Listeria monocytogenesからなる群より選択される細菌由 来であり得る。
[0055] 1つの実施开態では、上記第一のスクロースホスホリラーゼは、 Streptococcus m utans、 Streptococcus pneumoniae^ streptococcus sorbmusまプこ fま ^trept ococcus mitisに由来し得る。
[0056] 1つの実施开態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼは、 Streptococcus m utansま 7こ fま Leuconostoc mesenteroid.esに由来し得 >。
[0057] 1つの実施形態では、上記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20mM Tris緩衝 液（pH7. 0)中で 57°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37
°Cにおける酵素活性は、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおけ る酵素活性の 10%以上であり得る。
[0058] 1つの実施形態では、上記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20mM Tris緩衝 液（ρΗ7· 0)中で 57°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37
°Cにおける酵素活性は、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおけ る酵素活性の 20%以上であり得る。
[0059] 1つの実施形態では、上記耐熱化スクロースホスホリラーゼは、少なくとも、モチーフ 酉己列 1中の 14位に相当する位置において、前記第一のスクロースホスホリラーゼとは 異なるアミノ酸残基を有し得る。
[0060] 1つの実施形態では、上記耐熱化スクロースホスホリラーゼは、少なくとも、モチーフ 酉己列 3中の 19位に相当する位置において、前記第一のスクロースホスホリラーゼとは 異なるアミノ酸残基を有し得る。
[0061] 本発明の核酸分子は、上記の耐熱化スクロースホスホリラーゼをコードする塩基配 列を含む。
[0062] 本発明のベクターは、上記の核酸分子を含む。
[0063] 本発明の細胞は、上記の核酸分子を含む。 [0064] 本発明の 1つの方法は、グルコース- 1一リン酸の合成方法であって、該方法は、請 求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ、スクロースおよび無機リン酸を含む 反応溶液を反応させて、グルコース - 1 -リン酸を生産する工程を包含する。
[0065] 1つの実施形態では、上記反応は、 50°C— 70°Cの温度で行われ得る。
[0066] 本発明の 1つの方法は、グルコース重合体の合成方法であって、該方法は、請求 項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼと、 ひ—グルコース _1_リン酸を基質と する第二のホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはダルコ一 ス _1_リン酸とを含む反応液を反応させて、グノレコース重合体を生産する工程を包含 する。
[0067] 1つの実施形態では、上記グルコース重合体は、 ひ—ダルカンであり得る。
[0068] 1つの実施形態では、上記第二のホスホリラーゼは、 ひ—グルカンホスホリラーゼで あり得る。
[0069] 1つの実施形態では、上記第二のホスホリラーゼは、セロビオースホスホリラーゼ、 セロデキストリンホスホリラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼ、ラミナリデキストリンホ スホリラーゼ、 β— 1 , 3—グルカンホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼから なる群より選択され得る。
[0070] 1つの実施形態では、上記反応は、 50°C— 70°Cの温度で行なわれ得る。
[0071] 本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、天然のスクロースホスホリラーゼを改 変して得られる耐熱化スクロースホスホリラーゼであって、該耐熱化スクロースホスホリ ラーゼは、配列番号 2のアミノ酸配列の 47位トレオニン (T47)に相当する位置、 62 位セリン（S62)に相当する位置、 77位チロシン (Y77)に相当する位置、 128位バリ ン (V128)に相当する位置、 140位リジン (K140)に相当する位置、 144位グノレタミ ン（Q 144)に相当する位置、 155位ァスパラギン（N155)に相当する位置および 24 9位ァスパラギン酸 (D249)に相当する位置からなる群より選択される少なくとも 1つ の位置において、該天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し、 かつ該耐熱化スクロースホスホリラーゼを 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 55°C で 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性が 、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20%以上 である。
[0072] 1つの実施形態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸 配列と少なくとも 40%の同一性を有し得る。
[0073] 1つの実施形態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸 配列と少なくとも 60%の同一性を有し得る。
[0074] 1つの実施形態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸 配列をコードする塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズする核酸分子によってコードされ得る。
[0075] 1つの実施形態では、上記塩基配列は、配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5、配 列番号 7、配列番号 9、配列番号 11、配列番号 13、配列番号 15、配列番号 17およ び配列番号 19からなる群より選択され得る。
[0076] 1つの実施形態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択され得る。
[0077] 1つの実施形態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼは、 Streptococcus m utans、 Streptococcus pneumoniae^ streptococcus sorbmus、 Streptococ cus mitis、 Leuconostoc mesenteroides、 Oenococcus oeni、 Lactobacilli! s acidophilusおよび Listeria monocytogenesからなる群より選択される細菌由 来であり得る。
[0078] 1つの実施开態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼは、 Streptococcus m utans、 Streptococcus pneumoniae^ streptococcus sorbmusまプこ fま ^trept ococcus mitisからなる群より選択される細菌由来であり得る。 [0079] 1つの実施开態では、上記天然のスクロースホスホリラーゼは、 Streptococcus m utansま 7こは Leuconostoc mesenteroiaesに由来し守る。
[0080] 1つの実施形態では、上記 T47に相当する位置におけるアミノ酸残基は、セリンま
Figure imgf000014_0001
[0081] 1つの実施形態では、上記 S62に相当する位置におけるアミノ酸残基は、プロリン、 ァラニンまたはリジンであり得る。
[0082] 1つの実施形態では、上記 Y77に相当する位置におけるアミノ酸残基は、ヒスチジ
Figure imgf000014_0002
[0083] 1つの実施形態では、上記 Y77に相当する位置におけるアミノ酸残基は、アルギニ ンであり得る。
[0084] 1つの実施形態では、上記 V128に相当する位置におけるアミノ酸残基は、口イシ
Figure imgf000014_0003
[0085] 1つの実施形態では、上記 K140に相当する位置におけるアミノ酸残基は、メチォ ニン、システィン、フエ二ルァラニン、イソロイシン、ノくリンまたはチロシンであり得る。
[0086] 1つの実施形態では、上記 K140に相当する位置におけるアミノ酸残基は、パリン またはチロシンであり得る。
[0087] 1つの実施形態では、上記 Q144に相当する位置におけるアミノ酸残基は、アルギ ニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジンまたはバリンであり得る。
[0088] 1つの実施形態では、上記 Q144に相当する位置におけるアミノ酸残基は、ヒスチ ジンであり得る。
[0089] 1つの実施形態では、上記 N155に相当する位置におけるアミノ酸残基は、セリンま たはトレォニンであり得る。
[0090] 1つの実施形態では、上記 N155に相当する位置におけるアミノ酸残基は、セリン であり得る。
[0091] 1つの実施形態では、上記 D249に相当する位置におけるアミノ酸残基は、グリシ ン、システィン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、ァスパラギン、プロリン、グノレタミン、アル ギニンまたはセリンであり得る。
[0092] 1つの実施形態では、上記 D249に相当する位置におけるアミノ酸残基は、グリシ ンであり得る。
[0093] 1つの実施形態では、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、 20mM Tris 緩衝液（ρΗ7· 0)中で 57°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼ の 37°Cにおける酵素活性力 該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cに おける酵素活性の 10%以上であり得る。
[0094] 1つの実施形態では、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、 20mM Tris 緩衝液（pH7. 0)中で 57°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼ の 37°Cにおける酵素活性力 該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cに おける酵素活性の 20%以上であり得る。
[0095] 1つの実施形態では、上記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20%スクロースを含 む 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 65°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロー スホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性力 該加熱前の耐熱化スクロースホスホリ ラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 10%以上であり得る。
[0096] 1つの実施形態では、上記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20%スクロースを含 む 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 65°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロー スホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性力 該加熱前の耐熱化スクロースホスホリ ラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20%以上であり得る。
[0097] 1つの実施形態では、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、少なくとも上記 T47に相当する位置において、上記天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるァミノ 酸残基を有する。
[0098] 1つの実施形態では、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、少なくとも上記 T47に相当する位置において、上記天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるァミノ 酸残基を有する。
[0099] 1つの実施形態では、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、少なくとも上記 D249に相当する位置において、上記天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミ ノ酸残基を有する。
[0100] 本発明の方法は、耐熱化スクロースホスホリラーゼを調製する方法であって、該方 法は、第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子 を改変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程;該第二の核酸分子を 含む発現ベクターを作製する工程;該発現ベクターを細胞に導入して耐熱化スクロ ースホスホリラーゼを発現させる工程；および該発現された耐熱化スクロースホスホリ ラーゼを回収する工程を包含し、該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、配列番号 2の アミノ酸配列の 47位トレオニン (T47)に相当する位置、 62位セリン（S62)に相当す る位置、 77位チロシン (Y77)に相当する位置、 128位バリン (VI 28)に相当する位 置、 140位リジン (K140)に相当する位置、 144位グルタミン（Q144)に相当する位 置、 155位ァスパラギン（N155)に相当する位置および 249位ァスパラギン酸（D24
9)に相当する位置からなる群より選択される少なくとも 1つの位置において、該第一 のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、かつ該耐 熱化スクロースホスホリラーゼを 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 55。Cで 20分間 加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性力 S、該加熱 前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20%以上である。
[0101] 1つの実施形態では、上記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸 配列と少なくとも 40%の同一性を有し得る。
[0102] 1つの実施形態では、上記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸 配列と少なくとも 60%の同一性を有し得る。
[0103] 1つの実施形態では、上記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸 配列をコードする塩基配列からなる核酸分子とストリンジ工ントな条件下でハイブリダ ィズする核酸分子によってコードされ得る。
[0104] 1つの実施形態では、上記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列 番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択され得る。
[0105] 1つの実施形態では、上記第一のスクロースホスホリラーゼは、 Streptococcus m utans、 Streptococcus pneumoniae streptococcus sorbmus、 Streptococ cus mitis、 Leuconostoc mesenteroides、 Oenococcus oeni、 Lactobacilli! s acidophilusおよび Listeria monocytogenesからなる群より選択される細菌由 来であり得る。
[0106] 1つの実施开態では、上記第一のスクロースホスホリラーゼは、 Streptococcus m utans、 Streptococcus pneumoniae^ streptococcus sorbmusまプこ fま ^trept ococcus mitisからなる群より選択される細菌由来であり得る。
[0107] 1つの実施开態では、上記第一のスクロースホスホリラーゼは、 Streptococcus m utansま 7こ fま Leuconostoc mesenteroid.esに由来し得 >。
[0108] 1つの実施形態では、上記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20mM Tris緩衝 液（ρΗ7· 0)中で 57°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37 °Cにおける酵素活性は、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおけ る酵素活性の 10%以上であり得る。
[0109] 1つの実施形態では、上記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20mM Tris緩衝 液（ρΗ7· 0)中で 57°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37 °Cにおける酵素活性は、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおけ る酵素活性の 20%以上であり得る。
[0110] 1つの実施形態では、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、少なくとも上記 T47に相当する位置において、上記第一のスクロースホスホリラーゼとは異なるァミノ 酸残基を有し得る。
[0111] 1つの実施形態では、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、少なくとも上記 D249に相当する位置において、上記第一のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミ ノ酸残基を有し得る。
[0112] 本発明の核酸分子は、上記の耐熱化スクロースホスホリラーゼをコードする塩基配 列を含む。
[0113] 本発明のベクターは、上記の核酸分子を含む。 [0114] 本発明の細胞は、上記の核酸分子を含む。
[0115] 本発明のグルコース一 1一リン酸の合成方法は、上記の耐熱化スクロースホスホリラ ーゼ、スクロースおよび無機リン酸を含む反応溶液を反応させて、グルコース一 1ーリ ン酸を生産する工程を包含する。
[0116] 1つの実施形態では、上記反応は、 50°C— 70°Cの温度で行われ得る。
[0117] 本発明のグルコース重合体の合成方法は、上記の耐熱化スクロースホスホリラーゼ と、 ひ—グルコース _1_リン酸を基質とする第二のホスホリラーゼと、スクロースと、プラ イマ一と、無機リン酸またはグノレコース— 1一リン酸とを含む反応液を反応させて、ダル コース重合体を生産する工程を包含する。
[0118] 1つの実施形態では、上記グルコース重合体は、 ひ—グルカンであり得る。
[0119] 1つの実施形態では、上記第二のホスホリラーゼは、 ひ—グルカンホスホリラーゼで あり得る。
[0120] 1つの実施形態では、上記第二のホスホリラーゼは、セロビオースホスホリラーゼ、 セロデキストリンホスホリラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼ、ラミナリデキストリンホ スホリラーゼ、 β— 1 , 3—グルカンホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼから なる群より選択され得る。
[0121] 1つの実施形態では、上記反応は、 50°C— 70°Cの温度で行なわれ得る。
発明の効果
[0122] 本発明によって、高温 (例えば 60°C以上）で反応可能であり、かつ高温 (例えば 60 °C以上)で活性が非常に高い SP酵素が得られた。この耐熱化により、雑菌汚染およ びひ—ダルカンの老化を抑制し、 G—1—Pまたはひ—ダルカンの効率よい製造が可能 となった。
[0123] 本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子（例えば、 Streptoco ecus mutans由来の SPを耐熱化して得られる耐熱化 SPをコードする遺伝子）を大 腸菌などの中温菌を宿主として高発現させた場合、耐熱性の酵素を含む菌体抽出 液を 60°Cで加熱することにより、宿主菌由来の夾雑酵素を簡単に除去できるという利 点が得られる。従って、本発明の方法は、酵素精製においても有利となる。
[0124] 本発明の方法は、 Streptococcus mutans由来の SPおよび Leuconostoc me senteroides由来の SPのみに有効とレ、うわけではなく、 Streptococcus mutans 由来の SPのアミノ酸構造に対して高い相同性を示す他の SPの耐熱化にも好適に応 用できる。
[0125] 従って、モチーフ配列 1 :AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSAFG DWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS中の 14位に相当する位置、 29位に相 当する位置、および 44位に相当する位置；モチーフ配列 2： RPTQEDVDLIYKRK DRAPKQEIQFADGSVEHLWNTFGEEQID中の 7位に相当する位置、 19位 に相当する位置、 23位に相当する位置および 34位に相当する位置；ならびにモチ ーフ配列 3： ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG中の 1 9位に相当する位置；からなる群より選択される少なくとも 1つの位置において、該天 然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有する他の生 物種由来の耐熱性 SPを得ることができる。
[0126] 配列番号 2のアミノ酸配列の 47位トレオニン (T47)に相当する位置、 62位セリン（S 62)に相当する位置、 77位チロシン (Y77)に相当する位置、 128位バリン (V128) に相当する位置、 140位リジン (K140)に相当する位置、 144位グノレタミン（Q144) に相当する位置、 155位ァスパラギン（N155)に相当する位置および 249位ァスパ ラギン酸 (D249)に相当する位置からなる群より選択される少なくとも 1つの位置）に おいて、該天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を 有する他の生物種由来の耐熱性 SPを得ることができる。
図面の簡単な説明
[0127] [図 1A]図 1Aは、 GENETYX—WIN Ver. 4. 0のマルチプルァライメントにおいて ァライメントした、レ、くつかの生物由来のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列を示 す図である。図 1Aは図 1Bに続く。
[図 1B]図 1Bは、図 1Aの続きである。
[図 1C]図 1Cは、図 1Bの続きである。
[図 2]図 2は、種々の細菌（大腸菌 TG— 1および大腸菌 BL21)を 50°C、 55°C、 60°C または 65°Cで 30分間加熱した後のホスファターゼの残存活性（％)を示すグラフであ る。 [図 3]図 3は、種々の細菌（大腸菌 TG— 1、大腸菌 BL21および枯草菌 ANA— 1)を 5 0°C、 55°C、 60°Cまたは 65°Cで 30分間加熱した後のアミラーゼの残存活性（％)を 示すグラフである。
(配列表の説明）
配列番号 1 Streptococcus mutansのスクロースホスホリラーゼの塩基酉己歹 K； 配列番号 2 Streptococcus mutansのスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列； 配列番号 3 Streptococcus pneumoniaeのスクロースホスホリフーセの塩基目己 列；
酉己列番号 4： Streptococcus pneumoniaeのスクロースホスホリラーゼのアミノ酸 配列；
酉己列番号 5： Streptococcus sorbinusのスクロースホスホリラーゼの塩基配列； 酉己列番号 6： Streptococcus sorbinusのスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列 酉己列番号 7： Leuconostoc mesenteroidesのスクロースホスホリラーゼの塩基酉己 列；
酉己列番号 8： Leuconostoc mesenteroidesのスクロースホスホリラーゼのアミノ酸 配列；
配列番号 9： Oenococcus oeniのスクロースホスホリラーゼの塩基配列； 配列番号 10 : Oenococcus oeniのスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列； 配列番号 11： Streptococcus mitisのスクロースホスホリラーゼの塩基配列； 配列番号 12： Streptococcus mitisのスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列； 酉己列番号 13： Leuconostoc mesenteroidesの第 2のスクロースホスホリラーゼの 塩基配列；
酉己列番号 14： Leuconostoc mesenteroidesの第 2のスクロースホスホリラーゼの アミノ酸配列；
歹 K番号 15 : Lactobacillus acidophilusの第 1の Pseudomonas saccharoph ilaのスクロースホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号 16 Lactobacillus acidophilusの第 1のスクロースホスホリラーゼのアミ ノ酸配列；
配列番号 17： Lactobacillus acidophilusの第 2のスクロースホスホリラーゼの塩 基配列；
配列番号 18 Lactobacillus acidophilusの第 2のスクロースホスホリラーゼのアミ ノ酸配列；
酉己列番号 19： Listeria monocytogenesのスクロースホスホリラーゼの塩基配列； 酉己列番号 20： Listeria monocytogenesのスクロースホスホリラーゼのアミノ酸酉己 列；
配列番号 21 :実施例 2A (1)で作製した、 8つすベての変異 (T47S、 S62P、 Y77 H、 V128L、 K140M、 Q144R、 N155Sおよび D249G)を有する耐熱化スクロース ホスホリラーゼをコードする塩基配列；
配列番号 22 :実施例 2A (1)で作製した、 8つすベての変異 (T47S、 S62P、 Y77 H、 V128L、 K140M、 Q144R、 N155Sおよび D249G)を有する耐熱化スクロース ホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号 23：実施例 7で使用した、 C末端にアミノ酸の置換および付カ卩のあるスクロ ースホスホリラーゼをコードする塩基配列；
配列番号 24 :実施例 7で使用した、 C末端にアミノ酸の置換および付カ卩のあるスクロ ースホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号 25：モチーフ配列 1のアミノ酸配列；
配列番号 26：モチーフ配列 2のアミノ酸配列；および
配列番号 27：モチーフ配列 3のアミノ酸配列。
発明を実施するための最良の形態
[0129] 以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、本明細書において使用され る用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用レ、られる意味で用レ、られることが 理解されるべきである。
[0130] (1.スクロースホスホリラーゼ）
本明細書において「スクロースホスホリラーゼ」および「SP」は特に示さない限り互換 可能に用いられ、スクロースホスホリラーゼ活性を有する酵素を意味する。スクロース ホスホリラーゼは、 EC. 2. 4. 1. 7に分類される。スクロースホスホリラーゼによって触 媒される反応は、次式により示される：
[0131] [化 1]
スクロース +無機リン酸 α— D—グルコース一 1 —リン酸 + D—フルクトース
[0132] スクロースホスホリラーゼは、 自然界では種々の生物に含まれる。スクロースホスホリ ラーゼを産生する生物の例としては、 Streptococcus属に属する細菌（例えば、 Str eptococcus mutans、 Streptococcus pneumoniae streptococcus sorbin us、 Streptococcus thermophilusおよび Streptococcus mitis)、 Leuconost oc mesenteroides、 Oenococcus oeni、 Lactobacillus acidophilus Bifidob acterium sp. (例えは、 Bifidobacterium longumおよび Bifidobacterium ad olescentis) Agrobacterium sp. (例えば、 Agrobacterium vitis)、 Pseudom onas sp. (例えば、 Pseudomonas saccharophila)、 Eschericnia coli、 Lister ia sp. (例えは、； Listeria innocuaおよび Listeria monocytogenes)、 Clostrid ium sp.、 Pullularia pullulans^ Acetobacter xyli皿 m、 Synecococcus sp .、 Aspergillus niger、 Sclerotinea escerotiomm、および Chiamydomonas sp.が挙げられる。スクロースホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されない
[0133] 本発明の方法に用いられる第一の（例えば、天然の）スクロースホスホリラーゼは、 細菌由来であることが好ましぐ中温菌由来であることがより好ましい。しかし、これら のスクロースホスホリラーゼは耐熱性がなレ、。そのため、高温（例えば、約 50。C一 60
°C以上）では反応を充分に触媒できない。そのため、細菌由来の SPの反応至適温 度に合わせて反応を約 30°C—約 40°Cで行うと、雑菌汚染という問題またはひ—グノレ カンの老化とレ、う問題が生じ、 a -グノレカンまたは G-1-Pを効率よく生産できなレ、。
[0134] 本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したこ とのみを意味するのではなぐその生物を何らかの形で利用することによりその酵素 が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を 大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に 「由来する」という。 [0135] Streptococcus mutansの天然のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列 を配列番号 1に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号 2に示す。 Streptococcus mu tansには、配列番号 2とは異なるアミノ酸配列を有する天然のスクロースホスホリラー ゼも公知である。配列番号 2のアミノ酸配列を有する SPと、 S. mutans由来のこの他 の SPとはいずれも、 47位のアミノ酸がトレオニンであり、 62位のアミノ酸がセリンであ り、 77位のアミノ酸がチロシンであり、 128位のアミノ酸がバリンであり、 140位のアミノ 酸がリジンであり、 144位のアミノ酸がグルタミンであり、そして 155位のアミノ酸がァス パラギンであるので、これらのスクロースホスホリラーゼはいずれも、耐熱性がほぼ同 等である。本明細書中では、「天然の」スクロースホスホリラーゼは、もともとスクロース ホスホリラーゼを産生する細菌から単離されたスクロースホスホリラーゼだけでなぐ 天然のスクロースホスホリラーゼと同じアミノ酸配列を有する、遺伝子組換えによって 得られるスクロースホスホリラーゼをも包含する。
[0136] Streptococcus pneumoniaeの天然のスクロースホスホリラーゼをコードする塩 基配列を配列番号 3に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号 4に示す。
[0137] Streptococcus sorbinusの天然のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配 歹 IJを配列番号 5に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号 6に示す。
[0138] Leuconostoc mesenteroidesの天然のスクロースホスホリラーゼをコードする塩 基配列を配列番号 7に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号 8に示す。
[0139] Oenococcus oeniの天然のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を配 列番号 9に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号 10に示す。
[0140] Streptococcus mitisの天然のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を 配列番号 11に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号 12に示す。
[0141] Leuconostoc mesenteroidesの第 2の天然のスクロースホスホリラーゼをコード する塩基配列を配列番号 13に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号 14に示す。
[0142] Lactobacillus acidophilusの第 1の天然のスクロースホスホリラーゼをコードする 塩基配列を配列番号 15に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号 16に示す。
[0143] Lactobacillus acidophilusの第 2の天然のスクロースホスホリラーゼをコードする 塩基配列を配列番号 17に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号 18に示す。 [0144] Listeria monocytogenesの天然のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配 列を配列番号 19に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号 20に示す。
[0145] これらの天然のスクロースホスホリラーゼの塩基配列およびアミノ酸配列は例示であ り、これらの配列とはわずかに異なる配列を有する改変体（いわゆる、対立遺伝子改 変体）が天然に存在し得ることは公知である。本発明においては、例示した配列を有 するスクロースホスホリラーゼ以外にも、このような、天然に存在する改変体も耐熱化 に用い得る。
