CN101646687A

CN101646687A - 通过过表达戊糖磷酸途径的酶在棒状细菌中生产甲硫氨酸的方法

Info

Publication number: CN101646687A
Application number: CN200880005498A
Authority: CN
Inventors: O·泽尔德; H·施罗德; C·克洛普罗格; A·黑罗尔德
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2007-02-19
Filing date: 2008-02-13
Publication date: 2010-02-10
Also published as: RU2009134794A; EP2121735A1; US20120288901A1; JP2010518827A; WO2008101850A1; BRPI0807519A2; WO2008101850A8

Abstract

本发明涉及在棒状细菌中生产甲硫氨酸的方法，其中戊糖磷酸途径的酶被过表达。本发明还涉及生产甲硫氨酸的棒状细菌，其中戊糖磷酸途径的至少两种酶被过表达。

Description

通过过表达戊糖磷酸途径的酶在棒状细菌中生产甲硫氨酸的方法

发明领域

本发明涉及生产L-甲硫氨酸的微生物和方法。本发明特别涉及通过增加戊糖磷酸途径中至少一种酶的量和/或活性而在棒状细菌中生产甲硫氨酸的方法。本发明还涉及棒状细菌，其中戊糖磷酸途径的至少两种酶的量和/或活性增加。

背景

目前世界范围内每年生产的甲硫氨酸是大约500,000吨。甲硫氨酸是家禽饲料中首要的限制性氨基酸，由此其主要用作饲料添加剂。

与其它工业氨基酸相反，甲硫氨酸几乎只以通过化学合成产生的D-和L-甲硫氨酸的外消旋体形式应用。由于动物可以代谢甲硫氨酸的这两种立体异构体，因此可以直接喂食化学产生的外消旋混合物(D′Mello and Lewis，Effect of Nutrition Deficiencies in Animals：Amino Acids，Rechgigl(Ed.)，CRCHandbook Series in Nutrition and Food，441-490，1978)。

然而，仍非常感兴趣由只生产L-甲硫氨酸的生物技术方法代替现有的化学生产方法。这是因为这样的事实决定的，即较低水平补充L-甲硫氨酸是比D-甲硫氨酸更好的含硫氨基酸来源(Katz and Baker(1975)Poult.Sci.545：1667-74)。此外，化学方法使用更具危害性的化合物并且产生大量废物流。化学生产方法中所有这些缺点通过有效的生物技术方法均可以避免。

目前精细化学品如氨基酸、芳族化合物、微生物以及辅因子的发酵生产方法通常在微生物中进行，所述微生物如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、黑曲霉(Aspergillus niger)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Ashbya gossypii或者Gluconobacter oxydans。

因此，使用发酵方法生产氨基酸如谷氨酸。为此，已经证实某些微生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌是特别合适的。通过发酵生产氨基酸还具有这样的优势：仅产生L-氨基酸，而避免使用在化学合成方法中典型使用的环境问题化合物如溶剂。

先前已经尝试在微生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中生产精细化学品如氨基酸、脂质、维生素或者碳水化合物以实现这个目标，通过例如增加参与所述精细化学品各自生物合成途径的基因的表达而实现。

通过例如正调节参与生产赖氨酸的生物合成途径的基因的表达而增加赖氨酸生产的尝试在例如WO 02/10209、WO 2006008097、WO2005059093或者在Cremer et al.(Appl.Environ.Microbiol，(1991)，57(6)，1746-1752)中描述。

然而，仍强烈需要鉴别代谢途径中进一步的靶位，其可用于有益地影响在微生物如谷氨酸棒杆菌中生产甲硫氨酸。

发明目的和概述

鉴于这种情况，本发明的一个目的是提供棒状细菌，其可用于生产L-甲硫氨酸。本发明的另一目的是提供可用于在棒状细菌中生产L-甲硫氨酸的方法。

通过从随后的描述中可以明了的这些及及其它目的在本发明所附权利要求书中解决。所附权利要求书涉及本发明一些优选的实施方案。

一方面，本发明涉及在至少一种棒状细菌中生产L-甲硫氨酸(也称作甲硫氨酸)的方法，其中所述棒状细菌通过遗传修饰从起始生物体获得，由此所述棒状细菌与起始生物体相比呈现出更高的戊糖磷酸途径的至少一种酶的量和/或活性。

戊糖磷酸途径的酶的量和/或活性可以通过增加编码所述酶的核酸序列的拷贝数而与起始生物体相比增加。编码戊糖磷酸途径的酶的核酸序列的拷贝数可以通过使用例如包含编码所述酶的核酸序列的自主复制载体而增加，和/或通过将编码所述酶的核酸序列的额外拷贝经染色体整合进起始生物体的基因组中而增加。

戊糖磷酸途径的酶的量和/或活性的增加也可以通过增加编码所述酶的核酸序列的转录和/或翻译而实现。转录的增加可以通过使用强启动子和/或增强子元件而实现。如果针对在宿主生物体中表达而优化编码所述酶的核酸序列的密码子选择或者如果改良的核糖体的结合位点和翻译起始位点置于基因编码序列的上游区，则可以实现翻译的增加。

戊糖磷酸途径的酶的活性也可以通过在编码所述酶的基因中导入突变而与起始生物体相比增加，通过切断负调节机制如反馈抑制作用或者通过增加所述酶的酶周转率而增加所述酶活性。

在本发明的一些优选实施方案中，通过组合前述方法，戊糖磷酸途径的酶的量和/或活性与起始生物体相比增加。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及在棒状细菌中生产甲硫氨酸的方法，其中至少转酮醇酶(tkt)、转醛醇酶(tal)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、ocpa基因、内酯酶或者6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶(6PGDH)的量和/或活性与起始生物体相比增加。

本发明进一步优选的实施方案涉及在棒状细菌中生产甲硫氨酸的方法，其中至少转酮醇酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶或者葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以及6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性与起始生物体相比增加。

在本发明的一个更优选的实施方案中，通过用强启动子优选P_SOD置换相应的内源启动子，转酮醇酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性与起始生物体相比增加。在本发明这个最后方面的进一步描述中，使用编码突变形式的转酮醇酶、转醛醇酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶、opca蛋白和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的核酸序列，所述突变形式与各自的野生型酶相比更不倾向于负调节机制和/或展示更高的酶周转率。

本发明另一方面涉及棒状细菌，其通过遗传修饰从起始生物体获得，由此所述棒状细菌与起始生物体相比呈现出戊糖磷酸途径的至少两种酶的量和/或活性增加。

通过前述方法，所述至少两种酶的量和/或活性与起始生物体相比可增加，所述方法即增加编码所述酶的核酸序列的拷贝数、增加编码所述酶的核酸序列的转录和/或翻译，和/或在编码所述酶的核酸序列中导入突变，产生各个酶的更具活性的形式。

在优选的实施方案中，本发明涉及棒状细菌，其中至少转酮醇酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶或者至少葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性与起始生物体相比增加。

在一个更优选的实施方案中，棒状细菌特征在于转酮醇酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性与起始生物体相比增加，这优选通过用强启动子如P_SOD置换其各自的内源启动子而实现。

在本发明这个后一方面的进一步描述中，转酮醇酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的核酸序列编码突变形式的这些酶，所述突变形式与各自的野生型酶相比更不倾向于负调节机制和/或展示更高的酶周转率。

在本发明的所有前述实施方案中，选择这样的棒状细菌，其优选选自谷氨酸棒杆菌物种。可以用于本发明的优选谷氨酸棒杆菌菌株是野生型菌株如ATCC13032，或者已经针对甲硫氨酸生产而优化的菌株。后者菌株展示如下文描述的DSM17322、M2014或者OM469或者如WO2007012078所述的那些遗传变异。

在本发明的一方面中，本发明的方法和棒状细菌与起始生物体相比可以生产多至少2％、至少5％、至少10％或者至少20％，优选至少30％、至少40％或者至少50％，更优选至少2倍、至少5倍以及至少10倍以上的甲硫氨酸。

附图简述

图1示出质粒pCLIK int sacB PSOD TKT和pCLIK int sacB PSOD6PGDH示意图。

发明详述

一方面，本发明涉及在至少一种棒状细菌中生产甲硫氨酸的方法，其中所述棒状细菌通过遗传修饰得自起始生物体，由此所述棒状细菌与起始生物体相比呈现更高的至少一种戊糖磷酸途径的酶的量和/或活性。

本发明的另一实施方案涉及棒状细菌，其通过遗传修饰得自起始生物体，由此所述棒状细菌与起始生物体相比呈现更高的至少两种戊糖磷酸途径的酶的量和/或活性。

已经令人惊奇地发现增加不直接参与代谢途径的酶的量和/或活性可以导致在棒状细菌中甲硫氨酸的产生增加。因此，本发明人观测到如果在棒状细菌中过表达至少一种戊糖磷酸途径的酶如转酮醇酶或者6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶，则与在棒状细菌中这两种酶未高于其典型的内源性水平表达的情况相比产生更多量的甲硫氨酸。

在更详细地描述本发明的各个方面和一些优选的实施方案之前，提供如下定义，除非特别指出，则所述定义在本发明的描述中具有指定含义。

棒状细菌包含如谷氨酸棒杆菌、杰氏棒杆菌(Corynebacteriumjeikeum)、醋谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、嗜醋酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacteriummelassecola)和Corynebacterium effiziens。优选谷氨酸棒杆菌。

在本发明优选的实施方案中，棒状细菌可得自如下菌株：谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌KFCC10065、谷氨酸棒杆菌ATCC21608、醋谷氨酸棒杆菌ATCC15806、嗜醋酸棒状杆菌ATCC13870、热产氨棒状杆菌FERMBP-1539、栖糖蜜棒杆菌ATCC17965、C.effiziens DSM 44547和C.effiziens DSM 44549，以及其通过例如传统的诱变和选择法或者通过定向诱变获得的菌株。

其它特别优选的谷氨酸棒杆菌菌株可选自ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC21492、ATCC21513、ATCC21526、ATCC21543、ATCC13287、ATCC21851、ATCC21253、ATCC21514、ATCC21516、ATCC21299、ATCC21300、ATCC39684、ATCC21488、ATCC21649、ATCC21650、ATCC19223、ATCC13869、ATCC21157、ATCC21158、ATCC21159、ATCC21355、ATCC31808、ATCC21674、ATCC21562、ATCC21563、ATCC21564、ATCC21565、ATCC21566、ATCC21567、ATCC21568、ATCC21569、ATCC21570、ATCC21571、ATCC21572、ATCC21573、ATCC21579、ATCC19049、ATCC19050、ATCC19051、ATCC19052、ATCC19053、ATCC19054、ATCC19055、ATCC19056、ATCC19057、ATCC19058、ATCC19059、ATCC19060、ATCC19185、ATCC13286、ATCC21515、ATCC21527、ATCC21544、ATCC21492、NRRL B8183、NRRL W8182、B12NRRLB12416、NRRLB12417、NRRLB12418以及NRRLB11476。

缩写词KFCC是指Korean Federation of Culture Collection，ATCC是指American-Type Strain Culture Collection，DSM是指Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen。缩写词NRRL是指ARS cultures collection NorthernRegional Research Laboratory，Peorea，EL，USA。

对于本发明，优选的野生型菌株是谷氨酸棒杆菌ATCC13032。

特别优选的是已经能生产甲硫氨酸的微生物谷氨酸棒杆菌。因此，特别优选呈现出具有与如下述DSM17322、M2014或者OM469相似作用的遗传变异的菌株。

本发明文中所用术语“起始微生物”是指用于进行遗传修饰以增加戊糖磷酸途径的至少一种酶的量和/或活性的棒状细菌。

本发明文中所用术语“遗传修饰”和“遗传变异”以及其合乎语法的变化用语是指微生物已经通过基因技术被修饰为表达改变量的一或多种蛋白质，所述蛋白质可以是微生物中天然存在的蛋白质、微生物中非天然存在的蛋白质或者与未修饰的蛋白质相比活性改变的蛋白质。未修饰的微生物被认为是“起始生物体”，对其进行遗传变异产生本发明的微生物。

所述起始生物体可因此是野生型谷氨酸棒杆菌菌株如ATCC13032。

然而，起始生物体也可以优选是例如已经针对甲硫氨酸生产而优化的谷氨酸棒杆菌菌株。

这种生产甲硫氨酸的起始微生物可以例如得自野生型棒状细菌，优选得自在如下至少一个基因中含有遗传变异的野生型谷氨酸棒杆菌：ask^fbr、hom^fbr和metH，其中所述遗传变异导致任何这些基因的过表达，从而导致与没有所述遗传变异的情况中产生的甲硫氨酸相比甲硫氨酸的产生增加。在优选的实施方案中，这种生产甲硫氨酸的起始生物体在ask^fbr、hom^fbr和metH中同时含有遗传变异，从而导致与没有所述遗传变异的情况中产生的甲硫氨酸相比甲硫氨酸的产生增加。

在这些生物体中，ask和hom的内源拷贝被典型改变为反馈抗性等位基因，其不再由赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或者这些氨基酸的组合反馈抑制。这可以通过突变和选择或者通过用编码具有降低的或者减少的反馈抑制作用的蛋白质的突变的等位基因进行指定的基因遗传置换而实现。包括这些遗传变异的谷氨酸棒杆菌菌株是例如谷氨酸棒杆菌DSM17322。本领域技术人员意识到在下文描述的产生谷氨酸棒杆菌DSM17322的那些替代的遗传变异也可用于实现ask^fbr、hom^fbr和metH的过表达。

对于本发明，ask^fbr表示反馈抗性天冬氨酸激酶。Hom^fbr表示反馈抗性高丝氨酸脱氢酶。MetH表示维生素B12-依赖性甲硫氨酸合酶。

在另一个优选的实施方案中，生产甲硫氨酸的起始生物体可以得自野生型棒状细菌，优选得自在至少一个如下基因中含有遗传变异的野生型谷氨酸棒杆菌：ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)以及hsk^mutated，其中所述遗传变异导致任何这些基因的过表达，从而与没有所述遗传变异的情况产生的甲硫氨酸相比甲硫氨酸的产生增加。在优选的实施方案中，这种生产甲硫氨酸的起始生物体在ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)和hsk^mutated中同时含有遗传变异，从而与没有所述遗传变异的情况产生的甲硫氨酸相比甲硫氨酸的产生增加。

在这些起始生物体中，ask、hom和hsk的内源性拷贝典型由ask^fbr、hom^fbr和hsk^mutated置换，如上文针对ask^fbr和hom^fbr所述。包括这些遗传变异的谷氨酸棒杆菌菌株是例如谷氨酸棒杆菌M2014。本领域技术人员意识到下文特别针对产生谷氨酸棒杆菌M2014所述的那些遗传变异也可用于实现ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)和hsk^mutated的过表达。

对于本发明，metA是指例如得自大肠杆菌的高丝氨酸琥珀酰转移酶。MetY是指O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。Hsk^mutated是指高丝氨酸激酶，其已经被突变为降低酶活性。这可以通过在相应于SEQ ID No.19所示hsk的T190位置用丝氨酸或者丙氨酸置换苏氨酸而实现。或者或此外，可以用TTG起始密码子置换ATG起始密码子。这种突变导致所得hsk蛋白与未突变的hsk基因相比酶活性降低。

在另一个优选的实施方案中，生产甲硫氨酸的起始生物体可以得自野生型棒状细菌，优选得自在至少一个如下基因中含有遗传变异的野生型谷氨酸棒杆菌：ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)、hsk^mutated和metF，其中所述遗传变异导致任何这些基因的过表达，组合至少一个如下基因中的遗传变异：mcbR和metQ，其中所述遗传变异降低任何这些基因的表达，其中组合导致与没有组合的情况中产生的甲硫氨酸相比微生物产生的甲硫氨酸增加。在优选的实施方案中，这种生产甲硫氨酸的起始生物体在ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)、hsk^mutated和metF中同时含有遗传变异，其中所述遗传变异导致任何这些基因的过表达，组合在mcbR和metQ中的遗传变异，其中所述遗传变异降低任何这些基因的表达，其中所述组合导致导致与没有组合的情况中产生的甲硫氨酸相比微生物产生的甲硫氨酸增加。

在这些起始生物体中，ask、hom和hsk的内源性拷贝典型如上述置换，而mcbR和metQ的内源性拷贝典型被功能性破坏或者缺失。包括这些遗传变异的谷氨酸棒杆菌菌株是例如谷氨酸棒杆菌OM469。本领域技术人员意识到下文特别针对产生谷氨酸棒杆菌M2014所述的那些遗传变异也可用于实现ask^fbr、hom^fbr、metH、metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)、hsk^mutated和metF的过表达以及mcbR和metQ的降低的表达。

对于本发明，metF表示N5，10-亚甲基-四氢叶酸还原酶(EC 1.5.1.20)。McbR表示硫代谢的TetR-型转录调节剂(Genbank accession no：AAP45010)。MetQ表示D-甲硫氨酸结合脂蛋白。

本发明文中所用术语“戊糖磷酸途径的酶”根据标准教科书是指参与戊糖磷酸途径的7种酶。关于代谢途径如戊糖磷酸途径的综述可见于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(http://www.genome.jp/kegg/)。这个数据库还提供了关于代谢途径的物种特异性修饰的综述。对于本发明，如下酶构成戊糖磷酸途径的一部分：

●葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(zwf，g6pdh)(EC 1.1.1.49)

●6-磷酸-葡糖酸-内酯酶(6pgl)(EC 3.1.1.31)

●6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶(6pgdh)(EC 1.1.1.44)

●核酮糖-5-磷酸差向异构酶(rpe)(EC 5.1.3.1)

●核糖-5-磷酸异构酶(rpi)(EC 5.3.1.6.)

●转酮醇酶(tht)(EC 2.2.1.1.)

●转醛醇酶(tal)(EC 2.2.1.2.)

