KR20070034634A - Ｐ２-１０ 발현 유닛 - Google Patents

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KR20070034634A
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종수 최
월규 정
일권 김
성한 임
흥식 이
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바스프 악티엔게젤샤프트
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Abstract

본 발명은 유전자의 전사 및 발현 조절을 위한 핵산 서열의 용도, 신규 프로모터 및 발현 유닛, 유전자의 전사 속도 및/또는 발현 속도를 변경 또는 유발시키는 방법, 상기 발현 유닛을 포함하는 발현 카세트, 변경 또는 유발된 전사 속도 및/또는 발현 속도를 갖는 유전자 조작 미생물, 및 상기 유전자 조작 미생물의 배양에 의한 생합성 산물의 제조 방법에 관한 것이다.
유전자 전사, 유전자 발현, 핵산 서열, 발현 유닛, 유전자 조작 미생물

Description

Ｐ２-１０ 발현 유닛 {P2-10 EXPRESSION UNITS}
본 발명은 유전자의 전사 및 발현 조절을 위한 핵산 서열의 용도, 신규 프로모터 및 발현 유닛, 유전자의 전사 속도 및/또는 발현 속도를 변경 또는 유발시키는 방법, 상기 발현 유닛을 포함하는 발현 카세트, 변경 또는 유발된 전사 속도 및/또는 발현 속도를 갖는 유전자 조작 미생물, 및 상기 유전자 조작 미생물의 배양에 의한 생합성 산물의 제조 방법에 관한 것이다.
다양한 생합성 산물, 예를 들면 정밀 화학물질, 특히 아미노산, 비타민 및 단백질은 자연 대상 과정에 의해 세포에서 생산되며, 식료품, 사료, 화장품, 먹이, 식품 및 제약 산업을 비롯한 수많은 산업 분야에서 사용되고 있다. 정밀 화학물질/단백질로 총칭되는 이들 물질들은, 특히 유기산, 단백질원성 아미노산 및 비-단백질원성 아미노산 둘 모두, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민 및 보조인자, 및 단백질 및 효소를 포함한다. 이들은, 가장 편리하게는, 바람직한 특정 물질을 다량으로 생산 및 분비하도록 개발된 박테리아의 배양에 의해 산업적 규모로 생산된다. 이러한 목적에 특히 적합한 유기체는 코리네형 박테리아, 그람-양성 비-병원성 박테리아이다.
아미노산은 코리네형 박테리아 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미 쿰(Corynebacterium glutamicum)의 발효에 의해 제조되는 것으로 알려져 있다. 이는 매우 중요하기 때문에, 생산 공정을 개선하기 위한 작업이 계속 이루어져 왔다. 공정 개선은 발효 기술 수단, 예를 들면 교반 및 산소 공급; 영양 배지의 조성, 예를 들면 발효 중의 당 농도; 생성물 제공을 위한 마무리 처리, 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피 또는 분무 건조; 또는 미생물 고유의 성능 특성과 관련될 수 있다.
마찬가지로, 재조합 DNA 기술 방법이 개별 유전자를 증폭시켜 정밀 화학물질/단백질 생산에 대한 효과를 연구함으로써, 정밀 화학물질/단백질을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개선시키기 위해 수년간 이용되어 왔다.
정밀 화학물질, 아미노산 또는 단백질의 생산 공정을 개발하기 위한 다른 방법, 또는 정밀 화학물질, 아미노산 또는 단백질을 생산하는 기존 공정의 생산성을 증가 또는 개선시키기 위한 다른 방법은 하나 이상의 유전자의 발현을 증가 또는 변경시키고(시키거나) 적합한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 mRNA 번역에 영향을 끼치는 것이다. 이와 관련하여, "영향"은 유전자 발현의 증가, 감소, 또는 연대별 발현 패턴과 같은 다른 파라미터를 포함할 수 있다.
박테리아 조절 서열의 다양한 구성 성분은 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 소위 오퍼레이터(operator)라고도 지칭되는 레귤레이터(regulator)에 대한 결합 부위, 소위 -35 및 -10 영역으로 지칭되는 RNA 폴리머라제 전효소에 대한 결합 부위, 및 소위 리보좀 결합 부위 또는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열로 지칭되는 리보좀 16S RNA에 대한 결합 부위로 구분되어 있다.
본 발명의 목적에 있어서, 리보좀 결합 부위의 서열, 소위 샤인-달가노 서열은 번역 개시 코돈 상류의 20개의 염기 내에 위치하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.
문헌 [E. coli and S. typhimurium, Neidhardt F.C. 1995 ASM Press]에는, 샤인-달가노 서열의 폴리뉴클레오티드 서열의 조성, 염기의 서열 스트링(string) 뿐만 아니라, 샤인-달가노 서열에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열의 거리도 또한 번역 개시 속도에 상당한 영향을 끼친다고 보고되어 있다.
프로모터 활성을 갖는 핵산 서열은 다양한 방식으로 mRNA 형성에 영향을 끼칠 수 있다. 그 활성이 유기체의 생리학적 증식기와는 무관한 프로모터를 구성적(constitutive) 프로모터라고 지칭한다. 다른 프로모터는 또한, 산소, 대사산물, 열, pH 등과 같은 외부의 화학적 및 물리적 자극에 반응한다. 한편, 다른 프로모터들은 상이한 증식기에서는 프로모터 활성의 강도도 달라지는 것으로 나타났다. 예를 들면, 미생물의 대수 증식기 동안, 또는 달리 정확하게는 미생물 증식의 정지기에서 두드러지게 현저한 활성을 나타내는 프로모터가 상기 문헌에 기재되어 있다. 프로모터의 두 가지 특성은 모두 대사 경로에 따라 정밀 화학물질 및 단백질 생산에 대한 생산성에 유익한 효과를 나타낼 수 있다.
예를 들면, 미생물이 증식하는 동안에는 유전자 발현을 스위치 오프(switch off)시키지만, 미생물이 최적의 상태로 증식한 후에는 유전자 발현을 스위치 온(switch on)시키는 프로모터가 대사산물의 생산을 제어하는 유전자를 조절하는데 사용될 수 있다. 따라서, 조작된 균주는 출발 균주와 동일한 증식 파라미터를 나 타내지만, 세포 당 보다 많은 생성물을 생산한다. 이러한 유형의 조작은 역가 (생성물 g/ℓ) 및 C 수율 (생성물 g/C 공급원 g) 둘 모두를 증가시킬 수 있다.
이미 코리네박테리움 종에서는 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 단리할 수 있었다. 이들 조절된 프로모터는 세포의 내부 및/또는 외부 조건에 따라 유전자가 전사되는 속도를 증가 또는 감소시킬 수 있다. 몇몇 경우에는, 인듀서(inducer)로 공지된 특정 인자의 존재가 프로모터로부터 전사 속도를 촉진시킬 수 있다. 인듀서는 프로모터로부터 전사에 직접 또는 간접적으로 영향을 끼칠 수 있다. 서프레서(suppressor)로 공지되어 있는 또다른 종류의 인자는 프로모터로부터 전사를 감소 또는 억제할 수 있다. 인듀서와 마찬가지로, 서프레서 또한 직접 또는 간접적으로 작용할 수 있다. 그러나, 온도-조절된 프로모터가 또한 공지되어 있다. 따라서, 상기 프로모터의 전사 수준은, 예를 들면 증식 온도를 정상적인 세포 증식 온도보다 높게 증가시킴으로써, 증가 또는 감소시킬 수 있다.
지금까지 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)으로부터 소수의 프로모터가 기재되어 있다. 씨. 글루타미쿰 말레이트 신타제 유전자의 프로모터는 DE 4440118에 기재되어 있다. 이 프로모터는 단백질을 코딩하는 구조 유전자의 상류에 삽입되어 있다. 이러한 작제물을 코리네형 박테리아에 형질전환시킨 후에, 프로모터 하류의 구조 유전자의 발현이 조절된다. 구조 유전자의 발현은 적절한 인듀서를 배지에 첨가한 직후에 유도된다.
문헌 [Reinscheid et al., Microbiology 145:503 (1999)]에서는 씨. 글루타 미쿰으로부터의 pta-ack 프로모터와 리포터 유전자 (클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제) 사이의 전사 융합체를 기재하고 있다. 이러한 전사 융합체를 포함하는 씨. 글루타미쿰의 세포는 아세테이트-포함 배지 상에서 증식시켰을 때 리포터 유전자의 발현이 증가되는 것으로 나타났다. 이에 반해, 글루코스 상에서 증식시킨 형질전환된 세포에서는 상기 리포터 유전자의 발현이 증가되지 않는 것으로 나타났다.
문헌 [Pa'tek et al., Microbiology 142:1297 (1996)]에서는 씨. 글루타미쿰 세포에서 리포터 유전자의 발현을 향상시킬 수 있는 씨. 글루타미쿰으로부터의 몇몇 DNA 서열을 기재하고 있다. 씨. 글루타미쿰 프로모터에 대해 일치하는 서열을 규정하기 위해 상기 서열들을 서로 비교하였다.
유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있는 씨. 글루타미쿰으로부터의 추가의 DNA 서열이 특허 WO 02/40679에 기재되어 있다. 이들 단리된 폴리뉴클레오티드는 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는데 사용될 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 발현 유닛을 나타낸다. 상기 특허는 또한, 그 위에서 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 발현 유닛과 이종 유전자가 연결되는 재조합 플라스미드를 기재하고 있다. 상기 특허 본문에 기재된, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 프로모터와 이종 유전자를 융합시키는 방법은 특히 아미노산 생합성 유전자를 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 유리한 특성을 갖는 추가의 프로모터 및/또는 발현 유닛을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은, 유전자의 전사를 위한,
A) 서열 1의 핵산 서열,
B) 상기 서열로부터 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유래되고, 핵산 수준에서 서열 1과의 동일성이 90％ 이상인 서열,
C) 엄격한 조건하에 서열 1의 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열,
D) A), B) 또는 C) 서열의 기능적으로 동등한 단편
을 포함하는, 프로모터 활성을 갖는 핵산의 사용에 의해 상기 목적이 달성됨을 발견하였다.
본 발명에 있어서, "전사"는 DNA 주형으로부터 출발하여 상보적인 RNA 분자가 생성되는 과정을 의미한다. 단백질, 예를 들어 RNA 폴리머라제 (소위 시그마 인자로도 지칭됨) 및 전사 레귤레이터 단백질이 상기 과정에 관여한다. 합성된 RNA는 이후에 번역 과정에 주형으로 사용되며, 이 번역 과정은 이후에 생합성적으로 활성인 단백질을 생성한다.
생합성적으로 활성인 단백질이 생산되는 형성 속도는 전사 및 번역 속도로부터 결정된다. 이들 두 속도는 본 발명에 따라 영향을 받을 수 있으며, 따라서 미생물 내에서의 생성물 형성 속도에 영향을 끼칠 수 있다.
본 발명에 있어서, "프로모터" 또는 "프로모터 활성을 갖는 핵산"은 전사시킬 핵산에 대한 기능적 연결기에서 상기 핵산의 전사를 조절하는 핵산을 의미한다.
이와 관련하여, "기능적 연결기"는 예를 들면, 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 하나의 핵산 및 전사시킬 핵산 서열, 적절한 경우에, 예를 들어 핵산의 전사를 보장하는 핵산 서열 및 터미네이터(terminator)와 같은 추가의 조절 요소가 각각 핵산 서열의 전사에 있어서 자신의 기능을 완수할 수 있도록 순차적으로 배열된 것을 의미한다. 이 경우, 화학적 의미에서의 직접적인 결합이 반드시 필요하지는 않다. 예를 들어 인핸서(enhancer) 서열과 같은 유전자 제어 서열은 보다 멀리 떨어진 위치에서 또는 심지어 다른 DNA 분자로부터 표적 서열에 자신의 기능을 발휘할 수 있다. 전사시킬 핵산 서열을 본 발명의 프로모터 서열 뒤 (즉, 3' 말단)에 위치시켜 이들 두 서열이 공유결합에 의해 서로 연결되도록 하는 배열이 바람직하다. 이러한 배열에서, 프로모터 서열과 유전자 도입에 의해 발현시킬 핵산 서열 사이의 거리는 바람직하게는 200개 염기쌍 미만, 특히 바람직하게는 100개 염기쌍 미만, 특히 더 바람직하게는 50개 염기쌍 미만이다.
본 발명에 있어서, "프로모터 활성"은 특정 시간 내에 프로모터에 의해 형성되는 RNA의 양, 즉 전사 속도를 의미한다.
본 발명에 있어서, "특이적 프로모터 활성"은 각 프로모터에 대해 특정 시간 내에 프로모터에 의해 형성되는 RNA의 양을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "야생형"은 적절한 출발 미생물을 의미한다.
문맥에 따라, 용어 "미생물"은 출발 미생물 (야생형) 또는 본 발명의 유전자 조작 미생물, 또는 이들 둘 모두를 의미한다.
바람직하게는, 특히 미생물 또는 야생형이 명확하게 지정될 수 없는 경우, "야생형"은 각각의 경우에 프로모터 활성 또는 전사 속도의 변경 또는 유발, 발현 활성 또는 발현 속도의 변경 또는 유발, 및 생합성 산물 함량의 증가에 사용된 대조 유기체를 의미한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 대조 유기체는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032이다.
바람직한 실시양태에서, 사용되는 출발 미생물은 이미 목적하는 정밀 화학물질을 생산할 수 있다. 이와 관련하여, 코리네박테리움 속 박테리아 중 특히 바람직한 미생물 및 특히 바람직한 정밀 화학물질인 L-리신, L-메티오닌 및 L-트레오닌 중에서, 이미 L-리신, L-메티오닌 및/또는 L-트레오닌을 생산할 수 있는 출발 미생물이 특히 바람직하다. 예를 들면, 아스파르토키나제 (ask 유전자)를 코딩하는 유전자가 탈조절되거나, 피드백 억제가 제거 또는 감소된 코리네박테리아가 특히 바람직하다. 이러한 박테리아에는, 예를 들면 ask 유전자에서 피드백 억제의 감소 또는 제거를 초래하는 돌연변이 (예를 들면, 돌연변이 T311I)가 존재한다.
따라서, 유전자와 관련된 프로모터 활성 또는 전사 속도가 야생형에 비해 유발된 경우, 야생형에서 상기 방식으로는 존재하지 않았던 RNA의 형성이 야생형에 비해 유발된다.
따라서, 유전자와 관련된 프로모터 활성 또는 전사 속도가 야생형에 비해 변경된 경우, 특성 시간 내에 생성된 RNA의 양이 야생형에 비해 변경된다.
이와 관련하여, "변경된"은 바람직하게 증가되거나 감소되는 것을 의미한다.
예를 들어, 이와 같은 변경은 본 발명의 내인성 프로모터의 특이적 프로모터 활성을 증가 또는 감소시킴으로써, 예를 들면 프로모터를 돌연변이화시키거나 프로모터를 자극 또는 억제시킴으로써 일어날 수 있다.
또한, 예를 들어 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 의해 또는 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 프로모터 활성을 갖는 핵산과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 전사를 조절함으로써 프로모터 활성 또는 전사 속도를 증가시킬 수도 있다.
프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 의해 또는 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물 내에서의 유전자 전사 조절은, 바람직하게는
프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 본 발명의 핵산을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 도입된 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나,
하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명 내인성 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산은
A) 서열 1의 핵산 서열,
B) 상기 서열로부터 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유래되고, 핵산 수준에서 서열 1과의 동일성이 90％ 이상인 서열,
C) 엄격한 조건하에 서열 1의 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열, 또는
D) A), B) 또는 C) 서열의 기능적으로 동등한 단편을 포함한다.
서열 1의 핵산 서열은 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 당-포스페이트 에피머라제 (P2 -10)의 프로모터 서열을 나타낸다. 서열 1은 야생형 프로모터 서열에 상응한다.
본 발명은 또한 서열 1의 서열로부터 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유래되고, 핵산 수준에서 서열 1과의 동일성이 90％ 이상인 서열을 포함하는, 프로모터 활성을 갖는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 프로모터에 대한 본 발명의 천연 프로모터의 추가 예는, 예를 들면 데이타베이스에 기초하여 게놈 서열이 공지되어 있는 다양한 유기체로부터의 핵산 서열과 상기 기재된 서열 1의 서열의 동일성을 비교함으로써 용이하게 발견될 수 있다.
본 발명의 인공 프로모터 서열은 서열 1로부터 출발하여 인공적인 변이 및 돌연변이, 예를 들면 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 용이하게 발견될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "치환"은 하나 이상의 뉴클레오티드가 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 대체되는 것을 의미한다. "결실"은 뉴클레오티드가 직접 결합에 의해 대체되는 것을 의미한다. "삽입"은 하나 이상의 뉴클레오티드를 직접 결합으로 정식 대체시켜, 핵산 서열에 뉴클레오티드를 삽입하는 것을 의미한다.
두 핵산 사이의 동일성은 각각의 경우에, 특히 하기 파라미터를 설정한 클러스탈(Clustal) 방법 (문헌 [Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci.1989 Apr; 5(2):151-1])을 이용하여 벡터 NTI Suite 7.1 소프트웨어 (인포맥스 (Informax), 미국)를 사용하는 비교에 의해 계산된, 핵산의 완전한 길이에 걸친 뉴클레오티드의 동일성을 의미한다.
다중 배열 파라미터:
갭 개방 패널티 10
갭 신장 패널티 10
갭 분리 패널티 범위 8
갭 분리 패널티 오프(off)
정렬 지연에 대한 동일성％ 40
잔기 특이적 갭 오프
친수성 잔기 갭 오프
전치 중량(Transition weighing) 0
페어형(Pairwise) 정렬 파라미터:
FAST 알고리즘 온(on)
K-터플 크기(tuple size) 1
갭 패널티 3
윈도우 크기 5
최적 항의 수 5
따라서, 서열 1과의 동일성이 90％ 이상인 핵산 서열은, 특히 상기 파라미터 세트를 갖는 상기 프로그래밍 알고리즘에 따라 서열 1과 비교하였을 때 동일성이 90％ 이상인 핵산 서열을 의미한다.
특히 바람직한 프로모터는 서열 1의 핵산 서열과의 동일성이 91％, 보다 바람직하게는 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 특히 바람직하게는 99％이다.
또한, 천연 프로모터의 또다른 예는 게놈 서열이 공지되어 있지 않은 유기체로부터 상기 기재된 핵산 서열, 특히 서열 1로부터 출발하여 당업계에 공지된 방식으로 혼성화 기술을 이용하여 용이하게 발견될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 측면은 엄격한 조건하에 서열 1의 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열을 포함하는, 프로모터 활성을 갖는 핵산에 관한 것이다. 이 핵산 서열은 10개 이상, 보다 바람직하게는 12개, 15개, 30개, 50개 초과, 특히 바람직하게는 150개 초과의 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에 있어서, 혼성화는 엄격한 조건하에서 일어난다. 이러한 혼성화 조건은, 예를 들면 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F.,　Maniatis, T., in:Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에 기재되어 있다.
엄격한 혼성화 조건은, 특히 50％ 포름아미드, 5×SSC (750　mM NaCl, 75 mM 시트르산 3나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH　7.6), 5×덴하르트(Denhardt) 용액, 10％ 덱스트란 술페이트 및 20 g/ml 전단된 변성 연어 정자 DNA로 이루어진 용액 중에서 밤새 42℃에서 인큐베이션한 후에, 필터를 65℃의 0.1×SSC로 세척하는 것을 의미한다.
"기능적으로 동등한 단편"은 특이적 프로모터 활성이 출발 서열과 실질적으로 동등하거나 또는 보다 높은 프로모터 활성 단편을 갖는 핵산 서열을 의미한다.
