CN112375724A

CN112375724A - 高效合成α-熊果苷的基因工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN112375724A
Application number: CN202011298679.9A
Authority: CN
Inventors: 刘龙; 吕雪芹; 陈坚; 堵国成; 李江华
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2040-11-18
Also published as: CN112375724B

Abstract

本发明公开了一种高效合成α‑熊果苷的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明利用表达蔗糖磷酸化酶(SmSP)的重组枯草芽孢杆菌全细胞催化高效生产α‑熊果苷，为α‑熊果苷的生产提供了新的思路和方法。本发明通过分子对接以及定点饱和突变筛选到了SmSP酶活提高的蛋白突变体SmSP^I336L，通过增加SmSP^I336L在基因组上的拷贝数的方式，提高了SmSP的蛋白表达量，并通过优化BS‑3SmSP^I336L菌株的催化条件，大幅提高了α‑熊果苷的产量。当底物HQ的浓度为50g/L，蔗糖浓度为310.9g/L，菌体浓度OD₆₀₀＝40，催化体系在摇瓶中30℃、220rpm催化20h时α‑熊果苷的产量达到115.8g/L，底物HQ的摩尔转化率为93.6％。

Description

高效合成α-熊果苷的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种高效合成α-熊果苷的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

α-熊果苷(4-氢醌-α-D-吡喃葡萄糖苷)是一种天然糖苷，包含1个葡萄糖基和1个酚基，之间通过α-1，4糖苷键相连。近年来，由于α-熊果苷有良好的对光辐射的耐褐变性和对酪氨酸酶的抑制活性，其在化妆品工业中被广泛用作美白剂。此外，α-熊果苷不仅可以减少皮肤色素的沉积，同时还有杀菌、消炎的作用，是一种新型的无刺激、无过敏的天然美白活性物质。目前合成α-熊果苷的方法有化学合成法、酶法合成以及发酵法。其中，化学合成法立体选择性差，产物大多都为混和物，不能制备单一的产物，并且反应过程所用的化学物质极易造成环境污染，也会存在消费者对产品有过敏反应等问题；发酵法生产α-熊果苷由于前期底物投入较多，底物转化率低，发酵周期较长，需要多种酶参与，且产量较低，因此不适用于大规模生产；而酶合成法副产物少，产物单一且易于分离提取，环境污染小，是目前生产α-熊果苷最常用的方法。

蔗糖磷酸化酶是一种同型二聚体的细胞内酶，属于糖基水解酶13家族。蔗糖磷酸化酶可在一步反应中将蔗糖转化为相应的糖基化产物，即将蔗糖的糖基转移至对应受体上，形成相应的产物。有研究表明，蔗糖磷酸化酶主要以蔗糖、1-磷酸-葡萄糖为糖基供体，多羟基的糖和糖醇、酚羟基、羧基等多类物质均可以作为该酶的糖基受体。蔗糖磷酸化酶由于其广泛的受体特异性，因而在高效生产α-熊果苷方面具有很大的潜力。迄今为止，在许多细菌中都发现了蔗糖磷酸化酶的存在，其中来自变异链球菌(Streptococcus mutans)和青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶最稳定。

枯草芽孢杆菌作为一种对环境无害的(GRAS)革兰氏阳性细菌，由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主及重要的模式菌株。

酶作为天然生物催化剂，相比于传统化学催化剂在经济、环境、技术角度都有巨大的优势。由于大多天然酶分子普遍存在热耐受性差、活性低、底物适用性差、立体选择性低等问题，很难满足实际工业生产的需要，人们经常需要对酶分子进行改造，大幅度提升其催化性能，以实现工业应用。半理性设计是一种常见的酶分子改造策略，基于对酶结构与功能关系的认识预测与催化相关的位点，并对其进行突变，以期获得性能提高的蛋白质突变体的方法。

此前，本人已经在枯草芽孢杆菌WB600中整合表达了源于S.mutans UA159的蔗糖磷酸化酶(SmSP，由gtfA基因编码)，以蔗糖和对苯二酚(HQ)为底物，全细胞催化合成α-熊果苷(如图1所示)。然而α-熊果苷的产量不够高，距离工业化仍有一段距离。

因此，如何利用表达蔗糖磷酸化酶(SmSP)的枯草芽孢杆菌更高效的催化合成α-熊果苷，是本领域亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种高效合成α-熊果苷的基因工程菌株及其构建方法与应用，该基因工程菌株可以稳定且较高效的合成α-熊果苷。

本发明的第一个目的是提供一种高效合成α-熊果苷的基因工程菌，所述的基因工程菌是在枯草芽孢杆菌宿主中，以P43为启动子，异源表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶。

