CN101395472A - 预测生物系统反应的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明方法采用了一种“系统生物学”方法来预测由于暴露于测试物质而引起的生物反应。在一个实施方式中，发明提供了一种对测试物质的生物系统效应进行预测的自动化方法。在另一实施方式中，发明提供了一种构建具有已知生物系统效应的参照物质的反应分布图的知识库(或数据库)的方法。在另一实施方式中，发明提供了一套用于实施分布图制作的方案和软件工具。本发明的另一实施方式是一组制备反应分布图所需的试剂和方案，以创建知识库，或与现存的知识库和信息软件一起使用来描述物质生理效应。本发明的另一实施方式是一个生理谱的数据库。
Description
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2006年1月17号提交的申请号为60/759,476和2006年9月20日提交的申请号为60/846,006的美国临时专利申请的优先权。这两个临时专利申请的全部内容均引入本文。
背景技术
旨在预测生物对测试物质的反应的方法对包括药物发现、个性化医疗、环境毒理学和生物医学研究在内活动是非常重要的。通常，实施试验以评价测试物质对预定目标的作用，所述作用可以是分子或细胞行为。在基础生物学研究和医学研究的领域中，例如细胞分析方法是常规使用的方法。一些这类研究是针对于药物开发，这类研究可识别有效的候选药物，这些候选药物将经历大量系列的临床前研究和临床研究。然而，由于安全性(如毒性)和/或效力而不合格的大量候选药物只能在人类临床试验后期阶段才能被发现。通过利用能预测候选药物在体内作用的早期阶段试验可减少这种无效结果。
个性化医疗是基于考虑患者整体特征以确定最有效治疗的疾病系统方法的新兴学科。源于基因组和蛋白组，尤其是与特定疾病症状相关联的那些基因和蛋白(通常被称为“生物标记”)的分子信息确实是患者的有价值资料源。但是，利用这种方法的个性化药物治疗受到生物标记的良好特征分类的限制，由于没有改进的细胞分析方法而无法检测对于每个单独的基因组的治疗效果。
环境毒理学提出的挑战是评价不断增加的物质对人类健康的影响。几个因素使问题复杂化，如不断增加的待检物质；需要检测在不同的暴露机制、浓度和时间下暴露环境的复杂性；和由于年龄和遗传变异对结果的影响的不确定性。美国国家卫生研究院的国家的毒理学计划和全世界其它政府和私人机构都积极地寻找可改善环境毒理学检测的效力并减少所需的动物试验数量的有效手段。
在这些领域以及其它的细胞分析方法是很重要的领域中，发展受到通常关注于单一细胞生理过程的方法的限制，因为可用于分析复杂的多成分系统反应的工具是有限的。在最近的一组细胞毒理试验，包括DNA合成、蛋白合成、谷胱甘肽损耗、过氧化物的诱导、胱天蛋白酶3的诱导、生物膜的完整性和细胞活性的结果比较中发现，这些试验平均只能预测一半的动物研究(Xu et al.，Chem Biol Interact，2004.150(1)：p.115-28.)。但是，这些试验都是独立进行，而没有尝试以任何定量方式组合这些读数以改善总体预测性。一些研究已表明可通过标准方法聚簇基于细胞分析的多维细胞反应以确定具有相似活性的化合物(Taylor et al.，Drug Discov Today，2005.2(2)：p.149-154；Mitchison，Chembiochem，2005.6(1)：p.33-9；Perlman，Science，2004.306(5699)：p.1194-8)。这些研究已给出了聚簇的化合物反应的原理的证据，但没有尝试将这类确定的聚簇与特定反应分布图联系起来然后利用这种反应预测未知物质的生理影响。已开发了一种简单的自动化分类器，这种分类器可与一些商购的方法一起使用。这种分类器允许使用布尔运算以将各种方法特征的输出组合成单个结果(Abraham et al.，Preclinica，2004.2(5)：p.349-355)。布尔运算允许方法开发者定义一种组合了几种特征测量的输出。这在扩大某些高内涵筛选(HCS)方法的范围上是非常有用的，但也有限制特征，布尔运算并不是特意为与多维特征集一起使用而设计的，也不容易使用。因此，需要一种更稳健的预测生物系统反应的方法。
发明内容
在一种实施方式中，本发明提供了一种对测试物质的生物系统效应进行预测的自动化方法。根据一个方面，提供了一组待用测试物质处理的细胞，且待处理的细胞含有荧光或发光报告分子或操纵的独特组合。所述报告分子可响应并指示功能反应，而所述操纵在细胞内产生功能反应。在添加报告分子或进行操纵之前或之后，用测试物质接触(孵育)细胞。在添加报告分子或进行操纵并将细胞与测试物质接触之后，对细胞进行成像或扫描以获得报告分子的荧光图像。之后，分析细胞图像以测量或检测细胞特征。然后，将这些来自于细胞的特征组合以形成测试物质的反应分布图。根据另一方面，提供了一组待处理的细胞，类似地，用测试物质孵育待处理的细胞。之后，获得所述组内的细胞的图像并进行分析以测量或检测指示细胞功能类别的细胞特征。然后，将这些来自于细胞的特征组合以形成测试物质的反应分布图。在另一方面，该方法最终包括将测试物质的反应分布图与具有已知生物系统效应的参照物质的反应分布图数据库(或知识库)进行比对。作为比对的结果，在测试物质的反应分布图和具有已知生物系统效应的参照物质的反应分布图数据库之间的关联程度表明了测试物质在活细胞、组织或生物体中将表现出生物系统效应的概率。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种构建具有已知生物系统效应的参照物质的反应分布图的知识库(或数据库)的方法。根据一个方面，提供了一组用测试物质处理的细胞，且被处理的细胞含有荧光或发光报告分子或操纵的独特组合。在添加报告分子或进行操纵之前或之后，用参照物质接触(孵育)细胞。在添加报告分子或进行操纵并将细胞与参照物质接触之后，对细胞进行成像或扫描以获得报告分子的荧光图像。之后，分析细胞图像以测量或检测细胞特征。然后，将这些来自于细胞的特征组合以形成参照物质的反应分布图。根据另一方面，提供了一组待处理的细胞，类似地，用参照物质孵育待处理的细胞。之后，获得所述组内的细胞的图像并进行分析以测量或检测指示细胞功能类别的细胞特征。然后，将这些来自于细胞的特征组合以形成测试物质的反应分布图。在另一方面，所述方法包括将测试物质的反应分布图与具有已知生物系统效应的参照物质的反应分布图的数据库(或知识库)进行比对。然后将参照物质的反应分布图添加到所述数据库中。可利用不同的参照物质(例如：第一参照物质，第二参照物质等)重复该步骤以丰富数据库。本发明还提供了一个反应分布图的知识库(或数据库)。
所述方法可实现预测体内功能反应的识别和归类以应用于药物发现、个性化医疗、环境毒理学、生物医学研究和其它领域(如：环境健康和工业安全性)。
在另一种实施方式中，本发明提供了一套用于实施分布图制作的方案和软件工具。本发明的另一种实施方式是一组制备反应分布图所需的试剂和方案，以创建知识库(或数据库)，或与现存的知识库(或数据库)和信息软件一起使用来描出物质生理效应的分布图。本发明的另一种实施方式是生理分布图的数据库或知识库。
通过附图和以下的详细说明将使上述的方面和其它发明特征变得显而易见。
附图说明
图1A和1B是本发明方法的一种实施方式的流程图。图1A是关于知识库或数据库的构建，图1B是关于利用知识库或数据库评价测试化合物。
图2描述了用复用HCS分析方法获得的示例性图像。
图3说明了处理板以制备本发明方法的分布图的样本流程。
图4说明了能显示有助于构建细胞反应分布图的细胞反应的一些图示(graphical display)方法。
图5说明了能显示有助于构建细胞反应分布图的细胞反应的一些图示方法。图5a描绘了一系列细胞反应数据图。5b描述了一副三维曲面图。图5c描绘了一副二维等值图或数据“分布图”。
图6说明了六种与毒性评价相关的毒性相关功能分类和对应的细胞特征的组合。
图7说明了实施例6所述的细胞特征细胞毒性仿形多功能板(CellCipherCytotox Profiling multiplexed plate)1和2的标准板设计。
图8是用细胞特征(CellCipher)分析基于实施例6所述的剂量的反应所生成的数据。
图9是表示实施例6所述的30种化合物检测组的细胞特征(CellCipher)分布图聚簇分析的数据。
图10表示了30种化合物检测组的细胞特征(CellCipher)分布图的主要成分分析。
具体实施方式
本发明的方法采用了一种“系统生物学”方法来预测由暴露于测试物质而引起的生物反应。所述方法通过整合对细胞系统的多种成分进行的基于细胞的分析以生成反应分布图，该反应分布图能在更高水平上预测细胞和细胞系统和生物体的功能和反应。本发明的方法的一种实施方式通过图1A和1B中的流程图进行说明。为建立这样的一个知识库或数据库，测定了参照物质的反应分布图并将其添加到数据库中(图1A)。为评价测试物质，将该测试物质的反应分布图与具有已知生物系统效应的参照物质的反应分布图数据库(或知识库)进行比对(图1B)。
