BRPI0520842A2 - unidade de expressão recombinante compreendendo promotor múltiplo, cassete de expressão, vetor, microorganismo geneticamente modificado, processo para preparar um produto biossintético diferente de lisina, e, uso de uma unidade de expressão - Google Patents

Abstract

UNIDADE DE EXPRESSãO RECOMBINANTE COMPREENDENDOPROMOTOR MULTIPLO, CASSETE DE EXPRESSãO, VETOR, MICROORGAMSMO GENETICAMIENTE MODIFICADO, PROCESSO PARA PREPARAR UM PRODUTO BIOSSINTéTICO DIFERENTE DE USINA, E, USO DE UMA UNIDADE DE EXPRESSãO. A invenção diz respeito a promotores múltiplos e unidades de expressão de gene, ao uso destes para regular a transcrição e expressão de gene, aos cassetes de expressão contendo os ditos promotores múltiplos ou unidades de expressão, aos vetores contendo os ditos cassetes de expressão, aos microorganismos geneticamente modificados contendo os ditos vetores e/ou as ditas unidades de expressão e aos métodos para preparar produtos biossintéticos pelo cultivo de microorganismos geneticamente modificados.

Description

"UNIDADE DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE COMPREENDENDO PROMOTOR MÚLTIPLO, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR, MICROORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, PROCESSO PARA PREPARAR UM PRODUTO BIOSSINTÉTICO DIFERENTE DE LISINA, E, USO DE UMA UNIDADE DE EXPRESSÃO"

Dividido do PI0519165-3, depositado em 21/12/2005

A presente invenção diz respeito a promotores múltiplos e às unidades de expressão que os compreendem; ao uso destes para regular a transcrição e expressão de genes; aos cassetes de expressão que compreendem promotores múltiplos ou unidades de expressão deste tipo; aos vetores que compreendem tais cassetes de expressão; aos microorganismos geneticamente modificados que compreendem vetores e/ou unidades de expressão deste tipo; e aos processos para preparar produtos biossintéticos pelo cultivo dos ditos microorganismos geneticamente modificados.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Vários produtos biossintéticos são produzidos em células por intermédio de processos metabólicos naturais e são usados em muitos ramos da indústria, que incluem as indústrias de gêneros alimentícios, alimentos para animais, cosméticos, ração, alimentícias e farmacêuticas, Estas substâncias, que são resumidamente aludidos como produtos químicos finos/proteínas, compreendem, inter alia, ácidos orgânicos, tanto aminoácidos proteinogênicos e não proteinogênicos, nucleotídeos e nucleosídeos, lipídeos e ácidos graxos, dióis, carboidratos, compostos aromáticos, vitaminas e co- fatores e também proteínas e enzimas. Estes são mais convenientemente produzidos em uma larga escala pelo cultivo de cepas bacterianas ou outros microorganismos que foram desenvolvidos de modo a produzir e secretar grandes quantidades da substância desejada em cada caso. Organismos particularmente adequados para este propósito são bactérias corineformes, bactérias Gram-positivas não patogênicas. E conhecido que os aminoácidos podem ser preparados pela fermentação de cepas de bactérias corineformes, em particular Corynebacterium glutamicum. Devido à enorme importância, trabalho contínuo é realizado na melhora dos processos de produção. As melhorias do processo podem estar relacionadas com as medidas técnicas de fermentação tais como, por exemplo, agitação e fornecimento de oxigênio ou à composição dos meios nutrientes, tais como, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fermentação ou ao trabalho para se obter o produto, por exemplo pela cromatografia de troca iônica ou ainda pela secagem por pulverização ou às propriedades de desempenho intrínsecas do próprio microorganismo.

Métodos de tecnologia de DNA recombinante têm sido igualmente utilizados por alguns anos para melhorar as cepas de Corynebacterium produtoras de produtos químicos finos/proteínas, pela amplificação de genes individuais e estudando o efeito sobre a produção de produtos químicos finos/proteínas.

Outros modos de desenvolver um processo para produzir produtos químicos finos ou proteínas ou de aumentar ou melhorar a produtividade de um processo já existente para preparar produtos químicos finos ou proteínas compreendem aumentar ou alterar a expressão de um ou mais genes e/ou influenciar a tradução de um mRNA por via de seqüências de polinucleotídeo adequadas. Neste contexto, a influencia pode compreender aumentar, reduzir ou então outros parâmetros da expressão de genes, tais como os padrões de expressão relacionados com o tempo.

Vários componentes de seqüências reguladoras bacterianas são conhecidos pelo técnico habilitado. Uma distinção é feita entre os sítios de ligação de reguladores, também conhecidos como operadores, os sítios de ligação de holoenzimas da RNA polimerase, também conhecido como regiões -35 e -10 e o sítio de ligação de 16S-RNA ribossômico, também conhecido como sítio de ligação ribossômico (RBS) ou então seqüência de Shine- Dalgarno.

A composição da seqüência de polinucleotídeo da seqüência de Shine-Dalgarno e a seqüência das bases, mas também a distância de uma seqüência de polinucleotídeo presente na seqüência de Shine-Dalgarno em relação ao códon de partida são descritos na literatura (E. coli e S. typhimurium, Neidhardt F. C. 1995 ASM Press) como tendo uma influência substancial sobre a taxa de início de tradução.

As seqüências de ácido nucleico tendo atividade promotora pode influenciar a formação de mRNA em diferentes modos. Os promotores cujas atividades são independentes da fase de crescimento fisiológico do organismo são aludidos como constitutivos. Outros promotores por sua vez respondem aos estímulos químicos assim como aos físicos externos, tais como oxigênio, metabólitos, calor, pH, etc. Outros por sua vez demonstram uma dependência forte da sua atividade em diferentes fases de crescimento. Os exemplos de promotores que exibem uma atividade particularmente pronunciada durante a fase de crescimento exponencial de microorganismos ou então exatamente na fase estacionária do crescimento microbiano, são descritos na literatura. Ambas as características de promotores podem ter uma influência benéfica sobre a produtividade para a produção de produtos químicos finos e proteínas, dependendo do caminho metabólico.

Estas seqüências de nucleotídeo que podem ser utilizadas para aumentar ou atenuar a expressão de gene já foram isoladas em espécies de Corynebacterium. Estes promotores regulados podem aumentar ou reduzir a taxa na qual um gene é transcrito, como uma função das condições internas e/ou externas da célula. Em alguns casos, a presença de um fator particular, conhecido como indutor, pode estimular a taxa de transcrição do promotor. Indutores podem influenciar a transcrição do promotor diretamente ou então indiretamente. Outra classe de fatores, conhecidos como supressores, é capaz de reduzir ou então inibir a transcrição do promotor. Como indutores, supressores também podem atuar direta ou indiretamente. Entretanto, promotores termicamente regulados também são conhecidos. Assim, uma elevação da temperatura de cultivo acima da temperatura de cultivo normal da célula pode aumentar ou então atenuar o nível de transcrição de tais promotores.

Um número pequeno de promotores de C. glutamicum foram descritos até agora. O promotor do gene da malato sintase de C. glutamicum foi descrito na DE-A-44 40 118. Este promotor foi colocado a montante de um gene estrutural que codifica uma proteína. Depois da transformação de uma tal construção em uma bactéria corineforme, a expressão do gene estrutural a jusante do promotor é regulada. A expressão do gene estrutural é induzida assim que um indutor correspondente é adicionado ao meio.

Reinscheid et ai, Microbiology 145: 503 (1999), descreveram uma fusão transcricional entre o promotor pta-ack de C. glutamicum e um gene repórter (cloranfenicol acetiltransferase). As células de C. glutamicum contendo uma tal fusão transcricional exibiram expressão aumentada do gene repórter quando cultivadas em meio contendo acetato. Por comparação, o cultivo de células transformadas em glicose não mostrou nenhuma expressão aumentada do dito gene repórter.

Patek et al., Microbiology 142: 1297 (1996), descrevem algumas seqüências de DNA de C. glutamicum que são capazes de realçar a expressão de um gene repórter em células de C. glutamicum. Estas seqüências foram comparadas entre si de modo a definir as seqüências de consenso para os promotores de C. glutamicum.

Outras seqüências de DNA de C. glutamicum que podem ser utilizadas para regular a expressão de gene foram descritas na WO 02/40679. Estes polinucleotídeos isolados são unidades de expressão de Corynebacterium glutamicum, que podem ser utilizadas para aumentar ou então para reduzir a expressão de gene. Esta publicação impressa além disso descreve plasmídeos recombinantes nos quais as ditas unidades de expressão de Corynebacterium glutamicum estão associadas com genes heterólogos. O método aqui descrito, de fundir um promotor de Corynebacterium glutamicum a um gene heterólogo, pode ser utilizado, inter alia, para regular os genes da biossíntese de aminoácido.

Os pedidos de patente não previamente publicados, mais velhos DE-A-103 59 594, DE-A-103 59 595, DE-A-103 59 660 e DE-A-10 2004 035 065 divulgaram promotores únicos especiais de C. glutamicum.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A invenção foi fundamentada no objetivo de fabricar outras seqüências reguladoras de ácido nucleico disponíveis, em particular construções promotoras e/ou unidades de expressão tendo propriedades vantajosas, por exemplo atividade transcricional e/ou atividade traducional aumentadas ou alteradas, em comparação com o promotor de partida.

O objetivo foi alcançado de acordo com a invenção pelo fornecimento de uma unidade de expressão que compreende promotor múltiplo, compreendendo, na direção 5'-3', um módulo de seqüência da seguinte fórmula I:

5'-Pr(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3' (I)

onde

η é um número inteiro de 0 a 10,

Ax e Ay são idênticos ou diferentes e são uma ligação química ou uma seqüência ligadora de ácido nucleico;

Pi, Px e Py codificam seqüências promotoras idênticas ou diferentes que compreendem pelo menos uma região de ligação da RNA polimerase tal como, por exemplo, a região de núcleo; e pelo menos Py compreende uma seção de seqüência de terminal 3' que medeia a ligação de ribossoma. Pi e individual ou todo Px também podem ter, independentemente urn do outro, uma seção de seqüência deste tipo, que medeia a ligação de ribossoma.

De acordo com um forma de realização, P1, Px e Py são derivados de organismos eucarióticos ou, em particular, procarióticos idênticos ou diferentes. Os promotores artificiais também são utilizáveis.

De acordo com uma forma de realização preferida, P1, Px e Py são em cada caso derivados de uma seqüência contígua de 35 a 500 resíduos de nucleotídeo, preferivelmente de 35 a 300 resíduos de nucleotídeo, mais preferivelmente de 35 a 210 resíduos de nucleotídeo e de modo muito particularmente preferível de 35 a 100 resíduos de nucleotídeo, seqüência esta que está localizada 5' a montante da seqüência codificadora para uma proteína, por exemplo uma proteína envolvida em um caminho biossintético do organismo, no genoma do dito organismo.

De acordo com outra forma de realização, Pb Px e Py da unidade de expressão são derivados de uma bactéria corineforme.

De acordo com uma forma de realização preferida, P1, Px e Py da unidade de expressão são, independentemente um do outro, selecionados dentre as seqüências promotoras para a seqüência codificadora de uma proteína com alta abundância em um organismo eucariótico ou procariótico, em particular em uma bactéria corineforme, tais como, por exemplo, em um dos gêneros Corynebacterium ou Brevibacterium, por exemplo uma espécie ou uma cepa de acordo com a lista na Tabela 3.

Além disso, individual ou todas destas seqüências promotoras podem ser selecionadas dentre as seqüências promotoras para a seqüência codificadora de uma proteína listada na Tabela 1 e envolvida na biossíntese de aminoácido de um organismo. Pelo menos um dos promotores da unidade de expressão de acordo com a invenção, neste contexto, deve ter entretanto alta abundância como aqui definido.

De acordo com outra forma de realização preferida, P1, Px e Py da unidade de expressão são, independentemente um do outro, selecionados dentre as seqüências de nucleotídeo representadas na figura 1 ou, como será explicado mais tarde em mais detalhes, são derivados da SEQ ID NO: 1 (pGRO), SEQ ID NO: 2 (pEFTs), SEQ ID NO: 3 (pEFTu) e SEQ ID NO: 4 (pSOD).

De acordo com outra forma de realização, P1, Px e Py da unidade de expressão, independentemente um do outro, são selecionados dentre promotores fortes, constitutivos ou reguláveis.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um cassete de expressão, que compreende, na direção 5'-3', um módulo de seqüência da seguinte fórmula II:

<formula>formula see original document page 8</formula> (II)

onde

n, Ax, Ay, Px e Py são como definidos acima, e

G é pelo menos uma seqüência codificadora de ácido nucleico que é funcional ou operativamente ligado à seqüência reguladora a montante 5'.

De acordo com uma forma de realização preferida do cassete de expressão, G é selecionado dentre

a) ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de aminoácidos proteinogênicos e não proteinogênicos,

b) ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de nucleotídeos e nucleosídeos,

c) ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de ácidos orgânicos,

d) ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de lipídeos e ácidos graxos,

e) ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de dióis, f) ácidos nucleicos que codificam .uma proteína do caminho biossintético de carboidratos,

g) ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de compostos aromáticos,

h) ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de vitaminas,

i) ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de co-fatores,

j) ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de enzimas, e

k) ácidos nucleicos que codificam uma proteína do metabolismo central.

De acordo com uma forma de realização particularmente preferida do cassete de expressão, G é selecionado dentre ácidos nucleicos que codificam proteínas do caminho biossintético de aminoácidos, selecionados dentre aspartato quinase, aspartato semialdeído desidrogenase, diaminopimelato desidrogenase, diaminopimelato descarboxilase, diidrodipicolinato sintetase, diidrodipicolinato redutase, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, 3-fosfoglicerato quinase, piruvato carboxilase, triosefosfato isomerase, regulador transcricional LuxR, regulador transcricional LysRl, regulador transcricional LysR2, malato-quinona oxidorredutase, glicose-6-fosfato desidrogenase, 6-fosfogliconato desidrogenase, transcetolase, transaldolase, homosserina O-acetiltransferase, cistationina gama-sintase, cistationina beta-liase, serina hidroximetiltransferase,O-acetil-homosserina sulfidrilase, metilenotetraidrofoliato redutase, fosfosserina aminotransferase, fosfosserina fosfatase, serina acetiltransferase, homosserina desidrogenase, homosserina quinase, treonina sintase, veículo exportador de treonina, treonina desidratase, piruvato oxidase, exportador de lisina, biotina ligase, cisteína sintase I, cisteína sintase II, metionina sintase dependente da coenzima B12, atividade da metionina sintase independente da coenzima B12, subunidades 1 e 2 da sulfato adenililtransferase, fosfoadenosina fosfossulfato redutase, ferredoxina sulfito redutase, ferredoxina NADP redutase, 3-fosfoglicerato desidrogenase, regulador RXA00655, regulador RXN2910, arginil-tRNA sintetase, fosfoenolpiruvato carboxilase, proteína do efluxo de treonina, serina hidroximetiltransferase, frutose 1,6-bisfosfatase, proteína da redução de sulfato RXA077, proteína de redução de sulfato RXA248, proteína de redução de sulfato RXA247, proteína OpcA, 1 -fosfofrutoquinase e 6- fosfofrutoquinase, tetraidropicolinato succinilase, succinil aminocetopimelato aminotransferase, succinil diaminopimelato dessuccinilase, diaminopimelato epimerase, 6-fosfoglucanato desidrogenase, glicose fosfato isomerase, fosfoglicerato mutase, enolase, piruvato quinase, aspartato transaminase, enzima de malato.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um vetor que compreende pelo menos um dos cassetes de expressão supracitados.

Também de acordo com outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um microorganismo geneticamente modificado que foi transformado com pelo menos um dos vetores supracitados ou que compreende pelo menos um dos cassetes de expressão supracitados, preferivelmente em uma forma integrada.

De acordo com uma forma de realização, no geral o organismo modificado é derivado de bactérias corineformes.

De acordo com uma forma de realização preferida, o organismo geneticamente modificado é derivado de bactérias do gênero Corynebacterium ou Brevibacterium.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um processo para preparar um produto biossintético, que compreende cultivar qualquer um dos microorganismos geneticamente modificados supracitados e isolar o produto desejado da cultura.

De acordo com uma forma de realização do processo, o produto biossintético é selecionado dentre ácidos orgânicos, proteínas, nucleotídeos e nucleosídeos, aminoácidos tanto proteinogênicos quanto não proteinogênicos, lipídeos e ácidos graxos, dióis, carboidratos, compostos aromáticos, vitaminas e co-fatores, enzimas e proteínas. Os produtos biossintéticos muito particularmente preferidos são lisina, metionina, treonina e trealose.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção diz respeito ao uso de uma unidade de expressão da invenção para regular uma biossíntese de produto.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 representa seqüências específicas para quatro promotores, que foram usados para preparar os promotores múltiplos descritos nas formas de realização exemplares. As seqüências promotoras para pEFTu (Figura IA); para o promotor pGRO (Figura 1 B), para o promotor pEFTs (Figura 1C) e para o promotor pSOD (Figura 1D) são mostrados. Duas seqüências são indicadas para cada promotor, o mais longo dos quais (seqüência de topo) em cada caso indicando a seqüência promotora completa que inclui o sítio de ligação ribossômico (RBS), impresso no tipo negrito e em itálicos. No caso de um arranjo de terminal 3' do promotor particular na construção de promotor múltiplo da invenção, preferência é dada ao uso em cada caso da seqüência de nucleotídeo mais longa (que inclui RBS). As seqüências promotoras 5' a montante da unidade promotora de terminal 3' não compreendem nenhum RBS e foram usadas na seqüência de ácido nucleico trancada indicada em cada caso na segunda posição (sem RBS). As seqüências promotoras mais curtas também podem carecer, se apropriado, das seqüências parciais de terminal 3' indicadas em letras maiúsculas e tipo negrito. As "regiões -10" potenciais estão sublinhadas. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

I. Definições Gerais:

Um "produto biossintético" significa para os propósitos da invenção aqueles que são produzidos por intermédio de processos metabólicos naturais (caminhos biossintéticos) em células. Estes são usados em muitos modos diferentes, em particular nos gêneros alimentícios, alimentos para animais, cosméticos, indústrias de ração, alimentícias e farmacêuticas industries. Estas substâncias que são resumidamente aludidas como produtos químicos finos/proteínas compreendem, inter alia, ácidos orgânicos, aminoácidos tanto proteinogênicos quanto não proteinogênicos, nucleotídeos e nucleosídeos, lipídeos e ácidos graxos, dióis, carboidratos, compostos aromáticos, vitaminas e co-fatores e também proteínas e enzimas.

Um "promotor", um "ácido nucleico com atividade promotora" ou uma "seqüência promotora" significam de acordo com a invenção um ácido nucleico que esteja funcionalmente ligado a um ácido nucleico a ser transcrito e que regula a transcrição do dito ácido nucleico.

A menos que "promotores únicos" sejam expressamente aludidos, o termo "promotor" compreende de acordo com a invenção e dependendo do contexto também o arranjo seqüencial de mais do que uma seqüência de ácido nucleico (isto é, "promotores múltiplos") cada um dos quais, quando funcionalmente ligado a um ácido nucleico a ser transcrito, pode ser capaz de regular a transcrição do último.

O termo "promotor único" conseqüentemente refere-se a uma única seqüência de ácido nucleico que é capaz de regular a transcrição de um ácido nucleico a ser transcrito e que, quando funcionalmente ligada a um ácido nucleico a ser transcrito, pode transcrever o último.

No caso de "promotores múltiplos", pelo menos duas seqüências de ácido nucleico idênticas ou diferentes cada uma das quais, quando funcionalmente ligada a um ácido nucleico a ser transcrito, pode ser capaz de regular a transcrição do último (promotores únicos) são seqüencialmente ligadas em um tal modo que um início transcricional opcionalmente de uma das ditas seqüências de ácido nucleico pode produzir um transcrito contendo o dito ácido nucleico a ser transcrito. Neste contexto, é possível para as outras seqüências sem função promotora, por exemplo um ligador que tenha, por exemplo, um ou mais sítios de clivagem de restrição, a ser inserido em cada caso entre dois promotores únicos. Opcionalmente, em cada caso dois promotores únicos também podem estar ligados diretamente entre si. Os ditos promotores múltiplos preferivelmente contêm apenas um sítio de ligação ribossômico (RBS), em particular na região do término 3' do promotor.

As seqüências promotoras para a seqüência codificadora de uma proteína com "alta abundância' significam em particular "promotores fortes". Se é intencionado utilizar promotores múltiplos de modo a realçar os genes, preferência é dada a combinar em uma maneira adequada tais promotores fortes. Os promotores fortes regulam a transcrição de genes de modo que o último seja mais freqüentemente lido pela RNA polimerase do que a maioria dos genes do organismo. Na maioria dos casos, a presença de um promotor forte resulta em uma grande quantidade de transcrito também estando presente na célula. Quando a porcentagem do dito transcrito é superior em comparação com os outros transcritos celulares, isto é aludido como um "transcrito abundante". Em bactérias, a quantidade de transcrito e a quantidade da proteína correspondente deste modo codificada usualmente estão correlacionadas, isto é, "transcritos abundantes" também resultam em "proteínas abundantes" na maioria das vezes. Um método que possibilita "promotores fortes" a ser identificado por intermédio da abundância de proteínas é descrito abaixo por via de exemplo. Detalhes do procedimento metódico e outras referências podem ser encontrados, por exemplo, em Proteomics in Practice - A Laboratory Manual of Proteome Analysis (Autores: R. Westermeier, T. Naven; Editor: Wiley-VCH Verlag GmbH, 2002). As células bacterianas são rompidas e as proteínas do extrato celular são fracionados por meio da eletroforese em gel 2D. As proteínas são depois tingidas pelos métodos comuns tais como, por exemplo, tingimento com Coomassie, prata ou pigmento fluorescente. O tingimento excessivo das proteínas deve ser evitado aqui de modo a possibilitar que as manchas de proteína individuais sejam quantificadas mais tarde. Subseqüentemente, o gel é escaneado e a imagem obtida é analisada com a ajuda de software adequado (por exemplo, Melanie, Amersham Biosciences). Para este propósito, todas as manchas detectáveis são identificadas primeiro e o volume de mancha é determinado. A soma de todos os volumes de mancha corresponde, em uma primeira aproximação, à proteína total. As manchas que têm volumes de mancha particularmente grandes podem ser depois selecionadas com a ajuda do software de análise de imagem. Por exemplo, as manchas com volumes que ocupam mais do que 0,1 % do volume de mancha total pode ser aludido como abundante. Subseqüentemente, as manchas contendo proteínas particularmente abundante são cortadas do gel. Normalmente, a proteína presente na fatia de gel é depois proteoliticamente digerida (por exemplo, com tripsina) e a massa molar dos peptídeos resultantes é determinada, por exemplo com a ajuda de MALDI-ToF MS (ionização de dessorção a laser auxiliada por matriz - Espectrometria de Massa em Tempo de Vôo). Com base na massa molar de alguns dos peptídeos trípticos da proteína, a proteína correspondente pode ser depois identificada em pesquisas de base de dados. Isto é possível em particular se o genoma do organismo a ser estudado foi seqüenciado, como é o caso para C. glutamicum, E. coli e muitas outras bactérias. A ORF (matriz de leitura aberta) que codifica as ditas proteínas pode ser depois determinada com base na identidade da dita proteína. Em bactérias, os promotores que regulam o dito gene são usualmente localizados imediatamente a montante do códon de partida. Portanto, os promotores "fortes" freqüentemente também estão presentes em uma região de aprox. 200 nucleotídeos a montante do códon de partida de proteínas "abundantes".

Promotores "artificiais" para os propósitos da invenção compreendem em particular aquelas seqüências que não têm nenhuma atividade transcricional in situ e que são transcricionalmente ativos em um outro contexto de seqüência, tais como, em particular, no contexto de uma unidade de expressão ou cassete de expressão da invenção.

"Atividade promotora" significa de acordo com a invenção a quantidade de RNA formada pelo promotor em um tempo particular, isto é a taxa de transcrição.

Atividade promotora "específica" significa de acordo com a invenção a quantidade de RNA formada pelo promotor em um tempo particular, para cada promotor.

No caso de uma atividade promotora ou taxa de transcrição "causadas" com respeito a um gene, em comparação com o tipo selvagem, assim, em comparação com o tipo selvagem, a formação de um RNA que não estava presente nesta forma no tipo selvagem é causada.

No caso de uma atividade promotora ou taxa de transcrição "alterada" com respeito a um gene, em comparação com o tipo selvagem, assim, em comparação com o tipo selvagem, a quantidade de RNA formado em um tempo particular é alterada.

"Alterada" neste contexto significa preferivelmente aumentada ou reduzida.

Uma ligação "funcional" ou "operativa" significa neste contexto, por exemplo, o arranjo seqüencial de qualquer um dos ácidos nucleicos da invenção que têm atividade promotora e uma seqüência de ácido nucleico a ser transcrito e, se apropriado, outros elementos reguladores tais como, por exemplo, seqüências de ácido nucleico que garantem a transcrição de ácidos nucleicos, assim como um terminador, por exemplo, de modo que paira cada um dos ditos elementos reguladores a serem capazes de satisfazer a sua função na transcrição da dita seqüência de ácido nucleico. Isto não requer necessariamente uma ligação direta no sentido químico. As seqüências de controle genético tais como, por exemplo, as seqüências realçadoras podem exercer a sua função sobre a seqüência alvo também a partir de posições mais distantes ou ainda de outras moléculas de DNA. Preferência é dada aos arranjos em que a seqüência de ácido nucleico a ser transcrita é posicionada por detrás (isto é na extremidade 3') da seqüência promotora da invenção, de modo que as duas seqüências sejam covalentemente conectadas entre si. A distância entre a seqüência promotora e a seqüência de ácido nucleico a ser transgenicamente expressada é aqui preferivelmente menor do que 200 pares de base, de modo particularmente preferível menos do que 100 pares de base, de modo muito particularmente preferível menos do que 50 pares de base.

A seqüência de um "sítio de ligação ribossômico" ou "sítio de ligação de ribossoma" (RBS) (ou aludido como seqüência de Shine-Dalgarno) de acordo com a presente invenção significa seqüências de polinucleotídeo ricas em AJG que estão localizadas até 30 bases a montante do códon de início de tradução.

"Transcrição" significa de acordo com a invenção o processo que, partindo de um padrão de DNA, produz uma molécula de RNA complementar. Este processo envolve proteínas tais como a RNA polimerase, "fatores sigma" e proteínas reguladoras transcricionais. O RNA sintetizado serves depois como padrão no processo de tradução que depois resulta na proteína biossinteticamente ativa.

Uma "região de núcleo" de um promotor significa de acordo com a invenção uma seqüência contígua de ácido nucleico de cerca de 20 a 80 ou 30 a 60, nucleotídeos, que compreendem pelo menos uma "região -10" potencial. Os exemplos de regiões -10 potenciais são aqui descritos para as seqüências promotoras preferidas individuais; comparar a Figura 1 em particular. As "regiões -10" também são aludidas como caixas TATA ou seqüências de Pribnow-Schaller. Cada promotor usado deve compreender pelo menos uma destas regiões -10 potenciais, por exemplo 1, 2, 3, 4 ou 5. A região de núcleo está localizada 5' a montante do RBS e pode estar a uma distância do último de 1 a 200 ou 10 a 150 ou 20 a 100 resíduos de nucleotídeo.

Uma "unidade de expressão" significa de acordo com a invenção um ácido nucleico tendo atividade de expressão, que compreende um promotor múltiplo como aqui definido e que, depois da ligação funcional a um ácido nucleico ou um gene a ser expressado, regula a expressão, isto é a transcrição e tradução, do dito ácido nucleico ou dito gene. Neste contexto, portanto, a dita seqüência de ácido nucleico também é aludida como uma "seqüência de ácido nucleico reguladora". Além da construção de promotor múltiplo, outros elementos reguladores tais como, por exemplo, realçadores, podem estar presentes.

Um "cassete de expressão" significa de acordo com a invenção uma unidade de expressão que seja funcionalmente ligada ao ácido nucleico a ser expressado ou ao gene a ser expressado. Ao contrário de uma unidade de expressão, um cassete de expressão compreende assim não apenas seqüências de ácido nucleico de transcrição e tradução regulares mas também às seqüências de ácido nucleico que devam ser expressadas como proteína como um resultado da transcrição e tradução.

"Atividade de expressão" significa de acordo com a invenção a quantidade de proteína formada pelo cassete de expressão ou a sua unidade de expressão em um tempo particular, isto é a taxa de expressão.

"Atividade de expressão específica" significa de acordo com a invenção a quantidade de proteína formada pelo cassete de expressão ou a sua unidade de expressão em um tempo particular, para cada unidade de expressão. No caso de uma "atividade de expressão causada" ou taxa de expressão com respeito a um gene, em comparação com o tipo selvagem, assim, em comparação com o tipo selvagem, a formação de uma proteína que não estava presente nesta forma no tipo selvagem é causada.

No caso de uma atividade de expressão ou taxa de expressão "alteradas" com respeito a um gene, em comparação com o tipo selvagem, assim, em comparação com o tipo selvagem, a quantidade de proteína formada em um tempo particular é alterada. "Alterada" neste contexto significa preferivelmente aumentada ou reduzida. Isto pode ocorrer, por exemplo, aumentando-se ou reduzindo-se a atividade específica da unidade de expressão endógena, por exemplo por via de mutação ou por via de estimulação ou inibição. A atividade de expressão ou taxa de expressão alterada além disso pode ser obtida, por exemplo, pela expressão regular de genes no microorganismo pelas unidades de expressão da invenção, os genes sendo heterólogos com respeito às unidades de expressão.

A "taxa de formação" na qual uma proteína biossinteticamente ativa é produzida é um produto das taxas de transcrição e tradução. Ambas as taxas podem ser influenciadas de acordo com a invenção e assim influenciam a taxa de formação de produtos/produtos químicos finos em um microorganismo.

O termo "tipo selvagem" significa de acordo com a invenção o microorganismo de partida apropriado e não necessita necessariamente corresponder a um organismo que ocorre naturalmente.

Dependendo do contexto, o termo "microorganismo" pode significar o microorganismo de partida (tipo selvagem) ou um microorganismo geneticamente modificado da invenção ou ambos.

Preferivelmente e em particular em casos onde não é possível designar o microorganismo ou o tipo selvagem de modo não ambíguo, "tipo selvagem" para alterar ou causar a atividade promotora ou a taxa de transcrição, para alterar ou causar a atividade de expressão ou a taxa de expressão e para aumentar o teor de produto biossintético em cada caso significa um "organismo de referência". Em uma forma de realização preferida, este "organismo de referência" é Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ou um microorganismo derivado de ATCC 13032 pela mutação específica ou não específica.

Uso é feito em particular de "microorganismos de partida" que já são capazes de produzir o produto desejado (produto químico fino/proteína).

Uma seqüência "derivada", por exemplo uma seqüência promotora derivada, significa de acordo com a invenção, se nenhuma outra informação é dada, uma seqüência cuja identidade com a seqüência de partida é de pelo menos 80 % ou pelo menos 90 %, em particular 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % e 99 %.

"Identidade" entre dois ácidos nucleicos significa a identidade dos nucleotídeos em relação ao comprimento do ácido nucleico inteiro em cada caso, em particular a identidade calculada em comparação com a ajuda do software Vector NTI Suite 7.1 da Informax (USA), que aplica o método Clustal (Higgins D G, Sharp P M. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. Abril de 1989; 5(2): 151-1), ajustando os seguintes parâmetros:

Parâmetros de alinhamento múltiplo:

Penalidade de abertura de intervalo 10 Penalidade de extensão de intervalo 10 Faixa de penalidade de separação de intervalo 8 Penalidade de separação de intervalo desligado % de identidade para a demora de alinhamento 40 Intervalos específicos de resíduo desligado Intervalo de resíduo hidrofílico desligado Pesagem de Transição 0

Parâmetro de alinhamento aos pares:

algoritmo FAST ligado

tamanho K-tuple 1

penalidade de intervalo 3

tamanho da j anela 5

Número de melhores diagonais 5

"Hibridizar" significa a capacidade de um poli- ou oligonucleotídeo para ligar sob condições severas a uma seqüência virtualmente complementar, enquanto que as ligações não específicas entre parceiros não complementares não são formadas sob estas condições. Para este propósito, as seqüências devem ser preferivelmente 90 a 100 % complementares. A propriedade das seqüências complementares serem capazes de ligarem-se especificamente entre si é utilizada, por exemplo, nas Técnicas de Northern ou Southern Blotting ou para a ligação de iniciador na PCR ou RT-PCR.

De acordo com a invenção, a "hibridização" ocorre sob condições severas. As condições de hibridização deste tipo são descritas, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., em: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-9.57 ou em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Condições de hibridização severas significam em particular:

Incubação a 42° C durante a noite em uma solução que consiste de 50 % de formamida, 5 χ SSC (750 mM de NaCl, 75 mM de citrato de trissódio), fosfato de sódio a 50 mM (pH 7,6), 5 χ solução de Denhardt, 10 % de sulfato de dextrano e 20 g/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado, cisalhado, seguido pela lavagem dos filtros com 0,1 χ SSC a 65°C. Um "fragmento funcionalmente equivalente" significa fragmentos de seqüências de ácido nucleico tendo atividade promotora que essencialmente têm a mesma atividade promotora específica ou uma alterada, inferior ou superior do que a da seqüência de partida.

"Essencialmente idênticos" significa uma atividade promotora específica que tenha pelo menos 50 %, tal como, por exemplo, pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou pelo menos 95 %, da atividade promotora específica da seqüência de partida.

II. Unidades de expressão, cassetes de expressão e os seus componentes

a) Unidades de expressão

A presente invenção diz respeito inter alia ao fornecimento de uma unidade de expressão que compreende promotor múltiplo, que compreende, na direção de 5'-3', um módulo de seqüência da seguinte fórmula I:

'-Pr(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3'

onde

η é um número inteiro de 0 a 10, tal como por exemplo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6;

Ax e Ay são idênticos ou diferentes e são uma ligação química, em particular covalente ou uma quimicamente, em particular seqüência de ácido nucleico ligadora covalentemente integrada;

Pi, Px e Py codificam seqüências promotoras idênticas ou diferentes que compreendem pelo menos uma região de ligação da RNA polimerase tais como, por exemplo, uma região de núcleo; e pelo menos, por exemplo apenas, Py compreende uma seção de seqüência de terminal 3' que medeia a ligação de ribossoma.