本发明文中所用术语与起始生物体相比至少一种戊糖磷酸途径的酶的“量增加”是指棒状细菌被遗传修饰，以表达更高量的戊糖磷酸途径的至少一种上述酶。应理解至少一种戊糖磷酸途径的酶的量增加是指其中功能性酶的量增加的情况。本发明文中戊糖磷酸途径的酶如果能催化各自的反应则被认为是功能性的。有许多选项可增加棒状细菌中酶的量，这些方法为本领域技术人员所熟知。这些选项包括增加编码上述酶的核酸序列的拷贝数、增加这种核酸序列的转录和/或翻译。这些选项在下文详细描述。

术语至少一种戊糖磷酸途径的酶“活性的增加”是指这样的情况，其中在上述酶各自的野生型序列中导入至少一个突变，从而导致与表达相同量的野生型酶的情况相比产生更多的甲硫氨酸。导入突变形式的戊糖磷酸途径的酶而增加产量可以是例如反馈抑制作用降低的结果。因此，如果例如终产物由其中酶以足够程度参与的代谢途径产生，则所述酶降低其催化活性。本领域熟知可以通过在所述酶中各自的调节结合位点导入例如氨基酸取代、插入或者缺失而可以抑制这种反馈抑制作用。因此，这种反馈抗性或者反馈不敏感的酶持续展示高活性，甚至当例如代谢物的量已经产生时也如此，其否则将负调节所述酶的活性。此外，酶的活性可以通过导入增加酶的催化性周转的突变而增加。

已知小分子在酶水平调节PPP的酶(F Neidhardt，JL Ingraham，KB Low，B Magasanik，M Schaechter and HE Umbarger，eds.In：Escherichia coli andSalmonella typhimurium.Cellular and Molecular Biology，American Society forMicrobiology，Washington，DC(1987)。这些酶包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶，其已经示出通过效应子的抑制作用而被调节，所述效应子如NADP、NADPH、ATP、果糖1，6-二磷酸(Fru1，6P2)、D-甘油醛3-磷酸、赤藓糖4-磷酸和核酮糖5-磷酸(Rib5P)等，如S Moritz et al(Eur.J.Biochem.(2000)，267，3442-52)和Onishi et al.(Micorbiol.Lett.(2005)，242，265-74)所述。利用这个知识，技术人员可以鉴别例如前述效应子的结合位点，并且在这些位点导入突变，以增加或者降低所述酶对于其各自调节物的亲和性。根据调节物的作用，所述酶活性可以增加。

因此，至少一种酶的“活性增加”是指这样的情况，其中在上述戊糖磷酸途径的任何酶的野生型序列中导入突变，以降低负调节机制，如反馈抑制作用，和/或增加所述酶的催化性周转。

当然，可以组合增加至少一种酶的量和/或活性的方法。因此，例如可以用编码反馈不敏感形式的酶置换棒状细菌中至少一种戊糖磷酸途径的酶的内源性拷贝。如果这个突变的拷贝的转录在强启动子的控制下，则相应酶的量和活性增加。应理解在这种情况中，所述酶必须仍能催化其通常参与的反应。

关于根据本发明要增加量和/或活性的酶，可以使用相应棒状细菌优选谷氨酸棒杆菌的内源核酸序列，或者可以使用来自其它生物体的其功能性同源物。

因此，可以例如通过过表达相应的谷氨酸棒杆菌序列而增加谷氨酸棒杆菌中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的量，从自主复制载体或者另外插入的染色体拷贝(见下文描述)中，或者可以使用来自例如枯草芽孢杆菌或者大肠杆菌的相应酶并且通过使用可自主复制载体过表达所述酶。

在一些情况中，可优选使用内源酶，因为例如谷氨酸棒杆菌的内源编码序列已经针对其密码子选择而优化以在谷氨酸棒杆菌中表达。

在本发明的优选实施方案中，谷氨酸棒杆菌中至少一种戊糖磷酸途径的酶的量和/或活性增加。

在本发明此方面的进一步阐述中，使用相应的谷氨酸棒杆菌序列增加至少一种戊糖磷酸途径的酶的量和/或活性。

谷氨酸棒杆菌葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的核酸序列在SEQ ID NO.1中示出。相应的氨基酸序列在SEQ ID NO.2中示出。Genebank登记号(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)是Cgl1576。

6-磷酸葡糖酸内酯酶的核酸序列在SEQ ID NO.3中示出。相应的氨基酸序列在SEQ ID NO.4中示出。Genebank登记号是Cgl1578。

6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的核酸序列在SEQ ID NO.5中示出。相应的氨基酸序列在SEQ ID NO.6中示出。Genebank登记号是Cgl1452。

核酮糖-5-磷酸差向异构酶的核酸序列在SEQ ID NO.7中示出。相应的氨基酸序列在SEQ ID NO.8中示出。Genebank登记号是Cgl1598。

核糖-5-磷酸异构酶的核酸序列在SEQ ID NO.9中示出。相应的氨基酸序列在SEQ ID NO.10中示出。Genebank登记号是Cgl2423。

谷氨酸棒杆菌转酮醇酶的核酸序列在SEQ ID NO.11中示出。相应的氨基酸序列在SEQ ID NO.12中示出。Genebank登记号是Cgl1574。

谷氨酸棒杆菌转醛醇酶的核酸序列在SEQ ID NO.13中示出。相应的氨基酸序列在SEQ ID NO.14中示出。Genebank登记号是Cgl1575。

上述戊糖磷酸途径的谷氨酸棒杆菌酶的相应功能性同源物可易于由技术人员通过同源分析从其它生物体中鉴别。这可以通过确定推定的同源物的氨基酸或者核酸序列与所述基因或者其编码的蛋白质的序列之间的相同性百分比而进行(例如转酮醇酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸-葡糖酸脱氢酶及任何其它上述或者下述基因及其编码的蛋白质的核酸序列)。

相同性百分比可以例如通过目测或者通过基于同源性的算法确定。

例如，为了确定两个氨基酸序列的相同性百分比，所述算法将对比序列以进行最佳对比(例如可以在一个蛋白质的氨基酸序列中导入缺口，以与另一蛋白质的氨基酸序列最佳对比)。然后对比在相应氨基酸位置的氨基酸残基。当一个序列中的一个位置在另一序列的相应位置由相同氨基酸占据时，则认为分子在这个位置是相同的。两个序列之间的相同性百分比是序列共有的相同位置数的函数(即相同性百分比＝相同位置数/总位置数乘以100)。

本领域已知为此目的的多种计算机程序。例如，两个核酸或者氨基酸序列的相同性百分比可以通过使用GAP计算机程序对比序列信息而确定，所述程序由Devereux et al.(1984)Nucl.Acids.Res.，12：387描述并且可得自University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)。相同性百分比也可以通过使用Basic Local Alignment Search Tool(BLAST^TM)程序(如Tatusova et al.(1999)FEMS Microbiol.Lett.，174：247所述)对比两个核酸或者氨基酸序列而确定。

在这个专利申请的提请日，提供BLAST程序的标准软件包可见于NCBI的BLAST网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。例如，如果使用任何前述SEQ ID，可以进行基于核酸序列或者氨基酸序列的BLAST检索，并且鉴别在例如大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等中相应酶的密切相关的同源物。例如，使用BLAST^TM程序进行核酸序列对比时，默认设置如下：reward for match is 2，penalty for mismatch is-2，open gap andextension gap penalties are 5 and 2 respectively，gap.times.dropoff is 50，expect is 10，word size is 11，and filter is OFF。

相似的序列检索和分析可以在EMBL数据库(http://www.embl.org)或者Expasy主页(http://www.expasy.org/)上进行。所有上述序列检索均典型使用默认参数进行，因为它们是在本申请申请日由数据库提供者预先安装的。同源性检索也可以使用软件程序常规进行，所述程序如美国威斯康星州麦迪逊的DNA Star公司的激光基因软件，其使用CLUSTAL方法(Higgins etal.(1989)，Comput.Appl.Biosci.，5(2)151)。

技术人员理解如果两种蛋白质呈现如上述一定程度的相同性，则其很可能发挥相同功能(例如提供相同的酶活性)。氨基酸水平的典型较低限度是至少大约25％相同性。在核酸水平，较低限度是至少45％相同性。

两种类型的序列的优选相同性级别是至少大约50％、至少大约60％或者至少大约70％。更优选的相同性水平是至少大约80％、至少大约90％或者至少大约95％。这些相同性水平被认为是有意义的。

如本文所用，术语“同源性”和“同源的”非限于具有理论上共有遗传先祖的蛋白质，也包括遗传不相关的但是已经进化为发挥相似功能和/或具有相似结构的蛋白质。同系物应该是功能性的要求是指本文所述同系物包含与参考蛋白质具有基本相同活性的蛋白质。对于具有功能同源性的蛋白质，非必须要求其氨基酸序列中具有显著的相同性，而是具有功能同源性的蛋白质是根据其具有相似或者相同活性例如酶活性而定义的。

优选地，如果来自与例如宿主棒状细菌不同的另一生物体的酶示出至少明显的相似性-即在氨基酸水平大约50％序列相同性，并且与其对应物一样催化棒状细菌中的相同反应，则认为其是功能性同系物。进一步优选的功能性同系物是这样的功能性同系物，其提供相同的酶活性并且在氨基酸水平呈现出例如至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％或者至少大约90％序列相同性这样更高程度的相同性。

本领域技术人员已知也可以使用前述来自棒状细菌的酶及其在其它生物体中的功能同系物的片段或者突变形式，只要这些片段和突变形式呈现相同类型的功能性活性即可。典型的功能性活性片段显示出N-末端和/或C末端缺失，而突变形式典型包含缺失、插入或者点突变。

例如，如果大肠杆菌的序列在氨基酸水平展示出与SEQ ID NO.2的上述相同性水平并且展示相同的酶活性，则认为其编码谷氨酸棒杆菌葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的功能性同系物。一个例子是大肠杆菌对应物(Genbank登记号AP_002472)。也可以使用这些序列的片段或者例如点突变形式，只要所得蛋白质仍催化与全长的酶相同类型的反应即可。

根据本发明，增加至少一种戊糖磷酸途径的酶的量和/或活性可以改良棒状细菌中甲硫氨酸的产生。

改良棒状细菌中甲硫氨酸的产生是指增加甲硫氨酸合成的效率以及增加产生的甲硫氨酸的量。

术语“甲硫氨酸合成的效率”描述了甲硫氨酸的碳产量。这个效率根据以碳底物形式进入系统的能量输入的百分比计算。在本发明中，这个值以百分比表示(甲硫氨酸mol/碳底物mol×100)。术语“增加甲硫氨酸合成效率”因此涉及起始生物体与实际的棒状细菌之间的对比，所述实际的棒状细菌戊糖磷酸途径中的至少一种酶的量和/活性已经增加。

本发明优选的碳源是糖，如单糖、二糖或者多糖。例如，选自葡萄糖、果糖、hanose、半乳糖、核糖、山梨糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或者纤维素的糖可以作为特别优选的碳源。

本发明的方法和棒状细菌也可用于生产多于起始生物体生产的甲硫氨酸。

本发明的方法和棒状细菌也可以用于与起始生物体相比以更快的速度生产甲硫氨酸。例如，如果考虑典型的生产期，则所述方法和棒状细菌可以较快的速度生产甲硫氨酸，即与起始生物体相比在较早的时间点产生同量的甲硫氨酸。这特别用于对数生长期。

如果利用摇瓶保温法保温菌株，则本发明的方法和棒状细菌可以产生至少大约3g甲硫氨酸/l培养体积。如果利用摇瓶保温法保温菌株，可优选至少大约4g甲硫氨酸/l培养体积、至少大约5g甲硫氨酸/l培养体积或者至少大约7g甲硫氨酸/l培养体积的效价。如果将菌株利用摇瓶保温法保温，更优选的量值是至少大约10g甲硫氨酸/l培养体积，甚至更优选至少大约20g甲硫氨酸/l细胞量。

如果在发酵实验中使用搅拌和碳源补料发酵罐中保温菌株，则本发明的方法和棒状细菌可以产生至少大约25g甲硫氨酸/l培养体积。如果在发酵实验中使用搅拌和碳源补料发酵罐中保温菌株，可优选至少大约30g甲硫氨酸/l培养体积、至少大约35g甲硫氨酸/l培养体积或者至少大约40g甲硫氨酸/l培养体积的效价。如果在发酵实验中使用搅拌和碳源补料发酵罐中保温菌株，更优选的量值是至少大约50g甲硫氨酸/l培养体积，甚至更优选至少大约60g甲硫氨酸/l细胞量。

在优选的实施方案中，本发明的方法和微生物与起始生物体相比可以使甲硫氨酸合成效率和/或甲硫氨酸的量和/或甲硫氨酸合成的效价和/或速度增加至少大约2％、至少大约5％、至少大约10％或者至少大约20％。在优选的实施方案中，甲硫氨酸合成的效率和/或甲硫氨酸的量和/或所述效价和/或所述速度与起始生物体相比增加至少大约30％、至少大约40％或者至少大约50％。更优选增加至少大约2倍、至少大约3倍、至少大约5倍和至少大约10倍。然而，增加大约5％已经认为是显著改良。

根据本发明，如果上述七种酶的至少一种酶的量和/或活性与各自的起始生物体相比增加，则棒状细菌中甲硫氨酸的生产可以被改良。

一方面，优选增加转醛醇酶、葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶或者6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性。更优选地，在谷氨酸棒杆菌中进行。

如果谷氨酸棒杆菌中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的量和/或活性增加，技术人员意识到应伴随也要增加OCPA蛋白的量和/或活性，其编码序列位于谷氨酸棒杆菌基因组中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的3’位置。OCPA应伴随着被过表达，因为其似乎发挥平台作用，在其上功能性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶被装配(Moritz et al(vide supra))。谷氨酸棒杆菌OCPA的核酸序列在SEQ ID NO.15中示出。相应的氨基酸序列在SEQ ID NO.16中示出。Genebank登记号是Cgl1577。

在另一实施方案中，戊糖磷酸途径的至少两种酶的量和/或活性与各自的起始生物体相比增加。

在一个优选的实施方案中，转酮醇酶和葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶、转酮醇酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶或者葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性同时增加。在后者的进一步描述中，在谷氨酸棒杆菌中进行。

在本发明的一方面中，可以优选同时增加转酮醇酶、葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性。这可以优选在谷氨酸棒杆菌中进行。

如果谷氨酸棒杆菌中戊糖磷酸途径的至少四种酶的量和/或活性增加，优选同时增加转酮醇酶、转醛醇酶、葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性。这可以优选在谷氨酸棒杆菌中进行。

戊糖磷酸途径的上述优选的酶组合的量和/或活性优选在谷氨酸棒杆菌中增加。为此，可以使用野生型菌株如ATCC13032或者具有增加和改良甲硫氨酸合成的进一步的遗传修饰的菌株。

这种菌株可例如表达反馈抗性高丝氨酸脱氢酶(hom^fbr)。这种菌株可进一步表达反馈抗性天冬氨酸激酶(ask^fbr)。这种菌株可另外展示增加的甲硫氨酸合成酶(metH)的表达。适于生产甲硫氨酸以及过表达反馈抗性高丝氨酸脱氢酶、反馈抗性天冬氨酸激酶和甲硫氨酸合酶的菌株使例如前述的DSM17322。

可优选用于本发明的其它谷氨酸棒杆菌起始菌株具有前述DSM17322的修饰并且针对甲硫氨酸合成而进一步优化。这种菌株可例如表达增加水平的突变的高丝氨酸激酶(hsk^mutatedr)、高丝氨酸琥珀酰转移酶(metA)和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(metY)。具有所有这些遗传变异的菌株是例如实施例1的M2014。对于本发明特别有希望的谷氨酸棒杆菌中的起始生物体将因此展示增加水平的metH、metY和metA、hom^fbr、ask^fbr和hsk^mutated。

举例的反馈抗性高丝氨酸脱氢酶具有在SEQ ID NO.17中第393位的S393F突变。这个hom^fbr示出苏氨酸和/或甲硫氨酸的降低的反馈抑制作用。举例的反馈抗性天冬氨酸激酶具有在SEQ ID NO.18中第311位的T311I突变。这个ask^fbr示出赖氨酸和/或苏氨酸的降低的反馈抑制作用。具有前述功能性突变的高丝氨酸激酶具有在SEQ ID NO.19中第190位的T190A突变，或者在第190位的T190S突变或者TTG起始密码子。

可具有前述遗传变异如M2014的谷氨酸棒杆菌起始生物体可以通过缺失负调节子(mcbR)(Rey，D.et al.(2005)Mol.Microbiol.，56.871-887，Rey，D.et al.(2003)J.Biotechnol.，103，51-65，US2005074802)和D-甲硫氨酸结合脂蛋白(metQ)的核酸序列以及通过增加N5，10-亚甲基-四氢叶酸还原酶(metF)的表达而进一步改良。相应的菌株在实施例5中以OM469描述。展示与那些DSM17322、M2014或者OM469相同或者相当的遗传变异的菌株可优选作为谷氨酸棒杆菌起始生物体。

技术人员可以通过例如增加基因拷贝数即编码所述酶的核酸序列的拷贝数而增加棒状细菌中戊糖磷酸途径的酶的量，通过增加转录、增加翻译和/或其组合进行。

本领域技术人员熟知增加核酸序列的基因拷贝数、增加转录和/或增加翻译必需的遗传变异的类型。

通常地，技术人员可以通过在棒状细菌中表达包含编码多肽的核酸序列的载体而增加编码所述多肽的核酸序列的拷贝数。这种载体可以自主复制，由此其可以稳定保持在棒状细菌中。表达谷氨酸棒杆菌中戊糖磷酸途径的多肽和酶的典型载体包括pCliK pB和pEKO，如Bott，M.and Eggeling，L.，eds.Handbook of Corynebacterium glutamicum.CRC Press LLC，BocaRaton，FL；Deb，J.K.et al.(FEMS Microbiol.Lett.(1999)，175(1)，11-20)、Kirchner O.et al.(J.Biotechnol.(2003)，104(1-3)，287-299)、WO2006069711以及WO2007012078所述。

在增加编码棒状细菌中多肽的核酸序列的拷贝数的另一方法中，可以将编码这种多肽的核酸序列的其它拷贝整合进谷氨酸棒杆菌的染色体中。染色体整合可例如在各自多肽的内源性拷贝所在的基因座发生。此外和/或或者，多肽编码核酸序列的染色体倍增可以在棒状细菌基因组中其它基因座发生。在谷氨酸棒杆菌的情况中，有许多本领域技术人员已知的各种方法以通过染色体整合增加基因拷贝数。一种这样的方法例如使用载体pK19 sacB，并且已经在

A，et al.J Bacteriol.1994 176(23)：7309-7319中描述。多肽编码核酸序列的染色体整合的其它载体包括pCLIK intsacB，如WO2005059093或者WO2007011845所述。

增加至少一种戊糖磷酸途径的酶的量也可以通过增加编码相应酶的核酸序列的转录而实现。增加的转录将产生更多的mRNA，并最终产生更多量的翻译的蛋白质。

本领域技术人员意识到可以通过多种方法增加棒状细菌中编码序列的转录。因此，可以通过使用强启动子和/或强增强子元件增加转录。也可以使用转录激活物如适配子(aptamer)或者过表达转录因子。本发明优选使用强启动子。

如果启动子与野生型情况中先于各自核酸序列存在的内源启动子相比，使得编码各自多肽的核酸序列更高程度转录，则在本发明中认为其是“强启动子”。

对于本发明，认为可以使用如下启动子：P_SOD(SEQ ID NO.20)、P_groES(SEQ ID NO.21)、P_EFTu(SEQ ID NO.22)和λ_PR(SEQ ID NO.23)。这些启动子通常用于谷氨酸棒杆菌中以过表达多肽，认为启动子的强度如下顺序：

P_λR＞P_EFTu＞P_SOD＞P_GRoES

本领域技术人员充分意识到也许不总是需要使用最强的启动子如上述λ_PR。在一些情况中，仅例如略微增加第一种酶的量即为所需且足够的，但是希望尽可能地增加第二种酶的量。在这种情况中，因此用P_EFTu和λ_PR分别置换谷氨酸棒杆菌中第一种和第二种酶的内源启动子。除了使用强转录活性启动子之外，所谓核糖体结合位点的选择和序列也可以显著增加如上述那些酶的量。例如，起始密码子邻近的5’序列如起始密码子的15bp上游影响酶活性，并且可见于P_EFTu(SEQ ID NO.22)、P_groES(SEQ ID NO.21)、P_SOD(SEQ ID NO.20)和λ_PR(SEQ ID NO.23)的序列。

翻译的改良可以例如通过优化编码相应酶的核酸序列的密码子选择而实现。如果使用宿主酶的核酸序列，不需要密码子选择，但是也可以应用。然而，如果通过在谷氨酸棒杆菌中过表达大肠杆菌的相应酶而增加例如葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(和OCPA)的量，应根据谷氨酸棒杆菌的密码子选择调试大肠杆菌酶的编码序列。

在本发明的一些实施方案中，优选增加编码戊糖磷酸途径的酶的核酸序列的拷贝数，这通过将多拷贝的相应核酸序列整合在相应的棒状细菌优选谷氨酸棒杆菌中内源基因位置而实现。这种方法通常尽可能地保存基因组的完整性。

当然，本领域技术人员也关注前述方法的组合，并因此会考虑通过使用强启动子P_SOD增加葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的量，以及同时增加谷氨酸棒杆菌中葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的基因拷贝数。

编码戊糖磷酸途径的酶的一些基因在谷氨酸棒杆菌中构成操纵子。这种操纵子包含转酮醇酶、6-磷酸-葡糖酸-内酯酶、葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的基因，以及称作OCPA的基因。6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的基因不形成谷氨酸棒杆菌中这个操纵子的一部分。

根据本发明一些上述优选的实施方案，优选增加转酮醇酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶、转酮醇酶和葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶以及葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的组合的量和/或活性。优选这三种酶的伴随增加。

鉴于谷氨酸棒杆菌中这三种酶的基因组结构和位置，本发明优选的实施方案涉及生产甲硫氨酸的方法和谷氨酸棒杆菌生物体，其中谷氨酸棒杆菌转酮醇酶基因之前的内源启动子由上述强启动子置换。

在本发明更优选的实施方案中，谷氨酸棒杆菌转酮醇酶之前的内源启动子由上述强启动子置换，并且6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性增加。使用这种方法，通过进行最小的遗传修饰而可以实现在谷氨酸棒杆菌中转酮醇酶、葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶以及任选6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量增加。

本领域技术人员进一步发现当置换谷氨酸棒杆菌转酮醇酶基因之前的内源启动子时，可优选使用P_SOD启动子，因为这个启动子保证为增加谷氨酸棒杆菌中转酮醇酶及戊糖磷酸途径操纵子的其它基因的量的有效转录活性，以生产甲硫氨酸。相似地，如果使用强启动子增加6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量，优选P_SOD启动子。

在特别优选的实施方案中，本发明因此涉及谷氨酸棒杆菌生物体，其中谷氨酸棒杆菌tkt之前的内源启动子由强启动子置换，且其中6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶基因之前的内源启动子由强启动子置换，所述强启动子优选是P_SOD。

上文已经陈述了戊糖磷酸途径的酶的活性可以通过在这些的编码序列中导入突变而增加，所述突变产生例如相应酶的反馈抗性形式。下文举例提供了转酮醇酶、葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶。

在谷氨酸棒杆菌的转酮醇酶情况中，在相应于SEQ ID No.12的A293位置的丙氨酸突变为R和/或在相应于SEQ ID No.12的A327位置的丙氨酸突变为T产生酶活性改良的酶。本领域技术人员基于本发明提供的信息可以产生进一步的或者备选的突变。

