EP1771566A1 - P2-10-expressionseinheiten - Google Patents

P2-10-expressionseinheiten

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Publication number
EP1771566A1
EP1771566A1 EP05764004A EP05764004A EP1771566A1 EP 1771566 A1 EP1771566 A1 EP 1771566A1 EP 05764004 A EP05764004 A EP 05764004A EP 05764004 A EP05764004 A EP 05764004A EP 1771566 A1 EP1771566 A1 EP 1771566A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
activity
nucleic acids
expression
acids encoding
genes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05764004A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jong-Soo Choi
Weol Kyu Jeong
Il Kwon Kim
Seong Han Lim
Heung-Shick Lee
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1771566A1 publication Critical patent/EP1771566A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine

Definitions

  • the present invention relates to the use of nucleic acid sequences for the regulation of the transcription and expression of genes, the novel promoters and expression units themselves, methods for altering or causing the transcription rate and / or expression rate of genes, expression cassettes containing the expression units, genetically modified microorganisms altered or induced rate of transcription and / or rate of expression and methods for
  • biosynthetic products such as, for example, fine chemicals, such as, inter alia, amino acids, vitamins but also proteins
  • fine chemicals such as, inter alia, amino acids, vitamins but also proteins
  • These substances which are collectively referred to as fine chemicals / proteins, include, among others, organic acids, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, nucleotides and nucleosides, lipids and fatty acids, diols, carbohydrates, aromatic compounds, vitamins and cofactors, as well as proteins and enzymes.
  • Their production is most conveniently made on a large scale by culturing bacteria that have been developed to produce and secrete large quantities of the desired substance.
  • Particularly suitable organisms for this purpose are coryneform bacteria, gram-positive non-pathogenic bacteria.
  • Process improvements may include fermentation measures, such as stirring and supply of oxygen, or the composition of the nutrient media, such as the sugar concentration during fermentation, or the processing of the product, for example by ion exchange chromatography but also spray-drying, or the intrinsic performance characteristics of the microorganism concern yourself.
  • RNA polymerase holoenzymes also called -35 and -10 regions
  • ribosomal 16S RNA also ribosomal binding site or also Shine-Dalgarno Called sequence.
  • sequence of a ribosomal binding site also called Shine-Dalgarno sequence, for the purposes of this invention is understood to mean polynucleotide sequences which are up to 20 bases upstream of the initiation codon of the translation.
  • Nucleic acid sequences with promoter activity can influence the formation of mRNA in different ways. Promoters whose activity is independent of the physiological growth phase of the organism are called constitutive. Again other promoters react to external chemical as well as physical stimuli such as oxygen, metabolites, heat, pH, etc. Still others show a strong dependence of their activity in different growth phases. For example, promoters are described in the literature, which show a particularly pronounced activity during the exponential growth phase of microorganisms, or else exactly in the stationary phase of microbial growth. Both characteristics of promoters can have a favorable effect on productivity for the production of fine chemicals and proteins depending on the metabolic pathway.
  • promoters which, during growth, turn off the expression of a gene, but turn it on after optimal growth, to regulate a gene that controls the production of a metabolite.
  • the altered strain has the same growth parameters as the Monocytes, but produces more product per cell. This type of modification can increase both the titer (g product / liter) and the C yield (g product / gC source).
  • regulated promoters may increase or decrease the rate at which a gene is transcribed, depending on the internal and / or external conditions of the cell.
  • an inducer may stimulate the rate of transcription from the promoter.
  • Inducers may directly or indirectly affect transcription from the promoter.
  • suppressors is capable of reducing or inhibiting transcription from the promoter. Like the inducer, the suppressors can act directly or indirectly.
  • promoters known that are regulated by temperature Thus, for example, the level of transcription of such promoters may be increased or decreased by increasing the growth temperature above the normal growth temperature of the cell.
  • promoters from C. glutamicum have been described to date.
  • the promoter of the malate synthase gene from C. glutamicum was described in DE 4440118. This promoter was preceded by a structural protein coding for a protein. After transformation of such a construct into a coryneform bacterium, the expression of the downstream structural gene is regulated. The expression of the structural gene is induced as soon as a corresponding inducer is added to the medium.
  • the object of the invention was to provide further promoters and / or expression units with advantageous properties.
  • nucleic acids with promoter activity containing
  • transcription is understood to mean the process by which a complementary DNA molecule is produced by a DNA template, in which process proteins such as RNA polymerase are involved in so-called sigma factors and transcriptional regulatory proteins then serves as a template in the process of translation, which then leads to the biosynthetically active protein.
  • the rate at which a biosynthetic active protein is produced is a product of the rate of transcription and translation. Both rates can be influenced according to the invention and thus influence the rate of formation of products in a microorganism.
  • a "promoter” or a “nucleic acid with promoter activity” is understood as meaning according to the invention a nucleic acid which, in functional linkage with a nucleic acid to be transected, regulates the transcription of this nucleic acid.
  • a "functional linkage” is understood to mean, for example, the sequential arrangement of one of the nucleic acids according to the invention with promoter activity and a nucleic acid sequence to be transcribed and, if appropriate, further regulatory elements, for example nucleic acid sequences which ensure the transcription of nucleic acids, and for example Terminator such that each of the regulatory elements can fulfill its function in the transcription of the nucleic acid sequence.
  • further regulatory elements for example nucleic acid sequences which ensure the transcription of nucleic acids, and for example Terminator such that each of the regulatory elements can fulfill its function in the transcription of the nucleic acid sequence.
  • Genetic control sequences such as for example enhancer sequences, can also function
  • Preference is given to arrangements in which the nucleic acid sequence to be transcribed is positioned behind the (ie at the 3 'end) of the promoter sequence according to the invention rd, so that both sequences are covalently linked.
  • the distance between the promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is
  • promoter activity is understood as meaning the amount of RNA, that is to say the transcription rate, formed by the promoter in a specific time.
  • RNA per promoter activity is meant according to the invention the amount of RNA per promoter formed by the promoter in a certain time.
  • wild-type is understood according to the invention as the corresponding starting microorganism.
  • microorganism may be understood as meaning the starting microorganism (wild-type) or a genetically modified microorganism according to the invention or both.
  • the term "wild-type" is used to change or cause the promoter activity or transcription rate, to change or cause the expression activity or expression rate, and for the Er ⁇ increase the content of biosynthetic products each understood a reference organism.
  • this reference organism is Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.
  • starting microorganisms are used which are already capable of producing the desired fine chemical.
  • particularly preferred microorganisms of the bacteria of the genus Corynebacteria and the particularly preferred fine chemicals L-lysine, L-methionine and L-threonine those starting microorganisms which are already able to produce L-lysine, L-methionine and / or are particularly preferred To produce L-threonine.
  • these are particularly preferably corynebacteria in which, for example, the gene coding for an aspartokinase (ask gene) is deregulated or the feed-back inhibition is stopped or reduced.
  • such bacteria in the ask gene have a mutation which leads to a reduction or abolition of the feedback inhibition, for example. the mutation T3111.
  • RNA With a "caused promoter activity" or transcription rate with respect to a gene compared to the wild type, the formation of a RNA is thus caused in comparison to the wild type, which was thus not present in the wild type.
  • the amount of RNA formed is thus changed in a certain time compared to the wild type.
  • the increased promoter activity or transcription rate can be achieved, for example, by regulating the transcription of genes in the microorganism by nucleic acids according to the invention having promoter activity or by nucleic acids having increased specific promoter activity, the genes being heterologous with respect to the nucleic acids having promoter activity.
  • Vorzusgweise the regulation of the transcription of genes in the microorganism by nucleic acids according to the invention with promoter activity or by nucleic acids with increased specific promoter activity is achieved by one or more nucleic acids according to the invention having promoter activity, where appropriate with altered specific promoter activity, are introduced into the genome of the microorganism such that the transcription of one or more endogenous genes under the control of the incorporated nucleic acid according to the invention having promoter activity is optionally altered specific promoter activity, or
  • nucleic acid constructs comprising a nucleic acid according to the invention having promoter activity, optionally with altered specific promoter activity, and functionally linking one or more nucleic acids to be transcribed into which microorganism introduces.
  • nucleic acids according to the invention with promoter activity contain
  • nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. 1 or B a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of nucleotides which has an identity of at least 90% at the nucleic acid level with the sequence SEQ. ID. NO. 1 or
  • the nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. 1 represents the promoter sequence of the Zuckerphos- phosphate epimerase (P 2- io) from Corynebacterium glutamicum. SEQ. ID.NO. 1 corresponds to the wild-type promoter sequence.
  • the invention further relates to nucleic acids with promoter activity comprising a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of nucleotides, which has an identity of at least 90% at the nucleic acid level with the sequence SEQ. ID. NO. 1 has.
  • promoters according to the invention can be easily found, for example, from various organisms whose genomic sequence is known by identity comparisons of the nucleic acid sequences from databases with the sequences SEQ ID NO: 1 described above.
  • Artificial promoter sequences according to the invention can easily be found starting from the sequence SEQ ID NO: 1 by artificial variation and mutation, for example by substitution, insertion or deletion of nucleotides.
  • substitution in the description refers to the replacement of one or more nucleotides by one or more nucleotides.
  • “Deletion” is the replacement of a nucleotide by a direct bond Insertions are insertions of nucleotides into the nucleic acid sequence which formally replaces a direct bond with one or more nucleotides.
  • Identity between two nucleic acids is understood to mean the identity of the nucleotides over the entire nucleic acid length, in particular the identity which was determined by comparison with the Vector NTI Suite 7.1 software from Informax (USA) using the Clustal method (Higgins DG, Sharp PM Biosci 1989 Apr; 5 (2): 151-1) is calculated by setting the following parameters: and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer.
  • Pairwise alignment parameter FAST algorithm K-tupIesize 1 Gap penalty 3 Window size 5 Number of best diagonals 5
  • a nucleic acid sequence which has an identity of at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 1 is accordingly understood to mean a nucleic acid sequence which, in a comparison of its sequence with the sequence SEQ ID NO: 1, in particular above program logarithm with the above parameter set has an identity of at least 90%.
  • Particularly preferred promoters have with the nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. 1 has an identity of 91%, more preferably 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, more preferably 99%.
  • promoters can furthermore readily be found starting from the above-described nucleic acid sequences, in particular starting from the sequence SEQ ID NO: 1 from various organisms whose genomic sequence is unknown, by hybridization techniques in a manner known per se.
  • a further subject of the invention therefore relates to nucleic acids with promoter activity, containing a nucleic acid sequence which is linked to the nucleic acid sequence SEQ. ID. No. 1 hybridized under stringent conditions.
  • This nucleic acid sequence comprises at least 10, more preferably more than 12, 15, 30, 50, or more preferably more than 150 nucleotides.
  • hybridization is carried out according to the invention under stringent conditions.
  • stringent conditions are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, EF, Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd Edition, ColD Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57 or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6:
  • Under stringent hybridization conditions mean in particular: Overnight incubation at 42 0 C in a solution of 50% formamide, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6 ), 5x Denhardt solution, 10% dextran sulfate, and 20 g / ml denatured, sheared salmon sperm DNA, followed by washing the filters with 0.1 x SSC at 65 0 C.
  • 5 x SSC 750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate
  • 50 mM sodium phosphate pH 7.6
  • 5x Denhardt solution 10% dextran sulfate
  • a “functionally equivalent fragment” for nucleic acid sequences with promoter activity fragments understood that have substantially the same or higher specific promoter activity as the starting sequence.
  • a specific promoter activity which has at least 50%, preferably 60%, more preferably 70%, more preferably 80%, more preferably 90%, most preferably 95% of the specific promoter activity of the starting sequence.
  • “Fragments” are understood as meaning partial sequences of the nucleic acids with promoter activity described by embodiment A), B) or C) these fragments have more than 10, but more preferably more than 12, 15, 30, 50 or particularly preferably more than 150 contiguous nucleotides of the nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. 1 on.
  • nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. 1 is a promoter, i. for the transcription of genes.
  • the SEQ. ID. NO. 1 has been described without function assignment in Genbank entry AP005283. Therefore, the invention further relates to the novel nucleic acid sequences according to the invention with promoter activity.
  • the invention relates to a nucleic acid with promoter activity containing
  • nucleic acid having the sequence SEQ. ID. NO. 1 is excluded.
  • nucleic acids with promoter activity can furthermore be produced in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide units, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid units of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the An ⁇ storage of synthetic oligonucleotides and filling gaps with the Klenow fragment of the DNA polymerase and ligation reactions and general cloning procedures are in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Col. Spring Harbor Laboratory Press.
  • the invention further relates to the use of an expression unit comprising one of the nucleic acids according to the invention with promoter activity and additionally functionally linked to a nucleic acid sequence which ensures the translation of ribonucleic acids, for the expression of genes.
  • an expression unit is understood as meaning a nucleic acid with expression activity, ie a nucleic acid which, in functional linkage with a nucleic acid or gene to be expressed, regulates the expression, ie the transcription and the translation of this nucleic acid or gene.
  • a “functional linkage” is understood to mean, for example, the sequential arrangement of one of the expression units according to the invention and of a nucleic acid sequence to be expressed transgenically and, if appropriate, further regulatory elements such as a terminator in such a way that each of the regulative This does not necessarily require a direct link in the chemical sense: genetic control sequences, such as enhancer sequences, may also function from more distant locations or even from other DNA molecules Preference is given to arrangements in which the nucleic acid sequence to be transgenically expressed is positioned behind (ie at the 3 'end) of the expression unit sequence according to the invention, so that both sequences are covalently linked to one another between the expression unit sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgene less than 200 base pairs, more preferably less than 100 base pairs, most preferably less than 50 base pairs.
  • expression activity is understood to mean the amount of protein formed by the expression unit over a certain period of time, ie the expression rate.
  • specific expression activity is understood as meaning the amount of protein per expression unit formed by the expression unit over a certain period of time.
  • changed is preferably increased or decreased. This can be done, for example, by increasing or reducing the specific activity of the endogenous expression unit, for example by mutation of the expression unit or by stimulation or inhibition of the expression unit.
  • the increased expression activity or expression rate can be achieved, for example, by regulation of the expression of genes in the microorganism by expression units according to the invention or by expression units with increased specific expression activity, wherein the genes are heterologous with respect to the expression units.
  • the regulation of the expression of genes in the microorganism by expression units according to the invention or by expression units with increased specific expression activity according to the invention is achieved by
  • one or more expression units according to the invention into the genome of the microorganism ein ⁇ brings, so that the expression of one or more endogenous genes under the control of the introduced expression units according to the invention, optionally with altered specific expression activity occurs or
  • nucleic acid constructs containing an expression unit according to the invention, optionally with altered specific expression activity, and functionally linked one or more nucleic acids to be expressed into the microorganism.
  • the expression units according to the invention contain a nucleic acid according to the invention which is described above with promoter activity and additionally functionally linked to a nucleic acid sequence which ensures the translation of ribonucleic acids.
  • the expression unit according to the invention contains:
  • nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. 2 or F a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of nucleotides which has an identity of at least 90% at nucleic acid level with the sequence SEQ. ID. NO. 2 or
  • G a nucleic acid sequence which is linked to the nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. 2 hybridized under stringent conditions or
  • the nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. 2 represents the nucleic acid sequence of the expression unit of the sugar phosphate epimerase (P 2 -10 ) from Corynebacterium glutamicum. SEQ. ID.NO. 2 corresponds to the sequence of the expression unit of the wild-type.
  • the invention furthermore relates to expression units comprising a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of nucleotides which has an identity of at least 90% at the nucleic acid level with the sequence SEQ. ID. NO. 2 has.
  • a nucleic acid sequence which has an identity of at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 2 is accordingly understood as meaning a nucleic acid sequence which, in a comparison of its sequence with the sequence SEQ ID NO: 2, in particular above program logarithm with the above parameter set has an identity of at least 90%.
  • Particularly preferred expression units have with the nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. 2 has an identity of 91%, more preferably 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, most preferably 99%.
  • expression units can furthermore be obtained starting from the above-described nucleic acid sequences, in particular starting from the sequence SEQ ID NO: 2 from various organisms whose genomic Sequence is not known, easily find by hybridization techniques in a conventional manner.
  • a further subject of the invention therefore relates to expression units comprising a nucleic acid sequence which is linked to the nucleic acid sequence SEQ. ID. No. 2 hybridized under stringent conditions.
  • This nucleic acid sequence comprises at least 10, more preferably more than 12, 15, 30, 50 or particularly preferably more than 150 nucleotides.
  • hybridizing is meant the ability of a poly or oligonucleotide to bind under stringent conditions to a nearly complementary sequence, while under these conditions nonspecific binding between non-complementary partners is avoided.
  • sequences should preferably be 90-100%, complementary.
  • the property of complementary sequences to be able to specifically bind to one another for example, in the Northern or Southem blot technique or in the primer binding in PCR or RT-PCR advantage.
  • hybridization is carried out according to the invention under stringent conditions.
  • stringent conditions are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, EF, Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd Edition, ColD Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57 or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6:
  • Under stringent hybridization conditions mean in particular: Overnight incubation at 42 0 C in a solution of 50% formamide, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6 ), 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate and 20 g / ml denatured salmon sperm DNA, followed by washing the filters with 0.1x SSC at 65 ° C.
  • the nucleotide sequences according to the invention also make it possible to generate probes and primers which can be used for the identification and / or cloning of homologous sequences in other cell types and microorganisms.
  • probes or primers usually comprise a nucleotide sequence region which under stringent conditions is at least about 12, preferably at least about 25, e.g. about 40, 50 or 75 consecutive nucleotides of a sense strand of a nucleic acid sequence according to the invention or a corresponding antisense strand hybridizes.
  • nucleic acid sequences which comprise so-called silent mutations or, according to the codon usage, a special one Source or host organism are changed in comparison to a specific sequence mentioned, as well as naturally occurring variants, such as splice variants or allelic variants thereof.
  • a “functionally equivalent fragment” is meant for expression units, fragments having substantially the same or a higher specific expression activity as the starting sequence.
  • substantially the same is meant a specific expression activity which has at least 50%, preferably 60%, more preferably 70%, more preferably 80%, more preferably 90%, most preferably 95% of the specific expression activity of the starting sequence.
  • “Fragments” are to be understood as meaning partial sequences of the expression units described by embodiment E), F) or G.
  • these fragments Preferably, these fragments have more than 10, more preferably more than 12, 15, 30, 50 or, even more preferably, more than 150 contiguous nucleotides of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. 2 as expression unit, i. for the expression of genes.
  • the invention furthermore relates to the novel expression units according to the invention.
  • the invention relates to an expression unit comprising a nucleic acid according to the invention with promoter activity additionally functionally linked to a nucleic acid sequence which ensures the translation of ribonucleic acids.
  • the invention particularly preferably relates to an expression unit containing
  • the expression units of the invention comprise one or more of the following genetic elements: a minus 10 ("-10") sequence; a minus 35 (“-35”) sequence; a transcription start, an enhancer region; and an operator region.
  • these genetic elements are specific for the species Corynebacteria, especially for Corynebacterium glutamicum.
  • All of the abovementioned expression units can furthermore be prepared in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide units, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid building blocks of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can, for example, in a known manner, by the phosphoamidite method (Voet,
  • nucleic acid molecules of the present invention are preferably in the form of an isolated nucleic acid molecule.
  • nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules present in the natural source of nucleic acid and, moreover, may be substantially free of other cellular material or culture medium when produced by recombinant techniques or free of chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized.
  • the invention further comprises the nucleic acid molecules complementary to the specifically described nucleotide sequences or a portion thereof.
  • the promoters and / or expression units according to the invention can be used, for example, with particular advantage in improved processes for the fermentative preparation of biosynthetic products as described below.
  • the promoters and / or expression units according to the invention have the particular advantage that they are induced in microorganisms by stress.
  • this stress induction can be controlled for an increase in the rate of inflammation / expression of desired genes.
  • this stress phase is reached very early, so that here very early an increased transcription / expression rate of desired genes can be achieved.
  • nucleic acids with promoter activity according to the invention can be used to modify, ie to increase or reduce, or to cause the transcription rate of genes in microorganisms in comparison to the wild type.
  • the expression units according to the invention can be used for altering, that is to say for increasing or reducing, or for causing the expression rate of genes in microorganisms in comparison to the wild type.
  • nucleic acids according to the invention with promoter activity and the expression units according to the invention can serve to regulate and enhance the formation of different biosynthetic products, such as, for example, fine chemicals, proteins, in particular amino acids, in microorganisms, in particular in Corynebacterium species.
  • the invention therefore relates to a method for altering or causing the transcription rate of genes in microorganisms in comparison to the wild type a) modification of the specific promoter activity in the microorganism of endogenous nucleic acids according to the invention with promoter activity, which regulate the transcription of endogenous genes, in comparison to the wild-type or
  • the change or causation of the transcription rate of genes in microorganisms in comparison to the wild type can be achieved by modifying, ie increasing or decreasing, the specific promoter activity in the microorganism. This can be done, for example, by targeted mutation of the nucleic acid sequence according to the invention with promoter activity, that is to say by targeted substitution, de-insertion or insertion of nucleotides. Increased or decreased promoter activity can be achieved by exchanging the nucleotides in the binding site of the RNA polymerase holoenzyme binding sites (also known to the person skilled in the art as the -10 region and the region known).
  • binding sites also known to the person skilled in the art as regulators
  • regulatory proteins also known to the person skilled in the art as repressors and activators
  • increasing or reducing in comparison with the wild type means an increase or reduction of the specific activity with respect to the nucleic acid according to the invention having promoter activity of the wild-type, that is to say, for example, with reference to SEQ ID NO.
  • the transcription rate of genes in microorganisms can be changed or caused in comparison to the wild type by transcribing genes in the microorganism by nucleic acids with promoter activity according to the invention or by nucleic acids with modified specific promoter activity according to embodiment a). wherein the genes are heterologous with respect to the nucleic acids having promoter activity. This is preferably achieved by one
  • nucleic acid constructs containing a nucleic acid according to the invention with promoter activity, optionally with modified specific promoter activity, and functionally linked one or more nucleic acids to be transcribed into the microorganism.
  • one or more nucleic acids according to the invention having promoter activity, optionally with altered specific promoter activity are introduced into the genome of the microorganism such that the transcription of one or more endogenous genes under the control of the introduced nucleic acid having promoter activity, optionally with altered specific promoter activity , or
  • embodiment b2) introduces one or more endogenous genes into the genome of the microorganism such that the transcription of one or more of the introduced endogenous genes takes place under the control of the endogenous nucleic acids according to the invention having promoter activity, optionally with altered specific promoter activity or
  • nucleic acid constructs comprising a nucleic acid according to the invention with promoter activity, optionally with altered specific promoter activity, and functionally linked one or more endogenous nucleic acids to be transcribed into the microorganism. Furthermore, it is thus possible to cause the transcription rate of an exogenous gene compared to the wild type by
  • embodiment b2) introduces one or more exogenous genes into the genome of the microorganism such that the transcription of one or more of the introduced exogenous genes takes place under the control of the endogenous nucleic acids according to the invention having promoter activity, optionally with altered specific promoter activity or
  • nucleic acid constructs comprising a nucleic acid according to the invention having promoter activity, optionally with altered specific promoter activity, and functionally linked one or more exogenous nucleic acids to be transcribed, into which microorganism is introduced.