As seqüências promotoras Pb Px e Py podem ser derivadas de genes de organismos, que codificam proteínas envolvidas em um caminho bipssintético do dito organismo. As seqüências promotoras aqui são localizadas de 20 a 500 resíduos de nucleotídeo ou de 20 a 300 resíduos de nucleotídeo, por exemplo de 20 a 210 resíduos de nucleotídeo e em particular de 20 a 100 ou 35 a 100 resíduos de nucleotídeo, 5' a montante da seqüência codificadora da proteína particular no genoma do dito organismo.

Os exemplos de seqüências das quais as seqüências promotoras Pi, Px e Py podem ser derivadas são os genes listados na Tabela 1 abaixo.

Os exemplos não limitantes de seqüências promotoras especiais são derivados das seqüências de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 e a Figura 1, entretanto sem estarem limitados a estes.

Neste contexto, a SEQ ID NO: 1 corresponde à seqüência localizada a montante da região codificadora da GroES Chaperonina (pGRO), a SEQ ID NO: 2 corresponde à seqüência localizada a montante da região codificadora do fator de alongamento de proteína TS (pEFTs), a SEQ ID NO: 3 corresponde à seqüência localizada a montante da região codificadora do fator de alongamento de proteína TU (pEFTu) e a SEQ ID NO: 4 corresponde à seqüência localizada a montante da região codificadora da superóxido dismutase (pSOD), em cada caso de Corynebacterium glutamicum. A SEQ. ID.NO. 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 correspondem às seqüências promotoras do tipo selvagem.

Uma seqüência "derivada" significa de acordo com a invenção uma seqüência que seja pelo menos 80 % ou pelo menos 90 %, tal como 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % e em particular 99 %, idêntica à seqüência de partida. Este grau de identidade aplica-se em particular à "região de núcleo" definida acima do promotor particular. O grau de identidade fora da região de núcleo particular pode ser aqui mais baixa e pode estar na faixa de 0 a 80 %, tal como, por exemplo, de 10 a 80 %, de 20 a 70 %, de 30 a 60 % ou de 40 a 50 %.

As regiões de núcleo utilizáveis estão localizadas, por exemplo para pGRO na faixa de posição de 50 a 80 da SEQ ID NO: 1; para pEFTs na faixa de posição de 130 a 170 da SEQ ID NO: 2;

para pEFTu na faixa de posição de 30 a 110 da SEQ ID NO: 3; para pSOD na faixa de posição de 50 a 100 da SEQ ID NO: 4.

As unidades de expressão da invenção contêm em particular duas ou mais seqüências de ácido nucleico tendo atividade promotora,

a) preferivelmente derivada a partir de seqüências idênticas ou diferentes selecionadas dentre a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; ou outras seqüências promotoras para os genes com abundância comparável ou superior;

b) se apropriado, com uma ou mais das ditas seqüências representando uma seqüência derivada pela substituição, inserção, inversão ou deleção ou adição de nucleotídeos, seqüência esta que, em particular está na região de núcleo, pelo menos 80 % idêntica ao nível de ácido nucleico a uma seqüência preferivelmente selecionada dentre as seqüências SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4 ou outras seqüências promotoras para genes com abundância comparável ou superior,

c) ou, se apropriado, com uma ou mais destas seqüências de ácido nucleico presentes hibridizando sob condições severas com uma seqüência que seja complementar a uma das seqüências de ácido nucleico de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 e/ou a outras seqüências promotoras para os genes com abundância comparável ou superior,

d) ou, se apropriado, com uma ou mais destas seqüências de ácido nucleico presentes sendo "fragmentos funcionalmente equivalentes" das seqüências sob a), b) ou c). Outros promotores naturais que são utilizáveis como um componente de um promotor múltiplo da invenção podem ser facilmente identificados, por exemplo, a partir de vários organismos cuja seqüência genômica é conhecida, pela comparação das identidades das seqüências de ácido nucleico a partir de bases de dados com as seqüências SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4 descritas acima ou de acordo com a Figura 1 ou outras seqüências promotoras para os genes com abundância comparável ou superior.

Outros promotores naturais adequados podem ser facilmente identificados a partir de vários organismos cuja seqüência genômica não é conhecida aplicando-se as técnicas de hibridização em uma maneira conhecida por si, partindo das seqüências de ácido nucleico descritas acima, em particular partindo das seqüências SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4 e/ou das seqüências promotoras para os genes com abundância comparável ou superior.

Outros promotores naturais adequados também podem ser isolados pelos métodos conhecido pelo técnico habilitado, como são descritos, por exemplo, em Cadenas et al (1991) Gene 98, 117-121; Eikmanns et al, (1991) Gene 102, 93-98.; Patek et al (1996) Microbiology 142, 1297-1309 ou Santamaria et al (1987) Gene 56, 199-208. Isto usualmente envolve usando vetores de "sonda promotora" nos quais fragmentos genômicos do genoma em questão são inseridos. A atividade promotora de um fragmento individual pode ser depois determinada no ajuste experimental mencionado medindo-se a atividade de um gene repórter a jusante, por exemplo da cloranfenicol acetiltransferase.

A invenção portanto também compreende a combinação destes promotores que não estão aqui listados por nome. Isto também se aplica à combinação de promotores únicos já conhecidos, como são descritos, por exemplo, em Patek et al (2003). J of Biotechnology 104, 311-323; Vasicova et al. (1999) J. Bacteriol. 181, 6188-6191). A invenção portanto também diz respeito a ácidos nucleicos tendo atividade promotora para a incorporação em uma unidade de expressão da invenção que compreende promotor múltiplo, os ditos ácidos nucleicos tendo atividade promotora que compreendem uma seqüência de ácido nucleico que hibridiza com a seqüência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4 ou com as seqüências promotoras para os genes com abundância comparável ou superior sob condições severas. Esta seqüência de ácido nucleico compreende pelo menos 10, preferivelmente mais do que 12, 15, 30, 50 ou mais do que 150, nucleotídeos.

As seqüências promotoras artificiais para a incorporação em uma unidade de expressão da invenção que compreende promotor múltiplo podem ser facilmente preparadas partindo das seqüências SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4 ou de acordo com a Figura 1 e/ou seqüências promotoras para os genes com abundância comparável ou superior por via da variação e mutação artificiais, por exemplo pela adição, substituição, inserção, inversão ou deleção de um ou mais, resíduos de nucleotídeo individuais ou contíguos. (Patek et al (2003). J of Biotechnology 104, 311-323; Vasicova et ai. (1999) J. Bacteriol. 181, 6188-6191 e referências mencionadas nestas).

Os exemplos adequados de ligação de seções de seqüência de terminação 3' que medeia ribossoma de uma seqüência promotora Py são RBS de pGRO: GGAGGGA; o RBS de pEFTs: AGGAGGA; o RBS de pEFTu: AGGAGGA; e o RBS de pSOD: GGAGGGA (conforme também a Figura 1, ligada). O RBS ótimo teórico, isto é a seqüência que é 100 % complementar à seqüência anti-Shine-Dalgarno na C. glutamicum 16S rRNA, é: 5' GAAAGGAGG 3'. Outras seções de seqüência de RBS adequadas podem ser facilmente identificadas, por exemplo, pela variação e mutação artificiais, por exemplo pela substituição, inserção, inversão, adição ou deleção de nucleotídeos ou por intermédio de comparações de homologia com seqüências promotoras em bases de dados. Exemplos não limitantes de unidades de expressão da invenção que compreendem promotor múltiplo são selecionados dentre:

e) seqüências que codificam

PeftuPsod5 da posição 18 a 390 na SEQ ID NO: 45;

PsodPeftu, da posição 18 a 395 na SEQ ID NO: 52;

PgroPsod, da posição 18 a 369 na SEQ ID NO: 55;

PgroPsodPefts, da posição 11 a 538 na SEQ ID NO: 59;

PeftuPsodPefts; da posição 11 a 559 na SEQ ID NO: 60;

ou

f) seqüências que são derivadas de seqüências de acordo com

e) pela substituição, inserção, inversão, adição ou deleção de nucleotídeos e que, em comparação com a dita seqüência de partida, são pelo menos 80 % ou pelo menos 90 % idênticos ao nível de ácido nucleico; ou

g) seqüências de ácido nucleico que hibridizam com uma seqüência complementar a e) sob condições severas; ou

h) "fragmentos funcionalmente equivalentes" das seqüências supracitadas e), f) e g).

Um "fragmento funcionalmente equivalente", em particular de acordo com as formas de realização d) e h), significa, para as unidades de expressão, fragmentos que têm essencialmente a mesma atividade de expressão ou uma superior específica como/além da seqüência de partida.

"Essencialmente idênticos" significa uma atividade de expressão específica que tem pelo menos 50 %, preferivelmente 60 %, mais preferivelmente 70 %, mais preferivelmente 80 %, mais preferivelmente 90 %, de modo particularmente preferível 95 %, da atividade de expressão específica da seqüência de partida.

"Fragmentos" significa seqüências parciais das seqüências descritas pela forma de realização a) a h). Os ditos fragmentos preferivelmente têm mais do que 10, mas mais preferivelmente mais do que 12, 15, 30, 50 ou de modo particularmente preferível mais do que 150, nucleotídeos contíguos da seqüência de partida.

As unidades de expressão da invenção podem preferivelmente compreender um ou mais dos seguintes elementos genéticos: uma região -10; um início de transcrição, uma região realçadora; e uma região operadora.

Estes elementos genéticos são preferivelmente específicos para as espécies de corinebactérias, especialmente para Corynebacterium glutamicum.

Os promotores bacterianos normalmente consistem de três sítios de reconhecimento da RNA polimerase, a saber a região -10, a região - 35 e o elemento UP. Estes elementos promotores são altamente conservados na E. coli, mas não em C. glutamicum. Isto se aplica especialmente à região - 35. O último portanto pode ser derivado da seqüência apenas freqüentemente incerta, se sob qualquer condição. A região -10, também, é menos altamente conservada do que em organismos que compreendem genomas ricos em AT. As seqüências de consenso que previamente foram aqui descritas são TGNGNTA(C/T)AATGG e GNTANAATNG (Patek et al (2003), J. of Biotechnology 104, 311-323; Vasicova et al. (1999) J. Bacteriol 181, 6188- 6191).

E bem conhecido que uma alta variabilidade no geral ocorre nas seqüências de consenso de bactérias tendo um teor de GC moderado ou alto (tal como, por exemplo, C. glutamicum) (Bourn e Babb, 1995, Bashyam et al, 1996). Isto se aplica em particular à região -35 que portanto freqüentemente não pode ser prognosticada. Isto está descrito, por exemplo, em Patek et al (2003). J of Biotechnology 104, 325-334.

b) Cassetes de expressão

A invenção diz respeito ainda às unidades de expressão da invenção que compreendem promotor múltiplo, funcionalmente ligado a uma seqüência de ácido nucleico traduzível. Estas construções que são capazes de expressar genes, para os propósitos da invenção, também são aludidos como cassetes de expressão.

Uma "ligação funcional" significa neste contexto, por exemplo, o arranjo seqüencial de quaisquer da unidades de expressão da invenção e uma seqüência de ácido nucleico a ser expressada transgenicamente e, se apropriado, outros elementos reguladores tais como um terminador, por exemplo, de modo que cada um dos ditos elementos reguladores sejam capazes de satisfazer uma função na expressão transgênica da dita seqüência de ácido nucleico. Isto não requer necessariamente uma ligação direta no sentido químico. As seqüências de controle genético tais como, por exemplo, seqüências realçadoras podem exercer a sua função na seqüência alvo também a partir de posições mais distantes ou mesmo de outras moléculas de DNA. Preferência é dada aos arranjos em que a seqüência de ácido nucleico a ser expressada transgenicamente é posicionada por detrás (isto é na extremidade 3') da seqüência da unidade de expressão da invenção, de modo que as duas seqüências sejam covalentemente conectadas entre si. A distância entre a seqüência da unidade de expressão e a seqüência de ácido nucleico a ser expressada transgenicamente é aqui preferivelmente menor do que 200 pares de base, de modo particularmente preferível menor do que 100 pares de base, de modo muito particularmente preferível menor do que 50 pares de base.

Os cassetes de expressão da invenção que compreendem promotor múltiplo tomam possível obter uma atividade de expressão que é diferente em comparação com a atividade de expressão original e assim regular finamente a expressão do gene desejado.

A regulagem da expressão de genes no microorganismo pelas unidades de expressão da invenção é preferivelmente obtida pela

- introdução de uma ou mais unidades de expressão da invenção, se apropriado com atividade de expressão específica alterada, no genoma do microorganismo de modo que um ou mais genes endógenos sejam expressados sob o controle das unidades de expressão da invenção introduzidas; ou

- introdução de uma ou mais construções de ácido nucleico que compreendem uma unidade de expressão da invenção, se apropriado com atividade de expressão específica alterada, e, funcionalmente ligadas, um ou mais ácidos nucleicos a serem expressados, isto é um cassete de expressão, no microorganismo.

Nos cassetes de expressão da invenção, a posição física da unidade de expressão em relação ao gene a ser expressado é escolhida de modo que as ditas unidade de expressão regulem a transcrição e preferivelmente também a tradução, do gene a ser expressado e assim possibilitem a formação de uma ou mais proteínas. "Para possibilitar a formação" aqui inclui aumentar constitutivamente a dita formação, atenuar ou bloquear a dita formação sob condições específicas e/ou aumentar a dita formação sob condições específicas. As "condições" aqui compreendem: (1) adicionar um componente ao meio de cultura, (2) remover um componente do meio de cultura, (3) substituir um componente no meio de cultura com um segundo componente, (4) aumentar a temperatura do meio de cultura, (5) reduzir a temperatura do meio de cultura e (6) regular as condições atmosféricas tais como, por exemplo, concentração de oxigênio ou concentração de nitrogênio, em que o meio de cultura é mantido. c) Informação geral:

Todos os ácidos nucleicos supracitados tendo atividade promotora e unidades de expressão e cassetes de expressão além disso podem ser preparados em um maneira conhecido por si pela síntese química dos blocos de construção de nucleotídeo, por exemplo pela condensação de fragmento de blocos de construção de ácido nucleico complementares de sobreposição individuais da hélice dupla. A síntese química de oligonucleotídeos pode ser realizada, por exemplo, em uma maneira conhecida por si usando o método da fosfoamidita (Voet, Voet, 2a edição, Wiley Press Nova Iorque, pp. 896-897). A montagem de oligonucleotídeos sintéticos e o preenchimento de intervalos com a ajuda do fragmento Klenow de DNA polimerase e reações de ligação e também processos de clonagem geral são descritos em Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Os métodos e técnicas utilizadas para a presente invenção são conhecidos pelo técnico habilitado treinado em técnicas de DNA microbiológicas e recombinantes. Os métodos e técnicas para cultivar células bacterianas, transportar moléculas de DNA isoladas na célula hospedeira e isolar, clonar e seqüenciar moléculas de ácido nucleico isoladas, etc., são exemplos de tais técnicas e métodos. Estes métodos são descritos em muitos itens da literatura padrão: Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986); J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1972); J. H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1992); M. Singer e P. Berg, Genes & Genomes, University Science Books, Mill Valley, Califórnia (1991); J. Sambrook, E. F. Fritsch e T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989); Ρ. B. Kaufmann et al., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Flórida (1995); Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B. R. Glick e J. E. Thompson, eds., CRC Press, Boca Raton, Flórida (1993); e P. F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, Nova Iorque, NY (1989).

Todas as moléculas de ácido nucleico da presente invenção estão preferivelmente na forma de uma molécula de ácido nucleico isolada. Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é removida a partir de outras moléculas de ácido nucleico presentes na fonte natural do dito ácido nucleico e pode ser adicionalmente de modo essencial isento de outro material celular ou meio de cultura, se preparado pelas técnicas recombinantes ou isento de precursores químicos ou outros produtos químicos, se quimicamente sintetizada.

A invenção além disso compreende as moléculas de ácido nucleico complementares para as seqüências de nucleotídeo especificamente descritas ou uma seção destas.

As seqüências de nucleotídeo da invenção também possibilitam que sondas e iniciadores sejam gerados que podem ser usados para identificar e/ou clonar seqüências homólogas em outros tipos de célula e microorganismos. As sondas e iniciadores deste tipo usualmente compreendem uma região de seqüência de nucleotídeo que, sob condições severas, hibridiza a pelo menos cerca de 12, preferivelmente pelo menos cerca de 25, tal como, por exemplo, cerca de 40, 50 ou 75, nucleotídeos contínuos de um filamento de sentido de uma seqüência de ácido nucleico da invenção ou de um filamento de anti-sentido correspondente.

A invenção também compreende aquelas seqüências de ácido nucleico que compreendem "mutações silenciosas" ou que foram alteradas em comparação com uma seqüência especificamente mencionado de acordo com o uso do códon de uma fonte ou hospedeiro organismo especiais, assim como variantes que ocorrem naturalmente, por exemplo variantes de junção ou variantes alélicas, destes.

III. Vetores de expressão

A invenção também diz respeito a vetores de expressão que compreendem um cassete de expressão da invenção descrito acima.

Os vetores são bem conhecidos pelo técnico habilitado e podem ser encontrados, por exemplo, em "Vetores de Clonagem" (Pouwels P. Η. et al., eds., Elsevier, Amsterdam-Nova Iorque-Oxford, 1985). Além dos plasmídeos, vetores também significam quaisquer outros vetores conhecidos pelo técnico habilitado, tais como, por exemplo, fagos, transposons, elementos IS, fasmídeos, cosmídeos e DNA linear ou circular. Os ditos vetores podem ser replicados autonomamente no organismo hospedeiro ou pode ser cromossomicamente replicado.

Os plasmídeos preferidos são de modo particularmente preferível aqueles que são replicados em bactérias corineformes. Numerosos vetores plasmídicos conhecidos tais como, por exemplo, pZl (Menkel et al., Applied and Ambiental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) ou pHS2-l (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) são fundamentados nos plasmídeos críticos pHM1519, pBLl ou pGAl. Outros vetores plasmídicos tais como, por exemplo, pCLiK5MCS (ver o Exemplo 1) ou aqueles com base em pCG4 (US-A 4.489.160) ou pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)) ou pAGl (US-A 5.158.891) podem ser usados do mesmo modo.

Além disso também são adequados aqueles vetores plasmídicos com a ajuda dos quais o processo de amplificação de gene pela integração no cromossoma pode ser aplicado, como foi descrito, por exemplo, por Remscheid et al. (Applied and Ambiental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para a duplicação e amplificação do operon hom-thrB. Neste método, o gene completo é clonado em um vetor plasmídico que pode replicar em um hospedeiro (tipicamente E. coli) mas não em C. glutamicum. Os exemplos de vetores adequados são pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob ou pK19mob (Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEMl (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) ou PBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342). O vetor plasmídico que contém o gene a ser amplificado é subseqüentemente transferido pela transformação na cepa de C. glutamicum desejada. Os métodos de transformação são descritos, por exemplo, em Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican e Shivnan (Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)) e Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)).

IV. Genes e proteínas por meio destes codificadas

A taxa de transcrição e/ou a taxa de tradução de genes em microorganismos, em comparação com o tipo selvagem, podem ser alteradas ou causadas pela regulagem da transcrição de genes nos ditos microorganismos pelas unidades de expressão da invenção, os ditos genes sendo heterólogos com respeito às ditas unidades de expressão.

Isto é preferivelmente obtido pela

- introdução de um ou mais ácidos nucleicos da invenção tendo atividade promotora no genoma do microorganismo de modo que um ou mais genes endógenos sejam transcritos sob o controle do dito ácido nucleico introduzido tendo atividade promotora, se apropriado tendo uma atividade promotora específica alterada, ou

- introdução de uma ou mais construções de ácido nucleico contendo um ácido nucleico da invenção tendo atividade promotora e, funcionalmente ligadas, um ou mais ácidos nucleicos exógenos ou endógenos a serem transcritos, no microorganismo.

Se um ou mais genes são introduzidos no genoma de um microorganismo de modo que um ou mais genes introduzidos sejam transcritos sob o controle dos ácidos nucleicos da invenção, a inserção pode ocorrer de modo que o gene ou os genes sejam integrados em regiões codificadoras ou não codificadoras. A inserção preferivelmente ocorre em regiões não codificadoras.

Neste contexto, as construções de ácido nucleico podem ser cromossômica ou extracromossomicamente inseridos. As construções de ácido nucleico são preferivelmente inseridos cromossomicamente. Uma integração "cromossômica" é a inserção de um fragmento de DNA no cromossoma de um célula hospedeira.

"Endógeno" significa a informação genética tal como, por exemplo, genes, que já estão presentes no genoma do tipo selvagem (como definido acima).

"Exógenos" significa informação genética tal como, por exemplo, genes, que não estão presentes no genoma tipo selvagem. Se informação genética exógena, por exemplo a que compreende unidades de expressão de promotor múltiplo da invenção, é introduzida no genoma de uma cepa tipo selvagem, gerando deste modo uma cepa geneticamente modificada, depois esta informação genética é endógena em uma comparação da cepa genética inicialmente gerada com a sua progênie, mas exógenos em uma comparação com a cepa do tipo selvagem original que não compreendeu a dita informação genética.

O termo "genes" com respeito à regulagem da transcrição pelos ácidos nucleicos da invenção tendo atividade promotora significa preferivelmente ácidos nucleicos que compreendem uma região a ser transcrita, isto é, por exemplo, uma região que regula a tradução, uma região codificadora e, se apropriado, outros elementos reguladores tais como, por exemplo, um terminador.

O termo "genes" com respeito à regulagem da expressão pelas unidades de expressão da invenção significa preferivelmente ácidos nucleicos que compreendem uma região codificadora e, se apropriado, outros elementos reguladores tais como, por exemplo, um terminador.

Uma "região codificadora" significa uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína.

"Heteróloga" com respeito aos ácidos nucleicos tendo atividade promotora e genes significa que os genes usados não são transcritos no tipo selvagem com a regulagem dos ácidos nucleicos da invenção tendo atividade promotora, mas que uma nova ligação funcional que não ocorre no tipo selvagem é produzida e a combinação funcional de ácido nucleico da invenção tendo atividade promotora e específica gene não ocorre no tipo selvagem.

"Heteróloga" com respeito às unidades de expressão e genes significa que os genes usados não são expressados no tipo selvagem com regulagem das unidades de expressão da invenção, mas que uma nova ligação funcional que não ocorre no tipo selvagem é produzida e a combinação funcional da unidade de expressão da invenção e gene específico não ocorre no tipo selvagem.

Em uma forma de realização preferida dos processos da invenção descritos acima para alterar ou fazer com que a taxa de transcrição e/ou a taxa de expressão de genes em microorganismos, os genes são selecionados do grupo que consiste de ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de produtos químicos finos, sendo possível para os ditos genes conter outros elementos reguladores, se apropriado.

Em uma forma de realização particularmente preferida dos processos da invenção descritos acima para alterar ou fazer com que a taxa de transcrição e/ou a taxa de expressão de genes em microorganismos, os genes são selecionados dentre:

Ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de aminoácidos proteinogênicos e não proteinogênicos, ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de nucleotídeos e nucleosídeos, ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de ácidos orgânicos, ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de lipídeos e ácidos graxos, ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de dióis, ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de carboidratos, ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de compostos aromáticos, ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de vitaminas, ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de co-fatores e ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de enzimas, ácidos nucleicos que codificam uma proteína do metabolismo central, sendo possível para os genes conter outros elementos reguladores, se apropriado.

Em uma forma de realização particularmente preferida, as proteínas são selecionadas do caminho biossintético de aminoácidos, a saber: aspartato quinase, aspartato semialdeído desidrogenase, diaminopimelato desidrogenase, diaminopimelato descarboxilase, diidrodipicolinato sintetase, diidrodipicolinato redutase, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, 3-fosfoglicerato quinase, piruvato carboxilase, triosefosfato isomerase, regulador transcricional LuxR, regulador transcricional LysRl, regulador transcricional LysR2, malato-quinona oxidorredutase, glicose-6-fosfato desidrogenase, 6-fosfogliconato desidrogenase, transcetolase, transaldolase, homosserina O- acetiltransferase, cistationina gama-sintase, cistationina beta-liase, serina, hidroximetiltransferase, O-acetil-homosserina sulfidrilase, metilenotetra- hidrofoliato redutase, fosfosserina aminotransferase, fosfosserina fosfatase, serina acetiltransferase, homosserina desidrogenase, homosserina quinase, treonina sintase, veículo exportador de treonina, treonina desidratase, piruvato oxidase, exportador de lisina, biotina ligase, cisteína sintase I, cisteína sintase II, metionina sintase dependente da coenzima B12, atividade de metionina sintase independente da coenzima B12, subunidades 1 e 2 da sulfato adenililtransferase, fosfoadenosina fosfossulfato redutase, ferredoxina sulfito redutase, ferredoxina NADP redutase, 3-fosfoglicerato desidrogenase, regulador de RXA00655, regulador de RXN2910, arginil-tRNA sintetase, fosfoenolpiruvato carboxilase, proteína do efluxo de treonina, serina hidroximetiltransferase, frutose 1,6-bisfosfatase, proteína de redução de sulfato RXA077, proteína de redução de sulfato RXA248, proteína de redução de sulfato RXA247, proteína OpcA5 1-fosfofrutoquínase, 6-fosfofrutoquinase, tetraidropicolinato succinilase, succiníl aminocetopimelato aminotransferase, succiníl diaminopimelato dessuccinilase, diaminopimelato epimerase, 6- fosfoglíconato desídrogenase, glicose-fosfato isomerase, fosfoglicerato mutase, enolase, piruvato quinase, aspartato transaminase e enzima de malato.

As proteínas e ácidos nucleicos preferidos que codificam as ditas proteínas são seqüências de proteína e, respectivamente, seqüências de ácido nucleico de origem microbiana, preferivelmente de bactérias do gênero Corynebacterium ou Brevibacterium, preferivelmente de bactérias corineformes, de modo particularmente preferível de Corynebacterium glutamicum.

Os exemplos de seqüências de proteína particularmente preferidas e das seqüências de ácido nucleico correspondentes que codificam as ditas proteínas do caminho biossintético de aminoácidos, o documento que se refere a estas e a sua designação no documento de referência estão listados na Tabela 1:

Tabela 1

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Preferência é dada a selecionar o gene G alvo a ser regulado de acordo com a invenção a partir dos genes listados acima.

Outras seqüências de proteína particularmente preferidas do caminho biossintético de aminoácidos têm em cada caso a seqüência de aminoácido indicada na Tabela 1 para esta proteína, onde a respectiva proteína tem, em pelo menos uma das posições de aminoácido indicadas na Tabela 2, coluna 2 para esta seqüência de aminoácido, um aminoácido proteinogênico diferente do respectivo aminoácido indicado na Tabela 2, coluna 3 da mesma linhagem. Em uma outra forma de realização preferida, as proteínas têm, em pelo menos uma das posições de aminoácido indicada na Tabela 2, coluna 2 para a seqüência de aminoácido, o aminoácido indicado na Tabela 2, coluna 4 da mesma linhagem. As proteínas indicadas na Tabela 2 são proteínas do caminho biossintético mutadas de aminoácidos, que têm propriedades particularmente vantajosas e são portanto particularmente adequados para expressar os ácidos nucleicos correspondentes através de uma construção promotora da invenção e para produzir aminoácidos. Por exemplo, a mutação T3111 leva à inibição de retroalimentação de ask sendo desligada.

Os ácidos nucleicos correspondentes que codificam uma proteína mutada descrita acima a partir da Tabela 2 podem ser preparados pelos métodos convencionais.

Um ponto de partida adequado para preparar as seqüências de ácido nucleico que codificam uma proteína mutada é, por exemplo, o genoma de uma cepa de Corynebacterium glutamicum que é obtenível da American Type Culture Collection sob a designação ATCC 13032 ou as seqüências de ácido nucleico aludidas na Tabela 1. Para a retro-tradução da seqüência de aminoácido das proteínas mutadas nas seqüências de ácido nucleico que codificam estas proteínas, é vantajoso usar o uso do códon do organismo no qual a seqüência de ácido nucleico deva ser introduzida ou em que a seqüência de ácido nucleico está presente. Por exemplo, é vantajoso usar o uso do códon de Corynebacterium glutamicum for Corynebaeterium glutamicum. O uso do códon do organismo particular pode ser averiguado em um maneira conhecido por si a partir de bases de dados ou pedidos de patente que descrevem pelo menos uma proteína e um gene que codifica esta proteína a partir do organismo desejado.

A informação na Tabela 2 deve ser entendida do seguinte modo:

Na coluna 1 "identificação", uma designação não ambígua para cada seqüência em relação à Tabela 1 é indicada.

Na coluna 2 "AA-POS", o número respectivo refere-se à posição de aminoácido da seqüência de polipeptídeo correspondente da Tabela 1. Um "26" na coluna "AA-POS" conseqüentemente significa a posição de aminoácido 26 da seqüência de polipeptídeo correspondentemente indicada. A numeração da posição começa em +1 no término N.

Na coluna 3 "AA tipo selvagem", a respectiva letra designa o aminoácido - representado em código de uma letra - na posição indicada na coluna 2 na cepa do tipo selvagem correspondente da seqüência da Tabela 1.

Na coluna 4 "AA mutante", a respectiva letra designa o aminoácido - representado em código de uma letra - na posição indicada na coluna 2 na cepa mutante correspondente.

Na coluna 5 "função", a função fisiológica da seqüência de polipeptídeo correspondente é indicada.

Para uma proteína mutada com uma função particular (coluna 5) e uma seqüência de aminoácido inicial particular (Tabela 1), as colunas 2, 3 e 4 descrevem pelo menos uma mutação e uma pluralidade de mutações para algumas seqüências. Esta pluralidade de mutações sempre se referem à seqüência de aminoácido inicial mais próxima acima em cada caso (Tabela 1). O termo "pelo menos uma das posições de aminoácido" de uma seqüência de aminoácido particular preferivelmente significa pelo menos uma das mutações descritas para esta seqüência de aminoácido nas colunas 2, 3 e 4.

Código de uma letra para aminoácidos proteinogênicos:

A alanina I isoleucina Q glutamina

C cisteína K lisina R arginina <table>table see original document page 43</column></row><table> <table>table see original document page 44</column></row><table>

Microorganismos geneticamente modificados As unidades de expressão da invenção, os genes descritos acima e as construções de ácido nucleico ou cassetes de expressão descritos acima são introduzidos no microorganismo, em particular em bactérias corineformes, pelos métodos conhecidos pelo técnico habilitado, tais como a conjugação ou eletroporação (por exemplo, Liebl et al (1989) FEMS Microbiology Letters 53, 299-303).

Os cassetes de expressão integrados são preferivelmente selecionados pelo método SacB. O método SacB é conhecido pelo técnico habilitado e é descrito, por exemplo, em Schafer A, Tauch A, Jager W, Kalinowski J, Thierbach G, Pohler A.; Small mobilizable multipurpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 e pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene. Julho de 1994 22; 145(1): 69-73 e Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein BI.; Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSClOl replicon; Mol Microbial. Junho de 1991; 5(6): 1447-57.

Preferência é dada ao uso de acordo com a invenção como microorganismos de partida aqueles que já produzem o produto variável desejado (produto químico fino/proteína).

A invenção portanto também diz respeito a um microorganismo geneticamente modificado que compreende um cassete de expressão da invenção ou um vetor que compreende o cassete de expressão da invenção.

A presente invenção de modo particularmente preferível diz respeito a microorganismos geneticamente modificados, em particular bactérias corineformes, que compreendem um vetor, em particular um vetor transportador ou vetor plasmídico, que carregue pelo menos um cassete de expressão da invenção.

Os microorganismos ou microorganismos geneticamente modificados preferidos são bactérias, algas, fungos ou leveduras.

Os microorganismos particularmente preferidos são, em particular, bactérias corineformes. As bactérias corineformes preferidas são bactérias do gênero Corynebacterium, em particular das espécies Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium melassecola e Corynebacterium efficiens ou do gênero Brevibacterium, em particular das espécies Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum e Brevibacterium divaricatum.

As bactérias particularmente preferidas dos gêneros Corynebacterium e Brevibacterium são selecionadas do grupo que consiste de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium efficiens DSM 44547, Corynebacterium efficiens DSM 44548. Corynebacterium efficiens DSM 44549, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Corynebacterium glutamicum KFCC10065 e Corynebacterium glutamicum ATCC 21608 e também cepas derivada destas, por exemplo pela mutação e seleção clássicas ou pela mutação direta.

A abreviação KFCC significa a Korean Federation of Culture Collection, a abreviação ATCC significa a American type strain culture collection e a abreviação DSM (ou DSMZ) significa a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen).

Outras bactérias particularmente preferidas dos gêneros Corynebacterium e Brevibacterium são listadas na Tabela 3:

Tabela 3

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As abreviações têm os seguintes significados: ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA FERM: Fermentation Research Institute, Chiba5 Japão NRRL: ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, ILA, USA

CECT: Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Valência, Espanha NCIMB: National Collection of Industrial and Marine Bactéria Ltd., Aberdeen, UK

CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baam, NL NCTC: National Collection of Type Cultures, Londres, UK

DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zeilkulturen, Braunschweig, Alemanha

Particular preferência é dada aqui aos microorganismos de bactérias do gênero Corynebacterium, em particular aquelas que já são capazes de produzir L-lisina, L-metionina e/ou L-treonina. Estas são em particular corinebactérias em que, por exemplo, o gene que codifica uma aspartato quinase (gene ask) é desregulado ou a inibição de retroalimentação foi eliminada ou reduzida. Por exemplo, tais bactérias têm uma mutação no gene ask, que resulta em uma redução ou eliminação da inibição de retroalimentação, tal como, por exemplo, a mutação T31II.

As unidades de expressão da invenção possibilitam que os caminhos metabólicos para produtos biossintéticos específica nos microorganismos geneticamente modificados da invenção descritos acima seja regulados.

Para este propósito, por exemplo, os caminhos metabólicos que resultam em um produto biossintético específico são realçados causando ou aumentando a taxa de transcrição ou a taxa de expressão de genes deste caminho biossintético em que a quantidade de proteína aumentada resulta em uma atividade total aumentada destas proteínas do caminho biossintético desejado e assim em um fluxo metabólico realçado na direção do produto biossintético desejado.

Além disso, os caminhos metabólicos que divergem a partir de um produto biossintético específico podem ser atenuados pela redução da taxa de transcrição ou taxa de expressão de genes deste caminho biossintético divergente em que a quantidade de proteína reduzida resulta em uma atividade total reduzida destas proteínas do caminho biossintético não desejado e assim adicionalmente em um fluxo metabólico realçado na direção do produto biossintético desejado.

Os microorganismos geneticamente modificados da invenção são capazes, por exemplo, de produzir produtos biossintéticos a partir da glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, amido, celulose ou a partir de glicerol e etanol.

A invenção portanto diz respeito a um processo para produzir produtos biossintéticos pelo cultivo de microorganismos geneticamente modificados da invenção.