"본질적으로 동일한"은 출발 서열의 특이적 프로모터 활성의 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 보다 바람직하게는 70％ 이상, 보다 더 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 더 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상의 활성을 나타내는 특이적 프로모터 활성을 의미한다.
"단편"은 실시양태 A), B) 또는 C)에 의해 기재된 프로모터 활성을 갖는 핵산의 부분 서열을 의미한다. 이들 단편은 바람직하게는 서열 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 중 10개 초과, 보다 바람직하게는 12개, 15개, 30개, 50개 초과, 특히 바람직하게는 150개 초과의 연결된 뉴클레오티드를 갖는다.
서열 1의 핵산 서열을 프로모터로서, 즉 유전자의 전사를 위해 사용하는 것이 특히 바람직하다.
서열 1은 기능은 부여되지 않고, 진뱅크 (Genbank) 번호 AP005283으로 기재되어 있다. 따라서, 본 발명은 또한 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 신규한 핵산 서열에 관한 것이다.
본 발명은 특히
A) 서열 1의 핵산 서열,
B) 상기 서열로부터 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유래되고, 핵산 수준에서 서열 1과의 동일성이 90％ 이상인 서열,
C) 엄격한 조건하에 서열 1의 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열,
D) A), B) 또는 C) 서열의 기능적으로 동등한 단편
을 포함하되, 단 서열 1의 서열을 갖는 핵산은 제외된, 프로모터 활성을 갖는 핵산에 관한 것이다.
상기 언급된 모든 프로모터 활성을 갖는 핵산은 또한, 뉴클레오티드 빌딩 블럭으로부터의 화학적 합성, 예를 들면 이중 나선의 중복되는 각각의 상보적인 핵산 빌딩 블럭의 단편 축합에 의해 당업계에 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은, 예를 들면 포스포르아미디트 방법 (문헌 [Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New　York, pp. 896-897])에 의해 공지된 방식으로 수행할 수 있다. DNA 폴리머라제의 클레나우(klenow) 단편 및 라이게이션 반응을 이용한 합성 올리고뉴클레오티드의 첨가 및 갭 충전, 및 일반적인 클로닝 방법이 문헌 [Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning:A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있다.
또한, 본 발명은 유전자의 발현을 위한, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 중 하나 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 추가의 핵산 서열을 포함하는 발현 유닛의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 발현 유닛은 발현 활성을 갖는 핵산, 즉 발현시킬 핵산 또는 유전자에 기능적으로 연결되어 상기 핵산 또는 상기 유전자의 발현, 즉 전사 및 번역을 조절하는 핵산을 의미한다.
이와 관련하여, "기능적 연결기"는 본 발명의 발현 유닛 중 하나, 유전자 도입에 의해 발현시킬 핵산 서열, 및 적절한 경우에, 예를 들면 터미네이터와 같은 추가의 조절 요소가 각각 핵산 서열의 유전자 도입에 의한 발현에 있어서 자신의 기능을 완수할 수 있도록 순차적으로 배열된 것을 의미한다. 이 경우, 화학적 의미에서의 직접적인 결합이 반드시 필요하지는 않다. 예를 들어 인핸서 서열과 같은 유전자 제어 서열은 또한 보다 멀리 떨어진 위치에서 또는 심지어 다른 DNA 분자로부터 표적 서열에 자신의 기능을 발휘할 수 있다. 유전자 도입에 의해 발현시킬 핵산 서열을 본 발명의 발현 유닛 서열 뒤 (즉, 3'-말단)에 위치시켜 이들 두 서열이 공유 결합에 의해 서로 연결되도록 하는 배열이 바람직하다. 이러한 배열에서, 발현 유닛 서열과 유전자 도입에 의해 발현시킬 핵산 서열 사이의 거리는 염기쌍 200개 미만, 특히 바람직하게는 염기쌍 100개 미만, 특히 더 바람직하게는 염기쌍 50개 미만이 되도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "발현 활성"은 특정 시간 내에 발현 유닛에 의해 생성되는 단백질의 양, 즉 발현 속도를 의미한다.
본 발명에 있어서, "특이적 발현 활성"은 각 발현 유닛에 대해 특정 시간 내에 발현 유닛에 의해 생성되는 단백질의 양을 의미한다.
따라서, 야생형에 비해 유전자와 관련하여 "유발된 발현 활성" 또는 발현 속도의 경우, 야생형에서 상기 방식으로는 존재하지 않았던 단백질의 생성이 야생형에 비해 유발된다.
따라서, 야생형에 비해 유전자와 관련하여 "변경된 발현 활성" 또는 발현 속도의 경우, 특성 시간 내에 생성된 단백질의 양이 야생형에 비해 변경된다.
이와 관련하여, "변경된"은 바람직하게는 증가되거나 감소되는 것을 의미한다.
예를 들어, 이는 내인성 발현 유닛의 특이적 활성을 증가 또는 감소시킴으로써, 예를 들면 발현 유닛의 돌연변이화 또는 발현 유닛의 자극 또는 억제에 의해 일어날 수 있다.
또한, 증가된 발현 활성 또는 발현 속도는, 예를 들면 본 발명의 발현 유닛에 의해 또는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 발현 유닛에 의해 발현 유닛과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 발현을 조절함으로써 달성될 수도 있다.
본 발명의 발현 유닛에 의한 또는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현 조절은, 바람직하게는
적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 하나 이상의 본 발명의 발현 유닛을 미생물의 게놈에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나,
하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내인성 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나,
적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
본 발명의 발현 유닛은, 프로모터 활성을 갖는 상기한 본 발명의 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 추가의 핵산 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 발현 유닛은
E) 서열 2의 핵산 서열,
F) 상기 서열로부터 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유래되고, 핵산 수준에서 서열 2와의 동일성이 90％ 이상인 서열,
G) 엄격한 조건하에 서열 2의 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열, 또는
H) E), F) 또는 G) 서열의 기능적으로 동등한 단편을 포함한다.
서열 2의 핵산 서열은 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 당-포스페이트 에피머라제 (P2 -10) 발현 유닛의 핵산 서열을 나타낸다. 서열 2는 야생형 발현 유닛의 서열에 상응한다.
본 발명은 또한 서열 2의 서열로부터 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유래되고, 핵산 수준에서 서열 2와의 동일성이 90％ 이상이 서열을 포함하는 발현 유닛에 관한 것이다.
본 발명의 발현 유닛에 대한 본 발명의 천연 발현 유닛의 추가 예는, 예를 들면 데이타베이스에 기초하여 게놈 서열이 공지되어 있는 다양한 유기체로부터의 핵산 서열과 상기 기재된 서열 2의 서열의 동일성을 비교함으로써 용이하게 발견될 수 있다.
본 발명의 인공 발현 유닛 서열은 서열 2로부터 출발하여 인공적인 변이 및 돌연변이, 예를 들면 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 용이하게 발견될 수 있다.
따라서 서열 2와 90％ 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열은, 특히 상기 파라미터 세트를 갖는 상기 프로그래밍 알고리즘에 따라, 자신의 서열을 서열 2와 비교하였을 때 90％ 이상의 동일성을 나타내는 핵산 서열을 의미한다.
특히 바람직한 발현 유닛은 서열 2의 핵산 서열과 91％, 보다 바람직하게는 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 특히 바람직하게는 99％의 동일성을 나타낸다.
또한, 천연 발현 유닛의 또다른 예는 게놈 서열이 공지되어 있지 않은 다양한 유기체로부터 상기 기재된 핵산 서열, 특히 서열 2로부터 출발하여 당업계에 공지된 방식으로 혼성화 기술에 의해 용이하게 규정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 측면은 엄격한 조건하에 서열 2의 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열을 포함하는 발현 유닛에 관한 것이다. 이 핵산 서열은 10개 이상, 보다 바람직하게는 12개, 15개, 30개, 50개 초과, 특히 바람직하게는 150개 초과의 뉴클레오티드를 갖는다.
"혼성화"는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 엄격한 조건하에 실질적으로 상보적인 서열에 결합하는 능력을 의미하며, 상기 조건하에서는 비-상보적인 상대 사이에서 비특이적인 결합이 발생하지 않는다. 이를 위해, 서열은 바람직하게는 90 내지 100％ 상보적이어야 한다. 상보적인 서열이 서로 특이적으로 결합할 수 있는 특성은, 예를 들면 노던(Northern) 또는 서던(Southern) 블랏팅 기술, 또는 PCR 또는 RT-PCR에서의 프라이머 결합에 사용된다.
본 발명에 있어서, 혼성화는 엄격한 조건하에 수행한다. 이러한 혼성화 조건은, 예를 들면 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in:Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에 기재되어 있다.
엄격한 혼성화 조건은, 특히 50％ 포름아미드, 5×SSC (750　mM NaCl, 75 mM 시트르산 3나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH　7.6), 5× 덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트 및 20 g/ml 전단된 변성 연어 정자 DNA로 이루어진 용액에서 밤새 42℃에서 인큐베이션한 후에, 필터를 65℃의 0.1×SSC로 세척하는 것을 의미한다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열은 또한 다른 세포 유형 및 미생물에서 동종의 서열을 확인 및/또는 클로닝하는데 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머의 생산을 가능하게 한다. 이러한 프로브 및 프라이머는 통상적으로 본 발명 핵산 서열의 센스 가닥 또는 상응하는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 중 대략 13개 이상, 바람직하게는 대략 25개 이상, 예를 들면 대략 40개, 50개 또는 75개의 일련의 뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함한다.
본 발명에 있어서, 소위 사일런트 (silent) 돌연변이를 포함하거나, 또는 구체적으로 언급된 서열 및 이들의 자연 발생 변이체, 예를 들면 스플라이스(splice) 변이체 또는 대립유전자 변이체와 비교하였을 때 특정 유기체 자신의 코돈 사용 빈도 또는 특정 숙주 유기체의 코돈 사용 빈도에 따라 조작된 핵산 서열도 포함된다.
"기능적으로 동등한 단편"은 출발 서열과 실질적으로 동일하거나 또는 보다 높은 특이적 발현 활성을 갖는 발현 유닛 단편을 의미한다.
"본질적으로 동일한"은 출발 서열의 특이적 발현 활성의 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 보다 바람직하게는 70％ 이상, 보다 더 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 더 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상의 활성을 나타내는 특이적 발현 활성을 의미한다.
"단편"은 실시양태 E), F) 또는 G)에 의해 기재된 발현 유닛의 부분 단편을 의미한다. 이들 단편은 바람직하게는, 서열 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 중 10개 초과, 보다 바람직하게는 12개, 15개, 30개, 50개 초과, 특히 바람직하게는 150개 초과의 연결된 뉴클레오티드를 갖는다.
서열 2의 핵산 서열을 발현 유닛으로서, 즉 유전자 발현에 사용하는 것이 특히 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 신규한 발현 유닛에 관한 것이다.
본 발명은 특히 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 추가의 핵산 서열을 포함하는 발현 유닛에 관한 것이다.
본 발명은 특히, 바람직하게는
E) 서열 2의 핵산 서열,
F) 상기 서열로부터 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유래되고, 핵산 수준에서 서열 2와의 동일성이 90％ 이상인 서열,
G) 엄격한 조건하에 서열 2의 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열, 또는
H) E), F) 또는 G) 서열의 기능적으로 동등한 단편
을 포함하되, 단 서열 2의 서열을 갖는 핵산은 제외된 발현 유닛에 관한 것이다.
본 발명의 발현 유닛은 하기 유전자 요소 중 하나 이상을 포함한다: 마이너스 10 ("-10") 서열; 마이너스 35 ("-35") 서열; 전사 개시 서열; 인핸서 영역; 및 오퍼레이터 영역.
상기 유전자 요소는 바람직하게는 코리네박테리아 종, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰에 대해 특이적이다.
상기 언급된 모든 발현 유닛은 뉴클레오티드 빌딩 블럭으로부터의 화학적 합성, 예를 들면 이중 나선의 중복되는 각각의 상보적인 핵산 빌딩 블럭의 단편 축합에 의해 당업계에 공지된 방식으로 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은, 예를 들면 포스포르아미디트 방법 (문헌 [Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New　York, pp. 896-897])에 의해 공지된 방식으로 일어날 수 있다. DNA 폴리머라제의 클레나우 단편 및 라이게이션 반응을 이용한 합성 올리고뉴클레오티드의 첨가 및 갭 충전, 및 일반적인 클로닝 방법은 문헌 [Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning:A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있다.
본원에서 본 발명을 위해 사용되는 방법 및 기술은 미생물학 및 재조합 DNA 기술의 숙련자에게 공지되어 있다. 이러한 기술 및 방법의 예로는, 박테리아 세포를 증식시키는 방법 및 기술, 단리된 DNA 분자를 숙주 세포에 삽입하는 방법 및 기술, 단리된 핵산 분자를 단리, 클로닝 및 서열분석하는 방법 및 기술 등이 있다. 이들 방법은 다수의 표준 문헌에 기재되어 있다 (문헌 [Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986)]; [J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972)]; [J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992)]; [M. Singer and P. Berg, Genes ＆ Genomes, University Science Books, Mill Valley, California (1991)]; [J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]; [P.B. Kaufmann et al., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995)]; [Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick and J.E. Thompson, eds., CRC Press, Boca Raton, Florida (1993)]; 및 [P.F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia Coli, The Guilford Press, New York, NY (1989)]).
본 발명의 모든 핵산 분자는 바람직하게는 단리된 핵산 분자의 형태이다. "단리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산으로부터 분리되며, 또한 재조합 기술에 의해 제조된 경우에는 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성된 경우에는 화합물 전구체 또는 다른 화합물이 실질적으로 없을 수 있다.
본 발명은 보다 구체적으로 기재된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 핵산 분자, 또는 그의 절편을 포함한다.
본 발명의 프로모터 및/또는 발현 유닛은, 예를 들면 하기 기재하는 발효에 의한 개선된 생합성 산물의 제조 방법에 특히 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명의 프로모터 및/또는 발현 유닛은 미생물에서 스트레스에 의해 유도된다는 측면에서 특히 유리하다. 발효 공정을 적절하게 제어함으로써, 목적하는 유전자의 전사/발현 속도를 증가시키는 데 대해 특이적으로 상기 스트레스 유도를 제어할 수 있다. 특히, L-리신 생산시에는 상기 스트레스 단계에 매우 빠르게 도달하며, 이러한 경우에는 목적하는 유전자의 전사/발현 속도가 매우 빠르게 달성될 수 있다.
프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산은 미생물 내에서의 유전자 전사 속도를 야생형에 비해 변경, 즉 증가 또는 감소시키거나, 또는 유발시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 유닛은 미생물 내에서의 유전자 발현 속도를 야생형에 비해 변경, 즉 증가 또는 감소시키거나, 또는 유발시키는데 사용될 수 있다.
프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 본 발명의 발현 유닛은 또한, 미생물, 특히 코리네박테리움 종에서 다양한 생합성 산물, 예를 들면 정밀 화학물질, 단백질, 특히 아미노산의 생산을 조절 및 향상시키는데 사용될 수도 있다.
따라서, 본 발명은
a) 내인성 유전자의 전사를 조절하는, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내인성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성을 야생형에 비해 변경시키거나, 또는
b) 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 의해 또는 실시양태 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 프로모터 활성을 갖는 핵산과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 전사를 조절함으로써,
미생물 내에서의 유전자 전사 속도를 야생형에 비해 변경 또는 유발시키는 방법에 관한 것이다.
실시양태 a)에 따르면, 미생물의 특이적 프로모터 활성을 변경, 즉 증가 또는 감소시킴으로써 미생물 내에서의 유전자 전사 속도를 야생형에 비해 변경 또는 유발시킬 수 있다. 이는, 예를 들면 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 서열의 표적화된 돌연변이화, 즉 뉴클레오티드의 표적화된 치환, 결실 또는 삽입에 의해 일어날 수 있다. 프로모터 활성은 RNA 폴리머라제 전효소 결합 부위 (당업자에게 -10 영역 및 -35 영역으로도 공지되어 있음)에서 뉴클레오티드를 치환시킴으로써 증가 또는 감소시킬 수 있다. 또한, 뉴클레오티드를 결실시키거나 또는 삽입하여 기재된 RNA 폴리머라제 전효소 결합 부위 사이의 거리를 단축 또는 연장시킴으로써 프로모터 활성을 증가 또는 감소시킬 수도 있다. 또한, RNA 폴리머라제 전효소 결합 부위의 공간 근처에 조절 단백질 (당업자에게 저해제 및 활성화제로도 공지되어 있음)에 대한 결합 부위 (당업자에게 오퍼레이터라고도 공지되어 있음)를 위치시켜, 프로모터 서열에 결합한 후에 이들 레귤레이터가 RNA 폴리머라제 전효소의 결합 및 전사 활성을 감소 또는 향상시키거나 새로운 조절 영향하에 놓이게 함으로써 프로모터 활성을 증가 또는 감소시킬 수도 있다.
"특이적 프로모터 활성"과 관련하여, 야생형에 비해 증가 또는 감소된다는 것은 야생형 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산, 즉 서열 1의 핵산에 비해 특이적 활성이 증가 또는 감소하는 것을 의미한다.
실시양태 b)에 따르면, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 의해 또는 실시양태 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 미생물의 유전자 전사를 조절함으로써, 프로모터 활성을 갖는 핵산과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 전사 속도를 야생형에 비해 변경 또는 유발시킬 수 있다.
이는 바람직하게는,
b1) 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 본 발명의 핵산을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나,
b2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내인성 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
b3) 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
따라서,
실시양태 b1)에 따라, 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 본 발명의 핵산을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나,
실시양태 b2)에 따라, 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 내인성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내인성 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
실시양태 b3)에 따라, 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 내인성 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써,
야생형 내인성 유전자의 전사 속도를 변경, 즉 증가 또는 감소시킬 수 있다.
따라서,
실시양태 b2)에 따라, 하나 이상의 외인성 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 외인성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내인성 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
실시양태 b3)에 따라, 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 외인성 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써'
외인성 유전자의 전사 속도를 야생형에 비해 유발시킬 수도 있다.
실시양태 b2)에서, 유전자는 코딩 영역 또는 비코딩 영역에 통합시킴으로써 삽입될 수 있다. 삽입은, 바람직하게는 비코딩 영역에서 일어난다.
또한, 실시양태 b3)에서, 핵산 작제물은 염색체내 또는 염색체외에 삽입될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 작제물을 염색체내에 삽입한다. "염색체" 통합은 외인성 DNA 단편이 숙주 세포의 염색체내에 삽입되는 것이다. 이 용어는 또한 외인성 DNA 단편과 숙주 세포 염색체 상의 적절한 영역 사이의 동종 재조합에도 사용된다.
실시양태 b)에서, 바람직하게는 실시양태 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산을 사용한다. 실시양태 b)에서, 이들 핵산은 실시양태 a)에 기재된 바와 같이 미생물 내에 존재하거나 또는 미생물에서 제조될 수 있거나, 또는 단리된 형태로 미생물 내에 도입될 수도 있다.
"내인성"은, 야생형 게놈에 이미 존재하는 유전 정보, 예를 들면 유전자를 의미한다.
"외인성"은, 야생형 게놈에 존재하지 않는 유전 정보, 예를 들면 유전자를 의미한다.
프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 의한 전사 조절과 관련하여, 용어 "유전자"는 바람직하게는 전사시킬 영역, 즉 예를 들면 번역을 조절하는 영역, 및 코딩 영역, 및 적절한 경우에 추가의 조절 요소, 예를 들어 터미네이터를 포함하는 핵산을 의미한다.
하기 기재하는 본 발명의 발현 유닛에 의한 발현 조절과 관련하여, 용어 "유전자"는 바람직하게는 코딩 영역, 및 적절한 경우에 추가의 조절 요소, 예를 들어 터미네이터를 포함하는 핵산을 의미한다.
"코딩 영역"은 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다.