  • the insertion of genes according to embodiment b2) can be carried out so that the gene is integrated into coding regions or non-coding regions. Vor ⁇ preferably the insertion into non-coding regions.
  • the insertion of nucleic acid constructs according to embodiment b3) can be carried out chromosomally or extrachromosomally.
  • the insertion of the nucleic acid constructs is chromosomal.
  • a "chromosomal" integration is the insertion of an exogenous DNA fragment into the chromosome of a host cell, which is also used for homologous recombination between an exogenous DNA fragment and the corresponding region on the chromosome of the host cell.
  • nucleic acids according to the invention with modified specific promoter activity according to embodiment a). These can be present in the microorganism in Example b), as described in embodiment a), and can be prepared or introduced in isolated form into the microorganism.
  • endogenous is meant genetic information, such as genes, that are already contained in the wild-type genome.
  • exogenous are meant genetic information, such as genes, which are not contained in the wild-type genome.
  • genes with regard to regulation of transcription by the nucleic acids according to the invention having promoter activity are preferably understood as meaning nucleic acids which have a region to be transcribed, that is to say, for example, a rich regulates the translation, a coding region, and optionally other regulatory elements, such as a terminator included.
  • genes with regard to the expression regulation described below by the expression units according to the invention are preferably understood as meaning nucleic acids which contain a coding region and optionally further regulatory elements, for example a terminator.
  • coding region is meant a nucleic acid sequence encoding a protein.
  • heterologous with reference to nucleic acids with promoter activity and genes is understood that the genes used in the wild type are not transcribed under regulation of the nucleic acids according to the invention with promoter activity, but that a new, non-wild-type functional linkage is formed and the functional combination of inventive nucleic acid with promoter activity and specific gene does not occur in the wild type.
  • heterologous in terms of expression units and genes is meant that the genes used are not expressed in the wild-type under regulation of the expression units according to the invention, but that a new, not occurring in the wild type functional linkage is formed and the functional combination of inventive Expression unit and specific gene does not occur in the wild type.
  • nucleic acids according to the invention having promoter activity or by inventive Nucleic acids with increased specific promoter activity according to embodiment artisans) are achieved by reacting
  • nucleic acids according to the invention with promoter activity, optionally with increased specific promoter activity, into the genome of the invention
  • bh2 introduces one or more genes into the genome of the microorganism such that the transcription of one or more of the genes introduced takes place under the control of the endogenous nucleic acids according to the invention with promoter activity, optionally with increased specific promoter activity, or
  • nucleic acid constructs comprising a nucleic acid according to the invention with promoter activity, optionally with increased specific promoter activity, and functionally linked one or more nucleic acids to be transcribed into the microorganism.
  • the invention further relates, in a preferred embodiment, to a method for reducing the transcription rate of genes in microorganisms in comparison to the wild type, by
  • nucleic acids with reduced specific promoter activity according to embodiment a) is introduced into the genome of the microorganism, so that the
  • the invention further relates to a method for altering or causing the expression rate of a gene in microorganisms compared to the wild type
  • the change or causation of the expression rate of genes in microorganisms in comparison to the wild type can be achieved by altering, ie increasing or decreasing, the specific expression activity in the microorganism.
  • altering ie increasing or decreasing, the specific expression activity in the microorganism.
  • This can be done, for example, by targeted mutation of the nucleic acid sequence according to the invention with promoter activity, ie by targeted substitution, deletion or insertion of nucleotides.
  • the extension of the distance between Shine-Dalgamo sequence and the translational start codon generally leads to a change, a reduction or even an increase in the specific expression activity.
  • a change in the specific expression activity can also be achieved by shortening or lengthening the sequence of the Shine-Dalgamo region (ribosomal binding site) in its distance from the translational initiation codon by deletions or insertions of nucleotides. But also by the fact that the sequence of the Shine-Dalgamo region is changed so that the homology to complementary 3 'Page 16S rRNA either increased or decreased.
  • an increase or reduction in comparison to the wild type is understood to mean an increase or reduction of the specific activity relative to the wild-type expression unit according to the invention, ie, for example, with respect to SEQ ID NO.
  • the change or causation of the expression rate of genes in microorganisms in comparison to the wild type can be effected by regulating the expression of genes in the microorganism by expression units according to the invention or by expression units according to the invention with altered specific expression activity according to embodiment c) wherein the genes are heterologous with respect to the expression units.
  • d1) introducing one or more expression units according to the invention, optionally with altered specific expression activity, into the genome of the microorganism such that the expression of one or more endogenous genes takes place under the control of the introduced expression units or d2) introducing one or more genes into the genome of the microorganism, so that the expression of one or more of the genes introduced takes place under the control of the endogenous expression units according to the invention, optionally with altered specific expression activity, or
  • nucleic acid constructs containing an expression unit according to the invention, optionally with modified specific expression activity, and functionally linked one or more nucleic acids to be expressed, into which microorganism introduces.
  • one or more expression units according to the invention are introduced into the genome of the microorganism such that the expression of one or more endogenous genes takes place under the control of the introduced expression units or
  • embodiment d2) introduces one or more genes into the genome of the microorganism so that the expression of one or more of the introduced genes takes place under the control of the endogenous expression units according to the invention, optionally with altered specific expression activity, or
  • nucleic acid constructs containing an expression unit according to the invention, optionally with modified specific expression activity, and functionally linked one or more nucleic acids to be expressed, into which microorganism introduces.
  • embodiment d2) introduces one or more exogenous genes into the genome of the microorganism, so that the expression of one or more of the incorporated genes takes place under the control of the endogenous expression units according to the invention, optionally with altered specific expression activity, or
  • nucleic acid constructs containing an expression unit according to the invention, optionally with altered specific expression activity, and functionally linked one or more exogenous nucleic acids to be expressed, into which microorganism introduces.
  • the insertion of genes according to embodiment d2) can be carried out so that the gene is integrated into coding regions or non-coding regions.
  • the insertion takes place in non-coding regions.
  • the insertion of nucleic acid constructs according to embodiment d3) can be effected chromosomally or extrachromosomally.
  • the insertion of the nucleic acid constructs is chromosomal.
  • nucleic acid constructs are also referred to below as expression cassettes.
  • expression units according to the invention with modified specific expression activity according to embodiment c). These can be present in the microorganism in mold form d), as described in embodiment d), or can be prepared in isolated form in the microorganism.
  • the regulation of the expression of genes in the microorganism by expression units according to the invention or by expression units with increased specific expression activity according to embodiment c) is achieved by
  • dh1 introduces one or more expression units according to the invention, optionally with increased specific expression activity, into the genome of the microorganism, so that the expression of one or more endogenous Gene under the control of the introduced expression units, optionally with increased specific expression activity, takes place or
  • dh2 introduces one or more genes into the genome of the microorganism, so that the expression of one or more of the introduced genes is under the control of the endogenous expression units according to the invention, if appropriate with increased specific expression activity, or
  • nucleic acid constructs containing an expression unit according to the invention, optionally with increased specific expression activity, and functionally linked one or more nucleic acids to be expressed, into which microorganism introduces.
  • the invention further relates to a method for reducing the expression rate of genes in microorganisms compared to the wild type by
  • dr introduces expression units with reduced specific expression activity according to embodiment (s) into the genome of the microorganism, so that expression of endogenous genes takes place under the control of the introduced expression units with reduced expression activity.
  • the genes are selected from the group nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of fine chemicals, the genes optionally further regulatory elements can contain.
  • the genes are selected from the group nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, encoding nucleic acids a protein from the biosynthetic pathway of nucleotides and nucleosides, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of organic acids, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of lipids and fatty acids, nucleic acids encoding a protein from the biosynthesis pathway of diols, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of carbohydrate hydrates, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of aromatic compound, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of vitamins, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of vitamins, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of vitamins, nucleic acids en
  • proteins from the biosynthesis path of amino acids selected from the group aspartate kinase, aspartate-semialdehyde dehydrogenase, diaminopimelate
  • Dehydrogenase diaminopimelate decarboxylase, dihydrodipicolinate synthetase, dihydrodipicolinate reductase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 3-phosphoglycerate kinase, pyruvate carboxylase, triosephosphate isomerase, transcriptional regulator LuxR, transcriptional regulator LysR1, transcriptional regulator LysR2, malate quinone oxidoreductase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrognease, transketolase, transaldolase, homoserine O-acetyltransferase, cystahionine gamma synthase, cystahionine beta-lyase, serine hydroxymethyltransferase, Acetyl homoserine sulfhydrylase, methylene tetrahydrofolate reductase,
  • Preferred proteins and nucleic acids encoding these proteins of the above-described proteins from the biosynthetic pathway of amino acids are protein sequences or nucleic acid sequences of microbial origin, preferably from bacteria of the genus Corynebacterium or Brevibacterium, preferably from coryneform bacteria, particularly preferably from Corynebacterium glutamicum.
  • Another example of a particularly preferred protein sequence and the corresponding nucleic acid sequence encoding this protein from the biosynthetic pathway of amino acids is the sequence of the fructose-1,6-bisphosphatase 2, or also called fbr2, (SEQ ID NO. 8) and the corresponding nucleic acid sequence encoding a fructose-1, 6-bisphosphatase 2 (SEQ ID NO: 7).
  • Another example of a particularly preferred protein sequence and the corresponding nucleic acid sequence encoding this protein from the biosynthetic pathway of amino acids is the sequence of the protein in sulfate reduction, or also called RXA077, (SEQ ID NO: 10) and the corresponding Nucleic acid sequence encoding a protein in sulfate reduction (SEQ ID NO. 9)
  • Further particularly preferred protein sequences from the biosynthesis pathway of amino acids have in each case the amino acid sequence indicated for this protein in Table 1, wherein the respective protein in each case at at least one of the amino acid positions indicated in Table 2 / SpaIte2 for this amino acid sequence another proteinogenic amino acid than the respective amino acid indicated in Table 2 / Column 3 in the same line.
  • the proteins have the amino acid indicated in Table 2 / Column 4 in the same row on at least one of the amino acid positions indicated in Table 2 / Column 2 for the amino acid sequence.
  • the proteins given in Table 2 are mutated proteins of the biosynthetic pathway of amino acids which have particularly advantageous properties and are therefore particularly suitable for expression of the corresponding nucleic acids by the promoter according to the invention and for the production of amino acids.
  • the T3111 mutation results in switching off the feedback inhibition from ask.
  • nucleic acids which encode a mutated protein from Table 2 described above can be prepared by conventional methods.
  • the starting point for the preparation of the nucleic acid sequences encoding a mutant protein is, for example, the genome of a Corynebacterium glutamicum strain which is obtainable from the American Type Culture Collection under the name ATCC 13032 or the nucleic acid sequences referred to in Table 1.
  • a Corynebacterium glutamicum strain which is obtainable from the American Type Culture Collection under the name ATCC 13032 or the nucleic acid sequences referred to in Table 1.
  • Corynebacterium glutamicum it is preferable for Corynebacterium glutamicum to use the codon usage of Corynebacterium glutamicum.
  • the codon usage of the particular organism can be determined in a manner known per se from databases or patent applications which describe at least one protein and a gene which codes for this protein from the desired organism.
  • mutated protein with a certain function (column 5) and a certain initial amino acid sequence (table 1)
  • at least one mutation is described in columns 2, 3 and 4, and several mutations are also described for some sequences. These multiple mutations always refer to the above-mentioned, closest starting amino acid sequence (Table 1).
  • the term "at least one of the amino acid positions" of a particular amino acid sequence is preferably understood to mean at least one of the mutations described for this amino acid sequence in columns 2, 3 and 4.
  • the SacB method is known to the person skilled in the art and is described, for example, in Schwarz A, Tauch A, Jäger W, Kalinowski J 1 Thierbach G, Pühler A .; Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosomes of Corynebacterium glutamicum, Gene. 1994 JuI 22; 145 (1): 69-73 and Blomfield IC, Vaughn V, rest RF, Eisenstein Bl .; Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101 replicon; Mol Microbiol. 1991 Jun; 5 (6): 1447-57.
  • the change or causation of the transcription rate and / or expression rate of genes in microorganisms takes place by introducing Nucleic acids according to the invention having promoter activity or inventive expression units in the microorganism.
  • the change or causation of the transcription rate and / or expression rate of genes in microorganisms takes place by introducing the above-described nucleic acid constructs or expression cassettes into the microorganism.
  • the invention therefore further relates to an expression cassette comprising
  • At least one further nucleic acid sequence to be expressed ie a gene to be expressed
  • genetic control elements such as a terminator
  • the nucleic acid sequence to be expressed is at least one nucleic acid encoding a protein from the biosynthetic pathway of fine chemicals.
  • the nucleic acid sequence to be expressed is particularly preferably selected from the group of nucleic acids encoding a protein from the biosynthesis pathway of proteinogenic and nonproteinogenic amino acids, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of nucleotides and nucleosides, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of organic acids , Nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of lipids and fatty acids, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of diols, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of carbohydrates, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of aromatic compound, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of vitamins, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of cofactors and nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of
  • the physical position of the expression unit relative to the gene to be expressed is selected so that the expression unit regulates the transcription and preferably also the translation of the gene to be expressed and thus enables the formation of one or more proteins.
  • the "enabling education” involves constitutively increasing the formation, weakening or blocking the formation under specific conditions and / or increasing the formation under specific conditions.
  • the “conditions” include: (1) adding a component to the culture medium, (2) removing a component from the culture medium, (3) replacing a component in the culture medium with a second component, (4) increasing the temperature of the culture medium, (5) Lowering the temperature of the culture medium, and (6) regulating the atmospheric conditions, such as the oxygen or nitrogen concentration in which the culture medium is maintained.
  • the invention furthermore relates to an expression vector comprising an above-described expression cassette according to the invention.
  • Vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). Vectors other than plasmids are also to be understood as meaning all other vectors known to the person skilled in the art, such as, for example, phages, transposons, IS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA. These vectors can be autonomously replicated in the host organism or replicated chromosomally.
  • Plasmid ⁇ vectors such as. PCUK ⁇ MCS, or those based on pCG4 (US Pat. No.
  • those plasmid vectors by means of which one can apply the method of gene amplification by integration into the chromosome, as described for example by Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60,126- 132 (1994)) for duplication or amplification of the hom-thrB operon.
  • the complete gene is cloned into a plasmid vector which can replicate in a host (typically E. coli) but not in C. glutamicum.
  • vectors which are used are pSUP301 (Simon et al., Bio / Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob or pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), Berard et al. , Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) or pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342) Question.
  • the plasmid vector containing the gene to be amplified is then transformed into the desired strain of C. glutamicum by transformation.
  • the invention further relates to a genetically modified microorganism, wherein the genetic modification leads to a change or causation of the transcription rate of at least one gene in comparison to the wild type and is conditioned by
  • nucleic acids with promoter activity according to claim 1 or by nucleic acids with promoter activity according to claim 1 with altered specific promoter activity according to embodiment a) is achieved by
  • b1) introduces one or more nucleic acids with promoter activity according to claim 1, optionally with modified specific promoter activity, into the genome of the microorganism such that the transcription of one or more endogenous genes under the control of the introduced nucleic acid with promoter activity according to An ⁇ Speech 1, optionally with altered specific promoter activity, takes place or b2) introducing one or more genes into the genome of the microorganism such that the transcription of one or more of the introduced genes takes place under the control of the endogenous nucleic acids with promoter activity according to claim 1, optionally with altered specific promoter activity, or
  • the invention further relates to a genetically modified microorganism having an increased or caused transcription rate of at least one gene in comparison to the wild type, wherein
  • Promoter activity according to embodiment ah), wherein the genes are heterologous with respect to the nucleic acids having promoter activity.
  • nucleic acids with promoter activity according to claim 1 or by nucleic acids with promoter activity according to claim 1 with altered specific promoter activity according to embodiment a) is achieved by
  • bh1 introduces one or more nucleic acids with promoter activity according to claim 1, where appropriate with increased specific promoter activity, into the genome of the microorganism such that the transcription of one or more endogenous genes under control of the introduced nucleic acid with promoter activity, optionally with increased specific promoter activity, or
  • bh.2 introduces one or more genes into the genome of the microorganism such that the transcription of one or more of the introduced genes takes place under the control of the endogenous nucleic acids with promoter activity according to claim 1, optionally with increased specific promoter activity, or bh3) one or more nucleic acid constructs containing a nucleic acid with promoter activity according to claim 1, optionally with increased specific promoter activity, and functionally linked one or more nucleic acids to be transcribed into the microorganism.
  • the invention further relates to a genetically modified microorganism having a reduced transcription rate of at least one gene in comparison to the wild type, wherein
  • nucleic acids with reduced promoter activity according to embodiment a) have been introduced into the genome of the microorganism, so that the
  • the invention further relates to a genetically modified microorganism, wherein the genetic modification leads to a change or causation of the Expressionsra ⁇ te of at least one gene in comparison to the wild type and is caused by
  • d1) introduces one or more expression units according to claim 2 or 3, optionally with altered specific expression activity, into the genome of the microorganism, so that the expression of one or more endogenous genes under the control of the introduced expression units according to claim 2 or 3, optionally with altered specific expression activity, takes place or
  • d2 introduces one or more genes into the genome of the microorganism such that the expression of one or more of the genes introduced takes place under the control of the endogenous expression units according to claim 2 or 3, optionally with altered specific expression activity, or
  • nucleic acid constructs containing an expression unit according to claim 2 or 3, optionally with altered specific expression activity, and functionally linked one or more nucleic acids to be expressed, into which microorganism introduces.
  • the invention further relates to a genetically modified microorganism having an increased or caused expression rate of at least one gene in comparison to the wild type, wherein
  • dh1 introduces one or more expression units according to claim 2 or 3, optionally with increased specific expression activity, into the genome of the microorganism, so that the expression of one or more endogenous genes under the control of the introduced expression units according to claim 2 or 3, if appropriate with increased specific expression activity, takes place or
  • dh2 introduces one or more genes into the genome of the microorganism such that expression of one or more of the introduced genes is under the control of endogenous expressed expression units according to claim 2 or 3, optionally with increased specific expression activity, takes place or
  • nucleic acid constructs containing an expression unit according to claim 2 or 3, optionally with increased specific expression activity, and functionally linked one or more nucleic acids to be expressed, into which microorganism introduces.
  • the invention further relates to a genetically modified microorganism having a reduced expression rate of at least one gene in comparison to the wild type, wherein
  • one or more expression units according to claim 2 or 3 were introduced with reduced expression activity in the genome of the microorganism, so that the expression of at least one gene under the control of the introduced expression unit according to claim 2 or 3 takes place with reduced expression activity.
  • the invention relates to a genetically modified microorganism containing an expression unit according to claim 2 or 3 and functionally linked to a gene to be expressed, wherein the gene is heterologous with respect to the expression unit.
  • This genetically modified microorganism particularly preferably contains an expression cassette according to the invention.
  • the present invention particularly preferably relates to genetically modified microorganisms, in particular coryneform bacteria, which contain a vector, in particular pendulum vector or plasmid vector, which carries at least one recombinant nucleic acid construct according to the definition of the invention.
  • the genes described above are at least one nucleic acid encoding a protein from the biosynthetic pathway of fine chemicals.
  • the genes described above are selected from the group of nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway.
  • nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of organic acids nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of lipids and fatty acids
  • nucleic acids encoding a protein from the biosynthesis pathway of diols nucleic acids encoding a protein from the biosynthesis pathway of carbohydrates
  • nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of aromatic compound nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of vitamins
  • nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of cofactors and nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of enzymes, which genes may optionally contain further regulatory elements.
  • Preferred proteins from the biosynthetic pathway of amino acids are selected from the group aspartate kinase, aspartate-semialdehyde dehydrogenase, diaminopimelate dehydrogenase, diaminopimelate decarboxylase, dihydrodipicolinate synthetase, dihydrodipicolinate reductase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,
  • Preferred microorganisms or genetically modified microorganisms are bacteria, algae, fungi or yeasts. 007757
  • Besondar's preferred microorganisms are, in particular, coryneform bacteria.
  • Preferred coryneform bacteria are bacteria of the genus Corynebacterium, in particular of the species Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium melassecola and Corynebacterium efficiens or of the genus Brevibacterium, in particular of the species Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum and Brevibacterium divaricatum.
  • Particularly preferred bacteria of the genera Corynebacterium and Brevibacterium are selected from the group Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium me ⁇ lassecola ATCC 17965, Corynebacterium efficiens DSM 44547, Corynebacterium efficiens DSM 44548.
  • the abbreviation KFCC means the Korean Federation of Culture Collection
  • the abbreviation ATCC means the American strain strain culture collection
  • the abbreviation DSM the German Collection of Microorganisms.
  • ATCC American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA.
  • FERM Fermentation Research Institute, Chiba, Japan
  • NRRL ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA
  • DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany
  • inventive nucleic acids with promoter activity and the expression units according to the invention make it possible with the aid of the above-described inventive methods to regulate the metabolic pathways to specific biosynthetic products in the above-described inventive genetically modified microorganisms.
  • metabolic pathways which lead to a specific biosynthetic product by causing or increasing the transcription rate or expression rate of genes of this biosynthetic pathway in which the increased protein amount to increased total activity of these proteins of the desired biosynthetic pathway and thus to an increased metabolic flux to the gewün - leads biosynthetic product.
  • the genetically modified microorganisms according to the invention are, for example, able to produce biosynthetic products from glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose or from glycerol and ethanol.
  • the invention therefore relates to a process for the production of biosynthetic products by culturing genetically modified microorganisms according to the invention.
  • the transcription rate or expression rate of different genes must be increased or reduced.
  • At least one altered, that is to say increased or reduced, transcription rate or expression rate of a gene can be attributed to a nucleic acid according to the invention having promoter activity or the expression unit according to the invention.
  • additional modified i. additionally increased or additionally reduced transcription rates or expression rates of further genes in the genetically modified microorganism can, but need not go back to the nucleic acids according to the invention with promoter activity or the expression units according to the invention.
  • the invention therefore furthermore relates to a process for the preparation of biosynthetic products by culturing genetically modified microorganisms according to the invention.
  • Preferred biosynthetic products are fine chemicals.
  • fine chemical is well known in the art and includes compounds produced by an organism and used in various industries, such as, but not limited to, the pharmaceutical, agricultural, cosmetics, food and feed industries. These compounds include organic acids such as tartaric acid, itaconic acid and diaminopimelic acid, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides (as described for example in Kuinaka, A. (1996) Nucleotides and related Compounds, pp.
  • amino acids comprise the basic structural units of all proteins and are therefore essential for normal cell function.
  • amino acid is known in the art.
  • the proteinogenic amino acids of which there are 20 species, serve as structural units for proteins in which they are linked via peptide bonds, whereas the non-proteinogenic amino acids (of which hundreds are known) usually do not occur in proteins (see Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97 VCH: Weinheim (1985)).