进一步地，所述的异源表达为游离表达或整合表达。

进一步地，所述的游离表达是以pP43NMK-P43质粒为载体进行表达。

进一步地，所述的整合表达是将连接有P43启动子的蔗糖磷酸化酶基因片段整合至基因组上。

进一步地，所述的基因工程菌中蔗糖磷酸化酶的拷贝数为3，所述的连接有P43启动子的蔗糖磷酸化酶基因片段分别整合至ganA基因上、ycgB基因上，以及tcyP基因与yhcM基因之间。

进一步地，所述的枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600、枯草芽孢杆菌B.subtilis 168或枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800。

本发明的第二个目的是提供所述的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)将蔗糖磷酸化酶基因连接至含有P43的质粒上获得含有蔗糖磷酸化酶基因的表达载体，或将P43基因片段与蔗糖磷酸化酶编码基因片段相连后融合至整合框获得基因表达框，在表达框两端加上待整合位点上下游同源臂获得待同源重组的线性片段；

(2)将表达载体或线性片段转入枯草芽孢杆菌感受态中，筛选得到所述的基因工程菌株。

本发明的第三个目的是提供所述的基因工程菌在全细胞催化合成α-熊果苷中的应用。

进一步地，所述的应用是将所述的基因工程菌细胞作为催化剂，在25-35℃催化蔗糖和对苯二酚反应生产α-熊果苷；其中，催化体系包含OD₆₀₀＝30-60的基因工程菌细胞株，300-450g/L蔗糖，50-70g/L对苯二酚，0.5-2％Triton X-100。

进一步地，所述的基因工程菌细胞通过将所述的基因工程菌接种至TB培养基中35-38℃培养10-15h得到。

本发明的有益效果是：

本发明利用表达蔗糖磷酸化酶(SmSP)的重组枯草芽孢杆菌全细胞催化高效生产α-熊果苷，为α-熊果苷的生产提供了新的思路和方法。本发明通过分子对接以及定点饱和突变筛选到了SmSP酶活提高的蛋白突变体SmSP^I336L，通过增加SmSP^I336L在基因组上的拷贝数的方式，提高了SmSP的蛋白表达量，并通过优化BS-3SmSP^I336L菌株的催化条件，大幅提高了α-熊果苷的产量。当底物HQ的浓度为50g/L，蔗糖浓度为310.9g/L，菌体浓度OD₆₀₀＝40，催化体系在摇瓶中30℃、220rpm催化20h时α-熊果苷的产量达到115.8g/L，底物HQ的摩尔转化率为93.6％。

附图说明

图1为蔗糖磷酸化酶的反应机制；

图2为蔗糖磷酸化酶的晶体结构；

图3为蔗糖磷酸化酶的三维结构与底物HQ的三维结构进行分子对接示意图；

图4为重组菌BS-NMK-SmSP和BS-NMK-SmSP^I336L催化生产α-熊果苷的产量；

图5为重组菌BS-NMK-SmSP^I336L、BS-SmSP^I336L、BS-2SmSP^I336L和BS-3SmSP^I336L催化生产α-熊果苷的产量；

图6为不同底物浓度下α-熊果苷的产量；

图7为不同菌体浓度下α-熊果苷的产量；

图8为表面活性剂Triton X-100在不同浓度下α-熊果苷的产量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

涉及的检测方法：

α-熊果苷的测定方法：

高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，UV检测器，Agilent SB-Aq色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：10mmol/L的稀磷酸和甲醇(体积比为8:2)，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积为10μL。

实施例1：全细胞催化合成α-熊果苷

将待发酵的重组枯草芽孢杆菌于含有相应抗性的LB固体培养基上划线活化，37℃过夜培养。单菌落转接至添加有相应抗性的LB液体培养基(20mL)，37℃摇床养10h，得到种子液。将种子液以1％(v/v)的接种量转接至30mL添加相应抗性的TB培养基中，37℃培养12h，即得发酵液。将发酵液离心(8,000rpm，10min，4℃)收集细胞，用20mmol/L的PB缓冲液(pH 7.0)洗涤两次。全细胞催化体系包含310.9g/L蔗糖，50g/L HQ(蔗糖与HQ的摩尔比为2：1)，20mmol/L PB，细胞添加量OD₆₀₀＝20。全细胞催化反应在50mL的密闭容器中进行，置于30℃摇床中震荡反应20h。全细胞催化反应结束后，12,000rpm离心10min，上清液置于4℃保存。