[0146] 本発明の方法に用いられる第一の（例えば、天然の）スクロースホスホリラーゼは、 S treptococcus mutans、 Streptococcus pneumoniae^ Streptococcus sorbi nus、 Streptococcus mitis、 Leuconostoc mesenteroides、 Oenococcus oe ni、、 Lactobacillus acidophilusおよび Listeria monocytogenesに由来するこ と力 S奸 しく、 Streptococcus mutans、 Streptococcus pneumoniae^ Strepto coccus sorDinusまたは Streptococcus mitisに由来すること力 Sより好ましい。天 然のスクロ1 ~~スホスホリフ1 ~~ゼ (ま、 Streptococcus mutansま 7こ ίま Leuconostoc mesenteroidesに由来することが最も好ましレヽ。
[0147] スクロースホスホリラーゼの遺伝子は、既知のスクロースホスホリラーゼの配列を参 考にしてプライマーを設計し、スクロースホスホリラーゼ遺伝子を得ようとするゲノムラ イブラリーを铸型として PCRを行うことによって得ることができる。あるいは、既知の SP 遺伝子配列情報をもとに、ゲノムライブラリー作製をへることなぐ化学合成により直 接 SP遺伝子を作製することも可能である。遺伝子の合成方法は、例えば Te ' oら（F EMS Microbiological Letters, 190卷、 13—19頁、 2000年）などに記載されて いる。
[0148] 得られた SP遺伝子は、当業者に周知の方法で、適切なベクターに揷入できる。例 えば、大腸菌用のベクターであれば、 pMW118 (日本ジーン株式会社製）、 pUC18 (タカラバイオ（株）製）、 ρΚΚ233— 2 (Amersham— Pharmacia—Biotech製）などが 使用でき、枯草菌用のベクターであれば、 pUBl 10 (American Type Culture Collectionから購入可能）、 pHY300PLK (タカラバイオ (株)製）などが使用できる [0149] (2.スクロースホスホリラーゼの耐熱化）
本発明の方法は、第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第 一の核酸分子を改変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程;該第 二の核酸分子を含む発現ベクターを作製する工程;該発現ベクターを細胞に導入し て耐熱化スクロースホスホリラーゼを発現させる工程；および該発現された耐熱化スク ロースホスホリラーゼを回収する工程を包含する。
[0150] (2. 1 第一の（例えば、天然の）スクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を 含む核酸分子の単離）
本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子も また、本発明の範囲内にある。このような核酸分子は、本明細書の開示に基づいて、 当該分野で公知の方法を用いて得ることができる。
[0151] 天然のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子は、上記の ような自然界に存在する、スクロースホスホリラーゼを産生する細菌から直接単離され 得る。
[0152] 例えば、まず、 Streptococcus mutansなどから天然のスクロースホスホリラーゼ が単離される。 Streptococcus mutansのスクロースホスホリラーゼについての手 順を例示すると、最初に、 Streptococcus mutansを適切な培地（例えば、 LB培地 )中に接種し、振盪させながら 37°Cで一晩培養する。次いで、この培養液を遠心分 離して、 Streptococcus mutansの菌体を収集する。得られた菌体を、 20mM Tr is-塩酸緩衝液 (pH7. 0)中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液 を得る。次いで、この菌体破砕液にスクロースを加えて、 10%スクロースを含む菌体 破砕液を得る。この菌体破砕液を、 55°Cの水浴中で 30分間加熱する。加熱後、この 菌体破砕液を、遠心機（ベックマン社製、 AVANTI 卜 251)を用いて遠心分離し、 不溶性のタンパク質などを除去し、上清を得る。得られた上清を、あらかじめ平衡化し ておいた陰イオン交換樹脂 Q— Sepharoseに流してスクロースホスホリラーゼを樹脂 に吸着させる。樹脂を、 lOOmM塩ィ匕ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除 去する。続いて、 300mM塩化ナトリウムを含む緩衝液でスクロースホスホリラーゼを 溶出させ、 Streptococcus mutans由来スクロースホスホリラーゼ酵素液とする。 [0153] 通常、この段階でトリプシン処理に用い得るスクロースホスホリラーゼ含有溶液にな る力 さらなる精製を必要とする場合がある。このような場合、必要に応じて、 Sephac ryl S—200HR (フアルマシア社製）などを用いたゲルフィルトレーシヨンクロマトグラ フィ一による分画、 Phenyl_TOY〇PEARL 650M (東ソ一社製）などを用いた疎 水クロマトグラフィーによる分画を組み合わせることにより、精製 Streptococcus mu tans由来スクロースホスホリラーゼ含有溶液を得ることができる。他の細菌種からのス クロースホスホリラーゼの精製も同様に行い得る。
[0154] このようにして得た精製スクロースホスホリラーゼをトリプシン処理して、得られるトリ プシン処理断片を HPLCにより分離し、分離されたレ、ずれかのペプチド断片の N末 端のアミノ酸配列を、ペプチドシークェンサ一により同定する。次いで、同定したァミノ 酸配列をもとに作製した合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、適切なゲノムライ ブラリーまたは cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、天然のスクロースホ スホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子 (遺伝子ともいう）を得ることができ る。オリゴヌクレオチドプローブおよび DNAライブラリーを調製するための、ならびに 核酸のハイブリダィゼーシヨンによりそれらをスクリーニングするための基本的な戦略 は、当業者に周知である。例えば、 Sambrookら， Molecular Cloning : A Labor atory Manual (1989)； DNA Cloning,第 Iおよび II 卷（D. N. Glover編 19 85) ; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編 1984)； Nucleic
Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins編 1984)を参照のこと
[0155] あるいは、既知の種のスクロースホスホリラーゼの塩基配列に対する相同性に基づ いて、この塩基配列の少なくとも一部を含む核酸プローブを用いたハイブリダィゼー シヨンによってスクリーニングして、別種のスクロースホスホリラーゼの塩基配列を含む 核酸分子を獲得することもできる。このような方法は当該分野で公知である。
[0156] あるいは、種々のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列において保存された領域 に対応する縮重プライマーを作製して、 PCRによってスクロースホスホリラーゼの塩 基配列を獲得することも可能である。このような方法は当該分野で公知である。
[0157] ゲノムライブラリーをスクリーニングする場合、得られた核酸分子は、当業者に周知 の方法を用いてサブクローニングされ得る。例えば、 目的の遺伝子を含む λファージ と、適切な大腸菌と、適切なヘルパーファージとを混合することにより、容易に目的の 遺伝子を含有するプラスミドを得ることができる。その後、プラスミドを含有する溶液を 用いて、適切な大腸菌を形質転換することにより、 目的の遺伝子をサブクローニング し得る。得られた形質転換体を培養して、例えばアルカリ SDS法によりプラスミド DN Αを得、 目的の遺伝子の塩基配列を決定し得る。塩基配列を決定する方法は、当業 者に周知である。さらに、 DNAフラグメントの塩基配列を基に合成されたプライマー を用レヽ、 Streptococcus mutans、 Streptococcus pneumoniae^ Streptococ cus sorbinusなどのゲノム DNAなどを錡型に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)を用 いて直接スクロースホスホリラーゼ遺伝子を増幅することもできる。
[0158] 本明細書において「核酸分子」は、天然のヌクレオチドのみからなっていてもよぐ 非天然のヌクレオチドを含んでもよぐ非天然のヌクレオチドのみからなっていてもよ レ、。非天然のヌクレオチドの例としては、誘導体ヌクレオチド (ヌクレオチドアナログと もいう）が挙げられる。 「誘導体ヌクレオチド」および「ヌクレオチドアナログ」とは、天然 に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものを いう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野におい て周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては 、ホスホロチォエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネ ート、 2-0—メチルリボヌクレオチド、ペプチド-核酸（PNA)が挙げられる力 これら に限定されない。
[0159] (2. 2 第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分 子の改変）
第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改 変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る。第一の核酸分子は、上記（2. 1)のようにして得た、天然のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核 酸分子であり得る。第一の核酸分子はまた、天然のスクロースホスホリラーゼの酵素 活性と実質的に同様の酵素活性を有する、天然のスクロースホスホリラーゼに対して 1もしくは数個またはそれを超えるアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたスクロース ホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子であり得る。このような、天然の スクロースホスホリラーゼに対してアミノ酸が置換および付加されたスクロースホスホリ ラーゼをコードする塩基配列の例として、配列番号 23の塩基配列を示す。この塩基 配列は、天然の塩基配列（すなわち、配列番号 1の塩基配歹 1J)に対して、 3'末端の 4 塩基が置換されており、さらに 3'末端に 18塩基が付加されている。この塩基配列に よってコードされるアミノ酸配列（配列番号 24のアミノ酸配歹 1J)は、天然のアミノ酸配列 (すなわち、配列番号 2のアミノ酸配歹 1J)に対して、 C末端の 2アミノ酸が置換されてお り、さらに C末端に 6アミノ酸が付加されているが、酵素活性は、天然のスクロースホス ホリラーゼと実質的に同様である。「実質的に同様の酵素活性を有する」とは、天然 のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列に対してアミノ酸の置換、欠失もしくは付加 を有するスクロースホスホリラーゼを、天然のスクロースホスホリラーゼと同一条件下で 測定したときの酵素活性力 天然のスクロースホスホリラーゼの酵素活性の土 20%以 内であることをいう。好ましくは ± 10%以内、より好ましくは ± 5%以内である。
[0160] 改変は、当該分野で周知の方法を用いて、例えば、部位特異的変異誘発法、変異 原を用いた変異誘発法 (対象遺伝子を亜硝酸塩などの変異剤で処理すること、紫外 線処理を行うこと）、エラープローン PCRを行うことなどによって行われ得る。 目的の 変異を得やすい点から、部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。部位特異的 変異誘発を用いれば、 目的とする部位で目的とする改変を導入することができるから である。あるいは、 目的とする配列をもつ核酸分子を直接合成してもよい。そのような 化学合成の方法は、当該分野において周知である。
[0161] 本発明者らは、スクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸 残基を別のアミノ酸残基に置換することによって、得られる改変スクロースホスホリラ ーゼの耐熱性が向上することを見出した。このような特定の位置は、以下のモチーフ 配列のレ、ずれかまたは配列番号 2のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列とをァ ライメン卜することによって決定され得る：
モチーフ配列 1： AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPID YHEVDS AFGDWDD VKRLGEKYYLMFDFMINHIS (配列番号 25)；
モチーフ配列 2： RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTF GEEQID (配列番号 26)；および (配列番号 27)。
[0162] モチーフ配歹 1J1、 2および 3は、 Streptococcus mutans由来のスクロースホスホリ ラーゼのアミノ酸配列（配列番号 2)中に存在する。これらのモチーフ配列は、 Strept ococcus mutansのスクロースホスホリラーゼにおいて、以下の位置に存在する：モ チーフ配列 1：配列番号 2のアミノ酸配列の 34位一 89位；モチーフ配列 2：配列番号 2のアミノ酸配列の 122位一 163位；モチーフ配列 3 :配列番号 2のアミノ酸配列の 23 1位一 268位。一般に、天然のスクロースホスホリラーゼは、これらのモチーフ配列ま たはそれらに対して高い相同性を有する配列を有する。他のスクロースホスホリラー ゼについてのこれらのモチーフ配列の位置は、当業者によって容易に決定され得る
[0163] 本発明の方法においては、第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列 を含む核酸分子は、改変核酸分子によってコードされる耐熱化スクロースホスホリラ ーゼが、モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置、 29位に相当する位置、および 4 4位に相当する位置；モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置、 19位に相当する位 置、 23位に相当する位置および 34位に相当する位置；ならびにモチーフ配列 3中の 19位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも 1つの位置において、天然 のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有するように改変される。あるい は、第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子は、改変 核酸分子によってコードされる耐熱化スクロースホスホリラーゼカ 配列番号 2のアミ ノ酸配列の 47位トレオニン (T47)に相当する位置、 62位セリン（S62)に相当する位 置、 77位チロシン (Y77)に相当する位置、 128位バリン (VI 28)に相当する位置、 1 40位リジン (K140)に相当する位置、 144位グルタミン（Q144)に相当する位置、 1 55位ァスパラギン（N155)に相当する位置および 249位ァスパラギン酸（D249)に 相当する位置)からなる群より選択される少なくとも 1つの位置において、該天然のス クロースホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有するように改変され る。好ましくは、第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分 子は、改変核酸分子によってコードされる耐熱化スクロースホスホリラーゼの、モチー フ配列 1中の 14位に相当する位置、 29位に相当する位置、および 44位に相当する 位置；モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置、 19位に相当する位置、 23位に相当 する位置および 34位に相当する位置；ならびにモチーフ配列 3中の 19位に相当す る位置（あるいは、配列番号 2のアミノ酸配列の 47位トレオニン (T47)に相当する位 置、 62位セリン（S62)に相当する位置、 77位チロシン (Y77)に相当する位置、 128 位バリン (V128)に相当する位置、 140位リジン (K140)に相当する位置、 144位グ ルタミン（Q144)に相当する位置、 155位ァスパラギン (N155)に相当する位置およ び 249位ァスパラギン酸 (D249)に相当する位置)からなる群より選択される少なくと も 2つの位置において、より好ましくは少なくとも 3つの位置において、さらに好ましく は少なくとも 4つの位置において、なお好ましくは少なくとも 5つの位置において、な おさらに好ましくは少なくとも 6つの位置において、特に好ましくは少なくとも 7つの位 置において、最も好ましくは 8つ全ての位置において、上記天然のスクロースホスホリ ラーゼとは異なるように改変される。
[0164] 1つの実施形態では、第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む 核酸分子は少なくとも、改変核酸分子によってコードされる耐熱化スクロースホスホリ ラーゼの、モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置（あるいは、配列番号 2のァミノ 酸配列の 47位トレオニン (T47)に相当する位置）において上記天然のスクロースホ スホリラ一ゼとは異なるように改変される。
[0165] 1つの実施形態では、第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む 核酸分子は少なくとも、改変核酸分子によってコードされる耐熱化スクロースホスホリ ラーゼの、モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置（あるいは、配列番号 2のァミノ 酸配列の 249位ァスパラギン酸（D249)に相当する位置）において上記天然のスク ロースホスホリラーゼとは異なるように改変される。
[0166] 1つの実施形態では、第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む 核酸分子は少なくとも、改変核酸分子によってコードされる耐熱化スクロースホスホリ ラーゼの、モチーフ配列 2中の 34位に相当する位置（あるいは、配列番号 2のァミノ 酸配列の 155位ァスパラギン（N155)に相当する位置）において上記天然のスクロ ースホスホリラーゼとは異なるように改変される。
1つの実施形態では、第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む 核酸分子は少なくとも、改変核酸分子によってコードされる耐熱化スクロースホスホリ ラーゼにおいて、配列番号 2のアミノ酸配列の以下の組み合わせの位置に相当する 位置において上記天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるように改変される：
(1)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相当 する位置と、モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 7位に 相当する位置と、モチーフ配列 2中の 19位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 2 3位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 34位に相当する位置と、モチーフ配列 3 中の 19位に相当する位置との組合せ（すなわち、 8箇所全て）；
(2)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相当 する位置と、モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 7位に 相当する位置と、モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 3 4位に相当する位置と、モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置との組合せ）；
(3)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 7位に相当す る位置と、モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置と、モチーフ配列 3中の 19位に 相当する位置との組合せ；
(4)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相当 する位置と、モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置と、モチーフ配列 3中の 19位 に相当する位置との組合せ；
(5)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 7位に相当す る位置と、モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 34位に 相当する位置と、モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置との組合せ；
(6)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相当 する位置と、モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 34位に 相当する位置と、モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置との組合せ；
(7)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相当 する位置と、モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 7位に 相当する位置と、モチーフ配列 2中の 19位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 2 3位に相当する位置との組合せ；
(8)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相当 する位置と、モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 7位に 相当する位置と、モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 3 4位に相当する位置との組合せ；
(9)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相当 する位置と、モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 34位 に相当する位置と、モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置との組合せ；
(10)モチーフ配歹 1J1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配歹 IJ1中の 44位に相 当する位置と、モチーフ配列 2中の 19位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 23 位に相当する位置と、モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置との組合せ；
(11)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相 当する位置と、モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 23 位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 34位に相当する位置と、モチーフ配列 3 中の 19位に相当する位置との組合せ；
(12)モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 23位に相当 する位置と、モチーフ配列 2中の 34位に相当する位置と、モチーフ配列 3中の 19位 に相当する位置との組合せ；
(13)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相 当する位置と、モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 23位 に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 34位に相当する位置との組合せ；
(14)モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 34位に相当 する位置と、モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置との組合せ；
(15)モチーフ配列 1中の 29位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 7位に相当 する位置と、モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置と、モチーフ配列 3中の 19位 に相当する位置との組合せ；
(16)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相 当する位置と、モチーフ配列 2中の 19位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 34 位に相当する位置と、モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置との組合せ；
(17)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相 当する位置と、モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置との組合せ；
(18)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相 当する位置と、モチーフ配列 2中の 34位に相当する位置と、モチーフ配列 3中の 19 位に相当する位置との組合せ；
(19)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相 当する位置と、モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 7位 に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置との組合せ；
(20)モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 7位に相当 する位置と、モチーフ配列 2中の 34位に相当する位置との組合せ；
(21)モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 19位に相 当する位置と、モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置と、モチーフ配列 3中の 19 位に相当する位置との組合せ；
(22)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相 当する位置と、モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置との組合せ；
(23)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相 当する位置と、モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 34 位に相当する位置との組合せ；および
(24)モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置とモチーフ配列 3中の 19位に相当 する位置との組合せ。
別の実施形態では、第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む 核酸分子は少なくとも、改変核酸分子によってコードされる耐熱化スクロースホスホリ ラーゼにおいて、配列番号 2のアミノ酸配列の以下の組み合わせの位置に相当する 位置において上記天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるように改変される：
(1) 47位トレオニン (T47)に相当する位置と、 62位セリン（S62)に相当する位置と 、 77位チロシン (Y77)に相当する位置と、 128位バリン (VI 28)に相当する位置と、 140位リジン (K140)に相当する位置と、 144位グルタミン（Q144)に相当する位置 と、 155位ァスパラギン（N155)に相当する位置と、 249位ァスパラギン酸（D249)に 相当する位置との組合せ（すなわち、 8箇所全て）；
(2) 47位トレオニン (T47)に相当する位置と、 62位セリン（S62)に相当する位置と 、 77位チロシン (Y77)に相当する位置と、 128位バリン (VI 28)に相当する位置と、 144位グルタミン（Q144)に相当する位置と、 155位ァスパラギン（N155)に相当す る位置と、 249位ァスパラギン酸（D249)に相当する位置との組合せ）；
(3) T47に相当する位置と、 V128に相当する位置と、 Q144に相当する位置と、 D 249に相当する位置との組合せ；
(4) Τ47に相当する位置と、 S62に相当する位置と、 Q144に相当する位置と、 D2 49に相当する位置との組合せ；
(5) Τ47に相当する位置と、 V128に相当する位置と、 Q144に相当する位置と、 Ν 155に相当する位置と、 D249に相当する位置との組合せ；
(6) Τ47に相当する位置と、 S62に相当する位置と、 V128に相当する位置と、 N1 55に相当する位置と、 D 249に相当する位置との組合せ；
(7) Τ47に相当する位置と、 S62に相当する位置と、 Υ77に相当する位置と、 V12 8に相当する位置と、 K140に相当する位置と、 Q144に相当する位置との組合せ；
(8) Τ47に相当する位置と、 S62に相当する位置と、 Υ77に相当する位置と、 V12 8に相当する位置と、 Q144に相当する位置と、 N155に相当する位置との組合せ；
(9) Τ47に相当する位置と、 S62に相当する位置と、 Q144に相当する位置と、 N1 55に相当する位置と、 D 249に相当する位置との組合せ；
(10) Τ47に相当する位置と、 Υ77に相当する位置と、 K140に相当する位置と、 Q 144に相当する位置と、 D249に相当する位置との組合せ；
(11) Τ47に相当する位置と、 S62に相当する位置と、 Υ77に相当する位置と、 Q1 44に相当する位置と、 N155に相当する位置と、 D249に相当する位置との組合せ；
(12) V128に相当する位置と、 Q144に相当する位置と、 N155に相当する位置と 、 D 249に相当する位置との組合せ；
(13) T47に相当する位置と、 S62に相当する位置と、 V128に相当する位置と、 Q 144に相当する位置と、 N155に相当する位置との組合せ；
(14) V128に相当する位置と、 N155に相当する位置と、 D249に相当する位置と の糸且合せ；
( 15) S62に相当する位置と、 VI 28に相当する位置と、 Q 144に相当する位置と、 D249に相当する位置との組合せ；
(16) T47に相当する位置と、 S62に相当する位置と、 K140に相当する位置と、 Ν 155に相当する位置と、 D249に相当する位置との組合せ；
(17) Τ47に相当する位置と、 S62に相当する位置と、 D249に相当する位置との 組合せ；
(18) Τ47に相当する位置と、 S62に相当する位置と、 N155に相当する位置と、 D 249に相当する位置との組合せ；
(19) Τ47に相当する位置と、 S62に相当する位置と、 Υ77に相当する位置と、 VI 28に相当する位置と、 Q 144に相当する位置との組合せ；
(20) Υ77に相当する位置と、 V128に相当する位置と、 N155に相当する位置との 組合せ；
(21) Υ77に相当する位置と、 K140に相当する位置と、 Q144に相当する位置と、 D249に相当する位置との組合せ；
(22) Τ47に相当する位置と、 S62に相当する位置と、 V128に相当する位置との 組合せ；
(23) Τ47に相当する位置と、 S62に相当する位置と、 Q144に相当する位置と、 Ν 155に相当する位置との組合せ；および
(24) Τ47に相当する位置と D249に相当する位置との組合せ。
本明細書中で用いられる「配列番号 2のアミノ酸配列の 47位トレオニン (Τ47)に相 当する位置」とは、対象のアミノ酸配列と配列番号 2のアミノ酸配列とを相同性が最も 高くなるように、必要に応じて一方の配列にギャップを揷入して並べた場合に、配列 番号 2の 47位トレオニンと並置される位置をいう。なお、配列番号 2にギャップが揷入 された場合にそのギャップはアミノ酸残基の数として数えない。より好ましくは、 GEN ETYX-WIN Ver. 4. 0のマルチプルァライメントにおいて、デフォルトのスコアテ 一ブルを用レ、、 GAP Penalty (Peptide) :Insert=— 8、 Extend=— 3、 gap Exte nd on top position:設定あり（チェック）、 Match Mode: Local Matchの条件 で配列番号 2のアミノ酸配列と対象のアミノ酸配列とをァライメントした場合に、配列 番号 2の 47位トレオニンと並置される位置をレ、う。アミノ酸についてのデフォルトのス コアテーブルを以下の表 2に示す。
[0170] [表 2]
C 12,
S 0, 2,
T -2, 1. ,
P -3. 1, 0, 6,
A - 2, 1, 1, 1, 2,
G - 3. 1, 0.- -1, 1. 5,
! -4, 1, o, - -1, 0, 0. 2,
D -5, 0, ο,- -1, 0. 1, 2. 4,
E -5, 0, Ο,- -1, 0, 0. 1, 3, 4,
Q -5,- -1.- -1, 0, - 1, 1, 2, 4,
H -3,- 1, -1, ΰ,- -ι,' -2, 2, 1, 1， 3. 6,
R -4, 0,· - ο,- -2,- -3, 0r- 1,- -1, 1, 2, 6,
-5. 0. Ο,- Α,- -Ι,- -2. 1, 0, 0, 1. 0, 3, 5,
-5'. -2, -1. -2,- -し -3, -2,. -3, -2,■ -1, -2, 0, 0, 6,
I -2,- - 1, 0, -2，· - 1,. -3, - 2 - 2, - 2, -2, -2, - 1 ' -2, 2, 5,
し -6, -3, -2. -3, -2, -4, -3. .3, -2, -2, -3,. -3, 4' 2, 6,
V -2, -1, 0, - 1, 0, -1, -2, -2, -2, -2, -2. - 2, -2, 2, 4, 2, 4,
F - 4, - 3, -3, - 5, -Ί. -5, -4, - 6, -5, -5, -2. 4,' -5, 0. 1. 2, - 1, 9,
Y 0, -3. -3, -5. -3, -5, -2, - 4, -4, -4, 0, -4, -4, ―， -1, -2, 7.10.
-8, -2, -5, -6. - 6, -7, , -7. -7, 5, -3, 2， -3, -4, -5, -2, -6, 0, 0, 17,
B -4, 0, 0, -1. 0, 0, 2, 3, 2. 1, 1, -1. 1, -2. -2, -3, -2, 2.