本发明特别优选的实施方案是指这样的微生物和方法，其中谷氨酸棒杆菌中戊糖磷酸途径的酶的活性和量通过用强启动子、优选P_SOD启动子置换谷氨酸棒杆菌的转酮醇酶基因之前的内源启动子而增加。在这个实施方案中，转酮醇酶可进一步具有这样的突变，其提供与前述A293R和/或A327T突变相同的作用。

或者和/或此外，葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶基因可具有这样的突变，其提供与上述转酮醇酶A293R和A327T突变相似的作用。这些突变可以在但不限于在相应于SEQ ID No.2的第243位、和/或第261位、和/或第288位、和/或第289位、和/或第371位。这些位置可以被突变，由此所得蛋白质具有除了A243、A261、Q288、L289、V371之外的其他氨基酸，例如但不限于T243、P261、A288、R289、A371。

在本发明这个优选实施方案的进一步描述中，谷氨酸棒杆菌中6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和活性增加。所述量优选通过使用强启动子而增加，所述强启动子优选是P_SOD。所述活性通过在6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶基因的编码序列中导入突变而增加，所述突变提供与上述转酮醇酶中A293R和A327T突变相似的作用。在6-磷酸葡糖酸脱氢酶(SEQ ID No.6)中，相应于SEQ ID No.6的第150、209、269、288、329、330和/或353位的氨基酸可以被突变，由此所得蛋白质具有除了P150、R209、R269、A288、D329、V330、S353之外的其他氨基酸，例如但不限于150S、209P、269K、288R、329G、330L、353F。

本领域技术人员已知怎样在例如谷氨酸棒杆菌的内源序列中导入这种点突变。这可以例如通过将编码突变形式的转酮醇酶的修饰的核酸序列经染色体整合进谷氨酸棒杆菌中转酮醇酶的天然基因座中而实现。在原始基因座的染色体整合可以根据

A，et al.J Bacteriol.1994176(23)：7309-7319和WO2007011845所述方法实现。当然，也可以使用例如衍生自具有突变的编码大肠杆菌转酮醇酶的基因的序列。在这种情况中，所述突变应在相应于SEQ ID NO.12的例如第293和/或327位导入。

本发明因此一般性涉及在棒状细菌中增加甲硫氨酸合成的方法以及甲硫氨酸合成增加的棒状细菌。本发明的这两个方面均特征在于戊糖磷酸途径的酶的量和/或活性增加。就本发明的方法而言，棒状细菌中至少一种戊糖磷酸途径的酶的量和/或活性增加。就棒状细菌而言，本发明涉及戊糖磷酸途径的至少两种酶的量和/或活性增加。

在本发明优选的实施方案中，谷氨酸棒杆菌中戊糖磷酸途径的酶的量通过用强启动子、优选P_SOD启动子置换转酮醇酶基因之前的内源启动子而增加。在这个优选实施方案的进一步拓展中，另外增加6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量，这也可以通过使用强启动子而实现。在更优选的实施方案中，不仅要置换转酮醇酶基因之前的内源启动子，而且在转酮醇酶基因及任选葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶基因的编码序列中导入突变，所述突变另外增加这些酶的活性。本发明这个优选方面的进一步拓展包括这样的特征，即谷氨酸棒杆菌中6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量通过例如用强启动子、优选P_SOD启动子置换6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶内源启动子而增加，并且6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的活性通过导入上述突变而增加。这些优选的遗传变异可以导入谷氨酸棒杆菌的任何菌株中。如果使用野生型菌株，可以优选ATCC13032。然而在一些实施方案中，优选使用已经被认为是甲硫氨酸生产菌株的菌株，如DSM17322。进一步优选的菌株包括如上述遗传变异类型，即metY、metA、metH、hsk^fbr、ask^fbr和hom^mutated增加。具有相应遗传变异的谷氨酸棒杆菌菌株是例如M2014。这种菌株可以通过mcbR调节子缺失、metQ的负调节以及metF表达的增加而被进一步改良。反映相应遗传变异的菌株是OM469。

下表1示出不同生物体的戊糖磷酸途径的酶的Genebank登记号。表2提供了上述不同生物体的一些其他酶的Genebank登记号。

表1：戊糖磷酸途径的酶

酶	Genebank登记号	生物体
酶	Genebank登记号	生物体	葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶	Cgl1576，BAB98969，NCgl1514，NCgl1514，cg1778，CE1696，DIP1304，jk0994，RHA1_ro07184，nfa35750，MSMEG_3101，Mmcs_2412，MAP1176c，Mb1482c，MT1494，Rv1447c，SAV6313，Acel_1124，SCO1937，MAV_3329，Lxx11590，BL0440，Arth_2094，Tfu_2005，itte weitere angeben	谷氨酸棒杆菌及其它
OPCA蛋白	Cgl1577，NP_738307.1，NP_939658.1，YP_250777.1，YP_707105.1，YP_119788.1，ZP_01192082.1，NP_335942.1，ZP_01276169.1，NP_215962.1，ZP_01684361.1，YP_887415.1，ZP_01130849.1，YP_062111.1，ZP_00615668.1，YP_953530.1，ZP00995403.1，YP_882512.1，NP_960109.1，YP_290062.1，YP_831573.1，NP_827488.1，YP_947837.1，NP_822945.1，NP_626203.1，NP_630735.1，CAH10103.1，ZP_00120910.2，NP_695642.1，YP_909493.1，YP_872881.1，YP_923728.1，YP_056265.1，ZP_01648612.1，ZP_01430762.1，ZP_00569428.1，YP_714762.1，YP_480751.1，NP_301492.1，YP_642845.1，ZP_00767699.1	谷氨酸棒杆菌及其它	葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶		谷氨酸棒杆菌及其它
OPCA蛋白		谷氨酸棒杆菌及其它	6-磷酸葡糖酸内酯酶	Cgl1578，NCgl1516，NCgl1516，cg1780，CE1698，DIP1306，Mmcs_2410，MSMEG_3099，Mb1480c，MT1492，Rv1445c，MAV_3331，RHA1_ro07182，nfa35770，MAP1174c，ML0579，jk0996，Tfu_2007，FRAAL4578，SAV6311，SCO1939，SCC22.21，TW464	谷氨酸棒杆菌及其它
6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶	Cgl1452，BAB98845，NCgl1396，cgl1452，NCgl1396，cg1643，DIP1213，CE1588，jk0912，RHA1_ro07246，nfa11750，Mmcs_2812，MSMEG_3632，MT1892，Rv1844c，MAV_2871，MAP1557c，ML2065，SAV724，SCO0975，SCBAC19F3.02，BL0444，Lxx17380，Arth_2449，Mb1875c，OB0185Bitte weitere angeben	谷氨酸棒杆菌及其它	6-磷酸葡糖酸内酯酶		谷氨酸棒杆菌及其它
6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶		谷氨酸棒杆菌及其它	核酮糖-5-P-差向异构酶	Cgl1598，cg1801，CE1717，DIP1320，MSMEG_3066，Mb1443，MT1452，Rv1408，MAV_3370，ML0554，jk1011，MAP1135，RHA1_ro07167，Mmcs_2385，nfa36030，SCO1464，SAV6880，FRAAL5223，Acel_1276，BL0753	谷氨酸棒杆菌及其它
核糖-5-P-异构酶	Cgl2423，cg2658，CE2318，DIP1796，nfa13270，jk0541，RHA1_ro01378，MSMEG_4684，Mmcs_3599，Mb2492c，Rv2465c，MT2540，ML1484，MAV_1707，MAP2285c，SCO2627，SAV5426，Tfu_2202，Arth_2408，PPA1624，Francci3_1162	谷氨酸棒杆菌及其它	核酮糖-5-P-差向异构酶		谷氨酸棒杆菌及其它
核糖-5-P-异构酶		谷氨酸棒杆菌及其它	转酮醇酶	Cgl1574，YP_225858，cg1774，CE1694，DIP1302，jk0992，nfa35730，RHA1_ro07186，MSMEG_310	谷氨酸棒杆菌及其它

	3，MAP1178c，ML0583，MAV_3327，Mb1484c，MT1496，Rv1449c，Mmcs_2414，Tfu_2002，Arth_2097，Lxx11620，SAV1766，SCO1935，Acel_1127
			转醛醇酶	Cgl1575，cg1776，CE1695，DIP1303，jk0993，Mmcs_2413，MSMEG_3102，MAP1177c，RHA1_ro07185，MAV_3328，Mb1483c，Rv1448c，MT1495，nfa35740，ML0582，Arth_2096，Lxx11610，SAV1767，Tfu_2003，SCO1936，Francci3_1648	谷氨酸棒杆菌及其它

表2：生产甲硫氨酸的生物体的酶

酶	Genebank登记号	生物体
酶	Genebank登记号	生物体	亚甲基四氢叶酸还原酶(metF)	Cgl2171，CE2066，cg2383，DIP1611，jk0737，RHA1_ro01105，nfa17400，Tfu_1050，Acel_0991，SAV6100，SCO2103，FRAAL2163，Francci3_1389，aq_1429，TTC1656，TTHA0327，ELI_10095，CT1368，Sala_0035，DP1612，Pcar_1732	谷氨酸棒杆菌及其它
cob(I)丙氨酸依赖性甲硫氨酸合酶(metH)	Cgl1507，CE1637，cg1701，DIP1259，RHA1_ro00859，nfa31930，Rv2124c，Mb2148c，ML1307，SCO1657，Tfu_1825，SAV6667，Arth_3627，Acel_1174，MT2183，GOX2074，tll1027，GbCGDNIH1_0151，Rru_A1531，alr0308，slr0212	谷氨酸棒杆菌及其它	亚甲基四氢叶酸还原酶(metF)		谷氨酸棒杆菌及其它
cob(I)丙氨酸依赖性甲硫氨酸合酶(metH)		谷氨酸棒杆菌及其它	O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(metY)	Cgl0653，NCgl0625，cg0755，CE0679，DIP0630，jk1694，MAP3457，Mb3372，MT3443，Rv3340，nfa35960，Lxx18930，Tfu_2823，CAC2783，GK0284，BH2603，lmo0595，lin0604，LMOf2365_0624，ABC0432，TTE2151，BT2387，STH2782，str0987，stu0987，BF1406，SH0593，BF1342，lp_2536，L75975，OB3048，BL0933，LIC11852，LA2062，BMAA1890，BPSS0190，SMU.1173，BB1055，PP2528，PA5025，PBPRB1415，GSU1183，RPA2763，WS1015，TM0882，VP0629，BruAb1_0807，BMEI1166，BR0793，CPS_2546，XC_1090，XCC3068，plu3517，PMT0875，SYNW0851，Pro0800，CT0604，NE1697，RB8221，bll1235，syc1143_c，ACIAD3382，ebA6307，RSc1562，Daro_2851，DP2506，DR0873，MA2715，PMM0642，PMN2A_0083，IL2014，SPO1431，ECA0820，AGR_C_2311，Atu1251，mlr8465，SMc01809，CV1934，SPBC428.11，PM0738，SO1095，SAR11_1030，PFL_0498，CTC01153，BA_0514，BCE5535，BAS5258，GBAA5656，BA5656，BCZK5104，TTHA0760，TTC0408，BC5406，BT9727_5087，HH0636，YLR303W，ADL031W，CJE1895，spr1095，rrnAC2716，orf19.5645，Cj1727c，VNG2421G，PSPPH_1663，XOO1390，Psyr_1669，PSPTO3810，MCA2488，TDE2200，FN1419，PG0343，Psyc_0792，MS1347，CC3168，Bd3795，MM3085，389.t00003，NMB1609，SAV3305，NMA1808，GOX1671，APE1226，	谷氨酸棒杆菌及其它

	XAC3602，NGO1149，ZMO0676，SCO4958，lpl0921，lpg0890，lpp0951，EF0290，BPP2532，CBU2025，BP3528，BLi02853，BL02018，BG12291，CG5345-PA，HP0106，ML0275，jhp0098，At3g57050，107869，HI0086，NTHI0100，SpyM3_0133，SPs0136，spyM18_0170，M6_Spy0192，SE2323，SERP0095，SPy0172，PAB0605，DDB0191318，ST0506，F22B8.6，PTO1102，CPE0176，PD1812，XF0864，SAR0460，SACOL0503，SA0419，Ta0080，PF1266，MW0415，SAS0418，SSO2368，PAE2420，TK1449，1491，TVN0174，PH1093，VF2267，Saci_0971，VV11364，CMT389C，VV3008
			天冬氨酸激酶(ask)	Cgl0251，NCgl0247，CE0220，DIP0277，jk1998，nfa3180，Mb3736c，MT3812，Rv3709c，ML2323，MAP0311c，Tfu_0043，Francci3_0262，SCO3615，SAV4559，Lxx03450，PPA2148，CHY_1909，MCA0390，cbdb_A1731，TWT708，TW725，Gmet_1880，DET1633，GSU1799，Moth_1304，Tcr_1589，Mfla_0567，HCH_05208，PSPPH_3511，Psyr_3555，PSPTO1843，CV1018，STH1686，NMA1701，Tbd_0969，NMB1498，Pcar_1006，Daro_2515，Csal_0626，Tmden_1650，PA0904，PP4473，Sde_1300，HH0618，NGO0956，ACIAD1252，PFL_4505，ebA637，Noc_0927，WS1729，Pcryo_1639，Psyc_1461，Pfl_4274，LIC12909，LA0693，Rru_A0743，NE2132，RB8926，Cj0582，Nmul_A1941，SYN_02781，TTHA0534，CJE0685，BURPS1710b_2677，BPSL2239，BMA1652，RSc1171，TTC0166，RPA0604，BTH_I1945，Bpro_2860，Rmet_1089，Reut_A1126，RPD_0099，Bxe_A1630，Bcep18194_A5380，aq_1152，RPB_0077，Rfer_1353，RPC_0514，BH3096，BLi02996，BL00324，amb1612，tlr1833，jhp1150，blr0216，Dde_2048，BB1739，BPP2287，BP1913，DVU1913，Nwi_0379，ZMO1653，Jann_3191，HP1229，Saro_3304，Nham_0472，CBU_1051，slr0657，SPO3035，Synpcc7942_1001，BG10350，BruAb1_1850，BAB1_1874，BMEI0189，BT9727_1658，syc0544_d，BR1871，gll1774，BC1748，mll3437，BCE1883，ELI_14545，RSP_1849，BCZK1623，BAS1676，BA_2315，GBAA1811，BA1811，Ava_3642，alr3644，PSHAa0533，AGR_L_1357，Atu4172，lin1198，BH04030，PMT9312_1740，SMc02438，CYA_1747，RHE_CH03758，lmo1235，LMOf2365_1244，PMN2A_1246，CC0843，Pro1808，BQ03060，PMT0073，Syncc9902_0068，GOX0037，CYB_0217	谷氨酸棒杆菌及其它
高丝氨酸琥珀酰转移酶(metA)	Cgl0652，CE0678，CE0678，cg0754，DIP0623，jk1695，nfa9220，RHA1_ro06236，MAP3458，MAV_4316，MSMEG_1651，Mmcs_1207，ML0682，Mb3373，Rv3341，M	谷氨酸棒杆菌及其它	天冬氨酸激酶(ask)		谷氨酸棒杆菌及其它

	T3444，Tfu_2822，Arth_1318，Francci3_2831，Lxx18950，FRAAL4363，Cag_1206，Adeh_1400，Plut_0593，CT0605，CHY_1903，Moth_1308，Ava_4076，STH1685，SRU_0480，Mbur_0798，Mhun_2201，RPC_4281Msp_0676
			高丝氨酸脱氢酶(hom)	Cgl1183，CE1289，cg1337，DIP1036，jk1352，nfa10490，RHA1_ro01488，MSMEG_4957，Mmcs_3896，MAV_1509，Mb1326，Rv1294，MT1333，MAP2468c，ML1129，SAV2918，SCO5354，FRAAL5951，Francci3_3725，Tfu_2424，Acel_0630	谷氨酸棒杆菌及其它
高丝氨酸激酶(hsk)	Cgl1184，cg0307，CE0221，DIP0279，jk1997，RHA1_ro04292，nfa3190，Mmcs_4888，MSMEG_6256，MAP0310c，MAV_0394，Mb3735c，MT3811，Rv3708c，Acel_2011，ML2322，PPA0318，Lxx03460，SCO2640，SAV5397，CC3485	谷氨酸棒杆菌及其它	高丝氨酸脱氢酶(hom)		谷氨酸棒杆菌及其它
高丝氨酸激酶(hsk)		谷氨酸棒杆菌及其它	D-甲硫氨酸结合脂蛋白(metQ)	YP_224930，NP_599871，NP_737241，NP_938985，NP_938984，YP_701727，YP_251505，YP_120623，YP_062481，YP_056445，ZP_00121548，NP_696133，YP_034633，YP_034633，YP_081895，ZP_00390696，YP_016928，YP_026579，NP_842863，YP_081895，ZP_00240243，NP_976671	谷氨酸棒杆菌及其它
mcbR	cg3253，CE2788，DIP2274，jk0101，nfa21280，MSMEG_4517Lxx16190，SCO4454，Bcep18194_A3587，Bamb_0404，Bcen2424_0499，Bcen_2606，Ava_4037，BTH_I2940，RHA1_ro02712，BMA10299_A1735，BMASAVP1_A0031，BMA2807，BURPS1710b_3614	谷氨酸棒杆菌及其它	D-甲硫氨酸结合脂蛋白(metQ)		谷氨酸棒杆菌及其它

上述登记号是Genebank(Genbank)的官方登记号，或者是在Genebank交叉参考的登记号的异名。这些编号可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/检索和发现。

下文提供了怎样增加和降低谷氨酸棒杆菌中多肽和基因的量和/或活性的综述。当进行本发明实施方案时，本领域技术人员除了下文实施例中揭示的那些信息之外，还可以利用这个信息。

增加或者导入所述量和/或活性

对于增加所述量，可以分为两种基本情况。在第一种情况中，所述酶的量通过表达外源形式的相应蛋白质而增加。在另一种情况中，增加内源蛋白质的表达，这通过影响例如启动子和/或增强子核糖体结合位点元件的活性和/或调节转录、翻译或者翻译后水平的相应蛋白质的活性的其他调节活性而实现。

因此，蛋白质的活性和量的增加可以通过不同途径实现，例如通过关闭在转录、翻译和蛋白质水平的抑制性调节机制，或者通过与起始生物体相比增加编码这些蛋白质的核酸的基因表达，例如通过强启动子诱导内源转酮醇酶和/或通过导入编码转酮醇酶的核酸。

在一个实施方案中，表1或表2的酶的量和/或活性的增加通过将编码表1或表2的酶的核酸导入棒状细菌、优选谷氨酸棒杆菌中而实现。

原则上，可以使用具有表1或2列出的蛋白质的酶活性的不同生物体的每种蛋白质。由于来自真核来源的这种酶的基因组核酸序列含有内含子，已经加工的核酸序列如相应的cDNA被用于当宿主生物不能剪接或者不能被变成能剪接相应mRNA的情况中。本文描述中提及的所有核酸可以是例如RNA、DNA或者cDNA序列。

根据本发明，增加或者导入蛋白质的量通常包含如下步骤：

a)产生以5′-3′方向包含如下核酸序列、优选DNA序列的载体：

-在本发明生物体中起作用的启动子序列

-与编码例如表1所示蛋白质的DNA序列可操纵地连接的核酸序列、其功能同系物、功能片段或者功能突变形式

-在本发明的生物体中起作用的终止序列

b)将步骤a)的载体转移进本发明的生物体如谷氨酸棒杆菌中，并且任选整合进相应基因组中。

如上所述，功能片段是编码例如表1或2所示酶的核酸序列的片段，其表达仍产生具有相应全长蛋白质的酶活性的蛋白质。

上述方法可用于增加编码例如表1所示酶的DNA序列或者其功能片段的表达。包含调节序列如启动子和终止序列的这种载体的应用为本领域技术人员所已知。此外，本领域技术人员已知步骤a)的载体可以怎样转移进生物体如谷氨酸棒杆菌中，以及载体必须具备的性质怎样能整合进其基因组中。

根据本发明，应理解编码表1或2的酶的核酸的基因表达的增加也是对生物体、特别是谷氨酸棒杆菌的相应内源酶表达进行操纵。这可以例如通过改变编码这些酶的基因的启动子DNA序列而实现。导致这些酶的表达速度改变、优选增加的这种改变可以通过用强启动子置换以及通过缺失和/或插入DNA序列而实现。

内源基因的启动子序列的改变通常导致基因的表达量的改变，以及因此在细胞或者生物体中可检测的活性的改变。

此外，内源基因的改变和增加的表达分别可以通过在转化的生物体中不存在的且与这些基因的启动子相互作用的调节蛋白实现。这种调节子可以是由DNA结合结构域和转录激活物结构域组成的嵌合蛋白，例如在WO 96/06166中描述。