实施例2：分子对接及定点饱和突变

在SWISS MODEL在线软件(http://www.swissmodel.expasy.org/)数据库中搜索SmSP的同源酶晶体模型，来自B.adolescentis(PDB ID:2gdv)的蔗糖磷酸化酶BaSP与SmSP同源性为43.74％，符合同源建模的要求，据此对SmSP进行建模。我们利用PyMOL软件观察和分析SmSP的晶体结构，如图2所示，该结构由两个同源亚基组成，可以分为四个结构域：A，B，B’和C。结构域B包含两个短的α-螺旋、反平行β-折叠以及loop A。结构域B’由一长一短两个α-螺旋组成，其中包含一个柔性环结构loop B。结构域C是由SmSP的前56个残基形成的五个反平行β-折叠组成。其中，结构域B和B’中包含了受体结合位点。结合相关文献分析，loop A和loop B对于受体结合的特异性至关重要，这两个柔性环覆盖了催化腔并随后协助特定底物结合与催化。

利用Discovery Studio软件将SmSP的三维结构与底物HQ的三维结构进行分子对接，结果如图3所示，选择D136、N333、I336三个位点进行定点饱和突变。设计饱和突变引物，以pP43NMK-P43-gtfA质粒为模板(SmSP由gtfA基因编码，该质粒在之前的研究中获得)，环形PCR扩增，将PCR产物分别转入大肠杆菌JM109中，涂布于氨苄抗性的平板上。测序正确后，提取质粒分别转入枯草芽孢杆菌WB600中，后涂布于卡那抗性的平板上。如图4所示，对定点饱和突变库进行催化验证，获得了SmSP的催化活力增强的BS-NMK-SmSP^I336L菌株，α-熊果苷的产量为54.5g/L。

实施例3：基因工程菌株BS-SmSP^I336L的构建

使用Cre-loxP系统进行基因组整合。选取整合位点ganA基因。首先构建待同源重组的线性片段，将构建好的壮观霉素整合框(线性spc基因两端带有loxP序列)通过融合PCR与突变后的P43-gtfA-mut基因表达框融合成为spc-gtfA-mut,在spc-gtfA-mut的两端通过融合PCR分别加上ganA基因的上下游同源臂(各800bp)，获得待同源重组的线性片段。将该线性片段转入枯草芽孢杆菌感受态中，涂布于壮观霉素平板，将菌P验证整合成功的转化子制备成感受态，将实验室保藏的温敏型Cre质粒转化入该感受态，添加IPTG诱导表达Cre重组酶消除Spc抗性基因，随后升温至40℃消除温敏型Cre质粒，获得BS-SmSP^I336L菌株。

实施例4：增加SmSP^I336L在基因组上的拷贝数

以BS-SmSP^I336L为出发菌株，使用Cre-loxP系统，按照实施例3所述，依次将gtfA-mut基因整合至基因组的另外两个位点(ycgB基因、tcyP与yhcM之间)，获得BS-3SmSP^I336L菌株。如图5所示，经催化验证，BS-3SmSP^I336L菌株α-熊果苷产量提高至84.3g/L。

实施例5：基因工程菌株的催化条件优化

(1)底物浓度优化

将基因工程菌株BS-3SmSP^I336L按实施例2所述进行发酵催化，细胞浓度OD₆₀₀＝20，不同的是底物对苯二酚HQ的浓度分别控制在30、40、50、60和70g/L,供体底物蔗糖与HQ的摩尔比仍然保持2：1。催化结果如图6所示，底物HQ浓度为50g/L时，工程菌α-熊果苷产量为84.3g/L，基本达到最高，继续增加底物浓度仅使产量小幅提升，而底物转化率明显下降。

(2)细胞浓度优化

将基因工程菌株BS-3SmSP^I336L按实施例2所述进行发酵催化，底物HQ浓度为50g/L，不同的是细胞浓度分别控制在OD₆₀₀＝10、20、30、40、50、60、80，催化结果如图7所示，细胞浓度为OD₆₀₀＝40时，工程菌α-熊果苷产量最高，为102.2g/L。

(3)全细胞催化体系中表面活性剂的优化

在全细胞催化过程中，细胞膜对底物分子HQ和蔗糖的渗透能力会直接影响胞内SmSP的催化效率。表面活性剂的添加，可以在一定程度上破坏细胞膜的完整性，使底物分子更好的透过细胞膜进入胞内，提高了胞内酶与底物接触的机会，进而提高全细胞催化效率。因此，我们在全细胞转化体系中添加不同浓度的表面活性剂Tween-80和Triton X-100，利用HPLC检测α-熊果苷的产量，当添加的表面活性剂为Tween-80时，α-熊果苷的产量没有得到明显的提高。当添加的表面活性剂为Triton X-100时，结果如图8所示，添加1％TritonX-100时，α-熊果苷的产量提高至115.8g/L，相比对照提高了13.3％。因此，我们选择在全细胞催化体系中添加体积分数为1％Triton X-100，以达到最高的全细胞催化效率。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 高效合成α-熊果苷的基因工程菌及其构建方法与应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 481

