KR20100049012A - 비타민 b12 시스템이 탈조절된 미생물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비타민 B12 이용 효율이 개선된 미생물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 비타민 B12 흡수 효율이 증가된 미생물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 생합성을 위해서는 비타민 B12를 필요로 하는, 메티오닌을 비롯한 정밀 화학물질을 수득하기 위한 상기 미생물의 용도에 관한 것이다.
현재, 메티오닌의 세계적 연간 생산량은 약 500,000 톤에 달한다. 메티오닌은 가금류 가축 사료에서의 제1 제한 아미노산이며, 이 때문에 주로 사료 보충물로서 적용된다.
다른 산업용 아미노산과 달리, 메티오닌은 거의 전적으로 화학적 합성에 의해 생산된 D- 및 L-메티오닌의 라세미체로서 적용된다. 동물은 메티오닌의 2가지 입체이성질체를 모두 대사할 수 있기 때문에, 화학적으로 생산된 라세미 혼합물의 직접적인 공급이 가능하다 (문헌 [D'Mello and Lewis, Effect of Nutrition Deficiencies in Animals: Amino Acids, Rechgigl (Ed.), CRC Handbook Series in Nutrition and Food, 441-490, 1978]).
그러나, 기존의 화학적 생산을, 전적으로 L-메티오닌을 생산하는 생물공학적 공정으로 대체하는 것에 여전히 큰 관심을 두고 있다. 이는 D-메티오닌보다 더 낮은 수준으로 L-메티오닌을 보충하는 것이 황 아미노산의 더 우수한 공급원이라는 사실 때문이다 (문헌 [Katz and Baker (1975) Poult. Sci. 545: 1667-74]). 더욱이, 화학적 공정은 다소 위험한 화학물질을 사용하며 실질적인 폐기류를 생성한다. 효율적인 생물공학적 공정은 화학적 생산의 이러한 모든 단점을 피할 수 있다.
오늘날, 정밀 화학물질, 예로서, 아미노산, 방향족 화합물, 비타민 및 보조인자는 전형적으로 미생물, 예로서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) (C. 글루타미쿰(C. glutamicum)), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) (E. 콜라이(E. coli)), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) (S. 세레비시애(S. cerevisiae)), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizzosaccharomycs pombe) (S. 폼베(S. pombe)), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (P. 파스토리스(P. pastoris)), 아스퍼질러스 니가(Aspergillus niger), 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis), 애슈비아 거시피(Ashbya gossypii) 또는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans)에서 발효법으로 생산된다.
따라서, 아미노산, 예로서, 글루타메이트는 발효법의 사용으로 생산된다. 이러한 목적상, 특정 미생물, 예로서, 에스케리키아 콜라이 (E. 콜라이) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 (C. 글루타미쿰)이 특히 적합하다고 입증된 바 있다. 또한, 발효에 의한 아미노산 생산으로 L-아미노산만이 생산되며, 화학적 합성에 사용되는 용매 등과 같이 환경적으로 문제가 되는 화학물질의 사용은 피한다는 점에서 특별한 이점을 갖는다.
종래 기술에서는 예를 들면, 아미노산, 지질, 비타민 또는 당질과 같은 각각의 정밀 화학물질의 생합성 경로에 관여하는 유전자 발현을 증가시킴으로써 예를 들면, E. 콜라이 및 C. 글루타미쿰과 같은 미생물에서 상기 정밀 화학물질을 생산하고자 하는 여러 시도로 상기 목표가 이루어졌었다.
예를 들어, 리신 생산의 생합성 경로에 관여하는 유전자 발현을 상향조절함으로써 리신 생산을 증가시키고자 하는 시도는 예를 들어, WO 02/10209, WO 2006008097, WO 2005059093 또는 문헌 [Cremer et al. (Appl . Environ . Microbiol, (1991), 57(6), 1746-1752)]에 기재되어 있다.
그러나, 사용됨으로써 미생물, 예로서, C. 글루타미쿰에서의 메티오닌 또는 다른 정밀 화학물질의 생산에 유익하게 작용할 수 있는 대사 경로 중의 추가의 표적을 확인할 필요는 여전히 강하게 남아있다.
<본 발명의 목적>
이러한 상황에 비추어 보면, 본 발명의 한가지 목적은 L-메티오닌을 생산하는데 사용될 수 있는 미생물, 및 바람직하게는 코리네형(Coryneform) 세균을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 미생물, 및 바람직하게는 코리네형 세균에서 L-메티오닌을 생산하는데 사용될 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
다음의 설명으로부터 자명해지는 바와 같이 이러한 목적 및 기타 다른 목적은 독립항에 기술되어 있는 바와 같은 본 발명을 통해 해소될 것이다. 종속항은 본 발명의 바람직한 실시태양들 중 일부에 관한 것이다.
<본 발명의 요약>
하나의 실시태양에서, 본 발명은 비타민 B12 흡수 효율이 증가된 미생물에 관한 것이다. 그의 한 측면에서, 본 발명은 비타민 B12 흡수 시스템이 탈조절된 미생물에 관한 것이다. 전형적으로, 그러한 비타민 B12 흡수 시스템은 하나 이상의 음성 조절 단백질 및/또는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 그러한 음성 조절 단백질의 대표적인 예로는 서열 2를 갖는, C. 글루타미쿰의 추정 btuR2 리프레서가 있다. ABC형 수송체 단백질의 대표적인 예로는 서열 4, 6 및 8의, C. 글루타미쿰에서 ABC형 수송체를 형성하는 3개의 서브유닛이 있다. C. 글루타미쿰에서 상기 언급한 유전자들은 본원에서 btu2 오페론으로 지칭될 오페론에 의해 코딩되고, 3개의 코딩 서열 (서열 3, 5, 및 7)은 각각 btuF2, btuC2, 및 btuD2로 지칭될 것이다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 비타민 B12 흡수 시스템이 하나 이상의 음성 조절 단백질 및/또는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 하나 이상의 음성 조절 단백질 및 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질을 코딩하는 상기 핵산 서열은, 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질이 상기 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질의 발현을 조정하도록 하는 오페론으로서 조직된 것인, 비타민 B12 흡수 시스템이 탈조절된 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 미생물은, 서열 2의 하나 이상의 음성 조절 단백질, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편, 및 서열 4, 6 및 8의 서브유닛을 포함하는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 오페론을 포함하는 탈조절된 비타민 B12 흡수 시스템을 포함한다.
상기 언급한 실시태양의 하나의 측면에서, 본 발명은 유전자 변경에 의해 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질의 양이 상기 유전자 변경을 나타내지 않는 각각의 출발 유기체와 비교하였을 때 적어도 부분적으로 감소된 것인 미생물에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질의 양 및/또는 활성은 각각의 출발 유기체와 비교하였을 때 완전히 제거되거나 삭제된다.
상기 언급한 하나 이상의 음성 조절 단백질의 양 및/또는 활성은 예를 들어, 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질을 코딩하는 미생물의 내인성 핵산 서열을 파괴시킴으로써 적어도 부분적으로 감소될 수 있다. 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질의 양 및/또는 활성은 또한 예를 들어, 상기 단백질의 발현을 유도하는 내인성 프로모터보다 약한 프로모터의 제어하에 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질을 발현시키고/거나, ABC형 수송체 단백질의 발현에 대한 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질의 음성 조절 기능을 적어도 부분적으로 감소시키고, 바람직하게는 폐지시키는 돌연변이를 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질 중에 도입시킴으로써 감소될 수 있다.
본 발명의 상기 언급한 실시태양의 상기 측면에 대해 별법으로 또는 추가로, 본 발명은 유전자 변경에 의해 상기 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질의 양이 상기 유전자 변경을 나타내지 않는 각각의 출발 유기체와 비교하였을 때 적어도 부분적으로 증가된 것인 미생물에 관한 것이다.
상기 언급한 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질의 양 및/또는 활성은 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 카피수를 증가시킴으로써 출발 유기체와 비교하였을 때 증가될 수 있다. 핵산 서열의 카피수는 예를 들어, ABC형 수송체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 자가 복제 벡터를 사용하고/거나, 출발 유기체의 게놈 내로 ABC형 수송체 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 추가 카피를 염색체 통합시킴으로써 증가될 수 있다.
ABC형 수송체 단백질의 양 및/또는 활성은 또한 상기 단백질의 하나 이상의 유닛을 코딩하는 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 이들 핵산 서열의 발현을 지배하는 내인성 프로모터로부터 발현되는 것보다 더 강하게 발현될 수 있도록 하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용함으로써 전사는 증가될 수 있다. 상기 효소를 코딩하는 핵산 서열의 코돈 선호도가 숙주 유기체에서의 발현을 위해 최적화될 경우, 또는 리보좀에 대한 개선된 결합 부위 및 번역 개시 부위가 코딩 서열의 상류 영역에 설치될 경우에는 번역이 증가될 수 있다.
ABC형 수송체 단백질의 활성은 또한 상기 단백질의 활성을 증가시키는 돌연변이를 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 도입함으로써 출발 유기체와 비교하였을 때 증가될 수 있다.
본 발명의 몇몇 바람직한 실시태양에서, ABC형 수송체 단백질의 양 및/또는 활성은 상기 언급한 방법들의 조합에 의해 출발 유기체와 비교하였을 때 증가된다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 상기 언급한 측면의 미생물은 그람 양성 미생물, 바람직하게는 악티노바실러스(actinobacillus), 더욱 바람직하게는 악티노마이세트(actinomycete)로부터 선택된다.
더욱더 바람직한 실시태양에서, 미생물은 코리네박테리움 속, 바람직하게는 C. 글루타미쿰 종으로부터 선택된다. 본 발명의 목적상 사용될 수 있는 바람직한 C. 글루타미쿰 균주는 야생형 균주, 예로서, ATCC13032 또는 메티오닌 생산이 개선되도록 이미 공학처리된 균주이다. 상기 후자의 균주는 하기에 기술되는 바와 같이, 예로서, DSM17322, M2014 또는 OM469 또는 M2543의 것과 같은 유전자 변경을 나타낼 것이다.
특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 미생물이 C. 글루타미쿰 종으로부터 선택되고, 여기서 탈조절된 비타민 B12 흡수 시스템은 서열 2의 하나 이상의 음성 조절 단백질, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편, 및 서열 4, 6 및 8의 서브유닛을 포함하는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 오페론을 포함하는 것인 미생물에 관한 것이다.
하나 이상의 음성 조절 단백질의 기능적 상동체 또는 단편은 서열 2와 50% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질의 기능적 상동체 또는 단편은 서열 4, 6 및 8과 50% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
특히 바람직한 실시태양은 유전자 변경에 의해 서열 1의 하나 이상의 음성 조절 단백질, 또는 서열 2와 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 기능적 상동체 또는 단편의 발현이 상기 유전자 변경을 나타내지 않는 각각의 출발 유기체와 비교하였을 때 부분적으로 및 바람직하게는 완전하게 감소된 것인 C. 글루타미쿰 미생물에 관한 것이다.
특히 바람직한 또다른 실시태양은 유전자 변경에 의해서, 예로서, 강한 프로모터 및/또는 상기 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열의 증가된 카피수의 사용으로 서열 4, 6 및 8의 서브유닛을 포함하는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질, 또는 각각 서열 4, 6 및 8과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 그의 기능적 상동체 또는 단편의 발현이 상기 유전자 변경을 나타내지 않는 각각의 출발 유기체와 비교하였을 때 적어도 부분적으로 증가된 것인 C. 글루타미쿰 미생물에 관한 것이다.
동등하게 특히 바람직한 실시태양은 유전자 변경에 의해 서열 2의 하나 이상의 음성 조절 단백질, 또는 서열 2와 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 그의 기능적 상동체 또는 단편의 발현이 상기 유전자 변경을 나타내지 않는 각각의 출발 유기체와 비교하였을 때 적어도 부분적으로 및 바람직하게는 완전하게 감소되어 있고, 유전자 변경에 의해서, 예로서, 강한 프로모터 및/또는 상기 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열의 증가된 카피수의 사용으로 서열 4, 6 및 8의 서브유닛을 포함하는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질, 또는 각각 서열 4, 6 및 8과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 그의 기능적 상동체 또는 단편의 발현이 상기 유전자 변경을 나타내지 않는 각각의 출발 유기체와 비교하였을 때 적어도 부분적으로 증가된 것인 C. 글루타미쿰 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기술된 미생물의 용도 및 특히 생합성을 위해서는 비타민 B12를 필요로 하는 정밀 화학물질을 수득하는데 있어서의 그의 바람직한 실시태양에 관한 것이다. 그러한 정밀 화학물질로는 메티오닌, S-아데노실 메티오닌, 및 메티오닌 설폭시드를 포함한다.
본 발명은 또한 하기 기술하는 미생물을 배양하는 단계, 및 정밀 화학물질을 수득하는 단계를 포함하는, 생합성을 위해서는 비타민 B12를 필요로 하는 상기 정밀 화학물질을 수득하는 방법에 관한 것이다. 정밀 화학물질은 다시 상기 언급한 군으로부터 선택될 수 있다.
도 1은 btuR2 결실이 비타민 B12 흡수에 미치는 영향을 도시한 것이다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도, C. 글루타미쿰이 음성 조절 단백질 및 ABC형 수송체 단백질에 대한 핵산 서열을 포함하는 오페론으로 구성된 비타민 B12 흡수 시스템을 포함하는데, 여기서 음성 조절 단백질은 ABC형 수송체 단백질의 발현을 하향조절하는 것으로 보인다는 것을 발견하게 되었다.
이하, 총칭하여 btu (B12 흡수의 약어)로 명시되는 상기와 같은 시스템을 통해 비타민 B12를 세포로 수송할 수 있게 된다. 시스템을 탈조절시킴으로써 보다 효율적으로 비타민 B12를 사용하는 미생물을 제공할 수 있다. 그 결과, 그의 합성을 위해서는 비타민 B12를 필요로 하는 정밀 화학물질, 예로서, 메티오닌, S-아데노실 메티오닌, 및 메티오닌 설폭시드를 생산하는데 보편적으로 사용되는 미생물을 통상 사용되는 것보다는 적은 양의 비타민 B12를 포함하는 배지 중에서 성장시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 발명자들은 이하 btuR2로 명시되는 돌연변이 음성 조절 단백질이 C. 글루타미쿰 중 결실되어 있다면, 세포는 통상의 것보다 현저히 더 적은 양의 비타민 B12를 함유하는 배지 중에서 성장될 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 이러한 관찰 결과에 비추어 볼 때, 별법으로 또는 추가로, 또한 btu2 오페론의 일부도 형성하고, butF2, butC2 및 butD2로 명시되는, ABC형 수송체 단백질의 서브유닛을 코딩하는 서열을 과다발현시킨다면 같은 효과를 얻을 수 있다는 것도 타당한 것으로 보인다. 추가로, 본원에 개시된 관찰 결과를 사용하여 기타 다른 그람 양성 미생물, 및 특히, 악티노바실러스 군으로부터 선택되는 미생물, 더욱 바람직하게는 유사한 비타민 B12 흡수 시스템을 보이는 악티노마이세트 군으로부터 선택되는 미생물에서 유사한 기능을 하는 상동성 서열을 동정할 수 있다.
본 발명의 특정 측면 및 몇몇 바람직한 실시태양을 보다 상세히 설명하기 이전에, 하기와 같은 정의를 제공하는데, 이는 각 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 본 발명의 명세서 전반에 걸쳐 정의되는 의미를 갖는 것으로 한다.
하기에 예시적으로 기술되는 본 발명은 본원에서 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들 없이도 적절히 실시될 수 있다.
본 발명은 특정 실시태양과 관련하여 기술되겠지만, 본 발명을 그로 제한하는 것은 아니며, 본 발명은 청구의 범위에 의해서만 제한될 것이다.
본 명세서 및 청구의 범위에서 "~을 포함하는"이라는 용어가 사용되는 경우, 이는 기타 다른 요소를 제외시킨다는 것은 아니다. 본 발명의 목적상, "~으로 구성된"이라는 용어는 "~을 포함하는"이라는 용어의 바람직한 실시태양으로 간주된다. 이하, 하나의 군이 적어도 특정 갯수의 실시태양을 포함하는 것으로 정의되었다면, 이는 또한 바람직하게는 이들 실시태양만으로 구성된 하나의 군을 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
단수 명사를 언급할 때 예를 들어, "하나"("a," "an") 또는 "그"("the")와 같은 부정 관사 또는 정관 관사를 사용할 경우, 그외의 것으로 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 이는 복수 형태의 상기 명사도 포함한다. 본 발명과 관련하여 "약" 또는 "대략"이라는 용어는, 당업자가 해당 특성의 기술상의 효과를 그대로 보장하는 것으로서 이해하고 있는 정확도 구간을 의미한다. 본 용어는 전형적으로 지정 수치로부터의 편차가 ±10%, 바람직하게는 ±5%인 것을 나타낸다.
본 발명과 관련하여 용어 "미생물"이란 임의의 원핵 미생물을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 그람 음성 미생물, 예로서, E. 콜라이 및 그람 양성 미생물 예로서, C. 글루타미쿰을 포함한다. 바람직하게는 미생물은 그람 양성 미생물 군, 또는 더욱 바람직하게는 악티노바실러스, 더욱더 바람직하게는 악티노마이세트 군으로부터 선택된다. 코리네형 세균 종이 본 발명에 따라 특히 바람직한 미생물 서브세트를 형성한다.
코리네형 세균은 예로서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 제이케움(Corynebacterium jeikeum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens)와 같은 종을 포함한다. 바람직한 종은 C. 글루타미쿰이다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 코리네형 세균은 C. 글루타미쿰 ATCC13032, C. 글루타미쿰 KFCC10065, C. 글루타미쿰 ATCC21608, C. 아세토글루타미쿰 ATCC15806, C. 아세토아시도필룸 ATCC13870, C. 써모아미노게네스 FERM BP- 1539, C. 멜라세콜라 ATCC17965, C. 에피시엔스 DSM 44547 및 C. 에피시엔스 DSM 44549를 포함하는 균주 뿐만 아니라, 예를 들어, 고전적 돌연변이 유발 및 선별 과정에 의해, 또는 지정 돌연변이 유발에 의해 상기 균주로부터 유래된 균주로 구성된 군으로부터 유래될 수 있다.
특히 바람직한 다른 C. 글루타미쿰 균주는 ATCC13058, ATCC13059, ATCC13060, ATCC21492, ATCC21513, ATCC21526, ATCC21543, ATCC13287, ATCC21851, ATCC21253, ATCC21514, ATCC21516, ATCC21299, ATCC21300, ATCC39684, ATCC21488, ATCC21649, ATCC21650, ATCC19223, ATCC13869, ATCC21157, ATCC21158, ATCC21159, ATCC21355, ATCC31808, ATCC21674, ATCC21562, ATCC21563, ATCC21564, ATCC21565, ATCC21566, ATCC21567, ATCC21568, ATCC21569, ATCC21570, ATCC21571, ATCC21572, ATCC21573, ATCC21579, ATCC19049, ATCC19050, ATCC19051, ATCC19052, ATCC19053, ATCC19054, ATCC19055, ATCC19056, ATCC19057, ATCC19058, ATCC19059, ATCC19060, ATCC19185, ATCC13286, ATCC21515, ATCC21527, ATCC21544, ATCC21492, NRRL B8183, NRRL W8182, B12NRRLB12416, NRRLB12417, NRRLB12418 및 NRRLB11476을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
약어 KFCC는 한국 종균 협회(Korean Federation of Culture Collection)를 의미하고, ATCC는 미국 종균 협회(American Type Strain Culture Collection)를 의미하고, 약어 DSM은 독일 생물 자원 은행(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)를 의미한다. 약어 NRRL은 미국 일리노이주 페오리아 소재의 미 북부지역 연구 실험국(Northern Regional Research Laboratory) ARS 종균 협회(ARS cultures collection)를 의미한다.
본 발명의 목적상 바람직한 야생형 균주는 C. 글루타미쿰 ATCC13032이다.
메티오닌을 생산할 수 있는 능력을 이미 갖추고 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물이 특히 바람직하다. 그러므로, 유사한 효과를 갖는 유전자 변경을 보이는 균주, 예로서, 하기 기술되는 DSM17322; M2014, OM469 또는 M2543이 특히 바람직하다.
본 명세서에서, 특정 단백질은 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 명칭에 의해서 지칭될 수 있다. 예를 들면, "btuR2"는 유전자 btuR2 또는 상기 유전자 btuR2에 의해 코딩된 단백질을 지칭할 수 있다.
본 발명과 관련하여 "출발 유기체"라는 용어는 상기 언급한 음성 조절 단백질의 양 및/또는 활성을 감소시키고/거나, 상기 언급한 ABC형 수송체 단백질의 양 및/또는 활성을 증가시키기 위한 유전자 변형에 사용되는 미생물, 바람직하게는 코리네형 세균, 및 특히 바람직하게는 C. 글루타미쿰 미생물을 지칭한다.
"유전자 변형" 및 "유전자 변경"이라는 용어 뿐만 아니라, 본 발명의 의미 내에 포함되는 상기 용어의 문법상의 파생어도, 미생물이 각 미생물에서 천연적으로 존재할 수 있는 하나 이상의 단백질을 변경된 양으로 발현하도록 하거나, 각 미생물에서 천연적으로 존재하지 않는 하나 이상의 단백질을 발현하도록 하거나, 각각의 변형되지 않은 미생물의 단백질과 비교하여 활성이 변경된 하나 이상의 단백질을 발현하도록 하는 유전자 기술에 의해 변형되었다는 것을 의미하는 것으로 한다. 변형되지 않은 미생물이 "출발 유기체"로 간주되며, 출발 유기체의 유전자 변경을 통해 본 발명에 따른 미생물을 수득하게 된다.
따라서, 출발 유기체는 야생형 C. 글루타미쿰 균주, 예로서, ATCC13032일 수 있다.
그러나, 출발 유기체는 또한 바람직하게는 예를 들면, 메티오닌 생산을 위해 이미 최적화되어 있는 C. 글루타미쿰 균주일 수 있다.