增加内源基因的活性和含量的进一步的可能性是通过过表达正调节参与内源基因转录的转录因子。过表达转录因子的方法为本领域技术人员所已知。

如表1所示那些内源酶的表达可以通过特异性结合基因的启动子序列的适配子的表达而调节。根据适配子结合刺激或者抑制启动子区域，例如表2所示酶的量可以增加。

此外，内源基因活性的改变可以通过靶向诱变内源基因拷贝而实现。

编码例如表1所示酶的内源基因的改变也可以通过影响酶的翻译后修饰而实现。这可以例如通过通过相应的措施如过表达或者基因沉默调节参与酶翻译后修饰的酶如激酶或者磷酸酶的活性而发生。

在另一实施方案中，可以改良酶的效力或者其变构控制区破坏，由此防止化合物产生的反馈抑制作用。相似地，降解酶可以通过取代、缺失或者添加而可以被缺失或者修饰，由此其对于表1的希望的酶的降解活性降低，而不削弱细胞的存活力。在每种情况中，甲硫氨酸的总产量、生产速度或者量均增加。

也可能的是例如表1的蛋白质中这种改变可以改良其他精细化学品的产生，如其他含硫化合物如半胱氨酸或者谷胱甘肽、其他氨基酸、维生素、辅因子、保健食品、核酸、核苷和海藻糖。任一种化合物的代谢可以与细胞中其他生物合成和降解途径相纠结，并且一种途径中的必需辅因子、中间体或者底物可以由另一这种途径提供或者限制。因此，通过调节表1的一或多种蛋白质的活性，可以正向影响除了甲硫氨酸之外的其他精细化学品生产的量、效力和速度。

增加或者导入表1的酶的量和/或活性的前述策略不是限制性的，本领域技术人员可以对这些策略加以改变。

降低酶的量和/或活性

上文示出优选使用已经针对甲硫氨酸的生产而优化的起始生物体。在谷氨酸棒杆菌中，可以例如负调节metQ的活性。

为了降低酶的量和/或活性，可以利用各种策略。

如表2所示的那些内源酶的表达可以通过特异性结合基因启动子序列的适配子的表达而调节。根据所述适配子结合刺激或者抑制启动子区域，在这种情况中表2所示酶的量和活性可以被降低。

适配子也可以这样的方式设计，由此其特异性结合自身的酶并且通过例如结合相应酶的催化中心而降低所述酶的活性。适配子的表达通常通过基于载体的过表达而实现(见上述)，适配子的设计和选择为本领域技术人员所熟知(Famulok et al.，(1999)Curr Top Microbiol Immunol.，243，123-36)。

此外，表2所示内源酶的量和活性的降低可以通过各种实验方法实现，这些方法为本领域技术人员所熟知。这些方法通常概括为术语“基因沉默”。例如，通过将具有编码酶或其一部分的DNA序列的上述载体以反义方向转移进生物体如谷氨酸棒杆菌中而可以使内源基因的表达沉默。这基于这样的事实，即细胞中这种载体的转录产生RNA，所述RNA可以与内源基因转录的mRNA杂交并因此阻止其翻译。

原则上，反义策略可以与核酶方法结合。核酶是催化活性的RNA序列，如果其与反义序列结合，则催化性裂解靶序列(Tanner et al.，(1999)FEMS Microbiol Rev.23(3)，257-75)。这可以增强反义策略的效力。

为了产生同源重组微生物，制备这样的载体，其含有至少一部分编码表1所示酶的基因，其中已经导入缺失、添加或者取代，从而改变例如内源基因的功能性破坏。

在一个实施方案中，设计这样的载体，由此在同源重组时，内源基因被功能性破坏(即不再编码功能性蛋白质)。或者，可以设计这样的载体，由此在同源重组时，内源基因被突变或者另外改变，但是仍编码功能性蛋白质，例如可以改变上游调节区，从而改变例如表2所示内源酶的表达。这种方法可具有这样的优势，即酶的表达不被完全消除，而是降低为需要的最小水平。技术人员已知载体可用于置换或者缺失内源序列。对于谷氨酸棒杆菌，这种载体包括pK19和pCLIK int sacB。下文提供了关于破坏谷氨酸棒杆菌中染色体序列的详尽描述。

此外，通过减少转录因子的量而可以进行基因抑制。

抑制靶蛋白自身的因子也可以导入细胞中。蛋白质结合因子可例如是上述适配子(Famulok et al.，(1999)Curr Top Microbiol Immunol.243，123-36)。

作为进一步的蛋白质结合因子，其表达可以导致表1所示酶的量和/或活性降低，可以认为是酶特异性抗体。重组酶特异性抗体如单链抗体的产生为本领域所已知。抗体的表达也可从文献中获知(Fiedler et al.，(1997)Immunotechnology 3，205-216；Maynard and Georgiou(2000)Annu.Rev.Biomed.Eng.2，339-76)。

所述技术为本领域技术人员所熟知。因此，技术人员也已知用于例如反义方法的核酸构建体必须具备的典型大小以及相应核酸序列必须具备的互补性、同源性或者相同性。术语互补性、同源性和相同性为本领域技术人员所已知。

术语互补性描述了核酸分子与另一核酸分子优于两个互补碱基之间的氢键而杂交的能力。本领域技术人员已知两个核酸分子非必须呈现100％互补性以能彼此杂交。与另一核酸序列杂交的核酸序列优选与所述其他核酸序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、优选至少70％、特别优选至少80％、特别优选至少90％、特别优选至少95％以及最优选至少98或者100％互补性。

反义序列与内源mRNA序列的杂交典型在体内在细胞条件下或者在体外发生。根据本发明，在对于保证特异性杂交足够的严格条件下进行体内或者体外杂交。

严格的体外杂交条件为本领域技术人员所已知，且可从文献中获得(见例如Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Press(2001))。术语“特异性杂交”是指这样的情况，其中如果核酸序列是例如DNA或者RNA分子的复合混合物的一部分，某分子在严格条件下优先与该核酸序列结合。

术语“严格条件”是指在此条件下，核酸序列优先结合靶序列，但是不与其他序列结合或者结合程度至少显著降低。

严格条件依赖于环境而定。较长的序列在较高温度特异杂交。通常地，可以这样选择严格条件，由此杂交温度在指定离子浓度和指定pH值条件下低于特定序列解链点(Tm)大约5℃。Tm是与靶序列互补的分子有50％与所述靶序列杂交的温度(在指定pH值、指定离子浓度和指定核酸浓度下)。典型地，严格条件包含盐浓度在0.01至1.0M钠离子之间(或者另一种盐离子)，pH值在7.0-8.3之间。对于短分子，温度为至少30℃(例如对于包含10-50个核酸的这种分子而言)。此外，严格条件可包含加入去稳定化剂，例如甲酰胺。典型的杂交和洗涤缓冲液是如下成分的缓冲液。

预杂交溶液：

0.5％SDS

5x SSC

50mM NaPO₄，pH6.8

0.1％焦磷酸钠

5x Denhardt′s试剂

100μg/鲑精

杂交溶液：预杂交溶液

1x10⁶cpm/ml探针(5-10分钟，95℃)

20x SSC：3M NaCl

0.3M柠檬酸钠

用HCl调节pH为pH7

50x Denhardt′s试剂：5g Ficoll

5g聚乙烯吡咯烷酮

5g牛血清白蛋白

ad 500ml A.dest.

典型杂交程序如下所述：

任选：将印迹在1x SSC/0.1％SDS中在65℃洗涤30分钟

预杂交：在50-55℃至少2小时

杂交：在55-60℃过夜

洗涤：在2x SSC/0.1％SDS中洗涤0.5分钟min

杂交温度

30分钟 2x SSC/0.1％SDS

杂交温度

30分钟 1x SSC/0.1％SDS

杂交温度

45分钟 0.2x SSC/0.1％SDS 65℃

5分钟 0.1x SSC 室温

对于反义目的，100个核酸、80个核酸、60个核酸、40个核酸以及20个核酸的序列长度互补性可满足需要。较长的核酸长度当然也可以。组合应用上述方法也是可行的。

根据本发明，如果使用以5′-3′方向与生物体中活性的启动子可操纵地连接的DNA序列，则通常可以这样构建载体，即在转移进生物体的细胞之后，使得编码序列过表达或者导致内源核酸序列及从中表达的蛋白质的抑制或者竞争和阻断。

特定酶的活性也可以通过在生物体中过表达其非功能性突变体而降低。因此，不能催化所述反应但是能结合例如底物或辅因子的非功能性突变体可以通过过表达而竞争超过(out-compete)内源酶并因此抑制该反应。降低宿主细胞中酶的量和/或活性的进一步的方法为本领域技术人员所熟知。

根据本发明，非功能性酶分别具有与功能性酶及其功能性片段基本相同的核酸序列和氨基酸序列，但是在一些位置具有核酸或者氨基酸的点突变、插入或者缺失，其具有非功能性酶不具备的或者非常有限程度的能催化相应反应的能力。这些非功能性酶可以不与仍能催化相应反应但是不再被反馈调节的酶混合。根据本发明，术语“非功能性酶”不包含这样的蛋白质，即在氨基酸水平和核酸水平与相应的功能性酶不具有相当大的(substantial)序列同源性的蛋白质。因此，不能催化相应反应且与相应酶不具备相当大的序列同源性的蛋白质不被定义为本发明术语“非功能性酶”。在本发明范围内，非功能性酶也被称作失活的酶。

因此，例如具有上述点突变、插入和/或缺失的本发明表2所示的非功能性酶的特征在于与本发明表2所示野生型酶或者其功能等价部分的序列有相当大的同源性。为了确定相当大的序列同源性，应用上述相同性级别。

载体和宿主细胞

本发明的一方面涉及含有上述核酸序列的载体，优选表达载体。如本文所用，术语“载体”是指能转运与其连接的另一核酸的核酸分子。

一种类型的载体是“质粒”，是指环状双链DNA环，其中可以连接另外的DNA节段。另一类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA节段可以连接在病毒基因组中。

某些载体在所导入的宿主细胞中能自主复制(例如具有细菌复制起源的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体在导入宿主细胞中时被整合进宿主细胞基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能指导与其可操纵地连接的基因的表达。

这种载体在本文被称作“表达载体”。

通常地，重组DNA技术中表达载体的使用通常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，质粒是载体最常用的形式。然而，本发明还包括发挥等价功能的其他形式表达载体，如病毒载体。

本发明的重组表达载体可包含适于相应核酸在宿主细胞中表达形式的上述核酸，这意味着重组表达载体包含基于用于表达的宿主细胞选择的一或多个调节序列，其与被表达的核酸序列可操纵地连接。

对于本发明，可操纵地连接是指启动子、编码序列、终止子以及任选进一步的调节元件以这样的方式相继排列，由此当表达编码序列时，每个调节元件根据其决定可以完成其功能。

在重组表达载体中，“可操纵地连接”是指感兴趣的核酸序列与调节序列以使得核酸序列的表达这样的方式连接(例如在体外转录/翻译系统中或者当载体被导入宿主细胞中时在宿主细胞中)。术语“调节序列”是指包括启动子、阻抑物结合位点、激活物结合位点、增强子和其他表达控制元件(例如终止子或者mRNA二级结构的其他元件)。这种调节序列在例如Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。调节序列包括指导核酸序列在许多类型宿主细胞中组成型表达的那些序列，以及指导核酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些序列。优选的调节序列是例如启动子，如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-、tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、arny、SP02、SOD、EFTu、EFTs、GroEL、MetZ(均得自谷氨酸棒杆菌)，其优选用于细菌中。也可以使用人工启动子。本领域技术人员意识到表达载体的设计可根据这样的因素而定，如被转化的宿主细胞的选择、希望的蛋白质的表达水平等。本发明的表达载体可以被导入宿主细胞中，从而产生由上述核酸序列编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或者肽。

原核生物中蛋白质的表达通常使用含有组成型或者可诱导启动子的载体进行，所述启动子指导融合或者非融合蛋白的表达。

融合载体在编码的蛋白质加入一些氨基酸，通常在重组蛋白的氨基酸末端加入氨基酸，但是也可以在C末端加入氨基酸或者融合在蛋白质的合适区域中。这种融合载体典型提供四种用途：1)增加重组蛋白的表达，2)增加重组蛋白的溶解性，3)通过在亲和纯化中起配体作用帮助重组蛋白的纯化，4)为随后的蛋白质检测提供“标记”。在融合表达载体中，通常在融合部分与重组蛋白的结合处导入蛋白酶解位点，使得在纯化融合蛋白之后重组蛋白可以与融合部分分离。这种酶及其关联识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。

典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.and Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或者蛋白质A。

棒状细菌的合适的可诱导的非融合表达载体包括pHM1519、pBL1、pSA77或者pAJ667(Pouwels et al.，eds.(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。举例的合适的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌穿梭载体是例如pK19、pClik5aMCS pCLIKint sacB，或者可见于Eikmannset al(Gene.(1991)102，93-8)以及在如下出版物和专利申请中描述(A，et al.J Bacteriol.1994 176：7309-7319，Bott，M.and Eggeling，L.，eds.Handbook of Corynebacterium glutamicum CRC Press LLC，Boca Raton，FLWO2006069711，WO2006069711)。原核细胞和真核细胞的其他合适表达系统见Sambrook，J.et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，2003的第16和17章所述。

载体DNA可以通过常规的转化或者转染技术导入原核细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”、“接合”和“转导”是指本领域公认的将外源核酸(例如线性DNA或者RNA(例如线性化载体或者无载体的单独基因构建体)，或者以载体形式将核酸(例如质粒、噬菌体、质粒、噬菌粒、转座子或者其他DNA)导入宿主细胞中的各种技术方法，包括磷酸钙或者氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂染、天然感受态(naturalcompetence)、化合物介导的转移或者电穿孔等方法。转化或者转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A LaboratoryManual.3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2003)及其它实验指导。

为了鉴别和选择这些整合体，编码可选择的标记(例如抗生素抗性)的基因通常与感兴趣的基因一起被导入宿主细胞中。优选的可选择标记包括赋予药物抗性的那些标记，如G418、潮霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素和氨甲喋呤。编码可选择的标记的核酸可以在与编码上述修饰的核酸序列相同的载体上被导入宿主细胞中，或者可以在单独的载体上导入。用导入的核酸稳定转染的细胞可以通过药物选择鉴别(例如掺入可选择的标记基因的细胞将存货，而其他细胞死亡)。

在另一实施方案中，可以产生重组微生物，其含有可以调节导入的基因表达的选择的系统。例如，置于lac操纵子控制的包含上述核酸序列之一的载体使得所述基因仅在存在IPTG的条件下表达。这种调节系统为本领域所熟知。

本发明另一方面涉及其中已经导入本发明重组表达载体的生物体或者宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可互换使用。应理解这个术语不仅是指特定细胞，而且也包括这种细胞的后代或者潜在后代。由于突变或者环境影响而在后续的世代中可以出现某些修饰，因此这种后代事实上与亲代细胞也许不同，但是仍包含在本文所用术语的范围内。

谷氨酸棒杆菌的生长-培养基和培养条件

下文提供了培养谷氨酸棒杆菌的一般教导。技术人员可以对其加以修改。相应信息可以得自培养大肠杆菌的标准教科书。

遗传修饰的棒状细菌通常在合成的或者天然的生长培养基中培养。本领域熟知且可易于获得棒状细菌的许多不同的生长培养基(Lieb et al.(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.，32：205-210；von der Osten et al.(1998)Biotechnology Letters，11：11-16；Patent DE 4,120,867；Liebl(1992)″The GenusCorynebacterium，in：The Procaryotes，Volume II，Balows，A.et al.，eds.Springer-Verlag)。

这些培养基由一或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和痕量元素组成。优选的碳源是糖，如单糖、二糖或者多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或者纤维素用作非常良好的碳源。

也可以通过复合的化合物如糖蜜或者糖精炼的其他副产物为培养基提供糖。提供不同碳源的混合物也是有利的。其他可能的碳源是醇和有机酸，如甲醇、乙醇、乙酸或者乳酸。氮源通常是有机或者无机氮化合物，或者含有这些化合物的材料。举例的氮源包括氨气或者铵盐，如NH₄Cl或者NH₄)₂SO₄、NH₄OH、硝酸盐、尿素、氨基酸或者复合的氮源如玉米浸液、大都浸液、大豆蛋白、酵母提取物、肉提取物等。

培养基中可包含的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或者硫酸盐。螯合化合物可以加入培养基中以保持溶液中的金属离子。特别有用的螯合化合物包括二羟基酚，如邻苯二酚或者protocatechuate，或者有机酸，如柠檬酸。培养基典型还含有其他生长因子，如维生素或者生长启动子，例如包括生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐通常源自复合培养基成分，如酵母提取物、糖蜜、玉米浸液等。培养基化合物的精确成分主要依赖于即时实验，且根据每个特殊情况而单独确定。关于培养基优化的信息可见于Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach(Eds.P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)pp.53-73，ISBN 0 19 963577 3。也可以从商业供应商中选择生长培养基，如标准1(Merck)或者BHI(grain heartinfusion，DIFCO)等。

所有培养基成分均应被灭菌，通过加热(在1.5bar和121℃加热20分钟)或者通过过滤灭菌。所述成分可以一起灭菌或者如果需要时单独灭菌。

所有培养基成分在生长开始时即可存在，或者其可以任选连续或者分批加入。培养条件根据每个实验单独确定。

培养温度应在15℃至45℃之间。在实验期间温度可以保持恒定或者可以改变。培养基的pH值可以在5-8.5范围内，优选大约7.0，且可以通过向培养基中加入缓冲液而维持。为此目的的实验缓冲液是磷酸钾缓冲液。合成的缓冲液如MOPS、HEPES、ACES等可以交替或者同时使用。也可以通过在生长期间加入NaOH或NH₄OH以维持恒定培养pH值。如果利用复合培养基成分如酵母提取物，由于许多复合化合物具有高缓冲能力而减少了加入缓冲液的必要性。如果利用发酵罐培养微生物，也可以使用氨气控制pH。

保温时间通常是几小时至几天。选择这个时间用以在肉汤中积聚最大量的产物。可以在各种容器中进行所述生长实验，例如在不同大小的微滴定平板、玻璃试管、玻璃烧瓶或者玻璃或金属发酵罐中进行实验。为了筛选大量的克隆，微生物应在微滴定平板、玻璃试管或者有或无挡板的摇瓶中培养。优选地，使用100ml或者250ml摇瓶，充填10％(体积)的所需生长培养基。该摇瓶应在旋转摇床(振幅25mm)上使用100-300′rpm速度范围振荡。通过维持湿润大气环境消除蒸发损失；或者，应对蒸发损失进行数学校正。

如果检测遗传修饰的克隆，对于未修饰的对照克隆或者含有无任何插入体的基本质粒的对照克隆也应进行检测。将在琼脂平板上生长的细胞以OD600为0.5-1.5接种于培养基上，所述琼脂平板例如是已经在30℃保温的CM平板(10g/l葡萄糖，2.5g/l NaCl，2g/l尿素，10g/l多胨，5g/l酵母提取物，5g/l肉提取物，2g/l尿素，10g/l多胨，5g/l酵母提取物、5g/l肉提取物、22g/l琼脂，用2M NaOH将pH调节为pH6.8)。通过导入来自CM平板的谷氨酸棒杆菌细胞的盐水悬浮液或者加入这个细菌的液体预培养物完成培养基的接种。其他保温方法可见于WO2007012078所述。

一般方法

一般方法的方案可见于Handbook on Corynebacterium glutamicum，(2005)eds.：L.Eggeling，M.Bott.，Boca Raton，CRC Press，at Martin et al.(Biotechnology(1987)5，137-146)，Guerrero et al.(Gene(1994)，138，35-41)，Tsuchiya und Morinaga(Biotechnology(1988)，6，428-430)，Eikmanns et al.(Gene(1991)，102，93-98)，EP 0 472 869，US 4,601,893，Schwarzer and Pühler(Biotechnology(1991)，9，84-87，Reinscheid et al.(Applied and EnvironmentalMicrobiology(1994)，60，126-132)，LaBarre et al.(Journal of Bacteriology(1993)，175，1001-1007)，WO 96/15246，Malumbres et al.(Gene(1993)，134，15-24)，JP-A-10-229891，Jensen und Hammer (Biotechnology andBioengineering(1998)，58，191-195)，Makrides(Microbiological Reviews(1996)，60，512-538)WO2006069711，WO2007012078以及遗传和分子生物学领域的熟知教科书。

菌株、培养基和质粒

菌株可例如取自如下所列举的菌株：

谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，

醋谷氨酸棒杆菌ATCC 15806，

嗜醋酸棒状杆菌ATCC 13870，

热产氨棒状杆菌FERM BP-1539，

栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965，

黄色短杆菌ATCC 14067，

乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869，以及

叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020

或者已经衍生自其中的菌株如谷氨酸棒杆菌KFCC10065、DSM17322，或者

谷氨酸棒杆菌ATCC21608。

重组DNA技术

重组技术可见于：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.，inMolecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY，Vol.1，2，3以及Handbook on Corynebacteriumglutamicum(2005)eds.L.Eggeling，M.Bott.，Boca Raton，CRC Press。