프로모터 활성을 갖는 핵산 및 유전자와 관련하여, "이종"은 사용되는 유전자가 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산의 조절하에 전사되는 야생형에는 존재하지 않지만, 야생형에서 발생하지 않는 새로운 기능적 연결기가 생성되고, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산과 특이적 유전자의 기능적 조합이 야생형에서 일어나지 않는 것을 의미한다.
발현 유닛 및 유전자와 관련하여, "이종"은 사용되는 유전자가 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛의 조절하에 발현되는 야생형에 존재하지 않지만, 야생형에서 발생하지 않은 새로운 기능적 단편을 생성하고, 본 발명의 발현 유닛과 특이적 유전자의 조합이 야생형에서 일어나지 않는 것을 의미한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한
ah) 내인성 유전자의 전사를 조절하는, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내인성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성을 야생형에 비해 증가시키거나, 또는
bh) 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 의해 또는 실시양태 a)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 프로모터 활성을 갖는 핵산과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 전사를 조절함으로써
미생물 내에서의 유전자 전사 속도를 증가 또는 유발시키는 방법에 관한 것이다.
프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 의한 또는 실시양태 ah)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물 내에서의 유전자 전사 조절은, 바람직하게는
bh1) 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 본 발명의 핵산을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 도입된 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나,
bh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내인성 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
bh3) 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한
ar) 내인성 유전자의 전사를 조절하는, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내인성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성을 야생형에 비해 감소시키거나, 또는
br) 실시양태 a)에 따라 감소된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 내인성 유전자의 전사가 감소된 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어하에 일어나도록 함으로써,
미생물 내에서의 유전자 전사 속도를 야생형에 비해 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
c) 내인성 유전자의 발현을 조절하는 본 발명의 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 야생형에 비해 변경시키거나, 또는
d) 본 발명의 발현 유닛에 의해 또는 실시양태 c)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛에 의해 발현 유닛과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 발현을 조절함으로써,
미생물 내에서의 유전자 발현 속도를 야생형에 비해 변경 또는 유발시키는 방법에 관한 것이다.
실시양태 c)에 따르면, 미생물 내에서의 유전자 발현 속도는 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 변경, 즉 증가 또는 감소시킴으로써 야생형에 비해 변경 또는 유발시킬 수 있다. 이는, 예를 들면, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 서열의 표적화된 돌연변이화, 즉 뉴클레오티드의 표적화된 치환, 결실 또는 삽입에 의해 일어날 수 있다. 예를 들면, 샤인-달가노 서열 및 번역 개시 코돈 사이의 거리를 연장시키면 통상적으로 특이적 발현 활성이 변화, 감소 또는 향상된다. 특이적 발현 활성은 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입을 통해 번역 개시 코돈으로부터 샤인-달가노 영역 (리보좀 결합 부위)의 서열의 거리를 단축 또는 연장시킴으로서 변경시킬 수 있다. 이는 또한, 상보적인 3' 측면 16S rRNA에 대한 상동성이 향상 또는 감소되도록 샤인-달가노 영역의 서열을 변경시킴으로서 달성될 수도 있다.
"특이적 발현 활성"과 관련하여, 야생형에 비해 증가 또는 감소된다는 것은 특이적 발현 활성이 본 발명의 야생형 발현 유닛, 즉 서열 2의 발현 유닛에 비해 증가 또는 감소되는 것을 의미한다.
실시양태 d)에 따르면, 미생물 내에서의 유전자 발현 속도를 야생형에 비해 변경 또는 유발시키는 것은 본 발명의 발현 유닛에 의해 또는 실시양태 c)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛에 의해 발현 유닛과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 발현을 조절함으로써 일어날 수 있다.
이는 바람직하게는
d1) 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 하나 이상의 본 발명의 발현 유닛을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나,
d2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내인성 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
d3) 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
따라서,
실시양태 d1)에 따라, 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 하나 이상의 본 발명의 발현 유닛을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나,
실시양태 d2)에 따라, 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내인성 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
실시양태 d3)에 따라, 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써,
야생형 내인성 유전자의 발현 속도를 변경, 즉 증가 또는 감소시킬 수 있다.
따라서,
실시양태 d2)에 따라, 하나 이상의 외인성 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내인성 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
실시양태 d3)에 따라, 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 외인성 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써,
외인성 유전자의 발현 속도를 야생형에 비해 유발시킬 수도 있다.
또한, 실시양태 d2)에서, 유전자는 코딩 영역 또는 비코딩 영역에 통합시킴으로써 삽입될 수 있다. 삽입은, 바람직하게는, 비코딩 영역에서 일어난다.
또한, 실시양태 d3)에서, 핵산 작제물은 염색체내 또는 염색체외에 삽입된다. 바람직하게는, 핵산 작제물을 염색체내에 삽입한다.
핵산 작제물은 이하 발현 카세트로도 지칭된다.
실시양태 d)에서, 바람직하게는 실시양태 c)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛이 사용된다. 실시양태 d)에서 이들 발현 유닛은 실시양태 c)에 기재된 바와 같이 미생물에 존재하거나 또는 미생물에서 제조될 수 있으며, 또는 단리된 형태로 미생물 내에 도입될 수도 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한
ch) 내인성 유전자의 발현을 조절하는 본 발명의 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 야생형에 비해 증가시키거나, 또는
dh) 본 발명의 발현 유닛에 의해 또는 실시양태 c)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 발현 유닛에 의해 발현 유닛과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 발현을 조절함으로써,
미생물 내에서의 유전자 발현 속도를 야생형에 비해 증가 또는 유발시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 발현 유닛에 의한 또는 실시양태 c)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 발현 유닛에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현 조절은, 바람직하게는
dh1) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 하나 이상의 본 발명의 발현 유닛을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
dh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내인성 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
dh3) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
본 발명은 또한
cr) 내인성 유전자의 발현을 조절하는 본 발명의 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 야생형에 비해 감소시키거나, 또는
dr) 실시양태 cr)에 따라 감소된 특이적 발현 활성을 갖는 발현 유닛을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 내인성 유전자의 발현이 감소된 발현 활성을 갖는 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 함으로써,
미생물 내에서의 유전자 발현 속도를 야생형에 비해 감소시키는 방법에 관한 것이다.
미생물 내에서의 유전자 전사 속도 및/또는 발현 속도를 변경 또는 유발시키는 상기한 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 유전자는 정밀 화학물질 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이 때 상기 유전자는, 적절한 경우에, 추가의 조절 요소를 포함할 수 있다.
미생물 내에서의 유전자 전사 속도 및/또는 발현 속도를 변경 또는 유발시키는 상기한 본 발명의 방법의 특히 바람직한 실시양태에서, 유전자는 단백질원성 및 비-단백질원성 아미노산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 유기산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 지질 및 지방산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 디올 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 탄수화물 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 방향족 화합물 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 비타민 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 보조인자 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산 및 효소 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이 때 상기 유전자는, 적절한 경우에, 추가의 조절 요소를 포함할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 아미노산 생합성 경로로부터의 단백질은 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 디히드로디피콜리네이트 신테타제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 피루베이트 카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 전사 레귤레이터 LuxR, 전사 레귤레이터 LysR1, 전사 레귤레이터 LysR2, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제, 시스타티오닌 γ-신타제, 시스타티오닌 β-리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제, 포스포세린 포스파타제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 호모세린 데히드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제, 트레오닌 엑스포터 캐리어, 트레오닌 데히드라타제, 피루베이트 옥시다제, 리신 엑스포터, 비오틴 리가제, 시스테인 신타제　I, 시스테인 신타제 II, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제, 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 서브유닛 1 및 2, 포스포아데노신-포스포술페이트 리덕타제, 페레독신-술피트 리덕타제, 페레독신 NADP 리덕타제, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제, RXA00655 레귤레이터, RXN2910 레귤레이터, 아르기닐-tRNA 신테타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 트레오닌 유출 단백질, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, 프룩토스-1,6-비스포스파타제, 술페이트 환원 단백질 RXA077, 술페이트 환원 단백질 RXA248, 술페이트 환원 단백질 RXA247, 단백질 OpcA, 1-포스포프룩토키나제 및 6-포스포프룩토키나제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 기재된 아미노산 생합성 경로로부터의 단백질 중 바람직한 단백질 및 이들 단백질을 코딩하는 핵산은 각각 미생물, 바람직하게는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 박테리아, 바람직하게는 코리네형 박테리아, 특히 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 기원의 단백질 서열 및 핵산 서열이다.
아미노산 생합성 경로로부터의 특히 바람직한 단백질 서열 및 이들 단백질을 코딩하는 상응하는 핵산 서열의 예, 이들을 언급하고 있는 문헌, 및 참조 문헌에서의 이들의 명칭을 표 1에 나열하였다.
Figure 112007014720892-PCT00001
Figure 112007014720892-PCT00002
Figure 112007014720892-PCT00003
아미노산 생합성 경로로부터의 특히 바람직한 단백질 서열 및 이 단백질을 코딩하는 상응하는 핵산 서열의 추가의 예는 소위 fbr2로도 지칭되는 프룩토스-1,6-비스포스파타제 2의 서열 (서열 8) 및 프룩토스-1,6-비스포스파타제 2를 코딩하는 상응하는 핵산 서열 (서열 7)이다.
아미노산 생합성 경로로부터의 특히 바람직한 단백질 서열 및 이 단백질을 코딩하는 상응하는 핵산 서열의 추가의 예는 소위 RXA077로도 지칭되는 술페이트 환원 단백질의 서열 (서열 10) 및 술페이트 환원 단백질을 코딩하는 상응하는 핵산 서열 (서열 9)이다.
또한, 아미노산 생합성 경로로부터의 특히 바람직한 단백질 서열은 각각의 경우에 상기 단백질에 대해 표 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 여기서 각각의 단백질은 상기 아미노산 서열에 대해 표 2/컬럼 2에 나타낸 하나 이상의 아미노산 위치에서 동일한 행의 표 2/컬럼 3에 나타낸 각각의 아미노산과 상이한 단백질원성 아미노산을 갖는다. 보다 바람직한 실시양태에서, 단백질은 아미노산 서열에 대해 표 2/컬럼 2에 나타낸 하나 이상의 아미노산 위치에서 동일한 행의 표 2/컬럼 4에 나타낸 아미노산을 갖는다. 표 2에 나타낸 단백질은 특히 유리한 특성을 갖고 따라서 본 발명의 프로모터를 통한 상응하는 핵산의 발현 및 아미노산 생산에 특히 적합한 아미노산 생합성 경로의 돌연변이화된 단백질이다. 예를 들어, 돌연변이 T311I는 스위치 오프되는 ask의 피드백 억제를 야기한다.
표 2로부터 상기 기재된 돌연변이화된 단백질을 코딩하는 상응하는 핵산은 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
돌연변이화된 단백질을 코딩하는 핵산 서열 제조시 적합한 출발점은, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수할 수 있는 기탁번호 ATCC　13032의 코리네박테리움 글루타미굼 균주의 게놈, 또는 표 1에 언급된 핵산 서열이다. 돌연변이화된 단백질의 아미노산 서열을 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 역-번역하는 경우, 핵산 서열이 도입될 예정이거나 또는 핵산 서열이 존재하는 유기체의 코돈 사용 빈도를 사용하는 것이 유리하다. 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미굼의 코돈 사용 빈도를 사용하는 것이 유리하다. 특정 유기체의 코돈 사용 빈도는 바람직한 유기체로부터의 1종 이상의 단백질 및 이 단백질을 코딩하는 하나의 유전자를 기재하고 있는 데이타베이스 또는 특허 출원서로부터 당업계에 공지된 방식으로 확인할 수 있다.
표 2의 정보는 다음과 같은 방식으로 이해될 것이다:
컬럼 1 "명칭"에서, 표 1에 관련하여 각 서열에 대한 명확한 명칭이 제시된다.
컬럼 2 "AA-POS"에서, 각각의 숫자는 표 1로부터 상응하는 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치를 의미한다. 따라서, 컬럼 "AA-POS"에서 "26"은 상응하는 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치 26을 의미한다. 위치 넘버링은 N 말단에서 +1로 시작한다.
컬럼 3 "AA-야생형"에서, 각각의 문자는 표 1의 서열의 상응하는 야생형 균주에서 컬럼 2에 나타낸 위치에 1문자 코드로 나타낸 아미노산을 지칭한다.
컬럼 4 "AA-돌연변이체"에서, 각각의 문자는 상응하는 돌연변이체 균주에서 컬럼 2에 나타낸 위치에 1문자 코드로 나타낸 아미노산을 지칭한다.
컬럼 5 "기능"에서, 상응하는 폴리펩티드 서열의 생리학적 기능이 제시된다.
특정 기능 (컬럼 5) 및 특정 초기 아미노산 서열 (표 1)을 갖는 돌연변이화된 단백질에 대해, 컬럼 2, 3 및 4는 하나 이상의 돌연변이 및 일부 서열에 대한 다수의 돌연변이를 기재하고 있다. 상기 다수의 돌연변이는 항상 각각의 경우에 상기 가장 근접한 초기 아미노산 서열을 나타낸다 (표 1). 용어 특정 아미노산 서열의 "하나 이상의 아미노산 위치"는 바람직하게는 컬럼 2, 3 및 4에서 상기 아미노산 서열에 대해 기재된 하나 이상의 돌연변이를 의미한다.
단백질원성 아미노산의 1문자 코드는 다음과 같다.
A 알라닌
C 시스테인
D 아스파르테이트
E 글루타메이트
F 페닐알라닌
G 글리신
H 히스티딘
I 이소류신
K 리신
L 류신
M 메티오닌
N 아스파라긴
P 프롤린
Q 글루타민
R 아르기닌
S 세린
T 트레오닌
V 발린
W 트립토판
Y 티로신
Figure 112007014720892-PCT00004
Figure 112007014720892-PCT00005
미생물 내에서의 유전자 전사 속도 및/또는 발현 속도를 변경 또는 유발시키는 본 발명의 상기한 방법, 및 하기 기재하는 유전자 조작 미생물의 생산 방법, 하기 기재하는 유전자 조작 미생물 및 하기 기재하는 생합성 산물의 생산 방법에서, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 유닛, 상기 기재된 유전자, 및 상기 기재된 핵산 작제물 또는 발현 카세트는 바람직하게는 SacB 방법에 의해 미생물, 특히 코리네형 박테리아에 도입시킨다.
SacB 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌 [Schaefer A, Tauch A, Jaeger W, Kalinowski J, Thierbach G, Puehler A.; Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19:selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene. 1994 Jul 22; 145(1):69-73] 및 [Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein BI.; Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101 replicon; Mol Microbiol. 1991 Jun; 5(6):1447-57]에 기재되어 있다.
상기 기재한 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 미생물 내에서의 유전자 전사 속도 및/또는 발현 속도는 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 발현 유닛을 미생물 내에 도입시킴으로써 변경 또는 유발된다.
상기 기재한 본 발명의 방법의 보다 바람직한 실시양태에서, 미생물 내에서의 유전자 전사 속도 및/또는 발현 속도는 상기 기재된 핵산 작제물 또는 발현 카세트를 미생물 내에 도입시킴으로써 변경 또는 유발된다.
따라서, 본 발명은 또한
하나 이상의 본 발명의 발현 유닛,
하나 이상의 발현시킬 추가의 핵산 서열 (즉, 발현시킬 유전자), 및
적절한 경우에, 추가의 유전자 제어 성분 (예를 들면, 터미네이터)
를 포함하며, 여기서 하나 이상의 발현 유닛과 발현시킬 추가의 핵산 서열은 서로 기능적으로 연결되어 있고, 발현시킬 추가의 핵산 서열이 발현 유닛과는 이종인 발현 카세트에 관한 것이다.
발현시킬 핵산 서열은, 바람직하게는 정밀 화학물질 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산이다.
발현시킬 핵산 서열은, 특히 바람직하게는 단백질원성 및 비-단백질원성 아미노산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 유기산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 지질 및 지방산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 디올 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 탄수화물 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 방향족 화합물 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 비타민 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 보조인자 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산 및 효소 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
아미노산 생합성 경로로부터의 바람직한 단백질은 상기 기재되어 있으며, 그의 예는 표 1 및 2에 기재되어 있다.
본 발명의 발현 카세트 내에서 발현시킬 유전자에 대한 발현 유닛의 물리적 위치는 발현 유닛이 발현시킬 유전자의 전사, 및 바람직하게는 번역도 조절하여 하나 이상의 단백질을 생산할 수 있도록 선택된다. 이와 관련하여 "생산할 수 있는"은 구성적인 생산 증가, 특정 조건하에서의 생산 감소 또는 차단 및/또는 특정 조건하에서의 생산 증가를 포함한다. 이와 관련하여, "조건"은 (1) 배양 배지로의 성분의 첨가, (2) 배양 배지로부터의 성분 제거, (3) 배양 배지 중 한 가지 성분의 제2 성분으로의 교체, (4) 배양 배지의 온도 상승, (5) 배양 배지의 온도 감소, 및 (6) 예를 들면 배양 배지에서 유지되는 산소 또는 질소 농도와 같은 대기 조건의 조절을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌 ["Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., editors, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)]에서 찾아볼 수 있다. 플라스미드 이외에도, 벡터는 당업자에게 공지된 다른 모든 벡터, 예를 들면 파지, 트랜스포존, IS 성분, 파스미드, 코스미드, 및 선형 또는 원형 DNA를 의미한다. 이들 벡터는 숙주 유기체에서의 자발적 복제 또는 염색체 복제를 수행할 수 있다.
적합한, 및 특히 바람직한 플라스미드는 코리네형 박테리아에서 복제되는 것이다. 다수의 공지된 플라스미드 벡터, 예를 들면 pZ1 (문헌 [Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64:549-554), pEKEx1 (문헌 [ikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)]) 또는 pHS2-1 (문헌 [Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)])은 잠적(cryptic) 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1 기재의 것이다. 다른 플라스미드 벡터, 예를 들면 pCLiK5MCS, 또는 pCG4 (US-A 4,489,160), pNG2 (문헌 [Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)]) 또는 pAG1 (US-A 5,158,891) 기재의 벡터를 동일한 방식으로 사용될 수 있다.
염색체로의 통합에 의한 유전자 증폭 방법, 예를 들면 문헌 [Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]에 기재된 hom-thrB 오페론의 복제 및 증폭 방법을 사용할 수 있는 플라스미드 벡터가 또한 적합하다. 이 방법에서, 완전한 유전자는 숙주 (통상적으로는 이. 콜라이(E. coli))에서는 복제될 수 있지만 씨. 글루타미쿰에서는 복제될 수 없는 플라스미드 벡터에 클로닝된다. 적합한 벡터의 예로는 SUP301 (문헌 [Sirnon et al., Bio/ Technology 1,784-791 (1983)]), pK18mob 또는 pK19mob (문헌 [Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)], [Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234:534-541 (1993)]), pEM1 (문헌 [Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516]) 또는 pBGS8 (문헌 [Spratt et al., 1986, Gene 41:337-342])이 있다. 증폭시킬 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터는 이후에 형질전환에 의해 목적하는 씨. 글루타미쿰 균주로 전달된다. 형질전환 방법은, 예를 들면 문헌 [Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)], [Dunican and Shivnan, Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)] 및 [Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기재되어 있다.
본 발명은 또한,
유전자 조작이 하나 이상의 유전자의 전사 속도를 야생형에 비해 변경 또는 유발시키며,
a) 하나 이상의 내인성 유전자의 전사를 조절하는, 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 내인성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성이 변경되거나, 또는
b) 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 또는 실시양태 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 프로모터 활성을 갖는 핵산과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 전사가 조절되는 것에 의존하는 것인, 유전자 조작 미생물에 관한 것이다.