Dependendo do produto biossintético desejado, a taxa de transcrição ou a taxa de expressão de vários genes devem ser aumentadas ou reduzidas. E usualmente vantajoso alterar a taxa de transcrição ou a taxa de expressão de uma pluralidade de genes, isto é aumentar a taxa de transcrição ou a taxa de expressão de uma combinação de genes e/ou reduzir a taxa de transcrição ou a taxa de expressão de uma combinação de genes.

Nos microorganismos geneticamente modificados da invenção, pelo menos uma taxa de transcrição ou taxa de expressão de um gene alterada, isto é aumentada ou reduzida, pode ser atribuída a um ácido nucleico da invenção tendo atividade promotora ou a uma unidade de expressão da invenção.

Outras taxas de transcrição ou taxas de expressão, adicionalmente alteradas, isto é adicionalmente aumentadas ou adicionalmente reduzidas, de outros genes no microorganismo geneticamente modificado podem, mas não precisam, derivar dos ácidos nucleicos da invenção tendo atividade promotora ou das unidades de expressão da invenção.

A invenção portanto além disso diz respeito a um processo para produzir produtos biossintéticos pelo cultivo de microorganismos geneticamente modificados da invenção.

V. Campos de aplicação da invenção

As unidades de expressão, cassetes de expressão e vetores da invenção que compreendem promotor múltiplo, por exemplo podem ser usados de modo particularmente vantajoso em processos melhorados para a produção de produtos biossintéticos pela fermentação como descrito abaixo.

As unidades de expressão da invenção que compreendem promotor múltiplo ou os cassetes de expressão que os compreendem têm a vantagem particular de possibilitar uma modulação da expressão do gene estrutural funcionalmente ligado.

As unidades de expressão da invenção ou cassetes de expressão que as compreendem podem ser usados para alterar, isto é aumentar ou reduzir ou para causar a taxa de expressão de genes em microorganismos, em comparação com o tipo selvagem. Isto fornece a possibilidade, no caso de um aumento na taxa de expressão, de maximizar a expressão do gene em questão. Escolhendo-se uma unidade de expressão adequado, entretanto, a expressão também pode estar em uma concentração que esteja abaixo do máximo obtenível por uma unidade de expressão diferente, mas que ao mesmo tempo libera o produto de expressão em uma quantidade mais compatível para o microorganismo em expressão. Isto é particularmente vantajoso se concentrações de produto de expressão que são muito altas são tóxicas para o microorganismo em expressão. Por via de seleção dentre as unidades de expressão em cada caso com concentração diferente de expressão, as unidades de expressão da invenção possibilitam assim que a expressão seja finamente regulada a um valor ótimo, em particular para a expressão de longa duração.

As unidades de expressão da invenção ou cassetes de expressão que compreendem as ditas unidades de expressão também podem ser usados para regular e realçar a formação de vários produtos biossintéticos tais como, por exemplo, produtos químicos finos, proteínas, em particular aminoácidos, em microorganismos, em particular em espécies de

Corynebacterium.

A invenção portanto diz respeito ao uso de uma unidade de expressão da invenção que compreende promotor múltiplo para regular uma biossíntese de produto. Aqui, o gene de uma proteína envolvida na regulagem de uma biossíntese de produto é colocado sob o controle de uma tal unidade de expressão. A dita biossíntese de produto é influenciada dependendo da taxa de transcrição da unidade de expressão da invenção que compreende promotor múltiplo, selecionada. Alternativamente, o gene de uma proteína envolvida na regulagem de uma biossíntese de produto pode ser expressado como constituinte de um cassete de expressão da invenção em um microorganismo e a dita biossíntese de produto pode ser regulada pela proteína por meio deste expressada. Se a atividade de um promotor múltiplo é mais fraca do que aquela do promotor endógeno, um promotor múltiplo também pode ser utilizado de modo a atenuar especificamente caminhos biossintéticos indesejados.

A taxa de transcrição de uma unidade de expressão da invenção que compreende promotor múltiplo além disso pode ser regulada pela mutação específica de um ou mais promotores individuais que constituem o dito promotor múltiplo. Uma atividade promotora aumentada ou reduzida pode ser obtida substituindo-se nucleotídeos no sítio de ligação dos sítios de ligação da holoenzima da RNA polimerase (conhecidos pelo técnico habilitado também como região -IOe região -35). Além disso, uma influência pode ser exercida pela redução ou extensão da distância entre os sítios de ligação da holoenzima da RNA polimerase descrita pelas deleções de nucleotídeo ou inserções de nucleotídeo; além disso, colocando-se sítios de ligação (também conhecidos como operadores pelo técnico habilitado) para as proteínas reguladoras (conhecidas como repressores e ativadores pelo técnico habilitado) em proximidade espacial aos sítios de ligação da holoenzima de RNA polimerase, de modo que estes reguladores, depois da ligação a uma seqüência promotora, atenuem ou realcem a ligação e a atividade transcricional da holoenzima de RNA polimerase ou então submetam a dita ligação e atividade transcricional a uma nova influência reguladora.

A atividade traducional também pode ser influenciada pela mutação da seção de seqüência de terminal 3' que medeia a ligação de ribossoma de um promotor único Py dentro da unidade de expressão da invenção que compreende promotor múltiplo.

VI. Produtos biossintéticos e processos de produção preferidos Os produtos biossintéticos preferidos preparados de acordo com a invenção são produtos químicos finos. O termo "produto químico fino" é familiar ao técnico habilitado e inclui compostos que são produzidos por um organismo e são usados em vários ramos da indústria tais como, por exemplo mas não restritos à indústria farmacêutica, à agricultura, indústrias de cosméticos, alimento e ração. Estes compostos compreendem ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácido láctico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido itacônico e ácido diaminopimélico e aminoácidos proteinogênicos e não proteinogênicos, bases de purina e bases de pirimidina, nucleosídeos e nucleotídeos (como descrito por exemplo em Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, em Biotechnology vol. 6, Rehm et al., editores, VCH: Weinheim e as referências presentes nestas), lipídeos, ácidos graxos saturados e insaturados (por exemplo, ácido araquidônico), dióis (por exemplo, propanodiol e butanodiol), carboidratos (por exemplo, ácido hialurônico e trealose), compostos aromáticos (por exemplo, aminas aromáticas, vanilina e índigo), vitaminas e co-fatores (como descrito em Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim e as referências aí presentes; e Ong, A. S., Niki, E. e Packer, L (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia e the Society for Free Radical Research - Ásia, realizada em 1-3 de setembro, 1994 em Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)), enzimas e todos os outros produtos químicos descritos por Gutcho (1983) no Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 e as referências aí indicadas.

Os produtos biossintéticos particularmente preferidos são selecionados do grupo de ácidos orgânicos, proteínas, nucleotídeos e nucleosídeos, aminoácidos tanto proteinogênicos quanto não proteinogênicos, lipídeos e ácidos graxos, dióis, carboidratos, compostos aromáticos, vitaminas e co-fatores, enzimas e proteínas. Os ácidos orgânicos preferidos são ácido láctico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido itacônico e ácido diaminopimélico.

Os nucleosídeos e nucleotídeos preferidos são descritos por exemplo em Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, em Biotechnology, vol. 6, Rehm et al., editores VCH: Weinheim e referências aí presentes.

Os produtos biossintéticos preferidos são adicionalmente lipídeos, ácidos graxos saturados e insaturados tais como, por exemplo, ácido araquidônico, dióis tais como, por exemplo, propanodiol e butanodiol, carboidratos tais como, por exemplo, ácido hialurônico e trealose, compostos aromáticos tais como, por exemplo, aminas aromáticas, vanilina e índigo, vitaminas e co-fatores como descrito por exemplo em Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim e as referências ai presentes; e Ong, A. S., Niki, E. e Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, realizada em 1 a 3 de Set. de 1994 em Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)), enzimas, policetídeos (Cane et al. (1998) Science 282: 63-68) e todos os outros produtos químicos descritos por Gutcho (1983) em Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 e as referências aí indicadas.

Os produtos biossintéticos particularmente preferidos são aminoácidos, de modo particularmente preferível aminoácidos essenciais, em particular L-glicina, L-alanina, L-leucina, L-metionina, L-fenilalanina, L- triptofano, L-lisina, L-glutamina, L-ácido glutâmico, L-serina, L-prolina, L- valina, L-isoleucina, L-cisteína, L-tirosina, L-histidina, L-arginina, L- asparagina, L-ácido aspártico e L-treonina, L-homosserina, especialmente L- lisina, L-metionina e L-treonina. Um aminoácido tal como, por exemplo, lisina, metionina e treonina significa daqui em diante em cada caso tanto a forma L quanto a D do aminoácido, preferivelmente a forma L, isto é por exemplo L-lisina, L-metionina e L-treonina.

As seguintes seções descrevem as preparações particularmente preferidas de lisina, metionina e treonina em mais detalhes.

a) Preparação de lisina

A invenção em particular diz respeito a um processo para produzir lisina pelo cultivo de microorganismos geneticamente modificados com taxa de expressão aumentada ou causada de pelo menos um gene comparado com o tipo selvagem, onde

- a atividade de expressão no microorganismo de pelo menos um gene endógeno é regulada por uma unidade de expressão da invenção, ou

- a expressão de pelo menos um gene no microorganismo é causada ou alterada pela introdução no dito microorganismo de um cassete de expressão da invenção que compreende o dito gene.

Os genes são selecionados aqui em particular dentre ácidos nucleicos que codificam uma aspartato quinase, ácidos nucleicos que codificam uma aspartato-semialdeído desidrogenase, ácidos nucleicos que codificam uma diaminopimelato desidrogenase, ácidos nucleicos que codificam uma diaminopimelato descarboxilase, ácidos nucleicos que codificam uma diidrodipicolinato sintetase, ácidos nucleicos que codificam uma diidrodipicolinato redutase, ácidos nucleicos que codificam uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, ácidos nucleicos que codificam uma 3- fosfoglicerato quinase, ácidos nucleicos que codificam uma piruvato carboxilase, ácidos nucleicos que codificam uma triosefosfato isomerase, ácidos nucleicos que codificam um regulador transcricional LuxR, ácidos nucleicos que codificam um regulador transcricional LysRl, ácidos nucleicos que codificam um regulador transcricional LysR2, ácidos nucleicos que codificam uma malato-quinona oxidorredutase, ácidos nucleicos que codificam uma glicose-6-fosfato desidrogenase, ácidos nucleicos que codificam uma 6-fosfogliconato desidrogenase, ácidos nucleicos que codificam uma transcetolase, ácidos nucleicos que codificam uma transaldolase, ácidos nucleicos que codificam um exportador de lisina, ácidos nucleicos que codificam uma biotina ligase, ácidos nucleicos que codificam uma arginil-tRNA sintetase, ácidos nucleicos que codificam uma fosfoenolpiruvato carboxilase, ácidos nucleicos que codificam uma frutose- 1,6-bisfosfatase, ácidos nucleicos que codificam uma proteína OpcA5 ácidos nucleicos que codificam uma 1-fosfofrutoquinase, ácidos nucleicos que codificam uma 6-fosfofrutoquinase, ácidos nucleicos que codificam uma tetraidropicolinato succinilase, ácidos nucleicos que codificam uma succinil aminocetopimelato aminotransferase, ácidos nucleicos que codificam uma succinil diaminopimelato dessuccinilase, ácidos nucleicos que codificam uma diaminopimelato epimerase, ácidos nucleicos que codificam uma 6- fosfogliconato desidrogenase, ácidos nucleicos que codificam uma glicose fosfato isomerase, ácidos nucleicos que codificam uma fosfoglicerato mutase, ácidos nucleicos que codificam uma enolase, ácidos nucleicos que codificam uma piruvato quinase, ácidos nucleicos que codificam uma aspartato transaminase e ácidos nucleicos que codificam uma enzima de malato.

Uma outra forma de realização preferida do processo descrito acima para preparar lisina compreende os microorganismos geneticamente modificados, comparado com o tipo selvagem, tendo adicionalmente uma atividade aumentada, de pelo menos uma das atividades selecionadas dentre a atividade da aspartato quinase, atividade da aspartato semialdeído desidrogenase, atividade da diaminopimelato desidrogenase, atividade da diaminopimelato descarboxilase, atividade da diidrodipicolinato sintetase, atividade da diidrodipicolinato redutase, atividade da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, atividade da 3-fosfoglicerato quinase, atividade da piruvato carboxilase, atividade da triosefosfato isomerase, atividade do regulador transcricional LuxR5 atividade do regulador transcricional LysRl, atividade do regulador transcricional LysR2, atividade da malato-quinona oxidorredutase, atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase, atividade da 6- fosfogliconato desidrogenase, atividade da transcetolase, atividade da transaldolase, atividade do exportador de lisina, atividade da arginil-tRNA sintetase, atividade da fosfoenolpiruvato carboxilase, atividade da fratose-1,6- bisfosfatase, atividade da proteína OpcA, atividade da 1-fosfofrutoquinase, atividade da 6-fosfofrutoquinase, atividade da biotina ligase e atividade da tetraidropicolinato succinilase, atividade da succinil aminocetopimelato aminotransferase, atividade da succinil diaminopimelato desuccinilase, atividade da diaminopimelato epimerase, atividade da 6-fosfogliconato desidrogenase, atividade da glicose fosfato isomerase, atividade da fosfoglicerato mutase, atividade da enolase, atividade da piruvato quinase, atividade da aspartato transaminase e atividade da enzima de malato.

Uma outra forma de realização particularmente preferida do processo descrito acima para preparar lisina compreende os microorganismos geneticamente modificados tendo, comparado com o tipo selvagem, adicionalmente uma atividade reduzida, de pelo menos uma das atividades selecionadas do grupo de atividade da treonina desidratase, atividade da homosserina O-acetiltransferase, atividade da O-acetil-homosserina suifidrilase, atividade da fosfoenolpiruvato carboxiquinase, atividade da piruvato oxidase, atividade da homosserina quinase, atividade da homosserina desidrogenase, atividade do exportador de treonina, atividade da proteína do efluxo de treonina, atividade da asparaginase, atividade da aspartato descarboxilase e atividade da treonina sintase.

b) Preparação de metionina

A invenção ainda diz respeito a um processo para preparar metionina pelo cultivo de microorganismos geneticamente modificados com taxa de expressão aumentada ou causada de pelo menos um gene comparado com o tipo selvagem, onde

- a atividade de expressão no microorganismo de pelo menos um gene endógeno é regulada por um unidade de expressão da invenção, ou

- a expressão de pelo menos um gene no microorganismo é causado ou alterado pela introdução no dito microorganismo de uma unidade de expressão da invenção que compreende o dito gene.

Os genes são selecionados aqui em particular de ácidos nucleicos que codificam uma aspartato quinase, ácidos nucleicos que codificam uma aspartato semialdeído desidrogenase, ácidos nucleicos que codificam uma homosserina desidrogenase, ácidos nucleicos que codificam uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, ácidos nucleicos que codificam uma 3-fosfoglicerato quinase, ácidos nucleicos que codificam uma piruvato carboxilase, ácidos nucleicos que codificam uma triosefosfato isomerase, ácidos nucleicos que codificam uma homosserina O-acetiltransferase, ácidos nucleicos que codificam uma cistationina gama-sintase, ácidos nucleicos que codificam uma cistationina beta-liase, ácidos nucleicos que codificam uma serina hidroximetiltransferase, ácidos nucleicos que codificam uma O-acetil- homosserina sulfidrilase, ácidos nucleicos que codificam uma metilenotetraidrofoliato redutase, ácidos nucleicos que codificam uma fosfosserina aminotransferase, ácidos nucleicos que codificam uma fosfosserina fosfatase, ácidos nucleicos que codificam uma serina acetiltransferase, ácidos nucleicos que codificam uma atividade da cisteína sintase I, ácidos nucleicos que codificam uma atividade da cisteína sintase II, ácidos nucleicos que codificam uma atividade da metionina sintase dependente da coenzima B12, ácidos nucleicos que codificam uma atividade da metionina sintase independente da coenzima B12, ácidos nucleicos que codificam uma atividade da sulfato adenililtransferase, ácidos nucleicos que codificam uma atividade da fosfoadenosina fosfossulfato redutase, ácidos nucleicos que codificam uma atividade da ferredoxina sulfito redutase, ácidos nucleicos que codificam uma atividade da ferredoxina NADPH redutase, ácidos nucleicos que codificam uma atividade da ferredoxina, ácidos nucleicos que codificam uma atividade da proteína de redução de sulfato RXA077, ácidos nucleicos que codificam uma proteína de redução de sulfato RXA248, ácidos nucleicos que codificam uma proteína de redução de sulfato RXA247, ácidos nucleicos que codificam um regulador de RXA0655 e ácidos nucleicos que codificam um regulador de RXN2910, ácidos nucleicos que codificam uma 6-fosfogliconato desidrogenase, glicose fosfato isomerase, fosfoglicerato mutase, enolase, piruvato quinase, aspartato transaminase ou enzima de malato.

Uma outra forma de realização preferida do processo descrito acima para preparar metionina compreende os microorganismos geneticamente modificados tendo, comparado com o tipo selvagem, adicionalmente uma atividade aumentada de pelo menos uma das atividades selecionadas do grupo da aspartato quinase, atividade da aspartato semialdeído desidrogenase, atividade da homosserina desidrogenase, atividade da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, atividade da 3- fosfoglicerato quinase, atividade da piruvato carboxilase, atividade da triosefosfato isomerase, atividade da homosserina O-acetiltransferase, atividade da cistationina gama-sintase, atividade da cistationina beta-liase, atividade da serina hidroximetiltransferase, atividade da O-acetil-homosserina sulfidrilase, atividade da metilenotetraidrofoliato redutase, atividade da fosfosserina aminotransferase, atividade da fosfosserina fosfatase, atividade da serina acetiltransferase, atividade da cisteína sintase I, atividade da cisteína sintase II, atividade da metionina sintase dependente da coenzima B12, atividade da metionina sintase independente da coenzima B12, atividade da sulfato adenililtransferase, atividade da fosfoadenosina fosfossulfato redutase, atividade da ferredoxina sulfito redutase, atividade da ferredoxina NADPH redutase, atividade da ferredoxina, atividade da atividade de uma proteína de redução de sulfato RXA077, atividade de uma proteína de redução de sulfato RXA248, atividade de uma proteína de redução de sulfato RXA247, atividade de um regulador de RXA655 e atividade de um regulador de RXN2910, atividade de uma 6-fosfogliconato desidrogenase, atividade de uma glicose fosfato isomerase, atividade de uma fosfoglicerato mutase, atividade de uma enolase, atividade de uma piruvato quinase, atividade de uma aspartato transaminase e atividade da enzima de malato.

Uma outra forma de realização particularmente preferida do método descrito acima para preparar metionina compreende os microorganismos geneticamente modificados tendo, comparado com o tipo selvagem, adicionalmente uma atividade reduzida de pelo menos uma das atividades selecionadas do grupo da homosserina quinase, atividade da treonina desidratase, atividade da treonina sintase, atividade da meso- diaminopimelato D-desidrogenase, atividade da fosfoenol-piruvato carboxiquinase, atividade da piruvato oxidase, atividade da diidrodipicolinato sintase, atividade da diidrodipicolinato redutase e atividade da diaminopicolinato descarboxilase.

c) Preparação de treonina

A invenção ainda diz respeito a um processo para preparar treonina pelo cultivo de microorganismos geneticamente modificados com taxa de expressão aumentada ou causada de pelo menos um gene comparado com o tipo selvagem, onde

- a atividade de expressão no microorganismo de pelo menos um gene endógeno é regulada por uma unidade de expressão da invenção, ou

- a expressão de pelo menos um gene no microorganismo é causada ou alterada pela introdução no dito microorganismo de uma unidade de expressão da invenção que compreende o dito gene.

Os genes são selecionados aqui em particular de ácidos nucleicos que codificam uma aspartato quinase, ácidos nucleicos que codificam uma aspartato-semialdeído desidrogenase, ácidos nucleicos que codificam uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, ácidos nucleicos que codificam uma 3-fosfoglicerato quinase, ácidos nucleicos que codificam uma piruvato carboxilase, ácidos nucleicos que codificam uma triosefosfato isomerase, ácidos nucleicos que codificam uma homosserina quinase, ácidos nucleicos que codificam uma treonina sintase, ácidos nucleicos que codificam um veículo exportador de treonina, ácidos nucleicos que codificam uma glicose-6-fosfato desidrogenase, ácidos nucleicos que codificam uma transaldolase, ácidos nucleicos que codificam uma transcetolase, ácidos nucleicos que codificam uma malato-quinona oxidorredutase, ácidos nucleicos que codificam uma 6-fosfogliconato desidrogenase, ácidos nucleicos que codificam um exportador de lisina, ácidos nucleicos que codificam uma biotina ligase, ácidos nucleicos que codificam uma fosfoenolpiruvato carboxilase, ácidos nucleicos que codificam uma proteína do efluxo de treonina, ácidos nucleicos que codificam uma frutose-1,6- bisfosfatase, ácidos nucleicos que codificam uma proteína OpcA, ácidos nucleicos que codificam uma 1 -fosfofrutoquinase, ácidos nucleicos que codificam uma 6-fosfofrutoquinase e ácidos nucleicos que codificam uma homosserina desidrogenase e ácidos nucleicos que codificam uma 6- fosfogliconato desidrogenase, glicose fosfato isomerase, fosfoglicerato mutase, enolase, piruvato quinase, aspartato transaminase e enzima de malato.

Uma outra forma de realização preferida do processo descrito acima para preparar treonina compreende os microorganismos geneticamente modificados tendo, comparado com o tipo selvagem, adicionalmente uma atividade aumentada de pelo menos uma das atividades selecionadas do grupo de:

atividade da aspartato quinase, atividade da aspartato- semialdeído desidrogenase, atividade da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, atividade da 3-fosfoglicerato quinase, atividade da piruvato carboxilase, atividade da triosefosfato isomerase, atividade da treonina sintase, atividade da atividade de um veículo exportador de treonina, atividade da transaldolase, atividade da transcetolase, atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase, atividade da malato-quinona oxidorredutase, atividade da homosserina quinase, atividade da biotina ligase, atividade da fosfoenolpiruvato carboxilase, atividade da proteína do efluxo de treonina, atividade da proteína OpcA5 atividade da 1-fosfofrutoquinase, atividade da 6- fosfofrutoquinase, atividade da frutose-1,6-bisfosfatase, atividade da 6- fosfogliconato desidrogenase, homosserina desidrogenase atividade e atividade de uma 6-fosfogliconato desidrogenase, atividade de uma glicose fosfato isomerase, atividade de uma fosfoglicerato mutase, atividade de uma enolase, atividade de uma piruvato quinase, atividade de uma aspartato transaminase e atividade da enzima de malato.

Uma outra forma de realização particularmente preferida do processo descrito acima para preparar treonina compreende os microorganismos geneticamente modificados tendo, comparado com o tipo selvagem, adicionalmente uma atividade reduzida de pelo menos uma das atividades selecionadas do grupo da treonina desidratase, atividade da homosserina O-acetiltransferase, atividade da serina hidroximetiltransferase, atividade da O-acetil-homosserina sulfidrilase, atividade da meso- diaminopimelato D-desidrogenase, atividade da fosfoenolpiruvato carboxiquinase, atividade da piruvato oxidase, atividade da diidrodipicolinato sintetase, atividade da diidrodipicolinato redutase, atividade da asparaginase, atividade da aspartato descarboxilase, atividade do exportador de lisina, atividade da acetolactato sintase, atividade da cetol-ácido reductoisomerase, atividade da cadeia ramificada da aminotransferase, atividade da metionina sintase dependente da coenzima B12, atividade da metionina sintase independente da coenzima B12, atividade da diidróxi-ácido desidratase e atividade da diaminopicolinato descarboxilase. d) Outra informação sobre a preparação de bioprodutos de acordo com a invenção

Estas atividades aumentadas ou reduzidas adicionais de pelo menos uma das atividades descritas acima podem, mas não necessitam, ser causadas por uma unidade de expressão da invenção ou um cassete de expressão da invenção.

O termo "atividade" de uma proteína significa no caso de enzimas a atividade enzimática da proteína correspondente e no caso de outras proteínas, por exemplo proteínas estruturais ou de transporte, a atividade fisiológica das proteínas.

As enzimas são ordinariamente capazes de converter um substrato em um produto ou catalisar esta etapa de conversão. Conseqüentemente, a "atividade" de uma enzima significa a quantidade de substrato convertido pela enzima ou a quantidade de produto formado, em um tempo particular.

Assim, onde uma atividade é aumentada comparada com o tipo selvagem, a quantidade do substrato convertido pela enzima ou a quantidade de produto formado, em um tempo particular é aumentada comparada com o tipo selvagem.

Este aumento na "atividade", por exemplo, quantidades, para todas as atividades anteriormente descrita e daqui em diante, de pelo menos 1 a 5 %, tal como, por exemplo, pelo menos 20 %, pelo menos 50 %, pelo menos 100 %, pelo menos 300 % ou pelo menos 500 % ou pelo menos 600 % da "atividade do tipo selvagem".

Assim, onde uma atividade é reduzida comparada com o tipo selvagem, a quantidade de substrato convertido pela enzima ou a quantidade de produto formado, em um tempo particular é reduzida comparada com o tipo selvagem.

Uma atividade reduzida preferivelmente significa a supressão ou bloqueio parcial ou substancialmente completo, com base em vários mecanismos biológicos celulares, da funcionalidade desta enzima em um microorganismo.

Uma redução na atividade compreende uma diminuição quantitativa em uma enzima tanto quanto a ausência substancialmente completa da enzima (isto é a falta de detectabilidade da atividade correspondente ou a falta de detectabilidade imunológica da enzima). A atividade no microorganismo é preferivelmente reduzida, comparada com o tipo selvagem, em pelo menos 5 %, tal como em pelo menos 20 %, em pelo menos 50 % ou em cerca de 100 %. "Redução" também significa em particular a ausência completa da atividade correspondente.

A atividade de enzimas particulares em microorganismos geneticamente modificados e no tipo selvagem e assim o aumento ou redução na atividade enzimática pode ser medida pelos métodos conhecidos tais como, por exemplo, ensaios de enzima.

Um aumento adicional das atividades pode ocorrer de vários modos, por exemplo desligando-se os mecanismos reguladores inibidores ao nível de expressão e proteína ou pelo aumento da expressão de gene de ácidos nucleicos que codificam as proteínas descritas acima comparado com o tipo selvagem.

Aumentar a expressão de gene do ácidos nucleicos que codificam as proteínas descritas acima comparado com o tipo selvagem pode do mesmo modo ocorrer de vários modos, por exemplo pela indução do gene pelos ativadores ou, como descrito acima, aumentando-se a atividade promotora ou aumentando-se a atividade de expressão ou pela introdução de um ou mais cópias de gene no microorganismo.

Aumentar a expressão de gene de um ácido nucleico que codifica uma proteína também significa de acordo com a invenção a manipulação da expressão das proteínas endógenas intrínseca ao microorganismo. Isto pode ser obtido por exemplo, como descrito acima, alterando-se as seqüências promotoras dos genes, introduzindo uma unidade de expressão da invenção para o controle regulador dos genes e alterando as unidades de expressão da invenção introduzidas. Uma tal alteração, que resulta em uma taxa de expressão aumentada do gene, pode ocorrer por exemplo pela deleção ou inserção de seqüências de DNA.

E possível, como descrito acima, alterar a expressão das proteínas endógenas pela aplicação de estímulos exógenos. Isto pode ocorrer através de condições fisiológicas particulares, isto é através da aplicação de substâncias estranhas.

O técnico habilitado pode ter recursos para outros procedimentos diferentes, isoladamente ou em combinação, para se obter um aumento na expressão de gene. Assim, por exemplo, o número de cópia dos genes apropriados pode ser aumentado ou o promotor e a região reguladora ou o sítio de ligação de ribossoma localizado a montante do gene estrutural podem ser mutados. E adicionalmente possível aumentar a expressão durante a produção fermentativa através de promotores indutíveis. Procedimentos para prolongar o período de vida do mRNA do mesmo modo melhora a expressão. A atividade enzimática é do mesmo modo realçada também impedindo-se a degradação da proteína enzimática. Os genes ou construções de gene podem estar presentes em plasmídeos com número de cópia variável ou integrado e amplificado no cromossoma. Também é possível como uma alternativa obter a super expressão dos genes relevantes alterando-se a composição do meio e o controle da cultura.

O técnico habilitado pode encontrar orientação sobre isto inter alia em Martin et al. (Biotechnology 5, 137-146 (1987)), em Guerrero et ai. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya e Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), em Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), na EP-A 0472869, na USA 4.601.893, em Schwarzer e Pichler (Biotechnology 9, 84-87 (1991), em Reinscheid et al. (Applied and Ambiental Microbiology 60, 126-132 (1994), em LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), na WO 96/15246, em Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), na JP-A-IO- 229891, em Jensen e Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191- 195 (1998)), em Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996) e em livros texto bem conhecidos de genética e biologia molecular.

Pode ser adicionalmente vantajoso para a produção de produtos biossintéticos, especialmente L-lisina, L-metionina e L-treonina, além da expressão ou realce de um gene, eliminar reações colaterais indesejadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", em: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, UK, 1982).

Em uma forma de realização preferida, a expressão de gene de um ácido nucleico que codifica uma das proteínas descritas acima é aumentada pela introdução de pelo menos um ácido nucleico que codifica uma proteína correspondente no microorganismo. A introdução do ácido nucleico pode ocorrer cromossômica ou extracromossomicamente, isto é através do aumento do número de cópia no cromossoma e/ou uma cópia do gene em um plasmídeo que replique no microorganismo hospedeiro.

A introdução do ácido nucleico, por exemplo na forma de um cassete de expressão da invenção que compreende o ácido nucleico, preferivelmente ocorre cromossomicamente, em particular pelo método SacB descrito acima. É possível em princípio usar para este propósito qualquer gene que codifique uma das proteínas descritas acima.

No caso de seqüências de ácido nucleico genômicas de fontes eucarióticas que compreendem introns, se o microorganismo hospedeiro é incapaz ou não pode ser feito capaz de expressar as proteínas correspondentes é preferido usar seqüências de ácido nucleico que já tenham sido processadas, tais como os cDNAs correspondentes. Os exemplos dos genes correspondentes estão listados nas

Tabelas 1 e 2.

As atividades descritas acima em microorganismos são preferivelmente reduzidas em pelo menos um dos seguintes métodos: introdução de pelo menos uma seqüência de ácido ribonucleico de sentido para induzir a co-supressão ou de um cassete de expressão que garanta a sua expressão

• introdução de pelo menos um fator de ligação de DNA ou proteína contra um gene, um RNA ou uma proteína correspondentes ou de um cassete de expressão que garanta a sua expressão

• introdução de pelo menos uma seqüência de ácido nucleico viral que cause a degradação do RNA ou de um cassete de expressão que garanta a sua expressão

• introdução de pelo menos uma construção para produzir uma perda de of função, tal como, por exemplo, a geração de códons de parada ou mudanças na matriz de leitura, de um gene, por exemplo pela produção de uma inserção, deleção, inversão ou mutação em um gene. E possível e preferido gerar mutantes silenciados pela inserção alvejada no gene alvo desejado através da recombinação homóloga ou introdução de nucleases específicas de seqüência contra o gene alvo.

• introdução de um promotor com atividade promotora reduzida ou de uma unidade de expressão com atividade de expressão reduzida.

• introdução de um RNA de anti-sentido que reduza a tradução do RNA de sentido (mRNA).

O técnico habilitado está ciente de que outros processos também podem ser utilizados dentro do escopo da presente invenção para reduzir a sua atividade ou função. Por exemplo, a introdução de uma variante negativa dominante de uma proteína ou de um cassete de expressão que garanta a sua expressão também pode ser vantajoso.

É além disso possível para cada um destes processos realizar uma redução na quantidade de proteína, quantidade de mRNA e/ou atividade de uma proteína. Um uso combinado também é concebível. Outros métodos são conhecidos pelo técnico habilitado e podem compreender impedir ou suprimir o processamento da proteína, do transporte da proteína ou do seu mRNA, a inibição da ligação de ribossoma, a inibição da junção de RNA, indução de uma enzima de degradação do RNA e/ou inibição do prolongamento ou término da tradução.

VII. Cultivo de microorganismos e isolação de produtos

No processo da invenção para preparar produtos biossintéticos, a etapa de cultivar os microorganismos geneticamente modificados é preferivelmente seguida por uma isolação de produtos biossintéticos a partir dos microorganismos e/ou a partir do caldo de fermentação. Estas etapas podem ocorrer ao mesmo tempo e/ou preferivelmente depois da etapa de cultivo.

Os microorganismos geneticamente modificados da invenção podem ser cultivados para produzir produtos biossintéticos, em particular L- lisina, L-metionina e L-treonina, continuamente ou descontinuamente em um processo por batelada (cultivo por batelada) ou no processo de lote alimentado ou lote alimentado repetido. Um resumo de métodos de cultivo conhecidos deve ser encontrado nos livros texto por Chemiel (BioprozelMechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou nos livro texto por Storhas (Bioreaktoren and periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

O meio de cultura a ser usado deve satisfazer em uma maneira adequada as demandas das cepas respectivas. Existem descrições de meios de cultura para vários microorganismos no manual "Manual of Methods for General Bacteriology" da American Society for Bacteriology (Lavarton D.C., USA, 1981).

Estes meios que podem ser utilizados de acordo com a invenção usualmente compreendem uma ou mais fontes de carbono, fontes de nitrogênio, sais inorgânicos, vitaminas e/ou elementos traço.

As fontes de carbono preferidas são açúcares tais como mono-, di- ou polissacarídeos. Os exemplos de fontes de carbono muito boas são glicose, frutose, manose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sacarose, rafinose, amido ou celulose. Os açúcares podem ser colocados nos meios também por intermédio de compostos complexos tais como melaços ou outros sub-produtos do refino do açúcar. Também pode ser vantajoso adicionar misturas de várias fontes de carbono. Outras fontes de carbono possíveis são óleos e gorduras tais como, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e gordura de coco, ácidos graxos tais como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico ou ácido linoléico, álcoois tais como, por exemplo, glicerol, metanol ou etanol e ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácido acético ou ácido láctico.

As fontes de nitrogênio são usualmente compostos de nitrogênio orgânicos ou inorgânicos ou materiais contendo estes compostos.

Os exemplos de fontes de nitrogênio compreendem gás de amônia ou sais de amônio tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio ou nitrato de amônio, nitratos, uréias, aminoácidos ou fontes de nitrogênio complexas tais como o líquido da maceração do milho, farinha de soja, proteína de soja, extrato de levedura, extrato de carne e outros. As fontes de nitrogênio podem ser usadas isoladamente ou como misturas.