1 -5, 0, - 1, 0, 0, -1. 1, 3, 3, 3, 2, 0, 0, -2, -2, -3. -2. -5.- ,-6. 2, 3,
X 0, 0. 0. 0, 0. 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0. 0, ϋ, 0
C S τ Ρ A G N D Ε Q H R M I し V F Y W B Z X
[0171] GENETYX-WIN Ver.4.0のマルチプルァライメントは、以下のようなアルゴリ ズムに基づいている。このァライメントプログラムは、ァライメントする対象の全ての配 列にっレ、て総当りで 2配列のァライメントを行レヽ（ペアワイズァライメント）、その中から 共通する配列の保存割合（ペアワイズァライメントにおけるスコア）が高い組み合わせ の配列について、共通の配列から仮想配列（共通部分はそのまま、一致しない部分 はどちらか一方の配列を選択する）を作成する。仮想配列を構成する配列を除く全て の配列と仮想配列との総当りを同じ手順で、最後の仮想配列が作られるまで繰り返 す。その後、仮想配列が作られるときの GAPの挿入およびずれの情報を、もとの配 列に対して適用して全体を構成することによってマルチアライメントを完成させる。こ のペアワイズァライメントの計算式は以下のとおりである。
[0172] 配列長がそれぞれ m、 nの配列 a、 bがあり、それぞれの配列を
[0173] [数 1] a = al a2 a3 ... am
bl b2 b3 … bm
[0174] と表現するとき、 GAPペナルティ gは次の式で表される：
_g = s(ai, φ ) =s( , bj)。
[0175] ァライメントのスコアを得るための式は以下のとおりである：
[0176] [数 2]
G(0, 0) = 0
G(i. 0) = i (-g)
G(0, j) = j(-g)
-gk = -[a + )S(k-1)]
E(i, j) = max[G(i- 1, j)- a , E(i-1, j)— β)
F(i， j) = max{G(i, j-1)- a , F ( β)
G(i, j) = max{E(i, j), G(i-1. j -1)+s(ai, bj). F(i, j)}
[0177] aは GAP揷入のペナルティであり、 βは GAP伸長のペナルティである。 E、 F、 G はスコア行列であり、これを基にパス行列が作成される。
[0178] 62位セリン（S62)に相当する位置、 77位チロシン (Y77)に相当する位置、 128位 バリン（V128)に相当する位置、 140位リジン（K140)に相当する位置、 144位ダル タミン（Q144)に相当する位置、 155位ァスパラギン（N155)に相当する位置、およ び 249位ァスパラギン酸（D249)に相当する位置についても同様に解釈される。
[0179] GENETYX-WIN Ver. 4. 0のマルチプルァライメントにおいて、上記の条件で 、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、 配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20を配列番号 2とァライメントした。その 結果、配列番号 2のアミノ酸配列の 47位トレオニン (T47)に相当する位置にはトレオ ニン、イソロイシン、フエ二ルァラニンまたはセリンが並置された。 62位セリン（S62)に 相当する位置には、セリン、ァラニン、プロリンまたはグルタミン酸が並置された。 77 位チロシン (Y77)に相当する位置には、チロシン、ノくリン、ロイシン、ヒスチジン、セリ ンまたはァラニンが並置された。 128位バリン (V128)に相当する位置には、ノくリン、 イソロイシンまたはロイシンが並置された。 140位リジン (K140)に相当する位置には 、リジン、メチォニン、トレオニン、イソロイシン、フエ二ルァラニンまたはグルタミンが並 置された。 144位グルタミン（Q144)に相当する位置には、バリン、トレオニン、アル ギニン、ァスパラギン酸、リジン、セリンまたはグルタミンが並置された。 155位ァスパ ラギン（N155)に相当する位置には、ァスパラギン、トレオニンまたはバリンが並置さ れた。 249位ァスパラギン酸（D249)に相当する位置には、ァスパラギン酸、グリシン 、バリンまたはグルタミン酸が並置された。このァライメントの結果を図 1A 図 1Cに 示す。図 1A 図 1Cにおいて、「StMuSP」は、 Streptococcus mutans由来のス クロースホスホリラーゼのアミノ酸配列を示す。 「StPSP」は、 Streptococcus pneu moniae由来のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列を示す。 「StSSP」は、 Strep tococcus sorbinus由来のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列を示す。「LeuS Pl」は、 Leuconostoc mesenteroides由来の第 1のスクロースホスホリラーゼのァ ミノ酸配列を示す。 「LeuSP2」は、 Leuconostoc mesenteroides由来の第 2のス クロースホスホリラーゼのアミノ酸配列を示す。 「OenSP」は、 Oenococcus oeni由 来のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列を示す。「LBSP1」は、 Lactobacillus acidophilus由来の第 1のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列を示す。「LBSP2 」は、 Lactobacillus acidophilus由来の第 2のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸 配列を示す。 「ListSP2」は、 Listeria monocytogenes由来のスクロースホスホリラ ーゼのアミノ酸配列を示す。
本明細書では配列の同一性は、 GENETYX— WIN Ver. 4. 0 (株式会社ゼネテ イツタス）のマキシマムマッチングを用いて算出される。このプログラムは、解析対象と なる配列データに対して、比較対照となる配列データを置き換えおよび欠損を考慮し ながら、配列間で一致するアミノ酸対が最大になるように並べ替え、その際、一致 (M atches)、不一致（Mismatches)、ギャップ（Gaps)についてそれぞれ得点を与え合 計を算出して最小となるァライメントを出力しその際の同一性を算出する（参考文献： Takashi, K.，および Gotoh,〇. 1984. Sequence Relationships among V arious 4. 5 S RNA Spacies J. Biochem. 92 : 1173— 1177)。本明糸田書で は配列の同一性は、 GENETYX— WIN Ver. 4. 0のマキシマムマッチングを Mate hes =_l ; Mismatches = l ; Gaps = l ; * N + = 2の条件で用いて算出される。
[0181] GENETYX-WIN Ver. 4. 0のマキシマムマッチングを用いて、 Matches =— 1； Mismatches = 1； Gaps = 1； * N + = 2の条件で、 Streptococcus mutans由来 の SPのアミノ酸配歹 IK配列番号 2)、 Streptococcus pneumoniae由来の SPのアミ ノ酸配列（配列番号 4)、 Streptococcus sorbinus由来の SPのアミノ酸配列（配列 番号 6)、 Leuconostoc mesenteroides由来の SPのアミノ酸配列（配列番号 8)、 Oenococcus oeni由来の SPのアミノ酸酉己歹 [J (酉己歹 [J番号 10)、 Streptococcus mi tis由来の SPのアミノ酸配列（配列番号 12)、 Leuconostoc mesenteroides由来 の SPのアミノ酸配歹 IK配列番号 14)、 Lactobacillus acidophilusの第 1の SP由来 のアミノ酸配列（配列番号 16)、 Lactobacillus acidophilusの第 2の SPのアミノ酸 配列（配列番号 18)および Listeria monocytogenes由来の SPのアミノ酸配列（配 列番号 20)の間で相互にァライメントした場合に得られた同一性の値（％)を以下の 表 3に示す。
[0182] [表 3]
Figure imgf000039_0001
ί列えば、 Streptococcus pneumoniae由来のスクロースホスホリラーゼにおいて は、配列番号 2のアミノ酸配列の 47位トレオニン (T47)に相当する位置は、配列番 号 4のアミノ酸配列の 47位であり、 62位セリン（S62)に相当する位置は、配列番号 4 のアミノ酸配列の 62位であり、 77位チロシン (Y77)に相当する位置は、配列番号 4 のアミノ酸配列の 77位であり、 128位バリン (V128)に相当する位置は、配列番号 4 のアミノ酸配列の 128位であり、 140位リジン (K140)に相当する位置は、配列番号 4のアミノ酸配列の 140位であり、 144位グノレタミン（Q144)に相当する位置は、配列 番号 4のアミノ酸配列の 144位であり、 155位ァスパラギン（N155)に相当する位置 は、配列番号 4のアミノ酸配列の 155位であり、そして 249位ァスパラギン酸（D249) に相当する位置は、配列番号 4のアミノ酸配列の 249位である。
[0184] 例えば、 Streptococcus sorbinus由来のスクロースホスホリラーゼにおいては、 配列番号 2のアミノ酸配列の T47に相当する位置は、配列番号 6のアミノ酸配列の 4 7位であり、 S62に相当する位置は、配列番号 6のアミノ酸配列の 62位であり、 Y77 に相当する位置は、配列番号 6のアミノ酸配列の 77位であり、 VI 28に相当する位置 は、配列番号 6のアミノ酸配列の 128位であり、 140位リジン（K140)に相当する位 置は、配列番号 6の 140位であり、 Q144に相当する位置は、配列番号 6のアミノ酸 配列の 144位であり、 N155に相当する位置は、配列番号 6のアミノ酸配列の 155位 であり、そして D249に相当する位置は、配列番号 6のアミノ酸配列の 249位である。
[0185] 例えば、 Leuconostoc mesenteroides由来のスクロースホスホリラーゼにおいて は、配列番号 2のアミノ酸配列の T47に相当する位置は、配列番号 8のアミノ酸配列 の 47位であり、 S62に相当する位置は、配列番号 8のアミノ酸配列の 62位であり、 Y 77に相当する位置は、配列番号 8のアミノ酸配列の 77位であり、 V128に相当する 位置は、配列番号 8のアミノ酸配列の 131位であり、 140位リジン（K140)に相当す る位置は、配列番号 8の 143位であり、 Q144に相当する位置は、配列番号 8のァミノ 酸配列の 147位であり、 N155に相当する位置は、配列番号 8のアミノ酸配列の 158 位であり、そして D249に相当する位置は、配列番号 8のアミノ酸配列の 252位であ る。
[0186] 例えば、 Oenococcus oeni由来のスクロースホスホリラーゼにおいては、配列番 号 2のアミノ酸配列の T47に相当する位置は、配列番号 10のアミノ酸配列の 47位で あり、 S62に相当する位置は、配列番号 10のアミノ酸配列の 62位であり、 Y77に相 当する位置は、配列番号 10のアミノ酸配列の 77位であり、 V128に相当する位置は 、配列番号 10のアミノ酸配列の 128位であり、 K140に相当する位置は、配列番号 1 0のアミノ酸配列の 140位であり、 Q144に相当する位置は、配列番号 10のアミノ酸 配列の 144位であり、 N155に相当する位置は、配列番号 10のアミノ酸配列の 155 位であり、そして D249に相当する位置は、配列番号 10のアミノ酸配列の 249位であ る。
[0187] 例えば、 Streptococcus mitis由来のスクロースホスホリラーゼにおいては、配列 番号 2のアミノ酸配列の T47に相当する位置は、配列番号 12のアミノ酸配列の 47位 であり、 S62に相当する位置は、配列番号 12のアミノ酸配列の 62位であり、 Y77に 相当する位置は、配列番号 12のアミノ酸配列の 77位であり、 V128に相当する位置 は、配列番号 12のアミノ酸配列の 128位であり、 K140に相当する位置は、配列番 号 12のアミノ酸配列の 140位であり、 Q144に相当する位置は、配列番号 12のァミノ 酸配列の 144位であり、 N155に相当する位置は、配列番号 12のアミノ酸配列の 15 5位であり、そして D249に相当する位置は、配列番号 12のアミノ酸配列の 249位で ある。
[0188] 例えば、 Leuconostoc mesenteroides由来の第 2のスクロースホスホリラーゼに おいては、配列番号 2のアミノ酸配列の T47に相当する位置は、配列番号 14のァミノ 酸配列の 47位であり、 S62に相当する位置は、配列番号 14のアミノ酸配列の 62位 であり、 Y77に相当する位置は、配列番号 14のアミノ酸配列の 77位であり、 V128に 相当する位置は、配列番号 14のアミノ酸配列の 131位であり、 K140に相当する位 置は、配列番号 14のアミノ酸配列の 143位であり、 Q 144に相当する位置は、配列 番号 14のアミノ酸配列の 147位であり、 N155に相当する位置は、配列番号 14のァ ミノ酸配列の 158位であり、そして D249に相当する位置は、配列番号 14のアミノ酸 配列の 252位である。
[0189] 例えば、 Lactobacillus acidophilus由来の第 1のスクロースホスホリラーゼにお いては、配列番号 2のアミノ酸配列の T47に相当する位置は、配列番号 16のアミノ酸 配列の 47位であり、 S62に相当する位置は、配列番号 16のアミノ酸配列の 62位で あり、 Y77に相当する位置は、配列番号 16のアミノ酸配列の 77位であり、 V128に相 当する位置は、配列番号 16のアミノ酸配列の 128位であり、 K140に相当する位置 は、配列番号 16のアミノ酸配列の 140位であり、 Q144に相当する位置は、配列番 号 16のアミノ酸配列の 144位であり、 N155に相当する位置は、配列番号 16のァミノ 酸配列の 155位であり、そして D249に相当する位置は、配列番号 16のアミノ酸配 列の 249位である。
[0190] 例えば、 Lactobacillus acidophilus由来の第 2の由来のスクロースホスホリラー ゼにおいては、配列番号 2のアミノ酸配列の T47に相当する位置は、配列番号 18の アミノ酸配列の 47位であり、 S62に相当する位置は、配列番号 18のアミノ酸配列の 6 2位であり、 Y77に相当する位置は、配列番号 18のアミノ酸配列の 77位であり、 V12 8に相当する位置は、配列番号 18のアミノ酸配列の 128位であり、 K140に相当する 位置は、配列番号 18のアミノ酸配列の 140位であり、 Q144に相当する位置は、配 列番号 18のアミノ酸配列の 144位であり、 N155に相当する位置は、配列番号 18の アミノ酸配列の 155位であり、そして D249に相当する位置は、配列番号 18のァミノ 酸配列の 249位である。
[0191] 例えば、 Listeria monocytogenes由来のスクロースホスホリラーゼにおいては、 配列番号 2のアミノ酸配列の T47に相当する位置は、配列番号 20のアミノ酸配列の 47位であり、 S62に相当する位置は、配列番号 20のアミノ酸配列の 62位であり、 Y7 7に相当する位置は、配列番号 20のアミノ酸配列の 77位であり、 V128に相当する 位置は、配列番号 20のアミノ酸配列の 128位であり、 K140に相当する位置は、酉己 列番号 20のアミノ酸配列の 140位であり、 Q144に相当する位置は、配列番号 20の アミノ酸配列の 144位であり、 N155に相当する位置は、配列番号 20のアミノ酸配列 の 155位であり、そして D249に相当する位置は、配列番号 20のアミノ酸配列の 249 位である。
[0192] 耐熱性を向上させるアミノ酸残基の位置は、 481アミノ酸残基長の配列番号 2とァラ ィメントすることのみならず、上記のモチーフ配列 1、 2および 3からなる群より選択さ れる 1以上の配列とァライメントすることによって決定され得る。配列番号 2と相同性が 高い（例えば、配列番号 2のアミノ酸配列に対する相同性が約 40%以上の） SPのァ ミノ酸配列（配列番号 4のアミノ酸配列、配列番号 6のアミノ酸配列、配列番号 8のアミ ノ酸配列、配列番号 10のアミノ酸配歹 lj、配列番号 12のアミノ酸酉己列、配列番号 14の アミノ酸酉己列、配列番号 16のアミノ酸配列および配列番号 20のアミノ酸酉己列）につい てァライメントした限り、このようにして決定される位置は、配列番号 2を用いた場合も 、モチーフ配列 1、 2、および 3を用いた場合も、同じ位置となる。
[0193] モチーフ配列 1は、スクロースホスホリラーゼでよく保存されており、特に、 Streptoc occus属由来のスクロースホスホリラーゼでよく保存されてレ、る。配列番号 2のアミノ酸 配列の 47位トレオニン (T47)に相当する位置は、モチーフ配列 1中の 14位に相当 する位置ということができる。
[0194] モチーフ配列 2は、スクロースホスホリラーゼでよく保存されている。配列番号 2のァ ミノ酸配列の 128位バリン (V128)に相当する位置は、モチーフ配列 2中の 7位に相 当する位置ということができる。
[0195] モチーフ配列 3は、スクロースホスホリラーゼで保存されている。配列番号 2のァミノ 酸配列の 249位ァスパラギン酸（D249)に相当する位置は、モチーフ配列 3中の 19 位に相当する位置ということができる。
[0196] このように、耐熱性を向上させるアミノ酸残基の位置はまた、モチーフ配列を用いる ことによつても特定され得る。耐熱性を向上させるアミノ酸残基の位置は、モチーフ配
YYLMFDFMINHIS中の 14位に相当する位置、 29位に相当する位置、および 44 位に相当する位置；モチーフ配列 2： RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFAD GSVEHLWNTFGEEQID中の 7位に相当する位置、 19位に相当する位置、 23位 に相当する位置および 34位に相当する位置；ならびにモチーフ配列 3： ILPEIHEH YTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG中の 19位に相当する位置から なる群より選択される少なくとも 1つの位置であり得る。
[0197] 従って、本発明の方法においては、第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩 基配列を含む核酸分子は、改変核酸分子によってコードされる耐熱化スクロースホス ホリラーゼが、モチーフ配列 1： AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSA FGDWDD VKRLGEKYYLMFDFMINHIS中の 14位に相当する位置、 29位に 相当する位置、および 44位に相当する位置；モチーフ配列 2： RPTQEDVDLIYK RKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTFGEEQID中の 7位に相当する位置、 19 位に相当する位置、 23位に相当する位置および 34位に相当する位置；ならびにモ の 19位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも 1つの位置にぉレ、て、該 天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有するように 改変されるとレ、うことができる。
[0198] 本明細書中では、「モチーフ配列」とは、複数のタンパク質のアミノ酸配列の間で見 られる、共通または高度に保存された部分配列をいう。一般に、モチーフ配列は、特 定の機能を有することが多いが、本明細書中では、そのような特定の機能を有さなく とも、複数のアミノ酸配列間で保存されていれば、モチーフ配列と呼ぶ。
[0199] 「モチーフ配列 1中の 14位の」アミノ酸残基とは、モチーフ配列 1の N末端（左端）の アミノ酸残基を 1位として順番に数えたときに 14番目のアミノ酸残基をいう。 「モチ一 フ配列 1中の 29位」、「モチーフ配列 1中の 44位」、「モチーフ配列 2中の 7位」、「モ チーフ配列 2中の 19位」、「モチーフ配列 2中の 23位」、「モチーフ配列 2中の 34位」 、「モチーフ配列 3中の 19位」などにっレ、ても同様である。
[0200] これらのモチーフ配列は、一般に、スクロースホスホリラーゼにおいてよく保存され ている。モチーフ配列 1の位置、モチーフ配列 2の位置およびモチーフ配列 3 (前半） の位置を、図 1Aに示す。モチーフ配列 3 (後半）の位置を図 1Bに示す。
[0201] 本明細書中で用いられる「モチーフ配列 1： AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPI DYHEVDSAFGDWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS中の 14位に相当する 位置」とは、対象のアミノ酸配列とモチーフ配列 1とを相同性が最も高くなるように、ギ ヤップを揷入せず並べた場合に、モチーフ配列 1中の 14位のアミノ酸残基と並置さ れる位置をいう。より好ましくは、 GENETYX-WIN Ver. 4. 0のマルチプルァライ メントにおいて、デフォルトのスコアテーブルを用レ、、 GAP Penalty (Peptide) : 1ns ert=_8、 Extend=_3、 gap Extend on top position :設疋'あり (テエック J、 Match Mode : Local Matchの条件でモチーフ配列 1のアミノ酸配列と対象のアミ ノ酸配列とをァライメントした場合に、モチーフ配列 1中の 14位のアミノ酸残基と並置 される位置をいう。 [0202] モチーフ配列 1中の 29位、モチーフ配列 1中の 44位、モチーフ配列 2中の 7位、モ チーフ配列 2中の 19位、モチーフ配列 2中の 23位、モチーフ配列 2中の 34位、およ びモチーフ配列 3中の 19位についても同様に解釈される。
[0203] GENETYX-WIN Ver. 4. 0のマルチプルァライメントを上記の条件で用いて、 Streptococcus mutans由来の SPのアミノ酸配歹 lj (配列番号 2)に対して、 Strept ococcus pneumoniae由来の SPのアミノ酸酉己歹 [J (酉己歹 [J番号 4)、 Streptococcus sorbinus由来の第 2の SPのアミノ酸配歹 lj (配列番号 6)、 Leuconostoc mesenter oides由来の SPのアミノ酸配歹 1J (配列番号 8)、 Oenococcus oeni由来の SPのアミ ノ酸配列（配列番号 10)、 Streptococcus mitis由来の SPのアミノ酸配歹 lj (配列番 号 12)、 Leuconostoc mesenteroidesの第 2の SPのアミノ酸配歹 lj (配列番号 14) 、 Lactobacillus acidophilusの第 1の SPのアミノ酸配列（配列番号 16)、 Lactoba cillus acidophilusの第 2の SPのアミノ酸配歹 1J (配列番号 18)および Listeria mon ocytogenes由来の SPのアミノ酸配列（配列番号 20)をァライメントした。
[0204] さらに、 GENETYX-WIN Ver. 4. 0のマルチプルァライメントを上記の条件で用 いて、配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12 、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20を、モチーフ配列（モ チーフ配列 1、 2または 3)とァライメントした。その結果、モチーフ配列 1中の 14位に 相当する位置にはトレオニンまたはァスパラギン力 モチーフ配列 1中の 29位に相当 する位置にはセリン、プロリンまたはァラニン力 モチーフ配列 1中の 44位に相当す る位置にはチロシン力 モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置にはバリン、イソロイ シンまたはロイシンが、モチーフ配列 2中の 19位に相当する位置にはリジン、メチォ ニン、トレオニン、イソロイシン、チロシンまたはフエ二ルァラニンが、モチーフ配列 2中 の 23位に相当する位置にはグルタミン、ノ リン、トレオニン、リジンまたはグルタミン酸 、モチーフ配列 2中の 34位に相当する位置にはァスパラギン力 モチーフ配列 3 中の 19位に相当する位置にはァスパラギン酸またはグリシンが並置された。モチー フ配列 1、 2および 3は、配列番号 2の部分配列である。
[0205] 配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、 配列番号 16、配列番号 18、配列番号 20、配列番号 22、配列番号 24、配列番号 26 、配列番号 28および配列番号 30のそれぞれについて、配列番号 2の全長を用いて ァライメントした結果と、モチーフ配列 1、 2および 3を用いてァライメントした結果とを 比較した。その結果、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18、配列番号 20、配列番号 22、配列番 号 24、配列番号 26、配列番号 28および配列番号 30のそれぞれにおいて、配列番 号 2の 47位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置とは、同一 であった。配列番号 2の 62位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 29位に相当す る位置とは、同一であった。配列番号 2の 77位に相当する位置と、モチーフ配列 1中 の 44位に相当する位置とは、同一であった。配列番号 2の 128位に相当する位置と 、モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置とは、同一であった。配列番号 2の 140位 に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 19位に相当する位置とは、同一であった。 配列番号 2の 144位に相当する位置と、モチーフ配列 1中の 19位に相当する位置と は、同一であった。配列番号 2の 155位に相当する位置と、モチーフ配列 2中の 34 位に相当する位置とは、同一であった。配列番号 2の 249位に相当する位置と、モチ ーフ配列 3中の 19位に相当する位置とは、同一であった。このように、モチーフ配列 を用いてァライメントを行っても、配列番号 2のアミノ酸配列を用いた場合と同じ位置 が特定されることが確認された。
[0206] 配列表の配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番 号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18または配列番号 20に示されるァミノ 酸配列をコードする塩基配列を含む核酸分子に対して改変を行って得られる改変塩 基配列を含む核酸分子は、本発明の範囲内にある。
[0207] 配列表の配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5、配列番号 7、配列番号 9、配列番 号 11、配列番号 13、配列番号 15、配列番号 17または配列番号 19に示される塩基 配列を含む核酸分子に対して改変を行って得られる改変塩基配列を含む核酸分子 は、本発明の範囲内にある。
[0208] 配列表の配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番 号 12、配列番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選 択されるアミノ酸配歹 IJと少なくとも 40% (好ましくは少なくとも 60%)の同一性を有する アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸分子に対して改変を行って得られる 改変塩基配列を含む核酸分子は、本発明の範囲内にある。
[0209] 本明細書にぉレ、て配列（例えば、アミノ酸配歹 lj、塩基配列など）の「同一性」とは、 2 つの配列の間で同一のアミノ酸 (塩基配列を比較する場合は塩基）の出現する程度 をいう。一般に、 2つのアミノ酸または塩基の配列を比較して、付加または欠失を含み 得る最適な様式で整列されたこれら 2つの配列を比較することによって決定される。 同一性パーセントは、アミノ酸 (塩基配列を比較する場合は塩基）がこの 2つの配列 間で同一である位置の数を決定し、比較した位置の総数で同一の位置の数を除算し 、そしてこれら 2つの配列間の同一性パーセントを得るために、得られた結果に 100 を掛けることによって算出される。
[0210] 例示として、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを得るために用いられる第一 の（例えば、天然の）スクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、ある実施形態では、 配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列 番号 14、配列番号 16、配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミ ノ酸配列（すなわち、対照アミノ酸配歹 IJ)と同一、すなわち、 100%同一であってもよく 、別の実施形態では、このアミノ酸配列は、対照アミノ酸配列と比較してある一定の数 までアミノ酸が変化していてもよい。このような変化は、少なくとも 1個のアミノ酸の欠 失、保存および非保存置換を含む置換、または挿入からなる群より選択され得る。こ の変化は対照アミノ酸配列のァミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で生じてもよく 、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。アミノ酸残基の変化は、 1残基ず つ点在していてもよぐ数残基連続していてもよい。
[0211] 同様に、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを得るために用いられる第一の（ 例えば、天然の）スクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列は、こ れらの対照アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配歹 1J (すなわち、対照塩基配歹 1J)と 比較してある一定の数まで変化していてもよレ、。このような変化は、少なくとも 1個のヌ クレオチドの欠失、トランジシヨンおよびトランスバージョンを含む置換、または揷入か らなる群より選択され得る。この変化は対照塩基配列の 5 '末端もしくは 3'末端の位 置で生じてもよぐまたはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。塩基の変化は、 1塩基ずつ点在してレ、てもよく、数塩基連続してレ、てもよレ、。
[0212] 塩基の変化は、そのコード配列において、ノンセンス、ミスセンスまたはフレームシフ ト変異を生じ得、このような変化をした後の塩基配列によりコードされる SPに変化をも たらし得る。
[0213] 2つのアミノ酸配列を直接比較する場合、そのアミノ酸配列間でアミノ酸が、代表的 には少なくとも 20%、好ましくは z少なくとも 30%、より好ましくは少なくとも 40%、さら に好ましくは z少なくとも 50%、特に好ましくは少ヽなくとも 60%、 70%、 80%、 90%、 9 5%、 96%、 97%、 98%または 99%同一であること力 S好ましレヽ。
[0214] 第一の（例えば、天然の）酵素または核酸分子としてはまた、本明細書において具 体的に記載された第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列または第一 のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列（例えば、配列番号 1、 2など）に対して同 一ではないが相同性のある配列を有するものもまた使用され得る。第一の（例えば、 天然の）酵素または核酸分子に対して相同性を有するそのような酵素または核酸分 子としては、例えば、 GENETYX-WIN Ver. 4. 0のマキシマムマッチングにおい て、上記の条件で用いて比較した場合に、比較対象の配列に対して、核酸の場合、 少なくとも約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65% 、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 99%の同一性を有する 塩基配列を含む核酸分子が挙げられ、そして酵素の場合、少なくとも約 40%、約 45 %、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 9 0%、約 95%または約 99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素が挙げられ るがそれらに限定されない。
[0215] 配列表の配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5、配列番号 7、配列番号 9、配列番 号 11、配列番号 13、配列番号 15、配列番号 17および配列番号 19からなる群より選 択される塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする 核酸分子に対して改変を行って得られる改変塩基配列を含む核酸分子は、本発明 の範囲内にある。配列表の配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5、配列番号 7、配列 番号 9、配列番号 11、配列番号 13、配列番号 15、配列番号 17および配列番号 19 力 なる群より選択される塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハ イブリダィズする核酸分子に対して改変を行って得られる改変塩基配列を含む核酸 分子もまた、本発明の範囲内にある。当業者は、所望のスクロースホスホリラーゼ遺 伝子を容易に選択することができる。
[0216] 本明細書中で使用する用語「ストリンジェントな条件」とは、特異的な配列にはハイ ブリダィズするが、非特異的な配列にはハイブリダィズしない条件をいう。ストリンジェ ントな条件の設定は、当業者に周知であり、例えば、 Moleculer Cloning (Sambro okら、前出）に記載される。具体的には、例えば、コロニーあるいはプラーク由来の D NAを固定化したフィルターを用いて、 50%ホノレムアミド、 5 X SSC (750mM NaCl 、 75mM クェン酸三ナトリウム）、 50mM リン酸ナトリウム（pH7. 6)、 5 Xデンハル ト溶液（0. 2% BSA、 0. 2% Ficoll 400および 0. 2%ポリビニノレピロリドン）、 10 %硫酸デキストラン、および 20 μ gZml変性剪断サケ精子 DNAを含む溶液中での 65。Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1 2倍濃度の SSC (saline—sodium citrate)溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM 塩化ナトリウム、 15mM クェン酸ナトリウムである）を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄するという条件を 用いることにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。