本发明的方法是通过利用一组待用测试或参照物质处理的细胞来实施的。待检测组内的细胞可来自于一种类型的细胞或多种类型的细胞。而利用多种类型的细胞可更广泛地指示相关组织的反应。通常根据分析的目标功能来选择细胞类型。例如，对于制作毒性分布图，可选择肝细胞、心肌细胞或微血管内皮细胞。根据需要，这类细胞可以是原代细胞或已建立的细胞系(如：HepG2(人肝癌细胞))，并且可从多个供应商获得(如：Amphioxus、Admet Technologies、Multicell Technologies、Cambrex(Clonetics)、CellularDynamics、CXR Bioscience、Cambrex、Cell Applications Inc.和Geron(CxrBioscience))。根据需要，所述组内的细胞可以是一类或几类细胞的混合物。
所述组内的细胞可以任选地包括一种或多种报告分子和/或操纵。在一些实施方式中，所述细胞组内的每个细胞都含有报告分子和/或操纵的独特组合。在另一些实施方式中，所述组内的细胞群体含有报告分子和/或操纵的独特组合。细胞应含有许多适合接近生物系统的报告分子和/或操纵。通常，细胞含有至少6种或更多(例如至少约7种或更多，或至少约8种或更多)的独特组合，甚至至少约10种或更多，或至少约15种或更多的报告分子和/或操纵的独特组合。
在本发明的方法中，“报告分子”是一种荧光或发光分子，例如一种生理指示剂、标签、蛋白和生物传感器等。报告分子可以是一种蛋白或非蛋白物质。然而，当报告分子是蛋白物质时，所述细胞可表达一种或多种报告分子。可供选择地或附加地，可将一种或多种报告分子分子递送到细胞内，例如，通过粘附一个蛋白序列标签以促进通过膜的输入。在成像之前固定细胞的实施方式中，可利用标准标记技术提供报告分子。
适合用于本发明的方法的报告分子的标签实例包括，例如，能标记亚区室、定位蛋白、标记膜、响应膜势能、感知局部化学环境和读取分子游动并提供许多其它测量的探针(参见例如Waggoner，A.，＂Fluorescence probes foranalysis of cell structure，function and health by flow and imaging cytometry.，＂inApplications of Fluorescence in the Biomedical Sciences，D.Taylor，et al.，Editors.1986，Alan R.Liss，Inc.：New York.p.3-28.)。与抗体偶联的免疫荧光标记法提供了一种用于检测和定位蛋白或蛋白变体如磷酸化蛋白的简单方法。细胞还可以被设计表达用荧光蛋白的彩色变体中的任何一种标记的蛋白(Chalfie et al.，Science，1994.263(5148)：p.802-5；Chudakov，et al.TrendsBiotechnol，2005.23(12)：p.605-13)，并且这些荧光蛋白可以被进一步设计为形成生物传感器和特定细胞功能的指示剂(参见例如Conway et al.，ReceptorsChannels，2002.8(5-6)：p.331-41；Umezawa，et al.，Biosens Bioelectron，2005.20(12)：p.2504-1 1；Giuliano et al.，Trends Biotechnol，1998.16(3)：p.135-40；Giuliano et al.，Curr Opin Cell Biol，1995.7(1)：p.4-12)。在单个样品制备中可组合多种标签以测量群体中每一个单个细胞的许多特征以及作为整体的群体的许多特征(Zhang et al.，Cell，2004.119(1)：p.137-44；Taylor et al.，DrugDiscov Today，2005.2(2)：p.149-154)。量子点以它们的单个激发波长和窄发射频带提供在分析中更高程度的多路技术的潜能(Michalet，et al.，Science，2005.307(5709)：p.538-44)。除荧光探针的彩色信号外，许多生物发光和化学发光试剂可被有效地用于基于细胞的分析(Hemmila et al.，J Fluoresc，2005.15(4)：p.529-42；Roda et al.，Trends Biotechnol，2004.22(6)：p.295-303)。
在本发明的方法中，“操纵”是对一种或多种细胞的处理以影响在细胞中的功能反应(或改变)。可利用化学、生物、环境或基因处理来操纵细胞。这些处理可用于改变细胞离子、代谢物、大分子和细胞器的活性，所述活性的改变反过来影响表型的变化，表型的变化可被另外的物质处理进一步改变。操纵的实例包括蛋白的表达或高水平表达、蛋白表达的敲低(knockdown)、添加已知的反应刺激物、或添加可诱导干细胞或前体细胞分化的物质。在一种实施方式中，可通过以离子载体如离子霉素处理细胞，以调控细胞内游离钙离子浓度从而改变(操纵)细胞内离子浓度，或以尼日利亚菌素处理细胞以调节细胞内pH。在另一种实施方式中，以物质处理细胞以操纵细胞内代谢物浓度。例如，以毛喉素、8-Br-环腺苷酸(cAMP)或二丁基cAMP处理细胞，以改变细胞内信号代谢物cAMP浓度。在另一种实施方式中，可以操纵细胞，以改变细胞内大分子的活性和浓度。例如，大分子如蛋白可通过物理摄动方法如微注射或摩擦细胞被导入细胞中。或者，通过将分子如siRNAs、miRNAs或反义RNAs导入细胞降低细胞中蛋白的正常表达水平。在这方面，例如，可采用Cdc2 siRNA预处理以诱导细胞内G2细胞周期阻滞，G2细胞周期阻滞可被用于分析测试物质对诱导凋亡活性的抑制作用。在另一个实施例中，利用可诱导表达体系以控制编码蛋白的基因以及编码蛋白或其它大分子的RNA分子的表达可提高细胞中大分子的正常表达水平，所述可诱导表达体系例如那些采用基于昆虫(如蜕皮素)或基于抗生素(如四环素)的分子。而且，RNA分子可被导入细胞中操纵其它非编码RNAs如miRNAs、蛋白内含子部分转录的RNAs和任何其它一级或二级RNA分子的水平或活性，所述其它一级或二级RNA分子是由细胞内基因组或任何其它遗传物质的任何部分转录得到的。
将细胞接种在培养物上如微量培养板、显微镜载片或通常用于细胞分析的其它实验室器皿。通常，这类实验室器皿是透明的以便于后续的成像分析。优选微量培养板，因为它们有利于同时进行多个重复试验并易于用自动化设备操作。可以以任何所需的密度接种细胞以利于后续的成像分析。对于微量培养板，可在每个孔中加入几千个细胞(如每个40μl孔7000-8000个细胞)。
一旦接种，细胞即与测试物质或参照物质接触。在本发明中，“测试物质”或“参照物质”是在复杂细胞体系或生物体内的反应分布图是所需要的任意物质。例如，测试或参照物质可以是一种小分子(如一种“药物”或候选药物)、一种生物分子(如蛋白质、多肽、核苷酸(如DNA、RNA或杂交多核苷酸))、一种环境条件(例如渗透压、pH、温度或它们的组合)、电磁辐射(如光频、强度或持续时间)或其它类型辐射(如α、β和γ射线等)。当探讨某一物质对被研究的生物系统的影响时，该物质被当作测试物质处理。当某一物质对于生物系统的影响是已知，该物质对于细胞组的影响是期望的且其分布图可以添加到数据库或知识库中时，该物质为参照物质。
在实施本发明方法中，以一种适当的方法将测试或参照物质暴露于细胞以使测试或参照物质与细胞接触并与细胞相互作用。通常，当测试或参照物质是一种分子时，可加入到细胞所在位置(如，细胞放置的培养板的一孔)。然后分子可在细胞外表面与细胞相互作用或渗透进细胞并与其内部作用的物质(workings)相互作用。以一种适于其它物质的方法将其它类型的检测或参照物质(如，温度和辐射等)暴露于细胞。用检测或参照物质与细胞孵育适当时间，所述适当时间可以是一或几分钟至几天。可根据例如所需的是急性或慢性的活性来选择时间长度。
在选择性实施方式中，可采用不同的测试或参照物质以不同的浓度平行处理重复组(即类似组)的细胞以便构建每个浓度的反应分布图。例如，对于浓度范围从约1nM或更小至约1mM或更高的化合物可采用6-10点对数浓度系列。类似地，可将不同组的细胞(如具有不同报告分子或操纵的组)暴露于测试物质中。因而可平行处理不同细胞类型和/或浓度的重复组(如在同一多孔板的不同孔)并进行同时或平行分析。而且，可与测试物质或参照物质一起分析阴性和阳性对照细胞(如未处理孔或用具有已知活性的物质处理过的孔)。
将细胞暴露于测试或参照物质之后，获取细胞图像。当细胞含有一种或多种报告分子时，利用适合待成像的每种荧光或发光报告分子的频率(频段)获取图像。多元图像的例子显示在图2中。附加地或选择性地，可用能结合到所需的蛋白或细胞结构上的染料、荧光或发光标签(如抗体，配体等)对细胞着色，然后在适合待成像的各种染料、荧光或发光标签的频率(频段)成像。
分析细胞图像以测量或检测细胞特征，该细胞特征被选作为指示适合待分析特性(如毒性、慢性病理，组织病理等)的功能类别。因而，可选择报告分子(标签，染料等)靶向到(如结合到)适合分析细胞功能类别的特征。在每个这些细胞功能类别中，可通过一种或多种分析以测量在分析功能类别中作为反应指示的一种或多种细胞特征。在一种实施方式中，一种报告分子对应一种特征。在另一种实施方式中，一种报告分子可用于评价不同的特征。