  • the amino acids may be in the D or L configuration, although L-amino acids are usually the only type found in naturally occurring proteins. Biosynthesis and degradation pathways of each of the 20 proteinogenic amino acids are well characterized in both prokaryotic and eukaryotic cells (see, for example, Stryer, L.
  • the "essential" amino acids histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan and valine
  • the "essential" amino acids referred to as having to be taken up with the nutrition due to the complexity of their biosynthesis, are synthesized by simple synthetic routes converted into the remaining 11 "nonessential" amino acids (alanine, arginine, asparagine, aspartate, cysteine, glutamate, glutamine, glycine, proline, serine and tyrosine).
  • Higher animals have the ability to synthesize some of these amino acids, but the essential amino acids must be taken up with the diet for normal protein synthesis to take place.
  • Lysine is an important amino acid not only for human nutrition, but also for monogastric animals such as poultry and pigs.
  • Glutamate is most commonly used as a flavor additive (monosodium glutamate, MSG) as well as widely used in the food industry, as are aspartate, phenylalanine, glycine and cysteine.
  • Glycine, L-methionine and tryptophan are all used in the pharmaceutical industry.
  • Glutamine, valine, leucine, isoleucine, histidine, arginine, proline, serine and alanine are used in the pharmaceutical and cosmetics industries. Threonine, tryptophan and D- / L-methionine are widely used feed additives (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, pp. 466-502 in Rehm et al., (Ed.) Biotechnology Vol. 6, chapters 14a, VCH: Weinheim).
  • amino acids are also useful as precursors for the synthesis of synthetic amino acids and proteins such as N-acetylcysteine, S-carboxymethyl-L-cysteine, (S) -5-hydroxytryptophan and others in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97, VCH, Weinheim, 1985.
  • Cysteine and glycine are each produced from serine, the former by condensation of homocysteine with serine, and the latter by transfer of the side chain ⁇ -carbon atom to tetrahydrofolate, in a serine transhydroxymethylase catalyzed reaction.
  • Phenylalanine and tyrosine are synthesized from the precursors of the glycolysis and pentose phosphate pathway, erythrose 4-phosphate and phosphoenolpyruvate in a 9-step biosynthetic pathway that differs only in the last two steps after the synthesis of prephenate. Tryptophan is also produced from these two starting molecules, but its synthesis takes place in an 11-step pathway.
  • Tyrosine can also be prepared from phenylalanine in a reaction catalyzed by phenylalanine hydroxylase.
  • Alanine, valine and leucine are each biosynthesis products from pyruvate, the end product of glycolysis.
  • Aspartate is formed from oxalacetate, an intermediate of the citrate cycle.
  • Asparagine, methionine, threonine and lysine are each produced by conversion of aspartate. Isoleucine is going out Formed threonine.
  • histidine is formed from 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate, an activated sugar.
  • Amino acids whose amount exceeds the protein biosynthetic needs of the cell can not be stored, and are instead degraded to provide intermediates for the cell's major metabolic pathways (for review, see Stryer, L., Biochemistry, 3rd Ed. Chapter 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle", S 495-516 (1988)).
  • the cell is capable of converting unwanted amino acids into useful metabolic intermediates, amino acid production is costly in terms of energy, precursor molecules, and the enzymes necessary for their synthesis.
  • amino acid biosynthesis is regulated by feedback inhibition, wherein the presence of a certain amino acid slows down or completely stops its own production (for a review of the feedback mechanism in amino acid biosynthetic pathways, see Stryer , L, Biochemistry, 3rd Ed., Chapter 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", pp. 575-600 (1988)).
  • the emission of a particular amino acid is therefore limited by the amount of this amino acid in the cell.
  • Vitamins, cofactors and nutraceuticals comprise another group of molecules. Higher animals have lost the ability to synthesize them and thus need to ingest them, although they are readily synthesized by other organisms, such as bacteria. These molecules are either biologically active molecules per se or precursors of biologically active substances which serve as electron carriers or intermediates in a number of metabolic pathways. In addition to their nutritional value, these compounds also have significant industrial value as dyes, antioxidants and catalysts or other processing aids. (For an overview of the structure, activity and industrial applications of these compounds, see, for example, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996).
  • vitamin is known in the art and includes nutrients that are needed by an organism for normal function, but can not be synthesized by that organism itself.
  • the group of vitamins may include cofactors and nutraceutical compounds.
  • cofactor includes non-proteinaceous compounds that are necessary for the occurrence of normal enzyme activity. These compounds may be organic or inorganic; the cofactor molecules according to the invention are preferably organic.
  • nutraceutical includes food additives that are beneficial to the health of plants and animals, especially humans. Examples of such Leucules are vitamins, antioxidants and also certain lipids (eg polyunsaturated fatty acids).
  • Thiamine (vitamin B 1 ) is formed by chemical coupling of pyrimidine and thiazole units.
  • Riboflavin (vitamin B 2 ) is synthesized from guanosine 5'-triphosphate (GTP) and ribose 5'-phosphate.
  • riboflavin is used to synthesize flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD).
  • the family of compounds collectively referred to as "vitamin B6" eg, pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal-5'-phosphate and the commercially used pyridoxine hydrochloride
  • vitamin B6 eg, pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal-5'-phosphate and the commercially used pyridoxine hydrochloride
  • Panthothenate (pantothenic acid, R - (+) - N- (2,4-dihydroxy-3,3-dimethyl-1-oxobutyl) - ⁇ -alanine) can be prepared either by chemical synthesis or by fermentation.
  • the last steps in pantothenate biosynthesis consist of the ATP-driven condensation of ⁇ -alanine and pantoic acid.
  • the enzymes responsible for the biosynthesis steps for the conversion into pantoic acid, into ⁇ -alanine and for the condensation in pantothenic acid are known.
  • the metabolically active form of pantothenate is coenzyme A, whose biosynthesis proceeds through 5 enzymatic steps.
  • Pantothenate pyridoxal- ⁇ '-phosphate, cysteine and ATP are the precursors of coenzyme A. These enzymes catalyze not only the formation of pantothenate, but also the production of (R) -pantoic acid, (R) -pantolactone, (R ) Panthenol (provitamin B 5 ), pantethein (and its derivatives) and coenzyme A.
  • the biosynthesis of biotin from the precursor molecule pimeloyl-CoA in microorganisms has been extensively studied, and several of the genes involved have been identified. It has been found that many of the corresponding proteins are involved in Fe cluster synthesis and belong to the class of nifS proteins.
  • the lipoic acid is derived from octanoic acid and serves as a coenzyme in energy metabolism, where it becomes part of the pyruvate dehydrogenase complex and the ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase complex.
  • the folates are a group of substances which are all derived from folic acid, which in turn is derived from L-glutamic acid, p-aminobenzoic acid and 6-methylpterin.
  • Corrinoids such as the cobalamins and especially vitamin B 12
  • the porphyrins belong to a group of chemicals that are characterized by a tetrapyrrole ring system.
  • the biosynthesis of vitamin B 12 is sufficiently complex that it has not yet been fully characterized, however, a large part of the participating enzymes and substrates is now known.
  • Nicotinic acid (nicotinate) and nicotinamide are pyridine derivatives, also referred to as "niacin”.
  • Niacin is the precursor of the important coenzymes NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) and NADP (nicotinamide adrenine dinucleotide phosphate) and their reduced forms.
  • purine and pyrimidine metabolism and their corresponding proteins are important targets for the treatment of tumors and viral infections.
  • purine or pyrimidine includes nitrogen-containing bases which are part of the nucleic acids, coenzymes and nucleotides.
  • nucleotide includes the basic structural units of the nucleic acid molecules which comprise a nitrogen-containing base, a pentose sugar (in the case of RNA, the sugar is ribose, in the case of DNA the sugar is D-deoxyribose) and phosphoric acid.
  • nucleoside includes molecules which serve as precursors of nucleotides, but unlike the nucleotides have no phosphoric acid moiety.
  • nucleotides which do not form nucleic acid molecules but serve as energy stores (ie AMP) or as coenzymes (ie FAD and NAD).
  • AMP energy stores
  • FAD and NAD coenzymes
  • Several publications have described the use of these chemicals for these medical indications, whereby the purine and / or pyrimidine metabolism is influenced (for example Christopherson, Rl and Lyons, SD (1990) "Patent inhibitors of de novo pyrimidines and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents ", Med. Res. Reviews 10: 505-548).
  • the purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides also have other possibilities of use: as intermediates in the biosynthesis of various fine chemicals (eg thiamine, S-adenosylmethionine, folates or riboflavin), as energy carrier for the cell (for example ATP or GTP) and chemicals themselves are commonly used as flavor enhancers (eg, IMP or GMP) or for many medical applications (see, for example, Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Vol. Weinheim, pages 561-612).
  • Enzymes involved in purine, pyrimidine, nucleoside or nucleotide metabolism are also increasingly serving as targets against which chemicals are used plant protection, including fungicides, herbicides and insecticides.
  • the purine nucleotides are synthesized via a series of steps via the lnosine 5'-phosphate (IMP) intermediate from ribose-5-phosphate, resulting in the production of guanosine 5'-monophosphate (GMP) or adenosine 5'-monophosphate (AMP ), from which the triphosphate forms used as nucleotides can be easily prepared. These compounds are also used as energy stores, so that their degradation provides energy for many different biochemical processes in the cell.
  • the Pyrimidinbiosynthe- se via the formation of uridine 5'-monophosphate (UMP) from ribose-5-phosphate. In turn, UMP is converted to cytidine 5'-triphosphate (CTP).
  • the deoxy forms of all nucleotides are prepared in a one-step reduction reaction from the diphosphate ribose form of the nucleotide to the diphosphate deoxyribose form of the nucleotide. After phosphorylation, these molecules can participate in DNA synthesis. IV. Trehalose metabolites and uses
  • Trehalose consists of two molecules of glucose linked together by ⁇ , ⁇ -1, 1 bonding. It is commonly used in the food industry as a sweetener, as an additive for dried or frozen foods, and in beverages. However, it is also used in the pharmaceutical, cosmetics and biotechnology industries (see, for example, Nishimoto et al., (1998) US Patent No. 5,759,610; Singer, MA and Lindquist, S. Trends Biotech 16 (1998) 460-467; Paiva, CLA and Panek, AD Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; and Shiosaka, MJ Japan 172
  • Trehalose is produced by enzymes from many microorganisms and naturally released into the surrounding medium from which it can be recovered by methods known in the art.
  • biosynthetic products are selected from the group of organic acids, proteins, nucleotides and nucleosides, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, lipids and fatty acids, diols, carbohydrates, aromati cal compounds, vitamins and cofactors, enzymes and proteins.
  • Preferred organic acids are tartaric acid, itaconic acid and diaminopimelic acid
  • nucleosides and nucleotides are described, for example, in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds, pp. 561-612, Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., Ed. VCH: Weinheim and the citations contained therein.
  • Preferred biosynthetic products are also lipids, saturated and unsaturated fatty acids, such as arachidonic acid, diols such as propanediol and butanediol, carbohydrates such as hyaluronic acid and trehalose, aromatic compounds such as aromatic amines, vanillin and indigo, vitamins and cofactors, such as for example, described in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim and the citations contained therein; and Ong, AS, Niki, E. and Packer, L.
  • saturated and unsaturated fatty acids such as arachidonic acid, diols such as propanediol and butanediol
  • carbohydrates such as hyaluronic acid and trehalose
  • aromatic compounds such as aromatic amines, vanillin and indigo
  • vitamins and cofactors such as for example, described in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,
  • biosynthetic products are amino acids, more preferably essential amino acids, in particular L-glycine, L-alanine, L-leucine, L-methionine, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-lysine, L-glutamine, L-glutamic acid , L-serine, L-proline, L-valine, L-isoleucine, L-cysteine, L-tyrosine, L-histidine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid and L-threonine, L-homoserine, in particular L-lysine, L-methionine and L-threonine.
  • essential amino acids in particular L-glycine, L-alanine, L-leucine, L-methionine, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-lysine, L-glutamine, L-glutamic acid , L-serine,
  • both the L and the D form of the amino acid preferably the L-form, that is, for example, L-lysine, L-methionine and L-threonine stood.
  • the invention relates in particular to a process for the preparation of lysine by cultivating genetically modified microorganisms with an increased or caused expression rate of at least one gene in comparison to the wild type, wherein
  • the expression of genes in the microorganism is regulated by expression units according to the invention or by expression units according to the invention with increased specific expression activity according to embodiment (ch), whereby the genes are heterologous with respect to the expression units,
  • genes are selected from the group of nucleic acids encoding an aspartate kinase, nucleic acids encoding an aspartate semialdehyde dehydrogenase, nucleic acids encoding a diaminopimelate dehydrogenase, nucleic acids encoding a diaminopimelate decarboxylase, nucleic acids encoding a dihydrodipicolin synthetase, encoding nucleic acids a dihydridipicolinate reductase, nucleic acids encoding a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, nucleic acids encoding a 3-phosphoglycerate kinase, nucleic acids encoding a pyruvate carboxylase, nucleic acids encoding a triosephosphate isomerase, nucleic acids encoding a transcriptional regulator LuxR, Nucleic acids encoding a transcriptional regulator LysR
  • dh1 brings one or more expression units according to the invention, optionally with increased specific expression activity, into the genome of the microorganism such that the expression of one or more of these endogenous genes under the control of the introduced expression units according to the invention, if appropriate with increased specific expression activity, done or
  • dh2 introduces one or more of these genes into the genome of the microorganism, so that the expression of one or more of the introduced genes takes place under the control of the endogenous expression units according to the invention, optionally with increased specific expression activity, or
  • nucleic acid constructs containing an expression unit according to the invention, optionally with increased specific expression activity, and functionally linked one or more nucleic acids to be expressed, into which microorganisms are introduced.
  • a further preferred embodiment of the process for the preparation of lysine described above is characterized in that the genetically modified microorganisms in addition to the wild type additionally an increased activity, at least one of the activities selected from the group aspartate kinase activity, aspartate semialdehyde dehydrogenase Activity, diaminoperilate dehydrogenase activity, diaminopimelate decarboxylase activity, dihydrodipicolinate synthetase activity, dihydridipicolinate reductase activity, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity, 3-phosphoglycerate kinase activity, pyruvate carboxylase Activity, triosephosphate isomerase activity, transcriptional regulator LuxR activity, transcriptional regulator activity LysR1, transcriptional regulator activity LysR2, malate quinone oxo-reductase activity, glucose-6-phosphate de-dehydrogenase activity, 6-phosphogluconate Dehydrognea
  • a further particularly preferred embodiment of the process for the preparation of lysine described above is characterized in that the genetically modified microorganisms in addition to the wild type additionally a reduced activity, at least one of the activities selected from the group threonine dehydratase activity, homoserine O-acetyltransferase activity, O-acetyl homoserine sulfhydrylase activity, phosphoenolpyruvate carboxykinase activity, pyruvate oxidase activity, homoserine kinase activity, homoserine dehydrogenase activity, threonine exporter activity, threonine efflux protein Activity, asparaginase activity, aspartate decarboxylase activity and threonine synthase activity.
  • the genetically modified microorganisms in addition to the wild type additionally a reduced activity, at least one of the activities selected from the group threonine dehydratase activity, homoserine O-acet
  • nucleic acid according to the invention having promoter activity and / or an expression unit according to the invention.
  • the invention further relates to a process for the production of methionine by cultivating genetically modified microorganisms having an increased or caused expression rate of at least one gene in comparison to the wild type, wherein
  • genes are selected from the group of nucleic acids encoding an aspartate kinase, nucleic acids encoding an aspartate semialdehyde dehydrogenase, nucleic acids encoding a homoserine dehydrogenase, nucleic acids encoding a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, nucleic acids encoding a 3-phosphoglycerate kinase, encoding nucleic acids Pyruvate carboxylase, nucleic acids encoding a triosephosphate isomerase, nucleic acids encoding a homologous O-acetyltransferase, nucleic acids encoding a cystahionin gamma synthase, nucleic acids encoding a cystahionin beta-lyase, nucleic acids encoding a serine hydroxymethyltransferase, encoding nucleic acids an O
  • dh1 brings one or more expression units according to the invention, optionally with increased specific expression activity, into the genome of the microorganism such that the expression of one or more of these endogenous genes under the control of the introduced expression units according to the invention, if appropriate with increased specific expression activity, done or
  • dh2 introduces one or more of these genes into the genome of the microorganism, so that the expression of one or more of the introduced genes takes place under the control of the endogenous expression units according to the invention, optionally with increased specific expression activity, or
  • nucleic acid constructs containing an expression unit according to the invention, optionally with increased specific expression activity, and functionally linked one or more nucleic acids to be expressed, into which microorganisms are introduced.
  • a further preferred embodiment of the method for producing methionine described above is characterized in that the genetically modified microorganisms in comparison to the wild type additionally an increased activity, at least one of the activities selected from the group aspartate kinase activity, aspartate semialdehyde dehydrogenase Activity, homoserine dehydrogenase activity, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity, 3-phosphoglycerate kinase activity, pyruvate carboxylase activity, triosephosphate isomerase activity, homoserin O-acetyltransferase activity, cystahionine gamma synthase activity, cystahionine beta-lyase activity Serine hydroxymethyltransferase activity, O-acetyl homoserine sulfhydrylase activity, methylene tetrahydrofolate reductase activity, phosphoserine aminotransferase activity, phosphoserine
  • a further particularly preferred embodiment of the method for producing methionine described above is characterized in that the genetically modified microorganisms in addition to the wild type in addition a reduced activity, at least one of the activities selected from the homoserine kinase activity, threonine Dehydratase activity, threonine synthase activity, meso-
  • Diaminopimelate D-dehydrogenase activity phosphoenolpyruvate carboxykinase activity, pyruvate oxidase activity, dihydrodipicolinate synthase activity, dihydrodipicolinate reductase activity, and diaminopicolinate decarboxylase activity.
  • nucleic acid according to the invention having promoter activity and / or an expression unit according to the invention.
  • the invention further relates to a process for the production of threonine by cultivating genetically modified microorganisms having an increased or caused expression rate of at least one gene in comparison to the wild type, wherein
  • genes are selected from the group of nucleic acids encoding an aspartate kinase, nucleic acids encoding an aspartate semialdehyde dehydrogenase, nucleic acids encoding a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, nucleic acids encoding a 3-phosphoglycerate kinase, nucleic acids encoding a pyruvate carboxylase , Nucleic acids encoding a triosephosphate isomerase, nucleic acids encoding a homoserine kinase, nucleic acids encoding a threonine synthase, nucleic acids encoding a threonine exporter carrier, nucleic acids encoding a glucose-6-phosphate dehydrogenase, nucleic acids encoding a transaldolase, nucleic acids encoding a transketoiase, Nucleic acids encoding
  • dh1 brings one or more expression units according to the invention, optionally with increased specific expression activity, into the genome of the microorganism such that the expression of one or more of these endogenous genes under the control of the introduced expression units according to the invention, if appropriate with increased specific expression activity, done or
  • dh2 introduces one or more of these genes into the genome of the microorganism, so that the expression of one or more of the introduced genes takes place under the control of the endogenous expression units according to the invention, optionally with increased specific expression activity, or
  • nucleic acid constructs containing an expression unit according to the invention, optionally with increased specific expression activity, and functionally linked to one or more to be expressed nucleic acids, in the microorganisms.
  • a further preferred embodiment of the method for the production of threonine described above is characterized in that the genetically modified microorganisms in addition to the wild type additionally an increased activity, at least one of the activities selected from the group aspartate kinase activity, aspartate semialdehyde dehydrogenase activity , Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity, 3-phosphoglycerate kinase activity, pyruvate carboxylase activity, triosephosphate isomerase activity, threonine synthase activity, threonine export carrier activity, transaldolase activity, transketolase Activity, glucose-6-phosphate dehydrogenase activity, malate-quinone oxidoreductase activity, homoserine kinase activity, biotin ligase activity, phosphoenolpyruvate carboxylase activity, threonine efflux protein activity, protein OpcA- Activity, 1-phosphofructokina
  • a further particularly preferred embodiment of the above-described method for producing threonine is characterized in that the genetically modified microorganisms in addition to the wild type in addition a reduced activity, at least one of the activities selected from the group threonine dehydratase activity, homoserine O-acetyltransferase activity, serine hydroxymethyltransferase activity, O-acetylhomoserine sulfhydrylase activity, meso-diaminopimelate D-dehydrogenase activity, phosphoenolpyruvate carboxykinase
  • nucleic acid according to the invention having promoter activity and / or an expression unit according to the invention.
  • activity of a protein becomes the enzyme activity of enzymes of the corresponding protein, in other proteins, such as structure or transport proteins understood the physiological activity of the proteins.
  • the enzymes are usually able to convert a substrate into a product or to catalyze this conversion step.
  • the "activity" of an enzyme is understood to mean the amount of substrate or amount of product converted by the enzyme in a specific time.
  • the amount of substrate or the amount of product formed is thus increased by the enzyme compared to the wild type in a certain time.
  • this increase in the "activity" in all the activities described above and below is at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, in particular at least 600% of the "wild-type activity".
  • the amount of substrate or the amount of product formed is thus reduced by the enzyme compared to the wild type in a certain time.
  • a reduced activity is preferably understood to mean the partial or substantially complete interruption or blocking of the functionality of this enzyme in a microorganism based on different cell biological mechanisms.
  • a reduction in activity includes a reduction in the amount of an enzyme up to a substantially complete absence of the enzyme (i.e., lack of detectability of the corresponding activity or lack of immunological detectability of the enzyme).
  • the activity in the microorganism is reduced by at least 5%, more preferably by at least 20%, more preferably by at least 50%, more preferably by 100%, compared to the wild type.
  • “reduction” also means the complete absence of the corresponding activity.
  • a pyruvate carboxylase is understood as meaning a protein which has the enzymatic activity of converting pyruvate into oxaloacetate.
  • a pyruvate carboxylase activity is understood to mean the amount of pyruvate or added amount of oxaloacetate reacted in a specific time by the protein pyruvate carboxylase.
  • the amount of pyruvate or the amount of oxaloacetate formed is thus increased by the protein pyruvate carboxylase in a certain time compared with the wild type.
  • this increase in pyruvate carboxylase activity is at least 5%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50%, even more preferably at least 100%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 500%, especially at least 600% of the pyruvate carboxylase. Activity of the wild type.
  • a phosphoenolpyruvate carboxykinase activity as the enzyme activity of a phosphoenolpyruvate carboxykinase.
  • a phosphoenolpyruvate carboxykinase is meant a protein having the enzymatic activity of converting oxaloacetate to phosphoenolpyruvate.
  • phosphoenolpyruvate-carboxykinase activity is understood as meaning the amount of oxaloacetate reacted or the amount of phosphoenolpyruvate formed in a certain time by the protein phosphoenolpyruvate.
  • the amount of oxaloacetate or the amount of phosphoenolpyruvate formed is thus reduced in a certain time by the protein phosphoenolpyruvate carboxykinase in comparison to the wild type.