Os compostos de sal inorgânico que podem estar presentes nos meios compreendem o sais de cloreto, fosfórico ou sulfato de cálcio, magnésio, sódio, cobalto, molibdênio, potássio, manganês, zinco, cobre e ferro.

Para preparar produtos químicos finos, especialmente metionina, é possível usar como compostos inorgânicos fontes de enxofre tais como, por exemplo, sulfatos, sulfitos, ditionitos, tetrationatos, tiossulfatos, sulfetos, mas também compostos de enxofre orgânico tais como mercaptanas e tióis.

E possível usar como fonte de fósforo ácido fosfórico, diidrogeno fosfato de potássio ou diidrogeno fosfato de potássio ou os sais contendo sódio correspondentes.

Os agentes queladores podem ser adicionados ao meio de modo a manter os íons metálicos em solução. Os agentes queladores particularmente adequados compreendem diidroxifenóis tais como catecol ou protocatecuato ou ácidos orgânicos tais como ácido cítrico.

Os meios de fermentação utilizados de acordo com a invenção normalmente também compreendem outros fatores de crescimento tais como vitaminas ou promotores do crescimento, que incluem por exemplo biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato e piridoxina. Fatores de crescimento e sais são freqüentemente derivados de componentes complexos dos meios, tais como extrato de levedura, melaços, líquido da maceração do milho e outros. Precursores adequados também podem ser adicionados aos meios de cultura. A composição exata dos compostos nos meios depende enormemente do experimento particular e será decidido individualmente para cada caso específico. A informação sobre a otimização de meios é obtenível do livro texto "Applied Microbial. Physiology, A Practical Approach" (editores Ρ. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Os meios de cultivo também podem ser adquiridos de fornecedores comerciais, tais como o Padrão 1 (Merck) ou BHI (Infusão cperebro-coração, DIFCO) e outros.

Todos os componentes dos meios são esterilizados pelo aquecimento (20 min a 1,5 bar e 121° C) ou pela filtração esterilizante. Os componentes podem ser esterilizados juntos ou, se necessário, separadamente. Todos os componentes dos meios podem estar presentes no início do cultivo ou opcionalmente ser adicionados continuamente ou por batelada.

A temperatura da cultura está normalmente entre 15° C e 45° C, preferivelmente de 25° C a 40° C e pode ser mantida constante ou trocada durante o experimento. O pH do meio deve estar na faixa de 5 a 8,5, preferivelmente em torno de 7,0. O pH para o cultivo pode ser controlado durante o cultivo pela adição de compostos básicos tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa ou compostos ácidos tais como ácido fosfórico ou ácido sulfurico. O desenvolvimento de espuma pode ser controlado pela utilização de antiespumantes tais como, por exemplo, ésteres poliglicólicos de ácido graxo. A estabilidade de plasmídeos pode ser mantida pela adição ao meio de substâncias adequadas com uma ação seletiva, tal como, por exemplo, antibióticos. As condições aeróbicas são mantidas pela introdução de oxigênio ou misturas gasosas contendo oxigênio tal como, por exemplo, ar ambiente na cultura. A temperatura da cultura é normalmente de 20° C a 45° C. A cultura é continuada até que a formação do produto desejado esteja em um máximo. Este objetivo é normalmente atingido dentro de 10 horas a 160 horas.

O teor de matéria seca dos caldos de fermentação obtidos deste modo é normalmente de 7,5 a 25 % em peso.

E adicionalmente vantajoso conduzir também a fermentação com limitação de açúcar pelo menos no final, mas em particular durante pelo menos 30 % do tempo de fermentação. Isto significa que a concentração de açúcar utilizável no meio de fermentação é mantido de 0 a 3 g/l ou é reduzida, durante este tempo.

Os produtos biossintéticos são isolados do caldo de fermentação e/ou dos microorganismos em uma maneira conhecida por si de acordo com as propriedades físico/químicas do produto biossintético requerido e dos subprodutos biossintéticos.

O caldo de fermentação pode ser depois por exemplo processado ainda mais. Dependendo da exigência, a biomassa pode ser removida total ou parcialmente a partir do caldo de fermentação pelos métodos de separação tais como, por exemplo, centrifugação, filtração, decantação ou uma combinação destes métodos ou deixados completamente nele.

O caldo de fermentação pode ser depois espessado ou concentrado por métodos conhecidos tais como, por exemplo, com a ajuda de um evaporador rotativo, evaporador de película fina, evaporador de película em queda, pela osmose reversa ou pela nanofiltração. Este caldo de fermentação concentrado pode ser depois trabalhado pela secagem por congelamento, secagem por pulverização, granulação por pulverização ou por outros processos.

Entretanto, também é possível ainda purificar os produtos biossintéticos, especialmente L-lisina, L-metionina e L-treonina. Para este propósito, o caldo contendo produto é submetido, depois da remoção da biomassa, a uma cromatografia usando uma resina adequado, com o produto desejado ou as impurezas que são retidas total ou parcialmente na resina cromatográfica. Estas etapas cromatográficas podem ser repetidas se requerido, usando as mesmas resinas cromatográficas ou diferentes. O técnico habilitado é proficiente na seleção de resinas cromatográficas adequadas e o seu uso mais eficaz. O produto purificado pode ser concentrado pela filtração ou ultrafiltração e ser armazenado a uma temperatura na qual a estabilidade do produto seja um máximo.

Os produtos biossintéticos podem resultar em várias formas, por exemplo na forma de seus sais ou ésteres.

A identidade e pureza do(s) composto(s) isolado(s) pode(m) ser determinado(s) pelas técnicas da técnica anterior. Estas compreendem a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de tingimento, cromatografia de camada fina, MRS, ensaio de enzima ou ensaios microbiológicos. Estes métodos analíticos são resumidos em: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; e Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) vol. A27, VCH: Weinheim5 pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559- 566, 575-581 e pp. 581-587; Michel, G (1999) Biochemical Pathways: A Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et ai. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry em: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17.

A invenção é agora descrito em mais detalhes por meio dos seguintes exemplos não limitantes:

Exemplo 1:

Preparação do vetor pCLIK5MCS

Primeiro, a resistência à ampicilina e a origem de replicação do vetor pBR322 foram amplificados com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 5 e

SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 5:

5'-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGA AATACCGCACAG-3' SEQ ID NO: 6:

5'-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTT AAATTG AAGAC GAAAGGGCCTCG-3'

A parte das seqüências complementares a pBR322, o iniciador de oligonucleotídeo da SEQ ID NO: 5 compreende, na direção de 5' a 3', os sítios de clivagem para as endonucleases de restrição SmaI, BamHI, NheI e AscI e o iniciador de oligonucleotídeo da SEQ ID NO: 6 compreende, na direção de 5' a 3', os sítios de clivagem para as endonucleases de restrição XbaI, XhoI, NotI e DraI. A reação de PCR foi realizada por um método padrão tal como Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) usando a PfuTurbo polimerase (Stratagene, La Jolla, USA). O fragmento de DNA obtido, cujo tamanho é de aproximadamente 2,1 kb, foi purificado usando o Kit de GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha) de acordo com as informações do fabricante. As extremidades abruptas do fragmento de DNA foram ligados entre si usando o Kit de Ligação de DNA Rápido (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada de acordo com métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning.

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), em E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção para células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB Ágar contendo ampicilina (501,1 g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico de um clone individual foi isolado usando o kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as informações do fabricante e checado por intermédio de digestões de restrição. O plasmídeo obtido deste modo é denotado pCLiK1.

Partindo do plasmídeo pWLTl (Liebl et al., 1992) como padrão para uma reação de PCR, um cassete de resistência à canamicina foi amplificado usando os iniciadores de oligonucleotídeo da SEQ ID NO: 7 e

SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO: 7:

5'-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGG AAGCGGA-3'

SEQ ID NO: 8 5 '-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3'

A parte das seqüências complementares a ρWLTl, iniciador de oligonucleotídeo da SEQ ID NO: 7 compreende, na direção de 5' para 3', os sítios de clivagem para as endonucleases de restrição XbaI, SmaI5 BamHI, NheI e o iniciador de oligonucleotídeo da SEQ ID NO: 8 compreende, na direção 5' a 3', os sítios de clivagem para as endonucleases de restrição AscI e NheI. A reação de PCR foi realizada pelo método padrão tal como Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)), usando PfuTurbo polimerase (Stratagene, La Jo 11a, USA). O fragmento de DNA obtido, cujo tamanho é de aproximadamente 1,3 kb, foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA e Gel Band Purificação (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante. O fragmento de DNA foi cortado pelas endonucleases de restrição XbaI e AscI (New England Biolabs, Beverly, USA) e subseqüentemente purificado mais uma vez usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante. O vetor pCLiKl foi igualmente cortado pelas endonucleases de restrição XbaI e AscI e desfosforilado pela fosfatase alcalina (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) de acordo com as informações do fabricante. Depois da eletroforese em um gel de agarose a 0,8 % de concentração, o vetor linearizado (aprox. 2,1 kb) foi isolado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante. Este fragmento de vetor foi ligado com o fragmento de PCR cortado com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), em E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo ampicilina (50 μ§/πι1) e canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico de um clone individual foi isolado usando o Kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as informações do fabricante e checado por intermédio de digestões de restrição.

O plasmídeo obtido deste modo é denotado pCLiK2.

O vetor pCLiK2 foi cortado pela endonuclease de restrição DraI (New England Biolabs, Beverly, USA). Depois da eletroforese em um gel de agarose a 0,8 % de concentração, um fragmento de vetor de aprox. 2,3 kb foi isolado com o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante. Este fragmento de vetor foi religado com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos 15 métodos padrão como descrito em Sambrook et ai. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), em E. coli competente XL- 1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção para células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico de um clone individual foi isolado usando o Kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as informações do fabricante e checados por intermédio de digestões de restrição. O plasmídeo obtido deste modo é denotado pCLiK3.

Partindo do plasmídeo pWLQ2 (Liebl et al., 1992) como padrão para uma reação de PCR, a origem pHM1519 de replicação foi amplificada usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 9 e SEQ

ID NO: 10.

SEQ ID NO: 9:

5 '-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3' SEQ ID NO: 10:

5 '-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3'

A parte das seqüências complementares para pWLQ2, os iniciadores de oligonucleotídeo da SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10 compreendem sítios de clivagem para a endonuclease de restrição NotI. A reação de PCR foi realizada pelo método padrão tal como Innis et ai. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)), usando PfuTurbo polimerase (Stratagene, La Jolla, USA). O fragmento de DNA obtido, cujo tamanho é de aproximadamente 2,7 kb, foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante. O fragmento de DNA foi cortado pela endonuclease de restrição NotI (New England Biolabs, Beverly, USA) e subseqüentemente purificado mais uma vez usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante. O vetor pCLiK3 foi do mesmo modo cortado pela endonuclease de restrição NotI e desfosforilado pela fosfatase alcalina (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) de acordo com as informações do fabricante. Depois da eletroforese em um gel de agarose a 0,8 % de concentração, o vetor linearizado (aprox. 2,3 kb) foi isolado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante. Este fragmento de vetor foi ligado com o fragmento de PCR cortado com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápido (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), em E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em ágar LB contendo canamicina (20 μ§/πι1) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190). O DNA plasmídico de um clone individual foi isolado usando o Kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as informações do fabricante e checada por intermédio de digestões de restrição. O plasmídeo obtido deste modo é denotado pCLiK5.

De modo a estender pCLiK5 por um "sítio de clonagem múltiplo" (MCS), os dois oligonucleotídeos sintéticos, essencialmente complementares da SEQ ID NO: lie SEQ ID NO: 12, que compreendem sítios de clivagem para as endonucleases de restrição SwaI, XhoI, AatI, ApaI, Asp718, MluI, NdeI, SpeI, EcoRV, SalI, ClaI, BamHI, XbaI e SmaI foram combinados aquecendo-os juntos a 95° C seguido pelo esfriamento lento para dar um fragmento de DNA de filamento duplo. SEQ ID NO: 11:

5' -TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTAC

CACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCG

ATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGA

TTTAAAT-3'

SEQ ID NO: 12:

5'-GATC ATTT AAATCCCGGGTCTAGAGGATCCC AATTGTT AAT TAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAAC TAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGA GATIT AAAT-3'

O vetor pCLiK5 foi cortado pelas endonucleases de restrição XhoI e BamHI (New England Biolabs, Beverly, USA) e defosforilado pela fosfatase alcalina (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) de acordo com as 15 informações do fabricante. Depois da eletroforese em um gel de agarose a 0,8 % de concentração, o vetor linearizado (aprox. 5,0 kb) foi isolado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante. Este fragmento de vetor foi ligado com o fragmento de DNA de filamento duplo sintético com a ajuda da Rapid DNA Ligação Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et ai. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), into E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico de um clone individual foi isolado usando o Kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as informações do fabricante e checado por intermédio de digestões de restrição. O plasmídeo obtido deste modo é denotado pCLiK5MCS.

As reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemanha).

O plasmídeo resultante, pCLiK5MCS, está listado como a SEQ ID NO: 13.

Exemplo 2:

Preparação do plasmídeo PmetA metA

O DNA cromossômico ATCC 13032 de C. glutamicum foi preparado de acordo com Tauch et ai. (1995) Plasmid 33: 168-179 ou Eikmanns et ai. (1994) Microbiology 140: 1817-1828. Usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), o gene metA, que inclui a região 5' não codificadora, foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão como descrito em Innis et ai. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. SEQ ID NO: 14

5'-GCGCGGTACCT AGACTC ACCCCAGTGCT -3' e

SEQ ID NO: 15

5' -CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT -3'

O fragmento de DNA de aprox. 1,3 kb obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante. Este foi subseqüentemente clivado pelas enzimas de restrição Asp718 e SpeI (Roche Diagnostics, Mannheim) e o fragmento de DNA foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

O vetor pClik5MCS SEQ ID NO: 13 foi cortado pelas enzimas de restrição Asp718 e Spat e um fragmento de 5 kb foi isolado, depois do fracionamento eletroforético, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification.

O fragmento de vetor foi ligado junto com o fragmento de PCR com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), em E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μ§/ιη1) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico foi preparado pelos métodos e com materiais da Quiagen. As reações de seqüenciamento foram realizados de acordo com Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt). O plasmídeo resultante, pCLiK5MCS PmetA metA, está listado como SEQ ID NO: 16.

Exemplo 3:

Preparação do plasmídeo pCLIK5MCS Psod metA

O DNA cromossômico ATCC 13032 da C. glutamicum foi preparado de acordo com Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179 ou Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828. Usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), um fragmento de DNA de aprox. 200 pares de base da região não codificadoras 5' (região da unidade de expressão) da superóxido dismutase (Psod) foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão tais como Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to

Methods and Applications, Academic Press.

SEQ ID NO: 17

5 '-GAGACTCGAGAGCTGCCAA1TATTCCGGG-3' e

SEQ ID NO: 18

5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGGGTAAAAAATCCTTTC G -3'

O fragmento de DNA obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante.

Partindo do plasmídeo PmetA metA SEQ ID NO: 16 como padrão para uma reação de PCR, metA foi parcialmente amplificado usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20. SEQ ID NO: 19 5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG -3' e

SEQ ID NO: 20 5'-CTGGGTACATTGCGGCCC -3'

O fragmento de DNA obtido de aproximadamente 470 pares de base foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification de acordo com as informações do fabricante.

Os dois fragmentos obtidos acima foram usados junto como padrão em uma outra reação de PCR. No curso da reação de PCR, as seqüências homólogas a metA introduzidos com o iniciador de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 18 faz com que os dois fragmentos se liguem entre si e sejam prolongados pela polimerase usada para dar uma cepa de DNA contínua. O método padrão foi modificado em que os iniciadores de oligonucleotídeo usados, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 20, foram apenas adicionados à mistura de reação no início do 2o ciclo.

O fragmento de DNA amplificado de aproximadamente 675 pares de base foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification de acordo com as informações do fabricante. Este foi subseqüentemente clivado pelas enzimas de restrição XhoI e NcoI (Roche Diagnostics, Mannheim) e fracionadas pela eletroforese em gel. O fragmento de DNA de aprox. 620 pares de base foi depois purificado a partir de agarose, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg).

O plasmídeo PmetA metA da SEQ ID NO: 16 foi clivado pelas enzimas de restrição NcoI e SpeI (Roche Diagnostics, Mannheim). Depois do fracionamento pela eletroforese em gel, um fragmento metA de aprox. 0,7 kb foi purificado a partir da agarose, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification.

O vetor pClik5MCS da SEQ ID NO: 13 foi cortado pelas enzimas de restrição XhaI e SpeI (Roche Diagnostics, Mannheim) e um fragmento de 5 kb foi isolado, depois do fracionamento eletroforético, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification.

O fragmento de vetor foi ligado junto com o fragmento de PCR e o fragmento metA com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnosticsj Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), em E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico foi preparado pelos métodos e com materiais da Quiagen. As reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com Sanger et ai. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

O plasmídeo obtido, pCLIK5MCS PSODmetA, está listado como a SEQ ID NO: 21.

Exemplo 4:

Preparação do plasmídeo pCLiK5MCS P EF-TU metA

O DNA cromossômico ATCC 13032 da C. glutamicum foi preparado de acordo com Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179 ou Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828. Usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23, o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), um fragmento de DNA de aprox. 200 pares de base da região não codificadora 5' (região promotora) da superóxido dismutase (Psod) foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão tais como Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press.

SEQ ID NO: 22 5'-GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG -3' e SEQ ID NO: 23

5'-CCTGAAGGCGCGAGGGIGGGCATTGTATGTCCTCCTGGAC -3'

O fragmento de DNA obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR5 DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante.

Partindo do plasmídeo PmetA metA da SEQ ID NO: 16 como padrão para uma reação de PCR, metA foi parcialmente amplificado usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 25. SEQ ID NO: 24 5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG -3' e

SEQ ID NO: 25 5'-CTGGGTACATTGCGGCCC -3'

O fragmento de DNA obtido de aproximadamente 470 pares de base foi purificado usando o GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification Kit de acordo com as informações do fabricante.

Os dois fragmentos obtidos acima foram usados juntos como padrão em uma outra reação de PCR. No curso da reação de PCR, as seqüências homólogas a metA introduzidas com o iniciador de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 18 faz com que os dois fragmentos se liguem entre si e sejam prolongados pela polimerase usada para dar uma cepa de DNA contínua. O método padrão foi modificado em que os iniciadores de oligonucleotídeo usados, a SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 25, foram apenas adicionados à mistura de reação no início do 2o ciclo.

O fragmento de DNA amplificado de aproximadamente 675 pares de base foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification de acordo com as informações do fabricante. Este foi subseqüentemente clivado pelas enzimas de restrição XhoI e NcoI (Roche Diagnostics, Mannheim) e fracionadas pela eletroforese em gel. O fragmento de DNA de aprox. 620 pares de base foi depois purificado a partir da agarose, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg).

O plasmídeo PmetA metA da SEQ ID NO: 16 foi clivado com as enzimas de restrição NcoI e SpeI (Roche Diagnostics, Mannheim). Depois do fracionamento pela eletroforese em gel, um fragmento metA de aprox. 0,7 kb foi purificado a partir da agarose, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification.

O vetor pClik5MCS da SEQ ID NO: 13 foi cortado pelas enzimas de restrição XhoI e SpeI (Roche Diagnostics, Mannheim) e um fragmento de 5 kb foi isolado, depois do fracionamento eletroforético, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification.

O fragmento de vetor foi ligado junto com o fragmento da PCR e o fragmento metA com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), em E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico foi preparado pelos métodos e com materiais da Quiagen. As reações de seqüenciamento* foram realizadas de acordo com Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As Reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliada por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

O plasmídeo obtido, pCLiK5MCS P_EFTUmetA, está listado como SEQ ID NO: 26.

Exemplo 5:

Preparação do plasmídeo pCLIK5MCS Pgro metA O DNA cromossômico ATCC 13032 da C. glutamicum foi preparado de acordo com Tauch et ai. (1995) Plasmid 33: 168-179 ou Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828. Usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28, o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene)5 um fragmento de DNA de aprox. 200 pares de base da região não codificadora 5' (região promotora) do gene GroES (Pgro) foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão tais como Innis et ai. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press.

SEQ ID NO: 27

5'-GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTGGCTGCC -3' SEQ ID NO: 28

5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGATGAATCCCTCCATGA G-3'

O fragmento de DNA obtidos foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante.

Partindo do plasmídeo PmetA metA como padrão para uma reação de PCR, metA foi parcialmente amplificado usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30. SEQ ID NO: 29

5' -CCCACCCTCGCGCCTTGAG -3' SEQ ID NO: 30

5 '-CTGGGTACATTGCGGCCC -3'

O fragmento de DNA obtido de aproximadamente 470 pares de base foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification de acordo com as informações do fabricante.

Os dois fragmentos obtidos acima foram usados juntos como padrão em uma outra reação de PCR. No curso da reação de PCR, as seqüências homólogas a metA introduzidas com o iniciador de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 28 fazem com que os dois fragmentos se liguem entre si e sejam prolongados pela polimerase usada para dar uma cepa de DNA contínua. O método padrão foi modificado em que os iniciadores de oligonucleotídeo usados, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 30, foram apenas adicionados à mistura de reação no início do 2o ciclo.

O fragmento de DNA amplificado de aproximadamente 675 pares de base foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification de acordo com as informações do fabricante. Este foi subseqüentemente clivado pelas enzimas de restrição XhoI e NcoI (Roche Diagnostics, Mannheim) e fracionados pela eletroforese em gel. O fragmento de DNA de aprox. 620 pares de base foi depois purificado da agarose, usando o Kit GFK® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg).

O plasmídeo PmetA metA SEQ ID NO: 16 foi clivado pelas enzimas de restrição NcoI e SpeI (Roche Diagnostics, Mannheim). Depois do fracionamento pela eletroforese em gel, um fragmento metA de aprox. 0,7 kb foi purificado a partir da agarose, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification.

O vetor pClik5MCS SEQ ID NO: 13 foi cortado pelas enzimas de restrição XhoI e SpeI (Roche Diagnostics, Mannheim) e um fragmento de 5 kb foi isolado, depois do fracionamento eletroforético, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification.

O fragmento de vetor foi ligado junto com o fragmento de PCR e o fragmento metA com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et ai. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), em E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μιτι/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico foi preparado pelos métodos e com materiais da Quiagen. As reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

O plasmídeo obtido, pCLIK5MCS Pgro metA, é listada como a SEQ ID NO: 31.

Exemplo 6:

Preparação do plasmídeo P EF-TS metA

O DNA cromossômico ATCC 13032 da C. glutamicum foi preparada de acordo com Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179 ou Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828. Usando os iniciadores de oligonucleotídeo BK 1849 (SEQ ID NO: 32) e BK 1862 (SEQ ID NO: 33), o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), o gene MetaA que codifica a homosserina O-acetiltransferase foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão como descrito em Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. BK 1849 (SEQ ID NO: 32)

5'- GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG -3' e

BK 1862 (SEQ ID NO: 33) 5'-ATGCCCACCCTCGCGCC -3'

O fragmento de DNA de aprox. 1134 pares de base obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante.

Usando os iniciadores de oligonucleotídeo Haf 26 (SEQ ID NO: 34) e Haf 27 (SEQ ID NO: 35), o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), um fragmento de DNA de aprox. 200 pares de base da região não codificadora 5' (região da unidade de expressão) do gene que codifica o fator de alongamento TS foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão como descrito em Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press.

Haf 26 (SEQ ID NO: 34)

5 '-GAGAGGATCCCCCCCACGACAATGGAAC-3' e

Haf 27 (SEQ ID NO: 35)

5' -CCTGAAGGCGCGAGGGIGGGC ATTACGGGGCGATCCTCCTTATG -3'

O fragmento de DNA de aprox. 195 pares de base obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante.

Os iniciadores Hat 27 e BK 1862 compreendem uma seqüência de sobreposição e a suas extremidades 5' são homólogas entre si.

Os produtos de PCR obtidos acima foram usados como padrão para outra PCR que faz uso dos iniciadores BK 1849 (SEQ ID NO: 32) e Haf 26 (SEQ ID NO: 34).

Usando este método, um fragmento de DNA foi amplificado que correspondeu ao tamanho esperado de 1329 pares de base. Esta fusão P EF-TS/metA foi depois clonada por intermédio dos sítios de clivagem de restrição BamHI e SalI no vetor pClik 5a MCS (SEQ ID NO: 13). O fragmento de vetor foi ligado junto com o fragmento de PCR com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), na E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico foi preparado pelos métodos e com materiais da Quiagen. As reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

O plasmídeo resultante foi aludido como pClik 5a MCS P EF- TS metA (SEQ ID NO: 36).

Exemplo 7:

Preparação do plasmídeo P EF-Tu pSOD metA (H473)

O DNA cromossômico ATCC 13032 da C. glutamicum foi preparado de acordo com Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179 ou Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828. Usando os iniciadores de oligonucleotídeo BK 1753 (SEQ ID NO: 37) e BK 1754 (SEQ ID NO: 38), o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), o terminador GroEL foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão como descrito em Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press.

BK 1753 (SEQ ID NO: 37) GGATCTAGAGTTCTGTGAAAAACACCGTG BK 1754 (SEQ ID NO: 38) GÇGACTAGTGCCCCACAAATAAAAAACAC

O fragmento de DNA de aprox. 77 pares de base obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante, cortado pelas enzimas de restrição XbaI e BcuI e purificado uma vez mais.

O vetor pClik5MCS (SEQ ID NO: 13) foi linearizado pela enzima de restrição XbaI e purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante.

O vetor linearizado foi ligado junto com o fragmento de PCR com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), em E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico foi preparado pelos métodos e com materiais da Quiagen. As reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

O resultante plasmídeo foi aludido como H247 (SEQ ID NO:39).

Este plasmídeo foi tratado com as enzimas de restrição BcuI e SalI e purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante.

Uma PCR usando os oligonucleotídeos BK 1848 (SEQ ID NO: 40) e BK 1849 (SEQ ID NO: 41), o plasmídeo pClikSMCS Psod metA (SEC) ID NO: 21) como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene) foi realizado pelos métodos padrão como descrito em Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. O fragmento amplificado teve um comprimento esperado de aprox. 1350 pares de base e foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante, cortado pelas enzimas de restrição BcuI e SalI e purificado uma vez mais.

Este fragmento foi ligado com o plasmídeo H247 (sítios de clivagem BcuI e SalI) com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), na E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla5 USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico foi preparado pelos métodos e com materiais da Quiagen. As reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiter stadt).

O plasmídeo resultante foi aludido como pG A4 (H344) e é listada sob SEQ ID NO: 42. SEQ ID NO: 40 (BK 1848) GAGAACTAGTAGCTGCCAATTATTCCGGG SEQ ID NO: 41 (BK 1849)

GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG

O plasmídeo pG A4 (SEQ ID NO: 42) foi cortado pelas enzimas de restrição XhoI e BcuI e purificado usando o Kit GPX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante.

Construção de H473:

O DNA cromossômico ATCC 13032 da C. glutamicum foi preparado de acordo com Tauch et ai. (1995) Plasmid 33: 168-179 ou Eikmanns et ai. (1994) Microbiology 140: 1817-1828. Usando os iniciadores oligonucleotídicos BK 1695 (SEQ ID NO: 43) e Hafl6 (SEQ ID NO: 44), o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), um fragmento de DNA de aprox. 182 pares de base da região não codificadora 5' (região da unidade de expressão) do gene EF Tu (Peftu) foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão como descrito em Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press.

SEQ ID NO: 43 (BK1695) GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG SEQ ID NO: 44 (Hafló)

GAGAACT AGTGTGGCTACGACTTTCGCAGC

O fragmento de DNA de aprox. 200 pares de base obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR3 DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante, cortado pelas enzimas de restrição Xho I e Bcu I e purificado uma vez mais.

Este fragmento foi ligado com o plasmídeo pG A4 (H344) (sítios de clivagem XhoI e BcuI) com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), em E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O plasmídeo obtido foi aludido como pClik5MCS PeftuPsod metA (H473). Este está listado sob SEQ ID NO: 45. Este compreende (de 5' para 3') um promotor Peftu, uma unidade de expressão Psod e, imediatamente a jusante desta, a matriz de leitura aberta metA. Exemplo 8:

Preparação do plasmídeo PsodPeftu metA (H605) O DNA cromossômico ATCC 13032 da C. glutamicum foi preparado de acordo com Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179 ou Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828. Usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 46 (Haf64) e SEQ ID NO: 47 (Haf65), o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), um fragmento de DNA de aprox. 200 pares de base da região não codificadora 5' (região da unidade de expressão) do gene EF Tu (Peftu) foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão como descritos em Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. SEQ ID NO: 46 (Haf64)

GAGAACT AGTGGCCGTTACCCTGCGAATG SEQ ID NO: 47 (Haf65)

GCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGACTTC

O fragmento de DNA de aprox. 200 pares de base obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante.

Em uma segunda PCR, usando os iniciadores de oligonucleotídeo BK1862 (SEQ ID NO: 48) e BK1849 (SEQ ID NO: 49) e o plasmídeo H344 (SEQ ID NO: 42) como padrão, a matriz de leitura aberta metA foi amplificado pelos métodos padrão como descrito em Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. O fragmento de aprox. 1140 pares de base obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante.

SEQ ID NO: 48 (BK1862) ATGCCCACCCTCGCGCC SEQ ID NO: 49 (BK1849)

GTGTGTCGACTT AGATGT AGAACTCGATGTAG

Os dois fragmentos obtidos acima foram usados juntos como padrão em uma outra reação de PCR. No curso da reação de PCR, as seqüências homólogas a metA introduzidas com o iniciador de oligonucleotídeo Haf 65 SEQ ID NO: 47 faz com que os dois fragmentos se liguem entre si e sejam prolongados pela polimerase usada para dar uma cepa de DNA contínua. O método padrão foi modificado em que os iniciadores de oligonucleotídeo usados, Haf 64 e BK 1849 SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 49 foram apenas adicionados à mistura de reação no início do 2o ciclo.

O fragmento de DNA amplificado de aproximadamente 1350 pares de base foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification de acordo com as informações do fabricante. Este foi subseqüentemente clivado pelas enzimas de restrição BcuI e SaII (Roche Diagnostics, Mannheim) e fracionadas pela eletroforese em gel. O fragmento de DNA de aprox. 1340 pares de base foi depois purificado a partir da agarose, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg). Este fragmento compreende a unidade de expressão Peftu fundido à ORF metA (= fragmento Peftu-metA).

Usando os iniciadores de oligonucleotídeo BK 1697 (SEQ ID NO: 50) e Hafl7 (SEQ ID NO: 51), o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), um fragmento de DNA (comprimento total: 193 pares de base, 173 destes sendo pSOD) da região não codificadora 5' (região da unidade de expressão) do gene SOD (Psod) amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão como descrito em Innis et ai. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. SEQ ID NO: 50 (BK 1697) GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG SEQ ID NO: 51 (Haf 17) GAGAACTAGTTAGGTTCCGCACCGAGC

O fragmento de DNA amplificado foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification de acordo com as informações do fabricante. Este foi subseqüentemente clivado pelas enzimas de restrição XhoI e BcuI (Roche Diagnostics, Mannheim) e fracionadas pela eletroforese em gel. O fragmento de DNA de aprox. 180 pares de base foi depois purificado a partir da agarose, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) (= fragmento Psod).

O plasmídeo (H344) pG A4 SEQ ID NO: 42 foi clivado pelas enzimas de restrição XhoI e SalI (Roche Diagnostics, Mannheim) e fracionadas pela eletroforese em gel. O vetor linearizado foi depois purificado a partir da agarose, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg).

O vetor linearizado foi ligado com os dois fragmentos (fragmento de Peftu-metA e fragmento de Psod) com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), na E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla5 USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico foi preparado pelos métodos e com materiais da Quiagen. As reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

O plasmídeo resultante, pClik5MCS PsodPeftu metA, é listado como SEQ ID NO: 52.

Exemplo 9:

Preparação do plasmídeo pClik5MCS Pgro Psod metA (H472) O DNA cromossômico ATCC 13032 da C. glutamicum foi preparado de acordo com Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179 ou Eikmanns et al., (1994) Microbiology 140: 1817-1828. Usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 53 (BK1701) e SEQ ID NO: 54 (Hafl 8), o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), um fragmento de DNA de aprox. 175 nucleotídeo foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão como descrito em Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. Este compreende 155 pares de base da região não codificadora 5' (região da unidade de expressão) do gene GRO EL (Pgro) e um sítio de clivagem de restrição em cada uma das extremidades 5' e 3' (XhoI e BcuI, respectivamente). SEQ ID NO: 53 (BK1701) GAGACTCGAGCGGCTTAAAGYTTGGCTGCC

SEQ ID NO: 54 (HafO 18)

GAGAACT AGT AI61IGTGTGTGCCGGTTGTG

O fragmento de DNA de aprox. 175 pares de base obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante. Este foi subseqüentemente clivado pelas enzimas de restrição XhoI e BcuI (Roche Diagnostics, Mannheim) e o fragmento de DNA foi purificado usando o GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification.

O plasmídeo H344 (SEQ ID NO: 42) foi cortado pelas enzimas de restrição XhoI e BcuI e um fragmento de aprox. 6,4 kb foi isolado, depois do fracionamento eletroforético, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification.

O produto da PCR e o plasmídeo H344 cortado-aberto foram ligados com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et ai. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), na E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico foi preparado pelos métodos e com materiais da Quiagen. As reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com Sanger et ai. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467.

As reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

O plasmídeo resultante compreende um promotor Pgro imediatamente seguido por uma unidade de expressão Psod e a ORF metA. Este está listado como pCLiK5MCS PgroPsod metA (H472) sob a SEQ ID NO: 55.

Exemplo 10:

Preparação do plasmídeo PgroPsod Pefts metA (HSOl)

Uma PCR usando os iniciadores de oligonucleotídeo BKl782 (SEQ ID NO: 56) e Haf63 (SEQ ID NO: 57) e o plasmídeo pClikSMCS Pgro Psod metA (SEQ ID NO: 55 (H472)) como padrão foi realizada pelos métodos padrão como descritos em Innis et ai. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. O fragmento amplificado compreende aprox. 474 pares de base e um cassete Pgro-Psod com um sítio de clivagem Acc65I na extremidade 3'. O fragmento de DNA obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante, este foi subseqüentemente clivado pelas enzimas de restrição XhoI e Acc65I e o fragmento de DNA (333 pares de base) foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification. SEQ ID NO: 56 (BK1782) TCGAGAGATTGGATTCTTAC SEQ ID NO: 57 (Hat 63)

TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATAT ACATC

O plasmídeo H479 (SEQ ID NO: 58) compreende a unidade de expressão Pefts fundido à ORF metA. Este foi cortado (diretamente a montante de Pefts) pelas enzimas de restrição XhoI e Acc65I e um fragmento de aprox. 6,4 kb foi isolado, depois do fracionamento eletroforético, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification.