상기 메티오닌을 생산하는 출발 유기체는 예를 들어, 하기 유전자들: ask fbr , hom fbr 및 metH 중 적어도 하나에 유전자 변경을 포함하는 것인 야생형 코리네형 세균, 바람직하게는 야생형 C. 글루타미쿰 세균으로부터 유래될 수 있는데, 여기서 유전자 변경을 통해 이들 유전자들 중 임의의 것이 과다발현하게 되며, 이로써, 유전자 변경이 없는 상태에서 생산된 메티오닌과 비교하여 메티오닌의 생산은 증가하게 된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 메티오닌을 생산하는 출발 유기체는 동시에 ask fbr , hom fbr 및 metH에 유전자 변경을 포함함에 따라 유전자 변경이 없는 상태에서 생산된 메티오닌과 비교하여 메티오닌의 생산은 증가하게 될 것이다.
이러한 출발 유기체에서 ask 및 hom의 내인성 카피는 전형적으로 리신, 트레오닌, 메티오닌에 의해, 또는 이들 아미노산의 조합에 의해 더 이상은 피드백 저해되지 않는, 피드백 내성 대립 유전자로 바뀌게 된다. 이는 돌연변이화 또는 선별 과정에 의해, 또는 피드백 저해가 감소되거나 줄어든 단백질을 코딩하는, 돌연변이화된 대립 유전자에 의한 유전자들의 정의된 유전자 치환에 의해 수행될 수 있다. 이러한 유전자 변경을 포함하는 C. 글루타미쿰 균주는 예를 들어, C. 글루타미쿰 DSM17322이다. 당업자는 C. 글루타미쿰 DSM17322를 생성하기 위해 하기에 기술되어 있는 것으로의 대체 유전자 변경을 사용하여 ask fbr , hom fbr 및 metH를 또한 과다발현시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 목적상, ask fbr 는 피드백 내성 아스파테이트 키나제를 의미한다. hom fbr 는 피드백 내성 호모세린 데하이드로게나제를 의미한다. metH는 비타민 B12-의존 메티오닌 신테타제를 의미한다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 메티오닌을 생산하는 출발 유기체는 하기 유전자들: ask fbr , hom fbr , metH, metA (metX로도 지칭된다), metY (metZ로도 지칭된다), 및 hsk 돌연변이화 , met F 및 tkt 중 적어도 하나에 유전자 변경을 포함하는 것인 야생형 코리네형 세균, 바람직하게는 야생형 C. 글루타미쿰 세균으로부터 유래될 수 있는데, 여기서 유전자 변경을 통해 이들 유전자들 중 임의의 것이 과다발현하게 되며, 이로써, 유전자 변경이 없는 상태에서 생산된 메티오닌과 비교하여 메티오닌의 생산은 증가하게 된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 메티오닌을 생산하는 출발 유기체는 동시에 ask fbr , hom fbr , metH, metA (metX로도 지칭된다), metY (metZ로도 지칭된다), 및 hsk 돌연변이화 , met F 및 tkt에 유전자 변경을 포함함에 따라 유전자 변경이 없는 상태에서 생산된 메티오닌과 비교하여 메티오닌의 생산은 증가하게 될 것이다.
이러한 출발 유기체에서 ask, hom 및 hsk의 내인성 카피는 전형적으로 상기에 ask fbr 및 hom fbr 에 대해 기술된 바와 같이 ask fbr , hom fbr 및 hsk로 치환된다. 이러한 유전자 변경을 포함하는 C. 글루타미쿰 균주는 예를 들어, C. 글루타미쿰 M2014이다. 당업자는 C. 글루타미쿰 M2014를 생성하기 위해 하기에 구체적으로 기술되어 있는 것으로의 대체 유전자 변경을 사용하여 ask fbr , hom fbr , metH, metA (metX로도 지칭된다), metY (metZ로도 지칭된다), 및 hsk 돌연변이화 를 또한 과다발현시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 목적상, metA는 예를 들어, E. 콜라이로부터 유래된 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제를 의미한다. metY는 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라제를 의미한다. hsk 돌연변이화 는 돌연변이화되어 효소 활성이 감소된 호모세린 키나제를 의미한다. 이는 서열 19의 hsk의 T190에 상응하는 위치에서 트레오닌을 세린 또는 알라닌으로 교체함으로써 이루어질 수 있다. 별법으로 또는 추가로, ATG 출발 코돈을 TTG 출발 코돈으로 치환시킬 수 있다. 그러한 돌연변이화를 통해 생성된 hsk 단백질의 효소 활성은 돌연변이화되지 않은 hsk 유전자와 비교하여 감소하게 된다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 메티오닌을 생산하는 출발 유기체는 하기 유전자들: mcbR 및 metQ 중 적어도 하나에서의 유전자 변경 (여기서, 유전자 변경은 이들 유전자들 중 임의의 것의 발현을 감소시킨다)과 조합된, 하기 유전자들: ask fbr , hom fbr , metH, metA (metX로도 지칭된다), metY (metZ로도 지칭된다), hsk 돌연변이화 및 metF 중 적어도 하나에 유전자 변경 (여기서, 유전자 변경은 이들 유전자들 중 임의의 것을 과다발현시킨다)을 포함하는 것인 야생형 코리네형 세균, 바람직하게는 야생형 C. 글루타미쿰 세균으로부터 유래될 수 있는데, 여기서 상기와 같은 조합을 통해 조합되지 않은 메티오닌 생산에 비하여 본 미생물에 의한 메티오닌의 생산은 증가하게 된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 메티오닌을 생산하는 출발 유기체는 mcbR 및 metQ에서의 유전자 변경 (여기서, 유전자 변경은 이들 유전자들 중 임의의 것의 발현을 감소시킨다)과 조합된, ask fbr , hom fbr , metH, metA (metX로도 지칭된다), metY (metZ로도 지칭된다), hsk 돌연변이화 및 metF에서의 유전자 변경 (여기서, 유전자 변경은 이들 유전자들 중 임의의 것을 과다발현시킨다)을 동시에 포함하게 될 것이며, 여기서 상기와 같은 조합을 통해 조합되지 않은 메티오닌 생산에 비하여 본 미생물에 의한 메티오닌의 생산은 증가하게 된다.
이러한 출발 유기체에서 ask, hom 및 hsk의 내인성 카피는 전형적으로 상기 기술된 바와 같이 치환되는 반면, mcbR 및 metQ의 내인성 카피는 전형적으로는 기능적으로 파괴되거나 결실되게 된다. 이러한 유전자 변경을 포함하는 C. 글루타미쿰 균주는 예를 들어, C. 글루타미쿰 OM469이다. 당업자는 C. 글루타미쿰 OM469를 생성하기 위해 하기에 구체적으로 기술되어 있는 것으로의 대체 유전자 변경을 사용하여 ask fbr , hom fbr , metH, metA (metX로도 지칭된다), metY (metZ로도 지칭된다), hsk 돌 연변이 화 및 metF를 또한 과다발현시킬 수 있고, mcbR 및 metQ의 발현을 감소시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 목적상, metF는 N5,10-메틸렌-테트라하이드로폴레이트 리덕타제 (EC 1.5.1.20)를 의미한다. mcbR는 황 대사의 TetR형 전사 조절인자 (진뱅크 등록 번호: AAP45010)를 의미한다. metQ는 D-메티오닌 결합 지질단백질을 의미한다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 메티오닌을 생산하는 출발 유기체는 하기 유전자들: mcbR 및 metQ 중 적어도 하나에서의 유전자 변경 (여기서, 유전자 변경은 이들 유전자들 중 임의의 것의 발현을 감소시킨다)과 조합된, 하기 유전자들: ask fbr , hom fbr , metH, metA (metX로도 지칭된다), metY (metZ로도 지칭된다), hsk 돌연변이화 및 metF 및 tkt 중 적어도 하나에 유전자 변경 (여기서, 유전자 변경은 이들 유전자들 중 임의의 것을 과다발현시킨다)을 포함하는 것인 야생형 코리네형 세균, 바람직하게는 야생형 C. 글루타미쿰 세균으로부터 유래될 수 있는데, 여기서 상기와 같은 조합을 통해 조합되지 않은 메티오닌 생산에 비하여 본 미생물에 의한 메티오닌의 생산은 증가하게 된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 메티오닌을 생산하는 출발 유기체는 mcbR 및 metQ에서의 유전자 변경 (여기서, 유전자 변경은 이들 유전자들 중 임의의 것의 발현을 감소시킨다)과 조합된, ask fbr , hom fbr , metH, metA (metX로도 지칭된다), metY (metZ로도 지칭된다), hsk 돌연변이화 및 metF 및 tkt에서의 유전자 변경 (여기서, 유전자 변경은 이들 유전자들 중 임의의 것을 과다발현시킨다)을 동시에 포함하게 될 것이며, 여기서 상기와 같은 조합을 통해 조합되지 않은 메티오닌 생산에 비하여 본 미생물에 의한 메티오닌의 생산은 증가하게 된다. 이러한 출발 유기체에서 ask , hom 및 hsk의 내인성 카피는 전형적으로 상기 기술된 바와 같이 치환되는 반면, mcbR 및 metQ의 내인성 카피는 전형적으로는 기능적으로 파괴되거나 결실되게 된다. 이러한 유전자 변경을 포함하는 C. 글루타미쿰 균주는 예를 들어, C. 글루타미쿰 M2543이다. 당업자는 C. 글루타미쿰 M2543을 생성하기 위해 하기에 구체적으로 기술되어 있는 것으로의 대체 유전자 변경을 사용하여 ask fbr , hom fbr , metH, metA (metX로도 지칭된다), metY (metZ로도 지칭된다), hsk 돌 연변이 화 , metF 및 tkt를 또한 과다발현시킬 수 있고, mcbR 및 metQ의 발현을 감소시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 목적상, tkt는 트랜스케톨라제를 의미한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 비타민 B12 흡수 효율이 증가된 미생물에 관한 것이다. 그의 한 측면에서, 본 발명은 비타민 B12 흡수 시스템이 탈조절된 미생물에 관한 것이다. 전형적으로, 그러한 비타민 B12 흡수 시스템은 하나 이상의 음성 조절 단백질 및/또는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 비타민 B12 흡수 시스템이 하나 이상의 음성 조절 단백질 및/또는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 하나 이상의 음성 조절 단백질 및 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질을 코딩하는 상기 핵산 서열은, 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질이 상기 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질의 발현을 조정하도록 하는 오페론으로서 조직된 것인, 비타민 B12 흡수 시스템이 탈조절된 미생물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 일례는 서열 2의 하나 이상의 음성 조절 단백질, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편, 및 서열 4, 6 및 8의 서브유닛을 포함하는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 오페론을 포함하는 탈조절된 비타민 B12 흡수 시스템을 포함하는 미생물에 관한 것이다.
상기 언급한 미생물에서, 유전자 변경에 의해 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질의 양 및/또는 활성은 상기 유전자 변경을 나타내지 않는 각각의 출발 유기체와 비교하였을 때 적어도 부분적으로 감소될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 유전자 변경에 의해 ABC형 수송체의 하나 이상의 서브유닛 및 바람직하게는 모든 서브유닛의 양 및/또는 활성이 상기 유전자 변경을 나타내지 않는 각각의 출발 유기체와 비교하였을 때 증가될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 미생물 및 방법은 추가로
- metA/X,
- metZ/Y,
- metF,
- metH,
- thrA,
- metE 중 하나 이상의 인자, 또는 이의 기능적 상동체 및/또는 기능적 단편의 양 및/또는 활성이 출발 유기체와 비교하여 증가된다는 점, 및/또는
- metK,
- thrB 중 하나 이상의 인자, 또는 이의 기능적 상동체 및/또는 기능적 단편의 양 및/또는 활성이 출발 유기체와 비교하여 감소된다는 점을 특징으로 한다.
그러한 미생물과 방법은 특히 메티오닌 생산에 유용하다.
특히 바람직한 실시태양에서, 상기 언급한 인자 metA/X, metZ/Y, metF, metH, thrA 및 metE 모두의 양 및/또는 활성은 추가로 증가되고, metK 및 thrB의 양 및 활성은 추가로 감소하게 된다.
MetA/X는 아세틸 또는 숙시닐 기를 활성화된 아세틸-조효소 A 또는 각각의 숙시닐-조효소 A로부터 호모세린의 OH 기로 전달하여 o-아세틸-호모세린 또는 o-숙시닐-호모세린을 생성하는 것을 촉매화하는 효소를 코딩하는 유전자를 지칭한다 (진뱅크 등록 번호: AF052652).
MetZ/Y는 설피드 또는 메틸 머캅탄을 o-아세틸-호모세린 또는 o-숙시닐-호모세린으로 전달하여 호모시스테인을 생성하는 것을 촉매화하는 효소를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 효소 metZ/Y는 보조인자로서 피리독살-포스페이트를 사용한다 (진뱅크 등록 번호: AF220150).
MetF는 보조인자로서 NADPH 또는 NADH와 하이브리드 공여체를 사용하여 메틸렌 테트라하이드로폴레이트를 메틸 테트라하이드로폴레이트로 환원시키는 것을 촉매화하는 효소를 코딩하는 유전자를 지칭한다 (EC 1.7.99.5, 진뱅크 등록 번호: AAH68531).
MetH는 보조인자로서 하이드록시코발라민과, 제2 보조인자로서 SAM을 사용하여 호모시스테인 상의 메틸 테트라하이드로폴레이트로부터 메틸을 전달하는 것을 촉매화하는 효소를 코딩하는 유전자를 지칭한다 (EC 2.1.1.13, 진뱅크 등록 번호: Cgl1507).
ThrA (호모세린 데하이드로게나제)는 보조인자로서 NADPH 또는 NADH를 사용하여 아스파르토 세미알데히드를 환원시키는 것을 촉매화하는 효소를 코딩하는 유전자를 지칭한다 (EC 1.1.1.3, 진뱅크 등록 번호: Cgl1183, AAT03321, AAH68417, AEB13106). 효소는 돌연변이화된 형태로 사용될 수 있다.
ThrB (호모세린 키나제)는 보조인자로서 ATP를 사용하여 호모세린을 포스포 호모세린으로 인산화시키는 것을 촉매화하는 효소를 코딩하는 유전자를 지칭한다 (EC 2.7.1.39, 진뱅크 등록 번호: Cgl1183,). 효소는 돌연변이화된 형태로 사용될 수 있다.
MetE는 보조인자로서 SAM을 사용하여 호모시스테인 상의 메틸 테트라하이드로폴레이트부터 메틸을 전달하는 것을 촉매화하는 효소를 코딩하는 유전자를 지칭한다 (EC 2.1.1.14, 진뱅크 등록 번호: Cgl1139).
MetK는 보조인자로서 ATP와 S-아데노실메티오닌 신테타제를 사용하여 메티오닌 상의 S-아데노실-잔기를 전달하는 것을 촉매화하는 효소를 코딩하는 유전자를 지칭한다 (EC 2.5.1.6, 진뱅크 등록 번호: Cgl1603).
물론, 이들의 추가적인 변형 또한 상기 언급한 출발 유기체 내로 도입될 수 있다.
본 발명과 관련하여, 출발 유기체와 비교하여 C. 글루타미쿰의 btu 오페론의 하나 이상의 단백질, 예로서, 음성 조절 단백질의 "양을 감소시킨다"라는 용어는 상기 단백질의 양이 더 적게 발현되도록 코리네형 세균을 유전자 변형시키는 것을 의미한다. 이는 예를 들면, 염색체 결실로 이루어질 수 있다 (하기 참조).
C. 글루타미쿰의 btu 오페론의 하나 이상의 단백질, 예로서, 음성 조절 단백질의 "활성을 감소시킨다"라는 용어는, 하나 이상의 돌연변이를 상기 단백질의 각각의 야생형 서열에 도입하여 야생형 단백질 대신 돌연변이화된 변형물이 발현되는 것인 상기 단백질의 변이체가 생산될 수 있도록 하는 경우를 지칭한다. 그러나, 돌연변이 때문에 돌연변이화된 단백질은 예를 들면, 음성 조절 기능과 같은 것을 잃게 되어 비록 유사한 양의 단백질이 발현되기는 하지만, 각 단백질의 활성은 저하되게 된다.
상기 단백질의 양은 또한 내인성 프로모터를, 덜 현저하게 발현되도록 유도하는 프로모터로 치환함으로써 감소될 수 있다.
본 발명과 관련하여, 출발 유기체와 비교하여 하나 이상의 단백질의 "양을 증가시킨다"라는 용어는 상기 언급한 단백질 중 적어도 하나가 더 많은 양으로 발현되도록 코리네형 세균, 및 바람직하게는 C. 글루타미쿰을 유전자 변형시키는 것을 의미한다. 하나 이상의 단백질의 양을 증가시킨다는 것은 기능적 단백질의 양을 증가시키는 경우를 지칭하는 것임을 이해하여야 한다. 본 발명과 관련하여 단백질이 내인성 단백질과 동일한 반응을 수행할 수 있다면, 상기 단백질은 기능적인 것으로 간주된다. 코리네형 세균 및 바람직하게는 C. 글루타미쿰에서 단백질의 양을 증가시킬 수 있는 각종 옵션이 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 옵션으로는 상기 언급한 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 카피수를 증가시키는 것, 상기 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 증가시키는 것을 포함한다. 이러한 각종 옵션은 하기에서 더욱 상세히 논의될 것이다.
하나 이상의 단백질의 "활성을 증가시킨다"라는 용어는 하나 이상의 돌연변이를 상기 언급한 단백질의 각각의 야생형 서열에 도입함으로써, 동일한 양의 야생형 단백질이 발현되는 경우와 비교하여 비타민 B12의 유입이 개선될 수 있도록 하는 경우를 지칭한다.
물론, 하나 이상의 단백질의 양 및/또는 활성을 증가시키는 접근법들은 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 코리네형 세균에서 하나 이상의 단백질의 내인성 카피를 그의 돌연변이화된 변형물을 코딩하는 돌연변이체로 치환시킬 수 있다. 이러한 돌연변이화된 카피를 강한 프로모터의 제어하에 전사시킬 경우, 각 단백질의 양 및 활성은 증가하게 된다. 이러한 경우, 상기 단백질은 보통 그가 관여하는 기능을 여전히 수행할 수 있어야 함을 이해하여야 한다.
따라서, 예를 들면, 자가 복제 벡터로부터, 또는 추가로 삽입된 염색체 카피 (하기 참조)로부터 각 C. 글루타미쿰 서열 4, 6 및 8을 과다발현시켜 C. 글루타미쿰에서 C. 글루타미쿰 ABC형 수송체의 서브유닛의 양을 증가시킬 수 있거나, 예를 들어, 바실러스 섭틸러스 또는 E. 콜라이로부터 상응하는 단백질을 사용할 수 있고, 예를 들면, 자가 복제가능한 벡터의 사용에 의해 상기 단백질을 과다발현시킬 수 있다.
몇몇 상황하에서는 예를 들어, C. 글루타미쿰의 내인성 코딩 서열이 발현을 위한 그의 코돈 선호도와 관련하여 이미 최적화되어 있기 때문에 내인성 단백질을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 비타민 B12 흡수 시스템의 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질의 양 및/또는 활성이 C. 글루타미쿰에서 증가하게 된다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시태양은 비타민 B12의 흡수 효율이 증가되도록 유전자 변형된 미생물에 관한 것으로서, 여기서 상기 효율 증가는 하나 이상의 음성 조절 단백질 및/또는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 하나 이상의 음성 조절 단백질 및 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질을 코딩하는 상기 핵산 서열은, 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질이 상기 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질의 발현을 조정하도록 하는 오페론으로서 조직된 것인, 비타민 B12 흡수 시스템을 포함하는 탈조절된 비타민 B12 흡수 시스템으로 이루어진다.
바람직한 실시태양은 코리네형 세균으로부터 선택되는 미생물에 관한 것으로, C. 글루타미쿰인 것이 바람직하다.
본 발명의 이러한 후자 실시태양의 특히 바람직한 측면에서, 비타민 B12 흡수 시스템은 서열 2의, 이하 btuR2로 명시되는 추정의 음성 조절 단백질 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편에 대한 핵산 서열, 및 바람직하게는 서열 4, 6 및 8에 상응하는 3개의 서브유닛으로부터 형성되는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편에 대한 핵산 서열을 포함하는 오페론이다. 따라서, C. 글루타미쿰 유래의 미생물에 관한 바람직한 실시태양에서, 비타민 B12 흡수 시스템은 예로서, btuR과 같은 음성 조절 단백질을 코딩하는 1개의 핵산 서열과, ABC형 수송체 단백질의 성분을 코딩하는 다른 3개의 핵산 서열을 포함하는 4개의 유전자로 이루어진 오페론이다. 음성 조절 단백질이 상기 ABC형 수송체 단백질의 발현을 조정한다.
C. 글루타미쿰 음성 조절 단백질 btuR2의 핵산 서열은 서열 1에 도시한다. 상응하는 아미노산 서열은 서열 2에 도시한다. 진뱅크 등록 번호 (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)는 유전자인 경우, NCgl2034 또는 유전자 ID: 1020066이고, 단백질인 경우, NP 601315.1이다.
C. 글루타미쿰에서 비타민 B12 흡수 시스템을 구성하는 오페론의 ABC형 수송체 단백질 중 서브유닛 A에 대한 핵산 서열은 서열 3에 도시한다. 유전자를 btuF2로 명시한다. 상응하는 아미노산 서열은 서열 4에 도시한다. 진뱅크 등록 번호는 유전자인 경우, 등록 NC_006958.1 또는 유전자 ID:3345625이고, 단백질인 경우, NP 601313.1이다.
C. 글루타미쿰에서 비타민 B12 흡수 시스템을 구성하는 오페론의 ABC형 수송체 단백질 중 서브유닛 B에 대한 핵산 서열은 서열 5에 도시한다. 유전자를 btuC2로 명시한다. 상응하는 아미노산 서열은 서열 6에 도시한다. 진뱅크 등록 번호는 유전자인 경우, NCgl2032 또는 유전자 ID: 1020064이고, 단백질인 경우, NP 601312.1이다.
C. 글루타미쿰에서 비타민 B12 흡수 시스템을 구성하는 오페론의 ABC형 수송체 단백질 중 서브유닛 C에 대한 핵산 서열은 서열 7에 도시한다. 유전자를 btuD2로 명시한다. 상응하는 아미노산 서열은 서열 8에 도시한다. 진뱅크 등록 번호는 유전자인 경우, NCgl2031 또는 유전자 ID:1020063이고, 단백질인 경우, NP 601311.1이다.