방법에 대해 상기 기재한 바와 같이, 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 또는 실시양태 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물 내에서의 유전자 전사 조절은
b1) 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 전사가 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나,
b2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 내인성 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
b3) 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
본 발명은 또한
ah) 내인성 유전자의 전사를 조절하는, 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 내인성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성이 야생형에 비해 증가되거나, 또는
bh) 프로모터 활성을 갖는 핵산과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 전사가 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 또는 실시양태 ah)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 조절되는 것인,
하나 이상의 유전자의 전사 속도가 야생형에 비해 증가 또는 유발된 유전자 조작 미생물에 관한 것이다.
방법에 대해 상기 기재한 바와 같이, 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 또는 실시양태 a)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물 내에서의 유전자 전사의 조절은
bh1) 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나,
bh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 내인성 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
bh3) 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
본 발명은 또한
ar) 하나 이상의 내인성 유전자의 전사를 조절하는, 청구항 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 내인성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성이 야생형에 비해 감소되거나, 또는
br) 실시양태 a)에 따라 감소된 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산이 미생물의 게놈에 도입되어, 하나 이상의 내인성 유전자의 전사가 감소된 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어하에 일어나는 것인,
하나 이상의 유전자의 전사 속도가 야생형에 비해 감소된 유전자 조작 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또한
유전자 조작이 하나 이상의 유전자의 발현 속도를 야생형에 비해 변경 또는 유발시키며, 이 유전자 조작은
c) 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 조절하는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 변경되거나, 또는
d) 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 또는 실시양태 a)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 발현 유닛과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 발현이 조절되는 것에 의존하는 것인, 유전자 조작 미생물에 관한 것이다.
방법에 대해 상기 기재한 바와 같이, 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 또는 실시양태 a)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 미생물 내에서의 유전자 발현 조절은
d1) 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 발현 유닛을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나,
d2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 내인성 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
d3) 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
본 발명은 또한
ch) 내인성 유전자의 발현을 조절하는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 증가되거나, 또는
dh) 발현 유닛과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 발현이 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 또는 실시양태 a)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 조절되는 것인,
하나 이상의 유전자의 발현 속도가 야생형에 비해 증가 또는 유발된 유전자 조작 미생물에 관한 것이다.
방법에 대해 상기 기재한 바와 같이, 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의한 또는 실시양태 a)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현 조절은
dh1) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 발현 유닛을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나,
dh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 내인성 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
dh3) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
본 발명은 또한
cr) 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 조절하는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 감소되거나, 또는
dr) 감소된 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 발현 유닛이 미생물의 게놈에 도입되어, 하나 이상의 유전자의 발현이 감소된 발현 활성을 갖는 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나는 것인,
하나 이상의 유전자의 발현 속도가 야생형에 비해 감소된 유전자 조작 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 청구항 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛 및 발현 유닛과는 이종인 기능적으로 연결된 발현시킬 유전자를 포함하는 유전자 조작 미생물에 관한 것이다.
이 유전자 조작 미생물은, 특히 바람직하게는 본 발명의 발현 카세트를 포함한다.
본 발명은, 특히 바람직하게는 본 발명에 따라 정의된 하나 이상의 재조합 핵산 작제물을 보유하는 벡터, 특히 셔틀(shuttle) 벡터 또는 플라스미드 벡터를 포함하는 유전자 조작 미생물, 특히 코리네형 박테리아에 관한 것이다.
유전자 조작 미생물의 바람직한 실시양태에서, 상기 기재된 유전자는 정밀 화학물질 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산이다.
유전자 조작 미생물의 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 기재된 유전자는 단백질원성 및 비-단백질원성 아미노산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 유기산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 지질 및 지방산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 디올 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 탄수화물 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 방향족 화합물 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 비타민 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 보조인자 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산 및 효소 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 유전자는, 적절한 경우에, 추가의 조절 요소를 포함할 수 있다.
아미노산 생합성 경로로부터의 바람직한 단백질은 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 디히드로디피콜리네이트 신테타제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 피루베이트 카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 전사 레귤레이터 LuxR, 전사 레귤레이터 LysR1, 전사 레귤레이터 LysR2, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제, 시스타티오닌 γ-신타제, 시스타티오닌 β-리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제, 포스포세린 포스파타제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 호모세린 데히드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제, 트레오닌 엑스포터 캐리어, 트레오닌 데히드라타제, 피루베이트 옥시다제, 리신 엑스포터, 비오틴 리가제, 시스테인 신타제　I, 시스테인 신타제 II, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 서브유닛 1 및 2, 포스포아데노신-포스포술페이트 리덕타제, 페레독신-술피트 리덕타제, 페레독신 NADP 리덕타제, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제, RXA00655 레귤레이터, RXN2910 레귤레이터, 아르기닐-tRNA 신테타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 트레오닌 유출 단백질, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, 프룩토스-1,6-비스포스파타제, 술페이트 환원 단백질 RXA077, 술페이트 환원 단백질 RXA248, 술페이트 환원 단백질 RXA247, 단백질 OpcA, 1-포스포프룩토키나제 및 6-포스포프룩토키나제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
아미노산 생합성 경로로부터의 단백질 및 유전자의 특히 바람직한 예는 상기 표 1 및 표 2에 기재되어 있다.
바람직한 미생물 또는 유전자 조작 미생물은 박테리아, 조류, 진균 또는 효모이다.
특히 바람직한 미생물은, 특히 코리네형 박테리아이다.
바람직한 코리네형 박테리아는 코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라세콜라 (Corynebacterium melassecola) 종, 및 코리네박테리움 에피시엔스 (Corynebacterium efficiens) 종 또는 브레비박테리움 속, 특히 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) 및 브레비박테리움 디바리카툼 (Brevibacterium divaricatum) 종의 박테리아이다.
코리네박테리움 및 브레비박테리움 속의 특히 바람직한 박테리아는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC 15806, 코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC 13870, 코리네박테리움 써모아미노제네스 FERM BP-1539, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC 17965, 코리네박테리움 에피시엔스 DSM 44547, 코리네박테리움 에피시엔스 DSM 44548. 코리네박테리움 에피시엔스 DSM 44549, 브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC 13869, 브레비박테리움 디바리카툼 ATCC 14020, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10065 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21608로 이루어진 군으로부터 선택된다.
약자 KFCC는 한국 종균 협회 (Korean Federation of Culture Collection)을 의미하고, 약자 ATCC는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션을 의미하고, 약자 DSM은 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)을 의미한다.
코리네박테리움 및 브레비박테리움 속의 특히 더 바람직한 박테리아는 표 3에 나열하였다:
Figure 112007014720892-PCT00006
Figure 112007014720892-PCT00007
Figure 112007014720892-PCT00009
약어는 다음과 같은 의미를 갖는다.
ATCC: 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (미국 메릴랜드주 록빌),
FERM: 퍼멘테이션 리서치 인스티튜트 (Fermentation Research Institute, 일본 지바),
NRRL: ARS 컬쳐 컬렉션, 노던 리져널 리서치 래보러토리 (ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, 미국 일리노이주 페오리아),
CECT: 컬렉시온 에스파놀라 드 컬티보스 티포 (Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, 스페인 발렌시아),
NCIMB: 내셔날 컬렉션 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아 엘티디. (National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., 영국 애버딘),
CBS: 센트라알부로 보어 쉬멜컬쳐스 (Centraalbureau voor Schimmelcultures, 네덜란드 바른),
NCTC: 내셔널 컬렉션 오브 타입 컬쳐스 (National Collection of Type Cultures, 영국 런던),
DSMZ: 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 ((Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, 독일 브룬스빅).
프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 본 발명의 발현 유닛을 통해, 상기 기재된 본 발명의 방법을 이용하여 상기 기재된 본 발명의 유전자 조작 미생물에서 특정 생합성 산물에 대한 대사 경로를 조절할 수 있다.
이러한 목적을 위해, 예를 들면 특정 생합성 산물을 생성하는 대사 경로는, 상기 경로의 유전자 전사 속도 또는 발현 속도를 유발 또는 증가시킴으로써 향상시키며, 이 때 상기 생합성 경로에서는 단백질의 양이 증가하여 목적하는 생합성 경로로부터의 상기 단백질의 총 활성을 증가시킴으로써 목적하는 생합성 산물을 향한 대사 유입을 증가시킨다.
또한, 특정 생합성 산물로부터 분지되는 대사 경로는 이 분지된 생합성 경로의 유전자 전사 속도 또는 발현 속도를 감소시킴으로써 감소시킬 수 있으며, 이 때 상기 분지된 생합성 경로에서는 단백질의 양이 감소하여 원치않는 생합성 경로로부터의 상기 단백질의 총 활성을 감소시킴으로써 목적하는 생합성 산물을 향한 대사 유입을 더 증가시킨다.
본 발명의 유전자 조작 미생물은, 예를 들면 글루코스, 수크로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 생합성 산물을 생산할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 유전자 조작 미생물을 배양함으로써 생합성 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
목적하는 생합성 산물에 따라, 다양한 유전자의 전사 속도 또는 발현 속도는 증가 또는 감소되어야 한다. 통상적으로, 여러 유전자의 전사 속도 또는 발현 속도를 변경시키는 것, 즉 유전자 조합물의 전사 속도 또는 발현 속도를 증가시키고(시키거나) 유전자 조합물의 전사 속도 또는 발현 속도를 감소시키는 것이 유리하다.
본 발명의 유전자 조작 미생물에서는, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 발현 유닛에 의해 하나 이상의 유전자의 전사 속도 또는 발현 속도가 변경, 즉 증가 또는 감소될 수 있다.
또한, 유전자 조작 미생물에서 더 변경된 추가의 유전자의 전사 속도 또는 발현 속도, 즉 더 증가되거나 더 감소된 전사 속도 또는 발현 속도는 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 발현 유닛으로부터 유래될 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 유전자 조작 미생물을 배양함으로써 생합성 산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 생합성 산물은 정밀 화학물질이다.
용어 "정밀 화학물질"은 당업계에 공지되어 있으며, 유기체에 의해 생산되고, 예를 들어 제약 산업, 농업, 화장품, 사료 및 식품 산업 등을 비롯한 다양한 산업 분야에 사용되는 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 유기산 (예를 들면, 타르타르산, 이타콘산 및 디아미노피멜산), 및 단백질원성 및 비-단백질원성 아미노산, 퓨린 염기 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 (예를 들면, 문헌 [Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., editors, VCH:Weinheim] 및 여기에 언급된 참고문헌에 기재되어 있음), 지질, 포화 및 불포화 지방산 (예를 들면, 아라키돈산), 디올 (예를 들면, 프로판디올 및 부탄디올), 탄수화물 (예를 들면, 히알루론산 및 트레할로스), 방향족 화합물 (예를 들면, 방향족 아민, 바닐린 및 인디고), 비타민 및 보조인자 (문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH:Weinheim] 및 여기에 언급된 참고문헌; 및 [Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease", Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, held on Sept. 1-3, 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)]에 기재되어 있음), 효소, 및 다른 모든 화합물 (문헌 [Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN:0818805086] 및 여기에 언급된 참고문헌에 기재되어 있음)을 포함한다. 특정 정밀 화학물질의 대사 및 용도는 아래에 추가로 설명하였다.
I. 아미노산 대사 및 용도
아미노산은 모든 단백질의 기본 구조 단위를 포함하며, 따라서 정상적인 세포 기능에 필수적이다. 용어 "아미노산"은 당업계에 공지되어 있다. 20가지 유형의 단백질원성 아미노산은 단백질의 구조 단위로 사용되며, 이들은 펩티드 결합에 의해 서로 연결되어 있고, 한편 비-단백질원성 아미노산 (수백가지 유형이 공지되어 있음)은 보통 단백질에서는 발견되지 않는다 (문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, pp. 57-97 VCH:Weinheim (1985)] 참조). 아미노산은 D 또는 L 배열을 가질 수 있지만, 일반적으로 자연 발생 단백질에서는 L-아미노산만이 발견될 수 있다. 20가지 단백질원성 아미노산 각각의 생합성 및 분해 경로는 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 잘 규명되어 있다 (예를 들면, 문헌 [Stryer, L. Biochemistry, 3rd edition, pp. 578-590 (1988)] 참조). 생합성 과정이 복잡하기 때문에 반드시 음식으로 섭취해야 하는, 소위 "필수" 아미노산 (히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린)은 간단한 생합성 경로에 의해 다른 11가지 "비필수" 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 시스테인, 글루타메이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린 및 티로신)으로 전환된다. 고등 동물은 이들 아미노산 중 일부 합성하는 능력이 있지만, 정상적으로 단백질을 합성하기 위해서는 반드시 음식으로부터 섭취하여야 한다.
단백질 생합성에서의 이들의 기능 이외에도, 상기 아미노산은 그 자체로 흥미로운 화합물이며, 그 다수가 식료품, 사료, 화학 제품, 화장품, 농작물 및 제약 산업에서 다양한 용도로 사용되고 있는 것으로 나타났다. 리신은 인간의 영양 뿐만 아니라 가금류 및 돼지와 같은 단위(monogastric) 종의 영양에 중요한 아미노산이다. 글루타메이트는 향미제 첨가제 (글루탐산 1나트륨, MSG)로서 가장 자주 사용되고, 식품 산업에도 널리 쓰이고 있으며, 아스파르테이트, 페닐알라닌, 글리신 및 시스테인 또한 마찬가지이다. 글리신, L-메티오닌 및 트립토판은 모두 제약 산업에서 사용된다. 글루타민, 발린, 류신, 이소류신, 히스티딘, 아르기닌, 프롤린, 세린 및 알라닌은 제약 산업 및 화장품 산업에서 사용된다. 트레오닌, 트립토판 및 D-/L-메티오닌은 널리 사용되는 사료 첨가제이다 (문헌 [Leuchtenberger, W. (1996) Amino Acids - technical production and use, pp.　466-502 in Rehm et al., (editors) Biotechnology vol. 6, chapter 14a, VCH:Weinheim]). 이들 아미노산은 N-아세틸시스테인, S-카르복시메틸-L-시스테인, (S)-5-히드록시트립토판, 및 문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, pp.　57-97, VCH, Weinheim, 1985]에 기재된 다른 물질과 같은 합성 아미노산 및 단백질 합성에 사용되는 전구체로서 더 적합한 것으로 밝혀졌다.
상기 천연 아미노산의 생합성은 이들을 생산할 수 있는 유기체, 예를 들면 박테리아에서 잘 규명되어 있다 (박테리아 아미노산 생합성 및 그의 조절에 대한 검토는 문헌 [Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47:533 - 606] 참조). 글루타메이트는 시트르산 회로의 중간체인 α-케토글루타레이트의 환원성 아미노화에 의해 합성된다. 글루타민, 프롤린 및 아르기닌은 각각 글루타메이트로부터 연속적으로 생성된다. 세린의 생합성은 3-단계 방법으로 일어나며, 이는 3-포스포글리세레이트 (해당 과정의 중간체)로 출발하여, 산화, 아미노기 전이 및 가수분해 단계를 거쳐 세린을 생성한다. 시스테인 및 글리신은 각각 세린으로부터 생성되는데, 시스테인은 호모시스테인과 세린의 축합에 의해 생성되고, 글리신은 세린 트랜스히드록시메틸라제에 의해 촉매되는 반응에 의해 측쇄 β-탄소 원자를 테트라히드로폴레이트로 전달하여 생성된다. 페닐알라닌 및 티로신은 해당 과정 및 5탄당 포스페이트 경로의 전구체인 에리트로스 4-포스페이트 및 포스포에놀피루베이트로부터 프레페네이트를 합성한 후에 9-단계 생합성 경로 (최종 두 단계만이 상이함)에 의해 합성된다. 이와 마찬가지로, 트립토판은 상기 두 가지 출발 분자로부터 생성되지만, 11-단계 경로를 통해 합성된다. 또한, 티로신은 페닐알라닌으로부터 페닐알라닌 히드록실라제에 의해 촉매되는 반응에 의해 생성될 수 있다. 알라닌, 발린 및 류신은 각각 해당 과정의 최종 산물인 피루베이트의 생합성 산물이다. 아스파르테이트는 시트르산 회로의 중간체인 옥살로아세테이트로부터 형성된다. 아스파라긴, 메티오닌, 트레오닌 및 리신은 각각 아스파르테이트를 전환시켜 생성된다. 이소류신은 트레오닌으로부터 형성된다. 히스티딘은 활성화된 당인 5-포스포리보실 1-피로포스페이트로부터 복잡한 9-단계 경로에 의해 형성된다.
아미노산의 양이 세포의 단백질 생합성에 필요한 양을 초과한 경우, 이러한 아미노산은 저장될 수 없으며, 대신 분해되어 세포의 주요 대사 경로에 사용되는 중간체로 제공된다 (이에 대한 검토는 문헌 [Stryer, L., Biochemistry, 3rd edition, chapter 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle", pp. 495-516 (1988)] 참조). 세포가 불필요한 아미노산을 유용한 대사 중간체로 전환시킬 수 있다 하더라도, 아미노산 생산성은 이들의 합성에 필요한 에너지, 전구체 분자 및 효소의 측면에서 소비적이다. 따라서, 아미노산 생합성이 피드백 억제에 의해 조절되는 것은 놀라운 일이 아니며, 상기 피드백 억제에서는 특정 아미노산의 존재량이 서서히 감소하거나 그의 자체 생산이 완전히 종결된다 (아미노산 생합성 경로에서의 피드백 메카니즘에 대한 검토는 문헌 [Stryer,　L., Biochemistry, 3rd edition, chapter 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", pp. 575-600 (1988)] 참조). 따라서, 특정 아미노산의 산출량은 세포내 상기 아미노산의 양에 의해 제한된다.
II. 비타민, 보조인자 및 영양물질 대사 및 용도
비타민, 보조인자 및 영양물질은 추가의 분자 군을 포함한다. 이들은 박테리아와 같은 다른 유기체에 의해 용이하게 합성되지만, 고등 동물은 이를 합성하는 능력을 상실하였기 때문에 섭취할 필요가 있다. 이들 분자는 본래 생물학적으로 활성인 분자이거나, 전자 전달자로 사용되는 생물학적으로 활성인 물질의 전구체이거나, 또는 다수의 대사 경로에서의 중간체이다. 이들 화합물은, 영양학적 가치 이외에도, 착색제, 항산화제 및 촉매, 또는 다른 공정 보조제로서 상당한 산업적 가치를 갖는다 (이들 화합물의 구조, 활성 및 산업상 용도에 대한 검토는, 예를 들면 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", vol. A27, pp. 443-613, VCH:Weinheim, 1996] 참조). 용어 "비타민"은 당업계에 공지되어 있으며, 유기체의 정상적인 기능에 필요하지만 유기체 스스로는 합성할 수 없는 영양소를 포함한다. 비타민 군은 보조인자 및 영양물질 화합물을 포함한다. 용어 "보조인자"는 정상적인 효소 활성 발생에 필수적인 비-단백질성 화합물을 포함한다. 이들 화합물은 유기물 또는 무기물일 수 있으며, 본 발명의 보조인자 분자는 바람직하게는 유기물이다. 용어 "영양물질"은 식물 및 동물, 특히 인간의 건강을 증진시키는 식품 첨가제를 포함한다. 이러한 분자의 예로는 비타민, 항산화제 및 특정 지질 (예를 들면, 다중불포화 지방산)이 있다.
이들 분자의 생합성은 이들을 생산할 수 있는 유기체, 예컨대 박테리아에서 상세하게 규명되어 있다 (문헌 [Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" vol. A27, p.443-613, VCH:Weinheim, 1996], [Michal, G. (1999) Biochemical Pathways:An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley ＆.. Sons], [Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, held on Sept. 1-3, 1994, in Penang, Malaysia, AOCS Press:Champaign, IL X, 374 S]).