Este foi depois ligado com o fragmento de PCR (cassete Pgro- Psod) com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics5 Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook etal. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), na E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam o plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico foi preparado pelos métodos e com materiais da Quiagen. As reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

O plasmídeo resultante compreende os 3 promotores, Pgro, Psod e P EF -Ts, fundidos à ORF metA.

Este está listado como pCLiK5MCS Pgro Psod Pefts metA (HSOl) sob a SEQ ID NO: 59.

Exemplo 11:

Preparação do plasmídeo Peftu Psod Pefts metA (HS02)

Uma PCR usando os iniciadores de oligonucleotídeo BKl 782 (SEQ ID NO: 56) e Haf63 (SEQ ID NO: 57) e o plasmídeo pClik5MCS Peftu Psod (SEQ ID NO: 45 (H473)) como padrão foi realizada pelos métodos padrão como descrito em Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. O fragmento amplificado compreende aprox. 495 pares de base e um cassete Peftu-Psod com um sítio de clivagem Acc65I na extremidade 3'. O fragmento de DNA obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante. Este foi subseqüentemente clivado pelas enzimas de restrição XhoI e Acc651 e o fragmento de DNA (354 pares de base) foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification. SEQ ID NO: 56 (BK1782) TCGAGAGATTGGATTCTTAC SEQ ID NO: 57(Haf63)

TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATAT ACATC

O plasmídeo H479 (SEQ ID NO: 58) compreende a unidade de expressão Pefts fundida à ORF metA. Este foi cortado (diretamente a montante de Pefts) pelas enzimas de restrição XhoI e Acc65I e um fragmento de aprox. 6,4 kb foi isolado, depois do fracionamento eletroforético, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification.

Este foi depois ligado com o fragmento de PCR (cassete Peftu- Psod) com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), na E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico foi preparado pelos métodos e com materiais da Quiagen. As reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

O plasmídeo resultante compreende as 3 seqüências reguladoras, Peftu, Psod e PEF -Ts, fundido à ORF metA. Este está listado como pCLiK5MCS Peftu Psod Pefts metA (HSOl) sob a SEQ ID NO: 60.

Exemplo 12:

Medição das atividades de metA

A cepa ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum foi transformada em cada caso com os plasmídeos pClik5 MCS, pClik MCS Psod metA, pClik MCS Peftu metA, pClikS MCS Pefts metA, pClikS MCS Peftu Psod metA, pClik5 MCS Psod Peftu metA, pClik5 MCS Pgro Psod meta, pClik5 MCS Pgro Psod Pefts metA, pClik5 MCS Peftu Psod Pefts metA de acordo com o método descrito (Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53: 299-303). A mistura de transformação foi plaqueada em placas CM que adicionalmente contiveram 20 mg/L de canamicina de modo a obter a seleção quanto as células contendo plasmídeo. Os clones resistentes à canamicina obtidos foram escolhidas e diluídos.

As cepas de C. glutamicum que compreendem qualquer uma das ditas construções de plasmídeo foram cultivadas em Meio MMA ((40 g/l de sacarose, 20 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de KH2PO4, 1 g/l de K2HPO4, 0,25 g/MgS04 χ 7H20, 54 g de Aces, 1 ml de CaCl2 (10 g/l), 1 ml de protocatecuato (300 mg/10 ml), 1 ml de solução de elemento traço (10 g/l de FeSO4 χ /H2O, 10 g/l de MnSO4 χ H2O, 2 g/l de ZnSO4 χ 7 H2O, 0,2 g/l de CuSO4, 0,02 g/l de NiCl2 χ 6 H2O), 100 μ^Ι de vitamina B12, 0,3 mg/l de tiamina, 1 mM de leucina, 1 mg/l de piridoxal HCl, 1 ml de biotina (100 mg/l), pH 7,0) a 30° C durante a noite. As células foram removidas pela centrifugação a 4o C e lavada duas vezes com tampão de Tris-HCl fria (0,1 %, pH 8,0). Depois de outra centrifugação, as células foram absorvidas em tampão de Tris-HCl frio (0,1 %, pH 8,0) e a ODóOO foi ajustada a 160. As células foram rompidas pela transferência de 1 ml desta suspensão de célula a 2 ml de tubos Hybaid Ribolyser e lisados três vezes em cada caso por 30 s em um Hybaid Ribolyser, com rotação ajustada a 6,0. O lisado foi clarificado pela centrifugação em uma centrífuga Eppendorf a 15 000 rpm e 4o C por 30 minutos e o sobrenadante foi transferido a um novo copo de Eppendorf. O teor de proteína foi determinado de acordo com Bradford, Μ. M. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254.

A atividade enzimática de MetA foi realizada como segue. As misturas de reação de 1 ml contiveram 100 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 7,5), 5 mM de MgCl2, 100 μΜ de acetilCoA, 5 mM de L- homosserina, 500 μΜ de DTNB (Reagente de Ellman) e extrato celular. O ensaio foi iniciado pela adição do lisado de proteína relevante e incubados na temperatura ambiente. As cinéticas foram depois registradas a 412 nm por 10 min.

Os resultados estão representados na Tabela la.

Tabela Ia

<table>table see original document page 104</column></row><table>

Foi possível modular a atividade de MetA usando-se as várias combinações de promotores/unidades de expressão.

Exemplo 13:

Construção do plasmídeo pCIS IysC

De modo a gerar uma cepa que produz lisina, uma substituição alélica do gene tipo selvagem IysC foi realizada na Corynebacterium glutamicum ATCC13032. Isto envolveu uma substituição de nucleotídeo no gene IysC de modo que o aminoácido Thr na posição 311 foi substituído por um Ile na proteína resultante. Partindo do DNA cromossômico de ATCC13032 como padrão para uma reação de PCR, IysC foi amplificado com a ajuda do PfuTurbo PCR Systems (Stratagene USA) usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 62, de acordo com as informações do fabricante. SEQ ID NO: 61

5' -GAGAGAGAGACGCGTCCC AGTGGCTGAGACGC ATC —3' SEQ ID NO: 62

5'-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3'

O DNA cromossômico ATCC 13032 da C. glutamicum foi preparado de acordo com Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179 ou Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828. O fragmento amplificado é flanqueado por um corte de restrição SalI na sua extremidade 5' e por um corte de restrição MluI na sua extremidade 3'. Antes da clonagem, o fragmento amplificado foi digerido por estas duas enzimas de restrição e purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg).

O polinucleotídeo obtido foi clonado por intermédio dos cortes de restrição SalI e MluI em pCLIK5 MCS integrativo SacB, aludido como pCIS mais abaixo (SEQ ID NO: 63) e transformado no E. coli XL-I blue. A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190). O plasmídeo foi isolado e a seqüência de nucleotídeo esperada foi confirmada pelo seqüenciamento. O DNA plasmídico foi preparado pelos métodos e com materiais da Quiagen. As reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As Reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt). O plasmídeo obtido, pCIS IysC, é listado como a SEQ ID NO: 64.

Exemplo 14:

Mutagênese do gene IysC da C. glutamicum

A mutagênese direcionada do gene LysC da C. glutamicum foi realizada usando o Kit Quick-Change (Stratagene/USA) de acordo com as informações do fabricante. A mutagênese foi realizada no plasmídeo pCIS IysC, SEQ ID NO: 64,. Para substituir thr 311 com 311 ile com a ajuda do método Quick-Change (Stratagene), os seguintes iniciadores de oligonucleotídeo foram sintetizados: SEQ ID NO: 65

5'-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG -3' SEQ ID NO: 66

5'-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG -3'

O uso destes iniciadores de oligonucleotídeo na reação Quick- Change resulta em uma substituição do nucleotídeo na posição 932 (de CaT) no gene IysC da SEQ ID NO: 67. A substituição de aminoácido resultante, Thr3Ile, no gene LysC foi confirmado por um reação de seqüenciamento, depois da transformação na E. coli XLl-blue e preparação de plasmídeo. O plasmídeo foi denotado pCIS IysC thr311 ile e é listada como SEQ ID NO: 68.

O plasmídeo pCIS IysC thr311 ile foi transformada na C. glutamicum ATCC13032 por meio da eletroporação como descrito em Liebi, et ai. (1989) FEMS Microbiology Letters 53: 299-303. As modificações do protocolo estão descritas na DE 10046870. O arranjo cromossômico do local IysC de transformantes individuais foi checado pelos métodos padrão através da Southern blot e hibridização, como descrito em Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor. Isto garantiu que os transformantes integraram o plasmídeo transformado no local IysC por intermédio da recombinação homóloga. Depois de cultivar tais colônias em meio que não contém nenhum antibiótico durante a noite, as células são plaqueadas em um meio de sacarose CM-ágar (10 % de sacarose, 10 g/l de glicose; 2,5 g/l de NaCl; 2 g/l de uréia, 10 g/l de Bacto Peptona (Difco); 10 g/l de extrato de levedura, 22,0 g/L de ágar (Difco)) e incubadas a 30° C por 24 horas.

Visto que o gene sacB presente no vetor pCIS LysC thr311 ile converte a sacarose em um produto tóxico, apenas aquelas colônias podem crescer em que o gene sacB foi deletado por uma segunda etapa de recombinação homóloga entre o gene IysC do tipo selvagem e o gene IysC thr31 Iile mutado. É possível, durante a recombinação homóloga, para o gene do tipo selvagem ou o gene mutado ser deletado junto com o gene sacB. Se o gene sacB é removido junto com o gene do tipo selvagem, o resultado é um transformante mutado.

As colônias que se desenvolvem são escolhidas e testadas quanto a um fenótipo sensível à canamicina. Os clones com o gene sacB deletado, ao mesmo tempo, devem demonstrar comportamento de crescimento sensível à canamicina. Tais clones sensíveis à canamicina foram testados em um frasco agitador quanto à sua produtividade de lisina (ver o Exemplo 19). A C. glutamicum ATCC13032 não tratada foi cultivada por comparação. Os clones tendo produção de lisina aumentada, comparados com o controle, foram selecionados, o DNA cromossômico foi recuperado e a região correspondente do gene IysC foi amplificada por uma reação de PCR e seqüenciada. Um clone deste tipo, que tem a propriedade de síntese de lisina aumentada e uma mutação detectada em IysC na posição 932, foi denotado ATCC13032 IysC'br.

Exemplo 15:

Preparação do plasmídeo pCIS Peftu ddh

O DNA cromossômico ATCC 13032 da C. glutamicum foi preparado de acordo com Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179 ou Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828. Usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 69 (01d38) e SEQ ID NO: 70 (Old 39), o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), um fragmento de DNA de aprox. 200 pares de base da região não codificadora 5' (região da unidade de expressão) do gene EFTu (Peftu) foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão como descrito em Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and

Applications, Academic Press.

SEQ ID NO: 69 (01d38)

ACATCCATGGTGGCCGTTACCCTGCGAAT

SEQ ID NO: 70 (Old 39)

TGTATGTCCTCCTGGACTTC

O fragmento de DNA de aprox. 200 pares de base obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante.

Em uma segunda PCR, usando os iniciadores de oligonucleotídeo 01d40 (SEQ ID NO: 71) e SEQ ID NO: 72 (Old 37) e o DNA cromossômico ATCC 13032 da C. glutamicum como padrão, a matriz de leitura aberta ddh foi amplificada pelos métodos padrão como descrito em Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. O fragmento de aprox. 1017 pares de base obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante.

01d40 (SEQ ID NO: 71)

GAAGTCCAGGAGGACATACAATGACCAACATCCGCGTAGC Old 37 (SEQ ID NO: 72) GAAACCACACTG' I CCTTGC

Os dois fragmentos obtidos acima foram usados juntos como padrão em uma outra reação de PCR. No curso da reação de PCR, as seqüências homólogas a Peftu introduzidas com o iniciador de oligonucleotídeo 01d40 SEQ ID NO: 71 faz com que os dois fragmentos se liguem entre si e sejam prolongados pela polimerase usada para dar uma cepa de DNA contínua. O método padrão foi modificado em que os iniciadores de oligonucleotídeo usados, 01d37 e Old 38 (SEQ ID NO: 72 e SEQ ID NO: 69), foram apenas adicionados à mistura de reação no início do 2o ciclo.

O fragmento de DNA amplificado de aproximadamente 1207 pares de base foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification de acordo com as informações do fabricante. Este foi subseqüentemente clivado pelas enzimas de restrição NcoI e XholI (Roche Diagnostics, Mannheim) e fracionadas pela eletroforese em gel. O fragmento de DNA de aprox. 1174 pares de base foi depois purificado a partir da agarose, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg). Este fragmento compreende a unidade de expressão Peftu fundido à ORF ddh (= fragmento Peftu-ddh).

Usando os iniciadores de oligonucleotídeo Old 32 (SEQ ID NO: 73) e Old 33 (SEQ ID NO: 74), o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), um fragmento de DNA da região não codificadora 5' do gene ddh foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão como descrito em Innis et ai. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press.

SEQ ID 73 (01d32)

ATCAACGCGTCGACACCACATCATCAATCAC SEQ ID 74 (01d33)

ATCACCATGGGTTCTTGTAATCCTCCAAAATTG

O fragmento de DNA amplificado foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification de acordo com as informações do fabricante. Este foi subseqüentemente clivado pelas enzimas de restrição MluI e NcoI (Roche Diagnostics, Mannheim) e fracionadas pela eletroforese em gel. O fragmento de DNA de aprox. 720 pares de base foi depois purificado a partir da agarose, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) (= fragmento 5' ddh). O plasmídeo pCIS (SEQ ID NO: 63) foi clivado pelas enzimas de restrição MluI e XhoI (Roche Diagnostics, Mannheim) e fracionadas pela eletroforese em gel. O vetor linearizado foi depois purificado a partir da agarose, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg),

O vetor linearizado foi ligado com os dois fragmentos (fragmento Peftu-ddh e fragmento 5' ddh) com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), na E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico foi preparado pelos métodos e com materiais da Quiagen. As reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

O plasmídeo resultante, pCIS Peftu ddh, está listado como a SEQ ID NO: 75.

Exemplo 16:

Preparação de pCIS PeftuPsod ddh

O DNA cromossômico ATCC 13032 da C. glutamicum foi preparado de acordo com Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179 ou Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828. Usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 76 e SEQ ID NO: 77, o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), um fragmento de DNA de aprox. 677 pares de base da região 5' do gene ddh foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) pelos métodos padrão tais como Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (fragmento 5' ddh). SEQ ID NO: 76 (CK461) CCTGACGTCGCAATATAGGCAGCTGAATC SEQ ID NO : 77 (CK466) GCCCAATTGGTTCTTGTAATCCTCCAAAA

O fragmento de DNA obtido foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante. Este foi subseqüentemente clivado pelas enzimas de restrição AatlI e MunI (Roche Diagnostics, Mannheim) e fracionadas pela eletroforese em gel. O fragmento de DNA de aprox. 661 pares de base foi depois purificado a partir da agarose, usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg). O fragmento resultante compreende a região 5' da ORF ddh.

Partindo do plasmídeo P EF-Tu pSOD metA (H473) (SEQ ID 45) como padrão para uma reação de PCR, um cassete PeftuPsod foi amplificado usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 78 e SEQ ID NO: 79.

SEQ ID NO: 78 (CK426) CGCCAATTGTCGAGGGCCGTT ACCCT SEQ ID NO: 79 (CK463)

GCTACGCGGATGTTGGTCATGGGTAAAAAATCCTTTCGTA

O fragmento de DNA obtido de aproximadamente 378 pares de base foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification de acordo com as informações do fabricante.

A ORF ddh foi amplificado em uma PCR subseqüente. Para este propósito, o DNA cromossômico ATCC 13032 da C. glutamicum foi preparado de acordo com Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179 ou Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828. Usando os iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 80 (CK464) e SEQ ID NO: 81 (CK467), o DNA cromossômico como padrão e Pfu Turbo polimerase (Stratagene), um fragmento de DNA de aprox. 992 pares de base (ORF ddh) foi amplificado com a ajuda da reação da cadeia da polimerase (PCR) de acordo com os métodos padrão tais como Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. O fragmento de DNA amplificado foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification de acordo com as informações do fabricante. SEQ ID NO: 80 (CK464)

TACGAAAGGATTTTTTACCCATGACCAACATCCGCGTAGC SEQ ID NO: 81 (CK467) AGACCCGGGTTAGACGTCGCGTGCGATCA

Os dois fragmentos obtidos acima (cassete PeftuPsod e ORF ddh) foram usados junto como padrão em uma outra reação de PCR no curso da reação de PCR, as seqüências homólogas de Psod introduzidas com o iniciador de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 80 (CK464) faz com que os dois fragmentos se liguem entre si e sejam prolongados pela polimerase usada para dar uma cepa de DNA contínua. O método padrão foi modificado em que os iniciadores de oligonucleotídeo usados, SEQ ID NO: 79 (CK426) e SEQ ID NO: 81 (CK467), foram apenas adicionados à mistura de reação no início do 2º ciclo.

O fragmento de DNA amplificado de aproximadamente 1359 pares de base foi purificado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification de acordo com as informações do fabricante.

Este foi subseqüentemente clivado pelas enzimas de restrição MunI e SmaI (Roche Diagnostics, Mannheim) e fracionadas pela eletroforese em gel. O fragmento de DNA de aprox. 1359 pares de base foi depois purificado a partir da agarose, usando o Kit GFX® PCR3 DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg).

O fragmento resultante compreende (de 5' a 3') um promotor Peftu, uma unidade de expressão Psod e, imediatamente a jusante desta, a matriz de leitura aberta ddh (PeftuPsod ddh).

O vetor pCIS foi cortado pelas endonucleases de restrição AatII e SmaI e desfosforilado pela fosfatase alcalina (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante. Depois eletroforese em um gel de agarose a 0,8 % de concentração, o vetor linearizado (aprox. 4,2 kb) foi isolado usando o Kit GFX® PCR, DNA and Gel Band Purification (Amersham Pharmacia, Freiburg) de acordo com as informações do fabricante. Este fragmento de vetor foi ligado com os dois fragmentos de POR cortado (5'ddh e PeftuPsod ddh) com a ajuda do Kit de Ligação de DNA Rápida (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as informações do fabricante e a mistura de ligação foi transformada pelos métodos padrão como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), na E. coli competente XL-I Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A seleção quanto às células que abrigam plasmídeo foi obtida plaqueando-se em LB ágar contendo canamicina (20 μί*/πι1) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190).

O DNA plasmídico de clones individuais foi isolado usando o Kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as informações do fabricante e checado por intermédio de digestões de restrição.

Dois plasmídeos corretos foram seqüenciados. As reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. As reações de seqüenciamento foram fracionadas e avaliadas por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt). O plasmídeo resultante, pClik Peftu Psod ddh, é adequado para integrar o cassete PeftuPsod cromossomicamente a montante da ORF ddh com a ajuda de dois eventos de recombinação sucessivo.

O plasmídeo pCIS PeftuPsod ddh está listado como SEQ ID NO: 82.

Exemplo 17:

Geração das cepas ATCC13 032 IysCfbr Peftu ddh e ATCC13032 IysCfbr PeftuPsod ddh

As células da cepa de E. coli Mn522 (Stratagene, Amsterdam, Países Baixos) foram transformadas com cada um dos plasmídeos pCIS Peftu ddh e pCIS PeftuPsod ddh e com o plasmídeo pTc 15AcgIM de acordo com Liebl5 et ai. (1989) FEMS Microbiology Letters 53: 299-303. O plasmídeo pTc 15AcgIM possibilita que o DNA seja metilado de acordo com o padrão de metilação da Corynebacterium glutamicum (DE 10046870). Esta metilação aumenta a estabilidade dos plasmídeos pCIS Peftu ddh e pCIS PeftuPsod ddh nas células C. glutamicum. O DNA plasmídico foi subseqüentemente isolado das células Mn522 pelos métodos padrão e introduzidos com a ajuda da eletroporação na cepa ATCC 13032 ask (fbr) de Corynebacterium glutamicum descrita acima. A dita eletroporação e a seleção subseqüente em placas CM contendo canamicina (25 μ§/πι1) produziu uma pluralidade de transconj ugantes. De modo a selecionar quanto ao segundo evento de recombinação que deve excisar o vetor, os ditos transconjugantes foram cultivados em meio CM sem canamicina durante a noite e subseqüentemente plaqueados em placas CM contendo 10 % de sacarose para seleção. O gene sacB presente no vetor pCIS codifica a enzima levan sacarose e, com cultivo em sacarose, leva à síntese de levan. Visto que o levan é tóxico para a C. glutamicum, apenas as células de C. glutamicum que perderam o plasmídeo de integração devido à segunda etapa de recombinação crescem em meio contendo sacarose (Jager et ai., Journal of Bacteriology 174 (1992) 5462- 5466). 100 clones resistentes à sacarose foram checados quanto a sua sensibilidade à canamicina. Em uma pluralidade dos clones testados, uma sensibilidade à canamicina foi também detectada, além da resistência à sacarose, que é esperada com a excisão desejada das seqüências de vetor. A reação da cadeia da polimerase (PCR) foi usada de modo a checar se a integração desejada da unidade de expressão Peftu ou PeftuPsod também ocorreu. Para esta finalidade, os clones particulares foram removidos da placa de ágar usando um palito de dente e colocados em suspensão em 100 μΐ de H2O e fervidos a 95° C por 10 min. 10 μΐ da solução obtida foram em cada caso usados como padrão na PCR. Os iniciadores usados foram oligonucleotídeos que são homólogos à unidade de expressão a ser introduzida e ao gene ddh. As condições de PCR foram escolhidas como segue: desnaturação inicial: 5 min a 95° C; desnaturação: 30 s a 95° C; hibridização: 30 s a 55° C; amplificação: 2 min a 72° C; 30 ciclos: extensão final: 5 min a 72° C. Na mistura de reação contendo o DNA da cepa de partida, a escolha de oligonucleotídeos não produzem qualquer produto de PCR. Uma faixa foi esperada apenas para clones em que as unidades de expressão Peftu ou PeftuPsod foram integradas imediatamente 5' do gene ddh como um resultado da 2a recombinação. A integração bem sucedida pelos clones testados positivos aqui foi além disso também confirmado através da análise de Southern blot (pelos métodos padrão como descrito, por exemplo, em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)). 2 hidrólises diferentes com enzimas de restrição foram realizadas aqui para cada cepa a ser gerada, que hidrolisa permitiriam que a cepa de partida (ATCC13032 ask (fbr)) e a cepa desejada sejam distinguidas de nomo não ambíguo. O fato de que as cepas obtidas não têm quaisquer genes da canamicina no cromossoma foi além disso confirmado com a ajuda de uma sonda que é homóloga ao gene de resistência à canamicina.

Assim as seguintes cepas foram geradas: ATCC13032 IysCfbr Peftu ddh

ATCC13 032 IysCfbr PeftuPsod ddh

Todas estas cepas compreendem um gene ask desregulado na retroalimentação e portanto produzem lisina. Estas diferem entre si apenas pelas unidades reguladoras que controlam a transcrição do gene ddh.

Exemplo 18:

Efeito do realce de ddh por um promotor duplo sobre a produção de lisina

De modo a estudar o efeito do realce do gene ddh com a ajuda de um promotor duplo, as seguintes cepas foram testadas quanto a produção de lisina:

ATCC13032 IysCfbr

ATCC13032 IysCfbr Peftu ddh

ATCC13032 IysCfbr Peftu Psod ddh

Para este propósito, as cepas foram cultivadas em placas CM (10,0 g/L de D-glicose, 2,5 g/L de NaCl, 2,0 g/L de uréia, 10,0 g/L de Bacto Peptona (Difco), 5,0 g/L de Extrato de Levedura (Difco), 5,0 g/L de Extrato de Carne de Boi (Difco), 22,0 g/L de Agar (Difco), autoclavado (20 min, 121° C)) a 30° C por 3 dias. As células foram depois retiradas por raspagem da placa e recolocadas em suspensão em solução salina. Para a cultura principal, 10 ml de meio I e 0,5 g de CaCO3 autoclavado (Riedel de Haen) foram inoculados com a suspensão de célula a uma 0D600 de 1,5 em um frasco Erlenmeyer de 100 ml e incubados em um Infors AJl 18 (Infors, Bottmingen, Suíça) a 220 rpm por 40 horas. Isto foi seguido pela determinação da concentração da lisina secretada no meio.

Meio I:

40 g/l Sacarose

60 g/l Melaços (com base em 100 % de teor de açúcar)

10 g/l (NH4)2SO4 0,4 g/l MgS04*7H20

0,6 g/l KH2PO4

,3 mg/l Tiamina*HCl

1 mg/l Biotina (a partir de uma solução de estoque de 1 mg/ml que foram esterilizadas pela filtração e ajustadas ao pH 8,0 com

NH4OH)

2 mg/l FeSO4

2 mg/l MnSO4

ajustado ao pH 7,8 com NH4OH, autoclavado (121° C, 20min).

Adicionalmente, vitamina B12 (hidroxicobalamina, Sigma Chemicals) é adicionada a partir de uma solução de estoque (200 μg/ml, esterilizados por filtração) a uma concentração final de 100 μg/l.

A concentração de aminoácido foi determinada por meio da cromatografia líquida de alta pressão de acordo com a Agilent em um HPLC Agilent 1100 Série LC System. Uma derivatização de coluna de proteção com orto-ftalaldeído possibilita a quantificação dos aminoácidos formados e a mistura de aminoácido é fracionada em uma coluna Hypersil AA (Agilent).

O resultado do estudo está representado na tabela abaixo.

<table>table see original document page 117</column></row><table> LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> BASF AG

<120> Promotores Múltiplos <130> M/45256 <160> 84

<170> PatentIn versão 3.1

<210> 1 <211> 177 <212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> misc_feature <223> pGRO

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(177)

<223> seqüência promotora se nenhum outro promotor a jusante ocorre <220>

<221> misc_feature <222> (1) .. (155)

<223> seqüência promotora se um outro promotor está ligado a jusante <220>

<221> misc_feature

<222> (70)..(75)

<223> região -10 putativa

<220>

<221> misc_feature <222> (165)..(172)

<223> seqüência de ligação de ribossoma putativa <400> 1

cggcttaaag tttggctgcc atgtgaattt ttagcaccct caacagttga gtgctggcac 60

tctcgggggt agagtgccaa ataggttgtt tgacacacag ttgttcaccc gcgacgacgg 120

ctgtgctgga aacccacaac cggcacacac aaaatttttc tcatggaggg attcatc 177

<210> 2 <211> 195 <212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> misc_feature <223> pEFTS

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(195)

<223> seqüência promotora se nenhum outro promotor a jusante ocorre <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(178)

<223> seqüência promotora se um outro promotor está ligado a jusante <220>

<221> misc_feature <222> (147)..(152) <223> região -10 putativa

<220>

<221> misc_feature <222> (162)..(167) <223> região -10 putativa

<220>

<221> misc_feature <222> (179)..(185)

<223> seqüência de ligação de ribossoma putativa <400> 2

cccccacgac aatggaactt tgacttttaa aatttcatcg ccgtgggggc tttttgggca 60

gccagcccgc cgtgtcgcaa cgtaatcgac tgaatacctg tacgatcact ttttagacgg 120 gcgggtaggg ctactgtgcc ctaacctaag cttgtaaagc attaattatc catacataag 180 gaggatcgcc ccgta 195

<210> 3 <211> 199 <212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> misc_feature <223> pEFTU

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(199)

<223> seqüência promotora se nenhum outro promotor a jusante ocorre <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(176)

<223> seqüência promotora se um outro promotor está ligado a jusante <220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(41)

<223> região -10 putativa

<220>

<221> misc_feature

<222> (63)..(68)

<223> região -10 putativa

<220>

<221> misc_feature <222> (92) .. (97) <223> região -10 putativa <220>

<221> misc_feature <222> (187)..(193)

<223> seqüência de ligação de ribossoma putativa <400> 3

ggccgttacc ctgcgaatgt ccacagggta gctggtagtt tgaaaatcaa cgccgttgcc 60

cttaggattc agtaactggc acattttgta atgcgctaga tctgtgtgct cagtcttcca 120

ggctgcttat cacagtgaaa gcaaaaccaa ttcgtggctg cgaaagtcgt agccaccacg 180

aagtccagga ggacataca 199

<210> 4 <211> 191 <212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> misc_feature <223> pSOD

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(191)

<223> seqüência promotora se nenhum outro promotor a jusante ocorre <220>

<221> misc_feature <222> (1) . . (173)

<223> seqüência promotora se um outro promotor está ligado a jusante <220>

<221> misc_feature

<222> (65)..(70)

<223> região -10 putativa

<220>

<221> misc_feature

<222> (86)..(92)

<223> região -10 putativa

<220>

<221> misc_feature <222> (175)..(181)

<223> seqüência de ligação de ribossoma putativa <400> 4

(copiar a seqüência da página 6 da listagem de seqüência) agctgccaat tattccgggc ttgtgacccg ctacccgata aataggtcgg ctgaaaaatt 60

tcgttgcaat atcaacaaaa aggcctatca ttgggaggtg tcgcaccaag tacttttgcg 120 aagcgccatc tgacggattt tcaaaagatg tatatgctcg gtgcggaaac ctacgaaagg 180 attttttacc c 191

<210> 5 <211> 52 <2,12> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador <400> 5

cccgggatcc gctagcggcg cgccggccgg cccggtgtga aataccgcac ag 52

<210> 6 <211> 53 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 6

tctagactcg agcggccgcg gccggccttt aaattgaaga cgaaagggcc tcg 53

<210> 7 <211> 47 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 7

gagatctaga cccggggatc cgctagcggg ctgctaaagg aagcgga 47

<210> 8 <211> 38 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 8

gagaggcgcg ccgctagcgt gggcgaagaa ctccagca 38

<210> 9 <211> 34 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 9

gagagggcgg ccgcgcaaag tcccgcttcg tgaa 34

<210> 10 <211> 34 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <4 00> 10

gagagggcgg ccgctcaagt cggtcaagcc acgc 34

<210> 11 <211> 140 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Oligonucleotideo <4 00> 11

tcgaatttaa atctcgagag gcctgacgtc gggcccggta ccacgcgtca tatgactagt 60

tcggacctag ggatatcgtc gacatcgatg ctcttctgcg ttaattaaca attgggatcc 120

tctagacccg ggatttaaat 140

<210> 12 <211> 140 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Oligonucleotideo <4 00> 12

gatcatttaa atcccgggtc tagaggatcc caattgttaa ttaacgcaga agagcatcga 60

tgtcgacgat atccctaggt ccgaactagt catatgacgc gtggtaccgg gcccgacgtc 120

aggcctctcg agatttaaat 140

<210> 13 <211> 4323 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo <220>

<221> misc_feature <223> Plasmideo pCLiK5MCS

<220>

<221> misc_feature <222> (457) .. (1248) <223> KanR

<220>

<221> misc_feature <222> (3840)..(4302) <223> PsacB (complementar)

<220> <221> misc_feature <222> (2418)..(3839) <223> SacB (complementar)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1515) .. (2375)

<223> Ori-Ec (ρΜΒ) (complementar)

<4 00> 13

tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60 tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120 tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 180 cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 240 gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt 300 ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 360 ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 420 agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 480 gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 540 atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 600 gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 660 tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 720 agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 780 cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 840 gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 900 gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 960 gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 1020 ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 1080 tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 1140 gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 1200 cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc 1260 tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca 1320 ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 1380 tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca cgctagcggc gcgccggccg 1440 gcccggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 1500 gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 1560 cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 7 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 1620 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 1680 cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 1740 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 1800 cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 1860 gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 1920 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 1980 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 2040 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 2100 tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 2160 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 2220 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 2280 ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 2340 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg ccgccatcgg 2400 cattttcttt tgcgttttta tttgttaact gttaattgtc cttgttcaag gatgctgtct 2460 ttgacaacag atgttttctt gcctttgatg ttcagcagga agctcggcgc aaacgttgat 2520 tgtttgtctg cgtagaatcc tctgtttgtc atatagcttg taatcacgac attgtttcct 2580 ttcgcttgag gtacagcgaa gtgtgagtaa gtaaaggtta catcgttagg atcaagatcc 2640 atttttaaca caaggccagt tttgttcagc ggcttgtatg ggccagttaa agaattagaa 2700 acataaccaa gcatgtaaat atcgttagac gtaatgccgt caatcgtcat ttttgatccg 2760 cgggagtcag tgaacaggta ccatttgccg ttcattttaa agacgttcgc gcgttcaatt 2820 tcatctgtta ctgtgttaga tgcaatcagc ggtttcatca cttttttcag tgtgtaatca 2880 tcgtttagct caatcatacc gagagcgccg tttgctaact cagccgtgcg ttttttatcg 2940 ctttgcagaa gtttttgact ttcttgacgg aagaatgatg tgcttttgcc atagtatgct 3000 ttgttaaata aagattcttc gccttggtag ccatcttcag ttccagtgtt tgcttcaaat 3060 actaagtatt tgtggccttt atcttctacg tagtgaggat ctctcagcgt atggttgtcg 3120 cctgagctgt agttgccttc atcgatgaac tgctgtacat tttgatacgt ttttccgtca 3180 ccgtcaaaga ttgatttata atcctctaca ccgttgatgt tcaaagagct gtctgatgct 3240 gatacgttaa cttgtgcagt tgtcagtgtt tgtttgccgt aatgtttacc ggagaaatca 3300 gtgtagaata aacggatttt tccgtcagat gtaaatgtgg ctgaacctga ccattcttgt 3360 gtttggtctt ttaggataga atcatttgca tcgaatttgt cgctgtcttt aaagacgcgg 3420 ccagcgtttt tccagctgtc aatagaagtt tcgccgactt tttgatagaa catgtaaatc 3480 gatgtgtcat ccgcattttt aggatctccg gctaatgcaa agacgatgtg gtagccgtga 3540

tagtttgcga cagtgccgtc agcgttttgt aatggccagc tgtcccaaac gtccaggcct 3600

tttgcagaag agatattttt aattgtggac gaatcaaatt cagaaacttg atatttttca 3660

tttttttgct gttcagggat ttgcagcata tcatggcgtg taatatggga aatgccgtat 3720

gtttccttat atggcttttg gttcgtttct ttcgcaaacg cttgagttgc gcctcctgcc 3780

agcagtgcgg tagtaaaggt taatactgtt gcttgttttg caaacttttt gatgttcatc 3840

gttcatgtct ccttttttat gtactgtgtt agcggtctgc ttcttccagc cctcctgttt 3900

gaagatggca agttagttac gcacaataaa aaaagaccta aaatatgtaa ggggtgacgc 3960

caaagtatac actttgccct ttacacattt taggtcttgc ctgctttatc agtaacaaac 4020

ccgcgcgatt tacttttcga cctcattcta ttagactctc gtttggattg caactggtct 4080

attttcctct tttgtttgat agaaaatcat aaaaggattt gcagactacg ggcctaaaga 4140

actaaaaaat ctatctgttt cttttcattc tctgtatttt ttatagtttc tgttgcatgg 4200

gcataaagtt gcctttttaa tcacaattca gaaaatatca taatatctca tttcactaaa 4260

taatagtgaa cggcaggtat atgtgatggg ttaaaaagga tcggcggccg ctcgatttaa 4320

ate 4323

<210> 14 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <4 00> 14

gcgcggtacc tagactcacc ccagtgct 28

<210> 15 <211> 30 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <4 00> 15

ctctactagt ttagatgtag aactcgatgt 30

<210> 16 <211> 6349 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo <220>

<221> misc_feature

<223> pCLik5MCS PmetA metA

<220>

<221> misc_feature <222> (1727) .. (2518) <223> KanR

<220>

<221> misc_feature <222> (4799)..(5920) <223> Proteína Rep

<220>

<221> misc_feature

<222> (3791)..(4465)