C. 글루타미쿰에서 비타민 B12 흡수 시스템을 구성하는 상기 언급한 C. 글루타미쿰 서열의 상응하는 기능적 상동체는 당업자의 상동성 분석에 의해 다른 유기체에 대하여 쉽게 동정될 수 있다. 이는, 유전자 또는 예를 들면, btuR2, butF2에 대한 핵산 서열에 의해 코딩된 단백질, 및 임의의 유전자 및 이하 언급되는 유전자에 의해 코딩된 단백질에 대한 서열에서 추정의 상동체에 대한 아미노산 또는 핵산 서열 간의 동일성(%)을 측정함으로써 수행될 수 있다.
동일성(%)은 예를 들면, 시각적 검사에 의해, 또는 알고리즘 기반의 상동성을 사용하여 측정될 수 있다.
예를 들면, 두 아미노산 서열의 동일성(%)을 측정하기 위해서 알고리즘은 최적의 비교 목적으로 서열을 정렬할 것이다 (예를 들어, 또다른 단백질의 아미노산 서열과 최적으로 정렬될 수 있도록 하나의 단백질의 아미노산 서열에 갭을 도입할 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치에 있는 아미노산 잔기를 비교한다. 하나의 서열 중의 위치가 또다른 서열 중의 상응하는 위치에 있는 것과 동일한 아미노산 잔기로 점유되어 있을 경우, 이때 상기 분자는 상기 위치에서 동일한 것이다. 두 서열 간의 동일성(%)은 공통된 서열을 갖고 있는 동일 위치의 갯수에 관한 함수이다 (즉, 동일성(%) = 동일 위치의 갯수/위치의 총 갯수 X 100).
이러한 목적을 위한 컴퓨터 프로그램이 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 두 핵산 또는 아미노산 서열의 동일성(%)은 문헌 [Devereux et al. (1984) Nucl. Acids. Res., 12:387]에 기재되어 있고, 유니버시티 오브 위스콘신 제네틱스 컴퓨터 그룹(University of Wisconsin Genetics Computer Group)(UWGCG)으로부터 이용가능한 GAP 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교함으로써 측정할 수 있다. 동일성(%)은 또한 (문헌 [Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett., 174:247]에 기재되어 있는 것과 같은) 베이직 로컬 정렬 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST™) 프로그램을 사용하여 두 핵산 또는 아미노산 서열을 정렬시킴으로써 측정할 수 있다.
본 특허 출원의 출원일에 BLAST 프로그램을 제공하는 표준 소프트웨어 패키지는 NCBI의 BLAST 웹사이트에서 살펴볼 수 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). 예를 들면, 상기 언급한 서열번호들 중 임의의 것을 사용할 경우, 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 기반한 BLAST 검색을 실시할 수 있고, 예를 들면, E. 콜라이, S. 세르비지에(S. cervisiae), 바실러스 섭틸러스 등에서 각 효소와 밀접한 관련이 있는 상동체를 동정할 수 있다. 예를 들면, BLAST™ 프로그램을 사용한 뉴클레오티드 핵산 서열 정렬을 위한 디폴트 설정은 다음과 같다: 매치에 대한 보상은 2이고, 미스매치에 대한 패널티는 -2이고, 개방 갭 및 연장 갭 패널티는 각각 5 및 2이고, gap.times.dropoff는 50이고, 예측치는 10이고, 워드 크기는 11이고, 필터는 OFF이다. 후자의 알고리즘이 바람직하다.
EMBL 데이타베이스 (http://www.embl.org) 또는 Expasy 홈페이지 (http://www.expasy.org/)에서 유사한 서열 검색 및 분석을 수행할 수 있다. 상기 서열 검색 모두는 전형적으로 본 출원의 출원일에 데이타베이스 제공자에 의해 내장되어졌기 때문에 디폴트 파라미터와 함께 수행된다. 상동성 검색은 또한 통상적으로 소프트웨어 프로그램, 예로서, DNA 스타, 인코포레이티드(DNA Star, Inc.)(미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 의한 레이저 진 소프트웨어 (이는 CLUSTAL 방법을 사용한다 (문헌 [Higgins et al. (1989), Comput. Appl. Biosci., 5(2) 151]))를 사용하여 수행될 수 있다.
당업자는, 2개의 단백질이 상기 기술된 바와 같이 특정한 정도의 동일성을 공유한다면, 이들이 동일한 기능을 수행 (예를 들어, 동일한 효소 활성을 제공)할 수 있다는 것을 이해하고 있다. 아미노산 수준에 있어서 전형적인 하한은 전형적으로 적어도 약 50%의 동일성이다. 핵산 수준에 있어서, 하한은 전형적으로 적어도 40%이다.
2가지 유형의 서열에 대하여 바람직한 동일성 등급은 적어도 약 55%, 적어도 약 60% 또는 적어도 약 70%이다. 더욱 바람직한 동일성 수준은 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%이다. 이러한 동일성 수준이 유의적인 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 "상동성" 및 "상동성인"이라는 용어는 이론상 공통된 유전적 조상을 갖는 단백질을 명명하기 위한 것으로 제한되지 않고, 유전적으로 관련되지 않을 수 있음에도 유사한 기능을 수행하고/하거나, 유사한 구조를 갖도록 진화한 단백질을 포함한다. 상동체는 기능적이어야 한다는 요건은, 본원에 기술된 상동체가 기준 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 갖는 단백질을 포함한다는 것을 의미하는 것이다. 기능적 상동성을 갖는 단백질의 경우, 이들이 반드시 그들의 아미노산 서열에 유의적인 동일성을 가질 필요는 없고, 오히려 기능적 상동성을 갖는 단백질은 유사하거나 동일한 활성, 예를 들어, 효소 활성을 갖는 것으로서 규정된다.
바람직하게는 예를 들어, 숙주 코리네형 세균 이외의 또다른 유기체로부터 유래된 단백질이 적어도 유의적인 유사성, 즉, 아미노산 수준에 있어 약 50%의 서열 동일성을 보이고, 코리네형 세균에서 그의 대응물과 동일한 기능을 수행한다면 이는 기능적 상동체인 것으로 간주될 것이다. 동일한 효소 활성을 제공하고, 아미노산 수준에 있어서 보다 고도한 정도의 동일성, 예로서, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%의 서열 동일성을 공유하는 기능적 상동체가 추가의 바람직한 기능적 상동체이다.
코리네형 세균으로부터 유래된 상기 언급한 단백질, 및 기타 다른 유기체에서의 그들의 기능적 상동체의 단편 또는 돌연변이화된 변형물이 동일한 유형의 기능적 활성을 보인다면, 이들 단편 및 돌연변이화된 변형물도 사용할 수 있다는 것을 당업자는 알고 있다. 돌연변이화된 변형물은 전형적으로 결실, 삽입 또는 점 돌연변이를 포함하는 반면, 기능적으로 활성인 전형적인 단편은 N-말단 및/또는 C-말단 결실을 보일 것이다.
일례로, 바실러스 섭틸러스의 서열이 서열 2와 아미노산 수준에 있어 상기 언급한 동일성 수준을 보이고, 예를 들면, 서열 2, 4 및 6에 의해 코딩되는 것과 같은 ABC형 수송체 단백질의 발현에 있어 유사한 저해 활성을 보이는 경우, 상기 바실러스 섭틸러스의 서열은 C. 글루타미쿰 btuR2의 기능성 상동체를 코딩하는 것으로 간주될 것이다. 생성된 단백질이 여전히 전장의 단백질과 동일한 유형의 활성을 매개하는 한, 이들 서열의 단편, 또는 예를 들어, 점 돌연변이도 사용할 수 있다.
본 발명에 따라, 비타민 B12 흡수 시스템, 및 btu2 오페론 형태의, C. 글루타미쿰에 대해 기술된 것과 같은 비타민 B12 흡수 시스템을 탈조절시킴으로써 상기와 같은 탈조절된 비타민 B12 흡수 시스템을 포함하지 않는 미생물과 비교하였을 때, 보다 적은 양의 비타민 B12를 함유하는 배지 중에서도 미생물을 성장시킬 수 있고/거나, 메티오닌 생산을 개선시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라 유전자 변형된 미생물은 유기체가 비타민 B12 흡수 효율을 개선시키기 위한 유전자 변경을 포함하지 않는 상황하의 것과 비교하였을 때, 약 10% 더 적은 양, 약 20% 더 적은 양, 약 30% 더 적은 양, 약 40% 더 적은 양, 약 50% 더 적은 양, 약 60% 더 적은 양, 약 70% 더 적은 양, 약 80% 더 적은 양, 약 90% 더 적은 양 또는 약 95% 더 적은 양의 비타민 B12를 포함하는 배지를 사용함으로써 상기 유전자 변경을 나타내지 않는 미생물과 동일한 효율로 배지 중에서 성장할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본원에 기술된 바와 같이 비타민 B12 흡수를 개선시키기 위한 유전자 변경을 포함하지 않는 미생물에 대해 보편적으로 사용되는 배지와 비교하였을 때, 50% 더 적은 양, 바람직하게는 약 60% 더 적은 양, 더욱 바람직하게는 약 70% 더 적은 양, 더욱더 바람직하게는 약 80% 더 적은 양, 더욱더 바람직하게는 약 90% 더 적은 양의 비타민 B12를 배지가 포함하고 있다면, 본 발명에 따라 유전자 변형된 미생물은 유전자 변경을 포함하지 않는 미생물과 유사한, 바람직하게는 동일한 효율성으로 성장할 수 있다.
따라서, 비타민 B12 흡수 시스템이 개선됨에 따라 본 발명에 따른 미생물을 사용함으로써 저렴한 비용으로 생합성을 위해서는 비타민 B12를 필요로 하는 정밀 화학물질을 제공할 수 있다. 그러한 정밀 화학물질로는 메티오닌, S-아데노실 메티오닌, 및 메티오닌 설폭시드를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 기술된 유전자 변경의 결과로서, 비타민 B12 흡수 효율이 개선된 미생물은, 미생물, 예로서, 코리네형 세균 및 바람직하게는 C. 글루타미쿰에서 메티오닌, 및 생합성을 위해서는 비타민 B12를 필요로 하는 기타 다른 정밀 화학물질의 생산을 한층 더 개선시킬 수 있다.
코리네형 세균에서 메티오닌 생산의 개선이라는 것은 특히 메티오닌 생산량을 증가시키는 것 뿐만 아니라, 생산 속도, 최종 역가, 또는 메티오닌 합성 효율을 증가시키는 것도 의미한다.
"메티오닌 합성 효율"이라는 용어는 메티오닌의 탄소 수율을 기술한다. 상기 효율은 탄소 기질의 형태로 시스템에 투입되는 에너지 유입량의 백분율로서 계산된다. 본 발명 전반에 걸쳐 상기 값은 백분율 값 ((메티오닌(몰)) (탄소 기질(몰)-1 x 100)으로 주어진다. 따라서, "메티오닌 합성 효율이 증가된"이라는 용어는 출발 유기체와, 펜토스 포스페이트 대사 경로의 효소 중 하나 이상의 양 및/또는 활성이 증가된 본 발명의 코리네형 세균 사이의 비교에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 탄소 공급원은 당, 예를 들어, 단당류, 이당류 또는 다당류이다. 예를 들면, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스를 포함하는 군으로부터 선택되는 당이 탄소 공급원으로서 특히 바람직한 역할을 한다.
또한, 본 발명에 따른 방법 및 코리네형 세균을 사용함으로써 출발 유기체에 비해 더 많은 메티오닌을 생산할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법 및 코리네형 세균을 사용함으로써 출발 유기체에 비해 더 빠른 속도로 메티오닌을 생산할 수 있다. 예를 들어, 전형적인 생산 기간을 고려한다면, 본 방법 및 코리네형 세균을 통해서는 더 빠른 속도로 메티오닌을 생산할 수 있을 것이며, 즉, 동량의 메틴오닌은 출발 유기체와 비교하였을 때 더 이른 시점에 생산되어질 것이다. 이는 특히 대수 증식기로 적용된다.
균주를 진탕 인큐베이션으로 인큐베이션시킬 경우, 본 발명의 따른 방법 및 코리네형 세균을 통해서는 배양 부피 1 ℓ당 적어도 약 3 g의 메티오닌을 생산할 수 있다. 균주를 진탕 인큐베이션으로 인큐베이션시킬 경우, 배양 부피 1 ℓ당 적어도 약 4 g의 메티오닌, 배양 부피 1 ℓ당 적어도 약 5 g의 메티오닌, 또는 배양 부피 1 ℓ당 적어도 약 7 g의 메티오닌인 역가가 바람직할 수 있다. 균주를 진탕 인큐베이션으로 인큐베이션시킬 경우, 배양 부피 1 ℓ당 적어도 약 10 g의 메티오닌인 양이 더욱 바람직한 값이 되고, 세포 매스 1 ℓ당 적어도 약 20 g의 메티오닌인 양이 더욱더 바람직한 값이 된다.
균주를 교반형의, 탄소 공급원이 공급되는 유가식 발효기를 사용하여 발효 실험으로 인큐베이션시킬 경우, 본 발명의 따른 방법 및 코리네형 세균을 통해서는 배양 부피 1 ℓ당 적어도 약 25 g의 메티오닌을 생산할 수 있다. 균주를 교반형의, 탄소 공급원이 공급되는 유가식 발효기를 사용하여 발효 실험으로 인큐베이션시킬 경우, 배양 부피 1 ℓ당 적어도 약 30 g의 메티오닌, 배양 부피 1 ℓ당 적어도 약 35 g의 메티오닌, 또는 배양 부피 1 ℓ당 적어도 약 40 g의 메티오닌인 역가가 바람직할 수 있다. 균주를 교반형의, 탄소 공급원이 공급되는 유가식 발효기를 사용하여 발효 실험으로 인큐베이션시킬 경우, 배양 부피 1 ℓ당 적어도 약 50 g의 메티오닌인 양이 더욱 바람직한 값이 되고, 세포 매스 1 ℓ당 적어도 약 60 g의 메티오닌인 양이 더욱더 바람직한 값이 된다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법 및 미생물을 통해 출발 유기체와 비교하여 메티오닌 합성 효율 및/또는 메티오닌 양 및/또는 역가 및/또는 메티오닌 합성 속도를 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10% 또는 적어도 약 20% 만큼 증가시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 출발 유기체와 비교하여 메티오닌 합성 효율 및/또는 메티오닌 양 및/또는 역가 및/또는 속도는 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50% 만큼 증가하게 된다. 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 5배, 및 적어도 약 10배 증가시키는 것이 더욱더 바람직하다. 그러나, 약 5% 증가도 이미 유의적인 개선이 이루어진 것으로서 간주될 수 있다.
상기 언급한 서열 뿐만 아니라, 그의 기능적 상동체 및 단편의 양 및/또는 활성은 바람직하게는 C. 글루타미쿰에서 증가되고/거나 감소될 수 있다. 이러한 목적을 위해서는 야생형 균주, 예로서, ATCC13032 또는 메티오닌 생합성을 증가시키고 개선시키기 위한 추가의 유전자 변형을 수반하는 균주가 사용될 수 있다.
그러한 균주는 예를 들면, 피드백 내성 호모세린 데하이드로게나제 (hom fbr )를 발현할 수 있다. 그러한 균주는 추가로 피드백 내성 아스파테이트 키나제 (ask fbr )를 발현할 수 있다. 그러한 균주는 추가로 증가된 메티오닌 신테타제 (metH) 발현을 보일 수 있다. 메티오닌 생산에 적합하고, 피드백 내성 호모세린 데하이드로게나제, 피드백 내성 아스파테이트 키나제 및 메티오닌 신테타제를 과다발현하는 균주는 예를 들면 실시예에 있는 상기 언급한 DSM17322이다.
본 발명의 목적상 바람직하게는 사용될 수 있는 기타 다른 C. 글루타미쿰 출발 균주는 상기 언급한 DSM17322의 변형을 수반하고, 메티오닌 합성과 관련하여 추가로 최적화된다. 그러한 균주는 예를 들면, 돌연변이화된 호모세린 키나제 (hsk 돌연변 이화 ), 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 (metA), 및 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라제 (metY)를 증가된 수준으로 발현할 수 있다. 이들 유전자 변경 모두를 수반하는 균주는 예를 들면, 실시예 1의 M2014이다. 그러므로, 본 발명의 목적상 C. 글루타미쿰 중 특히 유망한 출발 유기체는 metH, metY 및 metA, hom fbr , ask fbr 및 hsk 돌 연변이화 를 증가된 수준으로 나타낼 것이다.
피드백 내성 호모세린 데하이드로게나제의 일례는 서열 17의 393번 위치에 S393F 돌연변이를 수반한다. 상기 hom fbr 은 트레오닌 및/또는 메티오닌에 의한 감소된 피드백 저해를 보인다. 피드백 내성 아스파테이트 키나제의 일례는 서열 18의 311번 위치에 T311I 돌연변이를 수반한다. 상기 ask fbr 은 리신 및/또는 트레오닌에 의한 감소된 피드백 저해를 보인다. 상기 언급한 기능적 돌연변이를 수반하는 호모세린 키나제는 서열 19의 190번 위치에 T190A 돌연변이, 또는 190번 위치에 T190S 돌연변이, 또는 TTG 출발 코돈을 수반한다.
상기 언급한 유전자 변경을 수반할 수 있는 C. 글루타미쿰 출발 유기체, 예로서, M2014는 음성 조절인자 (mcbR) (문헌 ([Rey, D. et al. (2005) Mol. Microbiol., 56. 871-887], [Rey, D. et al. (2003) J. Biotechnol, 103, 51-65], US2005074802)) 및 D-메티오닌 결합 지질단백질 (metQ)에 대한 핵산 서열을 결실시킴으로써, 그리고, N5,10-메틸렌-테트라하이드로폴레이트 리덕타제 (metF)의 발현을 증가시킴으로써 추가로 개선될 수 있다. 상응하는 균주는 실시예 5에 OM469로 기술되어 있다. DSM17322, M2014 또는 OM469와 동일하거나, 그와 유사한 유전자 변경을 보이는 균주가 C. 글루타미쿰 출발 유기체로서 바람직할 수 있다.
바람직한 출발 유기체일 수 있는 기타 다른 균주는 출발 균주 DSM17322, M2014 또는 OM469의 상기 언급한 유전자 변경 이외에도, 트랜스케톨라제 (tkt)의 증가된 활성 및/또는 양을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 그러한 출발 유기체는, C. 글루타미쿰에서 tkt 앞에 있는 내인성 프로모터가 강한 프로모터로 치환되어 있는 C. 글루타미쿰 유기체에 관한 것일 수 있는데, 상기 접근법은 트랜스케톨라제, 6-포스포-글루코노-락토나제, 글루코스-6-포스페이트-데하이드로게나제에 대한 유전자, 및 OPCA로 명명된 유전자가 단일 오페론으로 조직화되어 있다는 이유에서 바람직한 것이다. 따라서, tkt 앞에 있는 내인성 프로모터 대신 강한 프로모터, 예를 들어, λPR 프로모터는 트랜스케톨라제 이외의 펜토스 포스페이트 대사 경로에 관여하는 효소들의 양 및/또는 활성을 동시에 증가시킬 수 있으며, 메티오닌 표면에도 유익할 수 있다. 상응하는 유전자 변경을 반영하는 출발 유기체는 하기에 기술하는 M2543이다.
코리네형 세균 중 펜토스 포스페이트 대사 경로의 효소의 양은, 예를 들면, 유전자 카피수, 즉, 상기 효소를 코딩하는 핵산 서열의 카피수를 증가, 전사를 증가, 번역을 증가시킴으로써, 및/또는 그의 조합을 통해 증가시킬 수 있다.
당업자는 핵산 서열의 유전자 카피수를 증가시키기 위해, 전사를 증가시키기 위해, 및/또는 번역을 증가시키기 위해 필요한 유전자 변경 유형에 관해서는 잘 알고 있다.
일반적으로, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 카피수는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 코리네형 세균에서 발현시킴으로써 증가시킬 수 있다. 상기 벡터는 자가 복제가능한 바, 코리네형 세균 내에서 안정하게 유지될 수 있다. C. 글루타미쿰에서 펜토스 포스페이트 대사 경로의 폴리펩티드 및 효소를 발현하는 전형적인 벡터로는 (문헌 ([Bott, M. and Eggeling, L., eds. Handbook of Corynebacterium glutamicum. CRC Press LLC, Boca Raton, FL]; [Deb, J.K. et al. (FEMS Microbiol. Lett. (1999), 175(1), 11-20)], [Kirchner O. et al. (J. Biotechnol. (2003), 104 (1-3), 287-299)], WO 2006069711 및 WO 2007012078)에 기재되어 있는 pCliK pB 및 pEKO를 포함한다.
코리네형 세균에서 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 카피수를 증가시키기 위한 또다른 접근법에서는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 추가의 카피를 C. 글루타미쿰의 염색체 내로 통합시킬 수 있다. 염색체 통합은 예를 들면, 각 폴리펩티드의 내인성 카피가 위치하는 유전자좌에서 일어난다. 추가로 및/또는 별법으로, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 염색체 증식은 코리네형 세균의 게놈 중 다른 유전자좌에서 일어날 수 있다. C. 글루타미쿰의 경우, 염색체 통합에 의해 유전자 카피수를 증가시킬 수 있는 각종 방법이 당업자에게 알려져 있다. 그러한 방법은 예를 들면, 벡터 pK19를 이용하며, 이는 공개 문헌 [Schafer A, et al. J Bacteriol. 1994 176(23): 7309-7319]에 상세히 기재되어 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 염색체 통합을 위한 기타 다른 벡터로는 WO 2005059093 또는 WO 2007011845에 기재되어 있는 pCLIK int sacB를 포함한다.
펜토스 포스페이트 대사 경로를 이루는 하나 이상의 효소의 양을 증가시키는 것은 또한 각 효소를 코딩하는 핵산 서열의 전사를 증가시킴으로써 이루어질 수 있다. 전사가 증가하면 더 많은 mRNA가 형성되고, 이로써 최종적으로는 더 많은 양의 단백질이 번역될 것이다.
다수의 접근법에 의해 코리네형 세균에서 코딩 서열의 전사를 증가시킬 수 있다는 것을 당업자는 알고 있다. 따라서, 강한 프로모터 및/또는 강한 인핸서 요소를 사용함으로써 전사를 증가시킬 수 있다. 또한, 예를 들어, 압타머와 같은 전사 활성인자를 사용할 수 있거나, 전사 인자를 과다발현시킬 수 있다. 본 발명과 관련하여 강한 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
야생형 상황하의 각 핵산 서열 앞에 존재하는 내인성 프로모터보다 더 높은 정도로 각 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 전사시킨다면, 프로모터는 본 발명과 관련하여 "강한 프로모터"인 것으로 간주된다.