[0217] 本発明の方法で用いられる改変核酸分子は、第一のスクロースホスホリラーゼをコ ードする塩基配列を含む核酸分子に対して保存的に改変された核酸分子であっても よい。保存的に改変された核酸分子は特定の実施形態では、本発明の目的とする改 変以外の保存的改変を有していることが好ましい。 「第一のスクロースホスホリラーゼ をコードする塩基配列を含む核酸分子に対して保存的に改変された核酸分子」とは 、第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列力 コードするアミノ酸配列と 同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸分子をい う。 「第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列がコードするアミノ酸配列 と本質的に同一のアミノ酸配歹 |J」とは、第一のスクロースホスホリラーゼと本質的に同 じ酵素活性を有するアミノ酸配列をいう。遺伝コードの縮重のため、機能的に同一な 多数の塩基配列が任意の所定のアミノ酸配列をコードする。例えば、コドン GCA、 G CC、 GCGおよび GCUはすべて、アミノ酸ァラニンをコードする。したがって、 GCAコ ドンによってァラニンが特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたァラニン を変更することなぐ GCC、 GCGまたは GCUに変更され得る。同様に、複数のコドン によってコードされ得るアミノ酸に関しては、コドンによってそのアミノ酸が特定される 全ての位置で、そのコドンは、コードされた特定のアミノ酸を変更することなぐそのァ ミノ酸をコードする任意の別のコドンに変更され得る。このような塩基配列の変動は、 保存的に改変された変異の 1つの種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコ ードする本明細書中のすべての塩基配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレ ント改変を包含する。サイレント変異は、コードする核酸が変化しない「サイレント置換 」と、そもそも核酸がアミノ酸をコードしない場合を包含する。ある核酸がアミノ酸をコ ードする場合、サイレント変異は、サイレント置換と同義である。本明細書において「 サイレント置換」とは、塩基配列において、あるアミノ酸をコードする塩基配列を、同じ アミノ酸をコードする別の塩基配列に置換することをいう。遺伝コード上の縮重という 現象に基づき、あるアミノ酸をコードする塩基配列が複数ある場合 (例えば、グリシン など）、このようなサイレント置換が可能である。したがって、サイレント置換により生成 した塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、もとのポリべ プチドと同じアミノ酸配列を有する。したがって、本発明の耐熱化スクロースホスホリラ ーゼにおいて、本発明の目的とする改変（モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置 、 29位に相当する位置、および 44位に相当する位置；モチーフ配列 2中の 7位に相 当する位置、 19位に相当する位置、 23位に相当する位置および 34位に相当する位 置；ならびにモチーフ配列 3中の 19位に相当する位置からなる群より選択される少な くとも 1つの位置；あるいは、配列番号 2のアミノ酸配列の 47位トレオニン (T47)に相 当する位置、 62位セリン（S62)に相当する位置、 77位チロシン (Y77)に相当する位 置、 128位バリン (VI 28)に相当する位置、 140位リジン（K140)に相当する位置、 1 44位グノレタミン（Q144)に相当する位置、 155位ァスパラギン（N155)に相当する 位置および 249位ァスパラギン酸 (D249)に相当する位置からなる群より選択される 少なくとも 1つの位置において、該天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸残基とは 異なるアミノ酸残基を有するように置換すること）に加えて、塩基配列レベルでは、サ ィレント置換を含ませることも可能である。当該分野において、核酸中の各コドン (通 常メチォニンをコードする唯一のコドンである AUG、および通常トリプトファンをコード する唯一のコドンである TGGを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変 され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント 変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は 、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシスティンの置換を 回避するようになされ得る。
[0218] 本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列は、発現のために 導入される生物におけるコドンの使用頻度にあわせて変更され得る。コドン使用頻度 は、その生物において高度に発現される遺伝子での使用頻度を反映する。例えば、 大腸菌において発現させることを意図する場合、公開されたコドン使用頻度表 (例え ば、 Sharpら， Nucleic Acids Research 16 第 17号， 8207頁（1988) )に従つ て大腸菌での発現のために最適にすることができる。
[0219] (2. 3 発現ベクターの作製）
上記のようにして改変された塩基配列を含む核酸分子を用いて、発現ベクターが 作製される。特定の核酸配列を用いて発現ベクターを作製する方法は、当業者に周 知である。
[0220] 本明細書において核酸分子について言及する場合、「ベクター」とは、 目的の塩基 配列を目的の細胞へと移入させることができる核酸分子をいう。そのようなベクターと しては、 目的の細胞において自律複製が可能であるカ または目的の細胞の染色体 中への組込みが可能で、かつ改変された塩基配列の転写に適した位置にプロモー ターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであ り得る。
[0221] 本明細書において使用される「発現ベクター」とは、改変された塩基配列（すなわち 、改変されたスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配歹 1J)を目的の細胞中で発現 し得るベクターをいう。発現ベクターは、改変された塩基配列に加えて、その発現を 調節するプロモーターのような種々の調節エレメント、および必要に応じて、 目的の 細胞中での複製および組換え体の選択に必要な因子（例えば、複製起点（ori)、お よび薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー）を含む。発現ベクター中では、改変され た塩基配列は、転写および翻訳されるように作動可能に連結されている。調節エレメ ントとしては、プロモーター、ターミネータ一およびェンハンサ一が挙げられる。また、 発現された酵素を細胞外へ分泌させることが意図される場合は、分泌シグナルぺプ チドをコードする塩基配列力 改変された塩基配列の上流に正しいリーディングフレ ームで結合される。特定の生物（例えば、細菌）に導入するために使用される発現べ クタ一のタイプ、その発現ベクター中で使用される調節エレメントおよび他の因子の 種類が、 目的の細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
[0222] 本明細書において使用される「ターミネータ一」は、タンパク質コード領域の下流に 位置し、塩基配列が mRNAに転写される際の転写の終結、ポリ A配列の付加に関与 する配列である。ターミネータ一は、 mRNAの安定性に関与して遺伝子の発現量に 影響を及ぼすことが知られている。
[0223] 本明細書において使用される「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決 定し、また転写頻度を直接的に調節する DNA上の領域をレ、い、 RN Aポリメラーゼが 結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク 質コード領域の第 1ェキソンの上流約 2kbp以内の領域であることが多いので、 DNA 解析用ソフトウェアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば
、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子 ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺 伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一ェキソン翻訳 開始点から上流約 2kbp以内に存在する。
[0224] 本明細書において使用される「ェンハンサー」は、 目的遺伝子の発現効率を高める ために用いられ得る。そのようなェンハンサ一は当該分野において周知である。ェン ハンサ一は複数個用いられ得るが、 1個用いられてもよいし、用いなくともよい。
[0225] 本明細書において使用される「作動可能に連結された（る）」とは、所望の塩基配列 、発現 (すなわち、作動）をもたらす転写翻訳調節配列 (例えば、プロモーター、ェ ンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをレ、う。プロモータ 一が遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロ モーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
[0226] 改変した核酸配列を、上記調節エレメントに作動可能に連結するために、 目的のス クロースホスホリラーゼ遺伝子をカ卩ェすべき場合がある。例えば、プロモーターとコー ド領域との間が長すぎて転写効率の低下が予想される場合、またはリボゾーム結合 部位と翻訳開始コドンとの間隔が適切でない場合などである。加工の手段としては、 制限酵素による消ィ匕、 Bal31、 ExoIIIなどのェキソヌクレアーゼによる消ィ匕、あるいは Ml 3などの一本鎖 DNAまたは PCRを使用した部位特異的変異誘発の導入が挙げ られる。
[0227] (2. 4 耐熱化スクロースホスホリラーゼの発現）
次いで、上記のようにして作製された発現ベクターを細胞に導入して耐熱化スクロ ースホスホリラーゼが発現される。
[0228] 本明細書にぉレ、て酵素の「発現」とは、その酵素をコードする塩基配列力 インビボ またはインビトロで転写および翻訳されて、コードされる酵素が生産されることをいう。
[0229] 発現ベクターを導入する細胞（宿主ともレ、う）としては、原核生物および真核生物が 挙げられる。発現ベクターを導入する細胞は、スクロースホスホリラーゼの発現の容 易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択 され得る。例えば、スクロースホスホリラーゼを高分子量のアミロースの合成に用いる 場合、スクロースホスホリラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましレヽ ので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない細胞を用いること が好ましい。このような細胞の例としては、細菌、真菌などの微生物が挙げられる。よ り好ましい細胞の例としては、中温菌（例えば、大腸菌、枯草菌）が挙げられる。本明 細書において、「中温菌」とは、生育温度が通常の温度環境にある微生物のことであ り、特に生育至適温度が 20°C— 40°Cである微生物をいう。細胞は、微生物細胞であ つてもょレ、が、植物、動物などの細胞であってもよレ、。用いる細胞によっては、本発明 の酵素は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。植物としては、例えば、双子 葉植物、イネ、コムギ、ォォムギ、トウモロコシなどの単子葉植物が挙げられるがそれ らに限定されない。イネなどの穀物は、貯蔵タンパク質を種子に蓄積する性質を持つ ており、貯蔵タンパク質系を用いて、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを種子 に蓄積するように発現させることが可能である（特開 2002-58492号明細書を参照 のこと）。 [0230] 本発明の方法において、発現ベクターを細胞に導入する技術は、当該分野で公知 の任意の技術であり得る。このような技術の例としては、例えば、形質転換、形質導 入、トランスフエクシヨンなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該 分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、 Ausubel F. A.ら 編 (1988)、 Current Protocols in Molecular Biology、 Wiley、 New York 、NY; Sambrook Jら (1987) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2 nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , NY、別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載さ れる。
[0231] 細胞として植物の細胞を用いる場合、形質転換体を組織または植物体へと再分化 する方法は当該分野において周知である。そのような方法の例は、以下に記載され る： Rogersら， Methods in Enzymology 118 : 627—640 (1986) ;Tabataら , Plant Cell Physiol. , 28 : 73— 82 (1987) ; Shaw, Plant Molecular Biolo gy : A practical approach. IRL press、丄 988) ; Shimamotoら, Nature 338 : 274 (1989)；および Maligaら， Methods in Plant Molecular Biology : A 1 aboratory course. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995)。木本 植物を形質転換する方法については、 Molecular Biology of Woody Plants ( Vol. I, II) (ed. S. Mohan Jain, Subhash C. Minocha)、 Kluwer Academic
Publishers, (2000)に記載されている。また、木本植物を形質転換する方法は、 例えば、 Plant Cell Reports (1999) 19： 106—1 10に詳細に記載されている。従 つて、当業者は、 目的とするトランスジエニック植物に応じて上記周知方法を適宜使 用して、形質転換体を再分化させることができる。このようにして得られたトランスジヱ ニック植物には、 目的の遺伝子が導入されており、そのような遺伝子の導入は、ノー ザンブロット、ウェスタンブロット分析のような公知の方法または他の周知慣用技術を 用いて確認することができる。
[0232] 発現ベクターが導入されて耐熱化されたスクロースホスホリラーゼを発現する能力 を獲得した細胞（形質転換細胞ともいう）を培養することにより、耐熱化されたスクロー スホスホリラーゼを細胞に発現させることができる。形質転換細胞の培養条件は、使 用する宿主細胞の種類、発現ベクター内の発現調節因子の種類などに応じて、適切 に選択される。例えば、通常の振盪培養方法が用いられ得る。
[0233] 形質転換細胞の培養に用いる培地は、使用する細胞が増殖して目的の耐熱化スク ロースホスホリラーゼを発現し得るものであれば特に限定されなレ、。培地には、炭素 源、窒素源の他、無機塩、例えば、リン酸、 Mg2+、 Ca2+、 Mn2+、 Fe2+、 Fe3+、 Zn2+ 、 Co2+、 Ni2+、 Na+、 K+などの塩が必要に応じて、適宜混合して、または単独で用 レ、られ得る。また、必要に応じて形質転換細胞の増殖、 目的の耐熱化スクロースホス ホリラーゼの発現に必要な各種無機物または有機物が添加され得る。
[0234] 形質転換細胞を培養する温度は、用いる形質転換細胞の増殖に適するように選択 され得る。通常 15°C 60°Cである。形質転換細胞の培養は、耐熱化スクロースホス ホリラーゼの発現のために十分な時間続行される。
[0235] 誘導性プロモーターを有する発現ベクターを使用する場合、誘導物質の添加、培 養温度の変更、培地成分の調整などにより発現が制御され得る。例えば、ラタトース 誘導性プロモーターを有する発現ベクターを使用する場合は、イソプロピル一 β -D- チォガラタトピラノシド (IPTG)を添加することにより発現が誘導され得る。
[0236] (2. 5 耐熱化スクロースホスホリラーゼの回収）
このようにして発現された耐熱化スクロースホスホリラーゼは、次いで回収され得る。 例えば、発現された耐熱化スクロースホスホリラーゼが形質転換細胞内に蓄積する 場合、形質転換細胞を適切な条件下で培養した後、培養物を遠心分離または濾過 することによって細胞を回収し、次いで適切な緩衝液に懸濁する。次いで超音波処 理などにより細胞を破砕した後、遠心分離もしくは濾過することによって上清を得る。 あるいは、発現された耐熱化スクロースホスホリラーゼが形質転換細胞外に分泌され る場合、このようにして形質転換細胞を培養した後、培養物を遠心分離または濾過す ることによって細胞を分離して上清を得る。耐熱化スクロースホスホリラーゼが形質転 換細胞内に蓄積する場合も、形質転換細胞外に分泌される場合も、このようにして得 られた耐熱化スクロースホスホリラーゼ含有上清を通常の手段（例えば、塩析法、溶 媒沈澱、限外濾過）を用いて濃縮し、耐熱化スクロースホスホリラーゼを含む画分を 得る。この画分を濾過、あるいは遠心分離、脱塩処理などの処理を行い粗酵素液を 得る。さらにこの粗酵素液を、凍結乾燥、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフ ィー、晶出などの通常の酵素の精製手段を適宜組み合わせることによって、比活性 が向上した粗酵素あるいは精製酵素が得られる。 α—アミラーゼなどの α—グノレカン を加水分解する酵素が含まれていなければ、粗酵素をそのまま、例えば、高分子量 ひ—グルカンの製造に用い得る。
[0237] 上述のようにして耐熱化スクロースホスホリラーゼを生産することにより、天然のスク ロースホスホリラーゼの耐熱性を大幅に向上させることが可能となる。また、発現させ た耐熱化スクロースホスホリラーゼは、その耐熱性を利用して簡便に精製され得る。 簡単に述べると、耐熱化スクロースホスホリラーゼを含む細胞抽出液を 60°C程度で 加熱処理することにより、夾雑酵素が不溶化する。この不溶化物を遠心分離などで除 去して透析処理を行うことにより、精製された耐熱化スクロースホスホリラーゼが得ら れる。
[0238] 好ましい実施態様では、スクロースホスホリラーゼは、精製段階の任意の段階でスク 口ース（代表的には約 4%—約 30 %、好ましくは約 8 %—約 30 %、より好ましくは約 8 %—約 25%)の存在下で加熱され得る。この加熱工程における溶液の温度は、この 溶液を 30分間加熱した場合に、加熱前のこの溶液に含まれるスクロースホスホリラー ゼの活性の 50%以上、より好ましくは 80%以上の活性が残る温度であることが好まし レ、。この温度は好ましくは約 50°C—約 70°Cであり、より好ましくは約 55°C—約 65°C である。例えば、耐熱化 S. mutans由来スクロースホスホリラーゼの場合、この温度 は約 50°C—約 70°Cであることが好ましぐ約 55°C— 65°Cであることがより好ましい
。加熱が行われる場合、加熱時間は、反応温度を考慮して、スクロースホスホリラー ゼの活性を大きく損なうことがない限り、任意の時間で設定され得る。加熱時間は、 代表的には約 10分間一約 90分間、より好ましくは約 30分間一約 60分間である。
[0239] (3.耐熱化スクロースホスホリラーゼ）
(3. 1 耐熱化スクロースホスホリラーゼの特徴）
上記のような方法によって得られた本発明の酵素は、モチーフ配列 1中の 14位に 相当する位置、 29位に相当する位置、および 44位に相当する位置；モチーフ配列 2 中の 7位に相当する位置、 19位に相当する位置、 23位に相当する位置および 34位 に相当する位置；ならびにモチーフ配列 3中の 19位に相当する位置からなる群より 選択される少なくとも 1つの位置（あるいは、配列番号 2のアミノ酸配列の 47位トレオ ニン (T47)に相当する位置、 62位セリン（S62)に相当する位置、 77位チロシン (Y7 7)に相当する位置、 128位バリン (VI 28)に相当する位置、 140位リジン（K140)に 相当する位置、 144位グルタミン（Q144)に相当する位置、 155位ァスパラギン（N1 55)に相当する位置および 249位ァスパラギン酸（D249)に相当する位置からなる 群より選択される少なくとも 1つの位置）において、該天然のスクロースホスホリラーゼ のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、かつ該耐熱化スクロースホスホリラー ゼを 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 55°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロ ースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性力 該加熱前の耐熱化スクロースホスホ リラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20%以上である。
本発明の酵素は好ましくは、モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置、 29位に相 当する位置、および 44位に相当する位置；モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置 、 19位に相当する位置、 23位に相当する位置および 34位に相当する位置；ならび にモチーフ配列 3中の 19位に相当する位置（あるいは、配列番号 2のアミノ酸配列の 47位トレオニン (T47)に相当する位置、 62位セリン（S62)に相当する位置、 77位チ 口シン (Y77)に相当する位置、 128位バリン (V128)に相当する位置、 140位リジン (K140)に相当する位置、 144位グルタミン（Q144)に相当する位置、 155位ァスパ ラギン（N155)に相当する位置および 249位ァスパラギン酸（D249)に相当する位 置）からなる群より選択される少なくとも 2つの位置において、より好ましくは少なくとも 3つの位置において、さらに好ましくは少なくとも 4つの位置において、なお好ましくは 少なくとも 5つの位置において、殊に好ましくは少なくとも 6つの位置において、特に 好ましくは少なくとも 7つの位置にぉレ、て、最も好ましくは 8つ全ての位置にぉレ、て、 天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有する。例えば、配列番号 2のアミノ酸配列を有するスクロースホスホリラーゼに対して、この 8つ全ての位置で置 換が行われたアミノ酸配列の例を配列番号 22に示し、このアミノ酸配列をコードする 塩基配列を配列番号 21に示す。これらの置換が行われることによって、置換後のス クロースホスホリラーゼは、置換前のスクロースホスホリラーゼと比較して耐熱性の向 上が見られる。本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、これらの位置でのァミノ 酸残基の置換に加えて、天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して 1も しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでもよい。
[0241] 天然のスクロースホスホリラーゼの上記の 8つの位置は、それらの周囲のアミノ酸と 一緒になつて、スクロースホスホリラーゼの立体構造の中で、耐熱性に悪影響を与え る立体的部分構造を形成していると考えられる。これらの位置の残基を、別のアミノ酸 残基に変更することによって、耐熱性が向上する。また、これらの位置の残基は周囲 のアミノ酸残基と立体構造的に相互作用しているので、そのアミノ酸残基を置換する ことに重要な意義がある。例えば、 Streptococcus mutans由来のスクロースホスホ リラーゼの場合は、 T47の位置の Tをそれ以外に置換することに重要な意義がある。 また、例えば、 Lactobacillus acidophilus由来のスクロースホスホリラーゼにおレヽ ては、モチーフ配列 1中の 14位（あるいは、 T47)に相当する位置のアミノ酸は Nであ る力 Nを他のアミノ酸に置換することに重要な意義があり、例えば、 Nを Tに置換す ると置換後の配列は Streptococcus mutans由来のスクロースホスホリラーゼに類 似した配列になる力 その配列においても耐熱性の向上が見られる。
[0242] 本発明の酵素においては、モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置（あるいは、 T 47に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、天然のスクロースホスホリラーゼに見出 されるアミノ酸残基以外のアミノ酸であり得る。モチーフ配列 1中の 14位に相当する 位置（あるいは、 T47に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、セリンであることが最 も好ましい。別の実施形態では、モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置 (あるいは 、 T47に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、セリンまたはイソロイシンであること が特に好ましぐイソロイシンであることが最も好ましい。
[0243] 本発明の酵素においては、モチーフ配列 1中の 29位に相当する位置（あるいは、 S 62に相当する位置におけるアミノ酸残基）は、天然のスクロースホスホリラーゼに見出 されるアミノ酸残基以外のアミノ酸であり得る。モチーフ配列 1中の 29位に相当する 位置（あるいは、 S62に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、プロリンであることが 最も好ましい。別の実施形態では、モチーフ配列 1中の 29位に相当する位置 (あるい は、 S62に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、プロリン、ァラニンまたはリジンで あることが特に好ましぐァラニンであることが最も好ましい。
[0244] 本発明の酵素においては、モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置（あるいは、 Y 77に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、天然のスクロースホスホリラーゼに見出 されるアミノ酸残基以外のアミノ酸であり得る。モチーフ配列 1中の 44位に相当する 位置（あるいは、 Y77に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、ヒスチジンまたはトリ ブトファンであることが特に好ましぐヒスチジンであることが最も好ましい。別の実施 形態では、モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置（あるいは、 Y77に相当する位 置）におけるアミノ酸残基は、ヒスチジンまたはアルギニンであることが特に好ましぐ アルギニンであることが最も好ましレ、。
[0245] 本発明の酵素においては、モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置（あるいは、 VI 28に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、天然のスクロースホスホリラーゼに見出 されるアミノ酸残基以外のアミノ酸であり得る。モチーフ配列 2中の 7位に相当する位 置（あるいは、 VI 28に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、ロイシンであることが 最も好ましい。別の実施形態では、モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置 (あるい は、 VI 28に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、ロイシンまたはイソロイシンであ ることが特に好ましぐイソロイシンであることが最も好ましい。
[0246] 本発明の酵素においては、モチーフ配列 2中の 19位に相当する位置（あるいは、 K 140に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、天然のスクロースホスホリラーゼに見 出されるアミノ酸残基以外のアミノ酸であり得る。モチーフ配列 2中の 19位に相当す る位置 (あるいは、 K140に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、メチォニンまた はシスティンであることが特に好ましぐメチォニンであることが最も好ましい。別の実 施形態では、モチーフ配列 2中の 19位に相当する位置（あるいは、 K140に相当す る位置）におけるアミノ酸残基は、メチォニン、システィン、フエ二ルァラニン、イソロイ シン、ノ リンまたはチロシンであることがさらに好ましぐメチォニン、システィン、フエ 二ルァラニン、バリンまたはチロシンであることがさらに好ましぐシスティン、フエエル ァラニン、ノ リンまたはチロシンであることがさらに好ましぐフエ二ルァラニン、パリン またはチロシンであることがさらに好ましぐパリンまたはチロシンであることがさらに好 ましぐチロシンであることが最も好ましい。 [0247] 本発明の酵素においては、モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置（あるいは、 Q 144に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、天然のスクロースホスホリラーゼに見 出されるアミノ酸残基以外のアミノ酸であり得る。モチーフ配列 2中の 23位に相当す る位置（あるいは、 Q144に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、アルギニンまた はリジンであることが特に好ましぐアルギニンであることが最も好ましい。別の実施形 態では、モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置（あるいは、 Q144に相当する位 置）におけるアミノ酸残基は、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジンまたはバリ ンであることが好ましぐヒスチジン、イソロイシン、リジンまたはバリンであることがさら に好ましぐヒスチジン、イソロイシンまたはバリンであることがさらに好ましぐヒスチジ ンまたはイソロイシンであることがさらに好ましぐヒスチジンであることが最も好ましレ、
[0248] 本発明の酵素においては、モチーフ配列 2中の 34位に相当する位置（あるいは、 N 155に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、天然のスクロースホスホリラーゼに見 出されるアミノ酸残基以外のアミノ酸であり得る。モチーフ配列 2中の 34位に相当す る位置（あるいは、 N155に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、セリンまたはトレ ォニンであることが特に好ましぐセリンであることが最も好ましい。
[0249] 本発明の酵素においては、モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置（あるいは、 D 249に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、天然のスクロースホスホリラーゼに見 出されるアミノ酸残基以外のアミノ酸であり得る。モチーフ配列 3中の 19位に相当す る位置（あるいは、 D249に相当する位置）におけるアミノ酸残基は、グリシンまたはァ ラニンであることが特に好ましぐグリシンであることが最も好ましい。モチーフ配列 3 中の 19位に相当する位置（あるいは、 D249に相当する位置）におけるアミノ酸残基 は、グリシン、システィン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、ァスパラギン、プロリン、グルタ ミン、アルギニンまたはセリンであることがさらに好ましぐグリシン、ヒスチジンまたはァ スパラギンであることがさらに好ましぐグリシンまたはァスパラギンであることがさらに 好ましぐグリシンであることが最も好ましい。
[0250] 本発明の方法において、耐熱化スクロースホスホリラーゼを作製するために、本発 明の目的の改変（モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置、 29位に相当する位置 、および 44位に相当する位置；モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置、 19位に相 当する位置、 23位に相当する位置および 34位に相当する位置；ならびにモチーフ 配列 3中の 19位に相当する位置；からなる群より選択される少なくとも 1つの位置（あ るいは、配列番号 2のアミノ酸配列の 47位トレオニン (T47)に相当する位置、 62位 セリン（S62)に相当する位置、 77位チロシン (Y77)に相当する位置、 128位バリン（ V128)に相当する位置、 140位リジン (K140)に相当する位置、 144位グノレタミン（ Q144)に相当する位置、 155位ァスパラギン（N155)に相当する位置および 249位 ァスパラギン酸 (D249)に相当する位置からなる群より選択される少なくとも 1つの位 置）において、該天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残 基を有するように置換すること）に加えて、アミノ酸の置換、付加、欠失または修飾を 行うことができる。
[0251] アミノ酸の置換とは、 1つのアミノ酸を別の 1つのアミノ酸に置き換えることをいう。得 られるスクロースホスホリラーゼカ S、天然のスクロースホスホリラーゼの酵素活性と実質 的に同様の酵素活性を有する限り、アミノ酸の置換は、任意の箇所で任意の個数行 われ得る。例えば、置換は、好ましくは 1一 30個行われ得、より好ましくは 1一 20個行 われ得、さらに好ましくは 1一 10個行われ得、特に好ましくは 1一 5個行われ得、最も 好ましくは 1一 3個行われ得る。アミノ酸の置換は、 1残基ずつ点在していてもよぐ 2 残基以上連続していてもよい。特に、置換が N末端または C末端で行われる場合、他 の箇所に比較して活性への影響が少ないので、他の箇所への置換より多くのァミノ 酸残基を置換してもよレ、。 目的の変異が行われる位置（配列番号 2のアミノ酸配列の T47に相当する位置、 S62に相当する位置、 Y77に相当する位置、 V128に相当す る位置、 K140に相当する位置、 Q144に相当する位置、 N155に相当する位置およ び D249に相当する位置）の付近での置換は、耐熱性に影響を与える可能性がある のであまり好ましくない。
[0252] アミノ酸の付加とは、もとのアミノ酸配列中のどこかの位置に、 1つ以上、例えば、 1 一 30個、より好ましくは 1一 20個、さらに好ましくは 1一 10個、特に好ましくは 1一 5個 、最も好ましくは 1一 3個のアミノ酸を揷入することをいう。アミノ酸の付カロもまた、 1残 基ずつ点在していてもよぐ 2残基以上連続していてもよレ、。アミノ酸の付加はまた、 特に、 N末端または C末端で行われる場合、他の箇所に比較して活性への影響が少 ないので、他の箇所への付加より多くのアミノ酸残基を付カ卩してもよレ、。例えば 1一 1 00個、より好ましく ίま 1一 50個、さら【こより好ましく ίま 1一 30個、特 ίこ好ましく ίま 5一 30 個、最も好ましくは 5 10個のアミノ酸残基を付加してもよい。 目的の変異が行われ る位置の付近での付加は、耐熱性に影響を与える可能性があるのであまり好ましくな レ、。