氨基酸与甲硫氨酸中间体的量化

该分析利用具有guard cartridge和Synergi 4μm柱(MAX-RP 80

150*4.6mm)(Phenomenex，Aschaffenburg，Germany)的HPLC(Agilent 1100，Agilent，Waldbronn，Germany)进行。在注射之前，使用o-邻苯二甲醛(OPA)和巯基乙醇作为还原剂(2-MCE)衍生被分析物。此外，将巯基基团用碘乙酸封闭。以1ml/分钟流速进行分离，使用40mM NaH₂PO₄(洗脱液A，pH＝7.8，用NaOH调节)作为极性相，甲醇水混合物(100/1)作为非极性相(洗脱液B)。应用如下梯度：起始0％B、39分钟39％B、70分钟64％B、3.5分钟100％B、2分钟0％B以平衡。在室温的衍生化如下文所述自动进行。最初将于N-二羟乙基甘氨酸(0.5M，pH8.5)中0.5μl的0.5％ 2-MCE与0.5μl细胞提取物混合。随后，加入1.5μl的于N-二羟乙基甘氨酸(0.5M，pH8.5)中的50mg/ml碘乙酸，随后加入2.5μl N-二羟乙基甘氨酸缓冲液(0.5M，pH8.5)。通过加入0.5μl的溶解于1/45/54v/v/v的2-MCE/MeOH/N-二羟乙基甘氨酸(0.5M，pH8.5)中的10mg/ml OPA试剂进行衍生化。最后，将该混合物用32μl H₂O稀释。在上述每次移液步骤之间，等待时间为1分钟。然后将37.5μl总体积注射到柱上。注意如果在样品制备期间(例如等待时间内)和之后定期清洁自动取样针，则可以显著改善分析结果。通过荧光检测仪进行检测(340nm激发波长，450nm发射波长，Agilent，Waldbronn，Germany)。为了进行量化，α-氨基丁酸(ABA)作为内部标准。

重组方案的定义

在下文描述了实施上述发现可以构建具有增加的甲硫氨酸生产效率的谷氨酸棒杆菌菌株。在描述菌株的构建之前，提供了用于下文中的重组事件/方案的定义。

如本文所用，“Campbell in”是指原始宿主细胞的转化体，其中完整环状双链DNA分子(例如基于pCLIK int sacB或pK19的质粒)已经通过一次同源重组事件(交换事件(cross-in event))整合进染色体中，并且有效地导致所述环状DNA分子的线性化形式插入染色体的第一DNA序列中，其与所述环状DNA分子的第一DNA序列同源。“Campbelled in”是指已经整合进“Campbell in”转化体染色体中的线性化DNA序列。“Campbellin”含有第一同源DNA序列的重复，其每个拷贝均包括并围绕同源重组交换点的一个拷贝。所述名称来自Professor Alan Campbell，其首次提出这种重组。

如本文所用，“Campbell out”是指源于“Campbell in”转化体的细胞，其中在“Campbelled in”DNA的线性化插入的DNA上包含的第二DNA序列与染色体来源的第二DNA序列之间发生第二次同源重组事件(cross out事件)，所述染色体来源的第二个DNA序列与所述线性化插入物的第二DNA序列同源，所述第二次重组事件导致一部分整合的DNA序列缺失(jettisoning)，但是重要的是也导致一部分(可以是一个碱基那样小)整合的Campbelled in DNA保留在染色体中，由此与原始宿主细胞相比，“Campbell out”细胞在染色体中含有一或多个有意改变(例如单碱基取代、多碱基取代、异源基因或者DNA序列的插入、同源基因或者修饰的同源基因的一个或多个额外拷贝的插入、包含一个以上上文列举的这些前述实施例的DNA序列的插入)。

“Campbell out”细胞或菌株通常但非必需通过对基因反选择而获得，所述基因包含于“Campbelled in”DNA序列部分中(希望jettisoned的那部分)，例如枯草芽孢杆菌sacB基因，当其在存在大约5％-10％蔗糖条件下生长的细胞中表达时是致死的。使用或者不使用反选择方法，通过使用任何可筛选的表型筛选希望的细胞均可以获得或者鉴别希望的“Campbell out”细胞，可筛选的表型例如但不限于菌落形态、菌落颜色、抗生素抗性的存在与否、聚合酶链反应的指定DNA序列的存在与否、营养缺陷型的存在与否、酶的存在与否、菌落核酸杂交、抗体筛选等。术语“Campbell in”和“Campbell out”在不同语法状态下也可以用作动词，是指上述方法和过程。

应理解导致“Campbell in”或者“Campbell out”的同源重组事件可以在同源DNA序列中的一系列DNA碱基发生，且由于同源序列在这个范围至少部分彼此相同，因此通常不可能精确说明发生的交换事件。换句话说，不可能精确说明哪个序列源自插入的DNA，哪个序列源自染色体DNA。此外，第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常由部分非同源性区域分隔，正是这种非同源性区域被保留在“Campbell out”细胞染色体中。

为了实用，在谷氨酸棒杆菌中，典型的第一和第二同源DNA序列的长度为至少大约200个碱基对，且长度可直至几千个碱基对。然而，所述方法可以使用更短或更长的序列。例如，第一和第二同源序列的长度可以是大约500-2000个碱基，从“Campbell in”中获得“Campbell out”可以通过使第一和第二同源序列长度接近相同而促进，优选长度相差少于200个碱基对，更优选较短的序列长度是较长序列长度的至少70％。关于Campbell in和out的描述可见于WO2007012078。

实施例

如下实验证实谷氨酸棒杆菌转酮醇酶的过表达怎样导致增加的甲硫氨酸产生。然而这些实施例不以任何方式限制本发明。

摇瓶实验和HPLC测定

使用标准糖蜜培养基(Molasses Medium)一式两份或者一式四份对菌株进行摇瓶实验。一升的糖蜜培养基含有：40g葡萄糖、60g糖蜜、20g(NH₄)₂SO₄、0.4g MgSO₄*7H₂O、0.6g KH₂PO₄、10g酵母提取物(DIFCO)、5ml的400mM苏氨酸、2mgFeSO₄.7H₂O、2mg的MnSO₄.H₂O以及50g CaCO₃(Riedel-de Haen)，用ddH₂O制成一升体积。用20％NH₄OH将pH调节为7.8，将20ml连续搅拌培养基(以保持CaCO₃悬浮)加入250ml带挡板的Bellco摇瓶中，将该摇瓶高压灭菌20分钟。在高压灭菌之后，每升基本培养基加入4ml的4B溶液(或者80μl/瓶)。所述4B溶液每升含有：0.25g盐酸硫胺素(维生素B1)、50mg氰钴维生素(维生素B12)、25mg生物素、1.25g盐酸吡多辛(维生素B6)，用12.5mM KPO₄、pH7.0缓冲以溶解生物素，随后过滤灭菌。将培养物在用Bioshield纸覆盖并且用橡胶带固定的带挡板的摇瓶中在New Brunswick Scientific floorshaker中在28℃或者30℃以200或者300rpm生长48小时。在24小时和/或48小时取样。通过离心除去细胞，随后用等体积的60％乙腈稀释上清，然后使用Centricon 0.45μm离心柱(spin columns)对所述溶液进行膜过滤。使用HPLC测定滤液的甲硫氨酸、甘氨酸加上高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸及其它指定氨基酸的浓度。

对于HPLC测定，将过滤的上清用0.45μm过滤的1mM Na₂EDTA以1∶100比率稀释，并且将1μl该溶液用OPA试剂(AGILENT)在硼酸盐缓冲液(80mM NaBO₃，2.5mM EDTA，pH10.2)中衍生化，并且注射到200×4.1mm Hypersil 5μ AA-ODS柱上，在装备G1321A荧光检测仪(AGILENT)的Agilent 1100系列HPLC上运行。激发波长为338nm，监测的发射波长为425nm。对氨基酸标准溶液进行层析，并用于确定各种氨基酸的保留时间和标准峰面积。有提供的附带软件包Chem Station用于仪器控制、数据获得和数据处理。硬件是HP Pentium 4计算机，其支持Microsoft WindowsNT 4.0，配置最新的Microsoft Service Pack(SP6a)。

实验1：M2014菌株的产生

谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13032用DNA A(也称作pH273)(SEQ IDNO：24)转化以及“Campbelled in”，产生“Campbell in”菌株。然后将“Campbell in”菌株“Campbelled out”，产生“Campbell out”菌株M440，其含有编码反馈抗性高丝氨酸脱氢酶的基因(hom^fbr)。所得高丝氨酸脱氢酶蛋白包含氨基酸变化，其中S393被改变为F393(称作HsdhS393F)。

随后将菌株M440用DNA B(也称作pH373)(SEQ ID NO：25)转化，产生“Campbell in”菌株。然后将所述“Campbell in”菌株“Campbelledout”，产生“Campbell out”菌株M603，其含有编码反馈抗性天冬氨酸激酶的基因(Ask^fbr)(由lysC编码)。在所得天冬氨酸激酶蛋白中，T311被改变为I311(称作LysC T311I)。

发现菌株M603产生大约17.4mM赖氨酸，而ATCC13032菌株产生不可测量的量的赖氨酸。此外，M603菌株产生大约0.5mM高丝氨酸，相比之下ATCC13032菌株产生不可测量的量的高丝氨酸，如表3所概述。

表3：由菌株产生的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的量

菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)
菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)	ATCC13032	0.0	0.4	0.0	0.0
M603	0.5	0.7	0.0	17.4	ATCC13032	0.0	0.4	0.0	0.0

将菌株M603用DNA C(也称作pH304)(SEQ ID NO：26)转化，产生“Campbell in”菌株，然后将其“Campbelled out”，产生“Campbellout”菌株M690。M690菌株含有metH基因的上游PgroES启动子(称作P₄₉₇ metH)。P₄₉₇启动子的序列在SEQ ID NO：21中示出。M690菌株产生大约77.2mM赖氨酸和大约41.6mM高丝氨酸，如下表4所示。

表4：菌株M603和M690产生的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的量

菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)
菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)	M603	0.5	0.7	0.0	17.4
M690	41.6	0.0	0.0	77.2	M603	0.5	0.7	0.0	17.4

随后将M690菌株如下进行诱变：将在BHI培养基(BECTONDICKINSON)中生长的M603过夜培养物在50mM柠檬酸盐缓冲液pH5.5中洗涤，在30℃用N-甲基-N-亚硝基胍(在50mM柠檬酸盐缓冲液pH5.5中10mg/ml)处理20分钟。在处理之后，将细胞在50mM柠檬酸盐缓冲液pH5.5中再次洗涤，铺板于含有如下成分的培养基上：(所有监测量均以500ml培养基计算)10g(NH₄)₂SO₄、0.5g KH₂PO₄、0.5g K₂HPO₄、0.125gMgSO_4*7H₂O、21g MOPS、50mg CaCl₂、15mg原儿茶酸、0.5mg生物素、1mg硫胺素和5g/l D，L-乙硫氨酸(SIGMA CHEMICALS，CATALOG#E5139)，用KOH将pH调节为pH7.0。此外，所述培养基还含有0.5ml由如下成分组成的痕量金属溶液：10g/l FeSO_4*7H₂O、1g/l MnSO₄*H₂O、0.1g/l ZnSO₄*7H₂O、0.02g/l CuSO₄和0.002g/l NiCl₂*6H₂O，均溶解于0.1M HCl中。最终的培养基通过过滤灭菌，向培养基中加入40ml无菌50％葡萄糖溶液(40ml)以及无菌琼脂，终浓度为1.5％。将含有最终琼脂的培养基倒入琼脂平板中，标记为最小乙硫氨酸培养基。将诱变的菌株播种在该平板上(最小乙硫氨酸培养基)，在30℃保温3-7天。分离在该培养基上生长的克隆，在相同乙硫氨酸培养基上再次划线培养。选择一些克隆进行甲硫氨酸生产分析。

如下分析甲硫氨酸生产情况。将菌株在CM-琼脂培养基上在30℃生长2天，所述培养基含有：10g/l D-葡萄糖、2.5g/l NaCl、2g/l尿素、10g/l Bacto Peptone(DIFCO)、5g/l酵母提取物(DIFCO)、5g/l Beef Extract(DIFCO)、22g/l琼脂(DIFCO)，将其在大约121℃高压灭菌20分钟。

在菌株生长之后，刮下细胞并重悬浮于0.15M NaCl中。对于主培养物，将刮取的细胞的悬浮液以600nm起始OD加入大约1.5至10ml的具有0.5g固体和高压灭菌的CaCO₃(RIEDEL DE HAEN)的培养基II中(见下文)，将细胞在不带有挡板的100ml摇瓶中在轨道振荡平台上以大约200rpm在30℃保温72小时。培养基II含有：40g/l蔗糖、60g/l来自糖蜜的总糖(以糖含量计算)、10g/l(NH₄)₂SO₄、0.4g/l MgSO₄*7H₂O、0.6g/lKH₂PO₄、0.3mg/l盐酸硫胺素、1mg/l生物素、2mg/l FeSO₄以及2mg/lMnSO₄。将该培养基用NH₄OH将pH调节为pH7.8，在大约121℃高压灭菌大约20分钟。在高压灭菌及冷却之后，加入来自过滤灭菌的原液(200μg/ml)的维生素B₁₂(氰钴维生素)(SIGMA CHEMICALS)，至终浓度为100μg/l。

从培养基中取样并测定氨基酸含量。在Agilent 1100 Series LC SystemHPLC.(AGILENT)上，使用Agilent氨基酸方法确定产生的氨基酸，包括甲硫氨酸。在Hypersil AA-柱(AGILENT)上分离之后，用邻苯二甲醛对样品进行柱前衍生化使得可以量化产生的氨基酸。

分离示出甲硫氨酸效价是在M690中的至少2倍的克隆。用于进一步实验中的一个这样的克隆称作M1197，并且在2005年5月18日保藏在DSMZ菌株中心，菌株编号为DSM 17322。对比这个菌株与菌株M690产生的氨基酸，在下表5中概括示出。

表5：菌株M690和M1197产生的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的量

菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)
菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)	M690	41.6	0.0	0.0	77.2
M1179	26.4	1.9	0.7	79.2	M690	41.6	0.0	0.0	77.2

将菌株M1197用DNA F(也称作pH399，SEQ ID NO：27)转化，产生“Campbell in”菌株，随后将其“Campbelled out”，产生菌株M1494。这个菌株在高丝氨酸激酶基因中含有突变，导致所得高丝氨酸激酶中由T190至A190的氨基酸变化(称作HskT190A)。对于菌株M1494与菌株M1197产生的氨基酸，如下表6所示。

表6：菌株M1197和M1494产生的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的量

菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)
菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)	M1197	26.4	1.9	0.7	79.2
M1494	18.3	0.2	2.5	50.1	M1197	26.4	1.9	0.7	79.2

将菌株M1494用DNA D(也称作pH484，SEQ ID NO：28)转化，产生“Campbell in”菌株，随后将其“Campbelled out”，产生M1990菌株。M1990菌株使用groES-启动子和EFTU(延长因子Tu)-启动子(称作P₄₉₇P₁₂₈₄ metY)过表达metY等位基因。P₄₉₇P₁₂₈₄启动子的序列在SEQ ID NO：29中示出。对于由菌株M1494和菌株M1990产生的氨基酸，如下表7所示。

表7：菌株M1494和M1990产生的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的量

菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)
菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)	M1494	18.3	0.2	2.5	50.1
M1990	18.2	0.3	5.6	48.9	M1494	18.3	0.2	2.5	50.1

将菌株M1990用DNA E(也称作pH491，SEQ ID NO：30)转化，产生“Campbell in”菌株，然后将其“Campbelled out”，产生“Campbellout”菌株M2014。M2014菌株使用超氧化物歧化酶启动子(称作P₃₁₁₉ metA)过表达metA等位基因。P₃₁₁₉启动子的序列在SEQ ID NO：20中示出。对比由菌株M2014和菌株M1990产生的氨基酸，如下表8所示。

表8：菌株M1494和M1990产生的高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的量

菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰-高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)
菌株	高丝氨酸(mM)	O-乙酰-高丝氨酸(mM)	甲硫氨酸(mM)	赖氨酸(mM)	M1990	18.2	0.3	5.6	48.9
M2014	12.3	1.2	5.7	49.2	M1990	18.2	0.3	5.6	48.9

实验2：M2014中mcbR的缺失

含有RXA00655缺失的质粒pH429(SEQ ID No.31)用于通过整合和切除在谷氨酸棒杆菌中导入mcbR缺失(见WO 2004/050694 A1)。

将质粒pH429转化进M2014菌株中，根据卡那霉素抗性选择(Campbell in)。使用sacB反选择(counter-selection)，分离转化的菌株的卡那霉素敏感性衍生物，推测其已经通过切除而丧失了整合的质粒(Campbellout)。所述转化的菌株产生卡那霉素敏感性衍生物，其产生小菌落以及较大的菌落。通过PCR筛选这两种规格的菌落，以检测mcbR缺失的存在情况。较大的菌落无一含有所述缺失，而60-70％的较小菌落含有预期的mcbR缺失。

当在BHI平板上针对单菌落划线培养最初的分离株时，呈现出微小和小菌落的混合物。当将微小的菌落在BHI上再次划线培养时，再一次呈现出微小和小菌落的混合物。当将小菌落在BHI上再次划线培养时，该菌落的大小通常小且统一。选择称作OM403-4和OM403-8的两个小的单菌落分离株进一步研究。

摇瓶实验(表9)示出与亲代M2014相比，OM403-8产生是其至少两倍的甲硫氨酸。与M2014相比，这个菌株还产生小于1/5量的赖氨酸，提示从天冬氨酸半醛向高丝氨酸的碳流量转移。第三个显著差异是OM403与M2014相比异亮氨酸积累增加10倍以上。培养物在标准糖蜜培养基中生长48小时。

表9：在接种新鲜生长的细胞的摇瓶培养物中OM403菌株分离株产生的氨基酸

在表10中也示出OM403与M2014相比，O-乙酰高丝氨酸积累降低15倍以上。对此结果最可能的解释是积累在M2014中的大多数O-乙酰高丝氨酸在OM403中被转变为甲硫氨酸、高半胱氨酸和异亮氨酸。培养物在标准糖蜜培养基中生长48小时。

表10：用新鲜生长细胞接种的摇瓶培养物中OM403两个分离株的氨基酸产生

实验3：降低metQ表达

为了降低OM403-8中甲硫氨酸的输入，缺失启动子和metQ基因的5’部分。metQ基因编码为复杂功能所需的甲硫氨酸输入复合物亚基。使用标准Campbelling in和Campbelling out技术使用质粒pH449(SEQ ID NO：32)完成。在摇瓶测定中测定OM403-8和OM456-2的甲硫氨酸生产情况。结果(表11)示出OM456-2较OM403-8产生更多的甲硫氨酸。培养物在标准糖蜜培养基中生长48小时。

表11：OM456-2的摇瓶测定

实验4：OM469的构建

构建称作OM469的菌株，其包含metQ缺失以及的metF过表达，通过在OM456-2中用噬菌体λP_R启动子置换metF启动子而实现。这使用标准Campbelling in和Campbelling out技术用质粒pOM427(SEQ ID NO 33)完成。在摇瓶培养测定中测定OM469的四个分离株的甲硫氨酸产生情况，这四个菌株较OM456-2均产生更多的甲硫氨酸，如表12所示。培养物在含有2mM甲硫氨酸的标准糖蜜培养基中生长48小时。

表12：含有代替metF启动子的噬菌体λP_R启动子的OM456-2衍生物OM469的摇瓶测定

实验5：M2543的构建

将菌株OM469-2用SEQ ID No.34所示质粒pCLIK5A int sacB PSODTKT通过电穿孔转化(图1a)。这使用标准Campbelling in和Campbellingout技术完成。

在摇瓶培养测定中测定标记为M2543的OM 469 PSOD TKT分离株的甲硫氨酸产生情况，其与OM469-2相比产生更多的甲硫氨酸。菌株M2543的结果在表13中示出。

表13：OM469和M2543的摇瓶测定

实验6：6-磷酸葡萄酸脱氢酶中含有启动子和/或突变的菌株的构建

将菌株OM469-2或者M2543用SEQ ID No.35所示质粒pCLIK5APSODH661 PSOD 6PGDH通过电穿孔转化(图1b)。这使用标准Campbelling in和Campbelling out技术完成。所得菌株仅含有启动子P_SOD或者含有该启动子以及一或两个突变，如表14所示。

在摇瓶培养测定中测定标记为GK 1508、1511和GK1513的M2543PSOD 6PGDH分离株的甲硫氨酸产生情况，其与M2543相比产生更多的甲硫氨酸。结果在表14中示出。