根据分析目的，可选择任何适当的细胞功能类别。实施例1列出了适合评价毒性的细胞特征或功能类别的实例。在一种优选的实施方式中，细胞特征选自于由细胞增殖、应激途径、细胞器功能、细胞周期状态、形态、凋亡、DNA损伤、代谢、信号转导、细胞分化或细胞间相互作用所组成的组中的2种或多种功能反应类别。在另一种优选实施方式中，细胞特征选自于由细胞增殖、细胞周期、凋亡、氧化应激、应激激酶活化、线粒体功能、DNA损伤和过氧化物酶体增殖所组成的组中的2种或多于两种个功能反应类别。可被分析的指示细胞增殖的细胞特征包括核计数、细胞计数、总细胞质量、总DNA、细胞周期调节蛋白的磷酸化状态或细胞生长或分裂所涉及的任何蛋白的翻译后修饰状态。此外，可被分析的指示激活应激途径的细胞特征包括基因结合核因子(NF-κB)、衔接因子相关蛋白复合体1(AP1)、活化转录因子2(ATF2)、丝裂原-应激激活蛋白激酶1(MSK1)、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)或T细胞活化核因子(NFAT)的转录因子的活化，或p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、丝/苏激酶90(RSK90)或细胞外信号调节激酶的激酶(MEK)的激酶的活化。此外，可被分析的指示细胞器功能的细胞特征包括细胞骨架组织、线粒体质量或膜势能、过氧化物酶体质量、高尔基体组织、或膜通透性。另外，可被分析的指示细胞周期状态的细胞特征包括DNA含量、组蛋白H3的磷酸化状态、视网膜母细胞瘤蛋白的磷酸化状态、细胞周期蛋白B1(CDK1)的生物合成、细胞周期蛋白D1(CDK4)的生物合成、细胞周期蛋白E(CDK2)的生物合成。此外，可被分析的指示形态的细胞特征包括游动性、细胞扩展、粘附、边缘波动、神经突增生或集落形成。另外，可被分析的指示凋亡的细胞特征包括核的大小和形状、DNA含量和降解、胱天蛋白酶的活化，磷脂酰表达、Bcl2相关性X蛋白(Bax)转位。此外，可被分析的指示DNA损伤的细胞特征包括修复蛋白(APE)表达、抑癌基因(p53，视网膜母细胞瘤蛋白(Rb))表达、氧化活性(8-氧鸟嘌呤)，或转录活性(POU结构域蛋白1(Oct1))。另外，可被分析的指示代谢的细胞特征包括环腺苷酸(cAMP)浓度、P-糖蛋白活性或细胞色素P450(CYP450)诱导/抑制、或被添加物质的浓度。此外，可被分析的指示信号转导的细胞特征包括Ca++离子浓度、pH、蛋白表达、蛋白活化、蛋白修饰、蛋白转运或与特定途径相关的蛋白之间的相互作用。另外，可被分析的指示细胞分化的细胞特征包括组织特异性蛋白或表现出组织特异性形态。此外，可被分析的指示细胞间相互作用的细胞特征包括细胞间界面上紧密连接蛋白的浓度，或从一个细胞至另一细胞的物质转运。优选的可被分析的细胞特征包括微管稳定性、组蛋白H3磷酸化、线粒体质量、线粒体膜势能、p53活化、c-jun磷酸化水平、组蛋白H2A.X磷酸化水平、核大小、细胞周期阻滞、DNA降解和细胞损失(loss)。
可利用固定的细胞或活细胞进行成像分析所需细胞特征。对于活细胞分析，标记试剂(报告分子)可在扫描或读取板(或其它基底(substrate))之前任选地添加。固定和用报告分子如抗体、染料等标记(或染色)是常规程序并可自动化操作，自动化操作可提高分析过程的效率。对于固定细胞的分析，可获得空间信息，但只能获得一个时间点的空间信息。但是，当平行实施重复试验，可按所需时间间隔(如每几秒，每几分钟等)在分离的孔内固定细胞以便于分析随着时间推移的相似的细胞群体。相反，活细胞分析能实现一组细胞按照需要随时间推移以及空间被成像。然而，由于必需维持细胞生理健康一段时间以进行多种发光或荧光测量，因此，在测量中需要控制细胞的环境(如温度、湿度和二氧化碳)。对于活细胞或固定细胞分析，扫描细胞(或扫描分离的细胞子群)可重复多次以便于分析在每个时间点获取的对测试或参照物质的动力学反应。
通过标准方法和设备可实现获取细胞图像并分析提取的细胞特征(如Schroeder et al.，J.Biomol.Screen，1(2)，75-80(1996)；Taylor et al.，Toxicol.Pathol，22(2)，145-59(1994))，如高内涵筛选(HCS)(如Giuliano et al.，J BiomolScreen，1997.2(4)：p.249-259)和高通量细胞分析，自动化显微镜，或其它检测仪。简而言之，使用装置扫描每个样品或微量培养板的一个或多个光学区域，收集每个光学区域的一个或多个荧光频段。多波长图像可将一次的制备物的一组分析进行复合，但还可通过多次的制备物进行分析，并将特征测量组合到单个活动反应分布图中。可在图像获取过程中或在图像获取并处理之后提取细胞特征。适合的装置包括用于在整板上细胞群体反应的即时分析的，例如FLIPR(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)或FDS S6000(HamamatsuCity，Japan)，以及用于孔对孔和细胞对细胞分析的装置，如 HCS读取仪(Cellomics，Pittsburgh，PA)；固定终点和基于细胞的动力学分析；生成主要的细胞反应数据的图像分析算法；和用于提取衍生的特征如动力学参数、EC50、IC50和从测量中获得的群体反应分布的数据分析工具。所述分析可包括HCS分析和更高通量分析的组合，所述HCS分析是对单个细胞测量时进行的分析；所述更高通量分析是对在孔中的细胞群体作为整体在一个时间点或在多个时间点进行分析以测量动力学反应时的分析。对于动力学分析，可从动力学曲线中提取多个特征以建立附加的衍生的特征。例如，可从动力学曲线中衍生而来的特征如：峰的延迟、峰强度、半衰期、斜率和其它的特征。
算法用于从图像中提取信息以产生不同细胞特征的输出结果。通常地，该算法将原始图像数据转化成分析数据点。成像和细胞分析领域的技术人员知道易于获得许多这类算法，许多的所述细胞的生理过程适合基于细胞图像的分析以测量细胞功能。定制设计的算法或封装在由HCS供应商提供的生物应用软件中的算法，可产生多个数字特征值如亚细胞目标强度、形状和在光学区域内的每孔位置。vHCSTM Discovery Toolbox(Cellomics，Inc)，MetamorphTM(Molecular Devices)，来自于GE Healthcare的软件、以及其它HCS和图像分析数据包可被用于在获取图像后批量分析图像。在该系统中，根据细胞反应的异质性和分析方法的灵敏性，每孔中测量的细胞总数通常是100-1500。整板读取仪通常与软件一起提供以鉴别图像中的孔面积并测量在该面积内的一个或多个时间点的总荧光强度。
理想的是，算法用于组合不同细胞的特征的输出数据和对一个或多个测试板或孔的分析结果以产生一个适合预测更高水平整体功能的化合物的反应分布图。在不同时间点的细胞或板的特征可被组合(如某一生理反应持续一段时间)。可选择地，通过在不同孔或板加不同细胞类型的重复实验同样可被组合。优选地，反应分布图代表至少6个或更多特征或功能类别(如至少约7个或更多，或至少约8个或更多)和甚至至少约10个或更多，或至少约15个或更多特征或功能的类别。在板组内的每个板可产生一个图像集，该图像集由在待分析的每个波长和时间下每个孔中一个或多个区域的图像所组成。对图像集的分析产生每个板的细胞数据集，该数据集表示在板中的每个成像区域随时间和浓度系列变化的特征值。最后，处理细胞数据集并聚簇以形成反应分布图集，该反应分布图集可被添加到数据库或知识库中，或用于搜索数据库或知识库以识别可能的生理反应模式。图3说明了处理板以制备分布图的总体样本流程。
可使用几种方法从特征测量值产生分布图。例如，作为细胞群体移位的测量值的参数如柯司值(Kolmogorov-Smirnov(KS))或平均值可由在每种化合物的每个浓度下的每个特征测量值计算得到，其可生成系列稀释的参数。可利用4参数逻辑拟合法拟合该系列稀释的参数，并对得到的拟合数据进行分析以计算EC50值。将计算得到的EC50值依次转化成测试物质或参照物质活性测量值的对数形式。然后采用聚簇分析以鉴定分布图之间的相似性以及细胞体系反应之间的相关性。
图1A表示用于生成参照反应分布图以构建数据库或知识库的一种实施方式。根据这种方法，可分析某些通过算法生成的分析数据点以鉴定2种或多于两种个细胞子群。例如，核标记的强度与核内DNA的量是相关的。可分析孔中细胞群的核强度数据以识别含二倍体(2N)、四倍体(4N)和亚二倍体的DNA的细胞，亚二倍体的DNA表示存在DNA断裂。因而可根据1个或多个分析值将细胞群聚簇成子群，每个子群具有这些分析值的特征分布图，并因此表示一类细胞反应。在这个实施例中存在由一定比例的二倍体细胞、一定比例的四倍体细胞和一定比例亚二倍体细胞组成的三个子群和三个特征。这些特征的每个可被用作所述化合物的分布图中的一种成分。任意数量的其它分析特征的组合也可用于将细胞分类成子群。某些分析特征，如细胞损失部分，是整个群体的特征，因此可直接用作所述化合物的分布图中的一种成分。在所有情况下，将处理细胞的分析值与以介质(如0.4％二甲亚砜(DMSO))单独处理的细胞的分析值进行对比。