[0253] アミノ酸の欠失とは、もとのアミノ酸配列から 1つ以上、例えば、 1一 30個、より好まし くは 1一 10個、特に好ましくは 1一 5個、最も好ましくは 1一 3個のアミノ酸を除去する ことをいう。アミノ酸の欠失もまた、 1残基ずつ点在していてもよぐ 2残基以上連続し ていてもよい。特に、欠失が Ν末端または C末端で行われる場合、他の箇所に比較し て活性への影響が少ないので、他の箇所への欠失より多くのアミノ酸残基を欠失して もよレ、。 目的の変異が行われる位置の付近での欠失は、耐熱性に影響を与える可能 性があるのであまり好ましくない。
[0254] アミノ酸修飾の例としては、アミドィヒ、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキ ノレ化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、ァシル化（例えば、ァセチル化）などが挙げら れる力 これらに限定されなレ、。本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、ぺプチ ド合成方法によって合成されてもよぐこのような場合、置換または付加されるアミノ酸 は、天然のアミノ酸であってもよぐ非天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであって もよレ、。天然のアミノ酸が好ましい。
[0255] 本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、スクロースホスホリラーゼとしての酵素 活性を有する、酵素アナログであってもよい。本明細書において使用される用語「酵 素アナログ」とは、天然の酵素とは異なる化合物である力 S、天然の酵素と少なくとも 1 つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、酵素アナ ログには、もとの天然の酵素に対して、 1つ以上のアミノ酸アナログが付加または置換 されているものが含まれる。酵素アナログは、その機能（例えば、スクロースホスホリラ ーゼ活性）が、もとの天然の酵素の機能と実質的に同様またはそれよりも良好である ように、このような付加または置換がされている。そのような酵素アナログは、当該分 野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、酵素アナログは 、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。本明細書において「酵素」は、特に言 及しない限り、この酵素アナログを包含する。
[0256] 本明細書において、「アミノ酸」は、天然のアミノ酸であっても、非天然アミノ酸であ つても、誘導体アミノ酸であっても、アミノ酸アナログであってもよレ、。天然のアミノ酸が 好ましい。
[0257] 用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸の L一異性体を意味する。天然のァミノ 酸は、グリシン、ァラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチォニン、トレオニ ン、フエ二ルァラニン、チロシン、トリプトファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、ァス パラギン酸、ァスパラギン、グノレタミン酸、グノレタミン、 7—カルボキシグルタミン酸、ァ ノレギニン、オル二チン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全 てのアミノ酸は L体であるが、 D体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にあ る。
[0258] 用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を 意味する。非天然アミノ酸の例として、ノノレロイシン、パラ—ニトロフエ二ルァラニン、ホ モフエ二ルァラニン、パラ—フルオロフェニルァラニン、 3—ァミノ— 2_ベンジルプロピオ ン酸、ホモアルギニンの D体または L体および D—フエ二ルァラニンが挙げられる。
[0259] 「誘導体アミノ酸」とは、アミノ酸を誘導体化することによって得られるアミノ酸をいう。
[0260] 「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および/または機能に 類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、ェチォニン、力ナパニン、 2 -メチルグルタミンなどが挙げられる。
[0261] アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号か、または IUPAC— IUB Biochemical
Nomenclature Commissionにより推奨される 1文字記号のいずれかにより、本 明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた 1文字コー ドにより言及され得る。
[0262] 目的の改変に加えて、天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して 1も しくは数個またはそれを超える複数のアミノ酸の置換、付加または欠失による改変を 含む耐熱化スクロースホスホリラーゼは、本発明の範囲内にある。このような、 目的の 改変以外のアミノ酸の改変は、好ましくは保存的改変であり、より好ましくは保存的置 換である。また、天然のスクロースホスホリラーゼの N末端または C末端へのアミノ酸 の付加または欠失は、他の部分への置換、付加または欠失に比較して、スクロースホ スホリラーゼの酵素活性に対する影響が少ないと考えられる。それゆえ、アミノ酸の置 換、付加または欠失は、 N末端または C末端で行われることが好ましい。そのような 1 もしくは数個またはそれを超えるアミノ酸の置換、付加または欠失を含む耐熱化スク ロースホスホリフーゼ【ま、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Secon d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 Current Pro tocols in Molecular Biology, Supplement 1一 38， John Wiley & Sons ( 1987—1997)、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Pro Natl. Ac ad. Sci. , USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34， 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13， 4431 (1985)、 Pro Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985) 、 Pro Natl. Acad. Sci. , USA, 81 , 5662 (1984)、 Science, 224, 1431 (19 84)、 PCT WO85/00817 (1985)、 Nature, 316, 601 (1985)等に記載の方 法に準じて調製することができる。
[0263] 本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、当該分野において周知の方法を利用 して製造され得る。例えば、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを作成するた めのアミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、周知技術である部位特異的変異誘発法 により実施すること力 Sできる。部位特異的変異誘発の手法は、当該分野では周知で ある。例えば、 Nucl. Acid Research, Vol. 10, pp. 6487— 6500 (1982)を参照 のこと。
[0264] 本明細書において、耐熱化スクロースホスホリラーゼについて目的の改変以外に関 して用いられるとき、「1もしくは数個またはそれを超える複数のアミノ酸の置換、付加 または欠失」または「少なくとも 1つのアミノ酸の置換、付加または欠失」とは、スクロー スホスホリラーゼの酵素活性が喪失しなレ、、好ましくはその酵素活性が基準となるも の（例えば、天然のスクロースホスホリラーゼ）と同等以上となるような程度の数の置換 、付加または欠失をいう。当業者は、所望の性質を有する耐熱化スクロースホスホリラ ーゼを容易に選択することができる。あるいは、 目的とする耐熱化スクロースホスホリ ラーゼを直接化学合成してもよい。そのような化学合成の方法は、当該分野におい て周知である。
[0265] このようにして作製された本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、第一の（例 えば、天然の）スクロースホスホリラーゼ（好ましくは、 Streptococcus mutansまた は Streptococcus pneumoniae由来のスクロースホスホリラーゼ）のアミノ酸配列に 対して、好ましくは約 40%、より好ましくは約 45%、より好ましくは約 50%、より好まし くは約 55%、より好ましくは約 60%、より好ましくは約 65%、より好ましくは約 70%、よ り好ましくは約 75%、より好ましくは約 80%、より好ましくは約 85%、より好ましくは約 90%、より好ましくは約 95%、そして最も好ましくは約 99%の同一性を有する。
[0266] 上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク 質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性 は、一般に当該分野で認められている（Kyte. Jおよび Doolittle, R. F. J. Mol. Bi ol. 157 (1) : 105-132, 1982)。アミノ酸の珠水白勺十生質 fま、生成したタンノヽ °ク質の 二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプ ター、 DNA、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水 性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（ + 4. 5)；バリン（ + 4· 2)；ロイシン（ + 3· 8)；フエ二ルァラニン（ + 2· 8)；システィン /シスチン（ + 2· 5)；メチォニン（+ 1 · 9)；ァラニン（ + 1 · 8)；グリシン (一 0· 4)；スレ ォニン (一 0· 7)；セリン（一 0· 8)；トリプトファン（一 0· 9)；チロシン (一 1 · 3)；プロリン（一 1. 6)；ヒスチジン (一 3· 2)；グルタミン酸 (一 3· 5)；グルタミン (一 3· 5)；ァスパラギン酸 (-3. 5)；ァスパラギン (一 3· 5) ;リジン (一 3· 9)；およびアルギニン (一 4· 5) )である。
[0267] あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依 然として実質的に同様の生物学的機能を有するタンパク質 (例えば、酵素活性にお レ、て実質的に等価なタンパク質）を生じさせ得ることは、当該分野で周知である。この ようなアミノ酸置換において、疎水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内 であることがより好ましぐおよび ± 0. 5以内であることがさらにより好ましい。疎水性 に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解され る。米国特許第 4， 554, 101号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残 基に割り当てられている：アルギニン（ + 3. 0)；リジン（ + 3. 0)；ァスパラギン酸（+ 3 . 0 ± 1)；グルタミン酸（ + 3· 0± 1)；セリン（ + 0· 3)；ァスパラギン（ + 0· 2)；グノレタミ ン（ + 0· 2)；グリシン（0)；スレオニン (一 0· 4)；プロリン (一 0· 5 ± 1)；ァラニン (一 0· 5 )；ヒスチジン (一 0· 5)；システィン (_1 · 0)；メチォニン (一 1 · 3)；バリン (一 1 · 5)；ロイ シン（― 1. 8)；ィソロイシン（—1. 8)；チロシン（—2. 3)；フヱ二ルァラニン（—2. 5)；ぉ よびトリプトファン (一 3. 4)。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物 学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸 置換において、親水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがよ り好ましぐおよび ± 0. 5以内であることがさらにより好ましい。
[0268] 本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換さ れるアミノ酸との親水性指数または/および疎水性指数が上記のように類似してレ、る 置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内 での置換が挙げられるがこれらに限定されなレ、：アルギニンおよびリジン；グルタミン 酸およびァスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびァスパラギン；なら びにパリン、ロイシン、およびイソロイシン。
[0269] (3. 2 耐熱性の評価方法）
本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを 20mM Tris緩衝液（ρΗ7· 0)中で 55 °Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性 、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20%以 上であることを 1つの特徴とする。本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 55°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリ ラーゼの 37°Cにおける酵素活性は、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 3 7°Cにおける酵素活性の約 20%以上であることが好ましぐ約 30%以上であることが より好ましぐ約 40%以上であることがより好ましぐ約 50%以上であることがより好ま しぐ約 55。/0以上であることがより好ましぐ約 60。/o以上であることがより好ましぐ約 6 5%以上であることがさらに好ましぐ約 70%以上であることがいっそう好ましぐ約 80 Q/o以上であることが特に好ましぐ約 90。/o以上であることが最も好ましい。
[0270] 本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 57 °Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性 は、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の約 10% 以上であることが好ましぐ約 20%以上であることがより好ましぐ約 30%以上である ことがより好ましぐ約 40%以上であることがより好ましぐ約 50%以上であることがよ り好ましぐ約 55%以上であることがより好ましぐ約 60%以上であることがより好まし ぐ約 65%以上であることがさらに好ましぐ約 70%以上であることがいっそう好ましく 、約 80%以上であることが特に好ましぐ約 90%以上であることが最も好ましい。
[0271] 本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 60 °Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性 は、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の約 5% 以上であることが好ましぐ約 10%以上であることがより好ましぐ約 15%以上である ことがより好ましぐ約 20%以上であることがより好ましぐ約 25%以上であることがよ り好ましぐ約 30%以上であることがより好ましぐ約 35%以上であることがより好まし ぐ約 40%以上であることがさらに好ましぐ約 50%以上であることがいっそう好ましく 、約 60%以上であることが特に好ましぐ約 70%以上であることが最も好ましい。
[0272] 本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20%スクロースを含む 20mM Tris 緩衝液（ρΗ7· 0)中で 65°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼ の 37°Cにおける酵素活性は、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cに おける酵素活性の 10%以上であることがさらに好ましぐ約 20%以上であることがさ らに好ましぐ約 30%以上であることがさらに好ましぐ約 40%以上であることがさら に好ましぐ約 50%以上であることがさらに好ましぐ約 55%以上であることがさらに 好ましぐ約 60%以上であることがさらに好ましぐ約 65%以上であることがさらに好 ましぐ約 70%以上であることがいっそう好ましぐ約 80%以上であることが特に好ま しぐ約 90%以上であることが最も好ましい。なお、本明細書中でスクロースの濃度は 、 Weight/Volumeで、すなわち、
(スクロースの重量） X 100/ (溶液の容量）
で計算する。
[0273] (3. 2. 1 スクロースホスホリラーゼ（SP)活性測定法）
スクロースホスホリラーゼの活性単位は、当該分野で公知の任意の方法によって測 定され得る。例えば、下記の実施例の 1. 7に記載の方法によって求められる。
[0274] (3. 2. 2 耐熱性の測定法）
耐熱性は、以下の手順に従って測定され得る。
[0275] (i) 20%スクロースを含むかまたは含まなレ、、 2. 5-3. 5UZmlの酵素液（20mM
Tris緩衝液（pH7. 0)中）を 55°C、 57°C、 60°Cまたは 65°Cで 20分間インキュベー トする。
[0276] (ii) 20分後に取り出した酵素液を氷上に 10分間保持して冷却する。
[0277] (iii) (ii)の酵素液について、 SP活性測定法に従って 37°Cで酵素活性を測定する 。 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 55°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロース ホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性 A の割合は、加熱前の耐熱化スクロースホ 後
スホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性 A 力 、 (A ) ÷ (A ) X 100 (%)によって算 m 後 目リ
出される。加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの酵素活性 A に対する加熱後 の耐熱化スクロースホスホリラーゼの酵素活性 A の割合を、残存活性ともいう。
後
[0278] (3. 3 高温条件でのアミロースの収率）
本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを用いて、高温条件でアミロースを合成し 得る。本明細書中では、「高温条件でアミロースを合成し得る」とは、 58. 5mMスクロ ース、 ImMマルトテトラオース、 10mM無機リン酸、 lU/mlの Thermus aquatic us由来の α—グルカンホスホリラーゼ (以下の実施例の 2· 2に従って調製）および 1 U/mlの耐熱化スクロースホスホリラーゼを用いて、 50°Cにて 18時間インキュベート することによってアミロースを合成したときに合成されるアミロースの収率が 50%以上 であることをいう。この条件でアミロース合成を行った場合、アミロースの収率は好まし くは 60%以上であり、より好ましくは 70%以上であり、さらに好ましくは 80%以上であ り、最も好ましくは 90%以上である。
[0279] (3. 4 本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼの比活性）
本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、高温 (好ましくは 55°C)において高い 比活性を有する。比活性とは、スクロースホスホリラーゼの重量あたりの活性（U/g) をいう。
[0280] 本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを 5%スクロース、 250mM リン酸緩衝液 (pH7. 0)中で 55°Cで 15分間反応させた場合の比活性は、好ましくは少なくとも 20 U/mg以上であり、より好ましくは少なくとも 30U/mg以上であり、さらに好ましくは 少なくとも 40U/mgであり、さらに好ましくは少なくとも 50U/mgであり、さらに好ま しくは少なくとも 60UZmgであり、さらに好ましくは少なくとも 70UZmgであり、さらに 好ましくは少なくとも 80UZmgであり、さらに好ましくは少なくとも 90UZmgであり、 さらに好ましくは少なくとも 1 OOU/mgであり、さらに好ましくは少なくとも 11 OU/mg であり、さらに好ましくは少なくとも 120UZmgであり、さらに好ましくは少なくとも 130 UZmgであり、さらに好ましくは少なくとも 140U/mgであり、さらに好ましくは少なく とも 150U/mgであり、特に好ましくは少なくとも 160U/mgであり、最も好ましくは 少なくとも 180U/mgである。
[0281] 本発明の耐熱化 SP酵素は、天然の SP酵素と比較して、高温での比活性が高くか つ高温での残存活性が高いことが好ましい。
[0282] (4.本発明の酵素を用いた α -グノレカンの製造方法）
本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、 α—ダルカンの製造方法において有 利に用いられ得る。本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを用いるグルカンの製 造方法は、当該分野で公知の任意の α—グルカンの製造方法であり得る力 スクロー スとプライマーにスクロースホスホリラーゼと α—グルカンホスホリラーゼを同時に作用 させる方法（SP— GP法ともいう）において用いることが好ましい。 SP—GP法は、安価 な基質を用いて直鎖状グルカンを製造できるという利点を有する。
[0283] 本発明の α—グノレカンの合成方法は、本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼと、 α—グルカンホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはダルコ一 ス一 1一リン酸とを含む反応溶液を反応させて、 ひ—グノレカンを生産する工程を包含す る。
[0284] 本明細書中では「ひ—グルカン」とは、 D—グルコースを構成単位とする、糖であって 、 α -1, 4—グノレコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも 2糖単位以上有す る糖をいう。 ひ—グルカンは、直鎖状、分岐状または環状の分子であり得る。直鎖状グ ルカンとひ— 1， 4—グルカンとは同義語である。直鎖状ひ—ダルカンでは、 ひ— 1 , 4— グノレコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。 ひ _1， 6—ダルコシド結 合を 1つ以上含む α -グノレカンは、分岐状 α -グノレカンである。 α _グルカンは、好ま しくは、直鎖状の部分をある程度含む。分岐のない直鎖状 α—グノレカンがより好まし レ、。
[0285] ひ—グルカンは、場合によっては、分岐の数（すなわち、 ひ—1 , 6—ダルコシド結合 の数）が少ないことが好ましレ、。このような場合、分岐の数は、代表的には 0—10000 個、好ましくは 0— 1000個、より好ましくは 0— 500個、さらに好ましくは 0 100個、 さらに好ましくは 0— 50個、さらに好ましくは 0— 25個、さらに好ましくは 0個である。
[0286] 本発明のひ—グルカンでは、 ひ—1 , 6—ダルコシド結合を 1としたときのひ _1， 6—グ ルコシド結合の数に対するひ—1 , 4—ダルコシド結合の数の比は、好ましくは 1一 100 00であり、より好ましくは 10 5000であり、さらに好ましくは 50— 1000であり、さらに 好ましくは 100 500である。
[0287] ひ— 1， 6—グノレコシド結合は、 ひ—グノレカン中に無秩序に分布していてもよいし、均 質に分布していてもよい。 α—グルカン中に糖単位で 5個以上の直鎖状部分ができる 程度の分布であることが好ましレ、。
[0288] α—グルカンは、 D—グルコースのみ力 ら構成されていてもよいし、 α—グルカンの性 質を損なわなレ、程度に修飾された誘導体であってもよレ、。修飾されてレ、なレ、ことが好 ましい。
[0289] α—グルカンは、代表的には約 8 X 103以上、好ましくは約 1 X 104以上、より好まし くは約 5 X 104以上、さらに好ましくは約 I X 105以上、さらに好ましくは約 6 X 105以 上の分子量を有する。 ひ_グルカンは、代表的には約 1 X 108以下、好ましくは約 1 X 107以下、さらに好ましくは約 5 X 106以下、さらに好ましくは約 I X 106以下の分子量 を有する。
[0290] 当業者は、本発明の製造方法で用いられる基質の量、酵素の量、反応時間などを 適宜設定することによって所望の分子量のひ—グノレカンが得られることを容易に理解 する。
[0291] 生産効率の良い SP— GP法は、国際公開第 02Z097107号パンフレットに記載さ れる。
[0292] 本発明の製造方法では、例えば、耐熱化スクロースホスホリラーゼと、 ひ—グノレカン ホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース _1_リン酸 と、緩衝剤と、それを溶力している溶媒とを主な材料として用いる。これらの材料は通 常、反応開始時に全て添加される力 反応の途中でこれらのうちの任意の材料を追 カロして添加してもよい。本発明の製造方法では、必要に応じて、枝切り酵素、ブラン チングェンザィム、 4_ひ—グルカノトランスフェラーゼぉよびグリコーゲンデブランチン グェンザィムからなる群より選択される酵素を用いることができる。枝切り酵素、ブラン チングェンザィム、 4_ひ—グルカノトランスフェラーゼぉよびグリコーゲンデブランチン グェンザィムからなる群より選択される酵素は、 目的とするひーグルカンの構造に応じ て、本発明の製造方法の最初から反応溶液中に添加してもよぐ途中から反応溶液 中に添加してもよい。
[0293] 反応開始時の溶液中に含まれるスクロースホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶 液中のスクロースに対して、代表的には約 0. 05- 1 , 000U/gスクロース、好ましく は約 0. 1— 500U/gスクロース、より好ましくは約 0· 5— 100U/gスクロースである 。スクロースホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しや すくなる場合がある。使用量が少なすぎると、 α—グルカンの収率が低下する場合が ある。
[0294] 本明細書中では、「α—グルカンホスホリラーゼ」とは、 α—グルカンホスホリラーゼ活 性を有する酵素を意味する。 α—グノレカンホスホリラーゼは、 EC2. 4. 1. 1に分類さ れる。 α—グルカンホスホリラーゼ活性とは、無機リン酸と 4—グルカンとから、グ ルコース _1一リン酸および α _1 , 4—グノレカンの部分分解物とを作る反応またはその 逆反応を触媒する活性をいう。 α—グノレカンホスホリラーゼは、ホスホリラーゼ、スター チホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼなどと 呼ばれる場合もある。 ひ—グノレカンホスホリラーゼは、カロリン酸分解の逆反応であるひ -1 , 4—グノレカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の 量に依存する。生体内では、無機リン酸の量が多いので、 ひ—グノレカンホスホリラー ゼは加リン酸分解の方向に反応が進む。無機リン酸の量が少ないと、 α -1 , 4一ダル カンの合成の方向に反応が進む。
[0295] 全ての既知のひ—グルカンホスホリラーゼは、活性のためにピリドキサール 5 ' _リン 酸を必要とし、そして類似した触媒機構を共有するようである。異なった起源に由来 する酵素は、基質の優先性および調節形態が異なっている力 全ての α—グルカン ホスホリラーゼは、多数の α—グルカンホスホリラーゼを含む大きなグループに属する 。この大きなグループは、細菌、酵母および動物由来のグリコーゲンホスホリラーゼ、 植物由来のデンプンホスホリラーゼ、ならびに細菌由来のマルトオリゴサッカリドホス ホリラーゼを含む。
[0296] ひ—グルカンホスホリラーゼのひ—グルカン合成反応のための最小のプライマー分 子はマルトテトラオースであることが報告されている。 ひーグルカン分解反応のために 有効な最小の基質はマルトペンタオースであることも報告されている。一般に、これら は、 ひ—グノレカンホスホリラーゼに共通の特徴であると考えられていた。しかし、近年、 Thermus thermophilus由来のひ一グ /レカンホスホリフーセぉょ Ό、丄、hermococcu s litoralis由来のひ—グルカンホスホリラーゼは、他のひ—グルカンホスホリラーゼと は異なる基質特異性を有すると報告されている。これらの α—グルカンホスホリラーゼ につレ、ては、 α—グルカン合成にっレ、ての最小のプライマーがマルトトリオースであり 、 α—グルカン分解についての最小の基質がマルトテトラオースである。
[0297] α—グルカンホスホリラーゼは、デンプンまたはグリコーゲンを貯蔵し得る種々の植 物、動物および微生物中に普遍的に存在すると考えられる。
[0298] α—グルカンホスホリラーゼを産生する植物の例としては、馬鈴薯（ジャガイモともい う）、サッマイモ、ャマイモ、サトイモ、キヤッサバなどの芋類、キャベツ、ホウレンソゥな どの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、ォォムギ、ライムギ、ァヮなどの穀類、ソラマ メ、エンドゥマメ、ダイズ、ァズキ、ゥズラマメなどの豆類、 Arabidopsis thalianaなど の実験植物、柑橘類、藻類などが挙げられる。
[0299] ひ—グルカンホスホリラーゼを産生する動物の例としては、ヒト、ゥサギ、ラット、ブタ などの哺乳類などが挙げられる。
[0300] ひ—グルカンホスホリラーゼを産生する微生物の例としては、 Thermus aquaticus 、 Bacillus stearothermophilus^ E. coliなど力挙げられる。
[0301] ひ—グルカンホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されなレ、。 ひ—グルカン ホスホリラーゼは、天然のひ—グルカンホスホリラーゼであっても、天然のひ—グルカン ホスホリラーゼに変異を導入することによって耐熱性を向上させた耐熱化 α—グルカ ンホスホリラーゼであってもよい。
[0302] 本発明の方法に用いられる α -グノレカンホスホリラーゼは、植物または動物由来で あることが好ましぐ植物由来であることがより好ましい。一般に、植物由来の天然の ひ—グルカンホスホリラーゼは、高分子量のアミロースを合成する能力を有する。しか し、これらのひ—グノレカンホスホリラーゼは耐熱性がなレ、。そのため、高温 (例えば、約 60°C以上）では反応を触媒できない。そのため、馬鈴薯由来の SPの反応至適温度 に合わせて反応を約 30°C—約 40°Cで行うと、雑菌汚染という問題またはひ—グノレ力 ンの老化とレ、う問題が生じ、 α—グノレカンまたは G_1_Pを効率よく生産できなレ、。
[0303] ひ—グルカンホスホリラーゼは、 ひ—グルカンホスホリラーゼを産生する任意の生物 由来であり得る。 ひ—グルカンホスホリラーゼは、ある程度の耐熱性を有することが好 ましい。 ひ—グノレカンホスホリラーゼは、耐熱性が高ければ高いほど好ましい。例えば 、 α—グルカンホスホリラーゼを 20mM Tris緩衝液（ρΗ7· 0)中で 60°Cで 10分間 加熱した後の α—グノレカンホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性力 該加熱前の ひ-ダルカンホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20%以上であることが好まし レ、。
[0304] α—グルカンホスホリラーゼは、天然の α—グルカンホスホリラーゼであってもよぐあ るいは、耐熱性を向上させるために特定の位置に変異を導入した耐熱化 α—グルカ ンホスホリラーゼであってもよい。このような位置は、 GPモチーフ配歹 IJ1L : H_A_E_ F— T一 P— V— F_S中の 4位に相当する位置もしくは GPモチーフ配列 1H： H— A— Q_ Y-S-P-H-F-S中の 4位に相当する位置、 GPモチーフ配列 2： A— L_G_N_G_ G—L—G中の 4位に相当する位置、および GPモチーフ配列 3L : R_I_V_K_F_I_T -D-V中の 7位に相当する位置もしくは GPモチーフ配列 3H： R-I-V-K-L-V-N _D— V中の 7位に相当する位置（あるいは、天然の馬鈴薯タイプ L ひ—グルカンホス ホリラーゼの成熟アミノ酸配列の 39位フヱニルァラニン (F39)に相当する位置、 135 位ァスパラギン（N135)に相当する位置および 706位トレオニン (T706)に相当する 位置）からなる群より選択される少なくとも 1つの位置であり得る。 ひ—グルカンホスホリ ラーゼにおけるこれらの特定の位置は、 SPと同様にマルチプルァライメントを用いて 決定され得る。なお、 GPモチーフ配列の特定の位置に相当する位置は、 GENETY X— WIN Ver. 4. 0 (株式会社ゼネテイツタス）のマルチプルァライメントを前述の条 件で実施してもよく、マキシマムマッチングを、 Matches =-1； Mismatches = 1； Ga ps = 0 ; * N+ = 2の条件で実施してもよい。
[0305] GPモチーフ配歹 1J1Lもしくは 1H中の 4位、または F39に相当する位置におけるアミ ノ酸残基は、脂肪族アミノ酸または複素環式アミノ酸であることが好ましぐ脂肪族アミ ノ酸であることがより好ましぐ分枝アミノ酸 (すなわち、ノ リン、ロイシンまたはイソロイ シン）であることが特に好ましぐイソロイシンまたはロイシンであることが殊に好ましぐ ロイシンであることが最も好ましレ、。
[0306] GPモチーフ配列 2中の 4位または N135に相当する位置におけるアミノ酸残基は、 脂肪族アミノ酸または複素環式アミノ酸であることが好ましぐァラニン、システィン、ァ スパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチォニン 、フエ二ルァラニン、セリン、トレオニン、ノくリンまたはチロシンであることがより好ましく 、システィン、グリシン、セリンまたはバリンであることが特に好ましい。