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Met Pro Ile Thr Asn Lys Thr Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu

1 5 10 15

Gly Lys Asn Leu Lys Glu Leu Asn Glu Asn Ile Glu Asn Tyr Phe Gly

20 25 30

Asp Ala Val Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly

35 40 45

Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ile Asp Tyr His Glu Val Asp Ser Ala Phe

50 55 60

Gly Asp Trp Asp Asp Val Lys Arg Leu Gly Glu Lys Tyr Tyr Leu Met

65 70 75 80

Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Gln Ser Lys Tyr Tyr Lys

85 90 95

Asp Tyr Gln Glu Lys His Glu Ala Ser Ala Tyr Lys Asp Leu Phe Leu

100 105 110

Asn Trp Asp Lys Phe Trp Pro Lys Asn Arg Pro Thr Gln Glu Asp Val

115 120 125

Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Arg Ala Pro Lys Gln Glu Ile Gln

130 135 140

Phe Ala Asp Gly Ser Val Glu His Leu Trp Asn Thr Phe Gly Glu Glu

145 150 155 160

Gln Ile Asp Leu Asp Val Thr Lys Glu Val Thr Met Asp Phe Ile Arg

165 170 175

Ser Thr Ile Glu Asn Leu Ala Ala Asn Gly Cys Asp Leu Ile Arg Leu

180 185 190

Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Leu Asp Thr Asn Asp Phe Phe

195 200 205

Val Glu Pro Glu Ile Trp Thr Leu Leu Asp Lys Val Arg Asp Ile Ala

210 215 220

Ala Val Ser Gly Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Thr

225 230 235 240

Ile Gln Phe Lys Ile Ala Asp His Asp Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala

245 250 255

Leu Pro Met Val Thr Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Gly Lys Val Asp Arg

260 265 270

Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr Leu

275 280 285

Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Val Lys Asp Ile Leu Thr

290 295 300

Asp Glu Glu Ile Thr Tyr Thr Ser Asn Glu Leu Tyr Lys Val Gly Ala

305 310 315 320

Asn Val Asn Arg Lys Tyr Ser Thr Ala Glu Tyr Asn Asn Leu Asp Leu

325 330 335

Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asp Asp Asp Gln

340 345 350

Lys Tyr Phe Leu Ala Arg Leu Ile Gln Ala Phe Ala Pro Gly Ile Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Tyr Val Gly Phe Leu Ala Gly Lys Asn Asp Leu Glu Leu

370 375 380

Leu Glu Ser Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser

385 390 395 400

Ser Glu Glu Ile Ala Lys Glu Val Lys Arg Pro Val Val Lys Ala Leu

405 410 415

Leu Asn Leu Phe Thr Tyr Arg Asn Gln Ser Ala Ala Phe Asp Leu Asp

420 425 430

Gly Arg Ile Glu Val Glu Thr Pro Asn Glu Ala Thr Ile Val Ile Glu

435 440 445

Arg Gln Asn Lys Asp Gly Ser His Ile Ala Thr Ala Glu Ile Asn Leu

450 455 460

Gln Asp Met Thr Tyr Arg Val Thr Glu Asn Asp Gln Thr Ile Ser Phe

465 470 475 480

Glu

Claims

1.一种高效合成α-熊果苷的基因工程菌株，其特征在于，所述的基因工程菌是在枯草芽孢杆菌宿主中，以P43为启动子，异源表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的异源表达为游离表达或整合表达。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的游离表达是以pP43NMK-P43质粒为载体进行表达。

4.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的整合表达是将连接有P43启动子的蔗糖磷酸化酶基因片段整合至基因组上。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌中蔗糖磷酸化酶的拷贝数为3，所述的连接有P43启动子的蔗糖磷酸化酶基因片段分别整合至ganA基因上、ycgB基因上，以及tcyP基因与yhcM基因之间。

6.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600、枯草芽孢杆菌B.subtilis 168或枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800。

7.一种权利要求1-6任一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将蔗糖磷酸化酶基因连接至含有P43的质粒上获得含有蔗糖磷酸化酶基因的表达载体，或将P43基因片段与蔗糖磷酸化酶编码基因片段相连后融合至整合框获得基因表达框，在表达框两端加上待整合位点上下游同源臂获得待同源重组的线性片段；

8.权利要求1-6任一项所述的基因工程菌在全细胞催化合成α-熊果苷中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用是将所述的基因工程菌细胞作为催化剂，在25-35℃催化蔗糖和对苯二酚反应生产α-熊果苷；其中，催化体系包含OD₆₀₀＝30-60的基因工程菌细胞株，300-450g/L蔗糖，50-70g/L对苯二酚，0.5-2％Triton X-100。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的基因工程菌细胞通过将所述的基因工程菌接种至TB培养基中35-38℃培养10-15h得到。