对化合物分布图进行聚簇分析，主要成分分析和其它模式分析方法以识别一批化合物中的共同反应分布图。化合物的这些聚簇表示一类共同反应，而该反应的分布图可被用于构建一个分类器。所有参照化合物的分布图与各类化合物的分布图一起被存储到用于附加模式分析的分布图数据库中。
图1B显示了用于产生包括评估测试化合物的反应分布图和该化合物的分类反应的一种实施方式。与参照化合物的分析一样，分析特征被进一步分析以识别细胞子群分布图，细胞子群分布图与直接分析特征一起形成化合物分布图，该化合物分布图被存储在数据库中。测试化合物的反应分布图与数据库或知识库中的分布图之间的相似性的测量值被用于计算测试化合物在体外或体内产生相关分布图的概率。用于比较化合物分布图的度量可以是任何标准度量如欧几里德(Euclidean)距离，皮尔森(Pearson’s)相关系数，曼哈顿(Manhatten)距离，或任何其它用于比较多参数分布图的度量。用参照化合物分析测试化合物分布图以识别测试化合物与特定聚簇的联接。本领域技术人员知道有多种联接模型以及其它分类方法可用于对与数据库中参照化合物分布图相关的测试化合物进行分类。
在本发明的另一种实施方式中，将每个细胞的所有细胞特征值组合以构成一个细胞分布图。将用参照化合物处理的细胞群体的细胞分布图聚簇以识别特定反应类别。因此，暴露于特定浓度的特定物质中的单个孔中的所有细胞被分类到这些反应类别中。然后这些类别的每个占有率变成该孔的群体反应分布图。将由参照化合物得到的群体分布图与由参照化合物得到的分布图链接起来并存储于数据库或知识库中。将由测试化合物得到的群体分布图与数据库中由参照化合物得到的群体分布图进行比对并计算匹配的概率。
为量化以参照或测试物质处理细胞群而诱导的细胞反应的变化，几种不同的方法可被有效应用。在一个细胞群内，由于细胞反应的异质性，可能存在许多不同的单个细胞反应分布图(Elsasser，Proc Natl Acad Sci USA 1984；81(16)：5126-9；Rubin H，Proc Natl Acad Sci U S A 1984；81(16)：5121-5)。在一种实施方式中，通过柯司(KS)拟合分析的优度(KS值)将在一个孔中或一个载片上对于每个细胞参数的细胞反应分布与对照物质导致的对于每个细胞参数的细胞反应分布进行比对(Giuliano et al.，Assay Drug Dev Technol2005；3(5)：501-14)。为对由复用HCS得来的细胞群分布数据随物质的变化进行显著性检验，一维KS检验可被调整至皮科克(Peacock)所述的二维(Peacock，Monthly Notices of the Royal Astronomical Society 1983；202：615-27)，并由法萨诺(Fasano)和弗朗西切尼(Franceschini)进一步优化(Fasano et al.，Monthly Notices of the Royal Astronomical Society 1987；225：155-70.)。以物质处理后获取的经复用HCS分析而来的表示两种生理参数的二维细胞群数据分布可与由多孔未处理细胞获取的二维细胞群数据分布比对。首先，每种分布可被分入由未处理细胞数据分布计算而得的X轴和Y轴的中间数值所定义的象限中。然后可通过搜索所有四个象限以求得在每个处理象限的细胞部分和每个相应的未处理象限的细胞部分之间的最大差值求出二维KS值。还可采用其它统计方法分析细胞群反应的异质性。几种其它可用的分析算法或方法(包括方法如神经网络方法)可被用于根据参照物质训练集的已知特性来对细胞反应分布图进行分类。可利用附聚聚簇来聚簇KS分布图，以识别具有相似活性的化合物。除KS分析方法外的其它方法可用于在聚簇类之前处理数据，且可有效应用各种聚簇算法。
还对有助于构建反应分布图的细胞反应图表进行分析，以有助于本发明方法的实施。图4显示了一些显示有助于构建细胞反应分布图的细胞反应的图示方法。这些图示方法还可用于浏览多维细胞反应。细胞特征图(4A)被用于识别与特定反应分布图相关的细胞功能。知道如此处的描绘的导致凋亡的细胞生理学事件可增强分类器的信息输出，但不必要求应用本发明的方法。细胞分布图(4B)描述了随物质的浓度变化的细胞反应分布变化。这些图显示了随物质浓度的变化，群体中的细胞如何占据离散的反应类别，并从一个类别转移到另一类别。细胞反应分布图(4C)被用于通过应用KS分析来量化群体反应分布的变化。
图5描述了用于由HCS分析获取的细胞群反应分布图的附加显象工具。通过利用三种显象工具显示了表明11个浓度的络厘麦莱蒂(laulimalide)(LML)对于MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞的DNA含量的影响的一个数据集。图5a描述了一组细胞反应数据图。每副图显示了在LML的每个浓度(nM)下细胞DNA含量的群体分布。以这种方法可容易地观察到群体分布形状的细微变化，但很难辨别整个浓度范围内的趋势。这就是KS分析为整个群体反应的移位提供的一种更灵敏的测量。5b描述了三维曲面图。当以适当的彩色编码在任选角度观察，一系列多彩的细胞群体分布曲线提供了一种理想的背景(context)，在该背景中可同时观察和分析一系列复合曲线。然而，因为图的形状粗劣且缺乏视觉定位(alignment)线索，在二维调色板如计算机屏幕或纸上比对多个三维曲面图是成问题的。图5c描绘了二维等值图或数据的“分布图”。用彩色编码分布图中数据点的密度能提供一种用于在二维平面上基本上投射出三维曲面图的独特的方法。例如，蓝色阴影可编码最低群体密度，而黑色和黄色阴影可编码最高群体密度。当DNA含量数据被制成分布图时可重现由三维曲面图提供的大量细节。而且，由于复用HCS数据集能同时成像因此多个分布图可容易地被排列。
在另一种实施方式中，本发明提供了一套方案和软件工具用于实施制备分布图。本发明的另一种实施方式是一组用于制备反应分布图的试剂和方案，以创建知识库，或与现存的知识库和信息软件一起使用来制备物质生理效应的分布图。本发明的另一种实施方式是一种生理分布图的数据库。这些将作为产品(即试剂盒)提供给终端用户，或以本发明试剂组和软件或以客户自己的方法用于为客户实施制备分布图服务。
因此，本发明提供了一种含有试剂和按本发明方法使用试剂的说明书的试剂盒。在一种实施方式中，所述试剂盒含有一种或多种试剂和根据以下方案采用所述试剂分析一组细胞的用法说明书；所述方案包括：用测试物质或参照物质孵育一组细胞；获取所述组内细胞的图像；分析所述图像以测量或检测指示细胞功能类别的细胞特征；和创建含有至少6种细胞特征的反应分布图。所述试剂盒还可包括用于比对测试物质的反应分布图和具有已知生物系统效应的物质的反应分布图数据库的用法说明书。所述试剂可包括细胞(如保存在液氮中)、一种或多种荧光或发光标签、实验室器皿如微量培养板、培养液等等。另外，所述试剂盒可包括具有已知生物系统效应的物质的反应分布图数据库(如在电子存储介质中)。例如，表7、8和9中指定的试剂可按用于实施标准数量的分析板的适当量来包装，如实施例6中所述的处理16种化合物的6块板。通常所述试剂盒包括如实施例6所述的样品制备方案，和任选地具有已知反应分布图的化合物的参照数据值。这类数据可通过以电子格式存储在CD或DVD盘或其它数据存储介质以及经由网络登录到集中的化合物分布图数据库提供。这些试剂的组合和方案的选择、试验和验证应当尽量避免干扰并确保可靠的性能，因此得到了难以重新设计的试剂和方法的独特组合，并能获得用于制备细胞活动的分布图的多元数据。
下列实施例将进一步阐述本发明，但不以任何方式限制发明的范围。
实施例1
该实施例说明了本发明的一种实施方式，在该实施方式中使用一组分析功能类别以制备物质毒性的分布图。
用于分析毒性的功能类别包括应激途径、细胞器功能、细胞周期阶段、形态变化、凋亡和DNA损伤。在下列表1和图6中给出了一些可用本发明方法分析以形成知识库或分析测试化合物的特征。
表1
| 细胞功能类别 | 特征 |
| DNA损伤 | i、细胞周期调节(DNA含量和降解)ii、核形态iii、P53蛋白活化iv、成视网膜细胞瘤蛋白磷酸化v、产生8-氧鸟嘌呤DNA损伤产物vi、Oct1转录因子活化vii、DNA修复蛋白无嘌呤无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子(APE/ref-1)的活化viii、组蛋白H2A.X磷酸化 |
| 应激激酶的磷酸化状态的变化 | i、ERKii、JNKiii、p38iv、RSK90v、MEK. |
| 凋亡指标 | i、DNA含量和降解ii、核形态iii、胱天蛋白酶的活化(多种亚型)iv、线粒体功能(质量-势能)v、Bax线粒体转位vi、线粒体中细胞色素c的释放vii、PARP活化 |
| 细胞形态和分化 | i、神经突增生ii、细胞扩展和肥大iii、细胞粘附iv、细胞游动性v、集落形成-分散 |
| 应激诱导转录因子活化或抑制 | i、NF-κBii、ATF-2iii、CREBiv、AP-1v、MSKvi、NFATvii、转录激活子通路(stat)1、2、3 |
| 代谢 | i、P-糖蛋白活性ii、CYP450诱导-抑制 |