본 발명의 목적상, 하기 프로모터를 사용하는 것을 고려할 수 있다: PSOD (서열 9), PgroEs (서열 10), PEFTu (서열 11) 및 λPL (서열 12). 이러한 프로모터는 보통 C. 글루타미쿰에서 폴리펩티드를 과다발현시키는데 사용되고, 반드시 모든 정황에서 그러한 것은 아니지만, 몇몇 정황에 있어서 프로모터의 강도는 하기 순서를 갖는 것으로 간주된다:
λPL > PEFTu > PSOD > PGRoES.
예를 들어, 각 효소를 코딩하는 핵산 서열의 코돈 선호도를 최적화시킴으로써 번역을 개선시킬 수 있다. 숙주 효소의 핵산 서열을 사용하는 경우, 코돈 선호도를 적합화시키는 것이 전형적으로는 반드시 필요한 것은 아니지만, 이 또한 적용될 수도 있다. 그러나, C. 글루타미쿰에서 E. 콜라이의 각 서열을 과다발현시켜 예를 들어, ABC형 수송체 단백질의 양을 증가시키고자 하는 경우에는, E. 콜라이 단백질의 코딩 서열을 C. 글루타미쿰의 코돈 선호도로 적합화시키는 것을 고려해 볼 가치가 있을 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 예를 들면, 각 코리네형 세균, 바람직하게는 C. 글루타미쿰의 염색체 중의 내인성 유전자의 위치에 다수의 카피로 각 핵산 서열을 통합시킴으로써 C. 글루타미쿰의 btu 오페론에서 관찰되는 바와 같이 ABC형 수송체 단백질의 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열의 카피수를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 접근법은 보통 가능한 한 게놈의 게놈 통합성을 유지시켜 준다.
당업자는 또한 C. 글루타미쿰에서 btu2 오페론의 음성 조절 단백질 btuR2와 같은, 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질의 양 및/또는 활성을 하향조절하는 각종 방법을 알고 있다. 예를 들어, btuR2의 양 및/또는 활성을 하향조절하는 전형적인 접근법은 이러한 벡터를 코딩하는 내인성 유전자를 유전적으로 파괴시켜 더이상 기능적으로 작용하지 못하도록 하는 것이다. 대체 실시태양에서, 예를 들어, 서열 1의 내인성 서열에 돌연변이를 도입함으로써 생성된 단백질이 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질의 발현에 대해 그의 음성적 저해 효과를 발휘하지 못하거나, 적어도 그보다는 좀 더 적은 정도로 상기 효과를 발휘한다. C. 글루타미쿰에서 btu2 오페론 중 btuR2와 같은 음성 조절 단백질을 코딩하는 핵산 서열 앞에 내인성 프로모터보다 약한 프로모터를 배치하는 접근법 또한 사용될 수 있다.
한번에 1개의 염기를 교체하여 본 프로모터를 "-35" 또는 "-10" 영역에 있는 공통 프로모터와 덜 유사하게 만듦으로써 프로모터를 더 약하게 만들 수 있다. 공통 "-35" 영역은 서열 TTGACA를 가질 수 있고, 공통 "-10" 영역은 서열 TATAAT를 갖는다.
물론, 당업자는 상기 언급한 접근법들을 조합할 수 있다는 것도 이해할 것이다. 따라서, btuR2 또는 그의 대응물을 코딩하는 핵산 서열이 파괴되어 있고, 예를 들어, 서열 2, 6 및 8에 의해 코딩되는 ABC형 수송체 단백질 또는 그의 대응물의 발현이 예를 들어, 강한 프로모터에 의해 과다발현되는 것으로서, 바람직하게는 코리네박테리움으로부터 선택되고, 더욱더 바람직하게는 C. 글루타미쿰으로부터 선택되는 미생물을 구상할 수 있다.
하기 표 1은 이하에 더욱 상세히 논의되는, 효소 또는 단백질 및 그를 코딩하는 유전자 서열의 진뱅크 등록 번호에 관한 개관을 제공한다. 열거되어 있는 진뱅크 등록 번호는 진뱅크(GenBank) 또는 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/에서 살펴볼 수 있거나, 액세스할 수 있는 다른 공개 데이타베이스를 지칭하는 것이다. 하기 표에 열거되어 있는 유전자 또는 단백질 중 임의의 것의 많은 상동체들은 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, "질의"로서 하기 표의 서열을 사용하여 동일 웹사이트에서 찾아볼 수 있는 "BLAST" 프로그램을 사용함으로써 살펴볼 수 있다.
상기 등록 번호는 진뱅크의 공식 등록 번호이거나, 진뱅크에서 상호 참조 관계에 있는 등록 번호의 별칭이다. 이러한 번호는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/에서 검색할 수 있거나, 살펴볼 수 있다.
C. 글루타미쿰에서 폴리펩티드 및 유전자의 양 및/또는 활성을 증가 및 감소시킬 수 있는 방법에 대한 일반적인 개관을 하기에 제공한다. 당업자는 본 실시예에 개시되어 있는 것 이외의 실시태양을 실행할 때에 이러한 정보에 의존할 수 있다.
양 및/또는 활성의 증가 또는 도입
양을 증가시키는 것에 관해, 2가지 기본적인 시나리오가 차별화될 수 있다. 제1 시나리오에서 효소의 양은 각 단백질의 외인성 변형물의 발현에 의해 증가된다. 제2 시나리오에서 내인성 단백질의 발현은 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서, 리보좀 결합 부위 요소의 활성, 및/또는 전사, 번역 또는 번역 후 수준에서 각 단백질의 활성을 조절하는 다른 조절 활성에 영향을 줌으로써 증가된다.
따라서, 단백질의 활성 및 양을 증가시키는 것은 다른 경로들을 통해서, 예를 들면, 전사, 번역, 단백질 수준에서 저해 조절 기전의 작동을 정지시키거나, 예를 들어, 강한 프로모터에 의한 내인성 트랜스케톨라제를 유도하고/거나 트랜스케톨라제를 코딩하는 핵산을 도입함으로써 출발 유기체와 비교하여 이들 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 발현을 증가시킴으로써 이루어질 수 있다.
하나의 실시태양에서, 표 1의 효소의 양 및/또는 활성을 증가시키는 것은 표 1의 효소를 코딩하는 핵산을 코리네형 세균, 바람직하게는 C. 글루타미쿰 내로 도입함으로써 달성된다.
원칙적으로는 표 1 또는 2에 열거된 단백질의 효소 활성을 갖는, 여러 유기체의 모든 단백질이 사용될 수 있다. 진핵생물 공급원으로부터의 이러한 효소의 게놈 핵산 서열은 인트론을 함유하기 때문에, 숙주 유기체가 상응하는 mRNA를 스플라이싱할 수 없거나 상응하는 mRNA가 스플라이싱되도록 할 수 없을 경우에는 상응하는 cDNA와 같이 이미 프로세싱된 핵산 서열이 사용된다. 본 명세서에 언급된 모든 핵산은 예를 들어 RNA, DNA 또는 cDNA 서열일 수 있다.
본 발명에 따라, 단백질의 양을 증가시키거나 도입하는 것은 전형적으로 다음 단계들을 포함한다:
a) 5'-3'-배향의 하기 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 서열
- 본 발명의 유기체에서 기능적인 프로모터 서열,
- 그에 작동가능하게 연결된, 예를 들어, 표 1의 단백질, 그의 기능적 상동체, 기능적 단편 또는 기능적인 돌연변이화된 변형물을 코딩하는 DNA 서열,
- 본 발명의 유기체에서 기능적인 종결 서열
을 포함하는 벡터를 생산하는 단계:
b) 단계 a)로부터의 벡터를 본 발명의 유기체, 예를 들어, C. 글루타미쿰으로 전달하고, 임의로 각각의 게놈 내로 통합시키는 단계.
상기 언급한 바와 같이, 기능적 단편은 예를 들어, 표 1 또는 2의 효소를 코딩하는 핵산 서열의 단편에 관한 것으로서, 그의 발현을 통해서도 여전히 각각의 전장의 단백질의 효소 활성을 갖는 단백질을 수득할 수 있는 것이다.
상기 언급한 방법은 예를 들어, 표 1의 효소 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 DNA 서열의 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다. 프로모터 및 종결 서열과 같이, 조절 서열을 포함하는 상기 벡터의 용도가 당업자에게 공지되어 있다. 추가로, 당업자는 단계 a)로부터의 벡터를 유기체, 예로서, C. 글루타미쿰으로 전달할 수 있는 방법과, 그의 게놈 내로 통합될 수 있도록 하는데 어떤 특성을 벡터가 가져야 하는지를 알고 있다.
본 발명에 따라, 표 1의 효소를 코딩하는 핵산의 유전자 발현의 증가 또한 유기체, 특히, C. 글루타미쿰의 각각의 내인성 효소의 발현에 대한 조작이라는 것도 이해할 것이다. 이는 예를 들어, 상기 효소를 코딩하는 유전자에 대한 프로모터 DNA 서열을 변경시킴으로써 이루어질 수 있다. 상기와 같이 이들 효소의 발현 속도를 변경, 바람직하게는 증가시키는 변경은 강한 프로모터로의 치환에 의해, 그리고 DNA의 결실 및/또는 삽입에 의해 이루어질 수 있다.
내인성 유전자의 프로모터 서열을 변경시키면 일반적으로는 유전자의 발현량이 변경되고, 이로써, 세포 또는 유기체에서 검출가능한 활성도 변경되는 것이다.
추가로, 각각 내인성 유전자의 발현의 변경 및 증가는, 형질전환된 유기체에서는 발생되지 않고, 이들 유전자의 프로모터와 상호작용하는 것인 조절 단백질에 의해 이루어질 수 있다. 그러한 조절 인자는 예를 들어, WO 96/06166에 기재되어 있는 바와 같이, DNA 결합 도메인 및 전사 활성인자 도메인으로 구성된 키메라 단백질일 수 있다.
내인성 유전자의 활성 및 함량을 증가시킬 수 있는 추가의 가능성은 예를 들어, 과다발현에 의해서 내인성 유전자의 전사에 관여하는 전사 인자를 상향조절하는 것이다. 전사 인자의 과다발현 수단은 당업자에게 알려져 있다.
내인성 효소, 예로서, 표 1의 효소의 발현은 유전자의 프로모터 서열에 특이적으로 결합하는 압타머의 발현을 통해 조절될 수 있다. 자극 또는 억제 프로모터 영역에 결합하는 압타머에 따라 예를 들면, 표 1의 효소의 양은 증가하게 될 수 있다.
추가로, 내인성 유전자의 활성을 변경시키는 것은 내인성 유전자 카피의 표적화된 돌연변이 유발에 의해 이루어질 수 있다.
예를 들어, 표 1의 효소를 코딩하는 내인성 유전자를 변경시키는 것은 또한 상기 효소의 번역 후 변형에 영향을 줌으로써 이루어질 수 있다. 이는 예를 들면, 과다발현 또는 유전자 사일런싱과 같이 상응하는 수단에 의해서 효소의 번역 후 변형에 관여하는 키나제 또는 포스파타제와 같은 효소의 활성을 조절함으로써 일어날 수 있다.
또다른 실시태양에서, 효소는 효율이 개선될 수 있거나, 화합물 생산의 피드백 저해가 방지되도록 그의 알로스테릭 제어 영역이 파괴될 수 있다. 유사하게, 분해 효소는, 그의 분해 활성이 세포의 생존을 손상시키지 않으면서 표 1의 원하는 효소에 대해 감소되도록 치환, 결실 또는 부가에 의해 결실되거나 변형될 수 있다. 각각의 경우, 메티오닌의 전체 수율, 생산율 또는 양이 증가될 수 있다.
또한, 예를 들어, 표 1의 단백질에서의 상기와 같은 변경은 다른 정밀 화학물질, 예로서, 시스테인 또는 글루타티온과 같은 다른 황 함유 화합물, 다른 아미노산, 비타민, 보조인자, 기능 식품, 핵산, 뉴클레오시드 및 트레할로스의 생산을 개선시킬 수 있는 것도 가능하다. 임의의 하나의 화합물의 대사는 세포 내의 다른 생합성 및 분해 경로와 얽혀 있을 수 있고, 한 경로에서는 필수적인 보조인자, 중간체, 또는 기질이 또다른 이러한 경로에 의해 공급받거나 제한될 수 있다. 그러므로, 표 1의 단백질 중 하나 이상의 활성을 조정함으로써, 메티오닌 이외의 다른 정밀 화학물질의 양, 효율 및 속도는 긍정적인 영향을 받을 수 있다.
표 1의 효소의 양 및/또는 활성을 증가시키거나 도입하기 위한 상기 언급한 이들 전략법은 제한적인 것을 의미하지 않으며; 이러한 전략법에 대한 변형은 당업계의 숙련인에게는 용이하게 명백해질 것이다.
효소의 양 및/또는 활성의 감소
메티오닌 생산을 위해 미리 최적화된 출발 유기체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다는 것은 상기에서 설명된 바 있다. C. 글루타미쿰에서, 예를 들면, metQ의 활성을 하향조절시킬 수 있다.
효소의 양 및/또는 활성을 감소시키기 위해서는 다양한 전략법이 이용될 수 있다.
예로서, 표 1의 것과 같은 내인성 효소의 발현은 예를 들어 유전자의 프로모터 서열에 특이적으로 결합하는 압타머의 발현을 통해 조절될 수 있다. 자극 또는 억제 프로모터 영역에 결합하는 압타머에 따라, 표 1의 효소의 양, 및 따라서, 이 경우의 효소 활성은 예를 들어 감소될 수 있다.
압타머는 또한 예를 들어, 각 효소의 촉매 중심에 결합하는 것과 같이 그 자신이 효소에 특이적으로 결합하여 효소의 활성을 감소시키도록 디자인될 수 있다. 압타머의 발현은 보통 벡터-기반 과다발현 (상기 참조)에 의해 달성되며, 압타머의 디자인 및 선택은 당업자에게 잘 알려져 있다 (문헌 [Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243,123-36]).
추가로, 표 1의 내인성 효소의 양 및 활성의 감소는 당업자에게 잘 알려져 있는 다양한 실험적 수단에 의해 달성될 수 있다. 상기 수단은 보통 "유전자 사일런싱"이라는 용어로 요약된다. 예를 들어, 내인성 유전자의 발현은 상기 언급된 벡터를 전달함으로써 사일런싱될 수 있으며, 이것은 예로서, C. 글루타미쿰과 같은 유기체에 안티센스 배향으로 효소 또는 그의 일부를 코딩하는 DNA 서열을 갖는다. 이는 세포에서 이러한 벡터의 전사가 RNA를 초래하며, 이것이 내인성 유전자에 의해 전사된 mRNA와 혼성화할 수 있고 따라서 그의 번역을 방지할 수 있다는 사실에 기초한다.
원칙적으로, 안티센스 전략법은 리보자임 방법과 커플링될 수 있다. 리보자임은 안티센스 서열에 커플링될 경우에 표적 서열을 촉매적으로 표적 서열을 절단하는 촉매 활성인 RNA 서열이다 (문헌 [Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257-75]). 이는 안티센스 전략법의 효율을 증대시킬 수 있다.
상동성 재조합 미생물을 제조하기 위해, 결실, 부가 또는 치환이 도입되어 변경된, 예를 들어 내인성 유전자를 기능적으로 파괴시킨, 표 1의 효소를 코딩하는 유전자의 적어도 일부를 함유하는 벡터를 제조한다.
하나의 실시태양에서, 벡터는 상동성 재조합시에 내인성 유전자가 기능적으로 파괴되도록 (즉, 더이상 기능적 단백질을 코딩하지 못하도록) 디자인된다. 별법으로, 벡터는 상동성 재조합시에 돌연변이화되거나 다르게는 변경되기는 하나 여전히 기능적 단백질은 코딩하도록, 예를 들면, 상류 조절 영역이 변경됨으로써 예를 들어, 표 1의 내인성 효소의 발현을 변경시킬 수 있도록 디자인될 수 있다. 이러한 접근법은, 효소의 발현이 완전하게 파괴되지는 않지만, 필요한 최소 수준으로까지 감소된다는 이점을 가질 수 있다. 당업자는 내인성 서열을 치환하거나 결실시키는데 어떤 벡터가 사용될 수 있는지 알고 있다. C. 글루타미쿰의 경우, 그러한 벡터로는 pK19 및 pCLIK int sacB를 포함한다. C. 글루타미쿰에서 염색체 서열을 파괴시키는 것에 관한 구체적인 설명은 하기에서 제공한다.
추가로, 전사 인자의 양을 감소시킴으로써 유전자는 억제될 수 있다.
표적 단백질, 그 자체를 억제시킬 수 있는 인자 또한 세포 내로 도입될 수 있다. 단백질 결합 인자는 예를 들어, 상기 언급한 압타머일 수 있다 (문헌 [(Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol. 243, 123-36]).
그의 발현이 표 1의 효소의 양 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는 추가의 단백질 결합 인자로는 효소 특이 항체가 고려될 수 있다. 재조합 효소 특이 항체, 예로서, 단일 쇄 항체의 생산은 당업계에 공지되어 있다. 상기 항체의 발현은 또한 문헌 ([Fiedler et al., (1997) Immunotechnology 3, 205-216]; [Maynard and Georgiou (2000) Annu . Rev . Biomed . Eng . 2, 339-76])으로부터 알 수 있다.
언급한 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러므로, 당업자라면 또한 예를 들어 안티센스 방법에 사용되는 핵산 작제물은 전형적으로 어떠한 크기를 가져야 하는지, 및 각각의 핵산 서열은 어떠한 상보성, 상동성 또는 동일성을 가져야 하는지를 알 것이다. 상보성, 상동성 및 동일성이라는 용어는 당업자에게 공지되어 있다.
상보성이라는 용어는 2가지 상보적 염기 사이의 수소 결합으로 인해 또다른 핵산 분자와 혼성화할 수 있는 핵산 분자의 능력을 기재한다. 당업자라면 2가지 핵산 분자가 서로서로 혼성화할 수 있도록 하기 위해 100%의 상보성을 보일 필요는 없음을 알 것이다. 또다른 핵산 서열과 혼성화하는 핵산 서열은 상기 다른 핵산 서열과의 상보성이 각각 바람직하게는 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 특히 바람직하게는 적어도 80%, 또한 특히 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 98 또는 100%이다.
안티센스 서열과 내인성 mRNA 서열의 혼성화는 전형적으로 세포내 조건하에 생체내에서 또는 시험관내에서 일어난다. 본 발명에 따라, 혼성화는 특이적 혼성화를 보장하기에 충분한 엄격한 조건하에 생체내에서 또는 시험관내에서 수행된다.
엄격한 시험관내 혼성화 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌으로부터 알아낼 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (2001)] 참조). "특이적 혼성화"라는 용어는 분자가 엄격한 조건하에서 특정 핵산 서열에 우선적으로 결합하고, 이때 상기 핵산 서열이 예를 들어 DNA 또는 RNA 분자의 복합 혼합물의 일부분일 경우를 지칭한다.
따라서, "엄격한 조건"이라는 용어는 핵산 서열이 표적 서열에 우선적으로 결합하지만, 다른 서열에는 결합하지 않거나 또는 적어도 유의하게 감소된 정도로 결합하는 조건을 지칭한다.
엄격한 조건은 상황에 따라 달라진다. 서열이 길수록 보다 높은 온도에서 특이적으로 혼성화된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 및 한정된 pH 값을 갖는 특이적 서열의 융점 (Tm)보다 혼성화 온도가 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열에 상보적인 분자의 50%가 상기 표적 서열과 혼성화되는 온도 (한정된 pH 값, 한정된 이온 강도, 및 한정된 핵산 농도)이다. 전형적으로, 엄격한 조건은 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 (또는 또다른 염의 이온)의 염 농도, 및 7.0 내지 8.3의 pH 값을 포함한다. 짧은 분자 (예를 들어, 10 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 분자)의 경우, 상기 온도는 적어도 30℃이다. 또한, 엄격한 조건은 예를 들어 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가를 포함할 수 있다. 전형적인 혼성화 및 세척 완충액은 하기 조성의 것이다.
사전
혼성화
용액:
0.5 % SDS
5x SSC
50 mM NaPO4, (pH 6.8)
0.1% Na-피로포스페이트
5x 덴하르트 시약(Denhardt's reagent)
100 ㎍/연어 정액
혼성화 용액: 사전 혼성화 용액
1x106 cpm/ml 프로브 (5-10분, 95℃)
20x SSC : 3 M NaCl
0.3 M 시트르산나트륨
HCl을 사용하여 pH 7이 되도록 함
50x 덴하르트 시약: 5 g 피콜(Ficoll)
5 g 폴리비닐피롤리돈
5 g 소혈청알부민
A. dest를 500 mL까지 첨가
전형적인 혼성화 절차는 하기와 같다:
임의적 단계: 블롯을 1x SSC/0.1% SDS 중 65℃에서 30분 동안 세척
사전- 혼성화: 50-55℃에서 적어도 2시간 동안 수행
혼성화: 55-60℃에서 밤새도록 수행
세척: 05분, 2x SSC/0.1% SDS
혼성화 온도
30분, 2x SSC/0.1% SDS
혼성화 온도
30분, 1x SSC/0.1% SDS
혼성화 온도
45분, 0.2x SSC/0.1% SDS, 65℃
5분, 0.1x SSC, 실온
안티센스 목적을 위해, 100개의 핵산, 80개의 핵산, 60개의 핵산, 40개의 핵산 및 20개의 핵산의 서열 길이를 넘는 상보성이면 충분할 수 있다. 보다 긴 핵산 길이 또한 분명 충분할 것이다. 상기 언급한 방법의 조합 적용도 고려가능하다.
본 발명에 따라, 유기체에서 활성인 프로모터에 5'-3' 배향으로 작동가능하게 연결된 DNA 서열이 사용될 경우, 일반적으로 벡터는 유기체 세포로 전달된 후에 코딩 서열의 과다발현을 가능하게 하거나, 내인성 핵산 서열 및 그로부터 발현되는 단백질 각각의 억제 또는 경쟁 및 차단을 유발할 수 있도록 작제될 수 있다.