  • a reduction in phosphoenolpyruvate carboxykinase activity includes a quantitative reduction of a phosphoenolpyruvate carboxykinase to an essentially complete absence of phosphoenolpyruvate carboxykinase (ie, lack of detectability of phosphoenolpyruvate carboxykinase activity or lack of immunological detectability of phosphoenolpyruvate carboxykinase ).
  • the phosphoenolpyruvate carboxykinase activity is more preferred than the wild type by at least 5%, more preferably by at least 20% reduced by at least 50%, more preferably by 100%.
  • “reduction” also means the complete absence of the phosphoenolpyruvate carboxykinase activity.
  • the additional increase of activities can take place by different ways, for example by switching off inhibitory regulation mechanisms on expression and protein level or by increasing the gene expression of nucleic acids coding the proteins described above against the wild type.
  • the increase in the gene expression of the nucleic acids encoding the above-described proteins relative to the wild-type can also be effected by various means, for example by inducing the gene by activators or as described above by increasing the promoter activity or increasing the expression activity or by introducing one or more gene copies into the microorganism.
  • the person skilled in the art can take further different measures individually or in combination.
  • the copy number of the respective genes can be increased, or the promoter and regulatory region or ribosome binding site located upstream of the structural gene can be mutated.
  • inducible promoters it is additionally possible to increase the expression in the course of fermentative production. Measures to extend the lifetime of the mRNA also improve the expression.
  • enzyme activity is also enhanced.
  • the genes or gene constructs may either be present in different copy number plasmids or be integrated and amplified in the chromosome. Alternatively, an overexpression of the relevant Genes can be achieved by changing the composition of the media and culture.
  • biosynthetic products in particular L-lysine, L-methionine and L-threonine
  • L-lysine in particular L-lysine
  • L-methionine in particular L-methionine
  • L-threonine in particular L-threonine
  • the gene expression of a nucleic acid encoding one of the proteins described above is increased by incorporating at least one nucleic acid encoding a corresponding protein into the microorganism.
  • Introduction of the nucleic acid can be chromosomally or extrachromosomally, ie by increasing the copy number on the chromosome and / or a copy of the gene on a replicating plasmid in the host microorganism.
  • the introduction of the nucleic acid preferably takes place chromosomally, in particular by the SacB method described above.
  • any gene encoding one of the proteins described above can be used for this purpose.
  • nucleic acid sequences from eukaryotic sources containing introns in the event that the host microorganism is unable or unable to express the corresponding proteins, prefers already processed nucleic acid sequences, such as to use the corresponding cDNAs.
  • the reduction of the above-described activities in microorganisms is carried out by at least one of the following processes:
  • Knockout mutants can preferably be obtained by targeted insertion into the desired target gene by homologous recombination or introduction of sequence-specific
  • Each of these methods can cause a reduction in the amount of protein, mRNA amount and / or activity of a protein.
  • a combined application is also conceivable.
  • Further methods are known to the person skilled in the art and can hinder or prevent the processing of the protein, the transport of the protein Protein or its mRNA, inhibition of ribosome attachment, inhibition of RNA splicing, induction of an RNA degrading enzyme and / or inhibition of transiation elongation or termination.
  • the step of cultivating the genetically modified microorganisms is preferably followed by isolating biosynthetic products from the microorganisms or from the fermentation broth. These steps may take place simultaneously and / or preferably after the culturing step.
  • the genetically modified microorganisms according to the invention can be used continuously or discontinuously in the batch process (batch culturing) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) for the production of biosynthetic products, in particular L-lysine, L-methionine and L-threonine, to be cultured.
  • biosynthetic products in particular L-lysine, L-methionine and L-threonine, to be cultured.
  • a summary of known cultivation methods is in the textbook by Chmiel (Bioreatechnik 1. Introduction to the bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).
  • the culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981).
  • These media which can be used according to the invention usually comprise one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and / or trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • Very good sources of carbon are, for example, glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose. It is also possible to add sugar to the media via complex compounds, such as molasses, or other sugar refining by-products. It may also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible sources of carbon are oils and fats such.
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds.
  • Exemplary nitrogen sources include ammonia gas or ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate, nitrates, urea, amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soybean meal, soy protein, yeast extract, meat extract and others.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • Inorganic sizing compounds which may be included in the media include the chloride, phosphorus or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron
  • sulfur source for the production of fine chemicals in particular of methionine
  • inorganic compounds such as, for example, sulfates, sulfites, dithionites, tetrathionates, thiosulfates, sulfides, but also organic sulfur compounds, such as mercaptans and thiols.
  • Phosphoric acid potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid.
  • the fermentation media used according to the invention usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthogenate and pyridoxine.
  • growth factors and salts are often derived from complex media components, such as yeast extract, molasses, corn steep liquor, and the like.
  • suitable precursors can be added to the culture medium.
  • the exact composition of the media compounds will depend heavily on the particular experiment and will be decided on a case by case basis. Information about the media optimization is obtainable from the textbook "Applied Microbiol Physiology, A Practical Approach" (ed. PM Rhodes, PF Stanbury, IRL Press (1997) pp.
  • Growth media can also be obtained from commercial suppliers, such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like. All media components are sterilized either by heat (20 min at 1, 5 bar and 121 0 C) or by sterile filtration. The components can either be sterilized together or, if necessary, sterilized separately. All media components may be present at the beginning of the culture or added randomly or in batches as desired.
  • the temperature of the culture is normally between 15 0 C and 45 ° C, preferably at 25 ° C to 40 0 C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0.
  • the pH for cultivation can be controlled during cultivation by addition of basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid.
  • foam anti-foaming agents such as. As fatty acid polyglycol, are used.
  • suitable selective substances such as e.g. As antibiotics, are added.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such. B. ambient air, registered in the culture.
  • the temperature of the culture is usually 2O 0 C to 45 ° C.
  • the culture is continued until a maximum of the desired product has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.
  • the fermentation broths thus obtained usually have a dry matter content of 7.5 to 25% by weight.
  • the fermentation is driven sugar-limited at least at the end, but in particular over at least 30% of the fermentation time. This means that during this time the concentration of utilizable sugar in the fermentation medium is maintained at 0 to 3 g / l, or lowered.
  • biosynthetic products from the fermentation broth and / or the microorganisms takes place in a manner known per se in accordance with the physicochemical properties of the biosynthetic desired product and the biosynthetic by-products.
  • the fermentation broth can then be further processed, for example.
  • the biomass may be wholly or partly by Separationsmetho ⁇ the, such. As centrifugation, filtration, decantation or a combination of these methods from the fermentation broth or be completely left in it.
  • the fermentation broth with known methods, such as. B. with the aid of a rotary evaporator, thin film evaporator, falling film evaporator, by reverse osmosis, or by nanofiltration, thickened or aufkon ⁇ centered.
  • This concentrated fermentation broth can then be worked up by freeze drying, spray drying, spray granulation or by other methods.
  • the product-containing broth is subjected to chromatography with a suitable resin, the desired product or impurities being wholly or partially retained on the chromatography resin. If necessary, these chromatographic steps can be repeated using the same or different chromatography resins.
  • the person skilled in the art is familiar with the choice of suitable chromatography resins and their most effective use.
  • the purified product may be concentrated by filtration or ultrafiltration and stored at a temperature at which the stability of the product is maximized.
  • biosynthetic products can be obtained in different forms, for example in the form of their salts or esters.
  • the identity and purity of the isolated compound (s) can be determined by techniques of the prior art. These include high performance liquid chromatography (HPLC), spectroscopic methods, staining procedures, thin layer chromatography, NIRS, enzyme assay or microbiological assays. These analytical methods are summarized in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; and Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp.
  • the shuttle vector pMT ⁇ (Follettie et al., (1993) J. Bacteriol. 175: 4096-4103) was digested with the restriction enzymes Xhol and BamHI, then treated with the Klenow fragments and religated. The resulting plasmid was designated pMT1 -del.
  • the vector pMT1-del was digested with the restriction enzymes Bgl II and XbaI.
  • the 2.5 kb fragment contains the pSR1 ori from Corynebacterium glutamicum and was introduced into the 2 kb Plasperson pTnMod-Okm also cut with BglII and XbaI (Dennis and Zylstra (1998) Appl. Environ.
  • the vector thus obtained was designated pSK1.
  • the fragment of the plasposon pTnMod-Okm carries the pMB1 replication origin for Escherichia coli and a kanamycin resistance marker (Tn903).
  • the cat gene without promoter was used with the aid of oligonucleotide primer A (SEQ ID NO: 4) and B (SEQ ID NO: 5) with the vector pKK232-8 (SEQ ID NO: 3) as a template with the help the polymerase chain reaction (PCR) by standard methods, as described in Innis et al. (1990) PCR Protocol, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, ampiified.
  • This PCR product was ligated into the vector pSK1 after vector and insert were digested with the restriction enzymes BglII and KpnI.
  • the plasmid was named pSKICat ( Figure 1).
  • Oligonucleotide primer A SEQ. ID. NO. 4 ⁇ '-GGAAGATCTTTCAAGAATTCCCAGGCA-S 'oligonucleotide primer B SEQ. ID. NO. 5 ⁇ '-GGGGTACCTACCGTATCTGTGGGGGG-S '
  • the plasmid pKK223-3 SEQ. ID. NO. 6 contains the tac promoter (P t30 ) - This promoter was isolated by digestion with the restriction enzyme BamHI and the fragment cloned into the BamHI linearized vector pSKICat SEQ ID.
  • the plasmid was named pSK1P tac ( Figure 2).
  • the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum AS019E12 was isolated from cells of the late exponential phase by the method of Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828 and then partially digested with the restriction enzyme Sau3AI. The resulting fragments with a size of 0.4-1.0 kb were ligated into the linearized with the restriction enzyme BamHI vector pSKICat. The ligation mixture was prepared by electroporation by the method of Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175: 4096-4103 trans ⁇ formed in Corynebacterium glutamicum AS019E12. The cells were spread on plates containing 5 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • Plasmids from single colonies growing on these plates were isolated and analyzed.
  • One such plasmid was pSKICat 2- P io, the promoter P 2 .i 0 SEQ. ID. NO. 1 contains. This promoter is located in the upstream region of the gene encoding a sugar phosphate epimerase.
  • the insert has a size of 208 bp.
  • Corynebacterium glutamicum cells containing only the plasmid pSK1 Cat are not capable of MB (Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175: 4096-4103) and MCGC rats (of the Osten et al. (1989) Biotechnol. Lett 11: 11-16) with a chloramphenicol concentration of 5 // g / ml at 30 ° C. The cat gene is not expressed.
  • Corynebacterium glutamicum cells containing the plasmid pSK1CatP tac ( Figure 2) grow on MB and MCGC plates with a chloramphenicol concentration of 40 / yg / ml.
  • Cells of Escherichia coli containing the plasmid pSK1CatP ta o grow on LB plates (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning - A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory, 2 ⁇ d ed., CoId Spring Harbor , NY) with a chloramphenicol concentration of 400 // g / ml. Growth at a Chloramphenicol ⁇ concentration of 600 // g / ml was not observed.
  • Cells containing the plasmid pSK1CatP 2- io are capable of chloramphenicol at a 600 micrograms on LB plates to grow.
  • the CAT activities of Corynebacterium glutamicum AS019E12 were determined to determine a relative potency of promoter P 2-10 (SEQ ID NO: 1). For this raw extracts were by the method of Jetten and Sinsky (1993) FEMS Microbiol. Lett. 111: 183-188.
  • the activity of chloramphenicol acetyltransferase (CAT) was determined by the method of Shaw et al (1993) Methods Enzymol. 43: 737-755.
  • the reaction contained 100 mM Tris * HCl pH 7.5, 1 mM DTNB, 0.1 mM acetyl CoA, 0.25 mM chloramphenicol and a suitable amount of enzyme. The changes in the optical density at a wavelength of 412 nm were measured. Protein concentration was determined by the Bradford method (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254 analyzed. The results are shown in the following table:
  • Figure 1 shows a plasmid map of pSKICat (A) and the nucleotide sequence of the BamHI cloning site (B).
  • the underlined sequences in B reflect the regions used to make sequencing oligonucleotides. The start codon and the BamHI cloning site are indicated.
  • Figure 2 shows part of the nucleotide sequence of pSK1P tac .
  • the promoter P 130 is shown in italics. Furthermore, the -35 and -10 regions, the RBS and the start codon of the cat gene are marked.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen zur Regulation der Transkription und Expression von Genen, die neuen Promotoren und Expressionseinheiten selbst, Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate von Genen, Expressionskasetten, enthaltend die Expressionseinheiten, genetisch veränderte Mikroorganismen mit veränderter oder verursachter Trankriptionsrate und/oder Expressionsrate sowie Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produkten durch Kultivierung der genetisch veränderten Mikroorganismen.

Description

P2-io-Expressionseinheiten
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen zur Regulation der Transkription und Expression von Genen, die neuen Promotoren und Expressionseinheiten selbst, Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate von Genen, Expressionskasetten, enthal¬ tend die Expressionseinheiten, genetisch veränderte Mikroorganismen mit veränderter oder verursachter Trankriptionsrate und/oder Expressionsrate sowie Verfahren zur
Herstellung von biosynthetischen Produkten durch Kultivierung der genetisch veränder¬ ten Mikroorganismen.
Verschiedene biosynthetische Produkte, wie beispielsweise Feinchemikalien, wie unter anderem Aminosäuren, Vitamine aber auch Proteine werden über natürliche Stoff¬ wechselprozesse in Zellen hergestellt und werden in vielen Industriezweigen verwen¬ det, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik-, Feed-, Food- und pharmazeutischen Industrie. Diese Substanzen, die zusammen als Feinchemika¬ lien/Proteine bezeichnet werden, umfassen unter anderem organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Nukleotide und Nukleoside, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlenhydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine und Cofaktoren, sowie Proteine und Enzyme. Ihre Produktion erfolgt am zweckmäßigsten im Großmaßstab mittels Anzucht von Bakterien, die entwickelt wurden, um große Mengen der jeweils gewünschten Substanz zu produzieren und sezernieren. Für die- sen Zweck besonders geeignete Organismen sind coryneforme Bakterien, gram¬ positive nicht-pathogene Bakterien.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zum Produkt , beispielsweise durch lonenaustauschchroma- tographie aber auch Sprühtrocknung, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von Feinchemikalien/Proteine produzierender Stämme von Cory- nebacterium eingesetzt, indem man einzelne Gene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion von Feinchemikalien/Proteine untersucht. Andere Wege, um ein Verfahren für die Herstellung Feinchemikalien, Aminosäuren oder Proteine zu entwickeln, oder die Produktivität eines bereits existierenden Verfah¬ rens für die Herstellung Feinchemikalien, Aminosäuren oder Proteine zu erhöhen bzw. zu verbessern, sind die Expression eines oder mehrerer Gene zu erhöhen bzw. zu verändern und oder die Translation einer mRNA durch geeignete Polynukleotidse- quenzen zu beeinflussen. Beeinflussung kann in diesem Zusammenhang die Erhö¬ hung, Verringerung, oder auch andere Parameter der Expression von Genen wie zeitli¬ che Expressionsmuster umfassen.
Dem Fachmann sind unterschiedliche Bestandteile von bakteriellen Regulationsse¬ quenzen bekannt. Man unterscheidet die Bindungstellen von Regulatoren, auch Opera¬ toren genannt, die Bindungstellen von RNA-Polymerase-Holoenzymen, auch -35 und -10 Regionen genannt, und die Bindungsstelle von Ribosomaler 16S-RNA, auch Ribo- somale Bindungsstelle oder auch Shine-Dalgarno-Sequenz genannt.
Als Sequenz einer Ribosomalen Bindungsstelle, auch Shine-Dalgarno-Sequenz ge¬ nannt, im Sinne dieser Erfindung werden Polynukleotidsequenzen verstanden, die sich bis zu 20 Basen stromauf des Initiationskodon der Translation befinden.
In der Literatur (E. coli und S. typhimurium, Neidhardt F.C. 1995 ASM Press) wird be¬ schrieben, dass sowohl die Zusammensetzung der Polynukletidsequenz der Shine- Delgarno-Sequenz, die Sequenzabfolge der Basen, aber auch der Abstand einer in der Shine-Delgarno-Sequenz enthaltenen Polynukletidsequenz zum einen wesentlichen Einfluss auf die Initiationstionsrate der Translation hat.
Nukleinsäuresequenzen mit Promotoraktivität können die Bildung von mRNA auf un¬ terschiedliche Weise beeinflussen. Promotoren, deren Aktivität unabhängig von der physiologischen Wachstumsphase des Organismus sind, nennt man konstitutiv. Wie¬ derum andere Promotoren reagieren auf externe chemische, wie physikalische Stimuli wie Sauerstoff, Metabolite, Hitze, pH, etc.. Wiederum andere zeigen in unterschiedli¬ chen Wachstumsphasen eine starke Abhängigkeit ihrer Aktivität. Beispielsweise sind in der Literatur Promotoren beschrieben, die während der exponentiellen Wachstums¬ phase von Mikroorganismen eine besonders ausgeprägte Aktivität zeigen, oder aber auch genau in der stationären Phase des mikrobiellen Wachstums. Beide Charakteris- tika von Promotoren können für eine Produktion von Feinchemikalien und Proteine je nach Stoffwechselweg einen günstigen Einfluss auf die Produktivität haben.
Zum Beispiel kann man Promotoren die während des Wachstums die Expresssion ei¬ nes Gens ausschalten, diese aber nach einem optimalen Wachstum anschalten dazu nutzen, ein Gen zu regulieren, das die Produktion eines Metaboliten kontrolliert. Der veränderte Stamm weist dann die gleichen Wachstumsparameter wie der Ausgangs¬ stamm auf, produziert aber mehr Produkt pro Zelle. Diese Art der Modifizierung kann sowohl den Titer (g Produkt/Liter) als auch die C-Ausbeute (g Produkt/g-C-Quelle) er¬ höhen.
In Corynebacterium Spezies konnten bereits solche Nukleotidsequenzen isoliert wer¬ den, die für eine Erhöhung bzw. eine Abschwächung der Genexpression genutzt wer¬ den können. Diese regulierten Promotoren können die Rate, mit der ein Gen transkri¬ biert wird, abhängig von den internen und/oder externen Bedingungen der Zelle erhö- hen oder erniedrigen. Zum Teil kann die Anwesenheit eines bestimmten Faktors, be¬ kannt als Inducer, die Rate der Transkrition vom Promotor stimulieren. Inducer können direkt oder aber indirekt die Transkription vom Promotor beeinflussen. Eine andere Klasse von Faktoren, bekannt als Suppressoren ist in der Lage, die Transkription vom Promotor zu reduzieren oder aber zu inhibieren. Wie auch die Inducer, können auch die Suppressoren direkt oder indirekt wirken. Es sind jedoch auch Promotoren bekannt, die über die Temperatur reguliert werden. So kann der Level der Transkription solcher Promotoren zum Beispiel durch eine Erhöhung der Wachstumstemperatur über die normale Wachstumstemperatur der Zelle erhöht oder aber abgeschwächt werden.
Eine geringe Anzahl von Promotoren aus C. glutamicum wurden bis zum heutigen Tag beschrieben. Der Promotor des Malatsynthase-Gens aus C. glutamicum wurde im DE 4440118 beschrieben. Dieser Promotor wurde einem für ein Protein kodierendes Struk¬ turgen vorgeschaltet. Nach Transformation eines solchen Konstrukts in ein corynefor- mes Bakterium wird die Expression des dem Promotor nachgeschalteten Strukturgen reguliert. Die Expression des Strukturgens wird induziert sobald dem Medium ein ensprechender Induktor zugesetzt wird.
Reinscheid et al., Microbiology 145:503 (1999) haben eine trankriptionelle Fusion zwi¬ schen dem pta-ack Promotor aus C. glutamicum und einem Reportergen (ChIo- ramphenicol Acetyltransferase) beschrieben. Zellen von C. glutamicum, die eine solche transkriptioneile Fusion enthalten, wiesen eine erhöhte Expression des Reportergenes bei Wachstum auf Acetat haltigem Medium auf. Im Vergleich dazu zeigten transfor¬ mierte Zellen, die auf Glucose wuchsen, keine erhöhte Expression dieses Reporter¬ gens.
In Pa'tek et al., Microbiology 142:1297 (1996) wurden einige DNA Sequenzen aus C. glutamicum beschrieben, die die Expression eines Reportergens in C. glutamicum Zel¬ len verstärken können, beschrieben. Diese Sequenzen wurden miteinander verglichen, um Consensus-Sequenzen für C. glutamicum Promotoren zu definieren. Weitere DNA-Sequenzen aus C. glutamicum, die zur Regulation der Genexpression genutzt werden können, sind im Patent WO 02/40679 beschrieben worden. Diese iso¬ lierten Polynukleotide stellen Expressionseinheiten aus Corynebakterium glutamicum dar, die entweder zur Erhöhung oder aber zur Verringerung einer Genexpression ge- nutzt werden können. Weiterhin sind in diesem Patent rekombinante Plasmide be¬ schrieben, auf denen die Expressionseinheiten aus Corynebakterium glutamicum mit heterologen Genen assoziiert sind. Die hier beschrieben Methode , Fusion von einem Promotor aus Corynebakterium glutamicum mit einem heterlogen Gen, kann unter an¬ derem zur Regulation der Gene der Aminosäurebiosynthese eingesetzt werden.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde weitere Promotoren und/oder Expressions¬ einheiten mit vorteilhaften Eigenschaften zur Verfügung zustellen.
Demgemäß wurde gefunden, dass man Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, enthal- tend
A) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder
B) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleo¬ tiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nuklein- säureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist oder
C) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 un¬ ter stringenten Bedingungen hybridisiert oder
D) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter A), B) oder C)
zur Transkription von Genen verwenden kann.
Unter „Transkription" wird erfindungsgemäß der Prozess verstanden, durch den aus¬ gehend von einer DNA-Matrize ein komplementäres RNA-Molekül hergestellt wird. An diesem Prozess sind Proteine wie die RNA-Polymerase sogenannte Sigma-Faktoren und transkriptionelle Regulatorproteine beteiligt. Die synthetisierte RNA dient dann als Matrize im Prozess der Translation, der dann zum biosynthetisch aktiven Protein führt.
Die Bildungsrate, mit der ein biosynthetsich aktives Protein hergestellt wird, ist ein Pro- dukt aus der Rate der Transkription und der Translation. Beide Raten können erfin¬ dungsgemäß beeinflusst werden und damit die Rate der Bildung von Produkten in ei¬ nem Mikroorganismus beeinflussen. Unter einem „Promotor" oder einer „Nukleinsäure mit Promotoraktivität" wird erfin¬ dungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden, die in funktioneller Verknüpfung mit einer zu trankripierenden Nukleinsäure, die Transkription dieser Nukleinsäure reguliert.