| 细胞骨架 | i、.肌动蛋白细胞骨架稳定性ii、微管细胞骨架稳定性 |
在每个分析功能类别中，选择一种或多种分析用于测定一种或多种细胞特征以指示在该分析功能类别的反应。本发明的方法可用于验证附加的分析和功能类别，这些附加的分析和功能类别可被添加到分布图中以改善本发明特定实施方式的灵敏性、特异性或应用范围。
一个实施方式采用一组从每一类上述功能类别中选出一种功能的分析。首先这类分析用于构建预测毒理学知识库，然后生成测试化合物分布图以与知识库中的所述类别比对，从而预测该测试物质的毒理效应。本发明的另一种实施方式利用图6所列所有分析生成一个更广泛的分布图，然后通过统计方法如主要成分分析以识别对所选的毒理参数分布图具有最高预测力的特征。
用于分析这些细胞功能类别和特征的试剂是本领域技术人员公知的且是可商购供的。表2中列出了实例。
表2
| 细胞功能指标 | 细胞参数 试剂* 试剂来源 |
| 细胞增殖细胞周期凋亡 | 细胞数量 获彻斯特(Hoechst)33342 IVGN-H21492DNA含量 Sigma-B2261DNA断裂 AnaSpec-83218 |
| 氧化应激 | 提高的表达 兔(Rb)抗HlFlα Chemicon AB3883核位置 小鼠(Mo)抗HIFlα Chemicon AB5382核标记 小鼠(Mo)抗p-Hist H2A.X Upstate 05-636小鼠(Mo)抗p-Hist Upstate 16-202AH2A.X-FITC兔(Rb)抗p-Hist H2A.X Chemicon AB3369兔(Rb)抗p-Hist H2A.X Upstate 07-164 |
| 应激激酶活化 | 核标记 兔(Rb)抗p-c-Jun(ser 63) Upstate 06-828兔(Rb)抗p-c-Jun(scr 73) Upstate 06-659绵羊(Sh)抗p-c-Jun(T91/T93) Upstate07-570绵羊(Sh)抗c-Jun Chemicon CBL443 |
| 线粒体膜势能 | 线粒体强度 Mitotracker Red CMXRos invitrogon M7512Mitotracker Red CMH2XRos invitrogon M7513Mitotrackcr Orng CMTRos invitrogon M7510Mitotrackcr Orng CMH2TRos invitrogon M7511Mitotracker Red 580 invitrogon M22425Mitotracker Deep Red 633 invitrogon M22426 |
| DNA损伤 | 核标记 小鼠(Mo)抗p53 Chemicon CBL423小鼠(Mo)抗p53 Chemicon CBL422小鼠(Mo)抗p53(ser 392) Chemicon AB4060小鼠(Mo)抗p53(FITC) Chemicon CBL423F核标记 FITC-链霉亲和素 Chemicon SA103Qdot 565-链霉亲和素 Chemicon SA302Qdot 655-链霉亲和素 Chemicon SA306 |
| 凋亡 | 线粒体的释放 绵羊(Sh)抗细胞色素c Chemicon AB3547小鼠(Mo)抗细胞色素c Upstate 05-479小鼠(Mo)抗细胞色素c Chemicon MAB4612线粒体的释放 兔(Rb)抗AlF Chemicon AB16501兔(Rb)抗AlF Chemicon AB16502 |
| 过氧化物酶体增殖 | 过氧化物酶体强度 小鼠(Mo)抗PMP70 Affinity BiorcagentsPA1-650小鼠(Mo)抗PMP70 Invitrogen 71-8300兔(Rb)抗过氧化氢酶 Chemicon AB1212 |
| 第二抗体标签 | 驴抗小鼠Cy3 Chemicon AP 192C驴抗小鼠FITC Chemicon AP 192F驴抗小鼠Cy3 Chemicon AP 192S驴抗兔Cy3 Chemicon AP 182C驴抗兔FITC Chemicon AP 182F驴抗兔Cy5 Chemicon AP 182S驴抗绵羊Cy3 Chemicon AP 184C驴抗绵羊FITC Chemicon AP 184F驴抗绵羊Cy5 Chemicon AP 184S |
*所有试剂必须经验证以用于细胞的多种免疫荧光标记。
实施例2
该实施例说明了一种复用HCS毒性仿形组。
该组适于进行多种细胞类型的分析。所有组包括以细胞周期调节(如由DNA含量和降解分析的)作为功能类别和核形态测量。此外，下表3列出了可通过本发明方法分析以构成知识库或分析测试化合物的特征。
表3
| 细胞功能类别 | 特征 |
| 凋亡 | 1、线粒体质量2、线粒体的细胞色素c释放3、线粒体的Bax转位 |
| 细胞骨架-应激激酶 | 1、肌动蛋白细胞骨架稳定性2、微管细胞骨架稳定性3、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)(ERK)活化 |
| 神经毒性 | 1、神经突增生2、微管细胞骨架稳定性3、线粒体质量4、转录因子的活化(如NF-κB，ATF-2，或其它) |
| DNA损伤反应 | 1、组蛋白H2A.X的磷酸化2、P53蛋白的活化3、成视网膜细胞瘤蛋白的磷酸化 |
| 转录因子活化的调控 | 1、由肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和茴香霉素混合物引发的活化2、NF-κB和p38的活化3、c-jun或ATF-2的活化 |
实施例3
该实施例说明了利用RNAi敲低以提供关于细胞毒性反应的附加系统细胞生物学信息。
将特定的siRNA预处理物重叠以形成复用HCS毒性仿形组，如实施例1和2所示。以Cdc2的siRNA(编号42819；Ambion，Inc.；Austin，TX)预处理细胞诱导G2细胞周期阻滞，G2细胞周期阻滞可用于改变化合物毒性的检测(如：通过分析诱导凋亡活性的抑制)。实施该策略可以包括(a)在单个细胞类型中利用复用HCS分析方法交叉分析多组siRNA和(b)利用复用HCS分析方法并使用单一的siRNA预处理物，交叉分析多组细胞类型。
实施例4
该实施例说明了利用HCS毒性仿形以扩展毒理基因组学和整个动物研究。
之前，毒理基因组学已被用于在药物开发中预测毒性(参见Carson et al.，Cancer Res.64：2096(2004))。在本研究中，在用喜树碱处理后测量Hela细胞中mRNA丰度的总体变化。使用生物信息学软件按照标准基因本体论(GO)分类聚集喜树碱调节最显著的基因。多种分子途径和细胞功能被鉴定为参与毒性反应的潜在的候选者：1、p53诱导的基因(变化28.1％)，2、核区基因(变化16.5％)，3、NF-κB诱导基因(变化12.5％)，4、有丝分裂相关基因(变化9.7％)，5、组蛋白基因(变化8.1％)，和6、双链DNA断裂修复基因(变化4.0％)。利用如表4所列的复用HCS毒理组可扩展该研究。
表4
| 细胞功能类别 | 特征 |
| p53活化和细胞周期组 | a、p53蛋白活化b、细胞周期调节(DNA含量和降解)c、成视网膜细胞瘤蛋白磷酸化d、PSK90应激激酶磷酸化e、Cdc2 siRNA预处理 |
| 转录因子组 | a、NF-κB活化-抑制b、IRF-3活化-抑制c、Stat-3活化-抑制 |
| 有丝分裂和组蛋白修饰组 | a、组蛋白H3磷酸化b、CENP-A磷酸化c、微管细胞骨架稳定性 |
| 组蛋白和DNA双链断裂-修复组 | a、组蛋白H2A.X磷酸化b、ATM磷酸化c、8-氧鸟嘌呤生成 |
实施例5
该实施例说明了使用HCS毒性仿形组合测量在混合细胞类型群体中对肝代谢的毒性和潜能。
将具有特定的药物代谢活性的肝源细胞与肿瘤源细胞共培养，并通过复用HCS毒性仿形分析法分别测量了两个细胞群体的毒性反应。具有药物代谢活性的肝源细胞可以是，例如1、具有CYP450活性的组成型混合的原代肝细胞，或2、设计成表达特定CYP450活性的肝源细胞(如3A4，1A2等)。在形成的这类肝源细胞和肿瘤源药物靶细胞的共培养物中，两个群体被分别标记以便使两个群体的反应可被分别测量。然后将这种共培养物包含到如其它实施例所述的复用HCS毒性仿形分析组中。
然后可利用一组具有已知毒性效应如肝炎、胆汁郁积、硬化、黄疸、脂肪变性和其它肝代谢潜能的药物来验证毒性代谢筛选系统。而且，毒性代谢系统可用于筛选单个化合物以及化合物组合(如药物之间相互作用)的文库。
实施例6
该实施例关于复用毒性HCS仿形组。描述了特定的CellCipherTM细胞毒性仿形的实施，该CellCipherTM细胞毒性仿形被设计成利用2个板分析测量11个细胞毒性参数的。该实施例还说明了如何分析和解释获得的反应数据。
方法和试剂的说明。细胞毒性分布图板(Cytotox Profile Plate)1含有表5所列的标签和特征，而细胞毒性分布图板2含有表6所列的标签和特征。用于细胞毒性分布图板1的抗体、荧光指示剂和细胞生理反应物的说明包列在表7中，而用于细胞毒性分布图板2的抗体、荧光指示剂和细胞生理反应物的说明列在表8中。最后，用于细胞毒性分布图板1和2的试验缓冲液说明列在表9中。