특정 효소의 활성은 또한 유기체에서 그의 비기능적 돌연변이체를 과다발현시킴으로써 감소될 수 있다. 따라서, 해당 반응을 촉매화시킬 수는 없지만, 예를 들어, 기질 또는 보조 인자에 결합할 수 있는 비기능적 돌연변이체는 과다발현에 의해 내인성 효소와 경쟁하고 따라서 반응을 억제시킬 수 있다. 숙주 세포 중 효소의 양 및/또는 활성을 감소시키기 위한 추가의 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에 따라, 비기능성 효소는 본질적으로 기능성 효소 및 그의 기능적 단편과 각각 동일한 핵산 서열 및 아미노산 서열을 갖지만, 일부의 위치에서는 비기능성 효소가 각각의 반응을 촉매화시킬 수 없거나, 또는 매우 제한된 정도로만 촉매화시킬 수 있는 효과를 갖는, 핵산 또는 아미노산의 점 돌연변이, 삽입 또는 결실을 갖는다. 상기 비기능성 효소는, 각각의 반응을 여전히 촉매화시킬 수는 있지만 더 이상은 피드백 조절은 되지 않는 효소와 혼용(intermix)될 수 없다. 본 발명에 따라, "비기능성 효소"라는 용어는 각각 아미노산 수준 및 핵산 수준에서 각각의 기능성 효소에 실질적인 서열 상동성을 갖지 않는 단백질은 포함하지 않는다. 따라서, 각각의 반응을 촉매화시킬 수 없고, 각각의 효소에 실질적인 서열 상동성을 갖지 않는 단백질은 정의에 의해 본 발명의 "비기능성 효소"라는 용어의 의미에 포함되지 않는다. 비기능성 효소는 본 발명의 범위 내에서 불활성화된 효소 또는 불활성 효소로도 지칭된다.
그러므로, 상기 언급한 점 돌연변이, 삽입 및/또는 결실을 수반하는 본 발명에 따른 것으로, 예를 들어, 표 1의 것과 같은 비기능성 효소는 예를 들어, 본 발명에 따른 표 1의 야생형 효소 또는 그의 기능적 등가 부분과 실질적인 서열 상동성을 특징으로 한다. 실질적인 서열 상동성을 측정하기 위해서는 상기 기술된 동일성 등급이 적용될 것이다.
벡터 및 숙주 세포
본 발명의 하나의 측면은 상기 언급한 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본원에서 사용된 "벡터"라는 용어는 그에 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다.
벡터 중 한 가지 유형은 "플라스미드"인데, 이는 추가의 DNA 절편이 결찰될 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다.
특정 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제 가능하다 (예를 들어, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 다른 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈 내로 통합되고, 따라서 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 그에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다.
이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
일반적으로, 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는, 플라스미드가 가장 흔하게 사용되는 벡터 형태이기 때문에, 이들은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 등가의 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터를 포함시키고자 한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 언급한 바와 같은 핵산을 숙주 세포에서 각각의 핵산 발현에 적합한 형태로 포함할 수 있으며, 이는 재조합 발현 벡터가 발현에 사용될 숙주 세포에 기초하여 선택되어 발현될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함함을 의미한다.
본 발명의 목적상, 작동적 연결은 프로모터, 코딩 서열, 종결인자 및, 임의로 추가의 조절 요소가, 코딩 서열이 발현될 때, 그의 결정에 따라 그의 기능을 수행할 수 있는 방식으로 연속적으로 배열된 것으로 이해된다.
재조합 발현 벡터 내에서, "작동가능하게 연결된"이란 관심의 대상이 되는 핵산 서열이 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템내 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입된 경우 숙주 세포 내에서) 발현가능하도록 조절 서열(들)에 연결된 것을 의미한다. 용어 "조절 서열"이란 프로모터, 리프레서 결합 부위, 활성자 결합 부위, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 종결인자, 또는 mRNA 2차 구조와 관련된 다른 요소)를 포함하는 것으로 한다. 이러한 조절 서열은, 예를 들면, 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다. 조절 서열로는 많은 유형의 숙주 세포 내에서 핵산 서열이 구성적으로 발현되도록 하는 것과 특정 숙주 세포 내에서만 핵산 서열이 발현되도록 하는 것을 포함한다. 바람직한 조절 서열은, 예를 들면, 프로모터, 예로서, cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, amy, SP02, 파지 람다PR (λPR로도 알려져 있다), 파지 람다PL (λPL로도 알려져 있다), 파지 SPO1 P15, 파지 SPO1 P26, pSOD, EFTu, EFTs, GroEL, MetZ (C. 글루타미쿰으로부터의 마지막 5개) 등이며, 이는 세균에서 바람직하게는 사용된다. 추가의 조절 서열은 효모 및 진균으로부터의 프로모터, 예로서, ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, ENO2, 식물로부터의 프로모터, 예로서, CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos 또는 유비퀴틴- 또는 파세올린-프로모터이다. 또한 인공 프로모터도 사용할 수 있다. 당업계의 숙련인은 발현 벡터가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 따라 다르게 고안될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입됨으로써 상기 언급한 변형된 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질 또는 펩티드, 예를 들어, 융합 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다.
원핵 세포 내에서의 단백질 발현은 융합 또는 비융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도가능한 프로모터 함유 벡터로 수행하는 것이 가장 빈번하다.
융합 벡터는 그의 코딩되는 단백질에, 일반적으로는 재조합 단백질의 아미노 말단 뿐만 아니라, C-말단에 다수의 아미노산을 부가하거나, 상기 단백질의 적합한 영역 내에서 상기 아미노산을 융합시킨다. 이러한 융합 벡터는 전형적으로 다음의 네가지 목적을 위한 것이다: 1) 재조합 단백질의 발현 증가, 2) 재조합 단백질의 가용성 증가, 및 3) 친화성 정제시에 리간드로서 작용하여 재조합 단백질의 정제 보조, 4) 추후의 단백질 검출을 위한 "태그" 제공. 종종, 융합 발현 벡터 내에서는 융합 부분과 재조합 단백질의 접합부에 단백질 분해 절단 부위가 도입되어 있어서 융합 단백질을 정제한 후 융합 부분으로부터 재조합 단백질을 분리할 수 있다. 이러한 효소 및 그의 동족 인식 서열로는 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다.
전형적인 융합 발현 벡터로는 pGEX (파마시아 바이오테크 인코포레이트(Pharmacia Biotech Inc) (문헌 [Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40]), pMAL (매사추세츠주 비버리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 및 pRIT5 (뉴저지주 피스카타웨이 소재의 파마시아(Pharmacia)) 등을 포함하며, 이들은 각각 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A를 융합시킨다.
코리네형 세균에 적합한 유도가능한 비융합 발현 벡터의 예로는 pHM1519, pBL1, pSA77 또는 pAJ667을 포함한다 (문헌 [Pouwels et al, eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0444 904018]). 적합한 C. 글루타미쿰 및 E. 콜라이 셔틀 벡터의 예는 예를 들어, pK19, pClik5aMCS pCLIKint sacB이거나, 문헌 [Eikmanns et al (Gene. (1991) 102, 93-8)]에서, 및 하기 공개문헌 및 특허 출원: [Schafer A, et al. J Bacteriol. 1994 176: 7309-7319, Bott, M. and Eggeling, L., eds. Handbook of Corynebacterium glutamicum. CRC Press LLC, Boca Raton], FL WO 2006069711, WO 2006069711)에서 살펴볼 수 있다. 원핵 세포 및 진핵 세포, 둘 모두에 적합한 기타 다른 발현 시스템에 대해서는 문헌 [chapters 16 and 17 of Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003]을 참조한다.
벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "형질전환" 및 "형질감염," " 접합" 및 "형질도입"이란 외래 핵산 (예를 들면, 선형 DNA 또는 RNA (예를 들면, 선형화된 벡터이거나, 또는 벡터 없는 단독 유전자 작제물)) 또는 벡터 형태의 핵산 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 파스미드, 파지미드, 트랜스포존 또는 다른 DNA)을 숙주 세포 내에 도입하는 다양한 공지 기법을 의미하는 것이며, 여기에는 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 리포펙션, 천연 감응법, 화학물질-매개 전달법, 또는 전기천공법 등이 포함된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는데 적합한 방법은 문헌 [Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003] 및 다른 실험 매뉴얼에서 살펴볼 수 있다.
이들 통합체를 확인하고 선별하기 위해, 일반적으로 선별가능한 마커 (예를 들면, 항생제 내성) 를 코딩하는 유전자를 관심의 대상이 되는 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입시킨다. 바람직한 선별가능한 마커로는 예로서, G418, 하이그로마이신, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 암피실린 및 메토트렉세이트와 같은 약물 내성을 부여하는 것들을 포함한다. 선별가능한 마커를 코딩하는 핵산은 상기 언급한 변형된 핵산 서열을 코딩하는 것과 동일한 벡터 상에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나, 별도의 벡터 상에서 도입될 수도 있다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선별법을 통해 확인할 수 있다 (예를 들면, 선별가능한 마커 유전자가 혼입된 세포는 생존할 것이나, 그렇지 않은 다른 세포는 사멸한다).
또다른 실시태양에서, 도입된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 선택된 시스템을 포함하는 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 예를 들면, 벡터 상에 lac 오페론의 제어를 받는 상기 언급한 핵산 서열 중 하나가 포함된 경우에는 오직 IPTG 존재하에서만 유전자가 발현될 수 있다. 이러한 조절 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입되어 있는 유기체 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 본원에서 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특정 피험체 세포를 의미할 뿐만 아니라, 상기 세포의 자손 또는 잠재적 자손도 의미할 수 있는 것으로 이해된다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 잇따른 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 상기와 같은 자손은 사실상 모체 세포와는 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에서 사용되는 용어의 범주내 포함된다.
C.
글루타미쿰의
성장-배지 및 배양 조건
C. 글루타미쿰의 배양에 관한 일반 교시가 하기에 주어질 것이다. 적합화는 것은 당업자에게 명백할 것이다. E. 콜라이 배양에 관한 표준 교재로부터 상응하는 정보를 검색할 수 있다.
유전자 변형된 코리네박테리아는 전형적으로 합성 또는 천연 성장 배지 중서 배양된다. 코리네박테리아용의 여러 상이한 성장 배지는 잘 알려져 있기도 하고 용이하게 이용할 수도 있다 (문헌 ([Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol . Biotechnol., 32: 205-210]; [von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11: 11-16]; 특허 DE 4,120,867; [Liebl(1992) "The Genus Corynebacterium, in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Springer-Verlag])).
상기 배지는 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및 미량 원소로 이루어진다. 바람직한 탄소 공급원은 당, 예로서, 단당류, 이당류 또는 다당류이다. 예를 들면, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리보스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스가 매우 우수한 탄소 공급원으로서의 역할을 한다.
또한, 예로서, 당밀과 같은 복합 화합물, 또는 당 정제로부터의 기타 부산물을 통해 당을 배지에 공급할 수 있다. 또한, 상이한 탄소 공급원의 혼합물을 공급하는 것도 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 알코올 및 유기산, 예로서, 메탄올, 에탄올, 아세트산 또는 락트산이다. 질소 공급원은 보통 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 상기 화합물을 함유하는 물질이다. 예시적인 질소 공급원으로는 암모니아 기체 또는 암모니아 염, 예로서, NH4Cl 또는 (NH4)2S04, NH4OH, 니트레이트, 우레아, 아미노산 또는 복합 질소 공급원, 예를 들어, 옥수수 함침액, 대두분, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등을 포함한다.
배지에 포함될 수 있는 무기염 화합물로는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 클로라이드-, 포스포러스- 또는 설페이트-염을 들 수 있다. 킬레이트 화합물은 용액 중의 금속 이온을 유지하기 위해 배지에 첨가될 수 있다. 특히 유용한 킬레이트 화합물로는 카테콜 또는 프로토카테쿠에이트와 같은 디하이드록시페놀, 또는 시트르산과 같은 유기산을 포함한다. 배지는 또한 다른 성장 인자, 예로서, 비타민 또는 성장 촉진제를 함유하는 것이 전형적이며, 그 예로는 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 포함한다. 성장 인자 및 염은 흔히 예로서, 효모 추출물, 당밀, 옥수수 함침액 등과 같은 복합 배지 성분으로부터 기원한다. 배지 화합물의 정확한 조성은 당해 실험에 매우 의존하며, 각각의 특정한 경우에 대해 개별적으로 결정된다. 배지 최적화에 대한 정보는 교재 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (Eds. P. M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)]에서 이용가능하다. 또한, 스탠다드 1(머크(Merck)) 또는 BHI(곡물 미량 주입물, 디프코(DIFCO)) 등과 같은 상업적 공급업체로부터의 성장 배지를 선택하는 것도 가능하다.
모든 배지 성분은 열에 의해 (1.5 바 및 121℃에서 20분), 또는 멸균 여과에 의해 멸균되어야 한다. 성분은 함께 멸균될 수 있거나, 필요에 따라 개별적으로 멸균될 수 있다.
모든 배지 성분은 성장의 시작시에 존재할 수 있거나, 이들은 임의로 연속적으로 또는 배치식으로 첨가될 수 있다. 배양 조건은 각각의 실험에 대해 개별적으로 정의된다.
온도는 15℃ 내지 45℃ 범위여야 한다. 온도는 일정하게 유지될 수 있거나, 실험하는 동안 변경될 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5 범위, 바람직하게는 약 7.0일 수 있으며, 배지에 완충액을 첨가함으로써 유지될 수 있다. 이러한 목적을 위한 예시적인 완충액으로는 인산칼륨 완충액이 있다. 합성 완충액, 예로서, MOPS, HEPES, ACES 등이 교대로 또는 동시에 사용될 수 있다. 또한, 성장시키는 동안 NaOH 또는 NH4OH를 첨가함으로써 배양물의 pH를 일정하게 유지시킬 수 있다. 예로서, 효모 추출물과 같은 복합 배지 성분이 사용될 경우에는, 많은 복합 화합물이 큰 완충 능력을 갖는다는 사실 때문에 추가의 완충액에 대한 필요성이 감소될 수 있다. 발효기가 미생물 배양에 사용될 경우, pH는 또한 기체성 암모니아를 이용하여 제어될 수 있다.
인큐베이션 시간은 보통 수시간 내지 수일 범위이다. 상기 시간은 브로쓰에 축적되는 생성물의 양을 최대화하기 위해 선택된다. 개시된 성장 실험은 다양한 용기, 예로서, 미세역가 플레이트, 유리관, 유리 플라스크 또는 여러 가지 크기의 유리 또는 금속 발효기에서 수행될 수 있다. 대량의 클론을 스크리닝하기 위해, 미생물을 배플이 있거나 없는 미세역가 플레이트, 유리관 또는 진탕 플라스크에서 배양하여야 한다. 바람직하게는 필요한 성장 배지의 10 부피%가 충진된 100 ml 또는 250 ml 진탕 플라스크가 사용된다. 플라스크는 100-300 rpm 범위의 속도를 이용하여 회전 진탕기 (진폭 25 mm) 상에서 진탕시켜야 한다. 증발 손실은 습한 대기를 유지함으로써 감소될 수 있고; 별법으로, 증발 소실에 대한 수학적 보정이 수행되어야 한다.
유전자 변형된 클론을 시험할 경우, 어떠한 삽입도 없는 변형되지 않은 대조군 클론 또는 기본 플라스미드를 함유하는 대조군 클론 또한 시험해야 한다. 배지는 30℃에서 인큐베이션된 아가 플레이트, 예로서, CM 플레이트, 예로서, CM 플레이트 (10 g/ℓ 글루코스, 2,5 g/ℓ NaCl, 2 g/ℓ 우레아, 10 g/ℓ 폴리펩톤, 5 g/ℓ 효모 추출물, 5 g/ℓ 육류 추출물, 2 g/ℓ 우레아, 10 g/ℓ 폴리펩톤, 5 g/ℓ 효모 추출물, 5 g/ℓ 육류 추출물, 22 g/ℓ 아가, pH 6.8, 2 M NaOH 포함) 상에서 성장시킨 세포를 이용하여 0.5 내지 1.5의 OD600으로 접종한다. 배지의 접종은 CM 플레이트로부터의 C. 글루타미쿰 세포의 염수 현탁액의 도입 또는 상기 세균의 액상 전배양물의 첨가에 의해 달성된다. 다른 인큐베이션 방법은 WO 2007012078로부터 이용할 수 있다.
일반적 방법
일반적 방법에 대한 프로토콜은 문헌 ([Handbook on Corynebacterium glutamicum, (2005) eds.: L. Eggeling, M. Bott., Boca Raton, CRC Press, at Martin et al. (Biotechnology (1987) 5, 137-146)], [Guerrero et al. (Gene (1994), 138, 35-41)], [Tsuchiya und Morinaga (Biotechnology (1988), 6, 428-430)], [Eikmanns et al. (Gene (1991), 102, 93-98)], EP 0 472 869, US 4,601,893, [Schwarzer and Puehler (Biotechnology (1991), 9, 84-87)], [Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology (1994), 60,126-132)], [LaBarre et al. (Journal of Bacteriology (1993), 175, 1001-1007)], WO 96/15246, [Malumbres et al. (Gene (1993), 134, 15-24)], JP-A-10-229891, [Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering (1998), 58,191-195)], [Makrides (Microbiological Reviews (1996), 60, 512-538)], WO 2006069711, WO 2007012078) 및 널리 공지된 유전학 및 분자 생물학의 교재에서 살펴볼 수 있다.
균주, 배지 및 플라스미드
균주는 예를 들어 하기 목록으로부터 이용할 수 있다:
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032,
코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC 15806,
코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC 13870,
코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1539,
코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC 17965,
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067,
브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869, 및
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020, 또는
그로부터 유래된 균주, 예로서, 예로서, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10065, DSM17322 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21608.
재조합
DNA
기술
프로토콜은 문헌 ([Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3], 및 [Handbook on Corynebacterium glutamicum (2005) eds. L. Eggeling, M. Bott., Boca Raton, CRC Press]에서 살펴볼 수 있다.
아미노산 및 메티오닌 중간체의 정량
분석은 가드 카트리지 및 시너지(Synergi) 4 ㎛ 칼럼 (MAX-RP 80 Å, 150 * 4.6 mm) (독일 아샤펜부르크 소재의 페노메넥스(Phenomenex))으로 HPLC (애질런트(Agilent) 1100, 독일, 발트브론 소재의 애질런트)에 의해 수행하였다. 주입하기 전, 분석물을 o-프탈디알데히드 (OPA) 및 환원제로서 머캅토에탄올 (2-MCE)을 사용하여 유도체화시킨다. 추가로, 설프하이드릴기를 요오도아세트산으로 차단한다. 분리는 극성 상으로서 40 mM NaH2PO4 (용리제 A, pH=7.8, NaOH로 조정), 및 비극성 상 (용리제 B)으로서 메탄올 물 혼합물 (100/1)을 사용하여 1 mL/분의 유속으로 수행한다. 하기 구배를 적용시킨다: 출발 0% B; 39분 39% B; 70분 64% B; 100% B, 3.5분; 2분 0% B (평형화를 위해). 실온에서의 유도체화는 하기 기술하는 바와 같이 자동화된다. 처음에, 바이신 (0.5 M, pH 8.5) 중 0.5 ㎕의 0.5% 2-MCE를 0.5 ㎕의 세포 추출물과 혼합한다. 이어서, 바이신 (0.5 M, pH 8.5) 중 1.5 ㎕의 50 mg/mL 요오도아세트산을 첨가한 후, 2.5 ㎕의 바이신 완충액 (0.5 M, pH 8.5)을 첨가한다. 유도체화는 1/45/54 v/v/v의 2-MCE/MeOH/바이신 (0.5 M, pH 8.5)에 용해된 0.5 ㎕의 10 mg/mL OPA 시약을 첨가함으로써 수행한다. 마지막으로, 혼합물을 32 ㎕의 H2O로 희석시킨다. 각각의 상기 피펫팅 단계 사이에, 1분의 대기 시간을 둔다. 이어서, 총 부피 37.5 ㎕를 칼럼 상에 주입한다. 자동 샘플러 니들이 샘플 제조 동안 (예를 들어, 대기 시간 내에) 및 샘플 제조 후에 주기적으로 제거될 경우, 분석 결과가 현저하게 개선될 수 있음에 유념해야 한다. 검출은 형광 검출기 (340 nm 여기, 방출 450 nm, 독일 발트브론 소재의 애질런트)에 의해 수행한다. 정량을 위한 내부 표준물은 α-아미노 부티르산 (ABA)이었다.
재조합 프로토콜 정의
하기에서는 상기 예측 결과를 이행하는, 메티오닌 생산 효을이 증가된 C. 글루타미쿰 균주를 어떻게 작제할 수 있는지, 그에 작제 방법을 기술할 것이다. 균주 작제에 관해 기술하기 이전에, 하기에서 사용되는 재조합 이벤트/프로토콜에 관해 정의한다.
본원에서 사용되는 "캠벨 인(Campbell in)"은 전체 환상 이중 가닥 DNA 분자 (예를 들어, 플라스미드)가 그 내부에서 단일 상동성 재조합 이벤트 (크로스-인(cross-in) 이벤트)에 의해 염색체 내로 통합되고 상기 환상 DNA 분자의 선형화된 버전을 상기 환상 DNA 분자의 제1 DNA 서열에 상동성인 염색체의 제1 DNA 서열 내로 효과적으로 삽입시키는 원래의 숙주 세포의 형질전환체를 의미한다. "캠벨드 인(Campbelled in)"은 "캠벨 인" 형질전환체의 염색체 내로 통합된 선형화된 DNA 서열을 의미한다. "캠벨 인"은 제1 상동성 DNA 서열의 복제물을 포함하고, 그의 각각의 카피는 상동성 재조합 교차 지점의 카피를 포함하고, 상기 카피를 둘러싼다. 이 명칭은 상기 종류의 재조합을 처음 제안한 알랜 캠벨(Alan Campbell) 교수의 이름에서 유래한 것이다.