티아민 (비타민 B1)은 피리미딘과 티아졸 단위의 화학적 커플링에 의해 형성된다. 리보플라빈 (비타민 B2)은 구아노신 5'-트리포스페이트 (GTP) 및 리보스 5-포스페이트로부터 합성된다. 리보플라빈은 이후에 플라빈 모노뉴클레오티드 (FMN) 및 플라빈-아데닌 디뉴클레오티드 (FAD) 합성에 사용된다. "비타민 B6"으로 총칭되는 화합물 족 (예들 들면, 피리독신, 피리독사민, 피리독살 5'-포스페이트, 및 상업적으로 시판되는 피리독신 히드로클로라이드)는 모두 공통적인 구조 단위인 5-히드록시-6-메틸피리딘의 유도체이다. 판토테네이트 (판토텐산, R-(+)-N-(2,4-디히드록시-3,3-디메틸-1-옥소부틸)-β-알라닌)은 화학적 합성 또는 발효에 의해 생산될 수 있다. 판토테네이트 생합성의 마지막 단계는 β-알라닌과 판토산의 ATP-구동 축합으로 이루어진다. 판토산, β-알라닌으로 전환시키는 생합성 단계 또는 판토텐산으로 축합시키는 생합성 단계를 담당하는 효소는 공지되어 있다. 판토테네이트의 대사적으로 활성인 형태는 조효소 A로, 그의 생합성은 5-단계의 효소 반응을 통해 진행된다. 판토테네이트, 피리독살 5-포스페이트, 시스테인 및 ATP는 조효소 A의 전구체이다. 이들 효소는 판토테네이트 형성 뿐만 아니라 (R)-판토산, (R)-판토락톤, (R)-판테놀 (프로비타민 B5), 판테테인 (그의 유도체) 및 조효소 A의 생산을 촉매한다.
전구체 분자인 피멜로일-CoA로부터의 비오틴 생합성은 미생물에서 상세하게 연구되어 있으며, 이에 관여하는 유전자 중 몇 가지가 확인되었다. 상응하는 단백질 중 다수가 Fe 클러스터 합성에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 이들은 nifS 단백질 군에 속한다. 리포산은 옥탄산으로부터 유도되고, 에너지 대사에서 조효소로 사용되는데, 이 때 상기 리포산은 피루베이트 데히드로게나제 복합체 및 β-케토글루타레이트 데히드로게나제 복합체의 구성 성분이 된다. 폴레이트는 모두 엽산으로부터 유도되는 물질 군으로, 차례로 L-글루탐산, p-아미노벤조산 및 6-메틸프테린으로부터 유도된다. 대사 중간체인 구아노신 5'-트리포스페이트 (GTP), L-글루탐산 및 p-아미노벤조산으로부터 출발하는 엽산 및 그의 유도체의 생합성은 일부 미생물에서 상세하게 연구되어 있다.
코리노이드 (예컨대, 코발라민, 및 특히 비타민 B12) 및 포르피린은 테트라피롤 고리계에 의해 구별되는 화합물 군에 속한다. 비타민 B12의 생합성은 너무 복잡하여 아직 완전하게 규명되지는 않았지만, 이에 관여하는 효소 및 기질은 대부분 공지되어 있다. 니코틴산 (니코티네이트) 및 니코틴아미드는 피리딘 유도체이며, "니아신"으로 불리기도 한다. 니아신은 중요한 조효소인 NAD (니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드) 및 NADP (니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트) 및 이들이 환원된 형태의 전구체이다.
이들 화합물 중 일부, 예컨대 리보플라빈, 비타민 B6, 판토테네이트 및 비오틴이 상기와 마찬가지로 미생물의 대규모 배양에 의해 생산되기는 하지만, 이들 화합물의 산업적 규모의 생산은 대개의 경우 세포-무함유 화합물 합성에 의존하고 있는 실정이다. 비타민 B12만은 그의 합성이 복잡하기 때문에 발효에 의해서만 생성된다. 시험관내 방법은 상당한 양의 재료 및 시간 소비를 필요로 하며, 많은 비용이 소비되기도 한다.
III. 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 대사 및 용도
퓨린 및 피리미딘 대사를 위한 유전자 및 이들의 상응하는 단백질은 신생물 질환 및 바이러스 감염 치료에 중요한 표적이다. 용어 "퓨린" 또는 "피리미딘"은 핵산, 조효소 및 뉴클레오티드의 구성 성분인 질소 함유 염기를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드"는 질소 함유 염기, 5탄당 (RNA의 경우 당은 리보스이고, DNA의 경우 당은 D-데옥시리보스임) 및 인산으로 구성된 핵산 분자의 기본 구조 단위를 포함한다. 용어 "뉴클레오시드"는 뉴클레오티드의 전구체로서 사용되지만, 뉴클레오티드와는 달리 인산 단위를 갖지 않는 분자를 포함한다. 이들 분자의 생합성 또는 핵산 분자 형성을 위한 이들의 동원을 억제함으로써 RNA 및 DNA 합성을 억제할 수 있으며, 발암 세포에서 이러한 활성을 표적 억제시킴으로써 종양 세포의 분열 및 복제 능력을 억제시킬 수 있다.
또한, 핵산 분자를 형성하기 보다는, 에너지 저장소 (즉, AMP) 및 조효소 (즉, FAD 및 NAD)로 사용되는 뉴클레오티드도 있다.
퓨린 및/또는 피리미딘 대사가 영향을 끼치는 상기 화합물의 상기 의학적 처방에 있어서의 용도가 여러 문헌에 기재되어 있다(예를 들면, 문헌 [Christopherson, R.I. 및 Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents." Med. Res. Reviews 10:505-548]). 퓨린 및 피리미딘 대사에 관여하는 효소에 대한 연구는, 예를 들면 면역저해제 또는 항증식제로 사용될 수 있는 신약 개발에 초점을 두고 있다 (문헌 [Smith, J.L. "Enzymes in Nucleotide Synthesis." Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757]; [Biochem. Soc. Transact. 23 (1995) 877-902]). 그러나, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는, 다양한 정밀 화학물질 (예를 들면, 티아민, S-아데노실메티오닌, 폴레이트 또는 리보플라빈) 생합성에서의 중간체, 세포를 위한 에너지 전달자 (예를 들면, ATP 또는 GTP) 및 통상 향증진제로 사용되는 화합물 자체를 위한 에너지 전달자 (예를 들면, IMP 또는 GMP)로서, 또는 다수의 의학적 용도 (예를 들어, 문헌 [Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Compounds" in Biotechnology, vol. 6, Rehm et al., editors VCH:Weinheim, pp. 561-612] 참조)와 같은 다른 용도로도 사용될 수도 있다. 또한, 퓨린, 피리딘, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대사에 관여하는 효소가 살균제, 제초제 및 살충제를 비롯한 농작물 보호용 화합물 개발을 위한 표적으로 사용되는 연구가 점점 증가하고 있다.
박테리아에서의 상기 화합물의 대사는 규명되어 있다 (이에 대한 검토는, 예를 들어 문헌 [Zalkin, H. and Dixon, J. E. (1992) "De novo purine nucleotide biosynthesis", in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology, vol. 42, Academic Press, p.259-287] 및 [Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleosides", Chapter 8 in:Biochemical Pathways:An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York] 참조). 집중적으로 연구되고 있는 퓨린 대사는 세포가 정상적인 기능을 발휘하는데 필수적이다. 고등 동물에서 손상된 퓨린 대사는 심각한 장애, 예를 들면 통풍을 초래할 수 있다. 퓨린 뉴클레오티드는 리보스 5-포스페이트로부터 여러 단계를 거쳐 중간체 화합물인 이노신 5'-포스페이트 (IMP)를 통해 구아노신 5'-모노포스페이트 (GMP) 또는 아데노신 5'-모노포스페이트 (AMP)를 생성함으로써 합성되며, 이들로부터 뉴클레오티드로 사용되는 트리포스페이트 형태가 용이하게 제조될 수 있다. 이들 화합물은 또한 에너지 저장소로도 사용되는데, 이들은 분해시 다수의 상이한 세포내 생화학적 과정에 에너지를 공급한다. 피리미딘 생합성은 리보스 5-포스페이트로부터 우리딘 5'-모노포스페이트 (UMP)를 형성함으로써 진행된다. UMP는 이어서 시티딘 5'-트리포스페이트 (CTP)로 전환된다. 모든 뉴클레오티드의 데옥시 형태는 뉴클레오티드의 디포스페이트 리보스 형태로부터 뉴클레오티드의 디포스페이트 데옥시리보스 형태를 생성하는 1-단계 환원 반응에서 제조된다. 인산화된 후에, 이들 분자는 DNA 합성에 참여할 수 있다.
IV. 트레할로스 대사 및 용도
트레할로스는 α,α-1,1 연결기를 통해 서로 연결된 2개의 글루코스 분자로 구성된다. 트레할로스는 통상적으로 식품 산업에서 감미료, 건조 또는 냉동 식품 첨가제로서 사용되며, 음료에도 사용된다. 그러나, 트레할로스는 또한 제약 산업, 화장품 및 생명공학 산업에서도 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Nishimoto et al., (1998) US patent No. 5,759,610]; [Singer, M.A. and Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467]; [Paiva, C.L.A. and Panek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314]; 및 [Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102] 참조). 트레할로스는 여러 미생물의 효소에 의해 생산되어 자연적 방식으로 주변 배지에 방출되며, 이를 당업계에 공지된 방법에 의해 단리할 수 있다.
특히 바람직한 생합성 산물은 유기산, 단백질, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 단백질원성 및 비-단백질원성 아미노산 둘 모두, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민 및 보조인자, 효소 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 유기산은 타르타르산, 이타콘산 및 디아미노피멜산이다.
바람직한 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는, 예를 들면 문헌 [Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, in Biotechnology, vol. 6, Rehm et al., editors VCH:Weinheim] 및 여기에 언급된 참고문헌에 기재되어 있다.
바람직한 생합성 산물은 또한, 지질, 포화 및 불포화 지방산 (예를 들면, 아라키돈산), 디올 (예를 들면, 프로판디올 및 부탄디올), 탄수화물 (예를 들면, 히알루론산 및 트레할로스), 방향족 화합물 (예를 들면, 방향족 아민, 바닐린 및 인디고), 비타민 및 보조인자 (예를 들어, 문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH:Weinheim] 및 여기에 언급된 참고문헌; 및 [Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, held on Sept. 1-3, 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)]에 기재되어 있음); 효소, 폴리케티드 (문헌 [Cane et al . (1998) Science 282:63-68]); 및 다른 모든 화합물 (문헌 [Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN:0818805086] 및 여기에 언급된 참고문헌에 기재되어 있음)이다.
특히 바람직한 생합성 산물은 아미노산, 특히 바람직하게는 필수 아미노산, 특히 L-글리신, L-알라닌, L-류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-리신, L-글루타민, L-글루탐산, L-세린, L-프롤린, L-발린, L-이소류신, L-시스테인, L-티로신, L-히스티딘, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산 및 L-트레오닌, L-호모세린, 특히 L-리신, L-메티오닌 및 L-트레오닌이다. 아미노산, 예를 들어 리신, 메티오닌 및 트레오닌은 이하에서 각각의 경우에 아미노산의 L 및 D 형태 둘 모두, 바람직하게는 L 형태, 예를 들면 L-리신, L-메티오닌 및 L-트레오닌을 의미한다.
특히, 본 발명은 하나 이상의 유전자의 발현 속도가 야생형에 비해 증가 또는 유발된 유전자 조작 미생물을 배양함으로써 리신을 생산하는 방법에 관한 것으로, 여기서
ch) 내인성 유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 본 발명의 내인성 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 증가되거나, 또는
dh) 발현 유닛과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 발현이 본 발명의 발현 유닛에 의해 또는 실시양태 ch)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 발현 유닛에 의해 조절되며,
유전자는 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산, 디히드로디피콜리네이트 신테타제를 코딩하는 핵산, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 전사 레귤레이터 LuxR을 코딩하는 핵산, 전사 레귤레이터 LysR1을 코딩하는 핵산, 전사 레귤레이터 LysR2를 코딩하는 핵산, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 핵산, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 트랜스케톨라제를 코딩하는 핵산, 트랜스알돌라제를 코딩하는 핵산, 리신 엑스포터를 코딩하는 핵산, 비오틴 리가제를 코딩하는 핵산, 아르기닐-tRNA 신테타제를 코딩하는 핵산, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 프룩토스-1,6-비스포스파타제를 코딩하는 핵산, 단백질 OpcA를 코딩하는 핵산, 1-포스포프룩토키나제를 코딩하는 핵산 및 6-포스포프룩토키나제를 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
방법에 대해 상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 발현 유닛에 의한 또는 실시양태 ch)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현 조절은
dh1) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 하나 이상의 본 발명의 발현 유닛을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나,
dh2) 하나 이상의 상기 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내인성 발현 유닛의 제어하게 일어나도록 하거나, 또는
dh3) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
리신 제조에 대해 상기 기재한 방법의 보다 바람직한 실시양태는 유전자 조작 미생물이 아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 활성, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제 활성, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제 활성, 디히드로디피콜리네이트 신테타제 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 전사 레귤레이터 LuxR 활성, 전사 레귤레이터 LysR1 활성, 전사 레귤레이터 LysR2 활성, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제 활성, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 활성, 트랜스케톨라제 활성, 트랜스알돌라제 활성, 리신 엑스포터 활성, 아르기닐-tRNA 신테타제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 활성, 프룩토스-1,6-비스포스파타제 활성, 단백질 OpcA 활성, 1-포스포프룩토키나제 활성, 6-포스포프룩토키나제 활성 및 비오틴 리가제 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성이 야생형에 비해 더 증가된 활성을 갖는 방법을 포함한다.
리신 제조에 대해 상기 기재한 방법의 특히 더 바람직한 실시양태는 유전자 조작 미생물이 트레오닌 데히드라타제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 호모세린 키나제 활성, 호모세린 데히드로게나제 활성, 트레오닌 엑스포터 활성, 트레오닌 유출 단백질 활성, 아스파라기나제 활성, 아스파르테이트 데카르복실라제 활성 및 트레오닌 신타제 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성이 야생형에 비해 더 감소된 활성을 갖는 방법을 포함한다.
상기 기재된 하나 이상의 활성 중 더 증가되거나 감소된 활성은 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 발현 유닛에 의해 유발될 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 유전자의 발현 속도가 야생형에 비해 증가 또는 유발된 유전자 조작 미생물을 배양함으로써 메티오닌을 생산하는 방법에 관한 것으로, 여기서
ch) 내인성 유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 본 발명의 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 증가되거나, 또는
dh) 발현 유닛과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 발현이 본 발명의 발현 유닛에 의해 또는 실시양태 ch)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛에 의해 조절되며,
유전자는 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 시스타티오닌 γ-신타제를 코딩하는 핵산, 시스타티오닌 β-리아제를 코딩하는 핵산, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제를 코딩하는 핵산, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 핵산, 세린 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 시스테인 신타제 I을 코딩하는 핵산, 시스테인 신타제 II를 코딩하는 핵산, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제를 코딩하는 핵산, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제를 코딩하는 핵산, 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 포스포아데노신-포스포술페이트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 페레독신-술피트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 페레독신 NADPH-리덕타제를 코딩하는 핵산, 페레독신을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA077을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA248을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA247을 코딩하는 핵산, RXA0655 레귤레이터를 코딩하는 핵산 및 RXN2910 레귤레이터를 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
방법에 대해 상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 발현 유닛에 의한 또는 실시양태 ch)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현 조절은
dh1) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 하나 이상의 본 발명의 발현 유닛을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 상기 내인성 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나,
dh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내인성 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
dh3) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
상기한 메티오닌 제조 방법의 보다 바람직한 실시양태는 유전자 조작 미생물이 아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 활성, 호모세린 데히드로게나제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, 시스타티오닌 γ-신타제 활성, 시스타티오닌 β-리아제 활성, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 활성, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제 활성, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제 활성, 포스포세린 포스파타제 활성, 세린 아세틸트랜스퍼라제 활성, 시스테인 신타제 I 활성, 시스테인 신타제 II 활성, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 활성, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 활성, 포스포아데노신-포스포술페이트 리덕타제 활성, 페레독신-술피트 리덕타제 활성, 페레독신 NADPH-리덕타제 활성, 페레독신 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA077 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA248 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA247 활성, RXA655 레귤레이터 활성 및 RXN2910 레귤레이터 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성이 야생형에 비해 더 증가된 활성을 갖는 방법을 포함한다.
상기한 메티오닌 제조 방법의 특히 더 바람직한 실시양태는 유전자 조작 미생물이 호모세린 키나제 활성, 트레오닌 데히드라타제 활성, 트레오닌 신타제 활성, 메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 디히드로디피콜리네이트 신타제 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성 및 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성이 야생형에 비해 더 감소된 활성을 갖는 방법을 포함한다.
상기 기재된 하나 이상의 활성 중 더 증가되거나 감소된 활성은 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 발현 유닛에 의해 유발될 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다.
본 발명은 또한 하나 이상의 유전자 발현 속도가 야생형에 비해 증가 또는 유발된 유전자 조작 미생물을 배양함으로써 트레오닌을 제조하는 방법에 관한 것으로, 여기서
ch) 내인성 유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 본 발명의 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 증가되거나, 또는
dh) 발현 유닛과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 발현이 본 발명의 발현 유닛에 의해 또는 실시양태 ch)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛에 의해 조절되며,
유전자는 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 호모세린 키나제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 신타제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 엑스포터 캐리어를 코딩하는 핵산, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 트랜스알돌라제를 코딩하는 핵산, 트랜스케톨라제를 코딩하는 핵산, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 핵산, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 리신 엑스포터를 코딩하는 핵산, 비오틴 리가제를 코딩하는 핵산, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 유출 단백질을 코딩하는 핵산, 프룩토스-1,6-비스포스파타제를 코딩하는 핵산, OpcA 단백질을 코딩하는 핵산, 1-포스포프룩토키나제를 코딩하는 핵산, 6-포스포프룩토키나제를 코딩하는 핵산 및 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
방법에 대해 상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 발현 유닛에 의한 또는 실시양태 ch)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현 조절은
dh1) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 하나 이상의 본 발명의 발현 유닛을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 상기 내인성 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나,
dh2) 하나 이상의 상기 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내인성 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
dh3) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
상기한 트레오닌 제조 방법의 보다 바람직한 실시양태는 유전자 조작 미생물이 아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 트레오닌 신타제 활성, 트레오닌 엑스포터 캐리어 활성, 트랜스알돌라제 활성, 트랜스케톨라제 활성, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제 활성, 호모세린 키나제 활성, 비오틴 리가제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 활성, 트레오닌 유출 단백질 활성, 단백질 OpcA 활성, 1-포스포프룩토키나제 활성, 6-포스포프룩토키나제 활성, 프룩토스-1,6-비스포스파타제 활성, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 및 호모세린 데히드로게나제 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성이 야생형에 비해 더 증가된 활성을 갖는 방법을 포함한다.
상기한 트레오닌 제조 방법의 특히 더 바람직한 실시양태는 유전자 조작 미생물이 트레오닌 데히드라타제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 활성, 메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 디히드로디피콜리네이트 신테타제 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성, 아스파라기나제 활성, 아스파르테이트 데카르복실라제 활성, 리신 엑스포터 활성, 아세토락테이트 신타제 활성, 케톨-산 리덕토이소머라제 활성, 분지쇄 아미노트랜스퍼라제 활성, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 활성, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 디히드록시-산 데히드라타제 활성 및 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성이 야생형에 비해 더 감소된 활성을 갖는 방법을 포함한다.
상기 기재된 하나 이상의 활성 중 더 증가되거나 감소된 활성은 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 발현 유닛에 의해 유발될 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다.
용어 단백질의 "활성"은 효소의 경우에는 상응하는 단백질의 효소 활성을 의미하고, 다른 단백질, 예를 들어 구조 또는 수송 단백질의 경우에는 단백질의 생리적 활성을 의미한다.