表14：OM469和M2543的摇瓶测定

序列表

<110>赢创德固赛有限责任公司

<120>赢创德固赛有限责任公司

<130>B 8571/DB

<150>EP 07 102 257.9

<151>19.02.2007

<160>35

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1545

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>nucleic acid sequence

<222>(1)..(1545)

<223>glucose-6-phosphate-dehydrogenase

<400>1

gtgagcacaa acacgacccc ctccagctgg acaaacccac tgcgcgaccc gcaggataaa 60

cgactccccc gcatcgctgg cccttccggc atggtgatct tcggtgtcac tggcgacttg 120

gctcgaaaga agctgctccc cgccatttat gatctagcaa accgcggatt gctgccccca 180

ggattctcgt tggtaggtta cggccgccgc gaatggtcca aagaagactt tgaaaaatac 240

gtacgcgatg ccgcaagtgc tggtgctcgt acggaattcc gtgaaaatgt ttgggagcgc 300

ctcgccgagg gtatggaatt tgttcgcggc aactttgatg atgatgcagc tttcgacaac 360

ctcgctgcaa cactcaagcg catcgacaaa acccgcggca ccgccggcaa ctgggcttac 420

tacctgtcca ttccaccaga ttccttcaca gcggtctgcc accagctgga gcgttccggc 480

atggctgaat ccaccgaaga agcatggcgc cgcgtgatca tcgagaagcc tttcggccac 540

aacctcgaat ccgcacacga gctcaaccag ctggtcaacg cagtcttccc agaatcttct 600

gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc aaaacatcct ggctctgcgt 660

tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact acgttgacca cgtccagatc 720

accatggctg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt actacgacgg catcggcgca 780

gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg ctctggttgc catggaagaa 840

ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga tcaaggtgct ctctgcgaca 900

aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctcgtggtc agtacgctgc cggttggcag 960

ggctctgagt tagtcaaggg acttcgcgaa gaagatggct tcaaccctga gtccaccact 1020

gagacttttg cggcttgtac cttagagatc acgtctcgtc gctgggctgg tgtgccgttc 1080

tacctgcgca ccggtaagcg tcttggtcgc cgtgttactg agattgccgt ggtgtttaaa 1140

gacgcaccac accagccttt cgacggcgac atgactgtat cccttggcca aaacgccatc 1200

gtgattcgcg tgcagcctga tgaaggtgtg ctcatccgct tcggttccaa ggttccaggt 1260

tctgccatgg aagtccgtga cgtcaacatg gacttctcct actcagaatc cttcactgaa 1320

gaatcacctg aagcatacga gcgcctcatt ttggatgcgc tgttagatga atccagcctc 1380

ttccctacca acgaggaagt ggaactgagc tggaagattc tggatccaat tcttgaagca 1440

tgggatgccg atggagaacc agaggattac ccagcgggta cgtggggtcc aaagagcgct 1500

gatgaaatgc tttcccgcaa cggtcacacc tggcgcaggc cataa 1545

<210>2

<211>514

<212>PRT

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>amino acid sequence

<222>(1)..(514)

<223>glucose-6-phosphate-dehydrogenase

<400>2

Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp

1 5 10 15

Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val

20 25 30

Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala

35 40 45

Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu

50 55 60

Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr

65 70 75 80

Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn

85 90 95

Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe

100 105 110

Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile

115 120 125

Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile

130 135 140

Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly

145 150 155 160

Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys

165 170 175

Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val

180 185 190

Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu

195 200 205

Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln

210 215 220

Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile

225 230 235 240

Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp

245 250 255

Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu

260 265 270

Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln

275 280 285

Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr

290 295 300

Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln

305 310 315 320

Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro

325 330 335

Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser

340 345 350

Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu

355 360 365

Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His

370 375 380

Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile

385 390 395 400

Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser

405 410 415

Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe

420 425 430

Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg

435 440 445

Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn

450 455 460

Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala

465 470 475 480

Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly

485 490 495

Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg

500 505 510

Arg Pro

<210>3

<211>708

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>nucleic acid sequence

<222>(1)..(708)

<223>6-phosphogluconolactonase

<400>3

atggttgatg tagtacgcgc acgcgatact gaagatttgg ttgcacaggc tgcctccaaa 60

ttcattgagg ttgttgaagc agcaactgcc aataatggca ccgcacaggt agtgctcacc 120

ggtggtggcg ccggcatcaa gttgctggaa aagctcagcg ttgatgcggc tgaccttgcc 180

tgggatcgca ttcatgtgtt cttcggcgat gagcgcaatg tccctgtcag tgattctgag 240

tccaatgagg gccaggctcg tgaggcactg ttgtccaagg tttctatccc tgaagccaac 300

attcacggat atggtctcgg cgacgtagat cttgcagagg cagcccgcgc ttacgaagct 360

gtgttggatg aattcgcacc aaacggcttt gatcttcacc tgctcggcat gggtggcgaa 420

ggccatatca actccctgtt ccctcacacc gatgcagtca aggaatcctc cgcaaaggtc 480

atcgcggtgt ttgattcccc taagcctcct tcagagcgtg caactctaac ccttcctgcg 540

gttcactccg caaagcgcgt gtggttgctg gtttctggtg cggagaaggc tgaggcagct 600

gcggcgatcg tcaacggtga gcctgctgtt gagtggcctg ctgctggagc taccggatct 660

gaggaaacgg tattgttctt ggctgatgat gctgcaggaa atctctaa 708

<210>4

<211>235

<212>PRT

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>amino acid sequence

<222>(1)..(235)

<223>6-phosphogluconolactonase

<400>4

Met Val Asp Val Val Arg Ala Arg Asp Thr Glu Asp Leu Val Ala Gln

1 5 10 15

Ala Ala Ser Lys Phe Ile Glu Val Val Glu Ala Ala Thr Ala Asn Asn

20 25 30

Gly Thr Ala Gln Val Val Leu Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ile Lys Leu

35 40 45

Leu Glu Lys Leu Ser Val Asp Ala Ala Asp Leu Ala Trp Asp Arg Ile

50 55 60

His Val Phe Phe Gly Asp Glu Arg Asn Val Pro Val Ser Asp Ser Glu

65 70 75 80

Ser Asn Glu Gly Gln Ala Arg Glu Ala Leu Leu Ser Lys Val Ser Ile

85 90 95

Pro Glu Ala Asn Ile His Gly Tyr Gly Leu Gly Asp Val Asp Leu Ala

100 105 110

Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Glu Ala Val Leu Asp Glu Phe Ala Pro Asn

115 120 125

Gly Phe Asp Leu His Leu Leu Gly Met Gly Gly Glu Gly His Ile Asn

130 135 140

Ser Leu Phe Pro His Thr Asp Ala Val Lys Glu Ser Ser Ala Lys Val

145 150 155 160

Ile Ala Val Phe Asp Ser Pro Lys Pro Pro Ser Glu Arg Ala Thr Leu

165 170 175

Thr Leu Pro Ala Val His Ser Ala Lys Arg Val Trp Leu Leu Val Ser

180 185 190

Gly Ala Glu Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ile Val Asn Gly Glu Pro

195 200 205

Ala Val Glu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ser Glu Glu Thr Val

210 215 220

Leu Phe Leu Ala Asp Asp Ala Ala Gly Asn Leu

225 230 235

<210>5

<211>1455

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>nucleic acid sequence

<222>(1)..(1455)

<223>6-phospho-gluconate-dehydrogenase

<400>5

atgactaatg gagataatct cgcacagatc ggcgttgtag gcctagcagt aatgggctca 60

aacctcgccc gcaacttcgc ccgcaacggc aacactgtcg ctgtctacaa ccgcagcact 120

gacaaaaccg acaagctcat cgccgatcac ggctccgaag gcaacttcat cccttctgca 180

accgtcgaag agttcgtagc atccctggaa aagccacgcc gcgccatcat catggttcag 240

gctggtaacg ccaccgacgc agtcatcaac cagctggcag atgccatgga cgaaggcgac 300

atcatcatcg acggcggcaa cgccctctac accgacacca ttcgtcgcga gaaggaaatc 360

tccgcacgcg gtctccactt cgtcggtgct ggtatctccg gcggcgaaga aggcgcactc 420

aacggcccat ccatcatgcc tggtggccca gcaaagtcct acgagtccct cggaccactg 480

cttgagtcca tcgctgccaa cgttgacggc accccatgtg tcacccacat cggcccagac 540

ggcgccggcc acttcgtcaa gatggtccac aacggcatcg agtacgccga catgcaggtc 600

atcggcgagg cataccacct tctccgctac gcagcaggca tgcagccagc tgaaatcgct 660

gaggttttca aggaatggaa cgcaggcgac ctggattcct acctcatcga aatcaccgca 720

gaggttctct cccaggtgga tgctgaaacc ggcaagccac taatcgacgt catcgttgac 780

gctgcaggtc agaagggcac cggacgttgg accgtcaagg ctgctcttga tctgggtatt 840

gctaccaccg gcatcggcga agctgttttc gcacgtgcac tctccggcgc aaccagccag 900

cgcgctgcag cacagggcaa cctacctgca ggtgtcctca ccgatctgga agcacttggc 960

gtggacaagg cacagttcgt cgaagacgtt cgccgtgcac tgtacgcatc caagcttgtt 1020

gcttacgcac agggcttcga cgagatcaag gctggctccg acgagaacaa ctgggacgtt 1080

gaccctcgcg acctcgctac catctggcgc ggcggctgca tcattcgcgc taagttcctc 1140

aaccgcatcg tcgaagcata cgatgcaaac gctgaacttg agtccctgct gctcgatcct 1200

tacttcaaga gcgagctcgg cgacctcatc gattcatggc gtcgcgtgat tgtcaccgcc 1260

acccagcttg gcctgccaat cccagtgttc gcttcctccc tgtcctacta cgacagcctg 1320

cgtgcagagc gtctgccagc agccctgatc caaggacagc gcgacttctt cggtgcgcac 1380

acctacaagc gcatcgacaa ggatggctcc ttccacaccg agtggtccgg cgaccgctcc 1440

gaggttgaag cttaa 1455

<210>6

<211>484

<212>PRT

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>amino acid sequence

<222>(1)..(483)

<223>phospho-gluconate-dehydrogenase

<220>

<221>amino acid sequence

<222>(1)..(484)

<223>phospho-gluconate-dehydrogenase

<400>

Met Thr Asn Gly Asp Asn Leu Ala Gln Ile Gly Val Val Gly Leu Ala

1 5 10 15

Val Met Gly Ser Asn Leu Ala Arg Asn Phe Ala Arg Asn Gly Asn Thr

20 25 30

Val Ala Val Tyr Asn Arg Ser Thr Asp Lys Thr Asp Lys Leu Ile Ala

35 40 45

Asp His Gly Ser Glu Gly Asn Phe Ile Pro Ser Ala Thr Val Glu Glu

50 55 60

Phe Val Ala Ser Leu Glu Lys Pro Arg Arg Ala Ile Ile Met Val Gln

65 70 75 80

Ala Gly Asn Ala Thr Asp Ala Val Ile Asn Gln Leu Ala Asp Ala Met

85 90 95

Asp Glu Gly Asp Ile Ile Ile Asp Gly Gly Asn Ala Leu Tyr Thr Asp

100 105 110

Thr Ile Arg Arg Glu Lys Glu Ile Ser Ala Arg Gly Leu His Phe Val

115 120 125

Gly Ala Gly Ile Ser Gly Gly Glu Glu Gly Ala Leu Asn Gly Pro Ser

130 135 140

Ile Met Pro Gly Gly Pro Ala Lys Ser Tyr Glu Ser Leu Gly Pro Leu

145 150 155 160

Leu Glu Ser Ile Ala Ala Asn Val Asp Gly Thr Pro Cys Val Thr His

165 170 175

Ile Gly Pro Asp Gly Ala Gly His Phe Val Lys Met Val His Asn Gly

180 185 190

Ile Glu Tyr Ala Asp Met Gln Val Ile Gly Glu Ala Tyr His Leu Leu

195 200 205

Arg Tyr Ala Ala Gly Met Gln Pro Ala Glu Ile Ala Glu Val Phe Lys

210 215 220

Glu Trp Asn Ala Gly Asp Leu Asp Ser Tyr Leu Ile Glu Ile Thr Ala

225 230 235 240

Glu Val Leu Ser Gln Val Asp Ala Glu Thr Gly Lys Pro Leu Ile Asp

245 250 255

Val Ile Val Asp Ala Ala Gly Gln Lys Gly Thr Gly Arg Trp Thr Val

260 265 270

Lys Ala Ala Leu Asp Leu Gly Ile Ala Thr Thr Gly Ile Gly Glu Ala

275 280 285

Val Phe Ala Arg Ala Leu Ser Gly Ala Thr Ser Gln Arg Ala Ala Ala

290 295 300

Gln Gly Asn Leu Pro Ala Gly Val Leu Thr Asp Leu Glu Ala Leu Gly

305 310 315 320

Val Asp Lys Ala Gln Phe Val Glu Asp Val Arg Arg Ala Leu Tyr Ala

325 330 335

Ser Lys Leu Val Ala Tyr Ala Gln Gly Phe Asp Glu Ile Lys Ala Gly

340 345 350

Ser Asp Glu Asn Asn Trp Asp Val Asp Pro Arg Asp Leu Ala Thr Ile

355 360 365

Trp Arg Gly Gly Cys Ile Ile Arg Ala Lys Phe Leu Asn Arg Ile Val

370 375 380

Glu Ala Tyr Asp Ala Asn Ala Glu Leu Glu Ser Leu Leu Leu Asp Pro

385 390 395 400

Tyr Phe Lys Ser Glu Leu Gly Asp Leu Ile Asp Ser Trp Arg Arg Val

405 410 415

Ile Val Thr Ala Thr Gln Leu Gly Leu Pro Ile Pro Val Phe Ala Ser

420 425 430

Ser Leu Ser Tyr Tyr Asp Ser Leu Arg Ala Glu Arg Leu Pro Ala Ala

435 440 445

Leu Ile Gln Gly Gln Arg Asp Phe Phe Gly Ala His Thr Tyr Lys Arg

450 455 460

lle Asp Lys Asp Gly Ser Phe His Thr Glu Trp Ser Gly Asp Arg Ser

465 470 475 480

Glu Val Glu Ala

<210>7

<211>660

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>nucleic acid sequence

<222>(1)..(660)

<223>ribulose-5-phosphate epimerase

<400>7

atggcacaac gtactccact aatcgcccca tccattcttg ctgctgattt ctcccgctta 60

ggggagcagg tgttggctgt tcctgatgct gactggattc acgtcgacat catggacgga 120

cacttcgttc caaacttgag ctttggcgcg gatatcacag ctgcggtcaa ccgcgttacg 180

gacaaagaac tagacgtcca cctgatgatc gaaaacccag agaagtgggt ggacaactac 240

atcgacgctg gcgcggactg cattgttttc cacgttgaag ccaccgaagg tcacgttgag 300

ttggctaagt acatccgttc caagggtgtg cgtgcaggtt tctccctgcg ccctggaact 360

cccatcgagg attacttgga tgacctcgag cacttcgatg aagtcatcgt catgagcgtc 420

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<213>Corynebacterium glutamicum

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<213>Corynebacterium glutamicum

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tag 1083

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<210>18

<211>421

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>aspartate kinase

<400>18

Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala

1 5 10 15

Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala

20 25 30

Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp

35 40 45

Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg

50 55 60

Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu

65 70 75 80

Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr

85 90 95

Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg

100 105 110

Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly

115 120 125

Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg

130 135 140

Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val

165 170 175

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys

180 185 190

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly

195 200 205

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn

210 215 220

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr

245 250 255

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile

260 265 270

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp

275 280 285

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu

290 295 300

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg

305 310 315 320

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr

325 330 335

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala

340 345 350

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu

355 360 365

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg

370 375 380

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala

385 390 395 400

Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr

405 410 415

Ala Gly Thr Gly Arg

420

<210>19

<211>309

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>homoserine kinase

<400>19

Met Ala Ile Glu Leu Asn Val Gly Arg Lys Val Thr Val Thr Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Ser Ala Asn Leu Gly Pro Gly Phe Asp Thr Leu Gly Leu Ala

20 25 30

Leu Ser Val Tyr Asp Thr Val Glu Val Glu Ile Ile Pro Ser Gly Leu

35 40 45

Glu Val Glu Val Phe Gly Glu Gly Gln Gly Glu Val Pro Leu Asp Gly

50 55 60

Ser His Leu Val Val Lys Ala Ile Arg Ala Gly Leu Lys Ala Ala Asp

65 70 75 80

Ala Glu Val Pro Gly Leu Arg Val Val Cys His Asn Asn Ile Pro Gln

85 90 95

Ser Arg Gly Leu Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Val Ala Gly Val Ala

100 105 110

Ala Ala Asn Gly Leu Ala Asp Phe Pro Leu Thr Gln Glu Gln Ile Val

115 120 125

Gln Leu Ser Ser Ala Phe Glu Gly His Pro Asp Asn Ala Ala Ala Ser

130 135 140

Val Leu Gly Gly Ala Val Val Ser Trp Thr Asn Leu Ser Ile Asp Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gln Pro Gln Tyr Ala Ala Val Pro Leu Glu Val Gln Asp Asn

165 170 175

Ile Arg Ala Thr Ala Leu Val Pro Asn Phe His Ala Ser Thr Glu Ala

180 185 190

Val Arg Arg Val Leu Pro Thr Glu Val Thr His Ile Asp Ala Arg Phe

195 200 205

Asn Val Ser Arg Val Ala Val Met Ile Val Ala Leu Gln Gln Arg Pro

210 215 220

Asp Leu Leu Trp Glu Gly Thr Arg Asp Arg Leu His Gln Pro Tyr Arg

225 230 235 240

Ala Glu Val Leu Pro Ile Thr Ser Glu Trp Val Asn Arg Leu Arg Asn

245 250 255

Arg Gly Tyr Ala Ala Tyr Leu Ser Gly Ala Gly Pro Thr Ala Met Val

260 265 270

Leu Ser Thr Glu Pro Ile Pro Asp Lys Val Leu Glu Asp Ala Arg Glu

275 280 285

Ser Gly Ile Lys Val Leu Glu Leu Glu Val Ala Gly Pro Val Lys Val

290 295 300

Glu Val Asn Gln Pro

305

<210>20

<211>192

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>promotor P3119＝PSOD

<400>20

gagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60

ttcgttgcaa tatcaacaaa aaggcctatc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120

gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180

gattttttac cc 192

<210>21

<211>184

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>promotor P497＝PgroES

<400>21

ggtcgagcgg cttaaagttt ggctgccatg tgaattttta gcaccctcaa cagttgagtg 60

ctggcactct cgggggtaga gtgccaaata ggttgtttga cacacagttg ttcacccgcg 120

acgacggctg tgctggaaac ccacaaccgg cacacacaaa atttttctca tggagggatt 180

catc 184

<210>22

<211>192

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>promotor P1284＝PEFTU

<400>22

gagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60

ttcgttgcaa tatcaacaaa aaggcctatc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120

gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180

gattttttac cc 192

<210>23

<211>114

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>promotor

<400>23

gtcgactcat acgttaaatc tatcaccgca agggataaat atctaacacc gtgcgtgttg 60

actattttac ctctggcggt gataatggtt gcatgtacta aggaggatta atta 114

<210>24

<211>7070

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>Plasmid pH273

<400>24

tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttgg agaatcatga 60

cctcagcatc tgccccaagc tttaaccccg gcaagggtcc cggctcagca gtcggaattg 120

cccttttagg attcggaaca gtcggcactg aggtgatgcg tctgatgacc gagtacggtg 180

atgaacttgc gcaccgcatt ggtggcccac tggaggttcg tggcattgct gtttctgata 240

tctcaaagcc acgtgaaggc gttgcacctg agctgctcac tgaggacgct tttgcactca 300

tcgagcgcga ggatgttgac atcgtcgttg aggttatcgg cggcattgag tacccacgtg 360

aggtagttct cgcagctctg aaggccggca agtctgttgt taccgccaat aaggctcttg 420

ttgcagctca ctctgctgag cttgctgatg cagcggaagc cgcaaacgtt gacctgtact 480

tcgaggctgc tgttgcaggc gcaattccag tggttggccc actgcgtcgc tccctggctg 540

gcgatcagat ccagtctgtg atgggcatcg ttaacggcac caccaacttc atcttggacg 600

ccatggattc caccggcgct gactatgcag attctttggc tgaggcaact cgtttgggtt 660

acgccgaagc tgatccaact gcagacgtcg aaggccatga cgccgcatcc aaggctgcaa 720

ttttggcatc catcgctttc cacacccgtg ttaccgcgga tgatgtgtac tgcgaaggta 780

tcagcaacat cagcgctgcc gacattgagg cagcacagca ggcaggccac accatcaagt 840

tgttggccat ctgtgagaag ttcaccaaca aggaaggaaa gtcggctatt tctgctcgcg 900

tgcacccgac tctattacct gtgtcccacc cactggcgtc ggtaaacaag tcctttaatg 960

caatctttgt tgaagcagaa gcagctggtc gcctgatgtt ctacggaaac ggtgcaggtg 1020

gcgcgccaac cgcgtctgct gtgcttggcg acgtcgttgg tgccgcacga aacaaggtgc 1080

acggtggccg tgctccaggt gagtccacct acgctaacct gccgatcgct gatttcggtg 1140

agaccaccac tcgttaccac ctcgacatgg atgtggaaga tcgcgtgggg gttttggctg 1200

aattggctag cctgttctct gagcaaggaa tcttcctgcg tacaatccga caggaagagc 1260

gcgatgatga tgcacgtctg atcgtggtca cccactctgc gctggaatct gatctttccc 1320

gcaccgttga actgctgaag gctaagcctg ttgttaaggc aatcaacagt gtgatccgcc 1380

tcgaaaggga ctaattttac tgacatggca attgaactga acgtcggtcg taaggttacc 1440

gtcacggtac ctggatcttc tgcaaacctc ggacctggct ttgacacttt aggtttggca 1500

ctgtcggtat acgacactgt cgaagtggaa attattccat ctggcttgga agtggaagtt 1560

tttggcgaag gccaaggcga agtccctctt gatggctccc acctggtggt taaagctatt 1620

cgtgctggcc tgaaggcagc tgacgctgaa gttcctggat tgcgagtggt gtgccacaac 1680

aacattccgc agtctcgtgg tcttggctcc tctgctgcag cggcggttgc tggtgttgct 1740

gcagctaatg gtttggcgga tttcccgctg actcaagagc agattgttca gttgtcctct 1800

gcctttgaag gccacccaga taatgctgcg gcttctgtgc tgggtggagc agtggtgtcg 1860

tggacaaatc tgtctatcga cggcaagagc cagccacagt atgctgctgt accacttgag 1920

gtgcaggaca atattcgtgc gactgcgctg gttcctaatt tccacgcatc caccgaagct 1980

gtgcgccgag tccttcccac tgaagtcact cacatcgatg cgcgatttaa cgtgtcccgc 2040

gttgcagtga tgatcgttgc gttgcagcag cgtcctgatt tgctgtggga gggtactcgt 2100

gaccgtctgc accagcctta tcgtgcagaa gtgttgccta ttacctctga gtgggtaaac 2160

cgcctgcgca accgtggcta cgcggcatac ctttccggtg ccggcccaac cgccatggtg 2220

ctgtccactg agccaattcc agacaaggtt ttggaagatg ctcgtgagtc tggcattaag 2280

gtgcttgagc ttgaggttgc gggaccagtc aaggttgaag ttaaccaacc ttaggcccaa 2340

caaggaaggc ccccttcgaa tcaagaaggg ggccttatta gtgcagcaat tattcgctga 2400

acacgtgaac cttacaggtg cccggcgcgt tgagtggttt gagttccagc tggatgcggt 2460

tgttttcacc gaggctttct tggatgaatc cggcgtggat ggcgcagacg aaggctgatg 2520

ggcgtttgtc gttgaccaca aatgggcagc tgtgtagagc gagggagttt gcttcttcgg 2580

tttcggtggg gtcaaagccc atttcgcgga ggcggttaat gagcggggag agggcttcgt 2640

cgagttcttc ggcttcggcg tggttaatgc ccatgacgtg tgcccactgg gttccgatgg 2700

aaagtgcttt ggcgcggagg tcggggttgt gcattgcgtc atcgtcgaca tcgccgagca 2760

tgttggccat gagttcgatc agggtgatgt attctttggc gacagcgcgg ttgtcgggga 2820

cgcgtgtttg gaagatgagg gaggggcggg atcctctaga cccgggattt aaatcgctag 2880

cgggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc 2940

ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc 3000

aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta tggacagcaa 3060

gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa 3120

actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag 3180

agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg 3240

ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg 3300

atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc 3360

tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga 3420

cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc 3480

tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag 3540

tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat 3600

tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg 3660

tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca 3720

ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct 3780

tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg 3840

gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg 3900

gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc 3960

gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat 4020

gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg ccgccttcta 4080

tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg 4140

ggatctcatg ctggagttct tcgcccacgc tagcggcgcg ccggccggcc cggtgtgaaa 4200

taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca 4260

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 4320

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 4380

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 4440

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 4500

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 4560

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 4620

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 4680

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 4740

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 4800

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 4860

gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 4920

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 4980

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 5040

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 5100

ggatcttcac ctagatcctt ttaaaggccg gccgcggccg ccatcggcat tttcttttgc 5160

gtttttattt gttaactgtt aattgtcctt gttcaaggat gctgtctttg acaacagatg 5220

ttttcttgcc tttgatgttc agcaggaagc tcggcgcaaa cgttgattgt ttgtctgcgt 5280

agaatcctct gtttgtcata tagcttgtaa tcacgacatt gtttcctttc gcttgaggta 5340

cagcgaagtg tgagtaagta aaggttacat cgttaggatc aagatccatt tttaacacaa 5400

ggccagtttt gttcagcggc ttgtatgggc cagttaaaga attagaaaca taaccaagca 5460

tgtaaatatc gttagacgta atgccgtcaa tcgtcatttt tgatccgcgg gagtcagtga 5520

acaggtacca tttgccgttc attttaaaga cgttcgcgcg ttcaatttca tctgttactg 5580

tgttagatgc aatcagcggt ttcatcactt ttttcagtgt gtaatcatcg tttagctcaa 5640

tcataccgag agcgccgttt gctaactcag ccgtgcgttt tttatcgctt tgcagaagtt 5700

tttgactttc ttgacggaag aatgatgtgc ttttgccata gtatgctttg ttaaataaag 5760

attcttcgcc ttggtagcca tcttcagttc cagtgtttgc ttcaaatact aagtatttgt 5820

ggcctttatc ttctacgtag tgaggatctc tcagcgtatg gttgtcgcct gagctgtagt 5880

tgccttcatc gatgaactgc tgtacatttt gatacgtttt tccgtcaccg tcaaagattg 5940

atttataatc ctctacaccg ttgatgttca aagagctgtc tgatgctgat acgttaactt 6000

gtgcagttgt cagtgtttgt ttgccgtaat gtttaccgga gaaatcagtg tagaataaac 6060

ggatttttcc gtcagatgta aatgtggctg aacctgacca ttcttgtgtt tggtctttta 6120

ggatagaatc atttgcatcg aatttgtcgc tgtctttaaa gacgcggcca gcgtttttcc 6180

agctgtcaat agaagtttcg ccgacttttt gatagaacat gtaaatcgat gtgtcatccg 6240

catttttagg atctccggct aatgcaaaga cgatgtggta gccgtgatag tttgcgacag 6300

tgccgtcagc gttttgtaat ggccagctgt cccaaacgtc caggcctttt gcagaagaga 6360

tatttttaat tgtggacgaa tcaaattcag aaacttgata tttttcattt ttttgctgtt 6420

cagggatttg cagcatatca tggcgtgtaa tatgggaaat gccgtatgtt tccttatatg 6480

gcttttggtt cgtttctttc gcaaacgctt gagttgcgcc tcctgccagc agtgcggtag 6540

taaaggttaa tactgttgct tgttttgcaa actttttgat gttcatcgtt catgtctcct 6600

tttttatgta ctgtgttagc ggtctgcttc ttccagccct cctgtttgaa gatggcaagt 6660

tagttacgca caataaaaaa agacctaaaa tatgtaaggg gtgacgccaa agtatacact 6720

ttgcccttta cacattttag gtcttgcctg ctttatcagt aacaaacccg cgcgatttac 6780

ttttcgacct cattctatta gactctcgtt tggattgcaa ctggtctatt ttcctctttt 6840

gtttgataga aaatcataaa aggatttgca gactacgggc ctaaagaact aaaaaatcta 6900

tctgtttctt ttcattctct gtatttttta tagtttctgt tgcatgggca taaagttgcc 6960

tttttaatca caattcagaa aatatcataa tatctcattt cactaaataa tagtgaacgg 7020

caggtatatg tgatgggtta aaaaggatcg gcggccgctc gatttaaatc 7070

<210>25

<211>7070

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>Plasmid pH373

<400>25

tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttgg agaatcatga 60

cctcagcatc tgccccaagc tttaaccccg gcaagggtcc cggctcagca gtcggaattg 120

cccttttagg attcggaaca gtcggcactg aggtgatgcg tctgatgacc gagtacggtg 180

atgaacttgc gcaccgcatt ggtggcccac tggaggttcg tggcattgct gtttctgata 240

tctcaaagcc acgtgaaggc gttgcacctg agctgctcac tgaggacgct tttgcactca 300

tcgagcgcga ggatgttgac atcgtcgttg aggttatcgg cggcattgag tacccacgtg 360

aggtagttct cgcagctctg aaggccggca agtctgttgt taccgccaat aaggctcttg 420

ttgcagctca ctctgctgag cttgctgatg cagcggaagc cgcaaacgtt gacctgtact 480

tcgaggctgc tgttgcaggc gcaattccag tggttggccc actgcgtcgc tccctggctg 540

gcgatcagat ccagtctgtg atgggcatcg ttaacggcac caccaacttc atcttggacg 600

ccatggattc caccggcgct gactatgcag attctttggc tgaggcaact cgtttgggtt 660

acgccgaagc tgatccaact gcagacgtcg aaggccatga cgccgcatcc aaggctgcaa 720

ttttggcatc catcgctttc cacacccgtg ttaccgcgga tgatgtgtac tgcgaaggta 780

tcagcaacat cagcgctgcc gacattgagg cagcacagca ggcaggccac accatcaagt 840

tgttggccat ctgtgagaag ttcaccaaca aggaaggaaa gtcggctatt tctgctcgcg 900

tgcacccgac tctattacct gtgtcccacc cactggcgtc ggtaaacaag tcctttaatg 960

caatctttgt tgaagcagaa gcagctggtc gcctgatgtt ctacggaaac ggtgcaggtg 1020

gcgcgccaac cgcgtctgct gtgcttggcg acgtcgttgg tgccgcacga aacaaggtgc 1080

acggtggccg tgctccaggt gagtccacct acgctaacct gccgatcgct gatttcggtg 1140

agaccaccac tcgttaccac ctcgacatgg atgtggaaga tcgcgtgggg gttttggctg 1200

aattggctag cctgttctct gagcaaggaa tcttcctgcg tacaatccga caggaagagc 1260

gcgatgatga tgcacgtctg atcgtggtca cccactctgc gctggaatct gatctttccc 1320

gcaccgttga actgctgaag gctaagcctg ttgttaaggc aatcaacagt gtgatccgcc 1380

tcgaaaggga ctaattttac tgacatggca attgaactga acgtcggtcg taaggttacc 1440

gtcacggtac ctggatcttc tgcaaacctc ggacctggct ttgacacttt aggtttggca 1500

ctgtcggtat acgacactgt cgaagtggaa attattccat ctggcttgga agtggaagtt 1560

tttggcgaag gccaaggcga agtccctctt gatggctccc acctggtggt taaagctatt 1620

cgtgctggcc tgaaggcagc tgacgctgaa gttcctggat tgcgagtggt gtgccacaac 1680

aacattccgc agtctcgtgg tcttggctcc tctgctgcag cggcggttgc tggtgttgct 1740

gcagctaatg gtttggcgga tttcccgctg actcaagagc agattgttca gttgtcctct 1800

gcctttgaag gccacccaga taatgctgcg gcttctgtgc tgggtggagc agtggtgtcg 1860

tggacaaatc tgtctatcga cggcaagagc cagccacagt atgctgctgt accacttgag 1920

gtgcaggaca atattcgtgc gactgcgctg gttcctaatt tccacgcatc caccgaagct 1980

gtgcgccgag tccttcccac tgaagtcact cacatcgatg cgcgatttaa cgtgtcccgc 2040

gttgcagtga tgatcgttgc gttgcagcag cgtcctgatt tgctgtggga gggtactcgt 2100

gaccgtctgc accagcctta tcgtgcagaa gtgttgccta ttacctctga gtgggtaaac 2160

cgcctgcgca accgtggcta cgcggcatac ctttccggtg ccggcccaac cgccatggtg 2220

ctgtccactg agccaattcc agacaaggtt ttggaagatg ctcgtgagtc tggcattaag 2280

gtgcttgagc ttgaggttgc gggaccagtc aaggttgaag ttaaccaacc ttaggcccaa 2340

caaggaaggc ccccttcgaa tcaagaaggg ggccttatta gtgcagcaat tattcgctga 2400

acacgtgaac cttacaggtg cccggcgcgt tgagtggttt gagttccagc tggatgcggt 2460

tgttttcacc gaggctttct tggatgaatc cggcgtggat ggcgcagacg aaggctgatg 2520

ggcgtttgtc gttgaccaca aatgggcagc tgtgtagagc gagggagttt gcttcttcgg 2580

tttcggtggg gtcaaagccc atttcgcgga ggcggttaat gagcggggag agggcttcgt 2640

cgagttcttc ggcttcggcg tggttaatgc ccatgacgtg tgcccactgg gttccgatgg 2700

aaagtgcttt ggcgcggagg tcggggttgt gcattgcgtc atcgtcgaca tcgccgagca 2760

tgttggccat gagttcgatc agggtgatgt attctttggc gacagcgcgg ttgtcgggga 2820

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acgccgaagc tgatccaact gcagacgtcg aaggccatga cgccgcatcc aaggctgcaa 720

ttttggcatc catcgctttc cacacccgtg ttaccgcgga tgatgtgtac tgcgaaggta 780

tcagcaacat cagcgctgcc gacattgagg cagcacagca ggcaggccac accatcaagt 840

tgttggccat ctgtgagaag ttcaccaaca aggaaggaaa gtcggctatt tctgctcgcg 900

tgcacccgac tctattacct gtgtcccacc cactggcgtc ggtaaacaag tcctttaatg 960

caatctttgt tgaagcagaa gcagctggtc gcctgatgtt ctacggaaac ggtgcaggtg 1020

gcgcgccaac cgcgtctgct gtgcttggcg acgtcgttgg tgccgcacga aacaaggtgc 1080

acggtggccg tgctccaggt gagtccacct acgctaacct gccgatcgct gatttcggtg 1140

agaccaccac tcgttaccac ctcgacatgg atgtggaaga tcgcgtgggg gttttggctg 1200

aattggctag cctgttctct gagcaaggaa tcttcctgcg tacaatccga caggaagagc 1260

gcgatgatga tgcacgtctg atcgtggtca cccactctgc gctggaatct gatctttccc 1320

gcaccgttga actgctgaag gctaagcctg ttgttaaggc aatcaacagt gtgatccgcc 1380

tcgaaaggga ctaattttac tgacatggca attgaactga acgtcggtcg taaggttacc 1440

gtcacggtac ctggatcttc tgcaaacctc ggacctggct ttgacacttt aggtttggca 1500

ctgtcggtat acgacactgt cgaagtggaa attattccat ctggcttgga agtggaagtt 1560

tttggcgaag gccaaggcga agtccctctt gatggctccc acctggtggt taaagctatt 1620

cgtgctggcc tgaaggcagc tgacgctgaa gttcctggat tgcgagtggt gtgccacaac 1680

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gcctttgaag gccacccaga taatgctgcg gcttctgtgc tgggtggagc agtggtgtcg 1860

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gtgcaggaca atattcgtgc gactgcgctg gttcctaatt tccacgcatc caccgaagct 1980

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gtgcttgagc ttgaggttgc gggaccagtc aaggttgaag ttaaccaacc ttaggcccaa 2340

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tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag 3540

tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat 3600

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tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg 3840

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ggatctcatg ctggagttct tcgcccacgc tagcggcgcg ccggccggcc cggtgtgaaa 4200

taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca 4260

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 4320

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cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 4500

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gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 4980

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tgtaaatatc gttagacgta atgccgtcaa tcgtcatttt tgatccgcgg gagtcagtga 5520

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ggcctttatc ttctacgtag tgaggatctc tcagcgtatg gttgtcgcct gagctgtagt 5880

tgccttcatc gatgaactgc tgtacatttt gatacgtttt tccgtcaccg tcaaagattg 5940

atttataatc ctctacaccg ttgatgttca aagagctgtc tgatgctgat acgttaactt 6000

gtgcagttgt cagtgtttgt ttgccgtaat gtttaccgga gaaatcagtg tagaataaac 6060

ggatttttcc gtcagatgta aatgtggctg aacctgacca ttcttgtgtt tggtctttta 6120

ggatagaatc atttgcatcg aatttgtcgc tgtctttaaa gacgcggcca gcgtttttcc 6180

agctgtcaat agaagtttcg ccgacttttt gatagaacat gtaaatcgat gtgtcatccg 6240

catttttagg atctccggct aatgcaaaga cgatgtggta gccgtgatag tttgcgacag 6300

tgccgtcagc gttttgtaat ggccagctgt cccaaacgtc caggcctttt gcagaagaga 6360

tatttttaat tgtggacgaa tcaaattcag aaacttgata tttttcattt ttttgctgtt 6420

cagggatttg cagcatatca tggcgtgtaa tatgggaaat gccgtatgtt tccttatatg 6480

gcttttggtt cgtttctttc gcaaacgctt gagttgcgcc tcctgccagc agtgcggtag 6540

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tttttatgta ctgtgttagc ggtctgcttc ttccagccct cctgtttgaa gatggcaagt 6660

tagttacgca caataaaaaa agacctaaaa tatgtaaggg gtgacgccaa agtatacact 6720

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gtttgataga aaatcataaa aggatttgca gactacgggc ctaaagaact aaaaaatcta 6900

tctgtttctt ttcattctct gtatttttta tagtttctgt tgcatgggca taaagttgcc 6960

tttttaatca caattcagaa aatatcataa tatctcattt cactaaataa tagtgaacgg 7020

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<210>28

<211>6625

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>pH484

<400>28

tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtaccg ttgctcgctg atctttcggc ttaacaactt 60

tgtattcaat cagtcgggca tagaaagaaa acgcaatgat ataggaacca actgccgcca 120

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ccgccgcgat aaccccaaag acaaggagac caacgcgggc ggtcggtgac attttagggg 240

acttcttcac gcctactgga aggtcagtag cgttgctgta caccaaatca tcgtcattga 300

tgttgtcagt ctgttttatg gtcacgatct ttactgtttt ctcttcgggt cgtttcaaag 360

ccactatgcg tagaaacagc gggcagaaac agcgggcaga aactgtgtgc agaaatgcat 420

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tgagagatga tttataccat cctgcaccat ttagagtggg gctagtcata cccccataac 600

cctagctgta cgcaatcgat ttcaaatcag ttggaaaaag tcaagaaaat tacccgagac 660

atatgcggct taaagtttgg ctgccatgtg aatttttagc accctcaaca gttgagtgct 720

ggcactctcg agggtagagt gccaaatagg ttgtttgaca cacagttgtt cacccgcgac 780

gacggctgtg ctggaaaccc acaaccggca cacacaaaat ttttctcatg gccgttaccc 840

tgcgaatgtc cacagggtag ctggtagttt gaaaatcaac gccgttgccc ttaggattca 900

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gacatacaat gccaaagtac gacaattcca atgctgacca gtggggcttt gaaacccgct 1080

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cattcttcgg cgagactttc gccaacccac aggcagacgt cctggatatt cctgcggtgg 1560

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cgctcgtgcg cccgctcgag ctcggcgcag acgttgtcgt cgcttccctc accaagttct 1680

acaccggcaa cggctccgga ctgggcggcg tgcttatcga cggcggaaag ttcgattgga 1740

ctgtcgaaaa ggatggaaag ccagtattcc cctacttcgt cactccagat gctgcttacc 1800

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tcgacaccct ttccctgcgc ctggagcgcc acaacgaaaa cgccatcaag gttgcagaat 1980

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ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 4200

ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 4260

ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 4320

actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 4380

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tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 4500

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acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 4680

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tgtaatcacg acattgtttc ctttcgcttg aggtacagcg aagtgtgagt aagtaaaggt 4920

tacatcgtta ggatcaagat ccatttttaa cacaaggcca gttttgttca gcggcttgta 4980

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gtcaatcgtc atttttgatc cgcgggagtc agtgaacagg taccatttgc cgttcatttt 5100

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agttccagtg tttgcttcaa atactaagta tttgtggcct ttatcttcta cgtagtgagg 5400

atctctcagc gtatggttgt cgcctgagct gtagttgcct tcatcgatga actgctgtac 5460

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ttcagaaact tgatattttt catttttttg ctgttcaggg atttgcagca tatcatggcg 6000