본원에서 사용되는 "캠벨 아웃(Campbell out)"은 "캠벨 인" 형질전환체의 자손 세포로서, 여기서 제2 상동성 재조합 이벤트 (크로스 아웃 (cross out) 이벤트)가 "캠벨드 인" DNA의 선형화된 삽입된 DNA 상에 포함된 제2 DNA 서열과, 상기 선형화된 삽입체의 제2 DNA 서열에 상동성인 염색체 기원의 제2 DNA 서열 사이에 발생하고, 제2 재조합 이벤트는 통합된 DNA 서열의 일부를 결실 (제거)시키지만, 중요하게는, 원래의 숙주 세포에 비해, "캠벨 아웃" 세포가 염색체에 하나 이상의 의도적인 변화 (예를 들어, 이종 유전자 또는 DNA 서열의 단일 염기 치환, 다중 염기 치환, 삽입, 상동성 유전자 또는 변경된 상동성 유전자의 추가의 카피 또는 카피들의 삽입, 또는 상기 열거된 이들 상기 언급한 예를 1 초과로 포함하는 DNA 서열의 삽입)를 포함하도록, 통합된 캠벨드 인 DNA의 일부 (이것은 단일 염기만큼 작을 수 있다)를 염색체에 잔류시킨다.
"캠벨 아웃" 세포 또는 균주는 반드시 그러하지는 않지만, 보통은 "캠벨드 인" DNA 서열의 일부 (제거가 요구되는 부분)에 포함된 유전자, 예를 들면, 약 5% 내지 10%의 수크로스 존재하에 성장한 세포에서 발현될 때 치사되는 바실러스 섭틸리스 sacB 유전자에 대한 카운터-선별에 의해 수득한다. 카운터-선별과 함께 또는 카운터-선별을 수행하지 않으면서, 원하는 "캠벨 아웃" 세포는 제한하는 것은 아니지만, 예로서, 콜로니 형태, 콜로니 색상, 항생제 내성의 존재 또는 부재, 중합효소 연쇄 반응에 의한 제시된 DNA 서열의 존재 또는 부재, 영양요구성의 존재 또는 부재, 효소의 존재 또는 부재, 콜로니 핵산 혼성화, 항체 스크리닝 등과 같은 임의의 스크리닝가능한 표현형을 사용하여 원하는 세포에 대해 스크리닝함으로써 수득하거나 확인할 수 있다. 또한, 용어 "캠벨 인" 및 "캠벨 아웃"은 상기 기술한 방법 또는 공정을 언급하기 위해 상이한 시제에서 동사로서 사용될 수도 있다.
"캠벨 인" 또는 "캠벨 아웃"을 야기하는 상동성 재조합 이벤트가 상동성의 DNA 서열 내의 일정 범위의 DNA 염기에 걸쳐 발생할 수 있음이 이해되고, 상동성 서열은 상기 범위의 적어도 일부에 대해 서로 동일하기 때문에, 교차 이벤트가 발생한 정확한 위치를 특정하는 것이 보통은 불가능하다. 즉, 본래 어느 서열이 삽입된 DNA로부터 유도된 것인지 및 본래 어느 서열이 염색체 DNA로부터 유도된 것인지를 정확하게 특정하는 것은 불가능하다. 더욱이, 제1 상동성 DNA 서열 및 제2 상동성 DNA 서열은 보통 부분적인 비상동성 영역에 의해 분리되고, "캠벨 아웃" 세포의 염색체에 침적된 상태로 유지되는 것은 상기 비상동성 영역이다.
실용성을 위해, C. 글루타미쿰에서, 전형적인 제1 및 제2 상동성 DNA 서열은 적어도 약 200개 염기쌍의 길이일 수 있고, 수천개 염기쌍 이하의 길이일 수 있지만, 상기 과정은 보다 짧거나 더 긴 서열을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 상동성 서열의 길이는 약 500 내지 2000개의 염기일 수 있고, "캠벨 인"으로부터 "캠벨 아웃"을 얻는 것은 제1 및 제2 상동성 서열을 대략 동일한 길이로. 바람직하게는 200개 미만의 염기쌍의 차이로, 가장 바람직하게는 두 서열 중 짧은 서열의 길이가 더 긴 서열의 염기쌍의 적어도 70%인 길이가 되도록 정렬시켜 용이하게 수행된다. 캠벨 인 및 캠벨 인 아웃 방법에 관한 설명은 WO 2007012078로부터 인용할 수 있다.
<실시예>
하기 실험은 C. 글루타미쿰 트랜스케톨라제의 과다발현이 어떻게 메티오닌 생산을 증가시키는지에 관해 입증하는 것이다. 그러나, 이들 실시예는 어떤 식으로든 본 발명을 제한하고자 하는 것은 결코 아니다.
진탕 플라스크 실험 및
HPLC
분석
표준 당밀 배지를 사용하는 진탕 플라스크 실험을 균주를 이중 또는 사중으로 하여 수행하였다. 당밀 배지는 1 ℓ의 배지 중 40 g의 글루코스; 60 g의 당밀; 20 g의 (NH4)2SO4; 0.4 g의 MgSO4*7H2O; 0.6 g의 KH2PO4; 10 g의 효모 추출물 (디프코); 5 ml의 400 mM 트레오닌; 2 mg의 FeSO4.7H2O; 2 mg의 MnSO4.H2O; 및 50 g의 CaCO3 (리델 데 헨(Riedel-de Haen)) (부피는 ddH2O를 사용하여 채웠다)를 함유하였다. 20% NH4OH를 사용하여 pH를 7.8로 조정하고, 20 ml의 연속 교반된 배지 (CaCO3을 현탁 상태로 유지하기 위해)를 250 ml 배플이 달린 벨코(Bellco) 진탕 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 20분 동안 고압멸균시켰다. 고압멸균 후, 베이스 배지 1 ℓ당 4 ml의 "4B 용액"을 첨가하였다 (또는 80 ㎕/ 플라스크). "4B 용액"은 1 ℓ당 0.25 g의 티아민 하이드로콜로라이드 (비타민 B1), 50 mg의 시아노코발라민 (비타민 B12), 25 mg의 비오틴, 1.25 g의 피리독신 하이드로콜로라이드 (비타민 B6)를 함유하고, 비오틴을 용해시키기 위해 12.5 mM KPO4 (pH 7.0)으로 완충처리되고, 필터 멸균되었다. 몇몇 실험에서는, 비타민 B12의 최종 농도를 표준 농도보다 고농도로, 또는 저농도로 달리하였다. 배양물을 고무 밴드로 고정시킨 바이오쉴드(Bioshield)지로 덮인 배플이 달린 플라스크 내에서 48시간 동안 28℃ 또는 30℃에서 및 뉴 브런즈윅 사이언티픽(New Brunswick Scientific) 플로어 진탕기 내에서 200 또는 300 rpm에서 성장시켰다. 샘플은 24시간 및/또는 48시간째에 채취하였다. 원심분리에 의해 세포를 제거한 후, 상등액을 동일 부피의 60% 아세토니트릴로 희석시킨 후, 용액을 센트리콘(Centricon) 0.45㎛ 스핀 칼럼을 사용하여 막 여과하였다. 여액을 HPLC를 사용하여 메티오닌, 글리신 + 호모세린, O-아세틸호모세린, 트레오닌, 이소류신, 리신 및 다른 표시된 아미노산의 농도에 대해 분석하였다.
HPLC 분석을 위해, 여과된 상등액을 0.45㎛ 여과된 1 mM Na2EDTA로 1:100으로 희석하고, 1 ㎕의 용액을 보레이트 완충액(Borate buffer) (80 mM NaBO3, 2.5 mM EDTA (pH 10.2)) 중의 OPA 시약 (애질런트)를 사용하여 유도체화하고, G1321A 형광 검출기가 장착된 애질런트 1100 시리즈 HPLC 상에서 실행시키는 200 x 4.1 mm 하이퍼실(Hypersil) 5 μ AA-ODS 칼럼 (애질런트) 상으로 주입하였다. 여기 파장은 338 nm이고, 모니터링된 방출 파장은 425 nm이었다. 아미노산 표준 용액을 크로마토그래피시키고, 다양한 아미노산에 대한 체류 시간 및 표준 피크 면적을 측정하기 위해 사용하였다. 기기 제어, 데이타 획득 및 데이타 조작을 위해 애질런트에서 제공된 첨부 소프트웨어 패키지인 켐 스테이션(Chem Station)을 사용하였다. 하드웨어는 마이크로소프트 서비스 팩(Microsoft Service Pack) (SP6a)으로 업데이트된 마이크로소프트 윈도우스(Microsoft Windows) NT 4.0을 지원하는 HP 펜티엄 4 컴퓨터였다.
실험예
1 -
M2014
균주의 생성
C. 글루타미쿰 균주 ATCC 13032를 DNA A (pH273으로도 불린다) (서열 13)로 형질전환시키고, "캠벨드 인"시켜 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 이어서, "캠벨 인" 균주를 "캠벨드 아웃"시켜 피드백 내성 호모세린 데하이드로게나제 효소를 코딩하는 유전자(hom fbr )를 포함하는 "캠벨 아웃" 균주 M440을 수득하였다. 생성된 호모세린 데하이드로게나제 단백질은 S393이 F393으로 변화된 아미노산 변화 (Hsdh S393F로도 불린다)를 포함하였다.
이어서, 균주 M440을 DNA B (pH373으로도 불린다) (서열 14)로 형질전환시켜 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 이어서, "캠벨 인" 균주를 "캠벨드 아웃"시켜 피드백 내성 아스파테이트 키나제 효소를 코딩하는 유전자(Ask fbr ) (lysC 에 의해 코딩된다)를 포함하는 "캠벨 아웃" 균주 M603을 수득하였다. 생성된 아스파테이트 키나제 단백질에서, T311은 I311로 변화되었다 (LysC T311I로 불린다).
균주 M603은 약 17.4 mM 리신을 생산한 반면, ATCC13032 균주는 측정가능한 양의 리신을 생산하지 않은 것으로 밝혀졌다. 추가로, 표 2에 요약된 바와 같이, M603 균주는 약 0.5 mM 호모세린을 생산하였고, 이에 비해 ATCC13032 균주에 의해 측정가능한 양이 생산되지 않았다.
균주 ATCC13032 및 M603에 의해 생산된 호모세린, O-아세틸호모세린, 메티오닌 및 리신의 양 | ||||
균주 | 호모세린 (mM) | O-아세틸호모세린 (mM) | 메티오닌 (mM) | 리신 (mM) |
ATCC13032 | 0.0 | 0.4 | 0.0 | 0.0 |
M603 | 0.5 | 0.7 | 0.0 | 17.4 |
균주 M603을 DNA C (pH304로도 불린다) (서열 15)로 형질전환시켜 "캠벨 인" 균주를 수득하고, 이어서 상기를 "캠벨드 아웃"시켜 "캠벨 아웃" 균주 M690을 수득하였다. M690 균주는 metH 유전자의 상류에 PgroES 프로모터 (P497 metH로 불린다)를 함유하였다. P497 프로모터의 서열을 서열 10에 도시한다. 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, M690 균주는 약 77.2 mM 리신 및 약 41.6 mM 호모세린을 생산하였다.
균주 M603 및 M690에 의해 생산된 호모세린, O-아세틸호모세린, 메티오닌 및 리신의 양 | ||||
균주 | 호모세린 (mM) | O-아세틸호모세린 (mM) | 메티오닌 (mM) | 리신 (mM) |
M603 | 0.5 | 0.7 | 0.0 | 17.4 |
M690 | 41.6 | 0.0 | 0.0 | 77.2 |
이어서, M690 균주를 하기와 같이 돌연변이화시켰다: BHI 배지 (벡톤 디킨슨 (BECTON DICKINSON)) 중에서 성장시킨 M603의 철야 배양물을 50 mM 시트레이트 완충액 (pH 5.5) 중에 세척하고, 20분 동안 30℃에서 N-메틸-N-니트로소구아니딘 (50 mM 시트레이트 (pH 5.5) 중 10 mg/ml)로 처리하였다. 처리 후, 세포를 다시 50 mM 시트레이트 완충액 (pH 5.5)중에 세척하고, 하기 성분을 함유하는 배지 상에 플레이팅하였다: (모든 언급된 양은 500 ml 배지에 대해 계산된 것이다) 10 g의 (NH4)2SO4; 0.5 g의 KH2PO4; 0.5 g의 K2HPO4; 0.125 g의 MgSO4*7H2O; 21 g의 MOPS; 50 mg의 CaCl2; 15 mg의 프로토카테쿠인산; 0.5 mg의 비오틴; 1 mg의 티아민; 및 5 g/ℓ D,L-에티오닌 (시그마 케미칼스(SIGMA CHEMICALS), 카탈로그 번호 E5139) (KOH로 pH 7.0으로 조정된다). 추가로, 배지는 10 g/ℓ FeSO4*7H2O; 1 g/ℓ MnSO4*H2O; 0.1 g/ℓ ZnSO4*7H2O; 0.02 g/ℓ CuSO4; 및 0.002 g/ℓ NiCl2*6H2O (모두 0.1 M HCl에 용해시킴)으로 이루어진 미량 금속 용액 0.5 ml를 함유하였다. 최종 배지를 여과 멸균하고, 배지에 40 ml의 멸균 50% 글루코스 용액 (40 ml) 및 멸균 아가를 1.5%의 최종 농도로 첨가하였다. 최종 아가 함유 배지를 아가 플레이트에 붓고 최소-에티오닌 배지로서 표지하였다. 돌연변이화된 균주를 플레이트 (최소-에티오닌) 상에 스프레딩하고, 3-7일 동안 30℃에서 인큐베이션시켰다. 배지 상에서 성장된 클론을 단리시키고, 동일한 최소-에티오닌 배지 상에 재스트리킹하였다. 몇몇 클론을 메티오닌 생산 분석을 위해 선택하였다.
메티오닌 생산을 하기와 같이 분석하였다. 균주를 10 g/ℓ D-글루코스, 2.5 g/ℓ NaCl; 2 g/ℓ 우레아; 10 g/ℓ 박토 펩톤(Bacto Peptone) (디프코); 5 g/ℓ 효모 추출물 (디프코); 5 g/ℓ 소고기 추출물 (디프코); 22 g/ℓ 아가 (디프코)를 함유하고; 20분 동안 약 121℃에서 고압멸균시킨 CM-아가 배지 상에서 2일 동안 30℃에서 성장시켰다.
균주가 성장된 후, 세포를 스크레이핑(scraping)하고, 0.15 M NaCl 중에 재현탁시켰다. 주 배양물에 대해, 스크레이핑된 세포 현탁액을 600 nm의 출발 OD에서 약 1.5 내지 10 ml의 배지 II (하기 참조)에 0.5 g의 고형분 및 고압멸균된 CaCO3(리델 데 헨리)과 함께 첨가하고, 세포를 배플이 없는 100 ml 진탕 플라스크 중에서 72시간 동안 회전식 진탕 플랫폼 상에서 약 200 rpm에서 30℃에서 인큐베이션시켰다. 배지 II는 40 g/ℓ 수크로스; 60 g/ℓ의 당밀로부터의 총 당 (당 함량에 대해 계산된다); 10 g/ℓ (NH4)2SO4; 0.4 g/ℓ MgSO4*7H2O; 0.6 g/ℓ KH2PO4; 0.3 mg/ℓ 티아민*HCl; 1 mg/ℓ 비오틴; 2 mg/ℓ FeSO4; 및 2 mg/ℓ MnSO4를 함유하였다. 배지는 NH4OH로 pH 7.8로 조정하고, 약 121℃에서 약 20분 동안 고압멸균하였다. 고압멸균하고 냉각시킨 후, 비타민 B12 (시아노코발라민) (시그마 케미칼스)를 필터 멸균 원액 (200 ㎍/ml)으로부터 100 ㎍/ℓ의 최종 농도로 첨가하였다.
배지로부터 샘플을 채취하고, 아미노산 함량에 대해 분석하였다. 메티오닌을 비롯한, 생산된 아미노산은 애질런트 1100 시리즈 LC 시스템 HPLC(애질런트) 상에서 애질런트 아미노산 방법을 이용하여 측정하였다. 오르토-프탈알데히드를 사용하는 샘플의 사전-칼럼 유도체화는 하이퍼실 AA-칼럼 (애질런트) 상에서의 분리 후 생산된 아미노산의 정량을 허용하였다.
M690보다 적어도 2배의 메티오닌 역가를 보인 클론을 단리하였다. 추가의 실험에 사용된 상기 하나의 클론을 M1197로 명명하고, 2005년 5월 18일에 DSMZ DSMZ 종균 협회에 균주 번호 DSM17322로서 기탁하였다. 하기 표 4에 요약된 바와 같이, 상기 균주에 의한 아미노산 생산을 균주 M690에 의한 생산과 비교하였다.
균주 M690 및 M1197에 의해 생산된 호모세린, O-아세틸호모세린, 메티오닌 및 리신의 양 | ||||
균주 | 호모세린 (mM) | O-아세틸호모세린 (mM) | 메티오닌 (mM) | 리신 (mM) |
M690 | 41.6 | 0.0 | 0.0 | 77.2 |
M1197 | 26.4 | 1.9 | 0.7 | 79.2 |
균주 M1197을 DNA F (pH399로도 불림, 서열 16)로 형질전환시켜 "캠벨 인" 균주를 수득하고, 이어서 "캠벨드 아웃"시켜 균주 M1494를 수득하였다. 상기 균주는 호모세린 키나제에 대한 유전자 내에 돌연변이를 포함하고, 이는 생성된 호모세린 키나제 효소에서 T190에서 A190으로의 아미노산 변화를 일으킨다 (HskT190A로 불린다). 하기 표 5에 요약된 바와 같이, 균주 M1494에 의한 아미노산 생산을 균주 M1197에 의한 생산과 비교하였다.
균주 M1197 및 M1494에 의해 생산된 호모세린, O-아세틸호모세린, 메티오닌 및 리신의 양 | ||||
균주 | 호모세린 (mM) | O-아세틸호모세린 (mM) | 메티오닌 (mM) | 리신 (mM) |
M1197 | 26.4 | 1.9 | 0.7 | 79.2 |
M1494 | 18.3 | 0.2 | 2.5 | 50.1 |
균주 M1494를 DNA D (pH484로도 불린다) (서열 17)로 형질전환시켜 "캠벨 인" 균주를 수득하고, 이어서 "캠벨드 아웃"시켜 M1990 균주를 수득하였다. M1990 균주는 groES-프로모터 및 EFTU (신장 인자 Tu)-프로모터, 둘 모두를 사용하여 metY 대립유전자를 과다발현한다 (P497P1284 metY로 불린다). P497P1284 프로모터의 서열을 서열 18에 기재한다. 하기 표 6에 요약된 바와 같이, 균주 M1494에 의한 아미노산 생산을 균주 M1990에 의한 생산과 비교하였다.
균주 M1494 및 M1990에 의해 생산된 호모세린, O-아세틸호모세린, 메티오닌 및 리신의 양 | ||||
균주 | 호모세린 (mM) | O-아세틸호모세린 (mM) | 메티오닌 (mM) | 리신 (mM) |
M1494 | 18.3 | 0.2 | 2.5 | 50.1 |
M1990 | 18.2 | 0.3 | 5.6 | 48.9 |
균주 M1990을 DNA E (pH491로도 불린다) (서열 19)로 형질전환시켜 "캠벨 인" 균주를 수득하고, 이어서 상기를 "캠벨드 아웃"시켜 "캠벨 아웃" 균주 M2014를 수득하였다. M2014 균주는 슈퍼옥시드 디스뮤타제 프로모터를 사용하여 metA 대립유전자를 과다발현한다 (P3119 metA로 불린다). P3119 프로모터의 서열을 서열 9에 기재한다. 하기 표 7에 요약된 바와 같이, 균주 M2014에 의한 아미노산 생산을 균주 M1990에 의한 생산과 비교하였다.
균주 M1990 및 M2014에 의해 생산된 호모세린, O-아세틸호모세린, 메티오닌 및 리신의 양 | ||||
균주 | 호모세린 (mM) | O-아세틸호모세린 (mM) | 메티오닌 (mM) | 리신 (mM) |
M1990 | 18.2 | 0.3 | 5.6 | 48.9 |
M2014 | 12.3 | 1.2 | 5.7 | 49.2 |
실험예
2 -
M2014
로부터의
mcbR
의 결실
RXA00655 결실을 포함하는 플라스미드 pH429 (서열 20)를 사용하여 통합 및 절제를 통해 mcbR 결실을 C. 글루타미쿰 내로 도입시켰다 (WO 2004/050694 A1 참조).
플라스미드 pH429를 카나마이신 내성에 대한 선별을 이용하여 M2014 균주 내로 형질전환시켰다 (캠벨 인). sacB 카운터-선별을 이용하여, 아마도 절제에 의해 통합된 플라스미드를 상실한 (캠벨 아웃) 형질전환된 균주의 카나마이신-감수성 유도체를 단리시켰다. 형질전환된 균주는 작은 콜로니와 보다 큰 콜로니를 만든 카나마이신-감수성 유도체들을 생산하였다. 두 크기의 콜로니를 mcbR 결실의 존재를 검출하기 위해 PCR에 의해 스크리닝하였다. 보다 큰 콜로니는 결실을 포함하지 않은 반면, 보다 작은 콜로니의 60-70%는 예상된 mcbR 결실을 포함하였다.
원래의 단리물을 단일 콜로니를 위해 BHI 플레이트 상에 스트리킹할 때, 조그맣고 작은 콜로니의 혼합물이 나타났다. 조그마한 콜로니를 BHI 상에 재스트리킹할 때, 다시 한번 조그맣고 작은 콜로니의 혼합물이 나타났다. 작은 콜로니를 BHI 상에 재스트리킹할 때, 콜로니 크기는 대체로 작고 균일하였다. 2개의 작은 단일 콜로니 단리물 (OM403-4 및 OM403-8로 부름)을 추가 연구를 위해 선별하였다.
진탕 플라스크 실험 (표 8)은 OM403-8이 모체 M2014에 비해 적어도 2배 양의 메티오닌을 생산하였음을 보여주었다. 상기 균주는 또한 M2014에 비해 1/5 미만 양의 리신을 생산하였고, 이는 아스파테이트 세미알데히드로 부터 호모세린을 향한 탄소 유동의 우회를 제안한다. 세번째 두드러진 차이는 M2014에 비해 OM403에 의한 이소류신의 축적에서 10배 초과의 증가였다. 배양물을 48시간 동안 표준 당밀 배지 중에서 성장시켰다.