효소는 통상적으로 기질을 생성물로 전환시킬 수 있거나, 이러한 전환 단계를 촉매할 수 있다.
따라서, 효소의 "활성"은 특정 시간 내에 효소에 의해 전환된 기질의 양 또는 형성된 생성물의 양을 의미한다.
따라서, 활성이 야생형에 비해 증가된 경우에는, 특정 시간 내에 효소에 의해 전환된 기질의 양 또는 형성된 생성물의 양이 야생형에 비해 증가한다.
"활성"의 증가란, 상기 또는 하기 기재된 모든 활성의 경우에, 바람직하게 야생형 활성의 5％ 이상, 보다 바람직하게는 20％ 이상, 보다 더 바람직하게는 50％ 이상, 더욱 바람직하게는 100％ 이상, 더욱 더 바람직하게는 300％ 이상, 훨씬 더 바람직하게는 500％ 이상, 특히 600％ 이상 증가한 것이다.
따라서, 활성이 야생형에 비해 감소된 경우에는, 특정 시간 내에 효소에 의해 전환된 기질의 양 또는 형성된 생성물의 양이 야생형에 비해 감소한다.
감소된 활성은, 바람직하게는 다양한 세포 생물학적 메카니즘에 기초하여, 미생물에서 상기 효소의 기능이 부분적으로 또는 실질적으로 완전하게 저해 또는 차단되는 것을 의미한다.
활성의 감소는 효소의 양적인 감소 뿐만 아니라 효소의 실질적으로 완전한 부재 (즉, 상응하는 활성의 검출가능성 결여 또는 효소의 면역학적 검출가능성 결여)까지 포함한다. 미생물의 활성은 바람직하게는, 야생형에 비해 5％ 이상, 보다 바람직하게는 20％ 이상, 보다 더 바람직하게는 50％ 이상, 더욱 바람직하게는 100％ 이상 감소한다. 또한, "감소"는 특히 상응하는 활성의 완전한 부재를 의미한다.
유전자 조작 미생물 및 야생형에서의 특정 효소의 활성, 및 이에 따른 효소 활성의 증가 또는 감소는, 예를 들어 효소 분석과 같은 공지된 방법으로 측정할 수 있다.
예를 들면, 피루베이트 카르복실라제는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 효소 활성을 나타내는 단백질을 의미한다.
따라서, 피루베이트 카르복실라제 활성은 특정 시간 내에 피루베이트 카르복실라제 단백질에 의해 전환된 피루베이트의 양 또는 형성된 옥살로아세테이트의 양을 의미한다.
따라서, 피루베이트 카르복실라제 활성이 야생형에 비해 증가된 경우, 특정 시간 내에 피루베이트 카르복실라제 단백질에 의해 전환된 피루베이트의 양 또는 형성된 옥살로아세테이트의 양이 야생형에 비해 증가한다.
피루베이트 카르복실라제 활성은 바람직하게는 야생형 피루베이트 카르복실라제 활성의 5％ 이상, 보다 바람직하게는 20％ 이상, 보다 더 바람직하게는 50％ 이상, 더욱 바람직하게는 100％ 이상, 더욱 더 바람직하게는 300％ 이상, 훨씬 더 바람직하게는 500％ 이상, 특히 600％ 이상 증가한다.
또한, 예를 들어 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성은 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제의 효소 활성을 의미한다.
포스포에놀피루베이트 카르복시키나제는 옥살로아세테이트를 포스포에놀피루베이트로 전환시키는 효소 활성을 나타내는 단백질을 의미한다.
따라서, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성은 특정 시간 내에 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 단백질에 의해 전환된 옥살로아세테이트의 양 또는 형성된 포스포에놀피루베이트의 양을 의미한다.
따라서, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성이 야생형에 비해 감소된 경우에는, 특정 시간 내에 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 단백질에 의해 전환된 옥살로아세테이트의 양 또는 형성된 포스포에놀피루베이트의 양이 야생형에 비해 감소한다.
포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성의 감소란, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제의 정량적인 감소 뿐만 아니라 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제의 실질적으로 완전한 부재 (즉, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성의 검출가능성 결여 또는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제의 면역학적 검출가능성 결여)를 포함한다. 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성은, 바람직하게는 야생형에 비해 5％ 이상, 보다 바람직하게는 20％ 이상, 보다 더 바람직하게는 50％ 이상, 더욱 바람직하게는 100％까지 감소한다. 특히, "감소"는 또한 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성의 완전한 부재를 의미한다.
활성은 다양한 방법으로, 예를 들면 발현 및 단백질 수준에서 억제 조절 메카니즘을 스위치 오프시키거나, 또는 상기 기재된 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 발현을 야생형보다 증가시킴으로써 더 증가시킬 수 있다.
이와 마찬가지로, 상기 기재된 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 발현은 다양한 방법으로, 예를 들면 활성화제에 의해 유전자를 유도하거나, 상기 기재된 바와 같이, 프로모터 활성 또는 발현 활성을 증가시키거나, 또는 하나 이상의 유전자 카피를 미생물 내에 도입함으로써 야생형보다 증가시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 발현을 증가시키는 것은 또한 미생물 고유의 내인성 단백질의 발현을 촉진시키는 것을 의미한다.
이는 예를 들면, 상기 기재된 바와 같이, 유전자의 프로모터 및/또는 발현 유닛 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 이와 같이 유전자의 발현 속도를 증가시키는 변경은, 예를 들면 DNA 서열의 결실 또는 삽입에 의해 일어날 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 외인성 자극을 가함으로서 내인성 단백질의 발현을 변경시킬 수 있다. 이는 특정한 생리학적 조건, 즉 외부 물질의 적용을 통해 일어날 수 있다.
당업자는 유전자 발현을 증가시키는 또다른 절차를 단독으로 또는 조합하여 재현할 수 있다. 따라서, 예를 들면 적절한 유전자의 카피수를 증가시키거나, 또는 구조 유전자의 상류에 위치한 프로모터 및 조절 영역 또는 리보좀 결합 부위를 돌연변이화시킬 수 있다. 또한, 유도가능한 프로모터를 통해 발효 생산 공정 동안 발현을 증가시킬 수 있다. 이와 마찬가지로 mRNA의 수명을 연장시키는 절차가 발현을 향상시킨다. 이와 같이, 효소 활성이 효소 단백질의 분해 방지에 의해 향상될 수도 있다. 유전자 또는 유전자 작제물은 카피수를 다르게 하여 플라스미드에 존재하거나, 또는 염색체에 통합되어 증폭될 수 있다. 또한, 별법으로, 배지의 조성 및 배양액 관리를 변경시킴으로써 관련 유전자를 과다발현시킬 수 있다.
당업자는 이에 대한 지침을, 특히 문헌 [Martin et al., Biotechnology 5, 137-146 (1987)], [Guerrero et al., Gene 138, 35-41 (1994)], [Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1988)], [Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991)], 유럽 특허 0472869, 미국 특허 4,601,893, [Schwarzer and Puehler, Biotechnology 9, 84-87 (1991)], [Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)], [LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)], 국제 특허 출원 공개 WO 96/15246, [Malumbres et al., Gene 134, 15-24 (1993)], 일본 특허 공개 JP-A-10-229891, [Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)], [Makrides, Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)] 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교재에서 찾아볼 수 있다.
원치않는 부작용을 제거하는 것은, 유전자의 발현 또는 향상 이외에도, 생합성 산물, 특히 L-리신, L-메티오닌 및 L-트레오닌의 생산에 유리할 수도 있다 (문헌 [Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982]).
바람직한 실시양태에서, 상기 기재된 단백질 중 하나를 코딩하는 핵산의 유전자 발현은 상응하는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 미생물 내에 도입함으로써 증가시킨다. 핵산은 염색체내 또는 염색체외에, 즉 염색체 상의 카피수 및/또는 숙주 미생물에서 복제되는 플라스미드 상의 유전자 카피를 증가시킴으로써 도입시킬 수 있다.
핵산, 예를 들면 핵산을 포함하는 발현 카세트 형태의 핵산은, 바람직하게는 특히 상기 기재된 SacB 방법에 의해 염색체내에 도입된다.
이론상, 이러한 목적의 위해 상기 기재된 단백질 중 하나를 코딩하는 임의의 유전자를 사용할 수 있다.
인트론을 포함하는 진핵생물 공급원으로부터의 게놈 핵산 서열의 경우, 숙주 미생물이 상응하는 단백질을 발현시킬 수 없거나 또는 이를 발현시키도록 제조될 수 없다면, 상응하는 cDNA와 같이 이미 프로세싱된 핵산 서열을 사용하는 것이 바람직하다.
상응하는 유전자의 예를 표 1 및 2에 나열하였다.
미생물에서 상기 기재된 활성은 바람직하게는 하기 방법 중 하나 이상에 의해 감소된다:
- 동시억제 도입에 사용되는 하나 이상의 센스 리보핵산 서열 또는 이의 발현을 보장하는 발현 카세트의 도입.
- 상응하는 유전자, RNA 또는 단백질에 대한 하나 이상의 DNA- 또는 단백질-결합 인자 또는 이의 발현을 보장하는 발현 카세트의 도입.
- RNA 분해를 유발하는 하나 이상의 바이러스 핵산 서열 또는 이의 발현을 보장하는 발현 카세트의 도입.
- 예를 들면 유전자에 삽입, 결실, 역위 또는 돌연변이를 발생시켜, 예를 들어 정지 코돈의 생성 또는 리딩 프레임의 이동과 같이 유전자의 기능을 저하시키는 하나 이상의 작제물의 도입. 상동성 재조합 또는 표적 유전자에 대해 서열-특이적인 뉴클레아제의 도입을 통해 목적하는 표적 유전자에 표적화시켜 삽입시킴으로써 넉아웃 돌연변이를 발생시킬 수 있으며, 또한 바람직하다.
- 감소된 프로모터 활성을 갖는 프로모터 또는 감소된 발현 활성을 갖는 발현 유닛의 도입.
당업자는 활성 또는 기능을 감소시키기 위한 또다른 방법이 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있음을 인지하고 있다. 예를 들면, 단백질의 우성의 음성 변이체 또는 이의 발현을 보장하는 발현 카세트의 도입이 유리할 수도 있다.
또한, 상기 방법이 각각 단독적으로 단백질의 양, mRNA의 양 및/또는 단백질의 활성을 감소시킬 수도 있다. 이들 방법을 조합하여 사용하는 것도 고려해 볼 수 있다. 또다른 방법이 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질의 프로세싱, 단백질 또는 그의 mRNA의 수송의 방해 또는 억제, 리보좀 부착의 억제, RNA 스플라이싱의 억제, RNA 분해 효소의 유도 및/또는 번역 연장 또는 종결의 억제를 포함할 수 있다.
생합성 산물을 생산하기 위한 본 발명의 방법에서, 유전자 조작 미생물의 배양 단계 후에 바람직하게는 미생물 및/또는 발효 브로쓰로부터 생합성 산물을 단리한다. 이들 단계는 동시에 및/또는 바람직하게는 배양 단계 후에 수행할 수 있다.
본 발명의 유전자 조작 미생물을 배양하여, 배치식 방법 (배치식 배양) 또는 유가식 배양 또는 반복 유가식 배양 방법에 의해 연속적 또는 불연속적으로 생합성 산물, 특히 L-리신, L-메티오닌 및 L-트레오닌을 생산할 수 있다. 공지된 배양 방법의 개론은 문헌 [Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991] 또는 [Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen, Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994]에서 찾아볼 수 있다.
사용될 배양 배지는 각 균주의 요구를 적합한 방식으로 만족시켜야 한다. 문헌 ["Manual of Methods for General Bacteriology" of American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981)]에 다양한 미생물에 사용되는 배양 배지가 기재되어 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및/또는 미량 원소를 포함한다.
바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당류이다. 매우 우수한 탄소 공급원의 예로는 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스가 있다. 당류는 또한 당밀과 같은 복합 화합물 또는 다른 당 제련 부산물을 통해 배지에 공급할 수 있다. 또한, 다양한 탄소 공급원의 혼합물을 첨가하는 것이 유리할 수도 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 예를 들어 대두유, 해바라기씨 오일, 땅콩 오일 및 코코넛 지방과 같은 오일 및 지방; 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀산과 같은 지방산; 예를 들어 글리세롤, 메탄올 또는 에탄올과 같은 알콜; 및 예를 들어 아세트산 또는 락트산과 같은 유기산이다.
질소 공급원은 일반적으로 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 이들 화합물을 포함하는 물질이다. 질소 공급원의 예로는, 암모니아 기체 또는 암모늄 염, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄, 니트레이트, 우레아, 아미노산, 또는 복합 질소 공급원, 예컨대 옥수수 침지액, 대두 분말, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등이 있다. 질소 공급원은 단독으로 또는 혼합물로 사용할 수 있다.
배지에 존재할 수 있는 무기염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브데늄, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화물, 인산염 또는 황산염을 포함한다.
정밀 화학물질, 특히 메티오닌의 생산을 위해, 예를 들면 술페이트, 술피트, 디티오니트, 테트라티오네이트, 티오술페이트, 술피드와 같은 무기 화합물, 및 머캅탄 및 티올과 같은 유기 황 화합물을 황 공급원으로 사용할 수 있다.
인 공급원으로서, 인산, 인산2수소 칼륨 또는 인산수소 2칼륨, 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 사용할 수 있다.
용액 중 금속 이온을 유지시키기 위해 배지에 킬레이팅제를 첨가할 수 있다. 특히 적합한 킬레이팅제는 카테콜 또는 포토카테추에이트와 같은 디히드록시페놀, 또는 시트르산과 같은 유기산을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 발효 배지는 통상적으로 비타민 또는 증식 촉진제와 같은 다른 증식 인자를 포함하며, 예를 들면 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신이 있다. 증식 인자 및 염은 종종 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침지액 등과 같은 배지의 복합 성분으로부터 유래될 수도 있다. 적합한 전구체를 배지에 첨가할 수도 있다. 배지 중 화합물의 정확한 조성은 특정 실험에 따라 크게 좌우되며, 각각의 구체적인 상황에 따라 개별적으로 결정될 것이다. 배지의 최적화에 대한 정보는 문헌 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (editors. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)]로부터 얻을 수 있다. 증식 배지는 또한 Standard 1 (머크 (Merck)) 또는 BHI (뇌-심장 침출 배지, 딥코 (DIFCO))와 같은 상업적 공급원으로부터 구입할 수도 있다.
배지의 모든 성분은 열 (1.5 bar 및 121℃에서 20분) 또는 멸균 여과에 의해 멸균시킨다. 이 성분들은 함께, 또는 필요에 따라 개별적으로 멸균시킬 수 있다. 배지의 모든 성분은 배양 시작시에 포함되어 있을 수 있거나, 임의로는 연속 또는 배치식으로 첨가될 수 있다.
배양 온도는 통상적으로 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이며, 실험하는 동안 일정하게 유지하거나 변경시킬 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5, 바람직하게는 대략 7.0이어야 한다. 배양시 pH는 배양하는 동안 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아와 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 첨가함으로써 제어할 수 있다. 거품 발생은, 예를 들면 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용함으로써 제어할 수 있다. 플라스미드의 안정성은, 예를 들면 항생제와 같이 선별 작용을 하는 적합한 물질을 배지에 첨가함으로써 유지시킬 수 있다. 호기성 조건은, 예를 들어 대기와 같은 산소 또는 산소-포함 기체 혼합물을 배양액에 도입함으로써 유지시킬 수 있다. 배양 온도는 통상적으로 20℃ 내지 45℃이다. 배양은 목적하는 산물의 형성이 최대치에 도달할 때까지 계속한다. 이 목적은 통상적으로 10 내지 160 시간 내에 달성된다.
이러한 방법으로 수득한 발효 브로쓰의 건조 물질 함량은 통상적으로 7.5 내지 25중량％이다.
또한, 발효는 적어도 종료 시점에, 특히 발효 시간의 적어도 30％가 넘는 시간 동안 당 공급을 제한하면서 실시하는 것이 더 유리하다. 이는 상기 시간 동안 발효 배지 내의 이용가능한 당의 농도가 0 내지 3 g/l에서 유지되거나, 감소됨을 의미한다.
생합성 산물은 필요한 생합성 산물 및 생합성 부산물의 물리적/화학적 특성에 따라 당업계에 공지된 방법으로 발효 브로쓰 및/또는 미생물로부터 단리한다.
이어서, 발효 브로쓰는 예를 들어 추가로 가공될 수 있다. 필요에 따라, 바이오매스는 예를 들어 원심분리, 여과, 따라내기 또는 이들 방법의 조합과 같은 분리 방법에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 발효 브로쓰로부터 분리하거나 또는 발효 브로쓰 내부에서 완전하게 잔류시킬 수 있다.
발효 브로쓰는 이후에, 예를 들면 회전 증발기, 박막 증발기, 낙하 필름 증발기를 사용하는, 역삼투압 또는 나노여과와 같은 공지된 방법에 의해 농축시킬 수 있다. 이 농축된 발효 브로쓰는 이후에 동결 건조, 분무 건조 또는 다른 방법에 의해 마무리 처리될 수 있다.
그러나, 생합성 산물, 특히 L-라이신, L-메티오닌 및 L-트레오닌을 정제할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 생성물-포함 브로쓰는 바이오매스를 제거한 후에 적합한 수지를 사용하여 크로마토그래피에 의해 정제함으로써 목적하는 산물 또는 불순물을 전체적으로 또는 부분적으로 크로마토그래피 수지에 잔류시킨다. 이러한 크로마토그래피 단계는 필요하다면 동일하거나 상이한 크로마토그래피 수지를 사용하여 반복할 수 있다. 당업자라면 용이하게 적절한 크로마토그래피 수지를 선택하여 이를 가장 효과적으로 사용할 수 있다. 정제된 산물은 여과 또는 한외여과에 의해 농축시켜 이 산물의 안정성이 최대가 되는 온도에서 보관할 수 있다.
생합성 산물은 다양한 형태, 예를 들면 이들의 염 또는 에스테르 형태로 생성될 수 있다.
단리된 화합물(들)의 동일성 및 순도는 선행 기술에 의해 측정될 수 있다. 이러한 기술로는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 분광분석 방법, 염색 방법, 박층 크로마토그래피, NIRS, 효소 분석법 또는 미생물학 분석법이 있다. 이러한 분석 방법들은 문헌 [Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140]; [Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32]; [Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70]; [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) vol. A27, VCH:Weinheim, pp.　89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581 and pp. 581-587]; [Michal, G (1999) Biochemical Pathways:An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons]; [Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in:Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17]에 요약되어 있다.
이제, 본 발명을 하기 비제한적 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다:
실시예 1. 벡터 pSK1Cat 의 구축
셔틀 벡터 pMT1 (문헌 [Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175:4096-4103])을 제한 효소 XhoI 및 BamHI을 사용하여 분해한 후에, 클레나우 단편으로 처리하고, 다시 라이게이션시켰다. 생성된 플라스미드를 pMT1-del로 명명하였다. 벡터 pMT1-del을 제한 효소 BglII 및 XbaI으로 분해하였다. 2.5　kb 크기의 단편이 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 pSR1　기점을 포함하며, 이를 마찬가지로 BglII 및 XbaI으로 절단시킨 2　kb 크기의 플라스포존 pTnMod-Okm (문헌 [Dennis und Zylstra (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64:2710-2715])에 라이게이션시켰다. 생성된 벡터를 pSK1로 명명하였다. 플라스포존 pTnMod-Okm의 단편은 에스케리치아 콜리에 대한 pMB1 복제 기점 및 카나마이신 내성 마커 (Tn903)를 보유한다. 주형으로서 벡터 PKK232-8 (서열 3)을 사용하고, 올리고뉴클레오티드 프라이머 A (서열 4) 및 B (서열 5)를 사용하고, 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protokols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의한 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)을 이용하여 프로모터가 없는 cat 유전자를 증폭시켰다. 상기 PCR 산물은 벡터 및 인서트를 제한 효소 BglII 및 KpnI으로 분해시킨 후에 벡터 pSK1에 라이게이션시켰다. 이 플라스미드를 pSK1Cat (도　1)로 명명하였다.