Unter einer „funktionellen Verknüpfung" versteht man in diesem Zusammenhang bei¬ spielsweise die sequentielle Anordnung einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und einer zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel Nukleinsäureseuqenzen, die die Transkription von Nukleinsäuren gewährleisten, sowie zum Beipsiel einen Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Transkription der der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüp¬ fung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Bei¬ spiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positio¬ nen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevor- zugt sind Anordnungen, in denen die zu trankribierende Nukleinsäuresequenz hin¬ ter (d.h. am 3'-Ende) der erfindungsgemäßen Promotorsequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nuklein¬ säuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Unter „Promotoraktivität" wird erfindungsgemäß die in einer bestimmten Zeit durch den Promotor gebildete Menge RNA, also die Trankriptionsrate verstanden.
Unter „spezifischer Promotoraktivität" wird erfindungsgemäß die in einer bestimmten Zeit durch den Promotor gebildete Menge RNA pro Promotor verstanden.
Unter dem Begriff "Wildtyp" wird erfindungsgemäß der entsprechende Ausgangsmikro¬ organismus verstanden.
Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff "Mikroorganismus" der Ausgangsmik¬ roorganismus (Wildtyp) oder ein erfindungsgemäßer, genetisch veränderter Mikroorga¬ nismus oder beides verstanden werden.
Vorzugsweise und insbesondere in Fällen, in denen der Mikroorganismus oder der Wildtyp nicht eindeutig zugeordnet werden kann, wird unter "Wildtyp" für die Verände¬ rung oder Verursachung der Promotoraktivität oder Trankriptionsrate, für die Verände¬ rung oder Verursachung der Expressionsaktivität oder Expressionsrate und für die Er¬ höhung des Gehalts an biosynthetischen Produkten jeweils ein Referenzorganismus verstanden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dieser Referenzorganismus Corynebakteri- um glutamicum ATCC 13032.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Ausgangsmikroorganismen verwendet die bereits in der Lage sind, die gewünschte Feinchemikalie herzustellen. Besonders bevorzugt sind dabei unter den besonders bevorzugten Mikroorganismen der Bakterien der Gattung Corynebacterien und den besonders bevorzugten Feinchemikalien L- Lysin, L-Methionin und L-Threonin, diejenigen Ausgangsmikroorganismen die bereits in der Lage sind, L-Lysin, L-Methionin und/oder L-Threonin herzustellen. Dies sind be¬ sonderes bevorzugt Corynebakterien bei denen beispielsweise das Gen kodierend für eine Aspartokinase (ask-Gen) dereguliert ist oder die feed-back-lnhibierung aufgeho¬ ben oder reduziert ist. Beispielsweise weisen solche Bakterien im ask-Gen eine Muta¬ tion auf, die zu einer Reduzierung oder Aufhebung der feed-back-lnhibierung führen, wie beispielsweise. die Mutation T3111.
Bei einer „verursachten Promotoraktivität" oder Transkriptionsrate im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp die Bildung einer RNA verursacht, die im Wildtyp so nicht vorhanden war.
Bei einer veränderten Promotoraktivität oder Transkriptionsrate im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit die gebildete Menge der RNA verändert.
Unter „verändert" wird in diesem Zusammenhang bevorzugt erhöht oder erniedrigt ver¬ standen.
Dies kann beispielsweise durch Erhöhung oder Reduzierung der spezifischen Promo¬ toraktivität des endogenen erfindungsgemäßen Promotors, beispielsweise durch Muta- tion des Promotors oder durch Stimmulierung oder Hemmung des Promotors erfolgen.
Weiterhin kann die erhöhte Promotoraktivität oder Transkriptionsrate beispielsweise durch Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch erfindungs¬ gemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch Nukleinsäuren mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität erreicht werden, wobei die Gene in Bezug auf die Nuk¬ leinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.
Vorzusgweise wird die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch Nukleinsäu- ren mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität dadurch erreicht, dass man eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebe¬ nenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, in das Genom des Mikroorga¬ nismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer endogenen Gene un- ter der Kontrolle der eingebrachten erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit Promotorak¬ tivität gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der en- dogenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Nuklein¬ säure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotorakti- vität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität enthalten
A) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder B) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleo¬ tiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nuklein- säureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist oder
C) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 un- ter stringenten Bedingungen hybridisiert oder
D) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter A), B) oder C)
Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 stellt die Promotorsequenz der Zuckerphos- phat-Epimerase (P2-io) aus Corynebakterium glutamicum dar. SEQ. ID.NO. 1 entspricht der Promotorsequenz des Wildtyps.
Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren mit Promotoraktivität enthaltend eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nukleinsäureebene mit der Se- quenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist.
Weitere natürliche erfindungsgemäße Beispiele für erfindungsgemäße Promotoren lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Se¬ quenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Nukleinsäuresequenzen aus Daten- banken mit der vorstehend beschriebenen Sequenzen SEQ ID NO: 1 leicht auffinden. Künstliche erfindungsgemäße Promotor-Sequenzen lassen sich ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 1 durch künstliche Variation und Mutation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden leicht auffinden.
Unter dem Begriff "Substitution" ist in der Beschreibung der Austausch einer oder meh¬ rerer Nukleotide durch ein oder mehrere Nukleotide zu verstehen. „Deletion" ist das Ersetzen eines Nukleotides durch eine direkte Bindung. Insertionen sind Einfügungen von Nukleotiden in die Nukleinsäuresequenz, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Nukleotide ersetzt wird.
Unter Identität zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleotide über die jeweils gesamte Nukleinsäurelänge verstanden, insbesondere die Identität die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Multiple alignment parameter: Gap opening penalty 10
Gap extension penalty 10
Gap Separation penalty ränge 8
Gap Separation penalty off
% identity for alignment delay 40 Residue specific gaps off
Hydrophilic residue gap off
Transition weighing 0
Pairwise alignment parameter: FAST algorithmon K-tupIesize 1 Gap penalty 3 Window size 5 Number of best diagonals 5
Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 90 % mit der Se¬ quenz SEQ ID NO: 1 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz ver¬ standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, ins¬ besondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 90 % aufweist. Besonders bevorzugte Promotoren weisen mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 eine Identität von 91%, bevorzugter 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, beson¬ ders bevorzugt 99% auf.
Weitere natürliche Beispiele für Promotoren lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 1 aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher Nukleinsäuren mit Promotoraktivi¬ tät, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. No. 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst mindestens 10, bevorzugter mehr als12,15,30,50 oder besonders bevorzugt mehr als 150 Nukleotide.
Die Hybridisierung erfolgt erfinungsgemäß unter stringenten Bedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E.F., Mani- atis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31 -9.57 oder in Current Protocols in Molecuiar Biolo- gy, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 beschrieben:
Unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen werden insbesondere verstanden: Die über Nacht Inkubation bei 420C in einer Lösung bestehend aus 50 % Formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM Tri-Natrium Citrat), 50 mM Natrium Phosphat (ph7,6), 5x Denhardt Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescheerte Lachsspermien-DNA, gefolgt von einem Waschen der Filter mit 0,1 x SSC bei 650C.
Unter einem „funktionell äquivalenten Fragment" werden für Nukleinsäuresequenzen mit Promotoraktivität, Fragmente verstanden die im wesentlichen die gleiche oder eine höhere spezifische Promotoraktivität aufweisen wie die Ausgangssequenz.
Unter „im wesentlichen gleich" wird eine spezifische Promotoraktivität verstanden die mindestens 50%, vorzugsweise 60%, bevorzugter 70%, bevorzugter 80%, bevorzugter 90%, besonders bevorzugt 95% der spezifischen Promotoraktivität der Ausgangsse¬ quenz aufweist.
Unter „Fragmente" werden Teilsequenzen der durch Ausführungsform A), B) oder C) beschriebenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität verstanden. Vorzusgweise weisen diese Fragmente mehr als 10, bevorzugter aber mehr als 12,15, 30, 50 oder besonders bevorzugte mehr als 150 zusammenhängende Nukleotide der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 auf.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 als Promotor, d.h. zur Transkriptiion von Genen.
Die SEQ. ID. NO. 1 ist ohne Funktionszuordnung im Genbank-Eintrag AP005283 be¬ schrieben worden. Daher betrifft die Erfindung ferner die neuen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit Promotoraktivität.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure mit Promotoraktivität, enthaltend
A) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder B) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von
Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf
Nukleinsäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist oder
C) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder
D) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter A), B) oder C),
mit der Maßgabe, dass die Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 ausgenom¬ men ist.
Alle vorstehend erwähnten Nukleinsäuren mit Promotoraktivität sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oli- gonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamidit- methode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die An¬ lagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonie- rungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Expressionseinheit, enthaltend eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und zusätzlich funktionell verknüpft eine Nukleinsäuresequenz, die die Translation von Ribonukleinsäuren ge- währleistet, zur Expression von Genen. Unter einer Expressioneinheit wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure mit Expressi¬ onsaktivität verstanden, also eine Nukleinsäure verstanden, die in funktioneller Ver¬ knüpfung mit einer zu exprimierenden Nukleinsäure oder Gens, die Expression, also die Transkription und die Translation dieser Nukleinsäure oder dieses Gens reguliert.
Unter einer „funktionellen Verknüpfung" versteht man in diesem Zusammenhang bei¬ spielsweise die sequentielle Anordnung einer der erfindungsgemäßen Expressionsein¬ heit und einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer re¬ gulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulati- ven Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter (d.h. am 3'-Ende) der erfindungsgemäßen Expressionseinheitssequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwi¬ schen der Expressionseinheitssequenz und der transgen zu exprimierende Nuklein¬ säuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Unter „Expressionsaktivität" wird erfindungsgemäß die in einer bestimmten Zeit durch die Expressionseinheit gebildete Menge Protein, also die Expressionsrate verstanden.
Unter „spezifischer Expressionsaktivität" wird erfindungsgemäß die in einer bestimmten Zeit durch die Expressionseinheit gebildete Menge Protein pro Expressionseinheit ver¬ standen.
Bei einer „verursachten Expressionsaktivität" oder Expressionsrate im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp die Bildung eines Proteins verursacht, das im Wildtyp so nicht vorhanden war.
Bei einer „veränderten Expressionsaktivität" oder Expressionsrate im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimm- ten Zeit die gebildete Menge des Proteins verändert.
Unter „verändert" wird in diesem Zusammenhang bevorzugt erhöht oder erniedrigt ver¬ standen. Dies kann beispielsweise durch Erhöhung oder Reduzierung der spezifischen Aktivität der endogenen Expressionseinheit, beispielsweise durch Mutation der Expressionsein¬ heit oder durch Stimmulierung oder Hemmung der Expressionseinheit erfolgen.
Weiterhin kann die erhöhte Expressionsaktivität oder Expressionsrate beispielsweise durch Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsge¬ mäße Expressionseinheiten oder durch Expressionseinheiten mit Erhöhter spezifischer Expressionsaktivität erreicht werden, wobei die Gene im Bezug auf die Expressions¬ einheiten heterolog sind.
Vorzugsweise wird die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten oder durch erfindungsgemäße Expres¬ sionseinheiten mit Erhöhter spezifischer Expressionsaktivitätdadurch erreicht, dass man
eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit ver¬ änderter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus ein¬ bringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Ex¬ pression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endoge¬ nen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit veränderter spezi- fischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expres¬ sionseinheit, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mik- roorganismus einbringt.
Die erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, enthalten eine erfindungsgemäße, vor¬ stehend bechriebene Nukleinsäure mit Promotoraktivität und zusätzlich funktionell ver¬ knüpft eine Nukleinsäuresequenz, die die Translation von Ribonukleinsäuren gewähr- leistet.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Expressionsein¬ heit:
E) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder F) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nukleinsäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist oder
G) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder
H) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter E), F) oder G).
Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 stellt die Nukleinsäuresequenz der Expres¬ sionseinheit der Zuckerphosphat-Epimerase (P2-I0) aus Corynebakterium glutamicum dar. SEQ. ID.NO. 2 entspricht der Sequenz der Expressionseinheit des Wildtyps.
Die Erfindung betrifft weiterhin Expressionseinheiten, enthaltend eine von dieser Se¬ quenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Se¬ quenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nukleinsäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist.
Weitere natürliche erfindungsgemäße Beispiele für erfindungsgemäße Expressions¬ einheiten lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomi¬ sche Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der vorstehend beschriebenen Sequenzen SEQ ID NO: 2 leicht auf¬ finden.
Künstliche erfindungsgemäße Sequenzen der Expressionseinheiten lassen sich aus¬ gehend von der Sequenz SEQ ID NO: 2 durch künstliche Variation und Mutation, bei- spielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden leicht auffin¬ den.
Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 90 % mit der Se¬ quenz SEQ ID NO: 2 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz ver- standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, ins¬ besondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 90 % aufweist.
Besonders bevorzugte Expressionseinheiten weisen mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 eine Identität von 91 %, bevorzugter 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, besonders bevorzugt 99% auf.
Weitere natürliche Beispiele für Expressionseinheiten lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 2 aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher Expressionseinheiten, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. No. 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst mindestens 10, bevorzugter mehr als12, 15,30,50 oder besonders bevorzugt mehr als 150 Nukleo¬ tide.
Unter "hybridisieren" versteht man die Fähigkeit eines PoIy- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen vorzugsweise zu 90-100%, kom¬ plementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southem-Blot- Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze.
Die Hybridisierung erfolgt erfinungsgemäß unter stringenten Bedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E.F., Mani- atis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biolo- gy, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 beschrieben:
Unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen werden insbesondere verstanden: Die über Nacht Inkubation bei 420C in einer Lösung bestehend aus 50 % Formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM Tri-Natrium Citrat), 50 mM Natrium Phosphat (ph7,6), 5x Denhardt Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescheerte Lachsspermien-DNA, gefolgt von einem Waschen der Filter mit 0,1x SSC bei 65°C.
Die erfindungsgemäß Nukleotidsequenzen ermöglichen ferner die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologer Se¬ quenzen in anderen Zelltypen und Mikroorganismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringen¬ ten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfin¬ dungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon.
Unter einem „funktionell äquivalenten Fragment" werden für Expressionseinheiten, Fragmente verstanden die im wesentlichen die gleiche oder eine höhere spezifische Expressionsaktivität aufweisen wie die Ausgangssequenz.
Unter „im wesentlichen gleich" wird eine spezifische Expressionsaktivität verstanden die mindestens 50%, vorzugsweise 60%, bevorzugter 70%, bevorzugter 80%, bevor¬ zugter 90%, besonders bevorzugt 95% der spezifischen Expressionsaktivität der Aus¬ gangssequenz aufweist.
Unter „Fragmente" werden Teilsequenzen der durch Ausführungsform E), F) oder G) beschriebenen Expressionseinheiten verstanden. Vorzusgweise weisen diese Frag¬ mente mehr als 10, bevorzugter aber mehr als 12,15, 30, 50 oder besonders bevor- zugts mehr als 150 zusammenhängende Nukleotide der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 auf.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 als Expressionseinheit, d.h. zur Expression von Genen.
Die Erfindung betrifft femer die neuen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine Expressionseinheit, enthaltend eine erfin¬ dungsgemäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität zusätzlich funktionell verknüpft eine Nukleinsäuresequenz, die die Translation von Ribonukleinsäuren gewährleistet.
Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung eine Expressionseinheit, enthaltend
E) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder
F) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nukleinsäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist oder G) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder H) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter E), F) oder G), mit der Maßgabe, dass die Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 ausgenom¬ men ist.
Die erfindungsgemäßen Expressionseinheiten umfassen ein oder mehrere der folgen- den genetischen Elemente: eine Minus 10 ("-10") Sequenz; eine Minus 35 ("-35") Se¬ quenz; einen Transkriptionsstart, eine Enhancer Region; und eine Operator Region.
Vorzugsweise sind diese genetischen Elemente spezifisch für die Spezies Corynebak- terien, speziell für Corynbacterium glutamicum.
Alle vorstehend erwähnten Expressionseinheiten sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäure- bausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet,
Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthe¬ tischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Für die Erfindungen in diesem Patent wurden Methoden und Techniken genutzt, die dem Fachmann, der in mikrobiologischen und rekombinanten DNA-Techniken geübt ist, bekannt sind. Methoden und Techniken für das Wachstum von Bakterienzellen, das Einschleusen von isolierten DNA-Molekülen in die Wirtszelle, und die Isolierung, KIo- nierung und Sequenzierung von isolierten Nukleinsäuremolekülen usw. sind Beispiele für solche Techniken und Methoden. Diese Methoden sind in vielen Standardlitera¬ turstellen beschrieben: Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986); J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York (1972); J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics,
CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York (1992); M. Singer and P. Berg, Genes & Genomes, University Science Books, MiII Valley, Carlifornia (1991); J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York (1989); P.B. Kaufmann et al., Handbook of Molcular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995); Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick and J.E. Thompson, eds., CRC Press, Boca Raton, Florida (1993); and P.F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989). Alle Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung liegen bevorzugt in Form eines isolierten Nukleinsäuremoleküls vor. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von an¬ deren Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäu¬ re zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Mate- rial oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequen- zen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.
Die erfindungsgemäßen Promotoren und/oder Expressionseinheiten lassen sich bei¬ spielsweise besonders vorteilhaft in verbesserten Verfahren zur fermentativen Herstel¬ lung von biosynthetischen Produkten wie nachstehend beschrieben verwenden.
Die erfindungsgemäßen Promotoren und/oder Expressionseinheiten weisen insbeson¬ dere den Vorteil auf, dass sie in Mikroorganismen durch Stress induziert werden. Durch geeignete Steuerung des Fermentationsprozesses lässt sich diese Stress¬ induktion gezieit für eine Erhöhung der Trankritptions/Expressionsrate gewünschter Gene steuern. Insbesondere bei der Produktion von L-Lysin wird diese Stressphase sehr früh erreicht, so das hier sehr früh eine erhöhte Transkriptions/Expressionsrate von gewünschten Genen erreicht werden kann.
Die erfindungesgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität können zur Verände- rung, also zur Erhöhung oder Reduzierung, oder zur Verursachung der Transkriptions¬ rate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Expressionseinheiten können zur Veränderung, also zur Er¬ höhung oder Reduzierung, oder zur Verursachung der Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp verwendet werden.
Ferner können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und die erfindungesgemäßen Expressionseinheiten zur Regulation und Verstärkung der Bil¬ dung von verschiedenen biosynthetischen Produkten, wie beispielsweise Feinchemika- lien, Proteinen, inbesondere Aminosäuren, in Mikroorganismen, insbsondere in Cory- nebacterium species dienen.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der Transkriptionsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp durch a) Veränderung der spezifischen Promotoraktivität im Mikroorganismus von endo¬ genen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, die die Transkription von endogenen Genen regulieren, im Vergleich zum Wildtyp oder
b) Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch erfindungs¬ gemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch Nukleinsäuren mit ver¬ änderter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a), wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.
Gemäß Ausführungsform a) kann die Veränderung oder Verursachung der Transkripti¬ onsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp dadurch erfolgen, dass im Mikroorganismus die spezifische Promotoraktivität verändert, also erhöht oder erniedrigt wird. Dies kann beispielsweise durch gezielte Mutation der erfindungsgemä¬ ßen Nukleinsäuresequenz mit Promotoraktivität, also durch gezielte Substitution, DeIe- tion oder Insertion von Nukleotiden erfolgen. Eine erhöhte bzw. erniedrigte Promotor¬ aktivität kann dadurch erreicht werden.dass Nukleotide in der Bindungsstelle des RNA- Polymerase-Holoenzym-Bindungsstellen (dem Fachmann auch als -10-Region und - 35 Region bekannt) ausgetauscht werden. Weiterhin dadurch dass der Abstand der beschriebenen RNA-Polymerase-Holoenzym-Bindungsstellen zueinander durch DeIe- tionen von Nukleotiden oder Insertionen von Nukleotiden verkleinert oder vergrößert werden. Weiterhin dadurch dass Bindungsstellen (dem Fachmann auch als - Operatoren bekannt) für Regulatiosproteine (dem Fachmann bekannt als Repressoren und Aktiviatoren) in räumliche Nähe an die Bindungsstellen des RNA-Polymerase- Holoenzyms gebracht werden, dass diese Regulatoren nach Bindung an eine Promo- tor-Sequenz die Bindung des und Transkriptionsaktivität des RNA-Polymerase-
Holoenzyms abschwächen oder verstärken, oder auch unter einen neuen regulatori¬ schen Einfluss stellen.
In Bezug auf die „spezifische Promotoraktivität" wird unter Erhöhung oder Reduzierung im Vergleich zum Wildtyp eine Erhöhung oder Reduzierung der spezifischen Aktivität gegenüber der erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit Promotoraktivität des Wildtyps, also beispielsweise gegenüber der SEQ. ID. NO. 1 verstanden.
Gemäß Ausführungsform b) kann die Veränderung oder Verursachung der Transkripti- onsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp dadurch erfolgen, dass man die Transkription von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch Nukleinsäuren mit veränderter spezifi¬ scher Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) reguliert, wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind. Dies wird bevorzugt dadurch erreicht, dass man
b>1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, ge- benenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer en¬ dogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Nukleinsäure mit Promo¬ toraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, er¬ folgt oder
b2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kon¬ trolle der endogenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
b3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribie¬ rende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
Es ist somit möglich, die Transkriptionsrate eines endogenen Gens des Wildtyps zu verändern, also zu erhöhen oder zu erniedrigen indem man
gemäß Ausführungsform b1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Nukleinsäure mit Promotorak¬ tivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
gemäß Ausführungsform b2) ein oder mehrere endogene Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der einge¬ brachten, endogenen Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Pro¬ motoraktivität, erfolgt oder
Gemäß Ausführungsform b3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit verän¬ derter spezifischer Promotoraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribierende endogene Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt. Ferner ist es somit möglich, die Transkriptionsrate eines exogenen Gens im Vergleich zum Wildtyps zu verursachen, indem man
gemäß Ausführungsform b2) ein oder mehrere exogene Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der einge¬ brachten, exogenen Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Pro¬ motoraktivität, erfolgt oder
Gemäß Ausführungsform b3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit verän¬ derter spezifischer Promotoraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribierende exogene Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
Die Insertion von Genen gemäß Ausführungsform b2) kann dabei so erfolgen, dass das Gen in kodierende Bereiche oder nicht-kodierende Bereiche integriert wird. Vor¬ zugsweise erfolgt die Insertion in nicht-kodierende Bereiche.
Die Insertion von Nukleinsäurekonstrukten gemäß Ausführungsform b3) kann dabei chromosomal oder extrachromosomal erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Insertion der Nukleinsäurekonstrukte chromosomal. Eine „chromosomale" Integration ist die Inserti¬ on eines exogenen DNA-Fragmentes in das Chromosom einer Wirtszelle. Dieser Beg¬ riff wird auch für die homologe Rekombination zwischen einem exogenen DNA- Fragment und der entsprechenden Region auf dem Chromosom der Wirtszelle genutzt.