또한, 표 9에 제시된 바와 같이, M2014에 비해 OM403에 의한 O-아세틸호모세린의 축적에서 15배 초과의 감소가 있었다. 상기 결과에 대해 가장 가능성이 있는 설명은 M2014 내에 축적되는 대부분의 O-아세틸호모세린이 OM403 내에서 메티오닌, 호모시스테인 및 이소류신으로 전환된다는 것이다. 배양물을 48시간 동안 표준 당밀 배지 중에서 성장시켰다.
실험예
3 -
metQ
발현 감소
OM403-8 중에서 메티오닌의 유입을 감소시키기 위해, metQ 유전자의 프로모터 및 5' 부분을 결실시켰다. metQ 유전자는 복합체가 기능하기 위해 요구되는 메티오닌 유입 복합체의 서브유닛을 코딩한다. 이는 플라스미드 pH449 (서열 21)를 사용하여 표준 캠벨링 인 및 캠벨링 아웃 기법을 이용하여 달성하였다. OM403-8 및 OM456-2를 진탕 플라스크 분석에서 메티오닌 생산에 대해 분석하였다. 결과 (표 10)는 OM456-2가 OM403-8보다 더 많은 메티오닌을 생산하였음을 보여준다. 배양물을 48시간 동안 표준 당밀 배지 중에서 성장시켰다.
실험예
4 -
OM469
의
작제
OM456-2에서 metF 프로모터를 파지 람다 PR 프로모터로 치환함으로써 metQ 결실과 metF 과다발현, 둘 모두를 포함하는, OM469로서 지칭되는 균주를 작제하였다. 이는 플라스미드 pOM427 (서열 22)을 사용하여 표준 캠벨링 인 및 캠벨링 아웃 기법을 이용하여 달성하였다. OM469의 4개의 단리물을 진탕 플라스크 배양 분석에서 메티오닌 생산에 대해 분석하였고, 여기서 표 11에 제시된 바와 같이, 이들은 모두 OM456-2보다 더 많은 메티오닌을 생산하였다. 배양물을 48시간 동안 2 mM 트레오닌을 함유하는 표준 당밀 배지 중에서 성장시켰다.
실험예
5 -
M2543
작제
균주 OM469-2를, 서열 23에 도시한 플라스미드 pCLIK5A int sacB PSOD TKT로 전기천공하여 형질전환시켰다 (도 1a)). 이는 표준 캠벨링 인 및 캠벨링 아웃 기법을 이용하여 달성하였다.
표지된 M2543인, OM469 PSOD TKT의 단리물을 진탕 플라스크 배양 분석에서 메티오닌 생산에 대해 분석하였고, 여기서 이들은 OM469-2보다 더 많은 메티오닌을 생산하였다. 균주 M2543의 결과는 표 12에 제시되어 있다.
실험예 6 - OM513 , OM589 , OM590 , OM597 및 OM598 의 작제
균주 OM469를, 단백질 metX, metY 및 metF의 발현을 증가시키는 복제 플라스미드 pOM474 (서열 24)로 전기천공하여 형질전환시켰다. 생성된 균주를 OM513으로 명시하였다.
이어서, btu2 오페론 프로모터 대신 λPL 프로모터를 포함하는 C. 글루타미쿰 균주를 작제할 수 있도록 2개의 통합 플라스미드인 pOM511 (서열 25) 및 pOM512 (서열 26)를 작제하였다. 플라스미드 pOM511를 사용하여, 단지 λPL 프로모터 치환만을 포함하는 OM469의 유도체인 균주 OM589를 작제하였다. 플라스미드 pOM512를 사용하여 유사하게 Δ btuR2와 λPL 프로모터 치환, 둘 모두를 포함하는 OM469의 유도체인 균주 OM590을 작제하였다.
표준 캠벨링 인 및 캠벨링 아웃 기법을 이용하여 상기 언급한 플라스미드 pOM511 및 pOM512를 OM469로 형질전환시켜 균주를 수득하였다.
이어서, 상기 언급한 복제 플라스미드 pOM474를 OM589 및 OM590으로 형질전환시켜 OM597 및 OM598을 각각 수득하였다.
btu2 오페론 발현에 영향을 미치는 것으로 추정되는 변형의 효과를 평가하는 한가지 접근법은 저하된 비타민 B12 농도가 진탕 플라스크 배양물 중의 균주의 성장과 메티오닌 생산에 미치는 효과를 조사하는 것이다. 천연 비타민 B12 흡수 시스템의 발현을 억제시키는데 필요한 농도보다 차선의 농도가 더 크다면, 비타민 B12 유입의 탈조절로 균주는 차선이 농도에서 더욱 효율적으로 비타민 B12를 축적시킬 수 있어야 한다. 상기 기술된 바와 같이 btu2 오페론 변형을 갖는 균주를 진탕 플라스크 분석에서 4개의 상이한 비타민 B12 농도에서 평가하였다. 표 13에 도시한 결과는, 100 ㎍/ℓ 농도의 저하된 비타민 B12에 대한 그들의 반응에 있어 균주가 현저한 차이를 보였다는 것을 시사한다. 상기 비타민 B12 농도에서, λPL 프로모터 변형을 포함하는 2개의 균주 (OM597 및 OM598)는 이러한 변형을 포함하지 않는 2개의 균주보다도 더 많은 글루코스를 이용할 수 있고, 더 많은 메티오닌을 생산할 수 있었다.
추가로, 2개의 균주, 즉, OM597과 OM598을 발효기 중 1 mg/ℓ의 비타민 B12 농도에서 비교하였다. ΔbtuR2 결실을 포함하는 균주가 2개의 균주 중에서 가장 높은 메티오닌 역가를 제시하였다 (36시간째 23 g/ℓ 대 20 g/ℓ).
실험예 7 -
OM599
의
작제
OM469로부터 btuR2를 결실시켜 OM542로서 지칭되는 균주를 수득하였다. 이를 위해서 OM469로 전기천공시킨 후, 캠벨드 인 및 캠벨드 아웃시켜 플라스미드 pOM495 (서열 27)를 형질전환시킴으로써 균주 OM542를 수득하였다. pOM474을 사용하여 OM542를 형질전환시킴으로써 균주 OM462를 수득하였다.
추가로, 플라스미드 pOM513을 전기천공시키고, OM542를 캠벨드 인 및 캠벨드 아웃시켜 균주 OM592를 수득하였는데, 이는 tkt 유전자 및 하류 유전자를 유도하는 PSOD 프로모터를 포함하였다. 최종적으로, OM592를 복제 플라스미드, pOM474로 형질전환시켜 균주 OM599를 수득하였다.
이어서, 균주 OM562와 OM599를, 10 mg/ℓ 비타민 B12를 함유하는 표준 당밀 배지를 이용하여 진탕 플라스크 중에서 그들의 메티오닌 생산에 관해 비교하였다. 대조군은 pOM474로 형질전환된 OM469인 OM513이었다. OM562가 OM513보다 약간 더 많은 메티오닌을 생산하였고, M599가 OM562보다 더 많이 생산하였다 (하기 표 14 참조).
표 14를 통해 알 수 있는 바와 같이, btuR2 결실을 통해 비타민 B12 축적은 개선된다.
실험예
8 -
OM566
작제
M2543으로부터 btuR2를 결실시켜 OM566으로서 지칭되는 균주를 수득하였다. 이를 위해서 M2543으로 전기천공시킨 후, 캠벨드 인 및 캠벨드 아웃시켜 플라스미드 pOM495 (서열 27)를 형질전환시킴으로써 균주 OM566을 수득하였다.
비타민 B12 비타머 흡수를 측정하기 위해 시아노코발라민 1 mg/ℓ이 첨가된 BHI 배지 또는 첨가되지 않은 BHI 배지 중에서 세포를 성장시켰다. 밤새도록 성장시킨 후, 원심분리하여 세포를 수거하고, 염수 용액 (0.85% NaCl)을 사용하여 2회에 걸쳐 세척하였다. 제조사인 하이베이드(Hybaid)에 의해 기술된 바와 같이 리보라이저(Ribolyzer) 방법을 사용하여 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 원심분리하고, 비타민 B12 ELISA에 의해 분석하기 위해 상등액을 희석시켰다. R-바이오팜(R-Biopharm) (독일)로부터 입수한 비타민 B12 ELISA 키트는 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.
표준 및 세포 용해물 샘플을 제조사에 따라 완충액 중에 희석시켰다. C. 글루타미쿰으로부터 유래된 샘플 ELISA에서 1:100 내지 1:800으로 희석시켰다. ELISA의 선형 반응 곡선으로부터 얻은 값을 채택하여, 함유되어 있는 B12 비타머 농도를 결정하였다. 250 mg/ml의 단백질 농도를 C. 글루타미쿰 세포질의 일반적인 세포내 단백질 농도값으로 간주하였다. 상기 값 및 용해물의 단백질 농도로부터 세포 용해 이후 샘플 희석액의 값을 결정하였다. 일반적으로, B12 측정에 대한 오차값은 상이한 실험들로부터 대략적으로 10%인 것으로 밝혀졌다.
시아노코발라민이 하이드록스코발라민으로 전환되는 바, 세포 내부의 B12 비타머 값이 세포내 하이드록스코발라민 농도를 반영한다.
비타민 B12를 1 mg/ℓ의 농도로 배지에 첨가하였을 때, 균주 M2543에서는 세포중 하이드록스코발라민이 3 μM으로부터 198 μM으로 크게 증가한 것으로 나타났다는 것이 밝혀졌다.
비타민 B12를 BHI 배지에 첨가하지 않은 경우, btuR2가 결실되어 있는 M2543인 균주 OM566에서는 하이드록스코발라민 농도가 40배 증가 (124 μM)한 것으로 밝혀졌다. B12를 첨가하였을 때, 하이드록스코발라민 농도는 추가로 OM566에서 183 μM로 증가하였다 (도 1도 참조). 본 결과는 btuR2의 결실이 기능적으로 C. 글루타미쿰 균주의 B12 흡수 시스템을 유도한다는 것을 보여준다.
하기 공개문헌은 본 발명과 관련하여 참작한다:
SEQUENCE LISTING
<110> BASF SE
<120> Microorganisms with Deregulated Vitamin B12 System
<130> B 8695 / DB
<160> 27
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 444
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
atgaacgtac agtttgaatc agacatggcc gtccaaccag gaaacaccat ggaagctacc 60
gtcaccgaca ttcgtgatgc caagcgtaaa acaacccagc ttgattcagt aacgccgttt 120
aagaagaatt gcccgagccg caccttgctc gacaccatca gtgacaagtg ggcggtgctg 180
atcctgctca gcatggaaaa tggtccacag cgcaatggtg aaatcaaaga tcaggtccaa 240
ggaattaccc caaagatgct cacccagcgt cttggagtgt tggtggaaga cggactggtc 300
actcgcacct cccacgcagt tgtgccgcct cgtgtggatt atcagctcac cgatctgggt 360
gcttctgtca ttgagccttg ccgtgcgatg tattcctggg cagtggagaa cattaagcaa 420
gtggaggcct accgctcagc ataa 444
<210> 2
<211> 147
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
Met Asn Val Gln Phe Glu Ser Asp Met Ala Val Gln Pro Gly Asn Thr
1 5 10 15
Met Glu Ala Thr Val Thr Asp Ile Arg Asp Ala Lys Arg Lys Thr Thr
20 25 30
Gln Leu Asp Ser Val Thr Pro Phe Lys Lys Asn Cys Pro Ser Arg Thr
35 40 45
Leu Leu Asp Thr Ile Ser Asp Lys Trp Ala Val Leu Ile Leu Leu Ser
50 55 60
Met Glu Asn Gly Pro Gln Arg Asn Gly Glu Ile Lys Asp Gln Val Gln
65 70 75 80
Gly Ile Thr Pro Lys Met Leu Thr Gln Arg Leu Gly Val Leu Val Glu
85 90 95
Asp Gly Leu Val Thr Arg Thr Ser His Ala Val Val Pro Pro Arg Val
100 105 110
Asp Tyr Gln Leu Thr Asp Leu Gly Ala Ser Val Ile Glu Pro Cys Arg
115 120 125
Ala Met Tyr Ser Trp Ala Val Glu Asn Ile Lys Gln Val Glu Ala Tyr
130 135 140
Arg Ser Ala
145
<210> 3
<211> 990
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
atggtttcaa ccacaacatc tcgctcaatc gctggactgt cagtgcttgt ggcaacagca 60
ctaatcgctg gctgtagttc cgcagaggat gggacggttg actcggggag cagcacagag 120
gtcaccacaa cccaaagcaa ggaaggtttt cctgtcaccg tcacgtttgc cccagaagca 180
cctgtgacca ttgaggatca accagagcgc atcgtcagtt tgtccccagc gattacagaa 240
accttgttcg ctgtcggggc aggggatcat gtcgtcgcag tggatgaata ctcaaactac 300
ccagaggacg caccgctggt gcagggtctg tctggtttta ctcccaatgt ggagtccatc 360
ttggattacg atcctgacct ggtcgtgttg atgtctgcag atgattccat tttgaccggc 420
ctggatgctg caggagtgga tactttagtg atccccgcag cagagaactt ggatgagacc 480
tactcccaga ttgaacaagt aggtcgagcc accggatttg aagatcaagc aacaacggtt 540
gttgatcaga tgaaaaccgc cattgatgct gcagttgcca cagttcctga agaggtaaaa 600
gagcagggct taacctactt ccacgagctg ggcagtgatt tgttcactgt gtcagagcaa 660
acctacatcg gtcagattta cgacatgttt ggtctcacct ctattgctga cggtggcgac 720
gcttactcgc agctatccaa cgaagcaatc attgcggcaa accctgatct gattttcctc 780
agcgatgcca aggccgaaaa cctcactgca gaagatattg cggcgcgtcc aggctgggac 840
accattgatg cagtagccaa tggacgtatc tacattttgg acgatgatat tgcttccagg 900
tggggacctc gcgtatccca gctggtggaa gaaatcgcag cgcagttgaa tcagcttgct 960
tcttctgaag ctgtgccggc cgctgcttaa 990
<210> 4
<211> 329
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 4
Met Val Ser Thr Thr Thr Ser Arg Ser Ile Ala Gly Leu Ser Val Leu
1 5 10 15
Val Ala Thr Ala Leu Ile Ala Gly Cys Ser Ser Ala Glu Asp Gly Thr
20 25 30
Val Asp Ser Gly Ser Ser Thr Glu Val Thr Thr Thr Gln Ser Lys Glu
35 40 45
Gly Phe Pro Val Thr Val Thr Phe Ala Pro Glu Ala Pro Val Thr Ile
50 55 60
Glu Asp Gln Pro Glu Arg Ile Val Ser Leu Ser Pro Ala Ile Thr Glu
65 70 75 80
Thr Leu Phe Ala Val Gly Ala Gly Asp His Val Val Ala Val Asp Glu
85 90 95
Tyr Ser Asn Tyr Pro Glu Asp Ala Pro Leu Val Gln Gly Leu Ser Gly
100 105 110
Phe Thr Pro Asn Val Glu Ser Ile Leu Asp Tyr Asp Pro Asp Leu Val
115 120 125
Val Leu Met Ser Ala Asp Asp Ser Ile Leu Thr Gly Leu Asp Ala Ala
130 135 140
Gly Val Asp Thr Leu Val Ile Pro Ala Ala Glu Asn Leu Asp Glu Thr
145 150 155 160
Tyr Ser Gln Ile Glu Gln Val Gly Arg Ala Thr Gly Phe Glu Asp Gln
165 170 175
Ala Thr Thr Val Val Asp Gln Met Lys Thr Ala Ile Asp Ala Ala Val
180 185 190
Ala Thr Leu Pro Glu Glu Val Lys Glu Gln Gly Leu Thr Tyr Phe His
195 200 205
Glu Leu Gly Ser Asp Leu Phe Thr Val Ser Glu Gln Thr Tyr Ile Gly
210 215 220
Gln Ile Tyr Asp Met Phe Gly Leu Thr Ser Ile Ala Asp Gly Gly Asp
225 230 235 240
Ala Tyr Ser Gln Leu Ser Asn Glu Ala Ile Ile Ala Ala Asn Pro Asp
245 250 255
Leu Ile Phe Leu Ser Asp Ala Lys Ala Glu Asn Leu Thr Ala Glu Asp
260 265 270
Ile Ala Ala Arg Pro Gly Trp Asp Thr Ile Asp Ala Val Ala Asn Gly
275 280 285
Arg Ile Tyr Ile Leu Asp Asp Asp Ile Ala Ser Arg Trp Gly Pro Arg
290 295 300
Val Ser Gln Leu Val Glu Glu Ile Ala Ala Gln Leu Asn Gln Leu Ala
305 310 315 320
Ser Ser Glu Ala Val Pro Ala Ala Ala
325
<210> 5
<211> 1041
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 5
gtgctgaaga gaattttcct caacccctgg gtggctaccg cgttgtcggt agtcattttg 60
gggtttgtgg tgctgttttc aggttttagc ggtgttattg atttaagccc cacagcagtg 120
attagacatt tgagtgggca ggacacgctc acccctcgag atcaggccat cttctttgat 180
atccggctgc ctcgaattat cgctggtgtc attgtcggag caacgctggc tatttctggt 240
gcttcttacc aagcggtatt tagaaacccg ctggctgatc cttatttgtt gggtgtgtcc 300
gcaggttctg gccttggtgt cacggcagtg attgttggcg gtaccgtgct gggattttct 360
gcaccgagca tcggcgtgat tggtgcagca tttgtaggtg gtgttgccgc agtacttgcc 420
acgctgatgg tgagtcgggg agtaggacag ggatcatcaa ccaccgtggt tattttggcg 480
ggcgtggcgg ttgctgcttt tgccagttcc atccagacct atattcagca acgacacatc 540
gatacggtgg cgcgcgtata tgtgtggatg ttgggcaacc tcaatgtcac caactggatg 600
tcgatcttca tcgtggctgt ggtggcggga ctatgcgcgg ccgtgatcat gtcctgcgcc 660
aggttgttag acgtgatggc tgttggtgat gtggaagccc gcacattggg cgtcgatcca 720
ggcctcgtac gcattggcat tgtcatcgtg gcaacccttg gtacagctgc agtggtatcc 780
atttccggtc tcatcgggtt tgtgggcatc attgttccgc acgccctgcg cctaattgtt 840
ggcccggggc atcggatttt actgccactg tctttcgtat ggggtgccat tttcctcgtg 900
ttggcagata ccgcagggcg aacattgatg gctcctcagg aacttcccgt gggtgtggtg 960
acagctgcac tcggcgcacc gttcttctta tttattttgc gcagaaccag cagacaacga 1020
gttccaaaaa ggagtgctta a 1041
<210> 6
<211> 346
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 6
Met Leu Lys Arg Ile Phe Leu Asn Pro Trp Val Ala Thr Ala Leu Ser
1 5 10 15
Val Val Ile Leu Gly Phe Val Val Leu Phe Ser Gly Phe Ser Gly Val
20 25 30
Ile Asp Leu Ser Pro Thr Ala Val Ile Arg His Leu Ser Gly Gln Asp
35 40 45
Thr Leu Thr Pro Arg Asp Gln Ala Ile Phe Phe Asp Ile Arg Leu Pro
50 55 60
Arg Ile Ile Ala Gly Val Ile Val Gly Ala Thr Leu Ala Ile Ser Gly
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Gln Ala Val Phe Arg Asn Pro Leu Ala Asp Pro Tyr Leu
85 90 95
Leu Gly Val Ser Ala Gly Ser Gly Leu Gly Val Thr Ala Val Ile Val
100 105 110
Gly Gly Thr Val Leu Gly Phe Ser Ala Pro Ser Ile Gly Val Ile Gly
115 120 125
Ala Ala Phe Val Gly Gly Val Ala Ala Val Leu Ala Thr Leu Met Val
130 135 140
Ser Arg Gly Val Gly Gln Gly Ser Ser Thr Thr Val Val Ile Leu Ala
145 150 155 160
Gly Val Ala Val Ala Ala Phe Ala Ser Ser Ile Gln Thr Tyr Ile Gln
165 170 175
Gln Arg His Ile Asp Thr Val Ala Arg Val Tyr Val Trp Met Leu Gly
180 185 190
Asn Leu Asn Val Thr Asn Trp Met Ser Ile Phe Ile Val Ala Val Val
195 200 205
Ala Gly Leu Cys Ala Ala Val Ile Met Ser Cys Ala Arg Leu Leu Asp
210 215 220
Val Met Ala Val Gly Asp Val Glu Ala Arg Thr Leu Gly Val Asp Pro
225 230 235 240
Gly Leu Val Arg Ile Gly Ile Val Ile Val Ala Thr Leu Gly Thr Ala
245 250 255
Ala Val Val Ser Ile Ser Gly Leu Ile Gly Phe Val Gly Ile Ile Val
260 265 270
Pro His Ala Leu Arg Leu Ile Val Gly Pro Gly His Arg Ile Leu Leu
275 280 285
Pro Leu Ser Phe Val Trp Gly Ala Ile Phe Leu Val Leu Ala Asp Thr
290 295 300
Ala Gly Arg Thr Leu Met Ala Pro Gln Glu Leu Pro Val Gly Val Val
305 310 315 320
Thr Ala Ala Leu Gly Ala Pro Phe Phe Leu Phe Ile Leu Arg Arg Thr
325 330 335
Ser Arg Gln Arg Val Pro Lys Arg Ser Ala
340 345
<210> 7
<211> 801
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 7
gtggcgatca ttgaatgcga agacatcacg gttcgccacc cacatgcgcc cacacctgcg 60
gtttctgggt tgagcacctt tgtagaacaa ggggaatggc ttaatatcgt aggtcccaac 120
ggctgcggaa agagtacgtt gctgcacgct tttgctcagg tactgtcact ggaatcggga 180
aggctgaaaa tgggggaggg ggacgtcgaa aagcattttg cttttggtct taaagctgcg 240
aagcagcgtc gctttttcgc gcgtaccgtg gccctcatgc cacagaatcc tactattcct 300
gcaggtctga gcgtttttga ttatgtgctg ctggggcgtc atccgcacag ttacgcgccg 360
gggcgtgctg atgatgagat cgtgaagcgg tgcctcgctg atctgaaatt ggagcatttc 420
agcgaccgcg gcttagacga attgtccggc ggcgagcgtc aacgcgtcag ccttgcccgc 480
gcgctcgccc aagaaccgcg catcgtgctt ctcgacgagc cgacctccgc gcttgacatc 540
ggccatgcgc aggaaacgct tgagcttatc gacgccatcc ggcaccgact cggcctcacc 600
gtgatcgcgg cgatgcatga cctcaccctg actgcgcaat acggcgatcg ggtgctcatg 660
atgaatggtg gccgcaaagt tttcgagggc actgcagccg aagtgctcac cgcgcagcgg 720
atttcggaga tttatgatgc cactgtgatt gttgaggtta ttgatgggcg tcccgtggtg 780
attccgcagc ggtcgcactg a 801
<210> 8
<211> 266
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 8
Met Ala Ile Ile Glu Cys Glu Asp Ile Thr Val Arg His Pro His Ala
1 5 10 15
Pro Thr Pro Ala Val Ser Gly Leu Ser Thr Phe Val Glu Gln Gly Glu
20 25 30
Trp Leu Asn Ile Val Gly Pro Asn Gly Cys Gly Lys Ser Thr Leu Leu
35 40 45
His Ala Phe Ala Gln Val Leu Ser Leu Glu Ser Gly Arg Leu Lys Met
50 55 60
Gly Glu Gly Asp Val Glu Lys His Phe Ala Phe Gly Leu Lys Ala Ala
65 70 75 80
Lys Gln Arg Arg Phe Phe Ala Arg Thr Val Ala Leu Met Pro Gln Asn
85 90 95
Pro Thr Ile Pro Ala Gly Leu Ser Val Phe Asp Tyr Val Leu Leu Gly
100 105 110
Arg His Pro His Ser Tyr Ala Pro Gly Arg Ala Asp Asp Glu Ile Val
115 120 125
Lys Arg Cys Leu Ala Asp Leu Lys Leu Glu His Phe Ser Asp Arg Gly
130 135 140
Leu Asp Glu Leu Ser Gly Gly Glu Arg Gln Arg Val Ser Leu Ala Arg
145 150 155 160
Ala Leu Ala Gln Glu Pro Arg Ile Val Leu Leu Asp Glu Pro Thr Ser
165 170 175
Ala Leu Asp Ile Gly His Ala Gln Glu Thr Leu Glu Leu Ile Asp Ala
180 185 190
Ile Arg His Arg Leu Gly Leu Thr Val Ile Ala Ala Met His Asp Leu
195 200 205
Thr Leu Thr Ala Gln Tyr Gly Asp Arg Val Leu Met Met Asn Gly Gly
210 215 220
Arg Lys Val Phe Glu Gly Thr Ala Ala Glu Val Leu Thr Ala Gln Arg
225 230 235 240
Ile Ser Glu Ile Tyr Asp Ala Thr Val Ile Val Glu Val Ile Asp Gly
245 250 255
Arg Pro Val Val Ile Pro Gln Arg Ser His
260 265
<210> 9
<211> 192
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Promoter: PSOD
<400> 9
gagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60
ttcgttgcaa tatcaacaaa aaggcctatc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120
gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180
gattttttac cc 192
<210> 10
<211> 184
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Promoter: PgroES
<400> 10
ggtcgagcgg cttaaagttt ggctgccatg tgaattttta gcaccctcaa cagttgagtg 60
ctggcactct cgggggtaga gtgccaaata ggttgtttga cacacagttg ttcacccgcg 120
acgacggctg tgctggaaac ccacaaccgg cacacacaaa atttttctca tggagggatt 180
catc 184
<210> 11
<211> 199
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Promoter: P EFTu
<400> 11
ggccgttacc ctgcgaatgt ccacagggta gctggtagtt tgaaaatcaa cgccgttgcc 60
cttaggattc agtaactggc acattttgta atgcgctaga tctgtgtgct cagtcttcca 120
ggctgcttat cacagtgaaa gcaaaaccaa ttcgtggctg cgaaagtcgt agccaccacg 180
aagtccagga ggacataca 199
<210> 12
<211> 114
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Promoter: lambdaPL
<400> 12
gtcgactcat acgttaaatc tatcaccgca agggataaat atctaacacc gtgcgtgttg 60
actattttac ctctggcggt gataatggtt gcatgtacta aggaggatta atta 114
<210> 13
<211> 7070
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Plasmid: pH273
<400> 13
tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttgg agaatcatga 60
cctcagcatc tgccccaagc tttaaccccg gcaagggtcc cggctcagca gtcggaattg 120
cccttttagg attcggaaca gtcggcactg aggtgatgcg tctgatgacc gagtacggtg 180
atgaacttgc gcaccgcatt ggtggcccac tggaggttcg tggcattgct gtttctgata 240
tctcaaagcc acgtgaaggc gttgcacctg agctgctcac tgaggacgct tttgcactca 300
tcgagcgcga ggatgttgac atcgtcgttg aggttatcgg cggcattgag tacccacgtg 360
aggtagttct cgcagctctg aaggccggca agtctgttgt taccgccaat aaggctcttg 420
ttgcagctca ctctgctgag cttgctgatg cagcggaagc cgcaaacgtt gacctgtact 480
tcgaggctgc tgttgcaggc gcaattccag tggttggccc actgcgtcgc tccctggctg 540
gcgatcagat ccagtctgtg atgggcatcg ttaacggcac caccaacttc atcttggacg 600