<223> Ori-Ec (1113) (complementar)

<220>

<221> misc_feature <222> (2785)..(3645) <223> Orfl

<220>

<221> misc_feature <222> (42)..(177) <223> PmetA

<220>

<221> misc_feature <222> (178)..(1311) <223> metA <4 00> 16

tcgatttaaa tctcgagagg cctgacgtcg ggcccggtac ctagactcac cccagtgctt 60

aaagcgctgg gtttttcttt ttcagactcg tgagaatgca aactagacta gacagagctg 120

tccatataca ctggacgaag ttttagtctt gtccacccag aacaggcggt tattttcatg 180

cccaccctcg cgccttcagg tcaacttgaa atccaagcga tcggtgatgt ctccaccgaa 240

gccggagcaa tcattacaaa cgctgaaatc gcctatcacc gctggggtga ataccgcgta 300

gataaagaag gacgcagcaa tgtcgttctc atcgaacacg ccctcactgg agattccaac 360

gcagccgatt ggtgggctga cttgctcggt cccggcaaag ccatcaacac tgatatttac 420

tgcgtgatct gtaccaacgt catcggtggt tgcaacggtt ccaccggacc tggctccatg 480

catccagatg gaaatttctg gggtaatcgc ttccccgcca cgtccattcg tgatcaggta 540

aacgccgaaa aacaattcct cgacgcactc ggcatcacca cggtcgccgc agtacttggt 600

ggttccatgg gtggtgcccg caccctagag tgggccgcaa tgtacccaga aactgttggc 660

gcagctgctg ttcttgcagt ttctgcacgc gccagcgcct ggcaaatcgg cattcaatcc 720

gcccaaatta aggcgattga aaacgaccac cactggcacg aaggcaacta ctacgaatcc 780

ggctgcaacc cagccaccgg actcggcgcc gcccgacgca tcgcccacct cacctaccgt

840 ggcgaactag aaatcgacga acgcttcggc accaaagccc aaaagaacga aaacccactc 900

ggtccctacc gcaagcccga ccagcgcttc gccgtggaat cctacttgga ctaccaagca 960

gacaagctag tacagcgttt cgacgccggc tcctacgtct tgctcaccga cgccctcaac 1020

cgccacgaca ttggtcgcga ccgcggaggc ctcaacaagg cactcgaatc catcaaagtt 1080

ccagtccttg tcgcaggcgt agataccgat attttgtacc cctaccacca gcaagaacac 1140

ctctccagaa acctgggaaa tctactggca atggcaaaaa tcgtatcccc tgtcggccac 1200

gatgctttcc tcaccgaaag ccgccaaatg gatcgcatcg tgaggaactt cttcagcctc 1260

atctccccag acgaagacaa cccttcgacc tacatcgagt tctacatcta aactagttcg 1320

gacctaggga tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct 1380

agacccggga tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag 1440

tccgcagaaa cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga 1500

aaasgcaagc gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga 1560

ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa 1620

ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg 1680

caggggatca agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga 1740

tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc 1800

acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc 1860

ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc 1920

gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac 1980

tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc 2040

tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 2100

gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg 2160

tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct 2220

cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt 2280

cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg 2340

attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 2400

ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 2460

tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg 2520

agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat 2580

ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc 2640

ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca cgctagcggc 2700

gcgccggccg gcccggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 27 60 gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 2820 ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 2880 aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 2940 ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 3000 gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 3060 cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 3120 gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 3180 tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 3240 cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 3300 cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 3360 gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 3420 agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 3480 cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 3540 tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 3600 tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg 3660 ccgcgcaaag tcccgcttcg tgaaaatttt cgtgccgcgt gattttccgc caaaaacttt 3720 aacgaacgtt cgttataatg gtgtcatgac cttcacgacg aagtactaaa attggcccga 3780 atcatcagct atggatctct ctgatgtcgc gctggagtcc gacgcgctcg atgctgccgt 3840 cgatttaaaa acggtgatcg gatttttccg agctctcgat acgacggacg cgccagcatc 3900 acgagactgg gccagtgccg cgagcgacct agaaactctc gtggcggatc ttgaggagct 3960 ggctgacgag ctgcgtgctc ggccagcgcc aggaggacgc acagtagtgg aggatgcaat 4020 cagttgcgcc tactgcggtg gcctgattcc tccccggcct gacccgcgag gacggcgcgc 4080 aaaatattgc tcagatgcgt gtcgtgccgc agccagccgc gagcgcgcca acaaacgcca 4140 cgccgaggag ctggaggcgg ctaggtcgca aatggcgctg gaagtgcgtc ccccgagcga 4200 aattttggcc atggtcgtca cagagctgga agcggcagcg agaattatcg cgatcgtggc 4260 ggtgcccgca ggcatgacaa acatcgtaaa tgccgcgttt cgtgtgccgt ggccgcccag 4320 gacgtgtcag cgccgccacc acctgcaccg aatcggcagc agcgtcgcgc gtcgaaaaag 4380 cgcacaggcg gcaagaagcg ataagctgca cgaatacctg aaaaatgttg aacgccccgt 4440 gagcggtaac tcacagggcg tcggctaacc cccagtccaa acctgggaga aagcgctcaa 4500 aaatgactct agcggattca cgagacattg acacaccggc ctggaaattt tccgctgatc 4560 tgttcgacac ccatcccgag ctcgcgctgc gatcacgtgg ctggacgagc gaagaccgcc 4620 gcgaattcct cgctcacctg ggcagagaaa 12 atttccaggg eagcaagacc cgcgacttcg 4680 ccagcgcttg gatcaaagac ccggacacgg agaaacacag ccgaagttat accgagttgg 4740 ttcaaaatcg cttgcccggt gccagtatgt tgctctgacg cacgcgcagc acgcagccgt 4800 gcttgtcctg gacattgatg tgccgagcca ccaggccggc gggaaaatcg agcacgtaaa 4860 ccccgaggtc tacgcgattt tggagcgctg ggcacgcctg gaaaaagcgc cagcttggat 4920 cggcgtgaat ccactgagcg ggaaatgcca gctcatctgg ctcattgatc cggtgtatgc 4980 cgcagcaggc atgagcagcc cgaatatgcg cctgctggct gcaacgaccg aggaaatgac 5040 ccgcgttttc ggcgctgacc aggctttttc acataggctg agccgtggcc actgcactct 5100 ccgacgatcc cagccgtacc gctggcatgc ccagcacaat cgcgtggatc gcctagctga 5160 tcttatggag gttgctcgca tgatctcagg cacagaaaaa cctaaaaaac gctatgagca 5220 ggagttttct agcggacggg cacgtatcga agcggcaaga aaagccactg cggaagcaaa 5280 agcacttgcc acgcttgaag caagcctgcc gagcgccgct gaagcgtctg gagagctgat 5340 cgacggcgtc cgtgtcctct ggactgctcc agggcgtgcc gcccgtgatg agacggcttt 5400 tcgccacgct ttgactgtgg gataccagtt aaaagcggct ggtgagcgcc taaaagacac 5460 caagggtcat cgagcctacg agcgtgccta caccgtcgct caggcggtcg gaggaggccg 5520 tgagcctgat ctgccgccgg actgtgaccg ccagacggat tggccgcgac gtgtgcgcgg 5580 ctacgtcgct aaaggccagc cagtcgtccc tgctcgtcag acagagacgc agagccagcc 5640 gaggcgaaaa gctctggcca ctatgggaag acgtggcggt aaaaaggccg cagaacgctg 5700 gaaagaccca aacagtgagt acgcccgagc acagcgagaa aaactagcta agtccagtca 5760 acgacaagct aggaaagcta aaggaaatcg cttgaccatt gcaggttggt ttatgactgt 5820 tgagggagag actggctcgt ggccgacaat caatgaagct atgtctgaat ttagcgtgtc 5880 acgtcagacc gtgaatagag cacttaaggt ctgcgggcat tgaacttcca cgaggacgcc 5940 gaaagcttcc cagtaaatgt gccatctcgt aggcagaaaa cggttccccc gtagggtctc 6000 tctcttggcc tcctttctag gtcgggctga ttgctcttga agctctctag gggggctcac 6060 accataggca gataacgttc cccaccggct cgcctcgtaa gcgcacaagg actgctccca 6120 aagatcttca aagccactgc cgcgactgcc ttcgcgaagc cttgccccgc ggaaatttcc 6180 tccaccgagt tcgtgcacac ccctatgcca agcttctttc accctaaatt cgagagattg 6240 gattcttacc gtggaaattc ttcgcaaaaa tcgtcccctg atcgcccttg cgacgttggc 6300 gtcggtgccg ctggttgcgc ttggcttgac cgacttgatc agcggccgc 6349

<210> 17 <211> 29 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <400> 17

gagactcgag agctgccaat tattccggg

<210> 18 <211> 41 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <400> 18

cctgaaggcg cgagggtggg catgggtaaa aaatcctttc

<210> 19 <211> 19 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <4 00> 19

cccaccctcg cgccttcag

<210> 20 <211> 18 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <400> 20

ctgggtacat tgcggccc

<210> 21 <211> 6386 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo <220>

<221> misc_feature <223> pCLiK5MCS PSODmetA

<220>

<221> misc_feature <222> (1752)..(2543) <223> KanR

<220>

<221> misc_feature <222> (4824)..(5945) <223> Proteina Rep <22 0>

<221> misc_feature

<222> (2810)..(3670)

<223> Ori-Ec (ρΜΒ) (complementar)

<220>

<221> misc_feature <222> (3816)..(4490) <223> orfl

<220>

<221> misc_feature <222> (6)..(196) <223> Psod

<220>

<221> misc_feature <222> (197)..(1330) <223> met

<400> 21

tcgagagctg ccaattattc cgggcttgtg acccgctacc cgataaatag gtcggctgaa 60 aaatttcgtt gcaatatcaa caaaaaggcc tatcattggg aggtgtcgca ccaagtactt 120 ttgcgaagcg ccatctgacg gattttcaaa agatgtatat gctcggtgcg gaaacctacg 180 aaaggatttt ttacccatgc ccaccctcgc gccttcaggt caacttgaaa tccaagcgat 240 cggtgatgtc tccaccgaag ccggagcaat cattacaaac gctgaaatcg cctatcaccg 300 ctggggtgaa taccgcgtag ataaagaagg acgcagcaat gtcgttctca tcgaacacgc 360 cctcactgga gattccaacg cagccgattg gtgggctgac ttgctcggtc ccggcaaagc 420 catcaacact gatatttact gcgtgatctg taccaacgtc atcggtggtt gcaacggttc 480 caccggacct ggctccatgc atccagatgg aaatttctgg ggtaatcgct tccccgccac 540 gtccattcgt gatcaggtaa acgccgaaaa acaattcctc gacgcactcg gcatcaccac 600 ggtcgccgca gtacttggtg gttccatggg tggtgcccgc accctagagt gggccgcaat 660 gtacccagaa actgttggcg cagctgctgt tcttgcagtt tctgcacgcg ccagcgcctg 720 gcaaatcggc attcaatccg cccaaattaa ggcgattgaa aacgaccacc actggcacga 780 aggcaactac tacgaatccg gctgcaaccc agccaccgga ctcggcgecg cccgacgcat 840 cgcccacctc acctaccgtg gcgaactaga aatcgacgaa cgcttcggca ccaaagccca 900 aaagaacgaa aacccactcg gtccctaccg caagcccgac cagcgcttcg ccgtggaatc 960 ctacttggac taccaagcag acaagctagt acagcgtttc gacgccggct cctacgtctt 1020 gctcaccgac gccctcaacc gccacgacat tggtcgcgac cgcggaggcc tcaacaaggc 1080 actcgaatcc atcaaagttc cagtccttgt cgcaggcgta gataccgata ttttgtaccc 1140 ctaccaccag caagaacacc tctccagaaa cctgggaaat ctactggcaa tggcaaaaat 1200 cg.tatcccct gtcggccacg atgctttcct caccgaaagc cgccaaatgg atcgcatcgt 1260 gaggaacttc ttcagcctca tctccccaga cgaagacaac ccttcgacct acatcgagtt 1320 ctacatctaa catatgacta gttcggacct agggatatcg tcgacatcga tgctcttctg 1380 cgttaattaa caattgggat cctctagacc cgggatttaa atcgctagcg ggctgctaaa 1440 ggaagcggaa cacgtagaaa gccagtccgc agaaacggtg ctgaccccgg atgaatgtca 1500 gctactgggc tatctggaca agggaaaacg caagcgcaaa gagaaagcag gtagcttgca 1560 gtgggcttac atggcgatag ctagactggg cggttttatg gacagcaagc gaaccggaat 1620 tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac tggatggctt 1680 tcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagatc tgatcaagag acaggatgag 1740 gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg 1800 agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt 1860 tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc 1920 tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt 1980 gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag 2040 tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg 2100 ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag 2160 cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg 2220 atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc 2280 gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca 2340 tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc 2400 gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg 2460 ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct 2520 atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgaaatga ccgaccaagc 2580 gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg 2640 cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct 2700 ggagttcttc gcccacgcta gcggcgcgcc ggccggcccg gtgtgaaata ccgcacagat 2760 gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 2820 gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 2880 ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 2940 ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 3000 atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 3060 aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 3120 gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 3180 ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 3240 ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 3300 acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 3360 gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 3420 ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 3480 ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 3540 gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 3600 ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 3660 agatcctttt aaaggccggc cgcggccgcg caaagtcccg cttcgtgaaa attttcgtgc 3720 cgcgtgattt tccgccaaaa actttaacga acgttcgtta taatggtgtc atgaccttca 3780 cgacgaagta ctaaaattgg cccgaatcat cagctatgga tctctctgat gtcgcgctgg 3840 agtccgacgc gctcgatgct gccgtcgatt taaaaacggt gatcggattt ttccgagctc 3900 tcgatacgac ggacgcgcca gcatcacgag actgggccag tgccgcgagc gacctagaaa 3960 ctctcgtggc ggatcttgag gagctggctg acgagctgcg tgctcggcca gcgccaggag 4020 gacgcacagt agtggaggat gcaatcagtt gcgcctactg cggtggcctg attcctcccc 4080 ggcctgaccc gcgaggacgg cgcgcaaaat attgctcaga tgcgtgtcgt gccgcagcca 4140 gccgcgagcg cgccaacaaa cgccacgccg aggagctgga ggcggctagg tcgcaaatgg 4200 cgctggaagt gcgtcccccg agcgaaattt tggccatggt cgtcacagag ctggaagcgg 4260 cagcgagaat tatcgcgatc gtggcggtgc ccgcaggcat gacaaacatc gtaaatgccg 4320 cgtttcgtgt gccgtggccg cccaggacgt gtcagcgccg ccaccacctg caccgaatcg 4380 gcagcagcgt cgcgcgtcga aaaagcgcac aggcggcaag aagcgataag ctgcacgaat 4440 acctgaaaaa tgttgaacgc cccgtgagcg gtaactcaca gggcgtcggc taacccccag 4500 tccaaacctg ggagaaagcg ctcaaaaatg actctagcgg attcacgaga cattgacaca 4560 ccggcctgga aattttccgc tgatctgttc gacacccatc ccgagctcgc gctgcgatca 4620 cgtggctgga cgagcgaaga ccgccgcgaa ttcctcgctc acctgggcag agaaaatttc 4680 cagggcagca agacccgcga cttcgccagc gcttggatca aagacccgga cacggagaaa 4740 cacagccgaa gttataccga gttggttcaa aatcgcttgc ccggtgccag tatgttgctc 4800 tgacgcacgc gcagcacgca gccgtgcttg tcctggacat tgatgtgccg agccaccagg 4860 ccggcgggaa aatcgagcac gtaaaccccg aggtctacgc gattttggag cgctgggcac 4920 gcctggaaaa agcgccagct tggatcggcg tgaatccact gagcgggaaa tgccagctca 4980 tctggctcat tgatccggtg tatgccgcag caggcatgag cagcccgaat atgcgcctgc 5040 tggctgcaac gaccgaggaa atgacccgcg ttttcggcgc tgaccaggct ttttcacata 5100 ggctgagccg tggccactgc actctccgac gatcccagcc gtaccgctgg catgcccagc 5160 acaatcgcgt ggatcgccta gctgatctta tggaggttgc tcgcatgatc tcaggcacag 5220 aaaaacctaa aaaacgctat gagcaggagt tttctagcgg acgggcacgt atcgaagcgg 5280 caagaaaagc cactgcggaa gcaaaagcac ttgccacgct tgaagcaagc ctgccgagcg 5340 ccgctgaagc gtctggagag ctgatcgacg gcgtccgtgt cctctggact gctccagggc 5400 gtgccgcccg tgatgagacg gcttttcgcc acgctttgac tgtgggatac cagttaaaag 5460 cggctggtga gcgcctaaaa gacaccaagg gtcatcgagc ctacgagcgt gcctacaccg 5520 tcgctcaggc ggtcggagga ggccgtgagc ctgatctgcc gccggactgt gaccgccaga 5580 cggattggcc gcgacgtgtg cgcggctacg tcgctaaagg ccagccagtc gtccctgctc 5640 gtcagacaga gacgcagagc cagccgaggc gaaaagctct ggccactatg ggaagacgtg 5700 gcggtaaaaa ggccgcagaa cgctggaaag acccaaacag tgagtacgcc cgagcacagc 5760 gagaaaaact agctaagtcc agtcaacgac aagctaggaa agctaaagga aatcgcttga 5820 ccattgcagg ttggtttatg actgttgagg gagagactgg ctcgtggccg acaatcaatg 5880 aagctatgtc tgaatttagc gtgtcacgtc agaccgtgaa tagagcactt aaggtctgcg 5940 ggcattgaac ttccacgagg acgccgaaag cttcccagta aatgtgccat ctcgtaggca 6000 gaaaacggtt cccccgtagg gtctctctct tggcctcctt tctaggtcgg gctgattgct 6060 cttgaagctc tctagggggg ctcacaccat aggcagataa cgttccccac cggctcgcct 6120 cgtaagcgca caaggactgc tcccaaagat cttcaaagcc actgccgcga ctgccttcgc 6180 gaagccttgc cccgcggaaa tttcctccac cgagttcgtg cacaccccta tgccaagctt 6240 ctttcaccct aaattcgaga gattggattc ttaccgtgga aattcttcgc aaaaatcgtc 6300 ccctgatcgc ccttgcgacg ttggcgtcgg tgccgctggt tgcgcttggc ttgaccgact 6360 tgatcagcgg ccgctcgatt taaatc 6386 <210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 22

gagactcgag ggccgttacc ctgcgaatg 29 <210> 23 <211> 40 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <400> 23

cctgaaggcg cgagggtggg cattgtatgt cctcctggac

<210> 24 <211> 19 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <400> 24

cccaccctcg cgccttcag

<210> 25 <211> 18 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <400> 25

ctgggtacat tgcggccc

<210> 26 <211> 6394 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo <220>

<221> misc_feature

<223> pCLiK5MCS P EFTUmeth

<220>

<221> misc_feature <222> (1772)..(2563) <223> KanR

<220>

<221> misc_feature <222> (4844)..(6965) <223> Proteína Rep

<220>

<221> misc_feature

<222> (2830)..(3690)

<223> Ori-Ec (pMB) (complementar) <220>

<221> misc_feature <222> (3836)..(4510) <223> Orfl

<220>

<221> misc_feature <222> (18)..(216) <223> Peftu

<220>

<221> misc_feature <222> (217) .. (1350) <223> metA

<400> 26

tcgatttaaa tctcgagggc cgttaccctg cgaatgtcca cagggtagct ggtagtttga 60

aaatcaacgc cgttgccctt aggattcagt aactggcaca ttttgtaatg cgctagatct 120

gtgtgctcag tcttccaggc tgcttatcac agtgaaagca aaaccaattc gtggctgcga 180

aagtcgtagc caccacgaag tccaggagga catacaatgc ccaccctcgc gccttcaggt 240

caacttgaaa tccaagcgat cggtgatgtc tccaccgaag ccggagcaat cattacaaac 300

gctgaaatcg cctatcaccg ctggggtgaa taccgcgtag ataaagaagg acgcagcaat 360

gtcgttctca tcgaacacgc cctcactgga gattccaacg cagccgattg gtgggctgac 420

ttgctcggtc ccggcaaagc catcaacact gatatttact gcgtgatctg taccaacgtc 480

atcggtggtt gcaacggttc caccggacct ggctccatgc atccagatgg aaatttctgg 540

ggtaatcgct tccccgccac gtccattcgt gatcaggtaa acgccgaaaa acaattcctc 600

gacgcactcg gcatcaccac ggtcgccgca gtacttggtg gttccatggg tggtgcccgc 660

accctagagt gggccgcaat gtacccagaa actgttggcg cagctgctgt tcttgcagtt 720

tctgcacgcg ccagcgcctg gcaaatcggc attcaatccg cccaaattaa ggcgattgaa 780

aacgaccacc actggcacga aggcaactac tacgaatccg gctgcaaccc agccaccgga 840

ctcggcgccg cccgacgcat cgcccacctc acctaccgtg gcgaactaga aatcgacgaa 900

cgcttcggca ccaaagccca aaagaacgaa aacccactcg gtccctaccg caagcccgac 960

cagcgcttcg ccgtggaatc ctacttggac taccaagcag acaagctagt acagcgtttc 1020

gacgccggct cctacgtctt gctcaccgac gccctcaacc gccacgacat tggtcgcgac 1080

cgcggaggcc tcaacaaggc actcgaatcc atcaaagttc cagtccttgt cgcaggcgta 1140

gataccgata ttttgtaccc ctaccaccag caagaacacc tctccagaaa cctgggaaat 1200

ctactggcaa tggcaaaaat cgtatcccct gtcggccacg atgctttcct caccgaaagc 1260

cgccaaatgg atcgcatcgt gaggaacttc ttcagcctca tctccccaga cgaagacaac 1320

ccttcgacct acatcgagtt ctacatctaa catatgacta gttcggacct agggatatcg 1380 tcgacatcga tgctcttctg cgttaattaa caattgggat cctctagacc cgggatttaa 1440 atcgctagcg ggctgctaaa ggaagcggaa cacgtagaaa gccagtccgc agaaacggtg 1500 ctgaccccgg atgaatgtca gctactgggc tatctggaca agggaaaacg caagcgcaaa 1560 gagaaagcag gtagcttgca gtgggcttac atggcgatag ctagactggg cggttttatg 1620 gacagcaagc gaaccggaat tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg 1680 caaagtaaac tggatggctt tcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagatc 1740 tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg 1800 ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg 1860 ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa 1920 gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct 1980 ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga 2040 ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc 2100 cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac 2160 ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc 2220 cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact 2280 gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga 2340 tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg 2400 ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga 2460 agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga 2520 ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg 2580 ttcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc 2640 gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc 2700 cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc gcccacgcta gcggcgcgcc ggccggcccg 2760 gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc 2820 ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 2880 aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 2940 aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 3000 gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 3060 gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 3120 tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 3180 ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 3240 ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 3300 tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 3360 tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 3420 ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 3480 aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 3540 ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 3600 tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 3660 atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaaggccggc cgcggccgcg caaagtcccg 3720 cttcgtgaaa attttcgtgc cgcgtgattt tccgccaaaa actttaacga acgttcgtta 3780 taatggtgtc atgaccttca cgacgaagta ctaaaattgg cccgaatcat cagctatgga 3840 tctctctgat gtcgcgctgg agtccgacgc gctcgatgct gccgtcgatt taaaaacggt 3900 gatcggattt ttccgagctc tcgatacgac ggacgcgcca gcatcacgag actgggccag 3960 tgccgcgagc gacctagaaa ctctcgtggc ggatcttgag gagctggctg acgagctgcg 4020 tgctcggcca gcgccaggag gacgcacagt agtggaggat gcaatcagtt gcgcctactg 4080 cggtggcctg attcctcccc ggcctgaccc gcgaggacgg cgcgcaaaat attgctcaga 4140 tgcgtgtcgt gccgcagcca gccgcgagcg cgccaacaaa cgccacgccg aggagctgga 4200 ggcggctagg tcgcaaatgg cgctggaagt gcgtcccccg agcgaaattt tggccatggt 4260 cgtcacagag ctggaagcgg cagcgagaat tatcgcgatc gtggcggtgc ccgcaggcat 4320 gacaaacatc gtaaatgccg cgtttcgtgt gccgtggccg cccaggacgt gtcagcgccg 4380 ccaccacctg caccgaatcg gcagcagcgt cgcgcgtcga aaaagcgcac aggcggcaag 4440 aagcgataag ctgcacgaat acctgaaaaa tgttgaacgc cccgtgagcg gtaactcaca 4500 gggcgtcggc taacccccag tccaaacctg ggagaaagcg ctcaaaaatg actctagcgg 4560 attcacgaga cattgacaca ccggcctgga aattttccgc tgatctgttc gacacccatc 4620 ccgagctcgc gctgcgatca cgtggctgga cgagcgaaga ccgccgcgaa ttcctcgctc 4680 acctgggcag agaaaatttc cagggcagca agacccgcga cttcgccagc gcttggatca 4740 aagacccgga cacggagaaa cacagccgaa gttataccga gttggttcaa aatcgcttgc 4800 ccggtgccag tatgttgctc tgacgcacgc gcagcacgca gccgtgcttg tcctggacat 4860 tgatgtgccg agccaccagg ccggcgggaa aatcgagcac gtaaaccccg aggtctacgc 4920 gattttggag cgctgggcac gcctggaaaa agcgccagct tggatcggcg tgaatccact 4980 gagcgggaaa tgccagctca tctggctcat tgatccggtg tatgccgcag caggcatgag 5040 cagcccgaat atgcgcctgc tggctgcaac gaccgaggaa atgacccgcg ttttcggcgc 5100 tgaccaggct ttttcacata ggctgagccg tggccactgc actctccgac gatcccagcc 5160 gtaccgctgg catgcccagc acaatcgcgt ggatcgccta gctgatctta tggaggttgc 5220 tcgcatgatc tcaggcacag aaaaacctaa aaaacgctat gagcaggagt tttctagcgg 5280 acgggcacgt atcgaagcgg caagaaaagc cactgcggaa gcaaaagcac ttgccacgct 5340 tgaagcaagc ctgccgagcg ccgctgaagc gtctggagag ctgatcgacg gcgtccgtgt 5400 cctctggact gctccagggc gtgccgcccg tgatgagacg gcttttcgcc acgctttgac 5460 tgtgggatac cagttaaaag cggctggtga gcgcctaaaa gacaccaagg gtcatcgagc 5520 ctacgagcgt gcctacaccg tcgctcaggc ggtcggagga ggccgtgagc ctgatctgcc 5580 gccggactgt gaccgccaga cggattggcc gcgacgtgtg cgcggctacg tcgctaaagg 5640 ccagccagtc gtccctgctc gtcagacaga gacgcagagc cagccgaggc gaaaagctct 5700 ggccactatg ggaagacgtg gcggtaaaaa ggccgcagaa cgctggaaag acccaaacag 5760 tgagtacgcc cgagcacagc gagaaaaact agctaagtcc agtcaacgac aagctaggaa 5820 agctaaagga aatcgcttga ccattgcagg ttggtttatg actgttgagg gagagactgg 5880 ctcgtggccg acaatcaatg aagctatgtc tgaatttagc gtgtcacgtc agaccgtgaa 5940 tagagcactt aaggtctgcg ggcattgaac ttccacgagg acgccgaaag cttcccagta 6000 aatgtgccat ctcgtaggca gaaaacggtt cccccgtagg gtctctctct tggcctcctt 6060 tctaggtcgg gctgattgct cttgaagctc tctagggggg ctcacaccat aggcagataa 6120 cgttccccac cggctcgcct cgtaagcgca caaggactgc tcccaaagat cttcaaagcc 6180 actgccgcga ctgccttcgc gaagccttgc cccgcggaaa tttcctccac cgagttcgtg 6240 cacaccccta tgccaagctt ctttcaccct aaattcgaga gattggattc ttaccgtgga 6300 aattcttcgc aaaaatcgtc ccctgatcgc ccttgcgacg ttggcgtcgg tgccgctggt 6360 tgcgcttggc ttgaccgact tgatcagcgg ccgc 6394 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Iniciador <400> 27 gagactcgag cggcttaaag tttggctgcc 30

<210> 28 <211> 41 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <400> 28 cctgaaggcg cgagggtggg catgatgaat ccctccatga g

<210> 29 <211> 19 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <400> 29

cccaccctcg cgccttcag

<210> 30 <211> 18 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <400> 30

ctgggtacat tgcggccc

<210> 31 <211> 6372 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo <220>

<221> misc_feature

<223> pCLiK5MCS PGroESmetA

<220>

<221> misc_feature <222> (1735)..(2526) <223> KanR

<220>

<221> misc_feature <222> (4807) .. (5928) <223> Proteína Rep

<220>

<221> misc_feature

<222> (2793)..(3653)

<223> Ori-EC (ρΜΒ) (complementar)

<220>

<221> misc_feature <222> (3799)..(4473) <223> Orfl

<220>

<221> misc_feature <222> (3)..(179) <223> Pgro <220>

<221> misc_feature <222> (180)..(1313) <223> metA

<400> 31

agcggcttaa agtttggctg ccatgtgaat ttttagcacc ctcaacagtt gagtgctggc 60

actctcgggg gtagagtgcc aaataggttg tttgacacac agttgttcac ccgcgacgac 120

ggctgtgctg gaaacccaca accggcacac acaaaatttt tctcatggag ggattcatca 180

tgcccaccct cgcgccttca ggtcaacttg aaatccaagc gatcggtgat gtctccaccg 240

aagccggagc aatcattaca aacgctgaaa tcgcctatca ccgctggggt gaataccgcg 300

tagataaaga aggacgcagc aatgtcgttc tcatcgaaca cgccctcact ggagattcca 360

acgcagccga ttggtgggct gacttgctcg gtcccggcaa agccatcaac actgatattt 420

actgcgtgat ctgtaccaac gtcatcggtg gttgcaacgg ttccaccgga cctggctcca 480

tgcatccaga tggaaatttc tggggtaatc gcttccccgc cacgtccatt cgtgatcagg 540

taaacgccga aaaacaattc ctcgacgcac tcggcatcac cacggtcgcc gcagtacttg 600

gtggttccat gggtggtgcc cgcaccctag agtgggccgc aatgtaccca gaaactgttg 660

gcgcagctgc tgttcttgca gtttctgcac gcgccagcgc ctggcaaatc ggcattcaat 720

ccgcccaaat taaggcgatt gaaaacgacc accactggca cgaaggcaac tactacgaat 780

ccggctgcaa cccagccacc ggactcggcg ccgcccgacg catcgcccac ctcacctacc 840

gtggcgaact agaaatcgac gaacgcttcg gcaccaaagc ccaaaagaac gaaaacccac 900

tcggtcccta ccgcaagccc gaccagcgct tcgccgtgga atcctacttg gactaccaag 960

cagacaagct agtacagcgt ttcgacgccg gctcctacgt cttgctcacc gacgccctca 1020

accgccacga cattggtcgc gaccgcggag gcctcaacaa ggcactcgaa tccatcaaag 1080

ttccagtcct tgtcgcaggc gtagataccg atattttgta cccctaccac cagcaagaac 1140

acctctccag aaacctggga aatctactgg caatggcaaa aatcgtatcc cctgtcggcc 1200

acgatgcttt cctcaccgaa agccgccaaa tggatcgcat cgtgaggaac ttcttcagcc 1260

tcatctcccc agacgaagac aacccttcga cctacatcga gttctacatc taacatatga 1320

ctagttcgga cctagggata tcgtcgacat cgatgctctt ctgcgttaat taacaattgg 1380

gatcctctag acccgggatt taaatcgcta gcgggctgct aaaggaagcg gaacacgtag 1440

aaagccagtc cgcagaaacg gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg ggctatctgg 1500

acaagggaaa acgcaagcgc aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct tacatggcga 1560

tagctagact gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc 1620 tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc 1680 tgatggcgca ggggatcaag atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt 1740 gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat 1800 gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag 1860 gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac 1920 gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac 1980 gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc 2040 ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg 2100 ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag 2160 cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat 2220 caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag 2280 gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc 2340 ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg 2400 ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg 2460 ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag 2520 ttcttctgag cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat 2580 cacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc 2640 gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacg 2700 ctagcggcgc gccggccggc ccggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac 2760 cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 2820 cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 2880 aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 2940 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 3000 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 3060 agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 3120 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 3180 taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 3240 gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 3300 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 3360 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 3420 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 3480 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 3540 caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 3600