In Ausführungsform b) werden bevorzugt auch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit veränderter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) eingesetzt. Die¬ se können in Ausführungsform b), wie in Ausführungsform a) beschrieben im Mikroor¬ ganismus vorliegen und hergestellt werden oder in isolierter Form in den Mikroorga- nismus eingebracht werden.
Unter „endogen" werden genetische Informationen, wie beispielsweise Gene, verstan¬ den, die bereits im Wildtypgenom enthalten sind.
Unter „exogen" werden genetische Informationen, wie beispielsweise Gene, verstan¬ den, die im Wildtypgenom nicht enthalten sind.
Unter dem Begriff „Gene" in Bezug auf Regulation der Transkription durch die erfin¬ dungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität werden vorzugsweise Nukleinsäu- ren verstanden, die einen zu transkripierenden Bereich, also beispielsweise einen Be- reich der die Translation reguliert, einen kodierenden Bereich, sowie gegebenenfalls weitere Regulationselemente, wie beispielsweise einen Terminator, enthalten.
Unter dem Begriff „Gene" in Bezug auf die nachstehend beschriebene Regulation der Expression durch die erfindungsgemäßen Expressionseinheiten werden vorzugsweise Nukleinsäuren verstanden, die einen kodierenden Bereich, sowie gegebenenfalls wei¬ tere Regulationselemente, wie beispielsweise einen Terminator, enthalten.
Unter einem „kodierenden Bereich" wird eine Nukleinsäuresequenz verstanden, die ein Protein kodiert.
Unter „heterolog" in Bezug auf Nukleinsären mit Promotoraktivität und Gene wird ver¬ standen, dass die verwendeten Gene im Wildtyp nicht unter Regulation der erfin¬ dungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität transkribiert werden, sondern das eine neue, im Wildtyp nicht vorkommende funktionelle Verknüpfung entsteht und die funktionelle Kombination aus erfindungsgemäßer Nukleinsäure mit Promotoraktivität und spezifisches Gen im Wildtyp nicht vorkommt.
Unter „heterolog" in Bezug auf Expressionseinheiten und Gene wird verstanden, dass die verwendeten Gene im Wildtyp nicht unter Regulation der erfindungsgemäßen Ex¬ pressionseinheiten exprimiert werden, sondern das eine neue, im Wildtyp nicht vor¬ kommende funktionelle Verknüpfung entsteht und die funktionelle Kombination aus erfindungsgemäßer Expressionseinheit und spezifisches Gen im Wildtyp nicht vor¬ kommt.
Die Erfindung betrifft femer in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Erhöhung oder Verursachung der Transkriptionsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp indem man
ah) die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus von erfindungsgemäßen endogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität , die die Transkription von en¬ dogenen Genen regulieren, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder
bh) die Transkription von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch Nukleinsäuren mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) reguliert, wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.
Vorzugsweise wird die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch erfindungs- gemäße Nukleinsäuren mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausfüh¬ rungsform äh) dadurch erreicht wird, dass man
bh1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, in das Genom des
Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer en¬ dogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
bh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kon¬ trolle der erfindungsgemäßen, endogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
bh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribie¬ rende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
Die Erfindung betrifft ferner in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Reduzierung der Transkriptionsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp, indem man
ar) die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus von endogenen erfin¬ dungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, die die Transkription der endogenen Gene regulieren, im Vergleich zum Wildtyp reduziert oder
br) Nukleinsäuren mit reduzierter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausfüh- rungsform a) in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die
Transkription endogene Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Nuklein¬ säure mit reduzierter Promotoraktivität erfolgt.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der Expressionsrate eines Gens in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp durch
c) Veränderung der spezifischen Expressionsaktivität im Mikroorganismus von er¬ findungsgemäßen, endogenen Expressionseinheiten, die die Expression der endogenen Gene regulieren, im Vergleich zum Wildtyp oder d) Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungs¬ gemäße Expressionseinheiten oder durch erfindungsgemäße Expressionsein¬ heiten mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungs¬ form c), wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind.
Gemäß Ausführungsform c) kann die Veränderung oder Verursachung der Expressi¬ onsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp dadurch erfolgen, dass im Mikroorganismus die spezifische Expressionsaktivität verändert, also erhöht oder erniedrigt wird. Dies kann beispielsweise durch gezielte Mutation der erfindungs- gemäßen Nukleinsäuresequenz mit Promotoraktivität, also durch gezielte Substitution, Deletion oder Insertion von Nukleotiden erfolgen. Beispielsweise führt die Verlänge¬ rung des Abstandes zwischen Shine-Dalgamo-Sequenz und dem translationellen Startcodon in der Regel zu einer Änderung, einer Verkleinerung oder aber auch einer Verstärkung der spezifischen Expressionsaktivität. Eine Veränderung der der spezifi- sehen Expressionsaktivität kann auch dadurch erreicht werden, dass die Sequenz der Shine-Dalgamo-Region (Ribosomale Bindungsstelle) in seinem Abstand zum translati¬ onellen Startcodon durch Deletionen oder Insertionen von Nukleotiden entweder ver¬ kürzt oder verlängert wird. Aber auch dadurch dass die Sequenz der Shine-Dalgamo- Region so verändert wird, dass die Homologie zu komplementären 3' Seite 16S rRNA entweder verstärkt oder aber auch verringert wird.
In Bezug auf die „spezifische Expressionsaktivität" wird unter Erhöhung oder Reduzie¬ rung im Vergleich zum Wildtyp eine Erhöhung oder Reduzierung der spezifischen Akti¬ vität gegenüber der erfindungsgemäßen Expressionseinheit des Wildtyps, also bei- spielsweise gegenüber der SEQ. ID. NO. 2 verstanden.
Gemäß Ausführungsform d) kann die Veränderung oder Verursachung der Expressi¬ onsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp dadurch erfolgen, dass man die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit verän¬ derter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform c) reguliert, wobei die Gene in Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind.
Dies wird bevorzugt dadurch erreicht, dass man
d1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorga¬ nismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheiten erfolgt oder d2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der erfindungsgemäßen, endogenen Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
d3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsak¬ tivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nuklein¬ säuren, in den Mikroorganismus einbringt.
Es ist somit möglich, die Expressionsrate eines endogenen Gens des Wildtyps zu ver¬ ändern, also zu erhöhen oder zu erniedrigen indem man
gemäß Ausführungsform d1 ) eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinhei- ten, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endoge¬ nen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheiten erfolgt oder
gemäß Ausführungsform d2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganis- mus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der erfindungsgemäßen, endogenen Expressionseinheiten, gege¬ benenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
gemäß Ausführungsform d3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit veränderter spezifi¬ scher Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimie¬ rende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
Ferner ist es somit möglich, die Expressionssrate eines exogenen Gens im Vergleich zum Wildtyps zu verursachen, indem man
gemäß Ausführungsform d2) ein oder mehrere exogene Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrach¬ ten Gene unter der Kontrolle der erfindungsgemäßen, endogenen Expressionseinhei- ten, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
gemäß Ausführungsform d3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit veränderter spezifi¬ scher Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimie- rende, exogene Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt. Die Insertion von Genen gemäß Ausführungsform d2) kann dabei so erfolgen, dass das Gen in kodierende Bereiche oder nicht-kodierende Bereiche integriert wird.
Vorzugsweise erfolgt die Insertion in nicht-kodierende Bereiche.
Die Insertion von Nukleinsäurekonstrukten gemäß Ausführungsform d3) kann dabei chromosomal oder extrachromosomal erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Insertion der Nukleinsäurekonstrukte chromosomal.
Die Nukleinsäurekonstrukte werden im folgenden auch als Expressionskasetten be¬ zeichnet.
In Ausführungsform d) werden bevorzugt auch erfindungsgemäße Expressionseinhei¬ ten mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform c) ein- gesetzt. Diese können in Äusf ührungsform d), wie in Ausführungsform d) beschrieben im Mikroorganismus vorliegen und hergestellt werden oder in isolierter Form in den Mikroorganismus eingebracht werden.
Die Erfindung betrifft ferner in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Erhöhung oder Verursachung der Expressionsrate eines Gens in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp indem man
ch) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von erfindungsgemäßen, endogenen Expressionseinheiten, die die Expression der endogenen Gene regulieren, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder
dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expres¬ sionseinheiten oder durch Expressionseinheiten mit erhöhter spezifischer Expressi¬ onsaktivität gemäß Ausführungsform c) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind.
Vorzugsweise wird die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten oder durch Expressionseinheiten mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform c) dadurch erreicht, dass man
dh1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorga¬ nismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheiten, gegebe¬ nenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
dh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kon¬ trolle der erfindungsgemäßen, endogenen Expressionseinheiten, gegebenen¬ falls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsak¬ tivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nuklein¬ säuren, in den Mikroorganismus einbringt.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Reduzierung der Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp, indem man
er) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von endogenen, erfin¬ dungsgemäßen Expressionseinheiten, die die Expression der endogenen Gene regu¬ lieren, im Vergleich zum Wildtyp reduziert oder
dr) Expressionseinheiten mit reduzierter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Aus¬ führungsform er) in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression endogener Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheiten mit redu¬ zierter Expressionsaktivität erfolgt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen erfindungsge¬ mäßen Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen sind die Gene ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von Feinchemi- kalien, wobei die Gene gegebenenfalls weitere Regulationselemente enthalten können.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen erfin¬ dungsgemäßen Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen sind die Gene ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Nukleotiden und Nukleosiden, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nukleinsäu¬ ren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nuk- leinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Diolen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Konhlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von aromatischen Verbindung, Nuk¬ leinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäu¬ ren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzymen, wobei die Gene gege¬ benenfalls weitere Regulationselemente enthalten können.
In einer besondere bevorzugten Ausführungsform sind die Proteine aus dem Biosyn¬ theseweg von Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe Aspartatkinase, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Diaminopimelat-
Dehydrogenase, Diaminopimelat-Decarboxylase, Dihydrodipicolinate-Synthetase, Di- hydrodipicolinate-Reduktase, Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, 3- Phosphoglycerat-Kinase, Pyruvat-Carboxylase, Triosephosphat-Isomerase, Transkrip- tioneller Regulator LuxR, Transkriptioneller Regulator LysR1 , Transkriptioneller Regulator LysR2, Malat-Quinon-Oxidoreduktase, Glucose-6-Phosphat-Deydrogenase, 6-Phosphogluconat-Dehydrognease, Transketolase, Transaldolase, Homoserin-O- Acetyltransferase, Cystahionin-gamma-Synthase, Cystahionin-beta-Lyase, Serin- Hydroxymethyltransferase, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase, Methylen- Tetrahydrofolat-Reduktase, Phosphoserin-Aminotransferase, Phosphoserin- Phosphatase, Serin-Acetyl-Transferase, Homoserin-Dehydrogenase, Homoserin- Kinase, Threonin-Synthase, Threonin-Exporter-Carrier, Threonin-Dehydratase, Pyru- vat-Oxidase, Lysin-Exporter, Biotin-Ligase, Cystein-Synthasel, Cystein-Synthase II, Coenzym B12-abhängige Methionin-Synthase, Coenzym B12-unabhängige Methionin- Synthase-Aktivität, Sulfatadenyltransferase Untereinheit 1 und 2, Phosphoadenosin Phosphosulfat Reduktase, Ferredoxin-sulfit-reductase, Ferredoxin NADP Reduktase, 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase, RXA00655 Regulator, RXN2910-Regulator, Argi- nyl-t-RNA-Synthetase, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Threonin Efflux-Protein, Se- rinhydroxymethyltransferase, Fruktose-1 ,6-bisphosphatase, Protein der Sulfat- Reduktion RXA077, Protein der Sulfat-Reduktion RXA248, Protein der Sulfat- Reduktion RXA247, Protein OpcA, 1-Phosphofruktokinase und 6-Phosphofruktokinase.
Bevorzugte Proteine und Nukleinsäuren kodierend diese Proteine der vorstehend be¬ schriebenen Proteine aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren sind Proteinsequen¬ zen bzw. Nukleinsäuresequenzen mikrobiellen Ursprungs, vorzusgweise aus Bakterien der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, bevorzugt aus coryneformen Bak¬ terien, besonders bevorzugt aus Corynebakterium glutamicum.
Beispiele für besonders bevorzugte Proteinsequenzen und die entsprechenden Nuk¬ leinsäuresequenzen kodierend diese Proteine aus dem Biosyntheseweg von Amino- säuren, deren Bezugsdokument, sowie deren Bezeichnung im Bezugsdokument sind in Tabelle 1 aufgelistet:
Tabelle 1
Ein weiteres Beispiel für eine besonders bevorzugte Proteinsequenz und die entspre¬ chenden Nukleinsäuresequenz kodierend dieses Protein aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren, ist die Sequenz der Fructose-1 ,6-bisphosphatase 2, oder auch fbr2 ge- nannt, (SEQ. ID. NO. 8) und die entsprechenden Nukleinsäuresequenz kodierend eine Fructose-1 ,6-bisphosphatase 2 (SEQ. ID. NO. 7).
Ein weiteres Beispiel für eine besonders bevorzugte Proteinsequenz und die entspre¬ chenden Nukleinsäuresequenz kodierend dieses Protein aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren, ist die Sequenz des Proteins in Sulfat-Reduktion, oder auch RXA077 genannt, (SEQ. ID. NO. 10) und die entsprechenden Nukleinsäuresequenz kodierend ein Protein in Sulfat-Reduktion (SEQ. ID. NO. 9) Weitere besonders bevorzugte Proteinsequenzen aus dem Biosyntheseweg von Ami¬ nosäuren, weisen jeweils die in Tabelle 1 für dieses Protein angegebene Aminosäure¬ sequenz auf, wobei das jeweilige Protein jeweils an mindestens einer der in Tabelle 2/SpaIte2 für diese Aminosäuresequenz angegebenen Aminosäurepositionen eine andere proteinogene Aminosäure aufweist als die jeweilige in Tabelle2/Spalte3 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform, weisen die Proteine an mindestens einer der in Tabelle 2/Spalte 2 für die Aminosäure¬ sequenz angegebenenen Aminosäureposition die in Tabelle2/Spalte4 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure auf. Es handelt sich bei den in Tabelle 2 angegebenen Proteine um mutierte Proteine des Biosyntheseweges von Aminosäuren, die beson¬ ders vorteilhafte Eigenschaften aufweisen und sich deshalb insbesondere zur Expres¬ sion der entsprechenden Nukleinsäuren durch den erfinungsgemäßen Promotor und zur Herstellung von Aminosäuren eignen. Beispielsweise führt die Mutation T3111 zu einem Ausschalten der feedback-lnhibierung von ask.
Die entsprechenden Nukleinsäuren, die ein vorstehend beschriebenes mutiertes Prote¬ in aus Tabelle 2 kodieren, lassen sich durch übliche verfahren herstellen.
Als Ausgangspunkt zur Herstellung der Nukleinsäuresequenzen kodierend ein mutier- tes Protein eignet sich beispielsweise das Genom eines Corynebacterium glυtamicum- Stammes, der von der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 13032 erhältlich ist oder die in Tabelle 1 in Bezug genommenen Nukleinsäuresequen¬ zen. Für die Rückübersetzung der Aminosäuresequenz der mutierten Proteine in die Nukleinsäuresequenzen kodierend diese Proteine ist es vorteilhaft, die codon usage desjenigen Organismus zu verwenden, in den die Nukleinsäuresequenz eingebracht werden soll oder in der die Nukleinsäuresequenz vorliegt. Beispielsweise ist es vortei- haft für Corynebakterium glutamicum die codon usage von Corynebakterium glutami- cum zu verwenden. Die codon usage des jeweiligen Organismus lässt sich in an sich bekannter Weise aus Datenbanken oder Patentanmeldungen ermitteln, die zumindest ein Protein und ein Gen, das dieses Protein kodiert, aus dem gewünschten Organis¬ mus beschreiben.
Die Angaben in Tabelle 2 sind folgendermassen zu verstehen:
In Spalte 1 "Identifikation" wird eine eindeutige Bezeichnung für jede Sequenz in Bezug auf Tabelle 1 aufgeführt.
In Spalte 2 "AS-POS" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die Aminosäureposition der entsprechenden Polypeptidsequenz aus Tabelle 1. Eine "26" in der Spalte "AS-POS" bedeutet demzufolge die Aminosäureposition 26 der entsprechend angegebenen PoIy- peptidsequenz. Die Zählung der Position beginnt N-Terminal bei +1.
In Spalte 3 "AS-Wildtyp" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - darge- stellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 2 angegebenen Position beim ent¬ sprechenden Wildtyp-Stamm der Sequenz aus Tabelle 1.
In Spalte 4 "AS-Mutante" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - darge¬ stellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 2 angegebenen Position beim ent- sprechenden Mutanten-Stamm.
In Spalte 5 "Funktion" wird die physiologische Funktion der entsprechenden Polypep- tidsequenz aufgeführt.
Für ein mutiertes Protein mit einer bestimmten Funktion (Spalte 5) und einer bestimm¬ ten Ausgangsaminosäuresequenz (Tabelle 1 ) werden in den Spalten 2,3 und 4 min¬ destens eine Mutation, bei einigen Sequenzen auch mehrere Mutationen beschrieben. Diese mehreren Mutationen beziehen sich immer auf die jeweils obenstehende, nächstliegendste Ausgangsaminosäuresequenz (Tabelle 1). Unter dem Begriff „min- destens eine der Aminsäurepositionen" einer bestimmten Aminosäuresequenz wird vorzugsweise mindestens eine der für diese Aminosäuresequenz in Spalte 2, 3 und 4 beschriebenen Mutationen verstanden.
Ein-Buchstaben-Code der proteinogenen Aminosäuren:
A Alanin
C Cystein
D Aspartat
E Glutamat FPhenylalanin
G Glycin
H His
I lsoleucin
K Lysin LLeucin
M Methionin
N Asparagin
P Prolin
Q Glutamin R Arginin S Serin TThreonin V Valin W Tryptophan Y Tyrosin
Tabelle 2
In den vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Veränderung o- der Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate von Genen in Mik¬ roorganismen sowie den nachstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Mikroorganismen, den nachstehend beschriebenen genetisch veränderten Mikroorganoismen und den nachstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produkten erfolgt das Einbringen der erfindungsge¬ mäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, der erfindungsgemäßen Expressionsein¬ heiten, der vorstehend beschriebenen Gene und der vorstehend beschriebnen Nuk- leinsäurekonstrukte oder Expressionskasetten in den Mikroorganismus, insbeondere in corynefome Bakterien, vorzugsweise durch die SacB-Methode.
Die SacB-Methode ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Schäfer A, Tauch A, Jäger W, Kalinowski J1 Thierbach G, Pühler A.; Small mobilizable multi-purpose clo- ning vectors derived f rom the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene. 1994 JuI 22;145(1):69-73 und Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein Bl.; Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101 replicon; Mol Microbiol. 1991 Jun;5(6): 1447-57 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen erfindungsge¬ mäßen Verfahren erfolgt die Veränderung oder Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen durch Einbringen von erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität bzw. erfindungsgemäßen Expres¬ sionseinheiten in den Mikroorganismus.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen erfin- dungsgemäßen Verfahren erfolgt die Veränderung oder Verursachung der Transkripti¬ onsrate und/oder Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen durch Einbringen der vorstehend beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte oder Expressionskasetten in den Mikroorganismus.
Die Erfindung betrifft daher ferner eine Expressionskassette, umfassend
mindestens eine erfindungsgemäße Expressionseinheit
mindestens eine weitere, zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, also ein zu exprimie- rendes Gen und
gegebenenfalls weitere genetische Kontrollelemente, wie beispielsweise einen Termi¬ nator,
wobei mindestens eine Expressionseinheit und eine weitere, zu exprimierende, Nuk¬ leinsäuresequenz funktionell miteinander verknüpft sind und die weitere, zu exprimie¬ rende, Nukleinsäuresequenz in Bezug auf die Expressionseinheit heterolog ist.
Vorzugsweise ist die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mindestens eine Nuklein- säuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von Feinchemikalien.
Besonders bevorzugt ist die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von protei¬ nogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Nukleotiden und Nukleosiden, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nukleinsäuren kodie¬ rend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Diolen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Konhlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von aromatischen Verbindung, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäuren kodie¬ rend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodie¬ rend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzymen. Bevorzugte Proteine aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren sind vorstehend und deren Beispiele in Tabelle 1 und 2 beschrieben.
In den erfindungsgemäßen Expressionskassetten ist die physikalische Lage der Ex- pressionseinheit relativ zum zu exprimierenden Gen so gewählt, daß die Expressio¬ neinheit die Transkription und vorzugsweise auch die Translation des zu exprimieren¬ den Gens reguliert und damit die Bildung eines oder mehrerer Proteine ermöglicht. Die "Bildung ermöglichen" beinhaltet dabei die konstitutive Steigerung der Bildung, Abschwächung bzw. Blockierung der Bildung unter spezifischen Bedingungen und oder die Steigerung der Bildung unter spezifischen Bedingungen. Die "Bedingungen" umfassen dabei: (1) Zugabe einer Komponente zum Kulturmedium, (2) Entfernen einer Komponente vom Kulturmedium, (3) Austausch einer Komponente im Kulturmedium durch eine zweite Komponente, (4) Erhöhung der Temperatur des Kulturmediums, (5) Erniedrigung der Temperatur des Kulturmediums, und (6) Regulierung der atmosphäri- sehen Bedingungen, wie z.B. die Sauerstoff- oder Stickstoffkonzentration, in der das Kulturmedium gehalten wird.
Die Erfindung betrifft ferner einen Expressionsvektor enthaltend eine vorstehend be¬ schriebene, erfindungsgemäße Expressionskassette.
Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.
Als Plasmide eignen sich solche besonders bevorzugt, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKExi (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmid¬ vektoren, wie z. B. pCUKδMCS, oder solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160) oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)) oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher weise verwendet werden.
Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60,126- 132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/ Technology 1 ,784- 791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145,69-73 (1994)), Ber¬ nard et al., Journal ofMolecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991 , Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) oder pBGS8 (Spratt et al.,1986, Gene 41 : 337-342) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Ap¬ plied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio- technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123,343-347 (1994)) beschrieben.
Die Erfindung betrifft ferner einen genetisch verändertem Mikroorganismus, wobei die genetische Veränderung zu einer Veränderung oder Verursachung der Transkriptions¬ rate von mindestens einem Gen im Vergleich zum Wildtyp führt und bedingt ist durch
a) Veränderung der spezifischen Promotoraktivität im Mikroorganismus von mindes- tens einer endogenen Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , die die
Transkription mindestens eines endogenen Gens reguliert oder
b) Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivi- tat gemäß Anspruch 1 mit veränderter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausfüh¬ rungsform a), wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.
Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß An¬ spruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 mit verän¬ derter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) dadurch erreicht, dass man
b1 ) eine oder mehrere Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gebe- nenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, in das Genom des Mikroorga¬ nismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer endogenen Gene un¬ ter der Kontrolle der eingebrachten Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß An¬ spruch 1 , gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder b2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der en¬ dogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
b3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Nukleinsäure mit Pro¬ motoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promo¬ toraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribierende Nuklein¬ säuren, in den Mikroorganismus einbringt.