ccatggattc caccggcgct gactatgcag attctttggc tgaggcaact cgtttgggtt 660
acgccgaagc tgatccaact gcagacgtcg aaggccatga cgccgcatcc aaggctgcaa 720
ttttggcatc catcgctttc cacacccgtg ttaccgcgga tgatgtgtac tgcgaaggta 780
tcagcaacat cagcgctgcc gacattgagg cagcacagca ggcaggccac accatcaagt 840
tgttggccat ctgtgagaag ttcaccaaca aggaaggaaa gtcggctatt tctgctcgcg 900
tgcacccgac tctattacct gtgtcccacc cactggcgtc ggtaaacaag tcctttaatg 960
caatctttgt tgaagcagaa gcagctggtc gcctgatgtt ctacggaaac ggtgcaggtg 1020
gcgcgccaac cgcgtctgct gtgcttggcg acgtcgttgg tgccgcacga aacaaggtgc 1080
acggtggccg tgctccaggt gagtccacct acgctaacct gccgatcgct gatttcggtg 1140
agaccaccac tcgttaccac ctcgacatgg atgtggaaga tcgcgtgggg gttttggctg 1200
aattggctag cctgttctct gagcaaggaa tcttcctgcg tacaatccga caggaagagc 1260
gcgatgatga tgcacgtctg atcgtggtca cccactctgc gctggaatct gatctttccc 1320
gcaccgttga actgctgaag gctaagcctg ttgttaaggc aatcaacagt gtgatccgcc 1380
tcgaaaggga ctaattttac tgacatggca attgaactga acgtcggtcg taaggttacc 1440
gtcacggtac ctggatcttc tgcaaacctc ggacctggct ttgacacttt aggtttggca 1500
ctgtcggtat acgacactgt cgaagtggaa attattccat ctggcttgga agtggaagtt 1560
tttggcgaag gccaaggcga agtccctctt gatggctccc acctggtggt taaagctatt 1620
cgtgctggcc tgaaggcagc tgacgctgaa gttcctggat tgcgagtggt gtgccacaac 1680
aacattccgc agtctcgtgg tcttggctcc tctgctgcag cggcggttgc tggtgttgct 1740
gcagctaatg gtttggcgga tttcccgctg actcaagagc agattgttca gttgtcctct 1800
gcctttgaag gccacccaga taatgctgcg gcttctgtgc tgggtggagc agtggtgtcg 1860
tggacaaatc tgtctatcga cggcaagagc cagccacagt atgctgctgt accacttgag 1920
gtgcaggaca atattcgtgc gactgcgctg gttcctaatt tccacgcatc caccgaagct 1980
gtgcgccgag tccttcccac tgaagtcact cacatcgatg cgcgatttaa cgtgtcccgc 2040
gttgcagtga tgatcgttgc gttgcagcag cgtcctgatt tgctgtggga gggtactcgt 2100
gaccgtctgc accagcctta tcgtgcagaa gtgttgccta ttacctctga gtgggtaaac 2160
cgcctgcgca accgtggcta cgcggcatac ctttccggtg ccggcccaac cgccatggtg 2220
ctgtccactg agccaattcc agacaaggtt ttggaagatg ctcgtgagtc tggcattaag 2280
gtgcttgagc ttgaggttgc gggaccagtc aaggttgaag ttaaccaacc ttaggcccaa 2340
caaggaaggc ccccttcgaa tcaagaaggg ggccttatta gtgcagcaat tattcgctga 2400
acacgtgaac cttacaggtg cccggcgcgt tgagtggttt gagttccagc tggatgcggt 2460
tgttttcacc gaggctttct tggatgaatc cggcgtggat ggcgcagacg aaggctgatg 2520
ggcgtttgtc gttgaccaca aatgggcagc tgtgtagagc gagggagttt gcttcttcgg 2580
tttcggtggg gtcaaagccc atttcgcgga ggcggttaat gagcggggag agggcttcgt 2640
cgagttcttc ggcttcggcg tggttaatgc ccatgacgtg tgcccactgg gttccgatgg 2700
aaagtgcttt ggcgcggagg tcggggttgt gcattgcgtc atcgtcgaca tcgccgagca 2760
tgttggccat gagttcgatc agggtgatgt attctttggc gacagcgcgg ttgtcgggga 2820
cgcgtgtttg gaagatgagg gaggggcggg atcctctaga cccgggattt aaatcgctag 2880
cgggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc 2940
ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc 3000
aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta tggacagcaa 3060
gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa 3120
actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag 3180
agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg 3240
ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg 3300
atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc 3360
tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga 3420
cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc 3480
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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tcgagctctc caatctccac tgaggtactt aatccttccg gggaattcgg gcgcttaaat 60
cgagaaatta ggccatcacc ttttaataac aatacaatga ataattggaa taggtcgaca 120
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cccattaggc gattgggtga gcaccgatgg aggactgaac tatgcctctg agctcatcga 4440
tcttattaag tccactcctg agttccggga attcgacctc ggtatcgcct ccttccccga 4500
agggcatttc cgggcgaaaa ctctagaaga agacaccaaa tacactctgg cgaagctgcg 4560
tggaggggca gagtactcca tcacgcagat gttctttgat gtggaagact acctgcgact 4620
tcgtgatcgc cttgtcgctg cagaccccat tcatggtgcg aagccaatca ttcctggcat 4680
catgcccatt acgagcctgc ggtctgtgcg tcgacaggtc gaactctctg gtgctcaatt 4740
gccgagccaa ctagaagaat cacttgttcg agctgcaaac ggcaatgaag aagcgaacaa 4800
agacgagatc cgcaaggtgg gcattgaata ttccaccaat atggcagagc gactcattgc 4860
cgaaggtgcg gaagatctgc acttcatgac gcttaacttc acccgtgcaa cccaagaagt 4920
gttgtacaac cttggcatgg cgcctgcttg gggagcagag cacggccaag acgcggtgcg 4980
ttaaggatcc tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga 5040
acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc 5100
tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc 5160
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cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc 5340
cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt 5400
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ccaaggatct gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt 5760
cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta 5820
ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg 5880
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gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg 6060
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gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa 6360
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gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc 6480
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cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca 6600
acctgccatc acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa 6660
tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct 6720
tcgcccacgc tagcggcgcg ccacgggtgc gcatgatcgt gctcctgtcg ttgaggaccc 6780
ggctaggctg gcggggttgc cttactggtt agcagaatga atcaccgata cgcgagcgaa 6840
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gtttccgtgt ttcgtaaagt ctggaaacgc ggaagtcagc gccctgcacc attatgttcc 6960
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agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc tctggtcccg ccgcatccat accgccagtt 7080
gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg catgttcatc atcagtaacc cgtatcgtga 7140
gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta cccccatgaa cagaaatccc ccttacacgg 7200
aggcatcagt gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat ggcccgcttt atcagaagcc 7260
agacattaac gcttctggag aaactcaacg agctggacgc ggatgaacag gcagacatct 7320
gtgaatcgct tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag ctgcctcgcg cgtttcggtg 7380
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cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 8520
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cacagtagtg gaggatgcaa tcagttgcgc ctactgcggt ggcctgattc ctccccggcc 8940
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cgagcgcgcc aacaaacgcc acgccgagga gctggaggcg gctaggtcgc aaatggcgct 9060
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tcgcgtggat cgcctagctg atcttatgga ggttgctcgc atgatctcag gcacagaaaa 10080
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cagcggccgc 11230
<210> 25
<211> 9050
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Plasmid: pOM511
<400> 25
ggccgctcga tttaaatctc gagctctgga gtgcgacagg tttgatgata aaaaattagc 60
gcaagaagac aaaaatcacc ttgcgctaat gctctgttac aggtcactaa taccatctaa 120
gtagttgatt catagtgact gcatatgtaa gtatttcctt agataacaat tgattgaatg 180
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gaatgtgtaa gagcggggtt atttatgctg ttgttttttt gttactcggg aagggcttta 300
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agaagatttt cagcctgata cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga 3660
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aggatctgat ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc 3420
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 3480
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 3540
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 3600
caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 3660
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 3720
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 3780
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 3840
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 3900
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 3960
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 4020
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 4080
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 4140
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 4200
gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc 4260
tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg 4320
ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg 4380
cccacgctag cggcgcgcca cgggtgcgca tgatcgtgct cctgtcgttg aggacccggc 4440
taggctggcg gggttgcctt actggttagc agaatgaatc accgatacgc gagcgaacgt 4500
gaagcgactg ctgctgcaaa acgtctgcga cctgagcaac aacatgaatg gtcttcggtt 4560
tccgtgtttc gtaaagtctg gaaacgcgga agtcagcgcc ctgcaccatt atgttccgga 4620
tctgcatcgc aggatgctgc tggctaccct gtggaacacc tacatctgta ttaacgaagc 4680
gctggcattg accctgagtg atttttctct ggtcccgccg catccatacc gccagttgtt 4740
taccctcaca acgttccagt aaccgggcat gttcatcatc agtaacccgt atcgtgagca 4800
tcctctctcg tttcatcggt atcattaccc ccatgaacag aaatccccct tacacggagg 4860
catcagtgac caaacaggaa aaaaccgccc ttaacatggc ccgctttatc agaagccaga 4920
cattaacgct tctggagaaa ctcaacgagc tggacgcgga tgaacaggca gacatctgtg 4980
aatcgcttca cgaccacgct gatgagcttt accgcagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg 5040
acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg 5100
atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg 5160
cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc 5220
agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag 5280
gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 5340
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 5400
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 5460
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 5520
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 5580
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 5640
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 5700
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 5760
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 5820
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 5880
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 5940
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 6000
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 6060
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 6120
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 6180
tttaaaggcc ggccgcggcc gccatcggca ttttcttttg cgtttttatt tgttaactgt 6240
taattgtcct tgttcaagga tgctgtcttt gacaacagat gttttcttgc ctttgatgtt 6300
cagcaggaag ctcggcgcaa acgttgattg tttgtctgcg tagaatcctc tgtttgtcat 6360
atagcttgta atcacgacat tgtttccttt cgcttgaggt acagcgaagt gtgagtaagt 6420
aaaggttaca tcgttaggat caagatccat ttttaacaca aggccagttt tgttcagcgg 6480
cttgtatggg ccagttaaag aattagaaac ataaccaagc atgtaaatat cgttagacgt 6540
aatgccgtca atcgtcattt ttgatccgcg ggagtcagtg aacaggtacc atttgccgtt 6600
cattttaaag acgttcgcgc gttcaatttc atctgttact gtgttagatg caatcagcgg 6660
tttcatcact tttttcagtg tgtaatcatc gtttagctca atcataccga gagcgccgtt 6720
tgctaactca gccgtgcgtt ttttatcgct ttgcagaagt ttttgacttt cttgacggaa 6780
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atcttcagtt ccagtgtttg cttcaaatac taagtatttg tggcctttat cttctacgta 6900
gtgaggatct ctcagcgtat ggttgtcgcc tgagctgtag ttgccttcat cgatgaactg 6960
ctgtacattt tgatacgttt ttccgtcacc gtcaaagatt gatttataat cctctacacc 7020
gttgatgttc aaagagctgt ctgatgctga tacgttaact tgtgcagttg tcagtgtttg 7080
tttgccgtaa tgtttaccgg agaaatcagt gtagaataaa cggatttttc cgtcagatgt 7140
aaatgtggct gaacctgacc attcttgtgt ttggtctttt aggatagaat catttgcatc 7200
gaatttgtcg ctgtctttaa agacgcggcc agcgtttttc cagctgtcaa tagaagtttc 7260
gccgactttt tgatagaaca tgtaaatcga tgtgtcatcc gcatttttag gatctccggc 7320
taatgcaaag acgatgtggt agccgtgata gtttgcgaca gtgccgtcag cgttttgtaa 7380
tggccagctg tcccaaacgt ccaggccttt tgcagaagag atatttttaa ttgtggacga 7440
atcaaattca gaaacttgat atttttcatt tttttgctgt tcagggattt gcagcatatc 7500
atggcgtgta atatgggaaa tgccgtatgt ttccttatat ggcttttggt tcgtttcttt 7560
cgcaaacgct tgagttgcgc ctcctgccag cagtgcggta gtaaaggtta atactgttgc 7620
ttgttttgca aactttttga tgttcatcgt tcatgtctcc ttttttatgt actgtgttag 7680
cggtctgctt cttccagccc tcctgtttga agatggcaag ttagttacgc acaataaaaa 7740
aagacctaaa atatgtaagg ggtgacgcca aagtatacac tttgcccttt acacatttta 7800
ggtcttgcct gctttatcag taacaaaccc gcgcgattta cttttcgacc tcattctatt 7860
agactctcgt ttggattgca actggtctat tttcctcttt tgtttgatag aaaatcataa 7920
aaggatttgc agactacggg cctaaagaac taaaaaatct atctgtttct tttcattctc 7980
tgtatttttt atagtttctg ttgcatgggc ataaagttgc ctttttaatc acaattcaga 8040
aaatatcata atatctcatt tcactaaata atagtgaacg gcaggtatat gtgatgggtt 8100
aaaaaggatc ggc 8113
Claims (18)
- 비타민 B12의 흡수 효율이 증가하도록 유전자 변형된 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 효율 증가가 탈조절된 비타민 B12 흡수 시스템에 의해 이루어진 것인 미생물.
- 제2항에 있어서, 상기 비타민 B12 흡수 시스템이 서열 2의 하나 이상의 음성 조절 단백질, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편, 및/또는 서열 4, 6 및 8의 서브유닛으로부터 형성되는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 미생물.
- 제3항에 있어서, 하나 이상의 음성 조절 단백질 및 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질을 코딩하는 상기 핵산 서열이, 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질이 상기 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질의 발현을 조정하도록, 오페론으로서 조직된 것인 미생물.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질의 양 및/또는 활성이 유전자 변경에 의해 이러한 유전자 변경을 나타내지 않는 각각의 출발 유기체와 비교하였을 때 적어도 부분적으로 감소된 것인 미생물.
- 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질의 양 및/또는 활성이 유전자 변경에 의해 이러한 유전자 변경을 나타내지 않는 각각의 출발 유기체와 비교하였을 때 적어도 부분적으로 증가된 것인 미생물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 그람 양성 미생물, 바람직하게는 악티노바실러스(actinobacillus), 더욱 바람직하게는 악티노마이세트(actinomycete)로부터 선택된 미생물.
- 제7항에 있어서, 코리네박테리움(corynebacterium) 속, 바람직하게는 C. 글루타미쿰(C. glutamicum ) 종으로부터 선택된 미생물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 그람 양성 미생물이며, 비타민 B12 흡수 시스템이 서열 2의 하나 이상의 음성 조절 단백질, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편, 및 서열 4, 6 및 8의 서브유닛을 포함하는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 오페론을 포함하는 것인 미생물.
- 제9항에 있어서, 미생물이 C. 글루타미쿰 종으로부터 선택되며, 비타민 B12 흡수 시스템이 서열 2와 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 음성 조절 단백질 및 서열 4, 6 및 8과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 서브유닛을 포함하는 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 오페론을 포함하는 것인 미생물.
- 제10항에 있어서, 서열 2와 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질의 발현이 유전자 변경에 의해 이러한 유전자 변경을 나타내지 않는 출발 유기체와 비교하였을 때 적어도 부분적으로 감소되고, 서열 4, 6 및 8과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 서브유닛을 포함하는 상기 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질의 발현이 유전자 변경에 의해 이러한 유전자 변경을 나타내지 않는 출발 유기체와 비교하였을 때 적어도 부분적으로 증가된 것인 미생물.
- 제11항에 있어서, 서열 2와 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 하나 이상의 음성 조절 단백질의 발현이 유전자 변경에 의해 이러한 유전자 변경을 나타내지 않는 출발 유기체와 비교하였을 때 완전하게 감소된 것인 미생물.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 서열 4, 6 및 8과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 서브유닛을 포함하는 상기 하나 이상의 ABC형 수송체 단백질의 발현이 강한 프로모터에 의해 및/또는 상기 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열의 증가된 카피수에 의해 이러한 유전자 변경을 나타내지 않는 출발 유기체와 비교하였을 때 적어도 부분적으로 증가된 것인 미생물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로
- metA/X,
- metZ/Y,
- metF,
- metH,
- thrA,
- metE
중 하나 이상의 인자, 또는 그의 기능적 상동체 및/또는 기능적 단편의 양 및/또는 활성이 유전자 변경에 의해 이러한 유전자 변경을 나타내지 않는 출발 유기체와 비교하였을 때 증가되고/거나:
- metK,
- thrB
중 하나 이상의 인자, 또는 그의 기능적 상동체 및/또는 기능적 단편의 양 및/또는 활성이 유전자 변경에 의해 이러한 유전자 변경을 나타내지 않는 출발 유기체와 비교하였을 때 감소된 것인 미생물. - 생물학적 합성에 비타민 B12를 필요로 하는 정밀 화학물질을 수득하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 미생물의 용도.
- 제15항에 있어서, 메티오닌, S-아데노실 메티오닌 및 메티오닌 설폭시드를 수득하기 위한 용도.
- - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계; 및
- 생물학적 합성에 비타민 B12를 필요로 하는 정밀 화학물질을 수득하는 단계를 포함하는, 상기 정밀 화학물질의 수득 방법. - 제17항에 있어서, 상기 정밀 화학물질이 메티오닌, S-아데노실 메티오닌 및 메티오닌 설폭시드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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