[0307] GPモチーフ配列 3Lもしくは 3H中の 7位または T706に相当する位置におけるアミ ノ酸残基は、脂肪族アミノ酸であることが好ましぐ分枝アミノ酸 (すなわち、ノ リン、口 イシンまたはイソロイシン)または含硫アミノ酸（すなわち、システィン、シスチン、メチ ォニン）であることがより好ましぐシスティン、イソロイシン、ロイシン、バリンまたはトリ プトファンであることが特に好ましぐシスティン、イソロイシン、ロイシン、またはバリン であることが特に好ましぐイソロイシンであることが最も好ましい。
[0308] α—グルカンホスホリラーゼは、これらの 3つ全ての位置において改変されているこ とが好ましい。
[0309] ひ—グルカンホスホリラーゼは、馬鈴薯、サツマィモ、ソラマメ、 Arabidopsis thalia na、ホウレンソゥ、トウモロコシ、イネ、小麦または柑橘類に由来することが好ましぐ 馬鈴薯、サツマィモ、ソラマメ、 Arabidopsis thaliana,ホウレンソゥ、トウモロコシま たはイネに由来することがより好ましぐ馬鈴薯に由来することが最も好ましい。 ひ—グ ルカンホスホリラーゼは、タイプ Lのひ—グルカンホスホリラーゼに由来することが好ま しレ、。 ひ—グルカンホスホリラーゼは、馬鈴薯のタイプ L、 L2もしくは H、サツマィモの タイプ Lもしくは H、ソラマメのタイプ Lもしくは H、 Arabidopsis thalianaのタイプ Lも しくは H、ホウレンソゥのタイプ L、トウモロコシのタイプ L、イネのタイプ Lもしくは H、小 麦のタイプ Hまたは柑橘類のタイプ Hの α—グルカンホスホリラーゼに由来することが 好ましぐ馬鈴薯のタイプ Lもしくは L2、サツマィモのタイプ L、ソラマメのタイプ: L、 Ar abidopsis thalianaのタイプ L、ホウレンソゥのタイプ L、トウモロコシのタイプ Lまた はイネのタイプ Lのひ—グルカンホスホリラーゼに由来することがより好ましぐ馬鈴薯 のタイプ L ひ一グルカンホスホリラーゼまたは Arabidopsis thalianaのタイプ H a —グルカンホスホリラーゼに由来することがより好ましぐ馬鈴薯のタイプ L ひーグルカ ンホスホリラーゼに由来することが最も好ましい。 ひーグルカンホスホリラーゼは、耐熱 化されていることが好ましい。
[0310] 本発明の方法で用いられるひーグルカンホスホリラーゼは、例えば、以下のようにし て調製され得る。まず、 ひ—グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌 、真菌など）を培養する。この微生物は、 α—グノレカンホスホリラーゼを直接生産する 微生物であってもよレ、。また、 α—グノレカンホスホリラーゼをコードする遺伝子をクロー ン化し、得られた遺伝子で α _グルカンホスホリラーゼ発現に有利な微生物（例えば 、細菌、真菌など）を遺伝子組換えして組換えされた微生物を得、得られた微生物か ら α—グルカンホスホリラーゼを得てもよレ、。あるいは、得られた遺伝子を、上記のよう な特定のアミノ酸位置での改変を含むように改変した後、 α—グノレカンホスホリラーゼ 発現に有利な微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えして組換えされた微 生物を得、得られた微生物から耐熱化 α—グルカンホスホリラーゼを得てもよレ、。例え ば、馬鈴薯由来の α -グノレカンホスホリラーゼ遺伝子を用いて大腸菌を遺伝子組換 えすることによって得られる組換え馬鈴薯ひ—グノレカンホスホリラーゼの調製方法は、 国際公開第 02/097107号パンフレットに記載される。
[0311] ひ—グルカンホスホリラーゼ遺伝子での遺伝子組換えに用いられる微生物は、 ひ— グノレカンホスホリラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの 種々の条件を考慮して容易に選択され得る。 ひ—グルカンホスホリラーゼは、夾雑物 としてアミラーゼを含まなレ、ことが好ましレ、ので、アミラーゼを産生しなレ、かまたは低レ ベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いるこ とが好ましい。 α—グルカンホスホリラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌また は枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しない力または低 レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生される α—グ ルカンホスホリラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使 用に好ましい。
[0312] 第一の（例えば、天然の）ひ—グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子は、耐熱 性に寄与する特定の位置のアミノ酸残基を変更するために、当該分野で公知の方法 によって改変され得る。このような改変方法の例としては、例えば、部位特異的変異 誘発法、変異原を用いた変異誘発法（対象遺伝子を亜硝酸塩などの変異剤で処理 すること、紫外線処理を行うこと）、エラープローン PCRを行うことが挙げられる。
[0313] クローン化した遺伝子での微生物（例えば、細菌、真菌など）の遺伝子組換えは、 当業者に周知の方法に従って行われ得る。クローン化した遺伝子を用いる場合、こ の遺伝子を、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結する ことが好ましい。 「作動可能に連結する」とは、プロモーターと遺伝子とが、そのプロモ 一ターによって遺伝子の発現が調節されるように連結されることをいう。誘導性プロモ 一ターを用いる場合、培養を、誘導条件下で行うことが好ましい。種々の誘導性プロ モーターは当業者に公知である。
[0314] クローン化した遺伝子について、生産される α—グノレカンホスホリラーゼが菌体外に 分泌されるように、シグナルペプチドをコードする塩基配列をこの遺伝子に連結し得 る。シグナルペプチドをコードする塩基配列は当業者に公知である。
[0315] 当業者は、 α—グノレカンホスホリラーゼを生産するために、微生物（例えば、細菌、 真菌など）の培養の条件を適切に設定し得る。微生物の培養に適切な培地、各誘導 性プロモーターに適切な誘導条件などは当業者に公知である。
[0316] 適切な時間の培養後、 ひ—グルカンホスホリラーゼを培養物から回収する。生産さ れたひーグルカンホスホリラーゼが菌体外へ分泌される場合、遠心分離によって菌体 を除去すれば、上清中にひ—グノレカンホスホリラーゼが得られる。菌体内で生産され たひ—グルカンホスホリラーゼが菌体外へ分泌されない場合、超音波処理、機械的破 砕、化学的破砕などの処理によって微生物を破砕し、菌体破砕液を得る。 [0317] 本発明の方法では、菌体破砕液を精製せずに用いてもよい。次いで、菌体破砕液 を遠心分離して菌体の破片を除去し、上清を入手し得る。得られたこれらの上清から 、本発明の酵素を、硫酸アンモニゥム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオン または陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性 相互作用クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト クロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって回収し 得る。回収された生成物は、必要に応じて精製され得る。
[0318] 好ましい実施態様では、 ひ—グノレカンホスホリラーゼは、精製段階の任意の段階で 加熱され得る。この加熱工程における溶液の温度は、この溶液を 30分間加熱した場 合に、加熱前のこの溶液に含まれるひ—グルカンホスホリラーゼの活性の 50%以上、 より好ましくは 80%以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は好ましく は約 50°C 約 70°Cであり、より好ましくは約 55°C—約 65°Cである。例えば、耐熱化 された馬鈴薯由来タイプ L α—グルカンホスホリラーゼの場合、この温度は約 50°C 一約 60°Cであることが好ましい。加熱が行われる場合、加熱時間は、反応温度を考 慮して、 α _グルカンホスホリラーゼの活性を大きく損なうことがない限り、任意の時間 で設定され得る。加熱時間は、代表的には約 10分間一約 90分間、より好ましくは約 30分間一約 60分間である。
[0319] 反応開始時の溶液中に含まれる α—グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の 溶液中のスクロースに対して、代表的には約 0. 05- 1, 000U/gスクロース、好まし くは約 0. 1— 500U/gスクロース、より好ましくは約 0· 5— 100U/gスクロースであ る。 α—グノレカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集し やすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、 ひーグルカンの収率が低下する場合 力 Sある。
[0320] スクロースは、 C Η 〇 で示される、分子量約 342の二糖である。スクロースは、
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光合成能を有するあらゆる植物中に存在する。スクロースは、植物から単離されても ょレ、し、化学的に合成されてもよい。コストの面からみて、スクロースを植物から単離 することが好ましい。スクロースを多量に含む植物の例としては、サトウキビ、サトウダ イコンなどが挙げられる。サトウキビは、汁液中に約 20%のスクロースを含む。サトウ ダイコンは、汁液中に約 10— 15%のスクロースを含む。スクロースは、スクロースを含 む植物の汁液から精製糖に至るいずれの精製段階のものとして提供されてもよい。
[0321] 本発明の製造方法に用いられる耐熱化スクロースホスホリラーゼおよび α—グノレ力 ンホスホリラーゼはそれぞれ、精製酵素または粗酵素を問わず、固定化されたもので も反応に使用し得、反応の形式は、バッチ式でも連続式でもよい。固定化の方法とし ては、担体結合法、 （例えば、共有結合法、イオン結合法、あるいは物理的吸着法）、 架橋法あるいは包括法 (格子型あるいはマイクロカプセル型）が使用され得る。
[0322] プライマーの例としては、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロぺクチン、グリコーゲン、 デキストリン、プルラン、カップリングシュガー、澱粉およびこれらの誘導体が挙げられ る。
[0323] 本明細書中において、無機リン酸とは、 SPの反応においてリン酸基質を供与し得る 物質をいう。ここでリン酸基質とは、グルコース _1_リン酸のリン酸部分 (moiety)の原 料となる物質をいう。スクロースホスホリラーゼによって触媒されるスクロースカロリン酸 分解において、無機リン酸はリン酸イオンの形態で基質として作用していると考えら れる。当該分野ではこの基質を慣習的に無機リン酸というので、本明細書中でも、こ の基質を無機リン酸という。無機リン酸には、リン酸およびリン酸の無機塩が含まれる 。通常、無機リン酸は、アルカリ金属イオンなどの陽イオンを含む水中で使用される。 この場合、リン酸とリン酸塩とリン酸イオンとは平衡状態になるので、リン酸とリン酸塩 とは区別をしにくい。従って、便宜上、リン酸とリン酸塩とを合わせて無機リン酸という 。本発明において、無機リン酸は好ましくは、リン酸の任意の金属塩であり、より好ま しくはリン酸のアルカリ金属塩である。無機リン酸の好ましい具体例としては、リン酸二 水素ナトリウム、リン酸水素ニナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リ ン酸水素二カリウム、リン酸三カリウム、リン酸（H PO )、リン酸二水素アンモニゥム、
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リン酸水素二アンモニゥムなどが挙げられる。
[0324] 無機リン酸は、反応開始時の SP— GP反応系において、 1種類のみ含有されてもよ ぐ複数種類含有されてもよい。
[0325] 無機リン酸は、例えば、ポリリン酸（例えば、ピロリン酸、三リン酸および四リン酸）の ようなリン酸縮合体またはその塩を、物理的、化学的または酵素反応などによって分 解したものを反応溶液に添加することによって提供され得る。
[0326] 本明細書において、グルコース _1_リン酸とは、グルコース _1_リン酸（C H O P)
6 13 9 およびその塩をいう。グノレコース一 1一リン酸は好ましくは、狭義のグノレコース— 1一リン 酸（C H O P)の任意の金属塩であり、より好ましくはグルコース _1_リン酸（C H
6 13 9 6 13
O P)の任意のアルカリ金属塩である。グルコース _1_リン酸の好ましい具体例として
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は、グルコース— 1—リン酸ニナトリウム、グルコース— 1—リン酸二カリウム、グルコース— 1-リン酸 (C H O P)、などが挙げられる。本明細書において、括弧書きで化学式を
6 13 9
書いていないグルコース _1_リン酸は、広義のグルコース _1_リン酸、すなわち狭義 のグルコース _1_リン酸（C H O P)およびその塩を示す。
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[0327] グノレコース一 1一リン酸は反応開始時の SP— GP反応系において、 1種類のみ含有さ れてもよぐ複数種類含有されていてもよい。
[0328] 本発明のひ—グノレカン製造方法において、 ひ—1 , 6—ダルコシド結合を含有する出 発材料を用いる場合などの、生成物に分岐が生じる場合には、必要に応じて、枝切り 酵素を用いることができる。
[0329] 本発明で用いられ得る枝切り酵素は、 a -1 , 6—ダルコシド結合を切断し得る酵素 である。枝切り酵素は、アミロぺクチンおよびグリコーゲンにともによく作用するイソアミ ラーゼ（EC 3. 2. 1. 68)と、アミロぺクチン、グリコーゲンおよびプルランに作用す る α—デキストリンエンド— 1 , 6— α—ダルコシダーゼ（プルラナーゼともいう）（EC 3. 2. 1. 41)との 2つに分類される。
[0330] 枝切り酵素は、微生物、細菌、および植物に存在する。枝切り酵素を産生する微生 物の例としては、 Saccnaromyces cerevisiae、 Chlamydomonas sp. ¾挙げら れる。枝切り酵素を産生する細菌の例としては、 Bacillus brevis、 Bacillus acido pullulyticus^ Bacillus macerans、 Bacillus stearothermophilus^ Bacillus circulans、 Thermus aquaticus、 Klebsiella pneumoniae^ Thermoactinomy ces thalpophilus^ Thermoanaerobacter ethanolicus^ Pseudomonas amyl oderamosaなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する植物の例としては、ジャガイモ 、サツマィモ、トウモロコシ、イネ、コムギ、ォォムギ、オートムギ、サトウダイコンなどが 挙げられる。枝切り酵素を産生する生物はこれらに限定されない。 [0331] 本発明の方法において、生成物に分岐を生じさせることが所望される場合には、必 要に応じて、ブランチングェンザィムを用いることができる。
[0332] 本発明で用いられ得るブランチングェンザィムは、 a -1 , 4ーグルカン鎖の一部をこ のひ— 1， 4ーグルカン鎖のうちのあるグノレコース残基の 6位に転移して分枝を作り得る 酵素である。ブランチングェンザィムは、 1， 4一ひーグルカン分枝酵素、枝つくり酵素 または Q酵素とも呼ばれる。
[0333] ブランチングェンザィムは、微生物、動物、および植物に存在する。ブランチングェ ンザィムを産生する微生物の例としては、 Bacillus stearothermophilus, Bacillu s subtilis、 Bacillus caldolyticus^ Bacillus lichemformis、 Bacillus amylol iquefaciens、 Bacillus coagulans、 Bacillus caldovelox、 Bacillus thermoca tenulatus、 Bacillus smithii、 Bacillus megaterium、 Bacillus brevis、 Alkal ophillic Bacillus sp. 、 Streptomyces coelicolor、 Aquifex aeolicus、 Syne chosystis sp. 、 E. coli、 Agrobacteirum tumefaciens、 Thermus aquaticus 、 Rhodothermus obamensis、 Neurospora crassa、酵母など力孕げられる。ブ ランチングェンザィムを産生する動物の例としてはヒト、ゥサギ、ラット、ブタなどの哺 乳類が挙げられる。ブランチングェンザィムを産生する植物の例としては、藻類、ジャ ガイモ、サッマイモ、ャマイモ、キヤッサバなどの芋類、ホウレンソゥなどの野菜類、ト ゥモロコシ、イネ、コムギ、ォォムギ、ライムギ、ァヮなどの穀類、えんどう豆、大豆、小 豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。ブランチングェンザィムを産生する生物は これらに限定されない。
[0334] 本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて 、 4- a—ダルカノトランスフェラーゼを用いることができる。
[0335] 本発明で用いられ得る 4—ひ—ダルカノトランスフェラーゼは、デイスプロポーシヨネ 一ティングェンザィム、 D—酵素、アミ口マルターゼ、不均化酵素などとも呼ばれ、マル トオリゴ糖の糖転移反応（不均一化反応）を触媒し得る酵素である。 4- a—グルカノト ランスフェラーゼは、供与体分子の非還元末端からダルコシル基あるいは、マルトシ ノレもしくはマルトオリゴシノレユニットを受容体分子の非還元末端に転移する酵素であ る。従って、酵素反応は、最初に与えられたマルトオリゴ糖の重合度の不均一化をも たらす。供与体分子と受容体分子とが同一の場合は、分子内転移が生じ、その結果 、環状構造をもつ生成物が得られる。
[0336] 4_ α _ダルカノトランスフェラーゼは、微生物および植物に存在する。 4_ α _ダル カノトランスフェラーゼを産生する微生物の例としては、 Aquifex aeolicus、 Strept ococcus pneumoniae^ し lostridmm buty丄 icum、 Demococcus radiodurans 、 Haemophilus influenzae、 Mycobacterium tuberculosis、 Thermococcus litralis^ I hermotoga maritima^ Thermotoga neapolitana^ Chlamydia p sittaci、 Pyrococcus sp. 、 Dictyoglomus thermophilum^ Borrelia burgdor feri、 Synechosystis sp. 、 E. coli、 Thermus aquaticusなど力 げられる。 4_ ひ—ダルカノトランスフェラーゼを産生する植物の例としては、ジャガイモ、サッマイモ 、ャマイモ、キヤッサバなどの芋類、トウモロコシ、イネ、コムギなどの穀類、えんどう豆 、大豆などの豆類などが挙げられる。 4—ひ-ダルカノトランスフェラーゼを産生する生 物はこれらに限定されない。
[0337] 本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて 、グリコーゲンデブランチングェンザィムを用いることができる。
[0338] 本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングェンザィムは、 α— 1 , 6—ダルコ シダーゼ活性と、 4- aーグノレカノトランスフェラーゼ活性との 2種類の活性をもつ酵素 である。グリコーゲンデブランチングェンザィムが持つ、 4_ α _ダルカノトランスフェラ ーゼ活性により、環状構造を持つ生成物が得られる。
[0339] グリコーゲンデブランチングェンザィムは、微生物および動物に存在する。グリコー ゲンデブランチングェンザィムを産生する微生物の例としては、酵母などが挙げられ る。グリコーゲンデブランチングェンザィムを産生する動物の例としては、ヒト、ゥサギ
、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。グリコーゲンデブランチングェンザィムを産 生する生物はこれらに限定されない。
[0340] 本発明の製造方法に用いる溶媒は、スクロースホスホリラーゼぉよびひ—グルカンホ スホリラーゼの酵素活性を損なわない溶媒であれば任意の溶媒であり得る。
[0341] なお、 ひーグルカンを生成する反応が進行し得る限り、溶媒が本発明の製造方法に 用レ、る材料を完全に溶解する必要はなレ、。例えば、酵素が固体の担体上に担持さ れている場合には、酵素が溶媒中に溶解する必要はない。さらに、スクロースなどの 反応材料も全てが溶解している必要はなぐ反応が進行し得る程度の材料の一部が 溶解していればよい。
[0342] 代表的な溶媒は、水である。溶媒は、上記スクロースホスホリラーゼまたはひ—ダル カンホスホリラーゼを調製する際にスクロースホスホリラーゼまたはひ一グノレカンホスホ リラーゼに付随して得られる細胞破砕液のうちの水分であってもよい。
[0343] スクロースホスホリラーゼと、 ひ一グルカンホスホリラーゼと、スクロースと、プライマー と、無機リン酸またはグルコース— 1一リン酸とを含む溶液中には、スクロースホスホリラ ーゼとスクロースとの間の相互作用およびひ一グルカンホスホリラーゼとプライマーと の間の相互作用を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例 としては、緩衝剤、スクロースホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌 など）の成分、 ひ—グノレカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌な ど）の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。
[0344] これらの材料の使用量は、公知であり、当業者によって適切に設定され得る。
[0345] 本発明の製造方法においては、まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば 、適切な溶媒に、スクロースホスホリラーゼと、 α—グルカンホスホリラーゼと、固体状 のスクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグノレコース _1_リン酸とを添カ卩するこ とにより調製され得る。あるいは、反応溶液は、スクロースホスホリラーゼ、 α _ダル力 ンホスホリラーゼ、スクロース、プライマー、または無機リン酸もしくはグノレコース— 1ーリ ン酸をそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、反応溶 液は、スクロースホスホリラーゼと、 α—グルカンホスホリラーゼと、スクロースと、プライ マーと、無機リン酸またはグルコース _1_リン酸とのうちのいくつかの成分を含む溶液 に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。この反応溶液には、酵 素反応を阻害しない限り、必要に応じて、 ρΗを調整する目的で任意の緩衝剤を加え てもよレ、。この反応溶液には、必要に応じて枝切り酵素、ブランチングェンザィム、 4- ひ—ダルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングェンザィムからなる 群より選択される酵素を添加してもよレ、。
[0346] 次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することに より、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る
。反応開始時の反応溶液中のスクロース濃度が約 5—約 100%である場合には、反 応温度は代表的には、約 40°C—約 70°Cの温度であり得る。この反応工程における 溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるスクロースホスホ リラーゼおよびひーグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方、好ましくは両方の活性 の約 50%以上、より好ましくは約 80%以上の活性が残る温度であることが好ましい。 この温度は好ましくは約 50°C—約 70°Cであり、より好ましくは約 55°C 約 70°C、さら により好ましくは約 55°C 約 65°Cである。
[0347] 反応時間は、反応温度、反応により生産されるひーグルカンの分子量および酵素の 残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約 1時 間一約 100時間、より好ましくは約 1時間一約 72時間、さらにより好ましくは約 2時間 一約 36時間、最も好ましくは約 2時間一約 24時間である。
[0348] このようにして、 α _グルカンを含有する溶液が生産される。
[0349] 本発明の耐熱化 SPとしては、実施例 4と同じ条件下で用いて 55°Cで反応を行った 場合、天然の SPよりもアミロースの収率が高レ、ものが好ましい。この場合のアミロース の収率は、 5%以上であることが好ましぐ 10%以上であることがより好ましぐ 20% 以上であることがさらに好ましぐ 30%以上であることが最も好ましい。このような条件 を満たす耐熱化 SPは、実施例 4と同じ条件下で反応を行い、アミロースの収率を決 定することによって選択され得る。
[0350] (5.本発明の酵素を用いたグルコース 1 リン酸の合成方法）
本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、グノレコース _ι—リン酸の合成方法に おいても有利に用いられ得る。本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを用いるグ ルコース— 1—リン酸の合成方法は、当該分野で公知の任意のグルコース— 1—リン酸 の合成方法であり得る。
[0351] 本発明のグルコース— 1—リン酸の合成方法は、本発明の耐熱化スクロースホスホリ ラーゼ、スクロースおよび無機リン酸を含む反応溶液を反応させて、グルコース一 1ーリ ン酸を生産する工程を包含する。
[0352] 本発明のグルコース _1_リン酸の合成方法において用いられるスクロースおよび無 機リン酸の定義は、上記 4と同様である。
[0353] グノレコース- 1-リン酸の合成方法に用いられる材料の使用量は、公知であり、当業 者によって適切に設定され得る。
[0354] 本発明のグルコース- 1-リン酸の合成方法においては、まず、反応溶液を調製す る。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、スクロースホスホリラーゼと、スクロースと、 無機リン酸とを添加することにより調製され得る。あるいは、反応溶液は、スクロースホ スホリラーゼ、スクロース、または無機リン酸をそれぞれ含む溶液を混合することによ つて調製してもよレ、。あるいは、反応溶液は、スクロースホスホリラーゼと、スクロースと 、無機リン酸とのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合するこ とによって調製してもよい。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に 応じて、 pHを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。
[0355] 次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することに より、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る 。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に 含まれるスクロースホスホリラーゼ活性の約 50%以上、より好ましくは 80%以上の活 性が残る温度であることが好ましい。この温度は好ましくは約 50°C— 70°Cであり、より 好ましくは約 55°C— 70°Cであり、さらにより好ましくは約 55°C— 65°Cである。
[0356] 反応時間は、反応温度および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され 得る。反応時間は、代表的には約 1時間一約 100時間、より好ましくは約 1時間一約 72時間、さらにより好ましくは約 2時間一約 36時間、最も好ましくは約 2時間一約 24 時間である。
[0357] このようにして、グルコース一 1一リン酸を含有する溶液が生産される。
[0358] 本発明の耐熱化 SPとしては、実施例 5と同じ条件下で用いて 55°Cで反応を行った 場合、天然の SPよりもグノレコース _1_リン酸の収率が高いものが好ましい。この場合 のグルコース一 1_リン酸の収率は、 5%以上であることが好ましぐ 10%以上であるこ とがより好ましぐ 20%以上であることがさらに好ましぐ 30。/ο以上であることがさらに 好ましぐ 40%以上であることがさらに好ましぐ 50%以上であることがさらに好ましく 、 60。/ο以上であることがさらに好ましぐ 70。/ο以上であることが特に好ましぐ 80。/ο以 上であることが最も好ましい。このような条件を満たす耐熱化 SPは、実施例 5と同じ条 件下で反応を行い、グルコース - 1 -リン酸の収率を決定することによって選択され得 る。
[0359] (6.本発明の酵素を用いたその他の製造方法）
本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼは、上記の製造方法以外にも、スクロース ホスホリラーゼを使用する、当該分野で公知の任意の製造方法において使用され得 る。このような方法は、例えば、グルコース重合体の合成方法である。この方法は、本 発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼと、 ひ—グノレコース _1_リン酸を基質とする第 二のホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース— 1—リ ン酸とを含む反応液を反応させて、グルコース重合体を生産する工程を包含する。 本明細書中では、「グルコース重合体」とは、重合体の一部にグノレコース残基を含む ものをいう。グルコース重合体の例としては、グルカン（例えば、 ひ—グルカンおよび j3 _1 , 3—グルカン）、セロビオース、セロオリゴ糖、ラミナリビオース、ラミナリオリゴ糖お よびトレハロースが挙げられる。グルコース重合体がひ_ダルカンの場合は、上記「4
.本発明の酵素を用いた α—ダルカンの製造方法」に記載の通りである。
[0360] α _グルカン以外のグノレコース重合体の製造方法の例としては、以下が挙げられる ：例えば、セロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼと組み合 わせた、セロビオースおよびセロオリゴ糖の製造（特許第 2815023号公報「セロピオ ースの製造方法」を参照のこと）；ラミナリビオースホスホリラーゼおよびラミナリデキス トリンホスホリラーゼと組み合わせた、ラミナリビオースおよびラミナリオリゴ糖の製造（ 特開平第 6-343484号公報「ラミナリオリゴ糖の製造方法」を参照のこと） ·， β— 1 , 3— グノレカンホスホリラーゼと組み合わせた、 j3 -l , 3—グルカンの製造 (特開平第 6— 34 3484号公報「ラミナリオリゴ糖の製造方法」を参照のこと）；トレハロースホスホリラー ゼと組み合わせたトレハロースの製造（特開平 7—327691「トレハロースの製造方法」 を参照のこと）などに使用され得る。これらの製造方法に本発明の耐熱化スクロース ホスホリラーゼを利用することは当業者に容易に行われ得る。このような方法に本発 明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを用いると、従来より高温で反応を行うことがで き、生成物の収率が向上する。 [0361] (7.本発明の製造方法によって得られた α—グルカンの用途）
本発明の製造方法によって得られた α—グノレカンは、グノレカンにっレ、て当該分野 で公知の用途に使用され得る。 α—グノレカンのなかでも特に、不溶性のアミロースに は、食物繊維と同様の働きが予想され、健康食品への利用も期待できる。さらに、アミ ロースは、例えばヨウ素、脂肪酸などを分子内に包接し得る特徴を持つことから、医 薬品、化粧品、サニタリー製品分野での用途が期待される。アミロースはまた、アミ口 ースと同様の包接能力を持つシクロデキストリンおよびシクロアミロースの製造用原料 に利用できる。さらに、アミロースを含有したフィルムは、汎用プラスチックに劣らない 引張強度を持ち、生分解性プラスチックの素材として非常に有望である。高分子量の アミロースはまた、キラル分画に適している。このようにアミロースには、多くの用途が 期待されている。
[0362] (8.本発明の合成方法によって得られたグルコース一 1一リン酸の用途）
本発明の合成方法によって得られたグノレコース- 1一リン酸は、グルコース一 1一リン 酸について当該分野で公知の用途に使用され得る。グルコース- 1-リン酸は、例え ば、医療用抗菌剤、抗腫瘍剤（白金錯体)、心臓病の治療薬 (ァミン塩)、グノレカン（ 例えば、 4—グノレカンまたは 3—グノレカン)合成の基質、セロビオース合 成の基質、セロオリゴ糖合成の基質、ラミナリビオース合成の基質、ラミナリオリゴ糖合 成の基質、トレハロース合成の基質として利用されている。
[0363] 以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的の みに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例 にも限定されるものではなぐ請求の範囲によってのみ限定される。
実施例
[0364] (1.測定方法および計算方法）
本発明における各種物質を、以下の測定方法によって測定した。
[0365] (1. 1 グルコースの定量）
グルコースを、市販されている測定キットを用いて定量した。グルコース AR— II発色 試薬 (和光純薬社製)を用いて測定する。
[0366] (1. 2 フルクトースの定量） フルクトースを、市販されている測定キットを用いて定量した。 F—キット D—ダルコ ース/ D-フルクトース（ロシュ社製）を用いて測定する。
[0367] ( 1. 3 グルコース _1—リン酸の定量）
グルコース _1_リン酸を、以下の方法により定量した。 300 μ ΐの測定試薬（200m M Tris - HCl (pH7. 0)、 3mM NADP、 15mM 塩化マグネシウム、 3mM ED TA、 15 μ Mグルコース一 1， 6_二リン酸、 6 μ g/ml ホスホダルコムターゼ、 6 μ g /ml グルコース- 6-リン酸脱水素酵素）に、適切に希釈したグルコース- 1-リン酸 を含む溶液 600 μ 1を加えて攪拌し、得られた反応混合物を 30°Cで 30分間反応させ る。その後、分光光度計を用いて 340nmでの吸光度を測定する。濃度既知のグノレコ ース -1-リン酸ナトリウムを用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。こ の標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のダルコース— 1—リン酸濃 度を求める。この定量法では、グノレコース— 1一リン酸のみが定量され、無機リン酸の 量は定量されない。
[0368] ( 1. 4 無機リン酸の定量）