Die Erfindung betrifft ferner eine genetisch verändertem Mikroorganismus mit erhöhter oder verursachter Transkriptionsrate von mindestens einem Gen im Vergleich zum Wildtyp, wobei
ah) die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus von endogenen Nukleinsäu¬ ren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , die die Transkription von endogenen Ge¬ nen regulieren, im Vergleich zum Wildtyp erhöht ist oder
bh) die Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit Promo- toraktivität gemäß Anspruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit erhöhter spezifischer
Promotoraktivität gemäß Ausführungsform ah) reguliert wird, wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.
Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß An¬ spruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 mit verän¬ derter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) dadurch erreicht, dass man
bh1) eine oder mehrere Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , ge¬ gebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, in das Genom des Mikroorga¬ nismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer endogenen Gene un¬ ter der Kontrolle der eingebrachten Nukleinsäure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
bh.2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der en¬ dogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder bh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promo¬ toraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribierende Nuklein¬ säuren, in den Mikroorganismus einbringt.
Die Erfindung betrifft femer einen genetisch verändertem Mikroorganismus mit redu¬ zierter Transkriptionsrate von mindetstens einem Gen im Vergleich zum Wildtyp, wobei
ar)die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endo- genen Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , die die Transkription von mindestens einem, endogenen Gen reguliert, im Vergleich zum Wildtyp reduziert ist oder
br)eine oder mehrere Nukleinsäuren mit reduzierter Promotoraktivität gemäßAusfüh- rungsform a) in das Genom des Mikrorganismus eingebracht wurden, so dass die
Transkription mindestens eines endogenen Gens unter der Kontrolle der eingebrachten Nukleinsäure mit reduzierter Promotoraktivität erfolgt.
Die Erfindung betrifft ferner einen genetisch verändertem Mikroorganismus, wobei die genetische Veränderung zu einer Veränderung oder Verursachung der Expressionsra¬ te mindestens eines Gens im Vergleich zum Wildtyp führt und bedingt ist durch
c) Veränderung der spezifischen Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindes¬ tens einer endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, die die Ex- pression mindestens eines endogenen Gens reguliert, im Vergleich zum Wildtyp oder
d) Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionsein¬ heiten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform a), wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind.
Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit veränderter spezifi- scher Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform a) dadurch erreicht, dass man
d1 ) eine oder mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenen¬ falls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorga¬ nismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, ge¬ gebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
d2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endo¬ genen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit veränder¬ ter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
d3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Expressionseinheit ge- maß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsakti¬ vität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
Die Erfindung betrifft ferner einen genetisch verändertem Mikroorganismus mit erhöh- ter oder verursachter Expressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich zum Wild¬ typ, wobei man
ch) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, die die Expression der endogenen Gene reguliert, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder
dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinheiten ge¬ mäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform a) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind.
Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform a) dadurch erreicht, dass man
dh1 ) eine oder mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenen¬ falls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kon- trolle der eingebrachten Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenen¬ falls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
dh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endo- genen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Expressionseinheit gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivi¬ tät, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
Die Erfidnung betrifft ferner einen genetisch verändertem Mikroorganismus mit redu- zierter Expressionsrate von mindetstens einem Gen im Vergleich zum Wildtyp, wobei,
er) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens einer en¬ dogenen Expressionseinheit gemäß Anspruch 2 oder 3, die die Expression von min¬ destens einem edogenen Gen reguliert, im Vergleich zum Wildtyp reduziert ist oder
dr)eine oder mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit reduzierter Expressionsaktivität in das Genom des Mikrorganismus eingebracht wurden, so dass die Expression mindestens eines Gens unter der Kontrolle der eingebrachten Expres¬ sionseinheit gemäß Anspruch 2 oder 3 mit reduzierter Expressionsaktivität erfolgt.
Ferner betrifft die Erfindung einen genetisch veränderter Mikroorganismus, enthaltend eine Expressionseinheit gemäß Anspruch 2 oder 3 und funktionell verknüpft ein zu eprimierendes Gen, wobei das Gen im Bezug auf die Expressionseinheit heterolog ist.
Besonders bevorzugt enthält dieser genetisch veränderte Mikroorganismus eine erfin¬ dungsgemäße Expressionskasette.
Besonders bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung gentisch veränderte Mikroor- gansismen, insbesondere coryneforme Bakterien, die einen Vektor, insbesondere Pendelvektor oder Plasmidvektor, der wenigstens ein rekombinantes Nukleinsäurekon- strukt erfindungsgemäßer Definition trägt, enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der genetisch veränderten Mikroorganismen sind die vorstehend beschriebenen Gene mindestens eine Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von Feinchemikalien.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der genetisch veränderten Mikroor¬ ganismen sind die vorstehend beschriebenen Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Bio- syntheseweg von Nukleotiden und Nukleosiden, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Diolen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Konhlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von aromatischen Verbindung, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzymen, wobei die Gene gegebenenfalls weitere Regulationselemente enthalten können.
Bevorzugte Proteine aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren sind ausgewählt aus der Gruppe Aspartatkinase, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Diaminopimelat- Dehydrogenase, Diaminopimelat-Decarboxylase, Dihydrodipicolinate-Synthetase, Di- hydrodipicolinate-Reduktase, Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, 3-
Phosphoglycerat-Kinase, Pyruvat-Carboxylase, Triosephosphat-Isomerase, Transkrip- tioneller Regulator LuxR, Transkriptioneller Regulator LysR1 , Transkriptioneller Regulator LysR2, Malat-Quinon-Oxidoreduktase, Glucose-6-Phosphat-Deydrogenase, 6-Phosphogluconat-Dehydrognease, Transketolase, Transaldolase, Homoserin-O- Acetyltransferase, Cystahionin-gamma-Synthase, Cystahionin-beta-Lyase, Serin- Hydroxymethyltransferase, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase, Methylen- Tetrahydrofolat-Reduktase, Phosphoserin-Aminotransferase, Phosphoserin- Phosphatase, Serin-Acetyl-Transferase, Homoserin-Dehydrogenase, Homoserin- Kinase, Threonin-Synthase, Threonin-Exporter-Carrier, Threonin-Dehydratase, Pyru- vat-Oxidase, Lysin-Exporter, Biotin-Ligase, Cystein-Synthasel, Cystein-Synthase Il Coenzym B12-abhängige Methionin-Synthase, Coenzym B12-unabhängige Methionin- Synthase-Aktivität, Sulfatadenyltransferase Untereinheit 1 und 2, Phosphoadenosin Phosphosulfat Reduktase, Ferredoxin-sulfit-reductase, Ferredoxin NADP Reduktase, 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase, RXA00655 Regulator, RXN2910-Regulator, Argi- nyl-t-RNA-Synthetase, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Threonin Efflux-Protein, Se- rinhydroxymethyltransferase, Fruktose-1 ,6-bisphosphatase, Protein der Sulfat- Reduktion RXA077, Protein der Sulfat-Reduktion RXA248, Protein der Sulfat- Reduktion RXA247, Protein OpcA, 1 -Phosphof ruktokinase und 6-Phosphof ruktokinase
Besonders bevorzugte Beispiele der Proteine und Gene aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren sind vorstehend in Tabelle 1 und Tabelle 2 beschrieben.
Bevorzugte Mikroorganismen oder genetisch veränderte Mikroorganismen sind Bakte¬ rien, Algen, Pilze oder Hefen. 007757
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Besondars bevorzugte Mikroorgansimen sind insbeondere coryneforme Bakterien.
Bevorzugte coryneforme Bakterien sind Bakterien der Gattung Corynebacterium, ins¬ besondere der Arten Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutami- cum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium thermoaminogenes, Cory¬ nebacterium melassecola und Corynebacterium efficiens oder der Gattung Brevibacte- rium, insbesondere der Arten Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum und Brevibacterium divaricatum.
Besonders bevorzugte Bakterien der Gattungen Corynebacterium und Brevibacterium sind ausgewählt aus der Gruppe Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Coryne¬ bacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium me¬ lassecola ATCC 17965, Corynebacterium efficiens DSM 44547, Corynebacterium effi- ciens DSM 44548. Corynebacterium efficiens DSM 44549, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium divarica¬ tum ATCC 14020, Corynebacterium glutamicum KFCC10065 und Corynebacterium glutamicum ATCC21608.
Mit der Abkürzung KFCC ist die Korean Federation of Culture Collection gemeint, mit der Abkürzung ATCC die American type strain culture collection, mit der Abkürzung DSM die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen.
Weitere besonders bevorzugte Bakterien der Gattungen Corynebacterium und Brevi- bacterium sind in Tabelle 3 aufgelistet:
Die Abkürzungen haben folgende Bedeutung:
ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA FERM: Fermentation Research Institute, Chiba, Japan
NRRL: ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA
CECT: Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Valencia, Spain NCIMB: National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, UK CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, NL NCTC: National Collection of Type Cultures, London, UK
DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany
Durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und den erfin¬ dungsgemäßen Expressionseinheiten ist es mit Hilfe der vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren möglich in den vorstehend beschriebenen, erfindungs¬ gemäßen genetisch veränderten Mikroorganismen die Stoffwechselwege zu spezifi¬ schen biosynthetischen Produkten zu regulieren.
Dazu werden beispielsweise Stoffwechselwege die zu einem spezifischen biosyntheti¬ schen Produkt führen durch Verursachung oder Erhöhung der Transkriptionrate bzw. Expressionsrate von Genen dieses Biosyntheseweges verstärkt in dem die erhöhte Proteinmenge zu einer erhöhten Gesamtaktivität dieser Proteine des gewünschten Biosyntheseweges und damit zu einem verstärkten Stoffwechselfluß zu dem gewün- schen biosynthetischen Produkt führt.
Weiterhin können Stoffwechselwege die von einem spezifischen biosynthetischen Pro¬ dukt wegführen durch Reduzierung der Transkriptionrate bzw. Expressionsrate von Genen dieses wegführenden Biosyntheseweges abgeschwächt werden in dem die reduzierte Proteinmenge zu einer reduzierten Gesamtaktivität dieser Proteine des un¬ erwünschten Biosyntheseweges und damit zusätzlich zu einem verstärkten Stoffwech¬ selfluß zu dem gewünschen biosynthetischen Produkt führt. Die erfindungsgemäßen genetisch veränderten Mikroorganismen sind beispielsweise in der Lage aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol biosynthetische Produkte herzustellen.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produk¬ ten durch Kultivierung von erfindungsgemäßen, genetisch veränderten Mikroorganis¬ men.
Je nach gewünschtem biosynthetischen Produkt muss die Transkriptionsrate bzw. Ex- pressionsrate verschiedener Gene erhöht bzw. reduziert werden. In der Regel ist es vorteilhaft die Transkrioptionsrate bzw. Expressionsrate mehrere Gene zu verändern, d.h. die Transkrioptionsrate bzw. Expressionsrate einer Kombination von Gene zu Er¬ höhen und/oder die Transkrioptionsrate bzw. Expressionsrate einer Kombination von Gene zu reduzieren.
In den erfindungsgemäßen genetisch veränderten Mikroorganismen ist mindestens eine veränderte, dass heißt erhöhte oder reduzierte Transkriptionsrate bzw. Expressi¬ onsrate eines Gens auf eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität bzw. erfindungsgemäße Expressionseinheit zurückzuführen.
Weitere, zusätzliche veränderte, d.h. zusätzlich erhöhte oder zusätzlich reduzierte Transkriptionsraten bzw. Expressionsraten von weiteren Genen im genetisch veränder¬ ten Mikroorganismus können, müssen aber nicht auf die erfindungsgemäßen Nuklein¬ säuren mit Promotoraktivität bzw. die erfindungsgemäßen Expressionseinheiten zurück gehen.
Die Erfindung betrifft deshalb weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von biosyntheti¬ schen Produkten durch Kultivierung von erfindungsgemäßen, genetisch veränderten Mikroorganismen.
Bevorzugte biosynthetische Produkte sind Feinchemikalien.
Der Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet bekannt und beinhaltet Verbidnungen, die von einem Organismus produziert werden und in verschiedenen Industriezweigen Anwendungen finden, wie bspw., jedoch nicht beschränkt auf die pharmazeutische Industrie, die Landwirtschafts-, Kosmetik , Food und Feed-Industrie. Diese Verbindun¬ gen umfassen organische Säuren, wie beispielsweise Weinsäure, Itaconsäure und Diaminopimelinsäure, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide (wie bspw. beschrieben in Ku- ninaka, A. (1996) Nucleotides and related Compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten), Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (bspw. Arachidonsäure), Diole (bspw. Propan- diol und Butandiol), Kohlenhydrate (bspw. Hyaluronsäure und Trehalose), aromatische Verbindungen (bspw. aromatische Amine, Vanillin und Indigo), Vitamine und Cofakto- ren (wie beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Cor¬ poration, ISBN: 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen, beschriebe¬ nen Chemikalien. Der Metabolismus und die Verwendungen bestimmter Feinchemika¬ lien sind nachstehend weiter erläutert.
I. Aminosäure-Metabolismus und Verwendungen
Die Aminosäuren umfassen die grundlegenden Struktureinheiten sämtlicher Proteine und sind somit für die normalen Zellfunktionen essentiell. Der Begriff "Aminosäure" ist im Fachgebiet bekannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten gibt, dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen miteinan¬ der verknüpft sind, wohingegen die nicht-proteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt sind) gewöhnlich nicht in Proteinen vorkommen (siehe Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Die Aminosäuren können in der D- oder L-Konfiguration vorliegen, obwohl L-Aminosäuren gewöhnlich der einzige Typ sind, den man in natürlich vorkommenden Proteinen vor¬ findet. Biosynthese- und Abbauwege von jeder der 20 proteinogenen Aminosäuren sind sowohl bei prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen gut charakterisiert (siehe bspw. Stryer, L. Biochemistry, 3. Auflage, S. 578-590 (1988)). Die "essentiellen" Aminosäuren (Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin), so bezeichnet, da sie aufgrund der Komplexität ihrer Biosyn¬ these mit der Ernährung aufgenommen werden müssen, werden durch einfache Bio¬ syntheseswege in die übrigen 11 "nichtessentiellen" Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Prolin, Serin und Tyrosin) umgewandelt. Höhere Tiere besitzen die Fähigkeit, einige dieser Aminosäuren zu syn¬ thetisieren, jedoch müssen die essentiellen Aminosäuren mit der Nahrung aufgenom¬ men werden, damit eine normale Proteinsynthese stattfindet.
Abgesehen von ihrer Funktion bei der Proteinbiosynthese sind diese Aminosäuren inte- ressante Chemikalien an sich, und man hat entdeckt, daß viele bei verschiedenen An- Wendungen in der Nahrungsmittel-, Futter-, Chemie-, Kosmetik-, Landwirtschafts- und pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Lysin ist nicht nur für die Ernährung des Menschen eine wichtige Aminosäure, sondern auch für monogastrische Tiere, wie Geflügel und Schweine. Glutamat wird am häufigsten als Geschmacksadditiv (Mono- natriumglutamat, MSG) sowie weithin in der Nahrungsmittelindustrie verwendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin, Glycin und Cystein. Glycin, L-Methionin und Tryptophan werden sämtlich in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in der pharmazeutischen Industrie und der Kosmetikindustrie verwendet. Threonin, Tryptophan und D-/L- Methionin sind weitverbreitete Futtermittelzusätze (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg.) Biotechnology Bd. 6, Kapitel 14a, VCH: Weinheim). Man hat entdeckt, daß sich diese Aminosäuren außerdem als Vorstufen für die Synthese von synthetischen Aminosäuren und Protei¬ nen, wie N-Acetylcystein, S-Carboxymethyl-L-cystein, (S)-5-Hydroxytryptophan und anderen, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 beschriebenen Substanzen eignen.
Die Biosynthese dieser natürlichen Aminosäuren in Organismen, die sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist gut charakterisiert worden (für einen Überblick der bakte- riellen Aminosäure-Biosynthese und ihrer Regulation, s. Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533 - 606). Glutamat wird durch reduktive Aminierung von α- Ketoglutarat, einem Zwischenprodukt im Citronensäure-Zyklus, synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils nacheinander aus Glutamat erzeugt. Die Biosynthe¬ se von Serin erfolgt in einem Dreischritt- Verfahren und beginnt mit 3-Phosphoglycerat (einem Zwischenprodukt bei der Glykolyse), und ergibt nach Oxidations-, Transaminie- rungs- und Hydrolyseschritten diese Aminosäure. Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin produziert, und zwar die erstere durch Kondensation von Homocystein mit Serin, und die letztere durch Übertragung des Seitenketten-ß-Kohlenstoffatoms auf Tetrahydrofolat, in einer durch Serintranshydroxymethylase katalysierten Reaktion. Phenylalanin und Tyrosin werden aus den Vorstufen des Glycolyse- und Pento- sephosphatweges, Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat in einem 9-Schritt- Biosyntheseweg synthetisiert, der sich nur in den letzten beiden Schritten nach der Synthese von Prephenat unterscheidet. Tryptophan wird ebenfalls aus diesen beiden Ausgangsmolekülen produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem 11 -Schritt- Weg. Tyrosin läßt sich in einer durch Phenylalaninhydroxylase katalysierten Reaktion auch aus Phenylalanin herstellen. Alanin, Valin und Leucin sind jeweils Biosynthese¬ produkte aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Aspartat wird aus Oxalacetat, einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, gebildet. Asparagin, Methionin, Threonin und Lysin werden jeweils durch Umwandlung von Aspartat produziert. Isoleucin wird aus Threonin gebildet. In einem komplexen 9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von Histidin aus 5-Phosphoribosyl-1 -pyrophosphat, einem aktivierten Zucker.
Aminosäuren, deren Menge den Proteinbiosynthesebedarf der Zelle übersteigt, können nicht gespeichert werden, und werden stattdessen abgebaut, so daß Zwischenproduk¬ te für die Haupt-Stoffwechselwege der Zelle bereitgestellt werden (für einen Überblick siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle"; S 495-516 (1988)). Die Zelle ist zwar in der Lage, ungewünschte Aminosäuren in nützliche Stoffwechsel-Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die Aminosäure- Produktion hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und der für ihre Synthese nötigen Enzyme aufwendig. Es überrascht daher nicht, daß die Aminosäure- Biosynthese durch Feedback-Hemmung reguliert wird, wobei das Vorliegen einer be¬ stimmten Aminosäure ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet (für ei¬ nen Überblick über den Rückkopplungs-Mechanismus bei Aminosäure- Biosynthesewegen, siehe Stryer, L, Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", S. 575-600 (1988)). Der Ausstoß einer bestimmten Amino¬ säure wird daher durch die Menge dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt.
II. Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika-Metabolismus sowie Verwendungen
Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika umfassen eine weitere Gruppe von Molekülen. Höhere Tiere haben die Fähigkeit verloren, diese zu synthetisieren und müssen sie somit aufnehmen, obwohl sie leicht durch andere Organismen, wie Bakterien, syntheti¬ siert werden. Diese Moleküle sind entweder biologisch aktive Moleküle an sich oder Vorstufen von biologisch aktiven Substanzen, die als Elektronenträger oder Zwischen¬ produkte bei einer Reihe von Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben neben ihrem Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe, Antio- xidantien und Katalysatoren oder andere Verarbeitungs-Hiifsstoffe. (Für einen Über¬ blick über die Struktur, Aktivität und die industriellen Anwendungen dieser Verbindun- gen siehe bspw. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Der Begriff "Vitamin" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt Nährstoffe, die von einem Organismus für eine normale Funktion benötigt werden, jedoch nicht von diesem Organismus selbst synthetisiert werden können. Die Gruppe der Vitamine kann Cofaktoren und nutrazeutische Verbindungen umfassen. Der Begriff "Cofaktor" umfaßt nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise orga¬ nisch. Der Begriff "Nutrazeutikum" umfaßt Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Mo- leküle sind Vitamine, Antioxidantien und ebenfalls bestimmte Lipide (z.B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren).
Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die zu ihrer Produktion befähigt sind, wie Bakterien, ist umfassend charakterisiert worden (Ullmann's Encyclopedia of Indus- trial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996, Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for f ree Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S).
Thiamin (Vitamin B1) wird durch chemisches Kuppeln von Pyrimidin und Thiazol- Einheiten gebildet. Riboflavin (Vitamin B2) wird aus Guanosin-5'-triphosphat (GTP) und Ribose-5'-phosphat synthetisiert. Riboflavin wiederum wird zur Synthese von Flavin- mononukleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD) eingesetzt. Die Familie von Verbindungen, die gemeinsam als "Vitamin B6" bezeichnet werden (bspw. Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal-5'-phosphat und das kommerziell verwendete Pyridoxin- hydrochlorid), sind alle Derivate der gemeinsamen Struktureinheit 5-Hydroxy-6- methylpyridin. Panthothenat (Pantothensäure, R-(+)-N-(2,4-Dihydroxy-3,3-dimethyl-1- oxobutyl)-ß-alanin) kann entweder durch chemische Synthese oder durch Fermentation hergestellt werden. Die letzten Schritte bei der Pantothenat-Biosynthese bestehen aus der ATP-getriebenen Kondensation von ß-Alanin und Pantoinsäure. Die für die Biosyn¬ theseschritte für die Umwandlung in Pantoinsäure, in ß-Alanin und zur Kondensation in Pantothensäure verantwortlichen Enzyme sind bekannt. Die metabolisch aktive Form von Pantothenat ist Coenzym A, dessen Biosynthese über 5 enzymatische Schritte verläuft. Pantothenat, Pyridoxal-δ'-phosphat, Cystein und ATP sind die Vorstufen von Coenzym A. Diese Enzyme katalysieren nicht nur die Bildung von Pantothenat, son¬ dern auch die Produktion von (R)-Pantoinsäure, (R)-Pantolacton, (R)-Panthenol (Provi- tamin B5), Pantethein (und seinen Derivaten) und Coenzym A.
Die Biosynthese von Biotin aus dem Vorstufenmolekül Pimeloyl-CoA in Mikroorganis¬ men ist ausführlich untersucht worden, und man hat mehrere der beteiligten Gene i- dentifiziert. Es hat sich herausgestellt, daß viele der entsprechenden Proteine an der Fe-Cluster-Synthese beteiligt sind und zu der Klasse der nifS-Proteine gehören. Die Liponsäure wird von der Octanonsäure abgeleitet und dient als Coenzym beim Ener¬ gie-Metabolismus, wo sie Bestandteil des Pyruvatdehydrogenasekomplexes und des α-Ketoglutaratdehydrogenasekomplexes wird. Die Folate sind eine Gruppe von Sub¬ stanzen, die alle von der Folsäure abgeleitet werden, die wiederum von L- Glutaminsäure, p-Aminobenzoesäure und 6-Methylpterin hergeleitet ist. Die Biosynthe- se der Folsäure und ihrer Derivate, ausgehend von den metabolischen Stoffwechsel¬ zwischenprodukten Guanosin-5'-triphosphat (GTP), L-Glutaminsäure und p- Aminobenzoesäure ist in bestimmten Mikroorganismen eingehend untersucht worden.