올리고뉴클레오티드 프라이머 A (서열 4)
5'-GGAAGATCTTTCAAGAATTCCCAGGCA-3'
올리고뉴클레오티드 프라이머 B (서열 5)
5'-GGGGTACCTACCGTATCTGTGGGGGG-3'
실시예 2. 플라스미드 pSK1 P tac 의 구축
플라스미드 pKK223-3 (서열 6)은 (Ptac) 프로모터를 포함한다. 이 프로모터를 제한 효소 BamHI을 사용하는 분해를 통해 단리하고, 단편을 BamHI-선형화된 벡터 pSK1Cat 서열에 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pSK1Ptac (도　2)으로 명명하였다.
실시예 3. P 2 -10 (서열 1)의 클로닝
문헌 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]의 방법을 이용하여 후기 대수기의 세포로부터 코리네박테리움 글루타미쿰 AS019E12의 염색체 DNA를 단리한 후에, 제한 효소 Sau3AI을 사용하여 부분적으로 분해시켰다. 생성된 단편은 0.4 내지 1.0　kb 크기였으며, 이를 제한 효소 BamHI으로 선형화시킨 벡터 pSK1Cat에 라이게이션시켰다. 라이게이션 믹스를 문헌 [Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175:4096-4103]의 방법을 이용하여 전기천공에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 AS019E12로 형질전환시켰다. 5　㎍/ml 클로르암페니콜을 포함하는 플레이트에 세포를 플레이팅하였다. 이들 플레이트에서 증식시킨 각 콜로니로부터의 플라스미드를 단리하여 분석하였다. 상기 플라스미드 중 하나가 pSK1Cat P2 -10이었 으며, 이는 프로모터 P2 -10 (서열 1)을 포함한다. 이 프로모터는 당-포스페이트 에피머라제를 코딩하는 유전자의 상류 영역에 위치하였다. 인서트의 크기는 208　bp였다.
실시예 4. 코리네박테리움 글루타미쿰 AS019E12 의 클로르암페니콜에 대한 내성
플라스미드 pSK1Cat (도 1)만을 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 세포는 30℃의 클로르암페니콜 농도가 5　㎍/ml인 MB 플레이트 (문헌 [Follettie et al. (1993) J.　Bacteriol. 175:4096-4103]) 및 MCGC 플레이트 (문헌 [von der Osten et al. (1989) Biotechnol. Lett. 11:11-16])에서는 증식하지 않았다. cat 유전자도 발현되지 않았다. 이에 반해, 플라스미드 pSK1CatPtac (도　2)를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 세포는 클로르암페니콜 농도가 40　㎍/ml인 MB 및 MCGC 플레이트에서 증식할 것이다. 40 ㎍/ml을 초과하는 클로르암페니콜 농도에서는 증식이 매우 약하거나 또는 전혀 관찰되지 않았다. 플라스미드 pSK1CatP2 -10을 포함하는 세포는 클로르암페니콜 농도가 40　㎍/ml을 초과하는 MB 및 MCGC 플레이트에서 증식하였다.
실시예 5. 에스케리치아 콜리의 클로르암페니콜에 대한 내성
플라스미드 pSK1CatPtac (도 2)를 포함하는 에스케리치아 콜리 세포를 클로르암페니콜 농도가 400　㎍/ml인 LB 플레이트 (문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning - A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed., Cold Spring Harbor, N. Y.])에서 증식시켰다. 600　㎍/ml의 클로르암페니콜 농도에서는 증식이 관찰되지 않았다. 플라스미드 pSK1CatP2 -10을 포함하는 세포는 클로르암페니콜 농도가 600　㎍/ml인 LB 플레이트에서 증식하였다.
실시예 6. 클로르암페니콜 트랜스퍼라제 ( CAT ) 활성을 이용한 프로모터 강도의 측정
프로모터 P2 -10 (서열 1)의 상대 강도를 측정하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 AS019E12의 CAT 활성을 측정하였다. 이를 위해, 문헌 [Jetten and Sinsky (1993) FEMS Microbiol. Lett. 111:183-188]의 방법에 따라 조 추출물을 제조하였다. 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 활성은 문헌 [Shaw et al (1993) Methods Enzymol. 43:737-755]의 방법에 의해 측정하였다. 반응 혼합물은 100 mM Tris*HCl pH 7.5, 1 mM DTNB, 0.1 mM 아세틸-CoA, 0.25 mM 클로르암페니콜 및 적합한 양의 효소를 포함하였다. 412　nm 파장에서 광학 밀도 변화를 측정하였다. 브래드포드 방법 (문헌 [Anal. Biochem. (1996) 72:248-254])을 이용하여 단백질 농도를 분석하였다.
결과를 다음과 같이 표에 나타내었다:
cat 유전자 전위 프로모터 CAT 활성 (μmol/mg*min)
없음 0
Ptac 8.8
P2 -10 7.4
도 1은 pSK1Cat의 플라스미드 맵 (A) 및 BamHI 클로닝 부위의 뉴클레오티드 서열 (B)을 도시하고 있다. B에서의 밑줄친 서열은 올리고뉴클레오티드 서열 결정에 사용되는 영역을 나타낸다. 개시 코돈 및 BamHI 클로닝 부위를 표시하였다.
도 2는 pSK1Ptac 뉴클레오티드 서열의 일부를 도시하고 있다. 프로모터 Ptac는 이탤릭체로 나타내었다. cat 유전자의 -35 및 -10 영역, RBS 및 개시 코돈도 표시하였다.
SEQUENCE LISTING <110> BASF Aktiengesellschaft <120> P2-10 Expressionseinheiten <130> AE 20040551 <160> 10 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 208 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> promoter <222> (1)..(208) <223> <400> 1 agatccgcct cactgtccac ataatctctt atgtgttggg gcgttgttgg tcgcgctgac 60 tggaattaat ttacacaccc gcccaacagt ccgcaactgc ccaggtcaag cgctcttctt 120 accgggccac gcccggcaag aatgcgtggt gaggacgtgg ggcggcgtcg ataagcggaa 180 atcttgaaat atttaggtgt gatctttt 208 <210> 2 <211> 420 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(420) <223> Expressionseinheit <400> 2 agatccgcct cactgtccac ataatctctt atgtgttggg gcgttgttgg tcgcgctgac 60 tggaattaat ttacacaccc gcccaacagt ccgcaactgc ccaggtcaag cgctcttctt 120 accgggccac gcccggcaag aatgcgtggt gaggacgtgg ggcggcgtcg ataagcggaa 180 atcttgaaat atttaggtgt gatcttttgg ggggaggtat ttaatgatcc taccaatcct 240 ttagtttcgt ctgtagagcg atgtgtgacg caagttttaa gactctaaac ccacgtcaca 300 agaaatgagg ggtgctttgt 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gctccgcccc 2820 cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 2880 taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 2940 ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 3000 tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 3060 gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 3120 ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 3180 aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 3240 aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 3300 agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 3360 cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 3420 gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 3480 atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 3540 gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 3600 tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 3660 gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 3720 ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 3780 actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 3840 ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 3900 tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 3960 cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 4020 ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 4080 ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 4140 tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat 4200 agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 4260 atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 4320 gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 4380 aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 4440 tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 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ggc atg aag aat gaa ggc gac ggt gcc gct gtt gac gcc atg 144 Gly Arg Gly Met Lys Asn Glu Gly Asp Gly Ala Ala Val Asp Ala Met 35 40 45 cgc cag ctc atc aac tca gtg acc atg aag ggc gtc gtt gtt atc ggc 192 Arg Gln Leu Ile Asn Ser Val Thr Met Lys Gly Val Val Val Ile Gly 50 55 60 gag ggc gaa aaa gac gaa gct cca atg ctg tac aac ggc gaa gag gtc 240 Glu Gly Glu Lys Asp Glu Ala Pro Met Leu Tyr Asn Gly Glu Glu Val 65 70 75 80 gga acc ggc ttt gga cct gag gtt gat atc gca gtt gac cca gtt gac 288 Gly Thr Gly Phe Gly Pro Glu Val Asp Ile Ala Val Asp Pro Val Asp 85 90 95 ggc acc acc ctg atg gct gag ggt cgc ccc aac gca att tcc att ctc 336 Gly Thr Thr Leu Met Ala Glu Gly Arg Pro Asn Ala Ile Ser Ile Leu 100 105 110 gca gct gca gag cgt ggc acc atg tac gat cca tcc tcc gtc ttc tac 384 Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp Pro Ser Ser Val Phe Tyr 115 120 125 atg aag aag atc gcc gtg gga cct gag gcc gca ggc aag atc gac atc 432 Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala Ala Gly Lys Ile Asp Ile 130 135 140 gaa gct cca gtt gcc cac aac atc aac gcg gtg gca aag tcc aag gga 480 Glu Ala Pro Val Ala His Asn Ile Asn Ala Val Ala Lys Ser Lys Gly 145 150 155 160 atc aac cct tcc gac gtc acc gtt gtc gtg ctt gac cgt cct cgc cac 528 Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val Leu Asp Arg Pro Arg His 165 170 175 atc gaa ctg atc gca gac att cgt cgt gca ggc gca aag gtt cgt ctc 576 Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala Gly Ala Lys Val Arg Leu 180 185 190 atc tcc gac ggc gac gtt gca ggt gca gtt gca gca gct cag gat tcc 624 Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Gln Asp Ser 195 200 205 aac tcc gtg gac atc atg atg ggc acc ggc gga acc cca gaa ggc atc 672 Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly Gly Thr Pro Glu Gly Ile 210 215 220 atc act gcg tgc gcc atg aag tgc atg ggt ggc gaa atc cag ggc atc 720 Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly Gly Glu Ile Gln Gly Ile 225 230 235 240 ctg gcc cca atg aac gat ttc gag cgc cag aag gca cac gac gct ggt 768 Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln Lys Ala His Asp Ala Gly 245 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Leu Glu Arg Ala Lys Arg Ala Ala Ala Val Asp Thr 50 55 60 aat gcc ata gaa gga atc ttc caa act gat cgc ggt ttt acc cat aca 240 Asn Ala Ile Glu Gly Ile Phe Gln Thr Asp Arg Gly Phe Thr His Thr 65 70 75 80 gtt gca acg cag gta ggg gct tgg gag caa caa atg gcg atg aaa ggc 288 Val Ala Thr Gln Val Gly Ala Trp Glu Gln Gln Met Ala Met Lys Gly 85 90 95 aaa cat gtt aag cct gcg ttt gac gat act cta gaa ggc ttt gag tat 336 Lys His Val Lys Pro Ala Phe Asp Asp Thr Leu Glu Gly Phe Glu Tyr 100 105 110 gtt ctc gat gca gta act ggt aga act cca atc tct cag caa tgg att 384 Val Leu Asp Ala Val Thr Gly Arg Thr Pro Ile Ser Gln Gln Trp Ile 115 120 125 aga aat ttg cac gcc gtc att ctg cgg agc caa gaa agc cac gag gtt 432 Arg Asn Leu His Ala Val Ile Leu Arg Ser Gln Glu Ser His Glu Val 130 135 140 ttt aca gcc gtt gga gtc caa aat cag gcg ctt cag aaa ggc gag tat 480 Phe Thr Ala Val Gly Val Gln Asn Gln Ala Leu Gln Lys Gly Glu Tyr 145 150 155 160 aaa act cag cca aat agt cca cag cgc tca gat gga tct gta cat gca 528 Lys Thr Gln Pro Asn Ser Pro Gln Arg Ser Asp Gly Ser Val His Ala 165 170 175 tac gcc cca gtt gaa gat act cct gct gaa atg gct aga ttt att tca 576 Tyr Ala Pro Val Glu Asp Thr Pro Ala Glu Met Ala Arg Phe Ile Ser 180 185 190 gaa ctt gaa tct aag gaa ttc tta gca gcc gag aag gtt att caa gct 624 Glu Leu Glu Ser Lys Glu Phe Leu Ala Ala Glu Lys Val Ile Gln Ala 195 200 205 gcc tat gcc cac tat gct ttc gta tgt att cat cct ttt gca gat ggg 672 Ala Tyr Ala His Tyr Ala Phe Val Cys Ile His Pro Phe Ala Asp Gly 210 215 220 aat gga cga gtt gca cga gcc ttg gct agt gtt ttt cta tac aaa gat 720 Asn Gly Arg Val Ala Arg Ala Leu Ala Ser Val Phe Leu Tyr Lys Asp 225 230 235 240 cct ggt gtc cct ctc gta atc tac caa gat caa cgc aga gat tac atc 768 Pro Gly Val Pro Leu Val Ile Tyr Gln Asp Gln Arg Arg Asp Tyr Ile 245 250 255 cat gct cta gaa gca gcg gac aag aat aac ccg ctc ctg ctg att aga 816 His Ala Leu Glu Ala Ala Asp Lys Asn Asn Pro Leu Leu Leu Ile Arg 260 265 270 ttc ttt gct gaa cga gtg acc gat act att aac tct att atc gtt gat 864 Phe Phe Ala Glu Arg Val Thr Asp Thr Ile Asn Ser Ile Ile Val Asp 275 280 285 ctc act acc ccg atc gcg ggt aaa tct ggt tcg gct aag ctt tcg gat 912 Leu Thr Thr Pro Ile Ala Gly Lys Ser Gly Ser Ala Lys Leu Ser Asp 290 295 300 gcg cta cgc ccc act cgc gta tta cca gaa tta cat gat gct gca cat 960 Ala Leu Arg Pro Thr Arg Val Leu Pro Glu Leu His Asp Ala Ala His 305 310 315 320 agg ctc caa gaa agt tta ttt aca gaa atc cga tct cga ttg gat gaa 1008 Arg Leu Gln Glu Ser Leu Phe Thr Glu Ile Arg Ser Arg Leu Asp Glu 325 330 335 gaa gga aaa agg aat ggg ttg gag ttt cta ctt caa cgg att ttt atc 1056 Glu Gly Lys Arg Asn Gly Leu Glu Phe Leu Leu Gln Arg Ile Phe Ile 340 345 350 ggt tcc cca ttc aat ctg cca gag ggc tat aac gct ttc cct gat agc 1104 Gly Ser Pro Phe Asn Leu Pro Glu Gly Tyr Asn Ala Phe Pro Asp Ser 355 360 365 tat tgt ctg acc tta gct ttc aat agc aac tct cca aaa caa atc ttc 1152 Tyr Cys Leu Thr Leu Ala Phe Asn Ser Asn Ser Pro Lys Gln Ile Phe 370 375 380 cac ccg cta tcc ata gta ata gca gct cga gat ggg aaa aga gcg agc 1200 His Pro Leu Ser Ile Val Ile Ala Ala Arg Asp Gly Lys Arg Ala Ser 385 390 395 400 agc gac ctc gtg gca gct act tct att gga tac aac ttt cac gct tac 1248 Ser Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Ile Gly Tyr Asn Phe His Ala Tyr 405 410 415 gga cgt gaa gtc gag cct gtt gtt act gaa agc ttt cga gaa cgt gtg 1296 Gly Arg Glu Val Glu Pro Val Val Thr Glu Ser Phe Arg Glu Arg Val 420 425 430 aaa att tac gcc gac ggg att gta gat cac ttc tta acc gaa ctg gct 1344 Lys Ile Tyr Ala Asp Gly Ile Val Asp His Phe Leu Thr Glu Leu Ala 435 440 445 aaa aag ttt caa cag aat taa 1365 Lys Lys Phe Gln Gln Asn 450 <210> 10 <211> 454 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 10 Met Asn Asp Glu Asn Ile Gln Ser Ser Asn Tyr Gln Pro Phe Pro Ser 1 5 10 15 Phe Asp Asp Trp Lys Gln Ile Glu Val Ser Leu Leu Asp Val Ile Glu 20 25 30 Ser Ser Arg His Phe Ser Asp Leu Lys Asp Ser Thr Asp Arg Ser Ala 35 40 45 Leu Asp Ala Ala Leu Glu Arg Ala Lys Arg Ala Ala Ala Val Asp Thr 50 55 60 Asn Ala Ile Glu Gly Ile Phe Gln Thr Asp Arg Gly Phe Thr His Thr 65 70 75 80 Val Ala Thr Gln Val Gly Ala Trp Glu Gln Gln Met Ala Met Lys Gly 85 90 95 Lys His Val Lys Pro Ala Phe Asp Asp Thr Leu Glu Gly Phe Glu Tyr 100 105 110 Val Leu Asp Ala Val Thr Gly Arg Thr Pro Ile Ser Gln Gln Trp Ile 115 120 125 Arg Asn Leu His Ala Val Ile Leu Arg Ser Gln Glu Ser His Glu Val 130 135 140 Phe Thr Ala Val Gly Val Gln Asn Gln Ala Leu Gln Lys Gly Glu Tyr 145 150 155 160 Lys Thr Gln Pro Asn Ser Pro Gln Arg Ser Asp Gly Ser Val His Ala 165 170 175 Tyr Ala Pro Val Glu Asp Thr Pro Ala Glu Met Ala Arg Phe Ile Ser 180 185 190 Glu Leu Glu Ser Lys Glu Phe Leu Ala Ala Glu Lys Val Ile Gln Ala 195 200 205 Ala Tyr Ala His Tyr Ala Phe Val Cys Ile His Pro Phe Ala Asp Gly 210 215 220 Asn Gly Arg Val Ala Arg Ala Leu Ala Ser Val Phe Leu Tyr Lys Asp 225 230 235 240 Pro Gly Val Pro Leu Val Ile Tyr Gln Asp Gln Arg Arg Asp Tyr Ile 245 250 255 His Ala Leu Glu Ala Ala Asp Lys Asn Asn Pro Leu Leu Leu Ile Arg 260 265 270 Phe Phe Ala Glu Arg Val Thr Asp Thr Ile Asn Ser Ile Ile Val Asp 275 280 285 Leu Thr Thr Pro Ile Ala Gly Lys Ser Gly Ser Ala Lys Leu Ser Asp 290 295 300 Ala Leu Arg Pro Thr Arg Val Leu Pro Glu Leu His Asp Ala Ala His 305 310 315 320 Arg Leu Gln Glu Ser Leu Phe Thr Glu Ile Arg Ser Arg Leu Asp Glu 325 330 335 Glu Gly Lys Arg Asn Gly Leu Glu Phe Leu Leu Gln Arg Ile Phe Ile 340 345 350 Gly Ser Pro Phe Asn Leu Pro Glu Gly Tyr Asn Ala Phe Pro Asp Ser 355 360 365 Tyr Cys Leu Thr Leu Ala Phe Asn Ser Asn Ser Pro Lys Gln Ile Phe 370 375 380 His Pro Leu Ser Ile Val Ile Ala Ala Arg Asp Gly Lys Arg Ala Ser 385 390 395 400 Ser Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Ile Gly Tyr Asn Phe His Ala Tyr 405 410 415 Gly Arg Glu Val Glu Pro Val Val Thr Glu Ser Phe Arg Glu Arg Val 420 425 430 Lys Ile Tyr Ala Asp Gly Ile Val Asp His Phe Leu Thr Glu Leu Ala 435 440 445 Lys Lys Phe Gln Gln Asn 450 PF 55752 1 BASF Aktiengesellschaft 20040551 PF 55752 DE

Claims (48)

  1. 유전자의 전사를 위한,
    A) 서열 1의 핵산 서열,
    B) 상기 서열로부터 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유래되고, 핵산 수준에서 서열 1과의 동일성이 90％ 이상인 서열,
    C) 엄격한 조건하에 서열 1의 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열, 또는
    D) A), B) 또는 C) 서열의 기능적으로 동등한 단편
    을 포함하는, 프로모터 활성을 갖는 핵산의 용도.