無機リン酸を、リン酸イオンとして以下の方法により求めた。無機リン酸を含む溶液（ 200 μ 1)に対し、 800 β 1のモリブデン試薬（15mM モリブデン酸アンモニゥム、 100 mM 酢酸亜鉛）を混合し、続レ、て 200 μ 1の 568mMァスコルビン酸（ρΗ5· 0)を加 えて攪拌し、得られた反応混合物を 30°Cで 30分間反応させる。その後、分光光度計 を用いて 850nmでの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸 光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当て はめ、試料中の無機リン酸を求める。この定量法では、無機リン酸の量が定量され、 グルコース _1_リン酸の量は定量されない。
[0369] ( 1. 5 グルカンの収量の計算方法）
SP— GP法によりグルカンを合成した場合、出発物質として無機リン酸を用いて製造 したグノレカン (例えば、アミロース）の収量は、反応終了後の溶液中の、グルコース、 フルクトース、およびグルコース _1_リン酸の量から、以下の式により求められる。 [0370] [化 2]
グルカン （m M グルコース当量）
= (フルクトース （m M) ) - (グルコース-卜リン酸 （m M) ) ― (グルコース （m M ) )
[0371] この式は、以下の原理に基づく。
[0372] 本発明の方法では、まず、以下の式の反応 (A)が起き得る。
[0373] [化 3]
( A ) スクロース +無機リン酸→グルコース一 1一リン酸 + フルクトース
[0374] この反応は、スクロースホスホリラーゼにより触媒される。この反応では、スクロースと 無機リン酸とが反応して、同じモル量のグルコース 1 リン酸とフルクトースとが生じる 。生じたフルクトースはそれ以上他の物質と反応しないので、フルクトースのモル量を 測定することによって生じたグノレコース _1—リン酸のモル量がわかる。
[0375] スクロースホスホリラーゼは、上記の反応（A)の他に、以下の反応（B)のスクロース の加水分解も副反応として触媒し得る。
[0376] [化 4]
( B ) スクロース グルコース + フルク卜ース
[0377] グノレカンに取り込まれたグルコース量は以下によって計算される。
[0378] [化 5]
グルカンに取リ込まれたグルコース量
= (反応 Aにより生成されたダルコース-卜リン酸量） - (未反応のグルコース- 1 -リン酸量) = (反応 Aにより生成されたフルク I ^一ス量）—（未反応のグルコース- 1-リン酸量）
[0379] 反応（B)で生成するフルクトースを考慮すると、反応 Aにより生成されたフルクトース の量は、以下によって算出される：
[0380] [化 6]
(反応 Aにより生成されたフルク | ^一スの量）
= (反応終了後のフルクト一ス量） ― (反応終了後のグルコース量）
[0381] したがって、グルカンの収量は、以下の式により求められる。
[0382] [化 7]
(グルカン （m M グルコース当量)）
= (フルク I ^一ス （m M )) - (グルコース- 1-リン酸 （m M ) ) - (グルコース （m M ) )
[0383] 出発物質として、グルコース一 1—リン酸を用いて製造したグノレカンの収量は、初発 のグルコース一 1—リン酸の量、ならびに反応終了後の溶液中のグルコース、フルクト ースおよびグルコース- 1-リン酸の量から、以下の式により求められる。
[0384] [化 8]
(グルカン （m Mグルコース当量））
= (初発のグルコース一 1 —リン酸 （m M ) ) + (フルクト一ス （m M) )
一 （グルコース （m M ) ) — （反応後のグルコース— 1 -リン酸 （m M ) )
[0385] この式は以下の原理に基づく。
[0386] 反応溶液中では、初発のグルコース一 1_リン酸に加えて、反応 Aによって、ダルコ ースー 1-リン酸が生成される。つまり、初発のグノレコース一 1-リン酸と生成されたダル コース- 1一リン酸とが、グルカンの合成に使われ得る。グルカンの合成に使われ得る グノレコース- 1一リン酸の量から、反応終了後に反応溶液に残存するグルコース一 1ーリ ン酸の量を差し引くことによって、反応に使用されたグルコース一 1一リン酸の量、すな わち、グノレカンに取り込まれたグノレコースの量を算出できる。したがって、グルカンに 取り込まれたグルコースの量は上記に示す式により求められる。なお、この式は、 SP _GP反応系において出発材料として無機リン酸とグルコース一 1一リン酸とを併用した 場合にも適用できる。
[0387] (1. 6 グノレカンの収率）
出発物質として無機リン酸を用いて製造した場合のグノレカンの収率は、以下の式に よって求められる。
[0388] [化 9]
(グルカン収率 （％))
= (グルカン （m M グルコース当量)） ÷ (初発スクロース （m M ) ) X I 0 0
[0389] 出発物質としてグルコース一 1—リン酸を用いて製造した場合のグルカンの収率は、 以下の式によって求められる。
[0390] [化 10]
(グルカン収率 (¾))
= ί (初発のグルコース一 1一リン酸 （mM) ) + (フルクト一ス （mM))
一 （グルコース （mM)) - (反応後のグルコース— 1一リン酸 （mM)) } ÷ { (初発スクロース （mM)) + (初発のグルコース一 1一リン酸 （mM) ) } X 1 0 0
[0391] なお、この式は、 SP— GP反応系において出発材料として無機リン酸とグルコース- 1 リン酸とを併用した場合にも適用できる。
[0392] (1. 7 スクロースホスホリラーゼ活性の測定方法）
スクロースホスホリラーゼの活性単位は、例えば以下の方法によって求められる。
[0393] 25 μ 1の 10%スクロースと 20 μ 1の 500mM リン酸緩衝液（pH7. 0)とを混合する 。この混合液に、不溶性タンパク質を除去し適切に希釈した酵素液を 5 μ ΐ加えて攪 拌し、反応系を得る。この反応系を 37°Cで 20分間反応させた後、 100°Cで 5分間加 熱し反応を停止させる。その後、反応後の溶液中のグルコース一 1一リン酸を定量する 。通常は、 1分間に l z molのグルコース _1_リン酸を生成する酵素量を 1単位とする
[0394] (1. 8 ホスファターゼ活性の測定方法）
ホスファターゼの活性単位は、例えば以下の方法によって求められる。 20mM Tr is—塩酸緩衝液（pH7. 0)で適切に希釈した酵素液 ΙΟΟ μ Ιおよび 50mM ダルコ一 ス -1-リン酸水溶液 100 μ 1を含む反応液を 37°Cで 60分間保持した後、反応液中の グノレコース- 1 リン酸から生じた遊離の無機リン酸を定量することにより測定する。 1 分間に 1 μ molの無機リン酸を生成する酵素量を 1単位とした。
[0395] (1. 9 アミラーゼ活性の測定方法）
アミラーゼの活性単位は、例えば以下の方法によって求められる。 20mM Tris- 塩酸緩衝液（ρΗ7· 0)で適切に希釈した酵素液 25 μ ΐおよび 0. 5%アミロース（重量 平均分子量約 70, 000：アジノキ社製)水溶液 25 μ 1を含む反応液を 37°Cで 60分間 保持した後、 1mlのヨウ素水溶液（0. 1%ヨウ化カリウム、 0. 01%ヨウ素）を加え、 66 Onmの吸光度を測定する。 1分間に 660nmの吸光度を 10%低下させる酵素量を 1 単位とした。
[0396] (2.酵素の調製方法）
本発明の実施例で用レ、た各種酵素を、以下の方法によつて調製した。
[0397] (2. 1 スクロースホスホリラーゼの調製）
目的のスクロースホスホリラーゼ遺伝子を、選択マーカー遺伝子 Amprおよび Tetfと ともに PKK388—1に組み込み、プラスミド pKK388— SMSPを得た。このプラスミドで は、スクロースホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル— —D—チォガラタトピラノシドひ PTG)誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このプラスミドを、大腸 菌 TG—1 (STRATAGENE社製）に、コンビテントセル法により導入した。この大腸 菌を、抗生物質アンピシリンを含む LB培地（1%トリプトン、 0. 5%イーストエキス、 1 %NaCl、 50 z g/mlアンピシリン、 1. 5%寒天）プレートにプレーティングして、 37 °Cで一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、スクロー スホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がスクロースホ スホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって 確認した。また、得られた大腸菌がスクロースホスホリラーゼを発現していることを、活 性測定によって確認した。
[0398] 得られた大腸菌を、 LB液体培地（1 %トリプトン、 0. 5%イーストエキス、 l%NaCl、 50 μ g/mlアンピシリン） 5mlで 18時間培養し、全量を別の LB液体培地 1Lに植菌 し、 120rpmで振盪させながら 37°Cで 6— 7時間振盪培養した。その後、 IPTGを 0. 04mMになるようにこの培地に添加し、 30°Cでさらに 18時間振盪培養することによつ てスクロースホスホリラーゼを発現させた後、培養液を 5, OOOrpmにて 5分間遠心分 離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、 50mlの 20mM Tris—塩酸緩 衝液（ρΗ7· 0)中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破碎液 50mlを得 た。次いで、菌体破碎液にスクロースを加えて、 20%スクロースを含む菌体破碎液を 得た。この菌体破碎液を、 55°Cの水浴中で 20分間加熱した。加熱後、遠心機 (べッ クマン社製、 AVANTI J-25I)を用いて 8, 500rpmにて 20分間遠心分離し、不溶 性のタンパク質などを除去し、上清を得た。
[0399] 得られた上清を、あら力じめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂 Q-Sepharose ( アマシャムフアルマシア社製）に流してスクロースホスホリラーゼを樹脂に吸着させた 。樹脂を、 lOOmM塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続い て、 300mM塩化ナトリウムを含む緩衝液でスクロースホスホリラーゼを溶出させ、耐 熱化スクロースホスホリラーゼ酵素液とした。次いで、あらかじめ平衡化した Pheny卜 TOYOPEARL樹脂（東ソ一社製）に、 1. 5M硫酸アンモニゥムを含む上記の耐熱 化スクロースホスホリラーゼ酵素液を流して吸着させた。樹脂を、 1. 05M硫酸アンモ 二ゥムを含む緩衝液で洗浄し不純物を除去した。続いて、 0. 75M硫酸アンモニゥム を含む緩衝液でスクロースホスホリラーゼを溶出し、精製スクロースホスホリラーゼを 得た。この段階で本発明に使用し得るグルカンホスホリラーゼ含有溶液になるが、さ らなる精製を必要とする場合は、 Sephacryl S—200HR (アマシャムフアルマシア社 製）などを用いたゲルフィルトレーシヨンクロマトグラフィーによる分画を行なうことで精 製酵素液が得られる。
[0400] 得られた精製スクロースホスホリラーゼ酵素液約 1 μ gを用いて SDS_PAGE (SDS —ポリアクリルアミド電気泳動）を行った。その結果、どの精製スクロースホスホリラーゼ 酵素液についても、分子量約 55, 000のところに単一のバンドが認められ、他の場 所にはバンドが見られな力、つた。このようにして、スクロースホスホリラーゼが均質に精 製されたことが示された。
[0401] (2. 2 組換え Thermus aquaticus ひ—グルカンホスホリラーゼの調製方法）
Thermus aquaticus ひ一クノレカンホスホリフー 子 (J. Appl. Glycosci. ， 48 ( 1 ) (2001 ) 71 )を、選択マーカー遺伝子 Ampおよび Tetrとともに pKK388_l ( CLONTECH社製）に組み込み、プラスミド pKK388_GPを得た。このプラスミドで は、 a—グノレカンスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル一 β—D—チォガラタトピラノシド（ IPTG)誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このプラスミドを、大腸 菌 MC1061 (フアルマシア社製）に、コンビテントセル法により導入した。この大腸菌 を、抗生物質アンピシリンを含む LB培地（1 %トリプトン、 0. 5 %イーストエキス、 1 % NaCl、 50 /i g/mlアンピシリン、 1. 5%寒天）プレートにプレーティングして、 37°C で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、 ひ_グルカ ンホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌が α—グルカン ホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって 確認した。また、得られた大腸菌がひ—グルカンホスホリラーゼを発現していることを、 活性測定によつて確認した。
[0402] 得られた大腸菌を、 LB液体培地（1 %トリプトン、 0. 5%イーストエキス、 l %NaCl、
50 μ g/mlアンピシリン） 5mlで 18時間培養し、全量を別の LB液体培地 1Lに植菌 し、 120rpmで振盪させながら 37°Cで 4一 5時間振盪培養した。その後、 IPTGを 0. O lmMになるようにこの培地に添カ卩し、 37°Cでさらに 20時間振盪培養した。次いで 、この培養液を 5, OOCkprnにて 5分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得 られた菌体を、 50mlの 20mMトリス-塩酸緩衝液（pH7. 0)中に懸濁し、次いで超音 波処理により破砕し、菌体破碎液 50mlを得た。
[0403] 次いで、菌体破砕液を 70°Cで 30分間加熱した。加熱後、この菌体破砕液を 8， 50 Orpmで 20分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去し、上清を得た。得られ た上清を、組換え Thermus aquaticus ひ—グルカンホスホリラーゼ溶液とした。
[0404] (実施例 1：耐熱化スクロースホスホリラーゼ遺伝子の作製、スクリーニングおよび配 列決定）
概略を述べると、 Streptococcus mutans由来のスクロースホスホリラーゼ遺伝子 にランダム変異を導入し、ランダム変異の導入された遺伝子を大腸菌に導入して、ラ ンダム変異の導入されたスクロースホスホリラーゼを発現させ、発現されたスクロース ホスホリラーゼのうち、 52. 5°Cで 15分間加熱した後、グルカンを合成する能力を有 する耐熱化スクロースホスホリラーゼを発現する大腸菌を選択し、この大腸菌から耐 熱化スクロースホスホリラーゼ遺伝子を単離してその配列を決定した。
[0405] 詳細には、以下の通りである。
[0406] まず、配列番号 1に示す天然の Streptococcus mutans由来スクロースホスホリラ ーゼ遺伝子に対して、当業者に公知のエラーブローン PCR法によりランダム変異を 導入して、ランダム変異の導入された SP遺伝子を得た。この条件では一般に、スクロ ースホスホリラーゼ遺伝子 1つにつき、 1一 2箇所のランダム変異が入る。ランダム変 異の導入された SP遺伝子を、選択マーカー遺伝子 Ampおよび Te とともに pKK3 88—1に組み込み、プラスミドライブラリー pKK388_SMSPを得た。このプラスミドラ イブラリーでは、スクロースホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル _ j3— D—チォガラタ トピラノシド (IPTG)誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。
[0407] このプラスミドライブラリーを、大腸菌 TG— 1に、コンビテントセル法により導入した。
この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含む LB培地（1%トリプトン、 0. 5%イーストェ キス、 l%NaCl、 50 x g/mlアンピシリン、 1. 5%寒天）プレートにプレーティングし て、 37°Cで一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、ス クロースホスホリラーゼ遺伝子が導入された複数 (約 10万個）の大腸菌を得た。 [0408] この大腸菌の各々を別々の 50 /i g/mlアンピシリンを含む TERRIFICBROTH液 体培地（GIBCO BRL社製） 150 μ 1に接種し、 37°Cで 18時間静置養した。その後、 この培養液に溶菌液（10mg/ml卵白リゾチーム、 lU/mlデォキシリボヌクレア一 ゼ、 200mM塩ィ匕マグネシウム、 0. 5%卜ライトン Χ_100) 150 μ 1をカロえた後、 _80。C で 1時間凍結し、 37°Cで 1時間溶解させ、菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液 を、遠心機（日立社製、 CT-13R)を用いて 13， OOOrpmにて 10分間遠心分離し、 不溶性のタンパク質などを除去し、上清を得た。
[0409] 得られた上清 50 μ ΐを 1. 5mlのマイクロチューブに入れ、 52. 5°Cで 15分間加熱し た後、速やかに氷上に移し加熱を停止した。次いで、 50 μ ΐのアツセィ溶液（4。/。スク ロース、 lOOmMリン酸バッファー（ρΗ7. 0)、 0. 5mMマルトテトラオース、 2U/ml 馬鈴薯由来ひ—グルカンホスホリラーゼ）を加え混合した後、 45°Cで 2時間インキュべ ートした。その後、 100〃1のョゥ素液（1. 3%ヨウィ匕カリウム、 0. 13%ヨウ素）をカロえ 発色させた。上清中にスクロースホスホリラーゼが存在すると、インキュベートの際に スクロースからアミロースが合成され、アミロースはヨウ素によって青色に発色するがス クロースは発色しないので、ヨウ素液で青色に呈色したものは、耐熱化スクロースホス ホリラーゼを含むものである。上記の方法によりスクリーニングして、ランダム変異を有 するスクロースホスホリラーゼ遺伝子を含む形質転換大腸菌（約 8万個）から、耐熱化 スクロースホスホリラーゼ遺伝子を含む大腸菌 (約 100個）を得た。
[0410] 上記スクリーニングにより得られた、耐熱化スクロースホスホリラーゼ遺伝子を含む 大腸菌から当該分野で公知の方法に従ってプラスミドを回収し、 DNAシークェンサ 一（ABI社製）を用いてこのプラスミド中の耐熱化スクロースホスホリラーゼ遺伝子の 配列を決定した。
[0411] この耐熱化スクロースホスホリラーゼ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を、天 然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号 2のアミノ酸配歹 IJ)と比較した ところ、天然のスクロースホスホリラーゼの 47、 62、 77、 128、 140、 144、 155、およ び 249番目にあたるアミノ酸の位置に変異が導入されており、それぞれ T47→S、 S6 2→P、 Y77→H、 V128→L、 K140→M、 Q144→R、 N155→S、および D249→ Gにアミノ酸置換されていた。このように、スクロースホスホリラーゼの耐熱性向上に効 果のあると思われるアミノ酸位置が 8種類確認された。この中でも特に、 T47→Sおよ び V128→Lの変異は、いわゆる保存的置換である。保存的置換と言われるような類 似のアミノ酸に置換した場合でさえも耐熱化が見られることから、この位置が耐熱性 に特に関係のある位置であることが推測され、そしてさらに、類似していない他のアミ ノ酸に置換した場合にさらなる耐熱化が見られるのではなレ、かと期待される。また、こ れらの 8箇所以外には耐熱性に影響のある変異が見られなかったので、他の位置の 変異は、耐熱性に効果がないと考えられる。
[0412] また、 T47において S以外のアミノ酸、 S62において P以外のアミノ酸、 Y77におレヽ て H以外のアミノ酸、 V128において L以外のアミノ酸、 K140において M以外のアミ ノ酸、 Q144において R以外のアミノ酸、 N155において S以外のアミノ酸、または D2
49において G以外のアミノ酸についても耐熱化が見られる。
[0413] (実施例 2A:部位特異的変異誘発による耐熱化スクロースホスホリラーゼの作製、 および耐熱性の測定）
(1)部位特異的変異誘発による耐熱化スクロースホスホリラーゼの作製 概略を述べると、上記の 8種類の変異を組み合わせたライブラリーを作製した。その ライブラリーをスクリーニングし、耐熱性がさらに向上したスクロースホスホリラーゼを 得た。
[0414] 詳細には、実施例 1と同様にして耐熱化スクロースホスホリラーゼの発現ベクターを 作製した。本実施例では、実施例 1で耐熱化に寄与することが判明した位置の置換 を 1つのみ有する耐熱化 SPをコードする遺伝子と、いずれか 2つ一 7つの組み合わ せで有する耐熱化 SPをコードする遺伝子と、 8つ全てを有する耐熱化 SPをコードす る遺伝子とを作製した。 列として、 8つすベての変異（T47S、 S62P、 Y77H, VI 28 L、 K140K、 Q144R、 N155S,および D249G)を有する耐熱化 SPをコードする塩 基配列を配列番号 21に、そしてこの耐熱化 SPのアミノ酸配列を配列番号 22に示す 。これらのアミノ酸置換は、当該分野で公知の部位特異的変異誘発法を使用して行 われた。
[0415] このようにして得られた耐熱化 SPをコードする遺伝子をそれぞれ用いて、上記実施 例 1と同様に PKK388— 1に組み込み、プラスミド pKK388—SPMSを作製した。この プラスミドを、大腸菌 TG— 1に、コンビテントセル法により導入し、この大腸菌を、抗生 物質アンピシリンを含む LB培地（1%トリプトン、 0· 5%イーストエキス、 l%NaCl、 50 /i g/mlアンピシリン、 1. 5%寒天）プレートにプレーティングして、 37°Cでー晚培養 した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、耐熱化スクロースホスホ リラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がスクロースホスホリラ ーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した 。このようにして、耐熱化 SPを発現する大腸菌が作製できた。
[0416] 得られた耐熱化スクロースホスホリラーゼを発現する大腸菌から、 2. 1に記載の方 法により耐熱化スクロースホスホリラーゼ酵素液を調製した。
[0417] (1-2)天然のスクロースホスホリラーゼの調製
配列番号 1の遺伝子を用いて、 2. 1に記載の方法に従って、天然のスクロースホス ホリラーゼ酵素液を調製した。
[0418] (1-3)天然のスクロースホスホリラーゼの C末端に置換および付加を有するスクロ ースホスホリラーゼ（No. 33)の調製
配列番号 2のスクロースホスホリラーゼと比較して、 C末端の 2アミノ酸 FEを SLに置 換し、さらにメチォニン、イソロイシン、セリン、システィン、グルタミンおよびトレォニン をこの順序で付加したスクロースホスホリラーゼ (便宜的に No. 33と示す)酵素液を、 配列番号 23の遺伝子を用いて、 2. 1に記載の方法に従って調製した。
[0419] (1-4)変異型 SPの C末端に置換および付加を有するスクロースホスホリラーゼ（N o. la、 2a、 3a、 4a、 5aおよび 6a)の調製
目的の変異を有する耐熱化 SP酵素の C末端にアミノ酸の置換および付加を行なレ、
、これらの置換および付加は耐熱性への影響がなレ、ことを確認した。
[0420] 言羊しくは、 2. 1に示した方法と同様にして、表 4Aの No. 1、 2、 3、 4、 5または 6の各 々の耐熱化 SP酵素の C末端の 2アミノ酸（フヱ二ルァラニン、グノレタミン酸）を、それぞ れロイシン、セリンに置換し、さらに 6アミノ酸を、メチォニン、イソロイシン、セリン、シス ティン、グルタミン、トレオニンの順に付加した C末改変 SP酵素液を調製し、耐熱性 を測定した。
[0421] (2)種々のスクロースホスホリラーゼの耐熱性の測定 上記（1)一 (1-4)で調製された耐熱化 SP酵素液または他の SP酵素液の耐熱性 を測定した。測定を、以下の通りに行った。
[0422] (i)スクロースの非存在下での SPの耐熱性
まず、各 SP酵素液を 37°Cで 2. 5-3. 5U/mlになるように 20mM Tris緩衝液（ pH7. 0)によって適切に希釈した。希釈した酵素液 50 μ 1を 55°Cで 20分間、または 、 57°Cで 20分間、または 60°Cで 20分間加熱した。加熱終了後直ちに氷上で 10分 間保持して冷却した。冷却後の酵素液の活性および加熱前の酵素液の活性を、 1. 7に記載の SP活性測定法に従って 37°Cで測定した。各酵素の耐熱性を、加熱前の スクロースホスホリラーゼの酵素活性に対する、加熱後のスクロースホスホリラーゼの 酵素活性の割合 (残存活性)を求めることにより測定した。
[0423] (ii)スクロースの存在下での SPの耐熱性
まず、各 SP酵素夜を 5. 0—7. OU/m こなるよう (こ 20mM Tris fn¾ (pH7. 0 )によって適切に希釈した。希釈した酵素液 25 μ 1と、 40%スクロース含有 20mM T ris緩衝液 (pH7. 0) 25 β 1とを混合した。この混合溶液 50 β 1を 65°Cで 20分間加熱 した。加熱終了後直ちに氷上で 10分間保持して冷却した。冷却後の酵素液の活性 および加熱前の酵素液の活性を、 1. 7に記載の SP活性測定法に従って 37°Cで測 定した。各酵素の耐熱性を、加熱前のスクロースホスホリラーゼの酵素活性に対する 、加熱後のスクロースホスホリラーゼの酵素活性の割合 (残存活性）を求めることによ り測定した。スクロースの非存在下で 55°C、 57°Cまたは 60°Cで加熱した場合、なら びにスクロースの存在下で 65°Cで加熱した場合の結果を以下の表 4Aに示す。表 4 Aには、それぞれの変異体がどの変異を有するかについても示す。
[0424] [表 4A] S5°C 57Ϊ 6(TC 65"C c末端
T47S S6ZP Y77H V128L KH0M QI44R N1S5S D249G
No. -Sue -Sue -Sue +Suc 改変
1 99.3 98.3 80.6 99.3 0 〇 〇 〇 〇 O o o - la 99.1 97.4 80.5 98.9 〇 〇 〇 〇 〇 〇 o o 〇
2 99.4 95.2 67.2 99.1 O o 〇 o - 〇 o o -
2a 99.1 96.1 66.4 98.3 〇 〇 〇 〇 - 〇 〇 〇 〇
3 98.3 86.5 20.9 98.2 O - - 〇 - 〇 - 〇 -
3a 98.7 85.1 21.3 97.4 〇 - - o - 〇 - o 〇
4 94.2 86.5 14.8 91.7 O 〇 - - - O - 〇 - i 95.8 8S.1 15.3 93.3 〇 〇 - - - 〇 - 〇 〇
S 95.8 93.7 35.9 94.8 o - - o ― 〇 〇 〇 -
Si 94.9 94.2 37.4 92. Θ 〇 - - 〇 - O 0 o 〇
6 98.4 99.3 38.4 95.4 o 〇 - 〇 - - 〇 o -
6a 97.3 96.3 36.1 93.2 o o - o - - 〇 〇 〇
7 95,5 94.1 30. G 93.3 o 〇 〇 〇 o 〇 - - -
8 91.8 80.8 28.9 88.9 〇 〇 〇 o - 〇 〇 - -
9 99.4 83.5 22.0 84.3 〇 〇 - - - o 〇 o -
10 95.4 83.2 27. t 88.4 o - 〇 - o o - 〇 -
11 96.2 89.4 26. t 89.6 o 〇 〇 - - o o 〇 -
12 96.3 83.0 25.4 69.4 - - - 〇 - o 〇 〇 -
13 91.8 70.3 19.1 78.3 o 〇 - 〇 - 〇 〇 - -
14 90.5 78.0 20.5 62.4 - - - 〇 - - 〇 〇 -
15 90.0 77.1 17.7 82.6 - 0 - 〇 - 〇 - 〇 -
16 94.3 80.6 18.3 85.0 o 〇 - 一 〇 - 〇 〇 -
17 92.2 75.9 11.5 85.0 0 〇 - - - - - 〇 -
18 9S.5 81.9 14.6 83.5 〇 〇 - - - - 〇 〇 -
19 8S.7 60.7 11.9 83.2 〇 〇 o 〇 - 〇 - - -
20 80.3 49.4 7.6 38.7 - - o o - - o ― -
21 80.8 48.8 T.1 53.4 - - 〇 - 〇 〇 - 〇 -
22 81.2 47.5 4.1 79.1 0 〇 - 〇 - - - - -
23 85.2 40.2 3.6 55.8 〇 〇 - - - 〇 〇 - -
24 77.4 30.1 1.1 3S.Z 〇 - - - - - - 〇 -
25 47.3 11.5 1.1 30.4 〇 - - - - - - - -
26 33.4 4.4 1.4 9.5 - o - - - - - 一 -
27 22.6 2.2 1.4 6.9 - - o 一 - - - - -
28 26.6 3.0 1.7 10.8 - - - 〇 - - - - -
29 39.9 6.1 1.1 12.3 - - - - 〇 - - - -
30 23.2 2.1 1.3 5.2 - - - - - 〇 - - -
31 37.8 6.3 1.0 6.3 - - - - - - 0 - -
32 47.7 11.1 1.2 27.5 - - - - - - - o -
33 10.6 2.3 1.8 1.9 - - - - - - - - 〇 酐 11.3 2.3 1.8 1.9 - - - 一 一 - 一 - - 上記の表 4Aにおいて、 WTとは、変異していない天然の Streptococcus mutan s由来のスクロースホスホリラーゼを示す。 No. 33の変異体は、天然の Streptococc us mutans由来のスクロースホスホリラーゼの C末端の 2アミノ酸 FEを SLに置換し、 さらにメチォニン、イソロイシン、セリン、システィン、グルタミンおよびトレォニンをこの 順序で付加したスクロースホスホリラーゼを示す。〇は、その位置の変異を有すること を示す。例えば、 No. 3の変異体は、 T47S, V128L, Q144R,および D249Gの変 異を有する。なお、この表において、 5%未満の活性値は、活性測定で定量されるグ ルコース _1_リン酸の検出限界に極めて近いため、信頼性が極めて低ぐほぼ 0であ るとみな tる。
[0426] なお、 C末端の改変についての「〇」は、 480位のフエ二ルァラニンがロイシンに置 換され、 481位のグルタミン酸がセリンに置換され、メチォニン、イソロイシン、セリン、 システィン、グノレタミン、トレオニンがその先（482— 487位）に付加されている。
[0427] この結果、耐熱性に寄与する 8箇所のアミノ酸残基は、 1箇所置換されるだけでも、 天然の SPと比較して耐熱性を向上させることがわかった。さらに、これら 8箇所のアミ ノ酸残基のうちのいくつかまたはすべてが多重置換されることによって、スクロースホ スホリラーゼの耐熱性がさらに向上することがわ力 た。
[0428] 一方、 C末端でのアミノ酸の置換および付加は、耐熱性にほとんど影響を与えなか つた。このように、本発明の効果を阻害しない程度のアミノ酸の置換もしくは付加を行 ない得ること、および本発明者らが見出した位置での置換が耐熱性に関して重要で あって他の位置での置換は意味がないことがわかった。
[0429] スクロース存在下での耐熱性を測定したいずれの変異スクロースホスホリラーゼに ついても、スクロースが存在することによって、スクロースの非存在下と比較して耐熱 十生が向上した。
[0430] (実施例 2B：種々のアミノ酸残基で置換された耐熱化スクロースホスホリラーゼの作 製、および耐熱性の測定）
T47、 S62、 Y77、 V128、 K140、 Q144、 N155および D249をそれぞれ 1箇所 ずつ、別のアミノ酸残基に置換するように設計したプライマーを用いたこと以外は実 施例 2Aと同様にして、改変体スクロースホスホリラーゼ遺伝子を含むプラスミドを作 製し、そして種々の改変体 SP酵素液を得た。
[0431] これらの改変体 GP酵素液の耐熱性にっレ、て、加熱条件が、 55°Cで 20分間である こと以外は、上記実施例 2A (2) (i)と同様に加熱した後、残存活性を測定した。結果 を以下の表 4Bに示す。
[0432] [表 4B]
Figure imgf000100_0003
Figure imgf000100_0001
Figure imgf000100_0002
[0433] この表において、 T47Sは、 Streptococcus mutans由来の SPの 47位のトレオニ ンをセリンに置換した変異体を示す。他についても同様である。 WTは、 Streptococ cus mutans由来の天然の SPを示す。
[0434] この結果、耐熱性に寄与する 8箇所のアミノ酸残基は、それぞれ、別のアミノ酸残基 で置換されることにより、天然の SPと比較して耐熱性を向上させることがわかった。
[0435] (実施例 2C : Leuconostoc mesenteroides由来のスクロースホスホリラーゼの而ォ 熱化、および耐熱性の測定）
Streptococcus mutans由来の SPをコードする逾伝子の代わりに Leuconostoc mesenteroides由来の SPをコードする遺伝子（配列番号 7)を用い、 A62P、 VI 2 81または N155Sのそれぞれのアミノ酸置換となるように設計したプライマーを用いた こと以外は実施例 2Aと同様にして、改変体スクロースホスホリラーゼ遺伝子を含むプ ラスミドを作製し、そして種々の改変体 SPの酵素液を得た。天然の Leuconostoc mesenteroides由来の SPの酵素液をコントローノレとして用いた。
[0436] これらの改変体 SPの酵素液の耐熱性について、加熱条件力 50°C、 52°Cまたは 5 5°Cで 20分間であること以外は、上記実施例 2A (2) (i)と同様に加熱した後、残存活 性を測定した。結果を以下の表 4Cに示す。天然の Leuconostoc mesenteroides 由来の SPについての結果を、 WTとして示す。
[0437] [表 4C]
Figure imgf000101_0001
[0438] A62は、配列番号 2の S62に相当する位置である。 V128は、配列番号 2の V128 に相当する位置である。 N155は、 N155に相当する位置である。
[0439] この結果、 Leuconostoc mesenteroides由来の SPにおいても、耐熱化に寄与 する位置のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することにより、耐熱化 SPが得ら れることがわかった。
[0440] (実施例 3：耐熱化スクロースホスホリラーゼの高温での比活性）
本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 55°Cでの比活性を調べた。
[0441] 詳細には、まず、表 4Aにおける No. 2、 3、 4、 5もしくは 6の各々の精製耐熱化スク ロースホスホリラーゼ酵素液またはコントロールの天然（WT)の Streptococcus mu tansスクロースホスホリラーゼ酵素液を 37。Cで lU/mlになるように 20mM Tris緩 衝液 (pH7. 0)によって適切に希釈した。希釈した酵素液の活性を、反応温度が 55 °Cであること以外は 1. 7に記載の SP活性測定法に従って測定した。
[0442] 一方、反応に使用した酵素液量と同じ量の酵素液中のスクロースホスホリラーゼの 量を、プロテインアツセィキット (バイオラッド社製)を製造業者の指示に従って用いて 測定した。測定用の検量線は IgGを用いて作成した。
[0443] このようにして得られた SPの活性 (A (U/ml) )と SPの重量 (W (mg/ml) )と力、ら、 A÷W (U/mg)によって SPの比活性を求めた。
[0444] 結果を以下の表 5に示す。
[0445] [表 5] 比活性
No.