表5-CellCipherTM细胞毒性分布图：复用板1
| 细胞参数 | 测量 | 试剂 |
| (1)细胞损失(2)细胞周期阻滞(3)DNA降解(4)核大小 | ％细胞损失％二倍体细胞％亚二倍体细胞核面积 | Hoechat 33342 |
| (5)氧化应激 | 平均核强度Ch2 | 小鼠-抗-磷酸组蛋白H2A.XFITC-驴-抗-小鼠-IgG |
| (6)应激激酶活化 | 平均核强度Ch3 | 兔-抗-磷酸-c-junCy3-驴-抗-兔-IgG |
| (7)DNA损伤反应 | 平均核强度Ch4 | 绵羊-抗-p53Cy5-驴-抗-绵羊-IgG |
表6-CellCipherTM细胞毒性分布图：复用板2
| 细胞参数 | 测量 | 试剂 |
| 细胞损失细胞周期阻滞DNA降解核大小 | 细胞数量％二倍体细胞％亚二倍体细胞核面积 | Hoechat 33342 |
| (8)线粒体功能I(势能) | 平均细胞质强度@30分钟 | 线粒体示踪红(MitoTracker Red) |
| (9)线粒体功能II(质量) | 平均细胞质强度1-3天 | Mito Tracker Red |
| (10)有丝分裂标记 | 平均核强度 | 兔-抗-磷酸组蛋白H3FITC-驴-抗-兔-IgG |
| (11)微管细胞骨架稳定性 | 平均强度超过核的平均强度 | 小鼠-抗-α微管蛋白Cy5-驴-抗-小鼠-IgG |
表7-复用板1的试剂要求
| 板1的细胞参数 | 试剂 | 目录号(标签号) | 原试剂的初始稀释度(保存温度) | 原试剂的最终稀释度或最终试剂浓度 | 一个384孔微量培养板所要求的初始稀释度试剂的精确体积 |
| (1-4)核 | Hoechst33342 | SigmaB2261(044K4096) | 用水重组至10mg/.ml(4℃) | 1:10000 | 0.38μl |
| (5)氧化应激第一抗体 | 抗磷酸组蛋白H2A.X | Millipore 05636(27505) | 没有重组。已经含有30％甘油(-20℃) | 1:200 | 19.2μl |
| (5)氧化应激第二抗体 | FITC-抗-小鼠IgG | Millipore AP192F(0508006630) | 用400μl50％的甘油重组(-20℃) | 1:300 | 12.8μl |
| (6)应激激酶活化第一抗体 | 抗-磷酸-c-jun | Millipore 06659(28691) | 没有重组。已经含有30％甘油(-20℃) | 1:200 | 19.2μl |
| (6)应激激酶活化第二抗体 | Cy3抗-兔-IgG | Millipore AP182C(0605029437) | 用400ul50％的甘油重组(-20℃) | 1:300 | 12.8μl |
| (7)DNA损伤反应第一抗体 | 抗-p53 | CalbiochemJA1308(D252944) | 以等体积甘油稀释(-20℃) | 1:400 | 9.6μl |
| (7)DNA损伤反应第二抗体 | Cy5抗-绵羊IgG | Millipore AP184S(601021122) | 用400μl50％的甘油重组(-20℃) | 1:300 | 12.8μl |
试剂绝对体积由液体操作设备所决定。通常，要求的精确体积必须增加10-20％以补足液体操作设备要求。
表8-复用板2的试剂要求
| 板2的细胞参数 | 试剂 | 目录号(标签号) | 原试剂的初始稀释度(保存温度) | 原试剂的最终稀释度或最终试剂浓度 | 一个384孔微量培养板所要求的初始稀释度试剂的精确体积 |
| 核 | Hoechst33342 | Sigma B2261(044K4096) | 用水重组至10mg/ml(4℃) | 1:10000 | 0.38μl |
| (8)线粒体功能I | Mito TrackerRed | InvitrogenM7512(42746A) | 用DMSO重组至1mM(-20℃) | 1:20000 | 0.19μl |
| (9)线粒体功能II | Mito TrackerRed | InvitrogenM7512(42746A) | 用DMSO重组至1mM(-20℃) | 1:20000 | 0.19μl |
| (10)有丝分裂标记第一抗体 | 抗-磷酸组蛋白H3 | Millipore06570(32219) | 以等体积甘油稀释(-20℃) | 1:400 | 9.6μl |
| (10)有丝分裂标记第二抗体 | FITC抗-兔IgG | MilliporeAP182F(508007651) | 用400μl50％的甘油重组(-20℃) | 1:300 | 12.8μl |
| (11)微管细胞骨架第一抗体 | 抗-α-微管蛋白 | Millipore05829(32508) | 以等体积甘油稀释(-20℃) | 1:1000 | 3.8μl |
| (11)微管细胞骨架第二抗体 | Cy5抗-小鼠IgG | MilliporeAP192S(0604027318) | 用400ul 50％的甘油重组(-20℃) | 1:300 | 12.8μl |
试剂绝对体积由液体操作设备所决定。通常，要求的精确体积必须增加10-20％以补足液体操作设备要求。
表9-复用板1和2的试验缓冲液的要求。
| 试验步骤 | 试剂 | 目录号(标签号) | 一个384孔微量培养板所需要缓冲液的精确体积 |
| 甲醛的稀释 | 含酚红的汉克斯(Hanks)平衡盐溶液-1X | HycloneSH30030.03(AQL25083) | 15.4ml |
| 透化试剂的稀释 | 含酚红的Hanks平衡盐溶液-1X | HycloneSH30030.03(AQL25083) | 6.1ml |
| 固定后的洗涤 | Hanks平衡盐溶液-1X | HycloneSH30268.02(AQK24922) | 38.4ml |
| 透化后的洗涤 | Hanks平衡盐溶液-1X | HycloneSH30268.02(AQK24922) | 38.4ml |
| 第一抗体标记后的洗涤 | Hanks平衡盐溶液-1X | HycloneSH30268.02(AQK24922) | 38.4ml |
| 第二抗体标记后的洗涤 | Hanks平衡盐溶液-1X | HycloneSH30268.02(AQK24922) | 38.4ml |
试剂绝对体积是液体操作设备所决定。通常，要求的精确体积必须增加10-20％以补足液体操作设备要求。
HepG2细胞操作和接种程序。从美国典型培养物保藏中心(保藏号HB-8065)处获取HepG2细胞，且原始保存的细胞种子被制成一瓶装有1×10+6个细胞。按照标准程序从储存的细胞种子制备成暂时储存的细胞。需要时将暂时储存的细胞解冻并在丢弃前持续培养20代。细胞培养在附加了10％胎牛血清(FBS)(Hyclone SH30071.03)，非必需氨基酸(Hyclone SH30238.01)，青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Hyclone SV30082.01)，和丙酮酸钠(HycloneSH30239.01)的MEM/EBSS(Hyclone SH30244.01)中。细胞培养在含20ml培养液的T-150、通气、没有包被的TC培养瓶中(Corning 430825)。大约每3-4天传代细胞一次，这时细胞汇合率为约70％，并利用标准胰蛋白酶消化方法按1:4或1:5(大约4×10+6细胞)的稀释率传代。
制备用于细胞毒性分布图的HepG2细胞。在将细胞接种到微量培养板的前一天，用胰蛋白酶消化传代HepG2细胞(70％的汇合率)，包括研制，并再接种到除去细胞的同一培养瓶中。
接种用于细胞毒性分布图的细胞。为了获得细胞毒性分布图，采用薄底384孔微量培养板，该板符合在大多数HCS读取仪上可用到的高数值孔径光学部件的要求。Falcon #3962板具有最大的表面积，适合于HCS。以胶原I包被液包被这些微量培养板，用按1:1000溶解在冰醋酸(Sigma A6283)中浓度为0.25mg/ml的胶原I(Sigma C9791)冲洗微量培养板，然后将微量培养板在无菌罩中晾干产生了非常适合HepG2细胞粘附和扩散的基底。在晾干的384孔微量培养板中添加溶解的胶原I(16μl/孔)，将该板在室温下孵育5分钟，然后将溶液从孔内甩出，并将微量培养板置于无菌罩中晾干。通过胰蛋白酶消化传代细胞，包括研制和计数活细胞。为每个微量培养板制备浓度为1.0、2.0或3.5×10+6细胞/20ml的细胞悬浮液(20ml)，并在每孔中加入40μl细胞悬浮液以在每个时间点产生下列的细胞密度：处理30分钟-每孔7000个细胞；处理24小时-每孔4000个细胞；和处理72小时-每孔2000个细胞。在添加完每一块微量培养板后，将微量培养板置于稳定的平台上静置30分钟。在室温下静置30分钟后将微量培养板置入37℃的含5％CO2的孵育箱。