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaaggcc 3660

ggccgcggcc gcgcaaagtc ccgcttcgtg aaaattttcg tgccgcgtga ttttccgcca 3720

aaaactttaa cgaacgttcg ttataatggt gtcatgacct tcacgacgaa gtactaaaat 3780

tggcccgaat catcagctat ggatctctct gatgtcgcgc tggagtccga cgcgctcgat 3840

gctgccgtcg atttaaaaac ggtgatcgga tttttccgag ctctcgatac gacggacgcg 3900

ccagcatcac gagactgggc cagtgccgcg agcgacctag aaactctcgt ggcggatctt 3960

gaggagctgg ctgacgagct gcgtgctcgg ccagcgccag gaggacgcac agtagtggag 4020

gatgcaatca gttgcgccta ctgcggtggc ctgattcctc cccggcctga cccgcgagga 4080

cggcgcgcaa aatattgctc agatgcgtgt cgtgccgcag ccagccgcga gcgcgccaac 4140

aaaegccacg ccgaggagct ggaggcggct aggtcgcaaa tggcgctgga agtgcgtccc 4 200

ccgagcgaaa ttttggccat ggtcgtcaca gagctggaag cggcagcgag aattatcgcg 4260

atcgtggcgg tgcccgcagg catgacaaac atcgtaaatg ccgcgtttcg tgtgccgtgg 4320

ccgcccagga cgtgtcagcg ccgccaccac ctgcaccgaa tcggcagcag cgtcgcgcgt 4380

cgaaaaagcg cacaggcggc aagaagcgat aagctgcacg aatacctgaa aaatgttgaa 4440

cgccccgtga gcggtaactc acagggcgtc ggctaacccc cagtccaaac ctgggagaaa 4500

gcgctcaaaa atgactctag cggattcacg agacattgac acaccggcct ggaaattttc 4560

cgctgatctg ttcgacaccc atcccgagct cgcgctgcga tcacgtggct ggacgagcga 4 620

agaccgccgc gaattcctcg ctcacctggg cagagaaaat ttccagggca gcaagacccg 4 680

cgacttcgcc agcgcttgga tcaaagaccc ggacacggag aaacacagcc gaagttatac 4740

cgagttggtt caaaatcgct tgcccggtgc cagtatgttg ctctgacgca cgcgcagcac 4800

gcagccgtgc ttgtcctgga cattgatgtg ccgagccacc aggccggcgg gaaaatcgag 4860

cacgtaaacc ccgaggtcta cgcgattttg gagcgctggg cacgcctgga aaaagcgcca 4 920

gcttggatcg gcgtgaatcc actgagcggg aaatgccagc tcatctggct cattgatccg 4 980

gtgtatgccg cagcaggcat gagcagcccg aatatgcgcc tgctggctgc aacgaccgag 5040

gaaatgaccc gcgttttcgg cgctgaccag gctttttcac ataggctgag ccgtggccac 5100

tgcactctcc gacgatccca gccgtaccgc tggcatgccc agcacaatcg cgtggatcgc 5160

ctagctgatc ttatggaggt tgctcgcatg atctcaggca cagaaaaacc taaaaaacgc 5220

tatgagcagg agttttctag cggacgggca cgtatcgaag cggcaagaaa agccactgcg 5280

gaagcaaaag cacttgccac gcttgaagca agcctgccga gcgccgctga agcgtctgga 5340

gagctgatcg acggcgtccg tgtcctctgg actgctccag ggcgtgccgc ccgtgatgag 5400 acggcttttc

aaagacacca

ggaggccgtg

gtgcgcggct

agccagccga

gaacgctgga

tccagtcaac

atgactgttg

agcgtgtcac

aggacgccga

agggtctctc

gggctcacac

tgctcccaaa

aaatttcctc

agagattgga

acgttggcgt

atttaaatct

<210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: BK 1849

<400> 32

gtgtgtcgac ttagatgtag aactcgatgt ag 32

<210> 33 <211> 17 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: BK 1862

gccacgcttt gactgtggga taccagttaa agggtcatcg agcctacgag cgtgcctaca agcctgatct gccgccggac tgtgaccgcc acgtcgctaa aggccagcca gtcgtccctg ggcgaaaagc tctggccact atgggaagac aagacccaaa cagtgagtac gcccgagcac gacaagctag gaaagctaaa ggaaatcgct agggagagac tggctcgtgg ccgacaatca gtcagaccgt gaatagagca cttaaggtct aagcttccca gtaaatgtgc catctcgtag tcttggcctc ctttctaggt cgggctgatt cataggcaga taacgttccc caccggctcg gatcttcaaa gccactgccg cgactgcctt caccgagttc gtgcacaccc ctatgccaag ttcttaccgt ggaaattctt cgcaaaaatc cggtgccgct ggttgcgctt ggcttgaccg

aagcggctgg tgagcgccta 54 60

ccgtcgctca ggcggtcgga 5520

agacggattg gccgcgacgt 5580

ctcgtcagac agagacgcag 5640

gtggcggtaa aaaggccgca 5700

agcgagaaaa actagctaag 5760

tgaccattgc aggttggttt 5820

atgaagctat gtctgaattt 5880

gcgggcattg aacttccacg 5940

gcagaaaacg gttcccccgt 6000

gctcttgaag ctctctaggg 6060

cctcgtaagc gcacaaggac 6120

cgcgaagcct tgccccgcgg 6180

cttctttcac cctaaattcg 6240

gtcccctgat cgcccttgcg 6300

acttgatcag cggccgctcg 6360

6372 <400> 33

atgcccaccc tcgcgcc

<211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: Haf 26

<400> 34

gagaggatcc cccccacgac aatggaac

<210> 35 <211> 44 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: Haf 27)

<400> 35

cctgaaggcg cgagggtggg cattacgggg cgatcctcct tatg

<210> 36 <211> 6389 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<221> misc_feature

<223> pCLiK5MCS P EF-TS metA

<220>

<221> misc_feature <222> (1767) .. (2558) <223> KanR

<220>

<221> misc_feature <222> (4839) .. (5960) <223> Proteina Rep

<220>

<221> misc_feature

<222> (2825)..(3685)

<223> Ori-Ec (FHB) (complementar)

<220>

<221> misc_feature <222> (3831) . . (4505) <223> Orfl <220>

<221> misc_feature

<222> (1217)..(1411)

<223> P EF-TS (complementar)

<220>

<221> misc_feature <222> (83)..(1216) <223> metA (complementar)

<400> 36

tcgatttaaa tctcgagagg cctgacgtcg ggcccggtac cacgcgtcat atgactagtt 60

cggacctagg gatatcgtcg acttagatgt agaactcgat gtaggtcgaa gggttgtctt 120

cgtctgggga gatgaggctg aagaagttcc tcacgatgcg atccatttgg cggctttcgg 180

tgaggaaagc atcgtggccg acaggggata cgatttttgc cattgccagt agatttccca 240

ggtttctgga gaggtgttct tgctggtggt aggggtacaa aatatcggta tctacgcctg 300

cgacaaggac tggaactttg atggattcga gtgccttgtt gaggcctccg cggtcgcgac 360

caatgtcgtg gcggttgagg gcgtcggtga gcaagacgta ggagccggcg tcgaaacgct 420

gtactagctt gtctgcttgg tagtccaagt aggattccac ggcgaagcgc tggtcgggct 480

tgcggtaggg accgagtggg ttttcgttct tttgggcttt ggtgccgaag cgttcgtcga 540

tttctagttc gccacggtag gtgaggtggg cgatgcgtcg ggcggcgccg agtccggtgg 600

ctgggttgca gccggattcg tagtagttgc cttcgtgcca gtggtggtcg ttttcaatcg 660

ccttaatttg ggcggattga atgccgattt gccaggcgct ggcgcgtgca gaaactgcaa 720

gaacagcagc tgcgccaaca gtttctgggt acattgcggc ccactctagg gtgcgggcac 780

cacccatgga accaccaagt actgcggcga ccgtggtgat gccgagtgcg tcgaggaatt 840

gtttttcggc gtttacctga tcacgaatgg acgtggcggg gaagcgatta ccccagaaat 900

ttccatctgg atgcatggag ccaggtccgg tggaaccgtt gcaaccaccg atgacgttgg 960

tacagatcac gcagtaaata tcagtgttga tggctttgcc gggaccgagc aagtcagccc 1020

accaatcggc tgcgttggaa tctccagtga gggcgtgttc gatgagaacg acattgctgc 1080

gtccttcttt atctacgcgg tattcacccc agcggtgata ggcgatttca gcgtttgtaa 1140

tgattgctcc ggcttcggtg gagacatcac cgatcgcttg gatttcaagt tgacctgaag 1200

gcgcgagggt gggcattacg gggcgatcct ccttatgtat ggataattaa tgctttacaa 1260

gcttaggtta gggcacagta gccctacccg cccgtctaaa aagtgatcgt acaggtattc 1320

agtcgattac gttgcgacac ggcgggctgg ctgcccaaaa agcccccacg gcgatgaaat 1380

tttaaaagtc aaagttccat tgtcgtgggg gggatcctct agacccggga tttaaatcgc 1440

tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa cggtgctgac 1500 ccpggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc gcaaagagaa 1560

agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt ttatggacag 1620

caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag 1680

taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca agatctgatc 1740

aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc 1800

cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct 1860

ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg 1920

acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca 1980

cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc 2040

tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga 2100

aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc 2160

cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc 2220

ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg 2280

ccaggctcaa ggcgcgcatg·cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct 2340

gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc 2400

tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc 24 60

ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc 2520

agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc tggggttcga 2580

aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt 2640

ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg 2700

cggggatctc atgctggagt tcttcgccca cgctagcggc gcgccggccg gcccggtgtg 2760

aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc 2820

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 2880

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 2940

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 3000

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 3060

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 3120

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 3180

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 3240

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 3300

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 3360 gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 3420

ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 3480

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3540

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3600

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 3660

aaaggatctt cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg ccgcgcaaag tcccgcttcg 3720

tgaaaatttt cgtgccgcgt gattttccgc caaaaacttt aacgaacgtt cgttataatg 3780

gtgtcatgac cttcacgacg aagtactaaa attggcccga atcatcagct atggatctct 3840

ctgatgtcgc gctggagtcc gacgcgctcg atgctgccgt cgatttaaaa acggtgatcg 3900

gatttttccg agctctcgat acgacggacg cgccagcatc acgagactgg gccagtgccg 3960

cgagcgacct agaaactctc gtggcggatc ttgaggagct ggctgacgag ctgcgtgctc 4020

ggceagcgcc aggaggacgc acagtagtgg aggatgcaat cagttgcgcc tactgcggtg 4080

gcctgattcc tccccggcct gacccgcgag gacggcgcgc aaaatattgc tcagatgcgt 4140

gtcgtgccgc agccagccgc gagcgcgcca acaaacgcca cgccgaggag ctggaggcgg 4200

ctaggtcgca aatggcgctg gaagtgcgtc ccccgagcga aattttggcc atggtcgtca 4260

cagagctgga agcggcagcg agaattatcg cgatcgtggc ggtgcccgca ggcatgacaa 4320

acatcgtaaa tgccgcgttt cgtgtgccgt ggccgcccag gacgtgtcag cgccgccacc 4380

acctgcaccg aatcggcagc agcgtcgcgc gtcgaaaaag cgcacaggcg gcaagaagcg 4440

ataagctgca cgaatacctg aaaaatgttg aacgccccgt gagcggtaac tcacagggcg 4500

tcggctaacc cccagtccaa acctgggaga aagcgctcaa aaatgactct agcggattca 4560

cgagacattg acacaccggc ctggaaattt tccgctgatc tgttcgacac ccatcccgag 4 620

ctcgcgctgc gatcacgtgg ctggacgagc gaagaccgcc gcgaattcct cgctcacctg 4680

ggcagagaaa atttccaggg cagcaagacc cgcgacttcg ccagcgcttg gatcaaagac 4740

ccggacacgg agaaacacag ccgaagttat accgagttgg ttcaaaatcg cttgcccggt 4800

gccagtatgt tgctctgacg cacgcgcagc acgcagccgt gcttgtcctg gacattgatg 4860

tgccgagcca ccaggccggc gggaaaatcg agcacgtaaa ccccgaggtc tacgcgattt 4 920

tggagcgctg ggcacgcctg gaaaaagcgc cagcttggat cggcgtgaat ccactgagcg 4 980

ggaaatgcca gctcatctgg ctcattgatc cggtgtatgc cgcagcaggc atgagcagcc 5040

cgaatatgcg cctgctggct gcaacgaccg aggaaatgac ccgcgttttc ggcgctgacc 5100

aggctttttc acataggctg agccgtggcc actgcactct ccgacgatcc cagccgtacc 5160

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<212> DNA

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<223> Iniciador <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: BK 1753

<400> 37

ggatctagag ttctgtgaaa aacaccgtg 29

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<213> Seqüência Artificial <220>

<221> misc feature <223> designação interna: BK 1754 <400> 38

gcgactagtg ccccacaaat aaaaaacac 29

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo <220>

<221> misc_feature <223> H247

<400> 39 tcgatttaaa tctcgagagg cctgacgtcg ggcccggtac cacgcgtcat atgactagtt 60 cggacctagg gatatcgtcg acatcgatgc tcttctgcgt taattaacaa ttgggatcct 120 ctagagttct gtgaaaaaca ccgtggggca gtttctgctt cgcggtgttt tttatttgtg 180 gggcactaga cccgggattt aaatcgctag cgggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga 240 aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga 300 caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat 360 agctagactg ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct 420 ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct 480 gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 540 aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 600 actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 660 ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg 720 aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 780 ttgtcactga agcgggaagg gactggctgp tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 840 tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 900 tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 960 gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 1020 aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg 1080 atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 1140 tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 1200 tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 1260 tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 1320 tcjttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc 1380

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<223> Iniciador <220>

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gagaactagt agctgccaat tattccggg 29

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gtgtgtcgac ttagatgtag aactcgatgt ag 32

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo <220>

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tcgatttaaa tctcgagagg cctgacgtcg ggcccggtac cacgcgtcat atgactagta 60

gctgccaatt attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt 120 cgttgcaata tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga 180 agcgccatct gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga 240 ttttttaccc atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga 300 tgtctccacc gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg 360 tgaataccgc gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac 420 tggagattcc aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa 480

cactgatatt tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg 540

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tggcctcctt tctaggtcgg gctgattgct

aggcagataa cgttccccac cggctcgcct

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ttaccgtgga aattcttcgc aaaaatcgtc

tgccgctggt tgcgcttggc ttgaccgact

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo <220> <221> misc feature <223> designação interna : Η502 (pCliK5MCS Peftu Psod Pefts metA) <400> 60 aaatctcgag ggccgttacc ctgcgaatgt ccacagggta gctggtagtt tgaaaatcaa 60 cgccgttgcc cttaggattc agtaactggc acattttgta atgcgctaga tctgtgtgct 120 cagtcttcca ggctgcttat cacagtgaaa gcaaaaccaa ttcgtggctg cgaaagtcgt 180 agccacacta gtagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccga taaataggtc 240 ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggagg tgtcgcacca 300 agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcgggg 360 taccccccca cgacaatgga actttgactt ttaaaatttc atcgccgtgg gggctttttg 420 ggcagccagc ccgccgtgtc gcaacgtaat cgactgaata cctgtacgat cactttttag 480 acgggcgggt agggctactg tgccctaacc taagcttgta aagcattaat tatccataca 540 taaggaggat cgccccgtaa tgcccaccct cgcgccttca ggtcaacttg aaatccaagc 600 gatcggtgat gtctccaccg aagccggagc aatcattaca aacgctgaaa tcgcctatca 660 ccgctggggt gaataccgcg tagataaaga aggacgcagc aatgtcgttc tcatcgaaca 720 cgccctcact ggagattcca acgcagccga ttggtgggct gacttgctcg gtcccggcaa 780 agccatcaac actgatattt actgcgtgat ctgtaccaac gtcatcggtg gttgcaacgg 840 ttccaccgga cctggctcca tgcatccaga tggaaatttc tggggtaatc gcttccccgc 900 cacgtccatt cgtgatcagg taaacgccga aaaacaattc ctcgacgcac tcggcatcac 960 cacggtcgcc gcagtacttg gtggttccat gggtggtgcc cgcaccctag agtgggccgc 1020 aatgtaccca gaaactgttg gcgcagctgc tgttcttgca gtttctgcac gcgccagcgc 1080 ctggcaaatc ggcattcaat ccgcccaaat taaggcgatt gaaaacgacc accactggca 1140 cgaaggcaac tactacgaat ccggctgcaa cccagccacc ggactcggcg ccgcccgacg 1200 catcgcccac ctcacctacc gtggcgaact agaaatcgac gaacgcttcg gcaccaaagc 1260 ccaaaagaac gaaaacccac tcggtcccta ccgcaagccc gaccagcgct tcgccgtgga 1320 atcctacttg gactaccaag cagacaagct agtacagcgt ttcgacgccg gctcctacgt 1380 cttgctcacc gacgccctca accgccacga cattggtcgc gaccgcggag gcctcaacaa 1440 ggcactcgaa tccatcaaag ttccagtcct tgtcgcaggc gtagataccg atattttgta 1500 cccctaccac cagcaagaac acctctccag aaacctggga aatctactgg caatggcaaa 1560 aatcgtatcc cctgtcggcc acgatgcttt cctcaccgaa agccgccaaa tggatcgcat cgtgaggaac ttcttcagcc tcatctcccc agacgaagac aacccttcga cctacatcga gttctacatc taagtcgaca tcgatgctct tctgcgttaa ttaacaattg ggatcctcta gagttctgtg aaaaacaccg tggggcagtt tctgcttcgc ggtgtttttt atttgtgggg cactagaccc gggatttaaa tcgctagcgg gctgctaaag gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccacgctag cggcgcgccg gccggcccgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa

1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 3480 ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 3540 cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 3600

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 3660

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 3720

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 3780

agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 3840

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 3900

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 3960

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 4020

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aaggccggcc 4080

gcggccgcgc aaagtcccgc ttcgtgaaaa ttttcgtgcc gcgtgatttt ccgccaaaaa 4140

ctttaacgaa cgttcgttat aatggtgtca tgaccttcac gacgaagtac taaaattggc 4200

ccgaatcatc agctatggat ctctctgatg tcgcgctgga gtccgacgcg ctcgatgctg 4260

ccgtcgattt aaaaacggtg atcggatttt tccgagctct cgatacgacg gacgcgccag 4320

catcacgaga ctgggccagt gccgcgagcg acctagaaac tctcgtggcg gatcttgagg 4380

agctggctga cgagctgcgt gctcggccag cgccaggagg acgcacagta gtggaggatg 4440

caatcagttg cgcctactgc ggtggcctga ttcctccccg gcctgacccg cgaggacggc 4500

gcgcaaaata ttgctcagat gcgtgtcgtg ccgcagccag ccgcgagcgc gccaacaaac 4560

gccacgccga ggagctggag gcggctaggt cgcaaatggc gctggaagtg cgtcccccga 4 620

gcgaaatttt ggccatggtc gtcacagagc tggaagcggc agcgagaatt atcgcgatcg 4 680

tggcggtgcc cgcaggcatg acaaacatcg taaatgccgc gtttcgtgtg ccgtggccgc 4740

ccaggacgtg tcagcgccgc caccacctgc accgaatcgg cagcagcgtc gcgcgtcgaa 4800

aaagcgcaca ggcggcaaga agcgataagc tgcacgaata cctgaaaaat gttgaacgcc 48 60

ccgtgagcgg taactcacag ggcgtcggct aacccccagt ccaaacctgg gagaaagcgc 4920

tcaaaaatga ctctagcgga ttcacgagac attgacacac cggcctggaa attttccgct 4980

gatctgttcg acacccatcc cgagctcgcg ctgcgatcac gtggctggac gagcgaagac 5040

cgccgcgaat tcctcgctca cctgggcaga gaaaatttcc agggcagcaa gacccgcgac 5100

ttcgccagcg cttggatcaa agacccggac acggagaaac acagccgaag ttataccgag 5160

ttggttcaaa atcgcttgcc cggtgccagt atgttgctct gacgcacgcg cagcacgcag 5220

ccgtgcttgt cctggacatt gatgtgccga gccaccaggc cggcgggaaa atcgagcacg 5280

taaaccccga ggtctacgcg attttggagc gctgggcacg cctggaaaaa gcgccagctt 5340 ggatcggcgt gaatccactg agcgggaaat gccagctcat ctggctcatt gatccggtgt 5400 atgccgcagc aggcatgagc agcccgaata tgcgcctgct ggctgcaacg accgaggaaa 5460 tgacccgcgt tttcggcgct gaccaggctt tttcacatag gctgagccgt ggccactgca 5520 ctctccgacg atcccagccg taccgctggc atgcccagca caatcgcgtg gatcgcctag 5580 ctgatcttat ggaggttgct cgcatgatct caggcacaga aaaacctaaa aaacgctatg 5640 agcaggagtt ttctagcgga cgggcacgta tcgaagcggc aagaaaagcc actgcggaag 5700 caaaagcact tgccacgctt gaagcaagcc tgccgagcgc cgctgaagcg tctggagagc 5760 tgatcgacgg cgtccgtgtc ctctggactg ctccagggcg tgccgcccgt gatgagacgg 5820 cttttcgcca cgctttgact gtgggatacc agttaaaagc ggctggtgag cgcctaaaag 5880 acaccaaggg tcatcgagcc tacgagcgtg cctacaccgt cgctcaggcg gtcggaggag 5940 gccgtgagcc tgatctgccg ccggactgtg accgccagac ggattggccg cgacgtgtgc 6000 gcggctacgt cgctaaaggc cagccagtcg tccctgctcg tcagacagag acgcagagcc 6060 agccgaggcg aaaagctctg gccactatgg gaagacgtgg cggtaaaaag gccgcagaac 6120 gctggaaaga cccaaacagt gagtacgccc gagcacagcg agaaaaacta gctaagtcca 6180 gtcaacgaca agctaggaaa gctaaaggaa atcgcttgac cattgcaggt tggtttatga 6240 ctgttgaggg agagactggc tcgtggccga caatcaatga agctatgtct gaatttagcg 6300 tgtcacgtca gaccgtgaat agagcactta aggtctgcgg gcattgaact tccacgagga 6360 cgccgaaagc ttcccagtaa atgtgccatc tcgtaggcag aaaacggttc ccccgtaggg 6420 tctctctctt ggcctccttt ctaggtcggg ctgattgctc ttgaagctct ctaggggggc 6480 tcacaccata ggcagataac gttccccacc ggctcgcctc gtaagcgcac aaggactgct 6540 cccaaagatc ttcaaagcca ctgccgcgac tgccttcgcg aagccttgcc ccgcggaaat 6600 ttcctccacc gagttcgtgc acacccctat gccaagcttc tttcacccta aattcgagag 6660 attggattct taccgtggaa attcttcgca aaaatcgtcc cctgatcgcc cttgcgacgt 6720 tggcgtcggt gccgctggtt gcgcttggct tgaccgactt gatcagcggc cgctcgattt 6780

<210> 61 <211> 35 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <400> 61

gagagagaga cgcgtcccag tggctgagac gcatc 35

<210> 62 <211> 34 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador <400> 62

ctctctctgt cgacgaattc aatcttacgg cctg

<210> 63 <211> 4323 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

34

<220>

<223> Plasmideo <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: pCLiK5 MCS integrativo SacB (também aludido como pCIS)

<220>

<221> misc_feature <222> (457) .. (1248) <223> KanR

<220>

<221> misc_feature <222> (3840) .. (4302) <223> PsacB (complementar)

<220>

<221> misc_feature <222> (2418)..(3839) <223> SacB (complementar)

<220>

<221> misc_feature

<222> (15/5)..(2375)

<223> Ori-Ec (pMn) (complementar)

<400> 63

tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60

tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120

tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 180

cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 240

gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt 300

ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 360

ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 420

agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 480

gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca

540 atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 600 gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 660 tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 720 agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 780 cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 840 gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 900 gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 960 gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 1020 ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 1080 tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 1140 gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 1200 cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc 1260 tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca 1320 ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 1380 tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca cgctagcggc gcgccggccg 1440 gcccggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 1500 gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 1560 cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 1620 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 1680 cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 1740 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 1800 cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 1860 gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 1920 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 1980 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 2040 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 2100 tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 2160 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 2220 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 2280 ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 2340 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg ccgccatcgg 2400 cattttcttt tgcgttttta tttgttaact gttaattgtc cttgttcaag gatgctgtct 2460 ttgacaacag atgttttctt gcctttgatg ttcagcagga agctcggcgc aaacgttgat 2520 tgtttgtctg cgtagaatcc tctgtttgtc atatagcttg taatcacgac attgtttcct 2580 ttcgcttgag gtacagcgaa gtgtgagtaa gtaaaggtta catcgttagg atcaagatcc 2640 atttttaaca caaggccagt tttgttcagc ggcttgtatg ggccagttaa agaattagaa 2700 acataaccaa gcatgtaaat atcgttagac gtaatgccgt caatcgtcat ttttgatccg 2760 cgggagtcag tgaacaggta ccatttgccg ttcattttaa agacgttcgc gcgttcaatt 2820 tcatctgtta ctgtgttaga tgcaatcagc ggtttcatca cttttttcag tgtgtaatca 2880 tcgtttagct caatcatacc gagagcgccg tttgctaact cagccgtgcg ttttttatcg 2940 ctttgcagaa gtttttgact ttcttgacgg aagaatgatg tgcttttgcc atagtatgct 3000 ttgttaaata aagattcttc gccttggtag ccatcttcag ttccagtgtt tgcttcaaat 3060 actaagtatt tgtggccttt atcttctacg tagtgaggat ctctcagcgt atggttgtcg 3120 cctgagctgt agttgccttc atcgatgaac tgctgtacat tttgatacgt ttttccgtca 3180 ccgtcaaaga ttgatttata atcctctaca ccgttgatgt tcaaagagct gtctgatgct 3240 gatacgttaa cttgtgcagt tgtcagtgtt tgtttgccgt aatgtttacc ggagaaatca 3300 gtgtagaata aacggatttt tccgtcagat gtaaatgtgg ctgaacctga ccattcttgt 3360 gtttggtctt ttaggataga atcatttgca tcgaatttgt cgctgtcttt aaagacgcgg 3420 ccagcgtttt tccagctgtc aatagaagtt tcgccgactt tttgatagaa catgtaaatc 3480 gatgtgtcat ccgcattttt aggatctccg gctaatgcaa agacgatgtg gtagccgtga 3540 tagtttgcga cagtgccgtc agcgttttgt aatggccagc tgtcccaaac gtccaggcct 3600 tttgcagaag agatattttt aattgtggac gaatcaaatt cagaaacttg atatttttca 3660 tttttttgct gttcagggat ttgcagcata tcatggcgtg taatatggga aatgccgtat 3720 gtttccttat atggcttttg gttcgtttct ttcgcaaacg cttgagttgc gcctcctgcc 3780 agcagtgcgg tagtaaaggt taatactgtt gcttgttttg caaacttttt gatgttcatc 3840 gttcatgtct ccttttttat gtactgtgtt agcggtctgc ttcttccagc cctcctgttt 3900 gaagatggca agttagttac gcacaataaa aaaagaccta aaatatgtaa ggggtgacgc 3960 caaagtatac actttgccct ttacacattt taggtcttgc ctgctttatc agtaacaaac 4020 ccgcgcgatt tacttttcga cctcattcta ttagactctc gtttggattg caactggtct 4080 attttcctct tttgtttgat agaaaatcat aaaaggattt gcagactacg ggcctaaaga 4140 actaaaaaat ctatctgttt cttttcattc tctgtatttt ttatagtttc tgttgcatgg 4200 gcataaagtt gcctttttaa tcacaattca gaaaatatca taatatctca tttcactaaa 4260 taatagtgaa cggcaggtat atgtgatggg ttaaaaagga tcggcggccg ctcgatttaa 4320 ate 4323

<210> 64 <211> 5860 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo <220>

<221> misc_feature <222> (155)..(1420) <223> IysC

<220>

<221> misc_feature

<222> (3935)..(5356)

<223> saes (Bacillus subtilis)

<220>

<221> misc_feature

<222> (5357)..(5819)

<223> Promotor sacB complemento

<220>

<221> misc_feature <222> (1974) .. (2765) <223> kanR

<220>

<221> misc_feature <222> (3032)..(3892) <223> Ori-EC complement

<220>

<221> misc_feature <222> (3913)..(3934)

<223> região saes a jusante (complemento) <400> 64

cccggtacca cgcgtcccag tggctgagac gcatccgcta aagccccagg aaccctgtgc 60 agaaagaaaa cactcctctg gctaggtaga cacagtttat aaaggtagag ttgagcgggt 120 aactgtcagc acgtagatcg aaaggtgcac aaaggtggcc ctggtcgtac agaaatatgg 180 cggttcctcg cttgagagtg cggaacgcat tagaaacgtc gctgaacgga tcgttgccac 240 caagaaggct ggaaatgatg tcgtggttgt ctgctccgca atgggagaca ccacggatga 300 acttctagaa cttgcagcgg cagtgaatcc cgttccgcca gctcgtgaaa tggatatgct 360 cctgactgct ggtgagcgta tttctaacgc tctcgtcgcc atggctattg agtcccttgg 420 cgcagaagcc caatctttca cgggctctca ggctggtgtg ctcaccaccg agcgccacgg 480 aaacgcacgc attgttgatg tcactccagg tcgtgtgcgt gaagcactcg atgagggcaa 540 gatctgcatt gttgctggtt tccagggtgt taataaagaa acccgcgatg tcaccacgtt 600 gggtcgtggt ggttctgaca ccactgcagt tgcgttggca gctgctttga acgctgatgt 660 gtgtgagatt tactcggacg ttgacggtgt gtataccgct gacccgcgca tcgttcctaa 720 tgcacagaag ctggaaaagc tcagcttcga agaaatgctg gaacttgctg ctgttggctc 780 caagattttg gtgctgcgca gtgttgaata cgctcgtgca ttcaatgtgc cacttcgcgt 840 acgctcgtct tatagtaatg atcccggcac tttgattgcc ggctctatgg aggatattcc 900 tgtggaagaa gcagtcctta ccggtgtcgc aaccgacaag tccgaagcca aagtaaccgt 960 tctgggtatt tccgataagc caggcgaggc tgcgaaggtt ttccgtgcgt tggctgatgc 1020 agaaatcaac attgacatgg ttctgcagaa cgtctcttct gtagaagacg gcaccaccga 1080 catcaccttc acctgccctc gttccgacgg ccgccgcgcg atggagatct tgaagaagct 1140 tcaggttcag ggcaactgga ccaatgtgct ttacgacgac caggtcggca aagtctccct 1200 cgtgggtgct ggcatgaagt ctcacccagg tgttaccgca gagttcatgg aagctctgcg 1260 cgatgtcaac gtgaacatcg aattgatttc cacctctgag attcgtattt ccgtgctgat 1320 ccgtgaagat gatctggatg ctgctgcacg tgcattgcat gagcagttcc agctgggcgg 1380 cgaagacgaa gccgtcgttt atgcaggcac cggacgctaa agttttaaag gagtagtttt 1440 acaatgacca ccatcgcagt tgttggtgca accggccagg tcggccaggt tatgcgcacc 1500 cttttggaag agcgcaattt cccagctgac actgttcgtt tctttgcttc cccacgttcc 1560 gcaggccgta agattgaatt cgtcgacatc gatgctcttc tgcgttaatt aacaattggg 1620 atcctctaga cccgggattt aaatcgctag cgggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga 1680 aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga 1740 caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat 1800 agctagactg ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct 1860 ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct 1920 gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 1980 aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 2040 actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 2100 ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg 2160 aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 2220 ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 2280 tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 2340 tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 2400 gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 2460 aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg 2520 atptcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 2580 tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 2640 tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 2700 tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 2760 tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc 2820 acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg 2880 ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccacgc 2940 tagcggcgcg ccggccggcc cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 3000 gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 3060 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 3120 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 3180 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 3240 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 3300 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 3360 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 3420 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 3480 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 3540 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 3600 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 3660 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 3720 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 3780 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 3840 aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaaggccg 3900 gccgcggccg ccatcggcat tttcttttgc gtttttattt gttaactgtt aattgtcctt 3960 gttcaaggat gctgtctttg acaacagatg ttttcttgcc tttgatgttc agcaggaagc 4020 tcggcgcaaa cgttgattgt ttgtctgcgt agaatcctct gtttgtcata tagcttgtaa 4080 tcacgacatt gtttcctttc gcttgaggta cagcgaagtg tgagtaagta aaggttacat 4140 cgttaggatc aagatccatt tttaacacaa ggccagtttt gttcagcggc ttgtatgggc 4200 cagttaaaga attagaaaca taaccaagca tgtaaatatc gttagacgta atgccgtcaa 4260 tcgtcatttt tgatccgcgg gagtcagtga acaggtacca tttgccgttc attttaaaga 4320 cgttcgcgcg ttcaatttca tctgttactg tgttagatgc aatcagcggt ttcatcactt 4380 tt-ttcagtgt gtaatcatcg tttagctcaa tcataccgag agcgccgttt gctaactcag 4440 ccgtgcgttt tttatcgctt tgcagaagtt tttgactttc ttgacggaag aatgatgtgc 4500 ttttgccata gtatgctttg ttaaataaag attcttcgcc ttggtagcca tcttcagttc 4560 cagtgtttgc ttcaaatact aagtatttgt ggcctttatc ttctacgtag tgaggatctc 4620 tcagcgtatg gttgtcgcct gagctgtagt tgccttcatc gatgaactgc tgtacatttt 4680 gatacgtttt tccgtcaccg tcaaagattg atttataatc ctctacaccg ttgatgttca 4740 aagagctgtc tgatgctgat acgttaactt gtgcagttgt cagtgtttgt ttgccgtaat 4800 gtttaccgga gaaatcagtg tagaataaac ggatttttcc gtcagatgta aatgtggctg 4860 aacctgacca ttcttgtgtt tggtctttta ggatagaatc atttgcatcg aatttgtcgc 4920 tgtctttaaa gacgcggcca gcgtttttcc agctgtcaat agaagtttcg ccgacttttt 4980 gatagaacat gtaaatcgat gtgtcatccg catttttagg atctccggct aatgcaaaga 5040 cgatgtggta gccgtgatag tttgcgacag tgccgtcagc gttttgtaat ggccagctgt 5100 cccaaacgtc caggcctttt gcagaagaga tatttttaat tgtggacgaa tcaaattcag 5160 aaacttgata tttttcattt ttttgctgtt cagggatttg cagcatatca tggcgtgtaa 5220 tatgggaaat gccgtatgtt tccttatatg gcttttggtt cgtttctttc gcaaacgctt 5280 gagttgcgcc tcctgccagc agtgcggtag taaaggttaa tactgttgct tgttttgcaa 5340 actttttgat gttcatcgtt catgtctcct tttttatgta ctgtgttagc ggtctgcttc 5400 ttccagccct cctgtttgaa gatggcaagt tagttacgca caataaaaaa agacctaaaa 5460 tatgtaaggg gtgacgccaa agtatacact ttgcccttta cacattttag gtcttgcctg 5520 ctttatcagt aacaaacccg cgcgatttac ttttcgacct cattctatta gactctcgtt 5580 tggattgcaa ctggtctatt ttcctctttt gtttgataga aaatcataaa aggatttgca 5640 gactacgggc ctaaagaact aaaaaatcta tctgtttctt ttcattctct gtatttttta 5700 tagtttctgt tgcatgggca taaagttgcc tttttaatca caattcagaa aatatcataa 5760 tatctcattt cactaaataa tagtgaacgg caggtatatg tgatgggtta aaaaggatcg 5820 gcggccgctc gatttaaatc tcgagaggcc tgacgtcggg 5860 <210> 65 <211> 38 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Iniciador <400> 65 cggcaccacc gacatcatct tcacctgccc tcgttccg 38 <210> 66 <211> 38 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <400> 66

cggaacgagg gcaggtgaag atgatgtcgg tggtgccg 38

<210> 67 <211> 1263 <212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> misc_feature <223> gene IysC