(U mgタンパク質）
2 44.1
3 96.4
4 163.9
5 32.2
6 40.3
WT 10.7
[0446] この結果、変異を導入することによって 55°Cでの比活性が顕著に向上することがわ かった。
[0447] (実施例 4 :耐熱化スクロースホスホリラーゼを用いたアミロース合成）
本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを用いたアミロース合成におけるアミロー スの収率を調べた。耐熱化スクロースホスホリラーゼとして、上記実施例 3で調製され た各種耐熱化 SP (No. 1— 6、 25および 32)を用いた。
[0448] 対照として、天然の Streptococcus mutans由来スクロースホスホリラーゼを用い た。
[0449] アミロース合成反応を、以下の表 6に記載の組成の反応系を用いて、 50°Cまたは 5
5°Cで 18時間行った。
[0450] [表 6] アミロース合成反応の組成 量
スクロース 2 9 2 . 3 m
マルトテトラオース （G 4 ) 1 m M
無機リン酸 （P i ) 1 O m
α—グルカンホスホリラ一ゼ 1 U /m 1
スクロースホスホリラーゼ 1 U /m !
[0451] ここで、 α—グルカンホスホリラーゼとして、 2. 2で調製した組換え Thermusaquati cus由来グルカンホスホリラーゼを用レヽた。
[0452] この反応によって合成されたアミロースの収率を上記の「1.測定方法および計算方 法」により計算した。
[0453] この方法により合成されたアミロースの収率を、以下の表 7に示す。
[0454] [表 7] 合成されたアミロースの収率
Figure imgf000103_0001
[0455] 以上のように、本発明の耐熱化 SPは、高温条件下（例えば、 50°C— 55°C)でアミ口 ースを合成し得ることがわかった。本発明の耐熱化 SPを用いると、野生型の SPを用 いた場合と比較して約 2倍一約 18倍高い収率でアミロースを合成できることがわかつ た。
[0456] (実施例 5 :耐熱化スクロースホスホリラーゼを用いたグルコース _1_リン酸の合成） 本発明の耐熱化スクロースホスホリラーゼを用いたグルコース _1_リン酸の合成に おけるグルコース _1_リン酸の収率を調べた。耐熱化スクロースホスホリラーゼとして 、上記実施例 3で調製された各種耐熱化スクロースホスホリラーゼ (No. 1— 6、 25お よび 32)を用いた。対照として、天然（配列番号 2)の Streptococcusmutans由来ス クロースホスホリラーゼを用いた。グルコース _1_リン酸合成反応を以下の表 8に記載 の組成の反応系を用いて、 50°Cまたは 55°Cで 18時間行なった。
[0457] [表 8]
G - 1 - P合成反応の組成 量
スクロース 3 0 0 m
無機リン酸 （P i ) 3 0 0 m
スクロースホスホリラーゼ 1 U /m 1
[0458] この反応によって合成されたグノレコース一 1一リン酸を、上記の「1.測定方法および 計算方法」に記載の方法により定量した。得られたグルコース一 1一リン酸の収率を、 以下の式に従って求めた。
[0459] [数 3]
収率（％) =グルコース- 1-リン酸の収量 (mM) 初発のスクロース濃度（3 0 0 mM) X 1 0 0 [0460] 結果を、以下の表 9に示す。
[0461] [表 9]
Figure imgf000104_0001
[0462] 以上のように、本発明の耐熱化 SPは高温条件下でグルコース 1 リン酸を合成し 得ることがわかった。本発明の耐熱化 SPを用いると、特に 55°Cの反応条件では、野 生型の SPを用いた場合と比較して約 1. 5倍一約 16倍高い収率でグルコース一 1—リ ン酸を合成できることがわかった。
[0463] (実施例 6：加熱処理による夾雑タンパク質の除去の確認）
加熱処理によって耐熱化スクロースホスホリラーゼの精製が容易にできることを以下 の方法で確認した。
[0464] 表 4Aで示した No. 1、 2、 3、 4および 5の耐熱化スクロースホスホリラーゼを発現す る大腸菌、およびコントロールとして天然（配列番号 2)の Streptococcus mutans 由来スクロースホスホリラーゼを発現する大腸菌を、それぞれ実施例 2A(1)に記載 の方法と同様に培養した。培養液を遠心分離することにより、菌体を回収し、菌体を 緩衝液に懸濁し、超音波処理することにより、菌体抽出液を得た。この菌体抽出液に スクロースを添加して 20%のスクロース濃度の混合液を得て、この混合液を 65°Cで 2 0分間加熱後、遠心分離することにより不溶性のタンパク質を除去し、 SP酵素液を得 た。この SP酵素液の 37°Cにおける比活性を求めた。結果を表 10に示す。比活性の 算出に用いたタンパク量の測定を、実施例 3に記載した方法と同様に行なった。また 、加熱前および加熱後の SP酵素液中に含まれるホスファターゼ活性およびアミラー ゼ活性を測定し、加熱前と比較してどれくらいの割合のホスファターゼ活性およびァ ミラーゼ活性が残存しているかを決定した。その結果を表 1 1に示す。
[0465] [表 10]
比活性
[0466]
Figure imgf000105_0001
[0467] 耐熱化 SPを含む酵素液を 65°Cで加熱し、変性したタンパク質を除去することにより 、得られる精製酵素液の比活性が、加熱前の約 3倍一約 5倍に向上した。これは、耐 熱化 SPは変性せず、夾雑タンパクの大部分が変性し除去されたことを示す。これに 比べて天然（WT;配列番号 2)の SPの比活性は約 100分の 1に低下した。これは夾 雑タンパク質だけでなく SPタンパク質も変性していることを示す。さらに、 65°Cで加熱 することにより、宿主菌由来のホスファターゼ活性およびアミラーゼ活性を、それぞれ 加熱前の約 3. 0%以下および約 1. 0%以下にまで低下させることができた。以上の ように、耐熱化 SPを熱処理することによって、耐熱化 SPを簡便に精製できることがわ かった。
[0468] (実施例 7 : C末端でのアミノ酸の置換および C末端へのアミノ酸の付加による、比活 性への影響）
目的の変異以外に、 SP酵素の C末端にアミノ酸の置換および付加を行なレ、、比活 性への影響がなレ、ことを確認した。
[0469] 詳しくは、配列番号 23に示す塩基配列を持つ DNAを用い、 2. 1に示した方法と同 様にして配列番号 24に示すアミノ酸配列をもつ C末端改変 SP酵素（上記実施例 2A ( 1一 3)で作製した No. 33)を調製し、比活性を測定した。
[0470] この C末端改変 SP酵素および天然の SP酵素の 37°Cにおける比活性を、反応温度 が 37°Cである以外は実施例 3に記載の方法に従って測定した。結果を以下の表 12 に示す。この結果、 C末端改変 SP酵素の比活性と天然の SP酵素の比活性との間に 差はほとんど認められな力 た。このこと力ら、 C末端でのアミノ酸の置換および C末 端へのアミノ酸の付加は、スクロースホスホリラーゼの活性に対してほとんど影響を与 えないことがわかった。
[0471] [表 12]
Figure imgf000106_0001
[0472] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発 明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではなレ、。本発明は、請求の範 囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発 明の具体的な好ましレ、実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づ レ、て等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用し た特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されて レ、るのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが 理解される。
産業上の利用可能性
[0473] 本発明により、グルカン、 G— 1一 Pなどの高温での効率的な生産に利用され得る耐 熱性のスクロースホスホリラーゼが提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 天然のスクロースホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化スクロースホスホリラーゼ であって、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、
モチーフ配列 1： AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPID YHEVDS AFGDWDD VKRLGEKYYLMFDFMINHIS中の 14位に相当する位置、 29位に相当する位 置、および 44位に相当する位置；
モチーフ配列 2： RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTF GEEQID中の 7位に相当する位置、 19位に相当する位置、 23位に相当する位置お よび 34位に相当する位置；ならびに 中の 19位に相当する位置；
力 なる群より選択される少なくとも 1つの位置において、天然のスクロースホスホリラ 一ゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを 20mM Tris緩衝液（ρΗ7· 0)中で 55°Cで 2 0分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性力 該 加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20。/o以上であ る、
而ォ熱化スクロースホスホリラーゼ。
[2] 前記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列力 S、配列番号 2、配列番号 4、 配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、 配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも 40 %の同一性を有する、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[3] 前記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列力 S、配列番号 2、配列番号 4、 配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、 配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも 60 %の同一性を有する、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[4] 前記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列力 配列番号 2、配列番号 4、 配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、 配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする 塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸分子 によってコードされる、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[5] 前記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列力 S、配列番号 2、配列番号 4、 配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、 配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択される、請求項 1に記載の耐熱化 スクロースホスホリラーゼ。
[6] 前記天然のスクロースホスホリラーゼ力 Streptococcus mutans、 Streptococc us pneumoniae^ streptococcus sorbmus、 Streptococcus mitis、 Leucon ostoc mesenteroides^ Oenococcus oeni、 Lactobacillus acidophilusおよ び Listeria monocytogenesからなる群より選択される細菌由来である、請求項 1に 記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[7] 前記天然のスクロースホスホリラーゼカ Streptococcus mutans, Streptococc us pneumoniae^ streptococcus sorbmusまに ίま: streptococcus mitisに由 来する、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[8] 前記天然のスクロースホスホリラーゼカ Streptococcus mutansまたは Leucon ostoc mesenteroidesに由来する、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラ 一 。
[9] 前記モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置におけるアミノ酸残基力 セリンまた はイソロイシンである、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[10] 前記モチーフ配列 1中の 29位に相当する位置におけるアミノ酸残基力 S、プロリン、 ァラニンまたはリジンである、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[11] 前記モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置におけるアミノ酸残基力 S、ヒスチジン
、アルギニンまたはトリプトファンである、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリ ラーゼ。
[12] 前記モチーフ配列 1中の 44位に相当する位置におけるアミノ酸残基力 S、アルギニ ンである、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[13] 前記モチーフ配列 2中の 7位に相当する位置アミノ酸残基が、ロイシンまたはイソ口 イシンである、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[14] 前記モチーフ配列 2中の 19位に相当する位置におけるアミノ酸残基力 メチォニン
、システィン、フエ二ルァラニン、イソロイシン、バリンまたはチロシンである、請求項 1 に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[15] 前記モチーフ配列 2中の 19位に相当する位置におけるアミノ酸残基力 S、 ノ リンまた はチロシンである、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[16] 前記モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置におけるアミノ酸残基力 S、アルギニ ン、ヒスチジン、イソロイシン、リジンまたはバリンである、請求項 1に記載の耐熱化スク ロースホスホリラーゼ。
[17] 前記モチーフ配列 2中の 23位に相当する位置におけるアミノ酸残基力 S、ヒスチジン である、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[18] 前記モチーフ配列 2中の 34位に相当する位置におけるアミノ酸残基がセリンまたは トレオニンである、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[19] 前記モチーフ配列 2中の 34位に相当する位置におけるアミノ酸残基がセリンである
、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[20] 前記モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置におけるアミノ酸残基力 グリシン、 システィン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、ァスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギ ニンまたはセリンである、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[21] 前記モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置におけるアミノ酸残基力 グリシンで ある、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[22] 前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 57°C で 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性が 、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 10%以上 である、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[23] 前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 57°C で 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性が 、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20%以上 である、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[24] 前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20%スクロースを含む 20mM Tris緩衝 液（ρΗ7· 0)中で 65°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37 °Cにおける酵素活性力 該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおけ る酵素活性の 10。/o以上である、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[25] 前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20%スクロースを含む 20mM Tris緩衝 液（pH7. 0)中で 65°Cで 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37 °Cにおける酵素活性力 該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおけ る酵素活性の 20。/o以上である、請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[26] 少なくとも、モチーフ配列 1中の 14位に相当する位置において、前記天然のスクロ ースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有する、請求項 1に記載の耐熱化スクロ ースホスホリラーゼ。
[27] 少なくとも、モチーフ配列 3中の 19位に相当する位置において、前記天然のスクロ ースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有する、請求項 1に記載の耐熱化スクロ ースホスホリラーゼ。
[28] 耐熱化スクロースホスホリラーゼを調製する方法であって、
第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改 変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程；
該第二の核酸分子を含む発現ベクターを作製する工程；
該発現ベクターを細胞に導入して耐熱ィヒスクロースホスホリラーゼを発現させるェ 程；および
該発現された耐熱化スクロースホスホリラーゼを回収する工程
を包含し、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、
モチーフ配列 1： AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPID YHEVDS AFGDWDD VKRLGEKYYLMFDFMINHIS中の 14位に相当する位置、 29位に相当する位 置、および 44位に相当する位置；
モチーフ配列 2： RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTF GEEQID中の 7位に相当する位置、 19位に相当する位置、 23位に相当する位置お よび 34位に相当する位置；ならびに 中の 19位に相当する位置；
力、らなる群より選択される少なくとも 1つの位置において、該第一のスクロースホスホリ ラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 55°Cで 2 0分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性力 該 加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20。/o以上であ る、
方法。
[29] 前記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列力 S、配列番号 2、配列番号 4、 配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、 配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも 40 %の同一性を有する、請求項 28に記載の方法。
[30] 前記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列力 配列番号 2、配列番号 4、 配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、 配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも 60 %の同一性を有する、請求項 28に記載の方法。
[31] 前記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列力 配列番号 2、配列番号 4、 配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、 配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする 塩基配列からなる核酸分子とストリンジ工ントな条件下でハイブリダィズする核酸分子 によってコードされる、請求項 28に記載の方法。
[32] 前記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列力 S、配列番号 2、配列番号 4、 配列番号 6、配列番号 8、配列番号 10、配列番号 12、配列番号 14、配列番号 16、 配列番号 18および配列番号 20からなる群より選択される、請求項 28に記載の方法
[33] 前記第一のスクロースホスホリラーゼカ Streptococcus mutans, Streptococc us pneumoniae^ streptococcus sorbmus、 Streptococcus mrtis、 Leucon ostoc mesenteroides、 Oenococcus oeni、 Lactobacillus acidophilusおよ び Listeria monocytogenesからなる群より選択される細菌由来である、請求項 28 に記載の方法。
[34] 前記第一のスクロースホスホリラーゼ力 Streptococcus mutans、 Streptococc us pneumoniae^ streptococcus sorbmusま 7こ fま streptococcus mitis (こ由 来する、請求項 28に記載の方法。
[35] 前記天然のスクロースホスホリラーゼが、 Streptococcus mutansまたは Leucon ostoc mesenteroidesに由来する、請求項 28に記載の方法。
[36] 前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 57°C で 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性が
、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 10%以上 である、請求項 28に記載の方法。
[37] 前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、 20mM Tris緩衝液（ρΗ7· 0)中で 57°C で 20分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性が
、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20%以上 である、請求項 28に記載の方法。
[38] 前記耐熱化スクロースホスホリラーゼ力 少なくとも、モチーフ配列 1中の 14位に相 当する位置において、前記第一のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を 有する、請求項 28に記載の方法。
[39] 前記耐熱化スクロースホスホリラーゼカ 少なくとも、モチーフ配列 3中の 19位に相 当する位置において、前記第一のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を 有する、請求項 28に記載の方法。
[40] 請求項 1に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む、核 酸分子。
[41] 請求項 40に記載の核酸分子を含む、ベクター。
[42] 請求項 40に記載の核酸分子を含む、細胞。
[43] グノレコース- 1-リン酸の合成方法であって、該方法は、請求項 1に記載の耐熱化ス クロースホスホリラーゼ、スクロースおよび無機リン酸を含む反応溶液を反応させて、 グノレコース _1ーリン酸を生産する工程を包含する、方法。
[44] 前記反応が、 50°C— 70°Cの温度で行われる、請求項 43に記載の方法。
[45] グノレコース重合体の合成方法であって、該方法は、請求項 1に記載の耐熱化スクロ ースホスホリラーゼと、 ひ一グノレコース _1_リン酸を基質とする第二のホスホリラーゼと 、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース— 1一リン酸とを含む反応液 を反応させて、グルコース重合体を生産する工程を包含する、方法。
[46] 前記グルコース重合体がひ—ダルカンである、請求項 45に記載の方法。
[47] 前記第二のホスホリラーゼが、 ひ—グノレカンホスホリラーゼである、請求項 45に記載 の方法。
[48] 前記第二のホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリ ラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼ、ラミナリデキストリンホスホリラーゼ、 β— 1 , 3 ーグルカンホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼからなる群より選択される、 請求項 45に記載の方法。
[49] 前記反応が、 50°C— 70°Cの温度で行なわれる、請求項 45に記載の方法。
[50] 天然のスクロースホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化スクロースホスホリラーゼ であって、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、配列番号 2のアミノ酸配列の 47位トレオニン (T47)に相当する位置、 62位セリン（S62)に相当する位置、 77位チロシン (Y77) に相当する位置、 128位バリン (VI 28)に相当する位置、 140位リジン（K140)に相 当する位置、 144位グルタミン（Q 144)に相当する位置、 155位ァスパラギン（N 155 )に相当する位置および 249位ァスパラギン酸（D249)に相当する位置からなる群よ り選択される少なくとも 1つの位置において、該天然のスクロースホスホリラーゼとは異 なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを 20mM Tris緩衝液（pH7. 0)中で 55°Cで 2 0分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性力 該 加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20。/o以上であ る、
耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
[51] 耐熱化スクロースホスホリラーゼを調製する方法であって、
第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改 変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程；
該第二の核酸分子を含む発現ベクターを作製する工程；
該発現ベクターを細胞に導入して耐熱ィヒスクロースホスホリラーゼを発現させるェ 程；および
該発現された耐熱化スクロースホスホリラーゼを回収する工程
を包含し、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、配列番号 2のアミノ酸配列の 47位トレオニン (T47)に相当する位置、 62位セリン（S62)に相当する位置、 77位チロシン (Y77) に相当する位置、 128位バリン (VI 28)に相当する位置、 140位リジン（K140)に相 当する位置、 144位グルタミン（Q144)に相当する位置、 155位ァスパラギン（N155 )に相当する位置および 249位ァスパラギン酸 (D249)に相当する位置からなる群よ り選択される少なくとも 1つの位置において、該第一のスクロースホスホリラーゼのアミ ノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを 20mM Tris緩衝液（ρΗ7· 0)中で 55°Cで 2 0分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性力 該 加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの 37°Cにおける酵素活性の 20%以上であ る、
方法。
[52] グノレコース一 1一リン酸の合成方法であって、該方法は、請求項 50に記載の耐熱化 スクロースホスホリラーゼ、スクロースおよび無機リン酸を含む反応溶液を反応させて 、グノレコース- 1-リン酸を生産する工程を包含する、方法。
[53] グノレコース重合体の合成方法であって、該方法は、請求項 50に記載の耐熱化スク ロースホスホリラーゼと、 ひ—グルコース _1_リン酸を基質とする第二のホスホリラーゼ と、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース _1_リン酸とを含む反応 液を反応させて、グルコース重合体を生産する工程を包含する、方法。
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