化合物制备和细胞的处理。用DMSO(Sigma D8418)按以下浓度制备标准化合物：喜树碱-Sigma C9911，20mM；茴香霉素-Sigma A9789，10mM；氰氯苯腙(CCCP)-Sigma C2759，100mM；和紫杉醇-Sigma T7191，5mM。用DMSO将测试化合物制成浓度为25mM，并在-20℃下保存。在用含酚红的HBSS进一步稀释之前所有化合物都用DMSO稀释。标准化合物的最高终浓度如下：喜树碱-10μM(对于每3板的组用200μl的5倍溶液[50μM])；茴香霉素-10μM(对于每3板的组用200μl的5倍溶液[50μM])；CCCP-100μM(对于每3板的组用200μl的5倍溶液[500μM])；和紫杉醇-1μM(对于每3板的组用200μl的5倍溶液[5μM])。每一步以稍微超过3倍(10的平方根)稀释每种化合物以制备10个点的稀释液组。化合物的添加通过转移10μl的5倍的化合物储液液来完成。所有情况下，在添加化合物(50μl总体积)后，DMSO在每孔中的终浓度为0.4％。
在固定前用Mito Tracker Red标记细胞毒性仿形复用板2。首先，在温热的介质中制备100nM Mito Tracker Red储液。在微量培养板的每孔中，加入50μl的这种2倍的Mito Tracker Red溶液以获得终浓度为50nM。将微量培养板置入37℃的CO2孵育箱中孵育5分钟。然后将流体从微量培养板上移除并在每孔中加入50μl的细胞培养液。再将微量培养板置入37℃的CO2孵育箱中孵育30分钟，之后按细胞固定方案固定细胞。
细胞固定方案。用含酚红的HBSS制备含有浓度为7.2％的甲醛(Sigma，252549，36％储液)的2倍的固定液。在微量培养板的每孔中加入50μl固定液。将微量培养板在室温下孵育30分钟，之后用HBSS(100μl/孔)洗涤并立即除去HBSS。
细胞透化和标记方案。在室温下用0.5％(v/v)趋通X-100(TritonX-100)(Sigma T9284)孵育5分钟(16μl/孔)进行细胞透化。用HBSS(100μl/孔)洗涤微量培养板并立即除去HBSS。复用板1中的细胞用表3所列的第一抗体试剂在室温下孵育1小时(10μl/孔)。复用板2中的细胞用表4所列的第一抗体试剂在室温下孵育1小时(10μl/孔)。用HBSS(100μl/孔)洗涤微量培养板并立即除去HBSS。复用板1中的细胞用表3所列的第二抗体试剂和Hoechst 33342在室温下孵育1小时(10μl/孔)。复用板2中的细胞用表4所列的复用板2的第二抗体试剂和Hoechst 33342在室温下孵育1小时(10μl/孔)。用HBSS(100μl/孔)将微量培养板洗涤两次并将第二次的洗涤液保留在各孔中。密封微量培养板以用于HCS分析。
CellCipher细胞毒性分布图复用板的标准板设计。图7描绘了用于复用板1和2的标准板设计。每块微量培养板包括24个分布在角落的DMSO对照孔。每块微量培养板包括2个重复的标准毒素的10个点的浓度系列。每块微量培养板还包括16个重复的测试毒素的10个点的浓度系列。
板的读取。利用与
存储数据库连接的生物应用软件在
HCS读取仪上进行已制备的微量培养板或载片的细胞的成像。与相同或可选择的图像分析数据包连接的其它HCS读取仪和仪器(应用软件)，以及其它显微镜成像系统也可用于实施数据的获取和特征的提取。简而言之。用于扫描每个样品或微量培养板的孔中的一个或多个光学区域的装置为能收集每板上每一光学区域的4个频段的荧光。
算法。含在Cellomics生物应用软件的算法可对每个细胞和每板每孔产生多个数字特征值。细胞特征的实例包括亚细胞目标总强度和平均强度，形状特征如周长与面积之比和长宽比，和光学区域内每个细胞的位置。理想的特征是孔中测量的整个细胞群的平均或累计，并包括细胞计数、平均核大小、平均核强度、总核均度、平均细胞质/核比值和这些平均值的标准衍生值。根据添加化学化合物对细胞粘附到基底上的影响，每孔中测量的细胞总数量通常在100-1500，这还取决与细胞反应的异质性和分析方法的灵敏性。分析方法输出参数被用于测量表1和2在3个时间点所示的11个细胞毒性参数，3个时间点的反应分别为急性(30分钟)反应、早期(24小时)反应和晚期(72小时)反应。例如，为计算在核形态上的变化，使用了每个细胞的平均核强度值。利用以磷酸组蛋白H3特异的抗体标记的细胞的平均核强度获得了组蛋白H3磷酸化的测量值。表1和2列出了用于提取生物功能信息的特定图像特征。成像和细胞分析领域技术人员将会认识到许多容易可用的这类算法，并且存在许多适合基于细胞图像分析以测量细胞功能的这类细胞处理方法。
量化反应值。为量化以参照或测试分子处理细胞群体而诱发的细胞反应总体变化，利用非参数柯司(KS)拟合分析的优度(KS值)将孔中对于每个细胞参数的细胞反应分布与仅含有DMSO的对照孔的分布进行比对(Giuliano etal.，Assay Drug Dev Technol 2005；3(5)：501-14)。KS分析为每个孔以及每个浓度生成了单个值。利用XL拟合(IDBS，Guildford，UK)将剂量-反应数据拟合为4参数逻辑模型。将对整个浓度系列拟合的IC50值转化成对数形式(-log[IC50])。图8描述了一种化合物美伐他汀在单个时间点的剂量-反应拟合实例。用该组中的所有化合物的反应值创建了一个表格。
化合物反应的聚簇和分类。图9是该组内所有化合物的反应值的热图。化合物的名称沿水平轴分布而测得的特征分布在垂直轴。测得的特征分为3组；在30分钟测量的急性反应，24小时的早期反应和暴露72小时后的慢性反应。灰度表示IC50浓度，其中白色表示浓度的单位为mM及以上，中性灰色表示浓度的单位为μM和黑色表示浓度的单位为nM及以下。利用标准欧几里德距离度量聚簇化合物。本领域技术人员将认识到也可使用许多其它度量。系统树图顶端的高度表示分布图之间的相似程度，而较短分支表示分布图相似程度更高。用矩形A-C表示化合物的三个聚簇。在矩形A中的3种化合物在任何试验中都没有活性，因此具有非常高的相似程度。在聚簇B中的2种化合物，美伐他汀和洛伐他汀在许多试验中具有中等的活性程度(在μM范围内)，在试验中具有非常相似的活性分布图，且事实上具有非常相似的化学结构。聚簇C中的5种化合物在许多试验中具有非常高的活性程度(在nM范围内)，在它们的分布图中的相似程度是变化的。甚至在这个小数据集内，化合物反应分布图的聚簇可用于识别化学上相似的，以及生物上相似的化合物。除许多聚簇分析方法之外，数据收集(datamining)领域的技术人员将认识到其它统计方法可有效地用于发现多维数据集例如这个之间的关系。图10说明了了这个相同数据集的主要成分(PC)图。主要成分分析(PCA)是本领域所公知的，并可使数据的线性图转化成一组正交成分以使差异最大化。图10绘制了图9数据的初始的2个PCs。接近该图中部的最大聚簇是在初始的2个PCs中没有或几乎没有区别的化合物。但是有化合物的2个明显聚簇(图10中的A和B)，这些化合物明显区别于其它的化合物，但相对初始的2个PCs是相互类似。也存在2种化合物(图10中C和D)，对于初始的2个PCs这2种化合物在该组中是独特的。在此图中几种其它化合物也是区别明显。第一个PC的输入值的分析表明许多不同的试验特征对于PC中的差异的贡献几乎相等。10个最明显的试验是：慢性氧化应激、染色质凝集、应激激酶活化、细胞损失、DNA修复活性、核大小、和早期的应激激酶活性、氧化应激、核大小和细胞损失。这些特征的PC输入值在0.22-0.3表明所有这些特征通过这个分布图对化合物区别都有明显贡献。对其它PCs的输入值的分析表明甚至在这个小文库中大多数分析特征明显有助于区分细胞对这些化合物的作用模式，结论是在该分布图中的分析广度提供了一种可比对化合物活性并识别作用的共同模式的重要工具。
本文所引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利都被引入本文作为参考，这与每篇参考文献以单独和特别指出地以全文形式引入本文作为参考的程度相同。
除非本文另有说明或与内容明显矛盾，本发明的上下文中(尤其是在下列的权利要求的上下文中)使用的术语“一个”、“一种”和“该”和类似形式应解释成包括单数和复数。除非另外指出，术语“含有”，“具有”和“包括”应解释成开放式术语(即表示“包括但不限于”)。除非另外指明，本文描述的值的范围仅仅意在作为单独提及的落在该范围内的每个离散的值的速记方法，且每个离散的值被加入本说明书中如同它们在本文中被单独地描述一样。除非另外指出或与内容明显矛盾，本文所述的所有方法可通过任何适宜的次序实施。除非另有声明，本文使用的任意和所有实施例，或示例性语言(如“例如”)仅为于更好地阐述本发明而不限制本发明的范围。在说明书中任何表示非必需的元素的语言不应解释为表示实施本发明所必需的元素。
本文所述了本发明的优选实施方式，包括本发明的发明人已知的实施本发明的最佳方式。这些优选实施方式的变形对于本领域普通技术人员在阅读前述说明之后是显而易见的。本发明的发明人可预期技术人员能适当地运用这些变形，并且本发明的发明人欲以不同于本文具体所述的方式来实施本发明。因此，在所适用的法律允许下本发明包括所附权利要求所述主题的所有修饰和等效方式。而且，除非本文另有说明或与内容明显矛盾，上述元素以所有可能变形的任何组合也包含在本发明内。