<400> 67

gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60 aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120 tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180 ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240 gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300 ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360 gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420 aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480 ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540 accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600 atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660 cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720 attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780 gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840 aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900 tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960 cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020 gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080 accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140 tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200 ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260

cgc 1263

<210> 68 <211> 5860 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: pCIS sysC thr311ile <220>

<221> misc_feature <222> (155)..(1420) <223> IysC

<220>

<221> misc_feature <222> (3935)..(5356)

<223> sacB (Bacillus subtilis) complemento <220>

<221> misc_feature

<222> (5357)..(5819)

<223> Promotor sacB complemento

<220>

<221> misc_feature <222> (1974)..(2765) <223> kanR

<220>

<221> misc_feature <222> (3032)..(3892) <223> on-EC complemento

<400> 68

cccggtacca cgcgtcccag tggctgagac gcatccgcta aagccccagg aaccctgtgc 60

agaaagaaaa cactcctctg gctaggtaga cacagtttat aaaggtagag ttgagcgggt 120

aactgtcagc acgtagatcg aaaggtgcac aaaggtggcc ctggtcgtac agaaatatgg 180

cggttcctcg cttgagagtg cggaacgcat tagaaacgtc gctgaacgga tcgttgccac 240

caagaaggct ggaaatgatg tcgtggttgt ctgctccgca atgggagaca ccacggatga 300

acttctagaa cttgcagcgg cagtgaatcc cgttccgcca gctcgtgaaa tggatatgct 360

cctgactgct ggtgagcgta tttctaacgc tctcgtcgcc atggctattg agtcccttgg 420

cgcagaagcc caatctttca cgggctctca ggctggtgtg ctcaccaccg agcgccacgg 480

aaacgcacgc attgttgatg tcactccagg tcgtgtgcgt gaagcactcg atgagggcaa 540

gatctgcatt gttgctggtt tccagggtgt taataaagaa acccgcgatg tcaccacgtt

600 gggtcgtggt ggttctgaca ccactgcagt tgcgttggca gctgctttga acgctgatgt 660 gtgtgagatt tactcggacg ttgacggtgt gtataccgct gacccgcgca tcgttcctaa 720 tgcacagaag ctggaaaagc tcagcttcga agaaatgctg gaacttgctg ctgttggctc 780 caagattttg gtgctgcgca gtgttgaata cgctcgtgca ttcaatgtgc cacttcgcgt 840 acgctcgtct tatagtaatg atcccggcac tttgattgcc ggctctatgg aggatattcc 900 tgtggaagaa gcagtcctta ccggtgtcgc aaccgacaag tccgaagcca aagtaaccgt 960 tctgggtatt tccgataagc caggcgaggc tgcgaaggtt ttccgtgcgt tggctgatgc 1020 agaaatcaac attgacatgg ttctgcagaa cgtctcttct gtagaagacg gcaccaccga 1080 catcatcttc acctgccctc gttccgacgg ccgccgcgcg atggagatct tgaagaagct 1140 tcaggttcag ggcaactgga ccaatgtgct ttacgacgac caggtcggca aagtctccct 1200 cgtgggtgct ggcatgaagt ctcacccagg tgttaccgca gagttcatgg aagctctgcg 1260 cgatgtcaac gtgaacatcg aattgatttc cacctctgag attcgtattt ccgtgctgat 1320 ccgtgaagat gatctggatg ctgctgcacg tgcattgcat gagcagttcc agctgggcgg 1380 cgaagacgaa gccgtcgttt atgcaggcac cggacgctaa agttttaaag gagtagtttt 1440 acaatgacca ccatcgcagt tgttggtgca accggccagg tcggccaggt tatgcgcacc 1500 cttttggaag agcgcaattt cccagctgac actgttcgtt tctttgcttc cccacgttcc 1560 gcaggccgta agattgaatt cgtcgacatc gatgctcttc tgcgttaatt aacaattggg 1620 atcctctaga cccgggattt aaatcgctag cgggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga 1680 aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga 1740 caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat 1800 agctagactg ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct 1860 ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct 1920 gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 1980 aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 2040 actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 2100 ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg 2160 aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 2220 ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 2280 tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 2340 tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 2400 gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 2460 aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg 2520 atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 2580 tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 2640 tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 2700 tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 2760 tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc 2820 acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg 2880 ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccacgc 2940 tagcggcgcg ccggccggcc cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 3000 gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 3060 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 3120 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 3180 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 3240 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 3300 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 3360 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 3420 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 3480 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 3540 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 3600 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 3660 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 3720 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 3780 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 3840 aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaaggccg 3900 gccgcggccg ccatcggcat tttcttttgc gtttttattt gttaactgtt aattgtcctt 3960 gttcaaggat gctgtctttg acaacagatg ttttcttgcc tttgatgttc agcaggaagc 4020 tcggcgcaaa cgttgattgt ttgtctgcgt agaatcctct gtttgtcata tagcttgtaa 4080 tcacgacatt gtttcctttc gcttgaggta cagcgaagtg tgagtaagta aaggttacat 4140 cgttaggatc aagatccatt tttaacacaa ggccagtttt gttcagcggc ttgtatgggc 4200 cagttaaaga attagaaaca taaccaagca tgtaaatatc gttagacgta atgccgtcaa 4260 tcgtcatttt tgatccgcgg gagtcagtga acaggtacca tttgccgttc attttaaaga 4320 cgttcgcgcg ttcaatttca tctgttactg tgttagatgc aatcagcggt ttcatcactt 4380 ttttcagtgt gtaatcatcg tttagctcaa tcataccgag agcgccgttt gctaactcag 4440 ccgtgcgttt tttatcgctt tgcagaagtt tttgactttc ttgacggaag aatgatgtgc 4500 ttttgccata gtatgctttg ttaaataaag attcttcgcc ttggtagcca tcttcagttc 4560 cagtgtttgc ttcaaatact aagtatttgt ggcctttatc ttctacgtag tgaggatctc 4620 tcagcgtatg gttgtcgcct gagctgtagt tgccttcatc gatgaactgc tgtacatttt 4680 gatacgtttt tccgtcaccg tcaaagattg atttataatc ctctacaccg ttgatgttca 4740 aagagctgtc tgatgctgat acgttaactt gtgcagttgt cagtgtttgt ttgccgtaat 4800 gtttaccgga gaaatcagtg tagaataaac ggatttttcc gtcagatgta aatgtggctg 4860 aacctgacca ttcttgtgtt tggtctttta ggatagaatc atttgcatcg aatttgtcgc 4920 tgtctttaaa gacgcggcca gcgtttttcc agctgtcaat agaagtttcg ccgacttttt 4980 gatagaacat gtaaatcgat gtgtcatccg catttttagg atctccggct aatgcaaaga 5040 cgatgtggta gccgtgatag tttgcgacag tgccgtcagc gttttgtaat ggccagctgt 5100 cccaaacgtc caggcctttt gcagaagaga tatttttaat tgtggacgaa tcaaattcag 5160 aaacttgata tttttcattt ttttgctgtt cagggatttg cagcatatca tggcgtgtaa 5220 tatgggaaat gccgtatgtt tccttatatg gcttttggtt cgtttctttc gcaaacgctt 5280 gagttgcgcc tcctgccagc agtgcggtag taaaggttaa tactgttgct tgttttgcaa 5340 actttttgat gttcatcgtt catgtctcct tttttatgta ctgtgttagc ggtctgcttc 5400 ttccagccct cctgtttgaa gatggcaagt tagttacgca caataaaaaa agacctaaaa 5460 tatgtaaggg gtgacgccaa agtatacact ttgcccttta cacattttag gtcttgcctg 5520 ctttatcagt aacaaacccg cgcgatttac ttttcgacct cattctatta gactctcgtt 5580 tggattgcaa ctggtctatt ttcctctttt gtttgataga aaatcataaa aggatttgca 5640 gactacgggc ctaaagaact aaaaaatcta tctgtttctt ttcattctct gtatttttta 5700 tagtttctgt tgcatgggca taaagttgcc tttttaatca caattcagaa aatatcataa 5760 tatctcattt cactaaataa tagtgaacgg caggtatatg tgatgggtta aaaaggatcg 5820 gcggccgctc gatttaaatc tcgagaggcc tgacgtcggg 5860

<210> 69 <211> 29 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: 01d38

<400> 69 acatccatgg tggccgttac cctgcgaat

<210> 70 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: Old 39

<400> 70

tgtatgtcct cctggacttc

<210> 71 <211> 40 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: 01d40

<400> 71

gaagtccagg aggacataca atgaccaaca tccgcgtagc

<210> 72 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: Old 37

<400> 72

gaaaccacac tgtttccttg c

<210> 73 <211> 31 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: Old 32 <400> 73

atcaacgcgt cgacaccaca tcatcaatca c 31

<210> 74 <211> 33 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: 01d33

<400> 74

atcaccatgg gttcttgtaa tcctccaaaa ttg 33

<210> 75 <211> 6187 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: pCIS Peftu ddh (pCLiK int sacs Peftu ddh)

<400> 75

tcgagctaaa ttagacgtcg cgtgcgatca gatcgtccaa gttctctggg gagagcaggt 60 atggagcaac ttcgaggacg gtgaaagctc cgctttggcc ctgctgcttc atgcggtgag 120 ctgcgcgacc gaaagcgatc tgtgaggaag cggtgaaatc tgggtttcgg tccagcttga 180 ggatgtattc cacggtgtgg ttgaagccac cggtgtcgcc ggtggtaatc acgtggccac 240 cgtgtggcat gccggtgtgc tcggagtcga aggttgcttc gtcgatgaag ttgacttcga 300 cttcgtagcc aacgaagtaa tcaggcatgg tgcggatgtc gttttcgatg cgctcgtgat 360 cggccgcgtc ggcaaccacg aagcattggc gcttgtgggt ttgctttccg gtaaggtcgc 420 cggcttcgcc gcggcgggcc ttttccaggg cgtcttcgga tgggagggtg tactggactg 480 ccttttgaac gccagggatg cgtcgcaaag catcggagtg gccctgtgac aaacctgggc 540 cccagaaggt gtgctgctgg tgctcggcta agactgccgc tgcgtagacg cggttgatgg 600 agaacattcc tggatcccag ccggtagaga ccagtgcaac gttgccggct gcggtggcgg 660 cttcgttcat gacctggcgg tggcgtggga tgtcgcggtg gttgtcgtag gtgtctacgg 720 tgcaggcgaa ctgcgcgaac tttggtgcct gctcagggat gtcggtggcg gagcccatgc 780 acaggaacag cacgtccacg tcgtcggcgt gcttgtccac gtcggcgaca tcaaagactg 840 gcgtctttgt gtcgagggtg gcccggcgcg agaagattcc tacaaggtcc atgtcgggct 900 gcttggcaat aagcttttcg acgctgcgtc ccaggtttcc gtagcccacg atagctacgc 960

ggatgttggt cattgtatgt cctcctggac ttcgtggtgg ctacgacttt cgcagccacg 1020

aattggtttt gctttcactg tgataagcag cctggaagac tgagcacaca gatctagcgc 1080

attacaaaat gtgccagtta ctgaatccta agggcaacgg cgttgatttt caaactacca 1140

gctaccctgt ggacattcgc agggtaacgg ccaccatggg ttcttgtaat cctccaaaat 1200

tgtggtggca ctgtcctggt cgagcttacc gagatgcata cttagatgat gattcaggga 1260

catctctttc atcaggaccg aaagcgaacg tttcgtattg ttgagccttt tggttccacc 1320

acggatgcgc tgatctattt tcatggctcc cagcagtcag gatctgtggg gcgcagcttc 1380

accaacagga cttttgatcc gttgccgttc atggtggttt atccggatgg ggtggatcag 1440

cattggaatg atgcgcggtt gggtttggat gaaaataccc gccatttagg cattgatgat 1500

gtggggttct ttgtaaaact cgccacgcac ttgggcaaca cgtatggcat caagaggatc 1560

tttattgttg gctattccaa cggtgggcag atggtgttgc ggctcatgca tgaggttccc 1620

aagatgctca gtggcgctgc aaccattgca tccaacatgc cagttgcaga gaatacgctg 1680

ccgcaggtga aaaccttcaa gacacatccg gtgccttatt tggcgatggc tggaactgcc 1740

gatacttttt caccgtatga gggtggcgat gccggtattg gtcgcgaaca ccgccgtggc 1800

gtgggcatgt ccgcctttga ttcagctgcc tatattgccg cccgaaacgg actgaccgaa 1860

caccgccacg acgtgattga tgatgtggtg tcgacgcgtc atatgactag ttcggaccta 1920

gggatatcgt cgacatcgat gctcttctgc gttaattaac aattgggatc ctctagaccc 1980

gggatttaaa tcgctagcgg gctgctaaag gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca 2040

gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc 2100

aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc 2160

ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg 2220

gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg 2280

atcaagatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt 2340

gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca 2400

gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct 24 60

ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct 2520

atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc 2580

gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct 2640

tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga 2700

tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg 27 60 gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc 2820 agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac 2880 ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat 2940 cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga 3000 tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc 3060 cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg 3120 actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat 3180 tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg 3240 atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccacgctag cggcgcgccg 3300 gccggcccgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc 3360 ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 3420 agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 3480 catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 3540 tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 3600 gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 3660 ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 3720 cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 3780 caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 3840 ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 3900 taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 3960 taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 4020 cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 4080 tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 4140 gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 4200 catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aaggccggcc gcggccgcca 4260 tcggcatttt cttttgcgtt tttatttgtt aactgttaat tgtccttgtt caaggatgct 4320 gtctttgaca acagatgttt tcttgccttt gatgttcagc aggaagctcg gcgcaaacgt 4380 tgattgtttg tctgcgtaga atcctctgtt tgtcatatag cttgtaatca cgacattgtt 4440 tcctttcgct tgaggtacag cgaagtgtga gtaagtaaag gttacatcgt taggatcaag 4500 atccattttt aacacaaggc cagttttgtt cagcggcttg tatgggccag ttaaagaatt 4560 agaaacataa ccaagcatgt aaatatcgtt agacgtaatg ccgtcaatcg tcatttttga 4620 tccgcgggag tcagtgaaca ggtaccattt gccgttcatt ttaaagacgt tcgcgcgttc 4680 aatttcatct gttactgtgt tagatgcaat cagcggtttc atcacttttt tcagtgtgta 4740 atcatcgttt agctcaatca taccgagagc gccgtttgct aactcagccg tgcgtttttt 4800 atcgctttgc agaagttttt gactttcttg acggaagaat gatgtgcttt tgccatagta 4860 tgctttgtta aataaagatt cttcgccttg gtagccatct tcagttccag tgtttgcttc 4920 aaatactaag tatttgtggc ctttatcttc tacgtagtga ggatctctca gcgtatggtt 4980 gtcgcctgag ctgtagttgc cttcatcgat gaactgctgt acattttgat acgtttttcc 5040 gtcaccgtca aagattgatt tataatcctc tacaccgttg atgttcaaag agctgtctga 5100 tgctgatacg ttaacttgtg cagttgtcag tgtttgtttg ccgtaatgtt taccggagaa 5160 atcagtgtag aataaacgga tttttccgtc agatgtaaat gtggctgaac ctgaccattc 5220 ttgtgtttgg tcttttagga tagaatcatt tgcatcgaat ttgtcgctgt ctttaaagac 5280 gcggccagcg tttttccagc tgtcaataga agtttcgccg actttttgat agaacatgta 5340 aatcgatgtg tcatccgcat ttttaggatc tccggctaat gcaaagacga tgtggtagcc 5400 gtgatagttt gcgacagtgc cgtcagcgtt ttgtaatggc cagctgtccc aaacgtccag 5460 gccttttgca gaagagatat ttttaattgt ggacgaatca aattcagaaa cttgatattt 5520 ttcatttttt tgctgttcag ggatttgcag catatcatgg cgtgtaatat gggaaatgcc 5580 gtatgtttcc ttatatggct tttggttcgt ttctttcgca aacgcttgag ttgcgcctcc 5640 tgccagcagt gcggtagtaa aggttaatac tgttgcttgt tttgcaaact ttttgatgtt 5700 catcgttcat gtctcctttt ttatgtactg tgttagcggt ctgcttcttc cagccctcct 5760 gtttgaagat ggcaagttag ttacgcacaa taaaaaaaga cctaaaatat gtaaggggtg 5820 acgccaaagt atacactttg ccctttacac attttaggtc ttgcctgctt tatcagtaac 5880 aaacccgcgc gatttacttt tcgacctcat tctattagac tctcgtttgg attgcaactg 5940 gtctattttc ctcttttgtt tgatagaaaa tcataaaagg atttgcagac tacgggccta 6000 aagaactaaa aaatctatct gtttcttttc attctctgta ttttttatag tttctgttgc 6060 atgggcataa agttgccttt ttaatcacaa ttcagaaaat atcataatat ctcatttcac 6120 taaataatag tgaacggcag gtatatgtga tgggttaaaa aggatcggcg gccgctcgat 6180 ttaaatc 6187

<210> 76 <211> 29 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <220> <221> misc_feature

<223> designação interna: CK4 61

<400> 76

cctgacgtcg caatataggc agctgaatc 29

<210> 77 <211> 29 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: CE466

<400> 77

gcccaattgg ttcttgtaat cctccaaaa 29

<210> 79 <211> 26 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: CK426

<400> 78

cgccaattgt cgagggccgt taccct 26

<210> 79 <211> 40 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: CK463

<400> 79

gctacgcgga tgttggtcat gggtaaaaaa tcctttcgta 40

<210> 80 <211> 40 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: CR4 64

<400> 80

tacgaaagga ttttttaccc atgaccaaca tccgcgtagc 40

<210> 81 <211> 29 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador <220>

<221> misc_feature

<223> designação internai: CK467

<400> 81

agaGccgggt tagacgtcgc gtgcgatca 29

<210> 82 <211> 6233 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo <220>

<221> misc_feature

<223> designação interna: pCIS PeftuPsod ddh = pClik int sacB PeftuPs od ddh

<400> 82

gggatttaaa tcgctagcgg gctgctaaag gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca 60 gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc 120 aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc 180 ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg 240 gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg 300 atcaagatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt 360 gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca 420 gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct 480 ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct 540 atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc 600 gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct 660 tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga 720 tcçggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg 780 gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc 840 agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac 900 ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat 960 cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga 1020 tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc 1080 cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg 1140 actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat 1200 tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg 1260 atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccacgctag cggcgcgccg 1320 gccggcccgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc 1380 ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 1440 agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 1500 catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 1560 tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 1620 gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 1680 ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 1740 cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 1800 caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 1860 ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 1920 taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 1980 taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 2040 cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 2100 tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 2160 gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 2220 catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aaggccggcc gcggccgcca 2280 tcggcatttt cttttgcgtt tttatttgtt aactgttaat tgtccttgtt caaggatgct 2340 gtctttgaca acagatgttt tcttgccttt gatgttcagc aggaagctcg gcgcaaacgt 2400 tgattgtttg tctgcgtaga atcctctgtt tgtcatatag cttgtaatca cgacattgtt 2460 tcctttcgct tgaggtacag cgaagtgtga gtaagtaaag gttacatcgt taggatcaag 2520 atccattttt aacacaaggc cagttttgtt cagcggcttg tatgggccag ttaaagaatt 2580 agaaacataa ccaagcatgt aaatatcgtt agacgtaatg ecgtcaatcg tcatttttga 2640

tccgcgggag tcagtgaaca ggtaccattt gccgttcatt ttaaagacgt tcgcgcgttc 2700

aatttcatct gttactgtgt tagatgcaat cagcggtttc atcacttttt tcagtgtgta 2760

atcatcgttt agctcaatca taccgagagc gccgtttgct aactcagccg tgcgtttttt 2820

atcgctttgc agaagttttt gactttcttg acggaagaat gatgtgcttt tgccatagta 2880

tgctttgtta aataaagatt cttcgccttg gtagccatct tcagttccag tgtttgcttc 2940

aaatactaag tatttgtggc ctttatcttc tacgtagtga ggatctctca gcgtatggtt 3000

gtcgcctgag ctgtagttgc cttcatcgat gaactgctgt acattttgat acgtttttcc 3060

gtcaccgtca aagattgatt tataatcctc tacaccgttg atgttcaaag agctgtctga 3120

tgctgatacg ttaacttgtg cagttgtcag tgtttgtttg ccgtaatgtt taccggagaa 3180

atcagtgtag aataaacgga tttttccgtc agatgtaaat gtggctgaac ctgaccattc 3240

ttgtgtttgg tcttttagga tagaatcatt tgcatcgaat ttgtcgctgt ctttaaagac 3300

gcggccagcg tttttccagc tgtcaataga agtttcgccg actttttgat agaacatgta 3360

aatcgatgtg tcatccgcat ttttaggatc tccggctaat gcaaagacga tgtggtagcc 3420

gtgatagttt gcgacagtgc cgtcagcgtt ttgtaatggc cagctgtccc aaacgtccag 3480

gccttttgca gaagagatat ttttaattgt ggacgaatca aattcagaaa cttgatattt 3540

ttcatttttt tgctgttcag ggatttgcag catatcatgg cgtgtaatat gggaaatgcc 3600

gtatgtttcc ttatatggct tttggttcgt ttctttcgca aacgcttgag ttgcgcctcc 3660

tgccagcagt gcggtagtaa aggttaatac tgttgcttgt tttgcaaact ttttgatgtt 3720

catcgttcat gtctcctttt ttatgtactg tgttagcggt ctgcttcttc cagccctcct 3780

gtttgaagat ggcaagttag ttacgcacaa taaaaaaaga cctaaaatat gtaaggggtg 3840

acgccaaagt atacactttg ccctttacac attttaggtc ttgcctgctt tatcagtaac 3900

aaacccgcgc gatttacttt tcgacctcat tctattagac tctcgtttgg attgcaactg 3960

gtctattttc ctcttttgtt tgatagaaaa tcataaaagg atttgcagac tacgggccta 4020

aagaactaaa aaatctatct gtttcttttc attctctgta ttttttatag tttctgttgc 4080

atgggcataa agttgccttt ttaatcacaa ttcagaaaat atcataatat ctcatttcac 4140

taaataatag tgaacggcag gtatatgtga tgggttaaaa aggatcggcg gccgctcgat 4200

ttaaatctcg agaggcctga cgtcgcaata taggcagctg aatcaaaggc ggacatgccc 4260

acgccacggc ggtgttcgcg accaataccg gcatcgccac cctcatacgg tgaaaaagta 4320

tcggcagttc cagccatcgc caaataaggc accggatgtg tcttgaaggt tttcacctgc ggcagcgtat tctctgcaac tggcatgttg gatgcaatgg ttgcagcgcc actgagcatc

4380 4440 ttgggaacct catgcatgag ccgcaacacc atctgcccac cgttggaata gccaacaata 4500

aagatcctct tgatgccata cgtgttgccc aagtgcgtgg cgagttttac aaagaacccc 4560

acatcatcaa tgcctaaatg gcgggtattt tcatccaaac ccaaccgcgc atcattccaa 4 620

tgctgatcca ccccatccgg ataaaccacc atgaacggca acggatcaaa agtcctgttg 4 680

gtgaagctgc gccccacaga tcctgactgc tgggagccat gaaaatagat cagcgcatcc 4740

gtggtggaac caaaaggctc aacaatacga aacgttcgct ttcggtcctg atgaaagaga 4800

tgtccctgaa tcatcatcta agtatgcatc tcggtaagct cgaccaggac agtgccacca 4860

caattttgga ggattacaag aaccaattgt cgagggccgt taccctgcga atgtccacag 4920

ggtagctggt agtttgaaaa tcaacgccgt tgcccttagg attcagtaac tggcacattt 4 980

tgtaatgcgc tagatctgtg tgctcagtct tccaggctgc ttatcacagt gaaagcaaaa 5040

ccaattcgtg gctgcgaaag tcgtagccac actagtagct gccaattatt ccgggcttgt 5100

gacccgctac ccgataaata ggtcggctga aaaatttcgt tgcaatatca acaaaaaggc 5160

ctatcattgg gaggtgtcgc accaagtact tttgcgaagc gccatctgac ggattttcaa 5220

aagatgtata tgctcggtgc ggaaacctac gaaaggattt tttacccatg accaacatcc 5280

gcgtagctat cgtgggctac ggaaacctgg gacgcagcgt cgaaaagctt attgccaagc 5340

agcccgacat ggaccttgta ggaatcttct cgcgccgggc caccctcgac acaaagacgc 5400

cagtctttga tgtcgccgac gtggacaagc acgccgacga cgtggacgtg ctgttcctgt 54 60

gcatgggctc cgccaccgac atccctgagc aggcaccaaa gttcgcgcag ttcgcctgca 5520

ccgtagacac ctacgacaac caccgcgaca tcccacgcca ccgccaggtc atgaacgaag 5580

ccgccaccgc agccggcaac gttgcactgg tctctaccgg ctgggatcca ggaatgttct 5640

ccatcaaccg cgtctacgca gcggcagtct tagccgagca ccagcagcac accttctggg 5700

gcccaggttt gtcacagggc cactccgatg ctttgcgacg catccctggc gttcaaaagg 5760

cagtccagta caccctccca tccgaagacg ccctggaaaa ggcccgccgc ggcgaagccg 5820

gcgaccttac cggaaagcaa acccacaagc gccaatgctt cgtggttgcc gacgcggccg 5880

atcacgagcg catcgaaaac gacatccgca ccatgcctga ttacttcgtt ggctacgaag 5940

tcgaagtcaa cttcatcgac gaagcaacct tcgactccga gcacaccggc atgccacacg 6000

gtggccacgt gattaccacc ggcgacaccg gtggcttcaa ccacaccgtg gaatacatcc 6060

tcaagctgga ccgaaaccca gatttcaccg cttcctcaca gatcgctttc ggtcgcgcag 6120

ctcaccgcat gaagcagcag ggccaaagcg gagctttcac cgtcctcgaa gttgctccat 6180

acctgctctc cccagagaac ttggacgatc tgatcgcacg cgacgtctaa ccc 6233

<210> 83 <211> 7 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> misc_feature

<223> seqüência de ligação de ribossoma <400> 83

aggagga 7

<210> 84 <211> 1365 <212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> misc_feature <223> RAX077

<400> 84

atgaatgatg agaatattca aagctccaac tatcagccat tcccgagttt tgacgattgg 60 aaacagatcg aggtgtcgct cttagatgtc atcgaatcct cacgccattt ttctgatttg 120 aaagatagca ctgatcgttc tgcgttagat gctgcgctag agagagcaaa aagagctgcc 180 gcagttgata ccaatgccat agaaggaatc ttccaaactg atcgcggttt tacccataca 240 gttgcaacgc aggtaggggc ttgggagcaa caaatggcga tgaaaggcaa acatgttaag 300 cctgcgtttg acgatactct agaaggcttt gagtatgttc tcgatgcagt aactggtaga 360 actccaatct ctcagcaatg gattagaaat ttgcacgccg tcattctgcg gagccaagaa 420 agccacgagg tttttacagc cgttggagtc caaaatcagg cgcttcagaa aggcgagtat 480 aaaactcagc caaatagtcc acagcgctca gatggatctg tacatgcata cgccccagtt 540 gaagatactc ctgctgaaat ggctagattt atttcagaac ttgaatctaa ggaattctta 600 gcagccgaga aggttattca agctgcctat gcccactatg ctttcgtatg tattcatcct 660 tttgcagatg ggaatggacg agttgcacga gccttggcta gtgtttttct atacaaagat 720 cctggtgtcc ctctcgtaat ctaccaagat caacgcagag attacatcca tgctctagaa 780 gcagcggaca agaataaccc gctcctgctg attagattct ttgctgaacg agtgaccgat 840 actattaact ctattatcgt tgatctcact accccgatcg cgggtaaatc tggttcggct 900 aagctttcgg atgcgctacg ccccactcgc gtattaccag aattacatga tgctgcacat 960 aggctccaag aaagtttatt tacagaaatc cgatctcgat tggatgaaga aggaaaaagg 1020 aatgggttgg agtttctact tcaacggatt tttatcggtt ccccattcaa tctgccagag 1080 ggctataacg ctttccctga tagctattgt ctgaccttag ctttcaatag caactctcca 1140 aaacaaatct tccacccgct atccatagta atagcagctc gagatgggaa aagagcgagc 1200 agcgacctcg tggcagctac ttctattgga tacaactttc acgcttacgg acgtgaagtc 1260 gagcctgttg ttactgaaag ctttcgagaa cgtgtgaaaa tttacgccga cgggattgta 1320 gatcacttct taaccgaact ggctaaaaag tttcaacaga attaa 1365

Claims (16)

1. Unidade de expressão recombinante compreendendo promotor múltiplo, caracterizada pelo fato de que compreende, na direção de 5' a 3', um módulo de seqüência da seguinte fórmula 1: -P1 -(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3 (I) onde η é um número inteiro de 0 a 10, Ax e Ay são idênticos ou diferentes e são uma ligação química ou uma seqüência ligadora de ácido nucleico; Pi, Px e Py codificam seqüências promotoras idênticas ou diferentes a partir de bactérias corineformes iguais ou diferentes que compreendem pelo menos uma seção de ligação de RNA polimerase; e pelo menos Py compreende uma seção de seqüência de terminal 3' que medeia a ligação de ribossoma.

2. Unidade de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que P1, Px e Py são em cada caso derivada a partir de uma seqüência contígua de 35 a 500 resíduos de nucleotídeo, que é localizada 5' a montante da seqüência codificadora para uma proteína no genoma do organismo.

3. Unidade de expressão, de acordo com a reivindicação 1 ou -2, caracterizada pelo fato de que P1, Px e Py são, independentemente um do outro, selecionados dentre seqüências promotoras para a seqüência codificadora de uma proteína com alta abundância em um organismo.

4. Unidade de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que P1, Px e Py são, independentemente um do outro, selecionados dentre a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.

5. Unidade de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que os promotores são selecionados dentre promotores fortes, constitutivos ou reguláveis.

6. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende, na direção de 5' a 3', um módulo de seqüência da seguinte fórmula II: 5'-P,(-Ax-Px-VVPy-G-S' (II) onde n, Ax, Ay, Pi, Px e Py são como definidos acima, e G é pelo menos uma seqüência codificadora de ácido nucleico que é funcionalmente ligada à seqüência reguladora a montante de 5'.

7. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que G é selecionado dentre a. ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de aminoácidos proteinogênicos e não proteinogênicos, b. ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de nucleotídeos e nucleosídeos, c. ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de ácidos orgânicos, d. ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de lipídeos e ácidos graxos, e. ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de dióis, f. ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de carboidratos, g. ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de compostos aromáticos, h. ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de vitaminas, i. ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de co-fatores, e j. ácidos nucleicos que codificam uma proteína do caminho biossintético de enzimas. k. ácidos nucleicos que codificam uma proteína do metabolismo central.

8. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 7a), caracterizado pelo fato de que os ácidos nucleicos que codificam as proteínas do caminho biossintético de aminoácidos, selecionadas dentre aspartato quinase, aspartato semialdeído desidrogenase, diaminopimelato desidrogenase, diaminopimelato descarboxilase, diidrodipicolinato sintetase, diidrodipicolinato redutase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, 3- fosfoglicerato quinase, piruvato carboxilase, triosefosfato isomerase, regulador transcricional LuxR, regulador transcricional LysRl, regulador transcricional LysR2, malato-quinona oxidorredutase, glicose-6-fosfato desidrogenase, 6-fosfogliconato desidrogenase, transcetolase, transaldolase, homosserina O-acetiltransferase, cistationina gama sintase, cistationina beta liase, serina hidroximetiltransferase, O-acetil-homosserina sulfidrilase, metilenotetra-hidrofoliato redutase, fosfosserina aminotransferase, fosfosserina fosfatase, serina acetiltransferase, homosserina desidrogenase, homosserina quinase, treonina sintase, veículo exportador de treonina, treonina desidratase, piruvato oxidase, exportador de lisina, biotina ligase, cisteína sintase I, cisteína sintase II, metionina sintase dependente da coenzima B12, metionina sintase independente da coenzima B12, atividade das subunidades 1 e 2 da sulfato adenililtransferase, fosfoadenosina fosfossulfato redutase, ferredoxina sulfito redutase, ferredoxina NADP redutase, 3-fosfoglicerato desidrogenase, regulador de RXA00655, regulador de RXN2910, arginil-t-RNA sintetase, fosfoenolpiruvato carboxilase, proteína do efluxo de treonina, serina hidroximetiltransferase, frutose 1,6-bisfosfatase, proteína de redução de sulfato RXA077, proteína de redução de sulfato RXA248, proteína de redução de sulfato RXA247, proteína OpcA, 1- fosfofrutoquinase, 6-fosfo-frutoquinase, tetraidropicolinato succinilase, succinil aminocetopimelato aminotransferase, succinil diaminopimelato dessuccinilase, diamino-pimelato epimerase, 6-fosfogliconato desidrogenase, glicose fosfato isomerase, fosfoglicerato mutase, enolase, piruvato quinase, aspartato transaminase e enzima de malato.

9. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um cassete de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações de 6 a 8.

10. Microorganismo geneticamente modificado, caracterizado pelo fato de que é transformado com pelo menos um vetor como definido na reivindicação 9 ou que compreende pelo menos um cassete de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8.

11. Microorganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é derivado de bactérias corineformes.

12. Microorganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é derivado de bactérias do gênero Corynebacterium ou Brevibacterium.

13. Microorganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um cassete de expressão em uma forma integrada.

14. Processo para preparar um produto biossintético diferente de lisina, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microorganismo geneticamente modificado como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 13 e isolar o produto desejado da cultura.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o produto biossintético é selecionado dentre ácidos orgânicos, proteínas, nucleotídeos e nucleosídeos, aminoácidos tanto proteinogênicos quanto não proteinogênicos diferentes de lisina, lipídeos e ácidos graxos, dióis, carboidratos, compostos aromáticos, vitaminas e co- fatores, enzimas e proteínas.

16. Uso de uma unidade de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para regular uma biossíntese de produto diferente de lisina.