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tgcaaacttt ttgatgttca tcgttcatgt ctcctttttt atgtactgtg ttagcggtct 6180

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taaaatatgt aaggggtgac gccaaagtat acactttgcc ctttacacat tttaggtctt 6300

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<210>29

<211>363

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>promotor P497_P3119＝PgroES_PEFTU

<400>29

cggcttaaag tttggctgcc atgtgaattt ttagcaccct caacagttga gtgctggcac 60

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tggcacattt tgtaatgcgc tagatctgtg tgctcagtct tccaggctgc ttatcacagt 300

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aca 363

<210>30

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<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>plasmid pH491

<400>30

tcgagctcgg cgcagacgtt gtcgtcgctt ccctcaccaa gttctacacc ggcaacggct 60

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cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 2880

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 2940

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 3000

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 3060

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 3120

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 3180

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 3240

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 3300

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 3360

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 3420

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 3480

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 3540

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 3600

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 3660

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 3720

ttcacctaga tccttttaaa ggccggccgc ggccgccatc ggcattttct tttgcgtttt 3780

tatttgttaa ctgttaattg tccttgttca aggatgctgt ctttgacaac agatgttttc 3840

ttgcctttga tgttcagcag gaagctcggc gcaaacgttg attgtttgtc tgcgtagaat 3900

cctctgtttg tcatatagct tgtaatcacg acattgtttc ctttcgcttg aggtacagcg 3960

aagtgtgagt aagtaaaggt tacatcgtta ggatcaagat ccatttttaa cacaaggcca 4020

gttttgttca gcggcttgta tgggccagtt aaagaattag aaacataacc aagcatgtaa 4080

atatcgttag acgtaatgcc gtcaatcgtc atttttgatc cgcgggagtc agtgaacagg 4140

taccatttgc cgttcatttt aaagacgttc gcgcgttcaa tttcatctgt tactgtgtta 4200

gatgcaatca gcggtttcat cacttttttc agtgtgtaat catcgtttag ctcaatcata 4260

ccgagagcgc cgtttgctaa ctcagccgtg cgttttttat cgctttgcag aagtttttga 4320

ctttcttgac ggaagaatga tgtgcttttg ccatagtatg ctttgttaaa taaagattct 4380

tcgccttggt agccatcttc agttccagtg tttgcttcaa atactaagta tttgtggcct 4440

ttatcttcta cgtagtgagg atctctcagc gtatggttgt cgcctgagct gtagttgcct 4500

tcatcgatga actgctgtac attttgatac gtttttccgt caccgtcaaa gattgattta 4560

taatcctcta caccgttgat gttcaaagag ctgtctgatg ctgatacgtt aacttgtgca 4620

gttgtcagtg tttgtttgcc gtaatgttta ccggagaaat cagtgtagaa taaacggatt 4680

tttccgtcag atgtaaatgt ggctgaacct gaccattctt gtgtttggtc ttttaggata 4740

gaatcatttg catcgaattt gtcgctgtct ttaaagacgc ggccagcgtt tttccagctg 4800

tcaatagaag tttcgccgac tttttgatag aacatgtaaa tcgatgtgtc atccgcattt 4860

ttaggatctc cggctaatgc aaagacgatg tggtagccgt gatagtttgc gacagtgccg 4920

tcagcgtttt gtaatggcca gctgtcccaa acgtccaggc cttttgcaga agagatattt 4980

ttaattgtgg acgaatcaaa ttcagaaact tgatattttt catttttttg ctgttcaggg 5040

atttgcagca tatcatggcg tgtaatatgg gaaatgccgt atgtttcctt atatggcttt 5100

tggttcgttt ctttcgcaaa cgcttgagtt gcgcctcctg ccagcagtgc ggtagtaaag 5160

gttaatactg ttgcttgttt tgcaaacttt ttgatgttca tcgttcatgt ctcctttttt 5220

atgtactgtg ttagcggtct gcttcttcca gccctcctgt ttgaagatgg caagttagtt 5280

acgcacaata aaaaaagacc taaaatatgt aaggggtgac gccaaagtat acactttgcc 5340

ctttacacat tttaggtctt gcctgcttta tcagtaacaa acccgcgcga tttacttttc 5400

gacctcattc tattagactc tcgtttggat tgcaactggt ctattttcct cttttgtttg 5460

atagaaaatc ataaaaggat ttgcagacta cgggcctaaa gaactaaaaa atctatctgt 5520

ttcttttcat tctctgtatt ttttatagtt tctgttgcat gggcataaag ttgccttttt 5580

aatcacaatt cagaaaatat cataatatct catttcacta aataatagtg aacggcaggt 5640

atatgtgatg ggttaaaaag gatcggcggc cgctcgattt aaatctcgag aggcctgacg 5700

tcgggcccgg tacca 5715

<210>35

<211>7506

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>plasmid pCLIK5A PSODH661 PSOD 6PGDH

<400>35

cgcgtcgccg aaaccgatga cagcgcggcc atcggcgccc agtgcgcggt gaatgttggc 60

tagtgcaggt tcgcgaccat cctcagcgag aaagcccatg acgttgccgg cggagacaat 120

gagatcaaaa tcagtctctg agatctgatc aacagagaga tctcccacca cccagcgaac 180

ttctggaaag tcctgcttgg cgtaatcaat caggatggga tcaaggtctg tgcctagaac 240

atcgtggcct tgcttggaca ggtagccacc gatgcgtccc tggccgcagc cagcatccaa 300

gattttcgct cccctgggtg ccatggcatc aatgaggcgg gcttcgccgt aaatatcatt 360

gcctgctgcg gcgaggtttc gccagcgctg cgcgtagttt tctgagtgcg ctgggttgtt 420

atctgtgagc tctttccatg tagtcatggt gcccgagtat agggctactt gttcagcacc 480

atggtgcgca gtgtggttcg tgcgacgact tctccgcggt gggtgcattc gatctgccac 540

agatgggtgc ggccacctag ctgaatcggc gttgcttcgg ccacgatgac accggagctc 600

acagcagaaa tgaagtcggt gttgttgttg atgccgacga ccatttttcc aggggcggaa 660

atcatgctgg cgactgatcc agtggattcg gcgatggcgg cgtagacacc accgttgacc 720

aagcccacca cttgcaggtg cttggatgcc acgtgaagtt cgctgaccac ccggccgggc 780

tcgatggtgg tgtagcgcag ccccagattg cggtcgaggc cataattggc gttgttgagt 840

gcttcaagtt cgtctgtggt taaagctctg gtggcggcaa gttctgcaag cgaaagcaga 900

tcttggggtt gatcatcgcg ggaagtcata attaattact ctagtcggcc taaaatggtt 960

ggattttcac ctcctgtgac ctggtaaaat cgccactacc cccaaatggt cacacctttt 1020

aggccgattt tgctgacacc gggcttagct gccaattatt ccgggcttgt gacccgctac 1080

ccgataaata ggtcggctga aaaatttcgt tgcaatatca acaaaaaggc ctatcattgg 1140

gaggtgtcgc accaagtact tttgcgaagc gccatctgac ggattttcaa aagatgtata 1200

tgctcggtgc ggaaacctac gaaaggattt tttacccatg ccgtcaagta cgatcaataa 1260

catgactaat ggagataatc tcgcacagat cggcgttgta ggcctagcag taatgggctc 1320

aaacctcgcc cgcaacttcg cccgcaacgg caacactgtc gctgtctaca accgcagcac 1380

tgacaaaacc gacaagctca tcgccgatca cggctccgaa ggcaacttca tcccttctgc 1440

aaccgtcgaa gagttcgtag catccctgga aaagccacgc cgcgccatca tcatggttca 1500

ggctggtaac gccaccgacg cagtcatcaa ccagctggca gatgccatgg acgaaggcga 1560

catcatcatc gacggcggca acgccctcta caccgacacc attcgtcgcg agaaggaaat 1620

ctccgcacgc ggtctccact tcgtcggtgc tggtatctcc ggcggcgaag aaggcgcact 1680

caacggccca tccatcatgc ctggtggctc agcaaagtcc tacgagtccc tcggaccact 1740

gcttgagtcc atcgctgcca acgttgacgg caccccatgt gtcacccaca tcggcccaga 1800

cggcgccggc cacttcgtca agatggtcca caacggcatc gagtacgccg acatgcaggt 1860

catcggcgag gcataccacc ttctccgcta cgcagcaggc atgcagccag ctgaaatcgc 1920

tgaggttttc aaggaatgga acgcaggcga cctggattcc tacctcatcg aaatcaccgc 1980

agaggttctc tcccaggtgg atgctgaaac cggcaagcca ctaatcgacg tcatcgttga 2040

cgctgcaggt cagaagggca ccggacgttg gaccgtcaag gctgctcttg atctgggtat 2100

tgctaccacc ggcatcggcg aagctgtttt cgcacgtgca ctctccggcg caaccagcca 2160

gcgcgctgca gcacagggca acctacctgc aggtgtcctc accgatctgg aagcacttgg 2220

cgtggacaag gcacagttcg tcgaagacgt tcgccgtgca ctgtacgcat ccaagcttgt 2280

tgcttacgca cagggcttcg acgagatcaa ggctggcttc gacgagaaca actgggacgt 2340

tgaccctcgc gacctcgcta ccatctggcg cggcggctgc atcattcgcg ctaagttcct 2400

caaccgcatc gtcgaagcat acgatgcaaa cgctgaactt gagtccctgc tgctcgatcc 2460

ttacttcaag agcgagctcg gcgacctcat cgattcatgg cgtcgcgtga ttgtcaccgc 2520

cacccagctt ggcctgccaa ttccagtgtt cgcttcctcc ctgtcctact acgacagcct 2580

gcgtgcagag cgtctgccag cagccctgat ccaaggacag cgcgacttct tcggtgcgca 2640

cacctacaag cgcatcgaca aggatggctc cttccacacc gagtggtccg gcgaccgctc 2700

cgaggttgaa gcttaaaggc tctcctttta acacaacgcc aaaacccctc acagtcacct 2760

tagattgtga ggggtttttc gcgtgctgcc agggattcgc cggaggtggg cgtcgataag 2820

caaaaatctt ttaattgctt ttacccatgg ctctgccctt gttccaataa ccttgcgcgt 2880

tcatgtgcgt cttgggcatg ccggcgtggg tctgcagatg cttcttggcc gcacgggttt 2940

cggaggattc cgcgccgatc caggtataaa aatcggtgta atccgtgtca gcgatgtgat 3000

caatgaagga ttgttcgttg gaaatccact gcgcggtgat gtgctcgccc tggggaaaat 3060

cgaaggtgta atcaagtgga tcgtgggcga taagatacgc ggtcgcaggg atttcaccgt 3120

ccaaggtctc cagaatcgag cagatcgctg ggtaagaggt gagatcgcct aagaaaagga 3180

agccacgcgg cgctggatct gggatggcga acggaatgtc gacatcgatg ctcttctgcg 3240

ttaattaaca attgggatcc tctagacccg ggatttaaat cgctagcggg ctgctaaagg 3300

aagcggaaca cgtagaaagc cagtccgcag aaacggtgct gaccccggat gaatgtcagc 3360

tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca agcgcaaaga gaaagcaggt agcttgcagt 3420

gggcttacat ggcgatagct agactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg 3480

ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc 3540

ttgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga tcaagatctg atcaagagac aggatgagga 3600

tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag 3660

aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc 3720

cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 3780

aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 3840

gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 3900

ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 3960

gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg 4020

aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 4080

ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc 4140

atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg 4200

gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 4260

tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct 4320

gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 4380

cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga 4440

cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct 4500

tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg 4560

agttcttcgc ccacgctagc ggcgcgccgg ccggcccggt gtgaaatacc gcacagatgc 4620

gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 4680

tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 4740

acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 4800

aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 4860

cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 4920

gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 4980

tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 5040

tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 5100

cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 5160

gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 5220

ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt 5280

ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 5340

ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 5400

agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 5460

aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 5520

atccttttaa aggccggccg cggccgccat cggcattttc ttttgcgttt ttatttgtta 5580

actgttaatt gtccttgttc aaggatgctg tctttgacaa cagatgtttt cttgcctttg 5640

atgttcagca ggaagctcgg cgcaaacgtt gattgtttgt ctgcgtagaa tcctctgttt 5700

gtcatatagc ttgtaatcac gacattgttt cctttcgctt gaggtacagc gaagtgtgag 5760

taagtaaagg ttacatcgtt aggatcaaga tccattttta acacaaggcc agttttgttc 5820

agcggcttgt atgggccagt taaagaatta gaaacataac caagcatgta aatatcgtta 5880

gacgtaatgc cgtcaatcgt catttttgat ccgcgggagt cagtgaacag gtaccatttg 5940

ccgttcattt taaagacgtt cgcgcgttca atttcatctg ttactgtgtt agatgcaatc 6000

agcggtttca tcactttttt cagtgtgtaa tcatcgttta gctcaatcat accgagagcg 6060

ccgtttgcta actcagccgt gcgtttttta tcgctttgca gaagtttttg actttcttga 6120

cggaagaatg atgtgctttt gccatagtat gctttgttaa ataaagattc ttcgccttgg 6180

tagccatctt cagttccagt gtttgcttca aatactaagt atttgtggcc tttatcttct 6240

acgtagtgag gatctctcag cgtatggttg tcgcctgagc tgtagttgcc ttcatcgatg 6300

aactgctgta cattttgata cgtttttccg tcaccgtcaa agattgattt ataatcctct 6360

acaccgttga tgttcaaaga gctgtctgat gctgatacgt taacttgtgc agttgtcagt 6420

gtttgtttgc cgtaatgttt accggagaaa tcagtgtaga ataaacggat ttttccgtca 6480

gatgtaaatg tggctgaacc tgaccattct tgtgtttggt cttttaggat agaatcattt 6540

gcatcgaatt tgtcgctgtc tttaaagacg cggccagcgt ttttccagct gtcaatagaa 6600

gtttcgccga ctttttgata gaacatgtaa atcgatgtgt catccgcatt tttaggatct 6660

ccggctaatg caaagacgat gtggtagccg tgatagtttg cgacagtgcc gtcagcgttt 6720

tgtaatggcc agctgtccca aacgtccagg ccttttgcag aagagatatt tttaattgtg 6780

gacgaatcaa attcagaaac ttgatatttt tcattttttt gctgttcagg gatttgcagc 6840

atatcatggc gtgtaatatg ggaaatgccg tatgtttcct tatatggctt ttggttcgtt 6900

tctttcgcaa acgcttgagt tgcgcctcct gccagcagtg cggtagtaaa ggttaatact 6960

gttgcttgtt ttgcaaactt tttgatgttc atcgttcatg tctccttttt tatgtactgt 7020

gttagcggtc tgcttcttcc agccctcctg tttgaagatg gcaagttagt tacgcacaat 7080

aaaaaaagac ctaaaatatg taaggggtga cgccaaagta tacactttgc cctttacaca 7140

ttttaggtct tgcctgcttt atcagtaaca aacccgcgcg atttactttt cgacctcatt 7200

ctattagact ctcgtttgga ttgcaactgg tctattttcc tcttttgttt gatagaaaat 7260

cataaaagga tttgcagact acgggcctaa agaactaaaa aatctatctg tttcttttca 7320

ttctctgtat tttttatagt ttctgttgca tgggcataaa gttgcctttt taatcacaat 7380

tcagaaaata tcataatatc tcatttcact aaataatagt gaacggcagg tatatgtgat 7440

gggttaaaaa ggatcggcgg ccgctcgatt taaatctcga gaggcctgac gtcgggcccg 7500

gtacca 7506

Claims

1.在棒状细菌中生产甲硫氨酸的方法，包括如下步骤：

培养通过遗传修饰衍生自起始生物体的至少一种棒状细菌，所述棒状细菌与起始生物体相比显示出戊糖磷酸途径的至少一种酶的量和/或活性增加。

2.权利要求1的方法，其中与起始生物体相比，至少转酮醇酶、转醛醇酶、葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶或者6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性增加。

3.权利要求1或2的方法，其中与起始生物体相比，至少转酮醇酶和葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶、转酮醇酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶或者葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性增加。

4.权利要求3的方法，其中与起始生物体相比，至少转酮醇酶、葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性增加。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述酶的量和/或活性是通过增加编码所述酶的核酸序列的拷贝数、增加编码所述酶的核酸序列的转录和/或翻译、在编码所述酶的核酸序列中导入突变、或者这些措施的组合而增加。

6.权利要求5的方法，其中基因拷贝数通过使用包含编码所述酶的核酸序列的自主复制载体而增加，和/或通过将编码所述酶的核酸序列的额外拷贝经染色体整合进起始生物体的基因组中而增加。

7.权利要求5的方法，其中转录通过使用强启动子而增加。

8.权利要求7的方法，其中所述强启动子选自P_EFTu、P_groES、P_SOD和P_λR。

9.权利要求8的方法，其中使用启动子P_SOD。

10.权利要求7的方法，其中通过用强启动子优选P_SOD置换其各自的内源启动子，转酮醇酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性与起始生物体相比增加。

11.权利要求5的方法，其中转酮醇酶在相应于SEQ ID No.12的293或者327位置具有至少一个突变，以及6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶在相应于SEQ ID No.6的150、209、269、288、329、330或者353位置具有至少一个突变。

12.权利要求10和11的方法，其中通过用强启动子优选P_SOD置换其各自的内源启动子，转酮醇酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性与起始生物体相比增加，其中转酮醇酶在相应于SEQ ID No.12的293或者327位置具有至少一个突变，6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶在相应于SEQ ID No.6的150、209、269、288、329、330或者353位置具有至少一个突变。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述棒状细菌选自谷氨酸棒杆菌、醋谷氨酸棒杆菌、杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeum)、嗜醋酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacteriummelassecola)和Corynebacterium effiziens。

14.权利要求13的方法，其中使用谷氨酸棒杆菌菌株。

15.权利要求1-14任一项的方法，其中与起始生物体相比产生多至少大约2％、至少大约5％、至少大约10％、至少大约20％、优选至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％以及更优选至少大约2倍、至少大约5倍以及至少大约10倍的甲硫氨酸。

16.棒状细菌，其中所述棒状细菌通过遗传修饰衍生自起始生物体，由此所述棒状细菌显示与起始生物体相比戊糖磷酸途径的至少两种酶的量和/或活性增加。

17.权利要求16的棒状细菌，其中与起始生物体相比至少转酮醇酶和葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶、转酮醇酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶或者葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性增加。

18.权利要求17的棒状细菌，其中与起始生物体相比至少转酮醇酶、葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性增加。

19.权利要求16-18任一项的棒状细菌，其中所述酶的量和/或活性是通过增加编码所述酶的核酸序列的拷贝数、增加编码所述酶的基因的转录和/或翻译、在编码所述酶的核酸序列中导入突变、或者这些措施的组合而增加。

20.权利要求19的棒状细菌，其中基因拷贝数通过使用包含编码所述酶的核酸序列的自主复制载体而增加，和/或通过将编码所述酶的核酸序列的额外拷贝经染色体整合进起始生物体的基因组中而增加。

21.权利要求19的棒状细菌，其中转录通过使用强启动子而增加。

22.权利要求21的棒状细菌，其中所述强启动子选自P_EFTu、P_groES、P_SOD和P_λR。

23.权利要求22的棒状细菌，其中使用启动子P_SOD。

24.权利要求21的棒状细菌，其中通过用强启动子优选P_SOD置换其各自的内源启动子，转酮醇酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性与起始生物体相比增加。

25.权利要求19的棒状细菌，其中转酮醇酶在相应于SEQ ID No.12的293或者327位置具有至少一个突变，以及6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶在相应于SEQ ID No.6的150、209、269、288、329、330或者353位置具有至少一个突变。

26.权利要求24和25的棒状细菌，其中通过用强启动子优选P_SOD置换其各自的内源启动子，转酮醇酶和6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶的量和/或活性与起始生物体相比增加，其中转酮醇酶在相应于SEQ ID No.12的293或者327位置具有至少一个突变，6-磷酸-葡糖酸-脱氢酶在相应于SEQ ID No.6的150、209、269、288、329、330或者353位置具有至少一个突变。

27.权利要求16-26任一项的棒状细菌，其中所述棒状细菌选自谷氨酸棒杆菌、醋谷氨酸棒杆菌、杰氏棒杆菌、嗜醋酸棒状杆菌、热产氨棒状杆菌、栖糖蜜棒杆菌和Corynebacterium effiziens。

28.权利要求27的棒状细菌，其中使用谷氨酸棒杆菌菌株。

29.权利要求16-28任一项的棒状细菌，其中与起始生物体相比产生多至少大约2％、至少大约5％、至少大约10％、至少大约20％、优选至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％以及更优选至少大约2倍、至少大约5倍以及至少大约10倍的甲硫氨酸。

30.权利要求16-29任一项的棒状细菌在生产甲硫氨酸中的应用。