Claims (48)
1、一种对测试物质的生物系统效应进行预测的方法，该方法包括：
a、提供一组待处理的细胞；
b、用所述测试物质孵育所述细胞；
c、获取所述组中的细胞的图像；
d、分析所述图像以测量或检测指示细胞功能类别的细胞特征；
e、创建含有至少6种细胞特征的反应分布图；
f、将测试物质的反应分布图与具有已知生物系统效应的物质的反应分布图数据库进行比对；其中测试物质的反应分布图与具有已知生物系统效应的物质的反应分布图数据库之间的关联程度表示了所述测试物质在活细胞、组织或生物体中表现出生物系统效应的概率。
2、一种构建具有已知生物系统效应的参照物质的反应分布图数据库的方法，该方法包括：
a、提供一组待处理的细胞；
b、用第一种参照物质孵育所述细胞；
c、获取所述组中的细胞的图像；
d、分析所述图像以测量或检测指示细胞功能类别的细胞特征；
e、创建含有至少6种细胞特征的反应分布图；
f、将第一种参照物质的反应分布图添加到数据库中；和
g、任选地，以第二种参照物质取代第一种参照物质来重复步骤a-f。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其中，在获取所述图像之前，所述细胞含有一种或多种荧光报告分子或发光报告分子。
4、根据权利要求3所述的方法，其中，所述细胞表达一种或多种荧光报告分子或发光报告分子。
5、根据权利要求3所述的方法，其中，所述一种或多种荧光报告分子或发光报告分子被导入到所述细胞中。
6、根据权利要求1-5中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞的图像是在以靶向所述指示细胞功能类别的细胞特征的一种或多种荧光或发光报告分子进行标记之后获取的。
7、根据权利要求3-6中的任意一项所述的方法，其中，所述报告分子选自由荧光标签、荧光蛋白、发光标签和生物传感器所组成的组中。
8、根据权利要求1-7中的任意一项所述的方法，其中，在获取所述图像之前，所述细胞含有一种或多种操纵。
9、根据权利要求8所述的方法，其中，所述操纵选自由蛋白表达、蛋白表达的敲低、添加已知反应的刺激物、或添加诱导干细胞分化的物质所组成的组中。
10、根据权利要求1-9中的任意一项所述的方法，其中，在获取所述细胞的图像之前固定所述细胞。
11、根据权利要求1-9中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞是活体成像的。
12、根据权利要求1-11中的任意一项所述的方法，其中，利用算法对所述图像进行分析以从所述图像中提取信息并输出所述细胞特征。
13、根据权利要求1-12中的任意一项所述的方法，其中，利用包括聚簇分析的方法将所述特征组合到反应分布图内。
14、根据权利要求1-13中的任意一项所述的方法，其中，将所述细胞与一系列浓度的物质接触并构建每种浓度的反应分布图。
15、根据权利要求1-14中的任意一项所述的方法，其中，待处理的细胞组含有2种或多于2种的细胞类型。
16、根据权利要求1-15中的任意一项所述的方法，其中，重复扫描所述细胞多次并在每个时间点进行分析以获得动态反应。
17、根据权利要求1-16中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞特征选自2种或多于2种的功能反应类别，该功能反应类别选自由细胞增殖、应激途径、细胞器功能、细胞周期状态、形态、凋亡、DNA损伤、代谢、信号转导、细胞分化、和细胞间相互作用所组成的组中。
18、根据权利要求17所述的方法，其中，指示细胞增殖的细胞特征选自由核计数、细胞计数、总细胞质量、总DNA、细胞周期调节蛋白的磷酸化状态、和参与细胞生长或分裂的任何蛋白的翻译后修饰状态所组成的组中。
19、根据权利要求17所述的方法，其中，指示应激途径活化的细胞特征选自由基因结合核因子、衔接因子相关蛋白复合体1、活化转录因子2、丝裂原-应激激活蛋白激酶1、环腺苷酸反应元件结合蛋白、或T细胞活化核因子的转录因子活化，和p38、JNK、细胞外调节蛋白激酶、丝/苏激酶90或细胞外信号调节激酶的激酶活化所组成的组中。
20、根据权利要求17所述的方法，其中，指示细胞器功能的细胞特征选自由细胞骨架组织、线粒体质量或膜势能、过氧化酶体质量、高尔基体组织、和质膜通透性所组成的组中。
21、根据权利要求17所述的方法，其中，指示细胞周期状态的细胞特征选自由DNA含量、组蛋白H3的磷酸化状态、视网膜母细胞瘤蛋白的磷酸化状态、细胞周期蛋白B1(CDKl)的生物合成、胞周期蛋白D1(CDK4，6)的生物合成、和细胞周期蛋白E(CDK2)的生物合成所组成的组中。
22、根据权利要求17所述的方法，其中，指示形态的细胞特征选自由游动性、细胞扩展、粘附、边缘波动、神经突增生、和集落形成所组成的组中。
23、根据权利要求17所述的方法，其中，指示凋亡的细胞特征选自由核的大小和形状、DNA含量和降解、胱天蛋白酶的活化、磷脂酰表达、和Bcl2相关性X蛋白易位所组成的组中。
24、根据权利要求17所述的方法，其中，指示DNA损伤的细胞特征选自由修复蛋白(脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶)的表达、抑癌基因(p53，视网膜母细胞瘤蛋白)的表达、氧化活性(8-氧鸟嘌呤)、和转录活性(POU结构域蛋白1)所组成的组中。
25、根据权利要求17所述的方法，其中，指示代谢的细胞特征选自由环腺苷酸的浓度、P-糖蛋白活性或细胞色素P450诱导/抑制、以及添加物质的浓度所组成的组中。
26、根据权利要求17所述的方法，其中，指示信号转导的细胞特征选自由Ca++离子的浓度、pH、蛋白的表达、蛋白的活化、蛋白的修饰、蛋白的易位、和已知与特定途径相关的蛋白之间的相互作用所组成的组中。
27、根据权利要求17所述的方法，其中，指示细胞分化的细胞特征选自由组织特异性蛋白的表达、和表现出组织特异性形态所组成的组中。
28、根据权利要求17所述的方法，其中，指示细胞间相互作用的细胞特征选自由细胞间界面上紧密连接蛋白的浓度、和从一个细胞至另一细胞的物质转运所组成的组中。
29、根据权利要求1-16中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞特征选自2种或多于2种的功能反应类别，该功能反应类别选自由细胞增殖、细胞周期、凋亡、氧化应激、应激激酶活化、线粒体功能、DNA损伤、和过氧化物酶体增殖所组成的组中。
30、根据权利要求29所述的方法，其中，所述细胞特征之一为细胞损失。
31、根据权利要求29所述的方法，其中，所述细胞特征之一为DNA降解。
32、根据权利要求29所述的方法，其中，所述细胞特征之一为细胞周期阻滞。
33、根据权利要求29所述的方法，其中，所述细胞特征之一为核大小。
34、根据权利要求29所述的方法，其中，所述细胞特征之一为组蛋白H2A.X磷酸化水平。
35、根据权利要求29所述的方法，其中，所述细胞特征之一为c-jun磷酸化水平。
36、根据权利要求29所述的方法，其中，所述细胞特征之一为p53活化。
37、根据权利要求29所述的方法，其中，所述细胞特征之一为线粒体膜势能。
38、根据权利要求29所述的方法，其中，所述细胞特征之一为线粒体质量。
39、根据权利要求29所述的方法，其中，所述细胞特征之一为组蛋白H3的磷酸化。
40、根据权利要求29所述的方法，其中，所述细胞特征之一为微管的稳定性。
41、根据权利要求1-40中的任意一项所述的方法，其中，分布图由特征测量值构成，所述特征测量包括：
a、为每种化合物的每个浓度下的每个特征测量值计算包括柯司值或平均值在内的参数作为细胞群体移位的测量值，以生成系列稀释的参数；，
b、用4参数逻辑拟合法拟合所述系列稀释的参数；
c、对得到的拟合数据进行分析以计算EC50值；
d、将EC50值转化成化合物活性的测量值的对数形式；
e、进行聚簇分析，以鉴定分布图之间的相似性以及细胞体系反应之间的相关性。
42、一种试剂盒，该试剂盒包括一种或多种试剂、和按下述方案应用所述试剂分析一组细胞的用法说明书，所述方案包括：
a、用测试物质或参照物质孵育一组细胞；
b、获取所述组内的细胞的图像；
c、分析所述图像，以测量或检测指示细胞功能类别的细胞特征；和
d、创建含有至少6种细胞特征的反应分布图。
43、根据权利要求42所述的试剂盒，该试剂盒还包括将测试物质的反应分布图与具有已知生物系统效应的物质的反应分布图数据库进行比对的用法说明书。
44、根据权利要求42所述的试剂盒，该试剂盒还包括将参照物质的反应分布图添加到具有已知生物系统效应的物质的反应分布图数据库的用法说明书。
45、根据权利要求42-44中的任意一项所述的试剂盒，该试剂盒还包括具有已知生物系统效应的物质的反应分布图数据库。
46、根据权利要求42-45中的任意一项所述的试剂盒，其中，所述一种或多种试剂含有荧光或发光标签。
47、根据权利要求42-46中的任意一项所述的试剂盒，其中，所述一种或多种试剂含有细胞培养物。
48、一种数据库，该数据库是按权利要求2所述的方法构建的。
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