  2. 유전자의 발현을 위한, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 추가의 핵산 서열을 포함하는 발현 유닛의 용도.
  3. 제2항에 있어서, 발현 유닛이
    E) 서열 2의 핵산 서열,
    F) 상기 서열로부터 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유래되고, 핵산 수준에서 서열 2와의 동일성이 90％ 이상인 서열,
    G) 엄격한 조건하에 서열 2의 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열, 또는
    H) E), F) 또는 G) 서열의 기능적으로 동등한 단편을 포함하는 것인 용도.
  4. 제3항에 있어서, 발현 유닛이 서열 2의 핵산 서열로 이루어지는 것인 용도.
  5. A) 서열 1의 핵산 서열,
    B) 상기 서열로부터 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유래되고, 핵산 수준에서 서열 1과의 동일성이 90％ 이상인 서열,
    C) 엄격한 조건하에 서열 1의 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열, 또는
    D) A), B) 또는 C) 서열의 기능적으로 동등한 단편
    을 포함하되, 단 서열 1의 서열을 갖는 핵산은 제외된, 프로모터 활성을 갖는 핵산.
  6. 제5항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 추가의 핵산 서열을 포함하는 발현 유닛.
  7. 제6항에 있어서,
    E) 서열 2의 핵산 서열,
    F) 상기 서열로부터 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유래되고, 핵산 수준에서 서열 2와의 동일성이 90％ 이상인 서열,
    G) 엄격한 조건하에 서열 2의 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열, 또는
    H) E), F) 또는 G) 서열의 기능적으로 동등한 단편
    을 포함하되, 단 서열 2의 서열을 갖는 핵산은 제외된 것인 발현 유닛.
  8. a) 내인성 유전자의 전사를 조절하는, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 내인성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성을 야생형에 비해 변경시키거나, 또는
    b) 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 또는 실시양태 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 프로모터 활성을 갖는 핵산과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 전사를 조절함으로써,
    미생물 내에서의 유전자 전사 속도를 야생형에 비해 변경 또는 유발시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 또는 실시양태 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물 내에서의 유전자 전사 조절을
    b1) 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 전사가 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나,
    b2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입 된 유전자의 전사가 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 내인성 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
    b3) 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성하는 것인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    ah) 내인성 유전자의 전사를 조절하는, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 내인성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성을 야생형에 비해 증가시키거나, 또는
    bh) 프로모터 활성을 갖는 핵산과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 전사를 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 또는 실시양태 a)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 조절하여,
    미생물 내에서의 유전자 전사 속도를 야생형에 비해 증가 또는 유발시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 또는 실시양태 a)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물 내에서의 유전자 전사 조절을
    bh1) 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 전사가 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나,
    bh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 내인성 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
    bh3) 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성하는 것인 방법.
  12. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    ar) 내인성 유전자의 전사를 조절하는, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 내인성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성을 야생형에 비해 감소시키거나, 또는
    br) 실시양태 a)에 따라 감소된 프로모터 활성을 갖는 핵산을 미생물의 게놈에 도입하여, 내인성 유전자의 전사가 감소된 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어하에 일어나도록 함으로써,
    미생물 내에서의 유전자 전사 속도를 야생형에 비해 감소시키는 방법.
  13. c) 내인성 유전자의 발현을 조절하는 제2항 또는 제3항에 따른 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 야생형에 비해 변경시키거나, 또는
    d) 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 또는 실시양태 c)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 발현 유닛과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 발현을 조절함으로써,
    미생물 내에서의 유전자 발현 속도를 야생형에 비해 변경 또는 유발시키는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의한 또는 실시양태 a)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현 조절을
    d1) 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 발현 유닛을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나,
    d2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 내인성 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
    d3) 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성하는 것인 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    ch) 내인성 유전자의 발현을 조절하는 제2항 또는 제3항에 따른 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 야생형에 비해 증가시키거나, 또는
    dh) 발현 유닛과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 발현을 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 또는 실시양태 a)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 조절하여,
    미생물 내에서의 유전자 발현 속도를 야생형에 비해 증가 또는 유발시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의한 또는 실시양태 a)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현 조절을
    dh1) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 발현 유닛을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나,
    dh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 내인성 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
    dh3) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따 른 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성하는 것인 방법.
  17. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    cr) 내인성 유전자의 발현을 조절하는 제2항 또는 제3항에 따른 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 야생형에 비해 감소시키거나, 또는
    dr) 실시양태 cr)에 따라 감소된 특이적 발현 활성을 갖는 발현 유닛을 미생물의 게놈에 도입하여, 내인성 유전자의 발현이 감소된 발현 활성을 갖는 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 함으로써,
    미생물 내에서의 유전자 발현 속도를 야생형에 비해 감소시키는 방법.
  18. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자가 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 유기산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 지질 및 지방산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 디올 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 탄수화물 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 방향족 화합물 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 비타민 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 보조인자 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산 및 효소 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 적절한 경우에 추가의 조절 요소를 포함할 수 있는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 아미노산 생합성 경로로부터의 단백질이 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 디히드로디피콜리네이트 신테타제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 피루베이트 카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 전사 레귤레이터 LuxR, 전사 레귤레이터 LysR1, 전사 레귤레이터 LysR2, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제, 시스타티오닌 γ-신타제, 시스타티오닌 β-리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제, 포스포세린 포스파타제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 호모세린 데히드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제, 트레오닌 엑스포터 캐리어, 트레오닌 데히드라타제, 피루베이트 옥시다제, 리신 엑스포터, 비오틴 리가제, 시스테인 신타제 I, 시스테인 신타제 II, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제, 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 서브유닛 1 및 2, 포스포아데노신-포스포술페이트 리덕타제, 페레독신-술피트 리덕타제, 페레독신 NADP 리덕타제, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제, RXA00655 레귤레이터, RXN2910 레귤레이터, 아르기닐-tRNA 신테타제, 포 스포에놀피루베이트 카르복실라제, 트레오닌 유출 단백질, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, 프룩토스-1,6-비스포스파타제, 술페이트 환원 단백질 RXA077, 술페이트 환원 단백질 RXA248, 술페이트 환원 단백질 RXA247, 단백질 OpcA, 1-포스포프룩토키나제 및 6-포스포프룩토키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. a) 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 발현 유닛,
    b) 발현시킬 하나 이상의 추가의 핵산, 및
    c) 적절한 경우에 추가의 유전 조절 요소를 포함하며,
    여기서 하나 이상의 발현 유닛과 발현시킬 추가의 핵산 서열은 함께 기능적으로 연결되어 있고, 발현시킬 추가의 핵산 서열이 발현 유닛과는 이종인 발현 카세트.
  21. 제20항에 있어서, 발현시킬 추가의 핵산 서열이 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 유기산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 지질 및 지방산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 디올 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 탄수화물 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 방향족 화합물 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 비타민 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 보조인자 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산 및 효소 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 발현 카세트.
  22. 제21항에 있어서, 아미노산 생합성 경로로부터의 단백질이 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 디히드로디피콜리네이트 신테타제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 피루베이트 카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 전사 레귤레이터 LuxR, 전사 레귤레이터 LysR1, 전사 레귤레이터 LysR2, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제, 시스타티오닌 γ-신타제, 시스타티오닌 β-리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제, 포스포세린 포스파타제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 호모세린 데히드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제, 트레오닌 엑스포터 캐리어, 트레오닌 데히드라타제, 피루베이트 옥시다제, 리신 엑스포터, 비오틴 리가제, 시스테인 신타제 I, 시스테인 신타제 II, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제, 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 서브유닛 1 및 2, 포스포아데노신-포스포술페이트 리덕타제, 페레독신-술피트 리덕타제, 페레독신 NADP 리덕타제, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제, RXA00655 레귤레이터, RXN2910 레귤레이터, 아르기닐-tRNA 신테타제, 포 스포에놀피루베이트 카르복실라제, 트레오닌 유출 단백질, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, 프룩토스-1,6-비스포스파타제, 술페이트 환원 단백질 RXA077, 술페이트 환원 단백질 RXA248, 술페이트 환원 단백질 RXA247, 단백질 OpcA, 1-포스포프룩토키나제 및 6-포스포프룩토키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 발현 카세트.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터.
  24. 유전자 조작이 하나 이상의 유전자의 전사 속도를 야생형에 비해 변경 또는 유발시키며,
    a) 하나 이상의 내인성 유전자의 전사를 조절하는, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 내인성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성이 변경되거나, 또는
    b) 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 또는 실시양태 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 프로모터 활성을 갖는 핵산과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 전사가 조절되는 것에 의존하는 것인, 유전자 조작 미생물.
  25. 제24항에 있어서, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 또는 실 시양태 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물 내에서의 유전자 전사 조절이
    b1) 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 전사가 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나,
    b2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 내인성 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
    b3) 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성되는 것인 유전자 조작 미생물.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    ah) 내인성 유전자의 전사를 조절하는, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 내인성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성이 야생형에 비해 증가되거나, 또는
    bh) 프로모터 활성을 갖는 핵산과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 전사가 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 또는 실시양태 ah)에 따라 증 가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 조절되는 것인,
    하나 이상의 유전자의 전사 속도가 야생형에 비해 증가 또는 유발된 유전자 조작 미생물.
  27. 제26항에 있어서, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 또는 실시양태 a)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물 내에서의 유전자 전사 조절이
    bh1) 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나,
    bh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 내인성 핵산의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
    bh3) 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절한 경우에 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성되는 것인 유전자 조작 미생물.
  28. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    ar) 하나 이상의 내인성 유전자의 전사를 조절하는, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 내인성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성이 야생형에 비해 감소되거나, 또는
    br) 실시양태 a)에 따라 감소된 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산이 미생물의 게놈에 도입되어, 하나 이상의 내인성 유전자의 전사가 감소된 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어하에 일어나는 것인,
    하나 이상의 유전자의 전사 속도가 야생형에 비해 감소된 유전자 조작 미생물.
  29. 유전자 조작이 하나 이상의 유전자의 발현 속도를 야생형에 비해 변경 또는 유발시키며,
    c) 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 조절하는 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 변경되거나, 또는
    d) 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 또는 실시양태 a)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 발현 유닛과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 발현이 조절되는 것에 의존하는 것인, 유전자 조작 미생물.
  30. 제29항에 있어서, 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의한 또는 실시양태 a)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현 조절이
    d1) 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 발현 유닛을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나,
    d2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 내인성 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
    d3) 적절한 경우에 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성되는 것인 유전자 조작 미생물.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    ch) 내인성 유전자의 발현을 조절하는 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 증가되거나, 또는
    dh) 발현 유닛과는 이종인 유전자의 미생물 내에서의 발현이 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 또는 실시양태 a)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의해 조절되는 것인,
    하나 이상의 유전자의 발현 속도가 야생형에 비해 증가 또는 유발된 유전자 조작 미생물.
  32. 제31항에 있어서, 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의한 또는 실시양태 a)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현 조절이
    dh1) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 발현 유닛을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나,
    dh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 내인성 발현 유닛의 제어하에 일어나도록 하거나, 또는
    dh3) 적절한 경우에 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 미생물 내에 도입함으로써 달성되는 것인 유전자 조작 미생물.
  33. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    cr) 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 조절하는 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 내인성 발현 유닛의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 감소되거나, 또는
    dr) 감소된 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 발현 유닛이 미생물의 게놈에 도입되어, 하나 이상의 유전자의 발현이 감소된 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 도입된 발현 유닛의 제어하에 일어나는 것인,
    하나 이상의 유전자의 발현 속도가 야생형에 비해 감소된 유전자 조작 미생물.
  34. 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유닛 및 발현 유닛과는 이종인 기능적으로 연결된 발현시킬 유전자를 포함하는 유전자 조작 미생물.
  35. 제34항에 있어서, 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트를 포함하는 유전자 조작 미생물.
  36. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자가 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 유기산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 지질 및 지방산 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 디올 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 탄수화물 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 방향족 화합물 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 비타민 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 보조인자 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산 및 효소 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적절한 경우에 추가의 조절 요소를 포함할 수 있는 것인 유전자 조작 미생물.
  37. 제36항에 있어서, 아미노산 생합성 경로로부터의 단백질이 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 디히드로디피콜리네이트 신테타제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 피루베이트 카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 전사 레귤레이터 LuxR, 전사 레귤레이터 LysR1, 전사 레귤레이터 LysR2, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제, 시스타티오닌 γ-신타제, 시스타티오닌 β-리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제, 포스포세린 포스파타제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 호모세린 데히드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제, 트레오닌 엑스포터 캐리어, 트레오닌 데히드라타제, 피루베이트 옥시다제, 리신 엑스포터, 비오틴 리가제, 시스테인 신타제 I, 시스테인 신타제 II, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 서브유닛 1 및 2, 포스포아데노신-포스포술페이트 리덕타제, 페레독신-술피트 리덕타제, 페레독신 NADP 리덕타제, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제, RXA00655 레귤레이터, RXN2910 레귤레이터, 아르기닐-tRNA 신테타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 트레오닌 유출 단백질, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, 프룩토스-1,6-비스포스파타제, 술페이트 환원 단백질 RXA077, 술페이트 환원 단백질 RXA248, 술페이트 환원 단백질 RXA247, 단백질 OpcA, 1-포스포프룩토키나제 및 6-포스포프룩토키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 유전자 조작 미생물.
  38. 제24항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 유전자 조작 미생물을 배양함으로써 생합성 산물을 제조하는 방법.
  39. 제24항, 제25항, 제31항 및 제32항 중 어느 한 항에 따른 유전자 조작 미생물을 배양함으로써 리신을 제조하는 방법이며, 이 때 유전자는 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산, 디히드로디피콜리네이트 신테타제를 코딩하는 핵산, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 전사 레귤레이터 LuxR을 코딩하는 핵산, 전사 레귤레이터 LysR1을 코딩하는 핵산, 전사 레귤레이터 LysR2를 코딩하는 핵산, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 핵산, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 트랜스케톨라제를 코딩하는 핵산, 트랜스알돌라제를 코딩하는 핵산, 리신 엑스포터를 코딩하는 핵산, 비오틴 리가제를 코딩하는 핵산, 아르기닐-tRNA 신테타제를 코딩하는 핵산, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 프룩토스-1,6-비스포스파타제를 코딩하는 핵산, 단백질 OpcA를 코딩하는 핵산, 1-포스포프룩토키나제를 코딩하는 핵산 및 6-포스포프룩토키나제를 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 유전자 조작 미생물이, 아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 활성, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제 활성, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제 활성, 디히드로디피콜리네이트 신테타제 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 전사 레귤레이터 LuxR 활성, 전사 레귤레이터 LysR1 활성, 전사 레귤레이터 LysR2 활성, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제 활성, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 활성, 트랜스케톨라제 활성, 트랜스알돌라제 활성, 리신 엑스포터 활성, 아르기닐-tRNA 신테타제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 활성, 프룩토스-1,6-비스포스파타제 활성, 단백질 OpcA 활성, 1-포스포프룩토키나제 활성, 6-포스포프룩토키나제 활성 및 비오틴 리가제 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된, 야생형에 비해 더 증가된 하나 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 유전자 조작 미생물이, 트레오닌 데히드라타제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 호모세린 키나제 활성, 호모세린 데히드로게나제 활성, 트레오닌 엑스포터 활성, 트레오닌 유출 단백질 활성, 아스파라기나제 활성, 아스파르테이트 데카르복실라제 활성 및 트레오닌 신타제 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된, 야생형에 비해 더 감소된 하나 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
  42. 제24항, 제25항, 제31항 및 제32항 중 어느 한 항에 따른 유전자 조작 미생물을 배양함으로써 메티오닌을 제조하는 방법이며, 이 때 유전자는 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩 하는 핵산, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 시스타티오닌 γ-신타제를 코딩하는 핵산, 시스타티오닌 β-리아제를 코딩하는 핵산, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제를 코딩하는 핵산, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 핵산, 세린 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 시스테인 신타제 I을 코딩하는 핵산, 시스테인 신타제 II를 코딩하는 핵산, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제를 코딩하는 핵산, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제를 코딩하는 핵산, 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 포스포아데노신-포스포술페이트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 페레독신-술피트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 페레독신 NADPH-리덕타제를 코딩하는 핵산, 페레독신을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA077을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA248을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA247을 코딩하는 핵산, RXA0655 레귤레이터를 코딩하는 핵산 및 RXN2910 레귤레이터를 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 유전자 조작 미생물이, 아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 활성, 호모세린 데히드로게나제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, 시스타티오닌 γ-신타제 활성, 시스타티오닌 β- 리아제 활성, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 활성, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제 활성, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제 활성, 포스포세린 포스파타제 활성, 세린 아세틸트랜스퍼라제 활성, 시스테인 신타제 I 활성, 시스테인 신타제 II 활성, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 활성, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 활성, 포스포아데노신-포스포술페이트 리덕타제 활성, 페레독신-술피트 리덕타제 활성, 페레독신 NADPH-리덕타제 활성, 페레독신 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA077 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA248 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA247 활성, RXA655 레귤레이터 활성 및 RXN2910 레귤레이터 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된, 야생형에 비해 더 증가된 하나 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 유전자 조작 미생물이, 호모세린 키나제 활성, 트레오닌 데히드라타제 활성, 트레오닌 신타제 활성, 메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 디히드로디피콜리네이트 신타제 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성 및 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된, 야생형에 비해 더 감소된 하나 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
  45. 제24항, 제25항, 제31항 및 제32항 중 어느 한 항에 따른 유전자 조작 미생물을 배양함으로써 트레오닌을 제조하는 방법으로서, 유전자가 아스파르테이트 키 나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 호모세린 키나제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 신타제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 엑스포터 캐리어를 코딩하는 핵산, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 트랜스알돌라제를 코딩하는 핵산, 트랜스케톨라제를 코딩하는 핵산, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 핵산, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 리신 엑스포터를 코딩하는 핵산, 비오틴 리가제를 코딩하는 핵산, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 유출 단백질을 코딩하는 핵산, 프룩토스-1,6-비스포스파타제를 코딩하는 핵산, 단백질 OpcA를 코딩하는 핵산, 1-포스포프룩토키나제를 코딩하는 핵산, 6-포스포프룩토키나제를 코딩하는 핵산 및 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 유전자 조작 미생물이, 아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 트레오닌 신타제 활성, 트레오닌 엑스포터 캐리어 활성, 트랜스알돌라제 활성, 트랜스케톨라제 활성, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제 활성, 호모세린 키나제 활성, 비오틴 리가제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 활성, 트레오닌 유출 단백질 활성, 단백질 OpcA 활성, 1-포스포프룩토키나제 활성, 6-포스포프룩토키나제 활성, 프룩토스-1,6-비스포스파타제 활성, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 활성 및 호모세린 데히드로게나제 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된, 야생형에 비해 더 증가된 하나 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 유전자 조작 미생물이, 트레오닌 데히드라타제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 활성, 메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 디히드로디피콜리네이트 신테타제 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성, 아스파라기나제 활성, 아스파르테이트 데카르복실라제 활성, 리신 엑스포터 활성, 아세토락테이트 신타제 활성, 케톨-산 리덕토이소머라제 활성, 분지쇄 아미노트랜스퍼라제 활성, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 활성, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 디히드록시-산 데히드라타제 활성 및 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된, 야생형에 비해 더 감소된 하나 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
  48. 제38항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 생합성 산물을 배양 단계 후에 및/또는 배양 단계 동안 배양 배지로부터 단리하고, 적절한 경우에 정제하는 방법.
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