Corrinoide (wie die Cobalamine und insbesondere Vitamin B12) und die Porphyrine gehören zu einer Gruppe von Chemikalien, die sich durch ein Tetrapyrrol-Ringsystem auszeichnen. Die Biosynthese von Vitamin B12 ist hinreichend komplex, daß sie noch nicht vollständig charakterisiert worden ist, jedoch ist inzwischen ein Großteil der betei¬ ligten Enzyme und Substrate bekannt. Nikotinsäure (Nikotinat) und Nikotinamid sind Pyridin-Derivate, die auch als "Niacin" bezeichnet werden. Niacin ist die Vorstufe der wichtigen Coenzyme NAD (Nikotinamidadenindinukleotid) und NADP (Nikotinamidade- nindinukleotidphosphat) und ihrer reduzierten Formen.
Die Produktion dieser Verbindungen im Großmaßstab beruht größtenteils auf zellfreien chemischen Synthesen, obwohl einige dieser Chemikalien ebenfalls durch großange¬ legte Anzucht von Mikroorganismen produziert worden sind, wie Riboflavin, Vitamin B6, Pantothenat und Biotin. Nur Vitamin B12 wird aufgrund der Komplexität seiner Synthese lediglich durch Fermentation produziert. In-vitro-Verfahren erfordern einen erheblichen Aufwand an Materialien und Zeit und häufig an hohen Kosten.
III. Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- und Nukleotid-Metabolismus und Verwendungen
Gene für den Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel und ihre entsprechenden Proteine sind wichtige Ziele für die Therapie von Tumorerkrankungen und Virusinfektionen. Der Beg- riff "Purin" oder "Pyrimidin" umfaßt stickstoffhaltige Basen, die Bestandteil der Nuklein¬ säuren, Coenzyme und Nukleotide sind. Der Begriff "Nukleotid" beinhaltet die grundle¬ genden Struktureinheiten der Nukleinsäuremoleküle, die eine stickstoffhaltige Base, einen Pentose-Zucker (bei RNA ist der Zucker Ribose, bei DNA ist der Zucker D- Desoxyribose) und Phosphorsäure umfassen. Der Begriff "Nukleosid" umfaßt Moleküle, die als Vorstufen von Nukleotiden dienen, die aber im Gegensatz zu den Nukleotiden keine Phosphorsäureeinheit aufweisen. Durch Hemmen der Biosynthese dieser Mole¬ küle oder ihrer Mobilisation zur Bildung von Nukleinsäuremolekülen ist es möglich, die RNA- und DNA-Synthese zu hemmen; wird diese Aktivität zielgerichtet bei kanzeroge¬ nen Zellen gehemmt, läßt sich die Teilungs- und Replikations-Fähigkeit von Tumorzel- len hemmen.
Es gibt zudem Nukleotide, die keine Nukleinsäuremoleküle bilden, jedoch als Energie¬ speicher (d.h. AMP) oder als Coenzyme (d.h. FAD und NAD) dienen. Mehrere Veröffentlichungen haben die Verwendung dieser Chemikalien für diese me¬ dizinischen Indikationen beschrieben, wobei der Purin- und/oder Pyrimidin- Metabolismus beeinflußt wird (bspw. Christopherson, R.l. und Lyons, S.D. (1990) "Po¬ tent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic a- gents", Med. Res. Reviews 10: 505-548). Untersuchungen an Enzymen, die am Purin- und Pyrimidin-Metabolismus beteiligt sind, haben sich auf die Entwicklung neuer Medi¬ kamente konzentriert, die bspw. als Immunsuppressionsmittel oder Antiproliferantien verwendet werden können (Smith, J. L. "Enzymes in Nucleotide Synthesis" Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; Biochem. Soc. Transact. 23 (1995) 877-902). Die Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide haben jedoch auch andere Einsatz¬ möglichkeiten: als Zwischenprodukte bei der Biosysnthese verschiedener Feinchemi¬ kalien (z.B. Thiamin, S-Adenosyl-methionin, Folate oder Riboflavin), als Energieträger für die Zelle (bspw. ATP oder GTP) und für Chemikalien selbst, werden gewöhnlich als Geschmacksverstärker verwendet (bspw. IMP oder GMP) oder für viele medizinische Anwendungen (siehe bspw. Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Com¬ pounds in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim, S. 561-612). En¬ zyme, die am Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- oder Nukleotid-Metabolismus beteiligt sind, dienen auch immer stärker als Ziele, gegen die Chemikalien für den Pflanzenschutz, einschließlich Fungiziden, Herbiziden und Insektiziden entwickelt werden.
Der Metabolismus dieser Verbindungen in Bakterien ist charakterisiert worden (für Ü- bersichten siehe bspw. Zalkin, H. und Dixon, J.E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis" in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular biology, Bd. 42, Academic Press, S. 259-287; und Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleosides"; Kap. 8 in : Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York). Der Purin-Metabolismus, das Objekt intesiver Forschung, ist für das normale Funktionieren der Zelle essentiell. Ein gestörter Purin-Metabolismus in höhe¬ ren Tieren kann schwere Erkrankungen verursachen, bspw. Gicht. Die Purinnukleotide werden über eine Reihe von Schritten über die Zwischenverbindung lnosin-5'-phosphat (IMP) aus Ribose-5-phosphat synthetisiert, was zur Produktion von Guanosin-5'- monophosphat (GMP) oder Adenosin-5'-monophosphat (AMP) führt, aus denen sich die als Nukleotide verwendeten Triphosphatformen leicht herstellen lassen. Diese Ver¬ bindungen werden auch als Energiespeicher verwendet, so daß ihr Abbau Energie für viele verschiedene biochemische Prozesse in der Zelle liefert. Die Pyrimidinbiosynthe- se erfolgt über die Bildung von Uridin-5'-monophosphat (UMP) aus Ribose-5-phosphat. UMP wiederum wird in Cytidin-5'-triphosphat (CTP) umgewandelt. Die Desoxyformen sämtlicher Nukleotide werden in einer Einschritt-Reduktionsreaktion aus der Diphosphat-Riboseform des Nukleotides zur Diphosphat-Desoxyriboseform des Nukle¬ otides hergestellt. Nach der Phosphorylierung können diese Moleküle an der DNA- Synthese teilnehmen. IV. Trehalose-MΘtabolismυs und Verwendungen
Trehalose besteht aus zwei Glucosemolekülen, die über α,α-1 ,1 -Bindung miteinander verknüpft sind. Sie wird gewöhnlich in der Nahrungsmittelindustrie als Süßstoff, als Additiv für getrocknete oder gefrorene Nahrungsmittel sowie in Getränken verwendet. Sie wird jedoch auch in der pharmazeutischen Industrie, der Kosmetik- und Biotechno¬ logie-Industrie angewendet (s. bspw. Nishimoto et al., (1998) US-Patent Nr. 5759 610; Singer, MA und Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, C.L.A. und Panek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; und Shiosaka, M. J. Japan 172
(1997) 97-102). Trehalose wird durch Enzyme von vielen Mikroorganismen produziert und auf natürliche Weise in das umgebende Medium abgegeben, aus dem sie durch im Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen werden kann.
Besonders bevorzugte biosynthetische Produkte sind ausgewählt aus der Gruppe or¬ ganische Säuren, Proteine, Nukleotide und Nukleoside, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlehydrate, aromati¬ sche Verbindungen, Vitamine und Cofaktoren, Enzyme und Proteine.
Bevorzugte organische Säuren sind Weinsäure, Itaconsäure und Diaminopimelinsäure
Bevorzugte Nukleoside und Nukleotide sind beispielsweise beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related Compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten.
Bevorzugte biosynthetische Produkte sind weiterhin Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, wie beispielsweise Arachidonsäure, Diole wie beispielsweise Propandiol und Butandiol, Kohlenhydrate, wie beispielsweise Hyaluronsäure und Trehalose, aro¬ matische Verbindungen, wie beispielsweise aromatische Amine, Vanillin und Indigo, Vitamine und Cofaktoren, wie beispielsweise beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lip- ids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)), En¬ zyme Polyketide (Cane et al. (1998) Science 282: 63-68), und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen, beschriebenen Chemikalien. Besonders bevorzugte biosynthetische Produkte sind Aminosäuren, besonders bevor¬ zugt essentielle Aminosäuren, insbeondere L-Glycin, L-Alanin, L-Ieucin, L-Methionin, L- Phenylalanin, L-Tryptophan, L-Lysin, L-Glutamin, L-Glutaminsäure, L-Serin, L-Prolin, L- Valin, L-Isoleucin, L-Cystein, L-Tyrosin, L-Histidin, L-Arginin, L-Asparagin, L- Asparaginsäure und L-Threonin, L-Homoserin, insbesondere L-Lysin, L-Methionin und L-Threonin. Im folgenden wird unter unter einer Aminosäure, wie beispielsweise Lysin, Methionin und Threonin, sowohl jeweils die L- und die D-Form der Aminosäure, vor¬ zugsweise die L-Form, also beispielsweise L-Lysin, L-Methionin und L-Threonin ver¬ standen.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Lysin durch Kul¬ tivierung von genetisch veränderten Mikroorganismen mit erhöhter oder verursachter Expressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich zum Wildtyp, wobei man
ch) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheit, die die Expression der endoge¬ nen Gene reguliert, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder
dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expres- sionseinheiten oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit erhöhter spezi¬ fischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform ch) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind,
und wobei die Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend eine Aspartatkinase, Nukleinsäuren kodierend eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Diaminopimelat- Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodie¬ rend eine Diaminopimelat- Decarboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Dihydrodipi- coIinate-Synthetase, Nukleinsäuren kodierend eine Dihydridipicolinate-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Nuklein- säuren kodierend eine 3-Phosphoglycerat-Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Pyru- vat Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Triosephosphat-lsomerase, Nuklein¬ säuren kodierend einen Transkriptionellen Regulator LuxR, Nukleinsäuren kodierend einen Transkriptionellen Regulator LysR1 , Nukleinsäuren kodierend einen Transkripti¬ onellen Regulator LysR2, Nukleinsäuren kodierend eine Malat-Quinon- Oxodoreduktase, Nukleinsäuren kodierend eine Glucose-6-Phosphat-Deydrognease, Nukleinsäuren kodierend eine 6-Phosphogluconat-Dehydrognease, Nukleinsäuren kodierend eine Transketolase, Nukleinsäuren kodierend eine Transaldolase, Nuklein¬ säuren kodierend einen Lysin Exporter, Nukleinsäuren kodierend eine Biotin-Ligase, Nukleinsäuren kodierend eine Arginyl-t-RNA-Synthetase, Nukleinsäuren kodierend eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Fruktose-1 ,6- bisphosphatase, Nukleinsäuren kodierend ein Protein OPCA, Nukleinsäuren kodierend eine 1 -Phosphof ructokinase und Nukleinsäuren kodierend eine 6-Phosphof ructokinase.
Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Expression dieser Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten o- der durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit erhöhter spezifischer Expressi¬ onsaktivität gemäß Ausführungsform ch) dadurch erreicht, dass man
dh1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus ein¬ bringt, so dass die Expression eines oder mehrerer dieser endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenen¬ falls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
dh2) ein oder mehrere dieser Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöh¬ ter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mik¬ roorganismus einbringt.
Eine weiter bevorzugte Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Lysin ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine erhöhte Aktivität, mindes¬ tens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Aspartatkinase-Aktivität, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität, Diaminopi- melat- Dehydrogenase-Aktivität, Diaminopimelat-Decarboxylase-Aktivität, Dihydrodipi- colinate-Synthetase-Aktivität, Dihydridipicolinate-Reduktase-Aktivität, Glycerinaldehyd- 3-Phosphat Dehydrogenase-Aktivität, 3-Phosphoglycerat-Kinase-Aktivität, Pyruvat Carboxylase-Aktivität, Triosephosphat-Isomerase-Aktivität, Aktivität des Transkriptio¬ nellen Regulators LuxR, Aktivität des Transkriptionellen Regulators LysR1 , Aktivität des Transkriptionellen Regulators LysR2, Malat-Quinon-Oxodoreduktase-Aktivität, Glucose-6-Phosphat-Deydrognease-Aktivität, 6-Phosphogluconat-Dehydrognease- Aktivität, Transketolase-Aktivität, Transaldolase-Aktivität, Lysin-Exporter-Aktivität, Argi- nyl-t-RNA-Synthetase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität, Fruktose- 1 ,6-bisphosphatase-Aktivität, Protein OpcA-Aktivität, 1 -Phosphof ructokinase-Aktivität, 6-Phosphofructokinase-Aktivität und Biotin-Ligase-Aktivität aufweisen. Eine weiter besonders bevorzugte Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Lysin ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine reduzierte Ak- tivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Threonin Dehydra- tase-Aktivität, Homoserin O-Acetyltransferase-Aktivität, O-Acetylhomoserin- Sulfhydrylase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität, Pyruvat-Oxidase- Aktivität, Homoserine-Kinase-Aktivität, Homoserin-Dehydrogenase-Aktivität, Threonin- Exporter-Aktivität, Threonin-Efflux-Protein-Aktivität, Asparaginase-Aktivität, Aspartat- Decarboxylase-Aktivität und Threonin-Synthase-Aktivität aufweisen.
Diese zusätzlichen, erhöhten oder reduzierten Aktivitäten mindestens einer der vorste¬ hend beschriebenen Aktivitäten können, müssen aber nicht durch eine erfindungsge¬ mäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität und/oder eine erfindungsgemäße Expressi- onseinheit verursacht sein.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Methionin durch Kultivie¬ rung von genetisch veränderten Mikroorganismen mit erhöhter oder verursachter Ex¬ pressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich zum Wildtyp, wobei man
ch) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheit, die die Expression der endoge¬ nen Gene reguliert, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder
dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expres¬ sionseinheiten oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit erhöhter spezi¬ fischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform ch) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind,
und wobei die Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend eine Aspartatkinase, Nukleinsäuren kodierend eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Homoserin Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine 3- Phosphoglycerat Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Pyruvat Carboxylase, Nuklein- säuren kodierend eine Triosephosphat Isomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Ho¬ moserin O-Acetyltransferase, Nukleinsäuren kodierend eine Cystahionin-gamma- Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Cystahionin-beta-Lyase, Nukleinsäuren ko¬ dierend eine Serin-Hydroxymethyltransferase, Nukleinsäuren kodierend eine O- Acetylhomoserin-Sulfhydrylase, Nukleinsäuren kodierend eine Methylen-Tetrahydro- folat-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine Phosphoserin-Aminotransferase, Nuk- leinsäuren kodierend eine Phosphoserin-Phosphatase, Nukleinsäuren kodierend eine Serine Acetyl-TransferaseNukleinsäuren kodierend eine Cystein-Synthase Aktivität I, Nukleinsäuren kodierend eine Cystein-Synthase Aktivität Il , Nukleinsäuren kodierend eine Coenzym B12-abhängige Methionin-Synthase-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine Coenzym B12-unabhängige Methionin-Synthase-Aktivität, Nukleinsäuren kodie¬ rend eine Sulfat-Adenylyltransferase-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine Phospho- adenosin-Phosphosulfat-Reductase-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine Ferredo- xin-Sulfit-Reduktase-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine Ferredoxin NADPH- Reduktase Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine Ferredoxin-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend ein Protein der Sulfat-Reduktion RXA077, Nukleinsäuren kodierend ein Pro¬ tein der Sulfat-Reduktion RXA248, Nukleinsäuren kodierend ein Protein der Sulfat- Reduktion RXA247, Nukleinsäuren kodierend eine, RXA0655 Regulator undNuklein- säuren kodierend einen RXN2910 Regulator.
Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Expression dieser Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten o- der durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit erhöhter spezifischer Expressi¬ onsaktivität gemäß Ausführungsform ch) dadurch erreicht, dass man
dh1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus ein¬ bringt, so dass die Expression eines oder mehrerer dieser endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenen¬ falls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
dh2) ein oder mehrere dieser Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöh¬ ter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mik¬ roorganismus einbringt.
Eine weiter bevorzugte Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Methionin ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch verän¬ derten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine erhöhte Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Aspartatkinase-Aktivität, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität, Homoserin Dehydrogenase-Aktivität, Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase-Aktivität, 3-Phosphoglycerat Kinase- Aktivität, Pyruvat Carboxylase-Aktivität, Triosephosphat Isomerase-Aktivität, Homose- rin O-Acetyltransferase-Aktivität, Cystahionin-gamma-Synthase-Aktivität, Cystahionin- beta-Lyase-Aktivität Serin-Hydroxymethyltransferase-Aktivität, O-Acetylhomoserin- Sulfhydrylase-Aktivität, Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-Aktivität, Phosphoserin- Aminotransferase-Aktivität, Phosphoserin-Phosphatase-Aktivität, Seriπe Acetyl- Transferase-Aktivität, Cystein-Synthase-Aktivität, Cystein-Synthase Il -Aktivität, Coen- zym B12-abhängige Methionin-Synthase-Aktivität, Coenzym B12-unabhängige Methio- nin-Synthase-Aktivität, Sulfat-Adenylyltransferase-Aktivität, Phosphoadenosin- Phosphosulfat-Reductase-Aktivität, Ferredoxin-Sulfit-Reduktase-Aktivität, Ferredoxin NADPH-Reduktase Aktivität, Ferredoxin-Aktivität Aktivität Proteins der Sulfat- Reduktion RXA077, Aktivität eines Proteins der Sulfat-Reduktion RXA248, Aktivität eines Proteins der Sulfat-Reduktion RXA247, Aktivität eines RXA655-Regulators und Aktivität eines RXN2910-Regulators aufweisen
Eine weiter besonders bevorzugte Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Methionin ist dadurch gekennzeichnet, dass die gene¬ tisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine reduzier¬ te Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Homoserine-Kinase- Aktivität, Threonin-Dehydratase-Aktivität, Threonin Synthase-Aktivität, Meso-
Diaminopimelat D-Dehydrogenase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase- Aktivität, Pyruvat-Oxidase-Aktivität, Dihydrodipicolinat Synthase-Aktivität, Dihydrodipi- colinat Reduktase-Aktivität, und Diaminopicolinat Decarboxylase-Aktivität aufweisen.
Diese zusätzlichen, erhöhten oder reduzierten Aktivitäten mindestens einer der vorste¬ hend beschriebenen Aktivitäten können, müssen aber nicht durch eine erfindungsge¬ mäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität und/oder eine erfindungsgemäße Expressi¬ onseinheit verursacht sein.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Threonin durch Kultivie¬ rung von genetisch veränderten Mikroorganismen mit erhöhter oder verursachter Ex¬ pressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich zum Wildtyp, wobei man
ch) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheit, die die Expression der endoge¬ nen Gene reguliert, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder
dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expres¬ sionseinheiten oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit erhöhter spezi- fischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform ch) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind,
und wobei die Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend eine Aspartatkinase, Nukleinsäuren kodierend eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Nuklein¬ säuren kodierend eine 3-Phosphoglycerat Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Pyru- vat Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Triosephosphat Isomerase, Nuklein¬ säuren kodierend eine Homoserin-Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Threonin Synthase, Nukleinsäuren kodierend einen Threonin Exporter Carrier, Nukleinsäuren kodierend eine Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Transaldolase, Nukleinsäuren kodierend eine Transketoiase, Nukleinsäuren kodierend einer Malat-Quinon-Oxidoreductase, Nukleinsäuren kodierend eine 6- Phosphogluconat-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend einen Lysin-Exporter, Nukleinsäuren kodierend eine Biotin-Ligase, Nukleinsäuren kodierend eine Phosphoe- nolpyruvat-Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend ein Threonin Efflux-Protein, Nuklein¬ säuren kodierend eine Fruktose-1 ,6-bisphosphatase, Nukleinsäuren kodierend ein Op- cA Protein, Nukleinsäuren kodierend eine 1 -Phosphof ructokinase, Nukleinsäuren ko¬ dierend eine 6-Phosphofructokinase, und Nukleinsäuren kodierend eine Homoserin- Dehydrogenase
Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Expression dieser Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten o- der durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit erhöhter spezifischer Expressi- onsaktivität gemäß Ausführungsform ch) dadurch erreicht, dass man
dh1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus ein¬ bringt, so dass die Expression eines oder mehrerer dieser endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenen¬ falls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
dh2) ein oder mehrere dieser Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöh¬ ter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mik¬ roorganismus einbringt.
Eine weiter bevorzugte Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Threonin ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine erhöhte Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Aspartatkinase-Aktivität, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität, Glycerinal- dehyd-3-Phosphat Dehydrogenase-Aktivität, 3-Phosphoglycerat Kinase-Aktivität, Pyru- vat Carboxylase-Aktivität, Triosephosphat Isomerase-Aktivität, Threonin Synthase- Aktivität, Aktivität eines Threonin Export-Carriers, Transaldolase-Aktivität, Transketola- se-Aktivität, Glucose-6-Phosphat-dehydrogenase-Aktivität, Malat-Qinon- Oxidoreductase-Aktivität, Homoserin-Kinase-Aktivität, Biotin-Ligase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität, Threonin-Efflux-Protein-Aktivität, Protein OpcA-Aktivität, 1-Phosphofructokinase-Aktivität, 6-Phosphofructokinase-Aktivität, Fruk¬ tose 1 ,6 bisphosphatase-Aktivität, 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase und Homoserin- Dehydrogenase-Aktivität aufweisen.
Eine weiter besonders bevorzugte Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Threonin ist dadurch gekennzeichnet, dass die gene¬ tisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine reduzier¬ te Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Threonin Dehydratase-Aktivität, Homoserin O-Acetyltransferase-Aktivität, Serin- Hydroxymethyltransferase-Aktivität, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase-Aktivität, Meso- Diaminopimelat D-Dehydrogenase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-
Aktivität, Pyruvat-Oxidase-Aktivität, Dihydrodipicolinat Synthetase-Aktivität, Dihydrodi- picolinat Reduktase-Aktivität, Asparaginase-Aktivität, Aspartat-Decarboxylase-Aktivität, Lysin-Exporter-Aktivität, Acetolactat-Synthase-Aktivität , Ketol-Aid-Reductoisomerase- Aktivität , Branched chain aminotransferase- Aktivität , Coenzym B12-abhängige Methionin Synthase- Aktivität , Coenzym B12-unabhängige Methion Synthase- Aktivi¬ tät, Dihydroxy-acid Dehydratase- Aktivität und Diaminopicolinat Decarboxylase-Aktivität aufweisen.
Diese zusätzlichen, erhöhten oder reduzierten Aktivitäten mindestens einer der vorste- hend beschriebenen Aktivitäten können, müssen aber nicht durch eine erfindungsge¬ mäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität und/oder eine erfindungsgemäße Expressi¬ onseinheit verursacht sein.
Unter dem Begriff der „Aktivität" eines Proteins wird bei Enzymen die Enzymaktivität des entsprechenden Proteins, bei anderen Proteinen, beispielsweise Struktur oder Transport-Proteinen die physiologische Aktivität der Proteine verstanden.
Die Enzyme sind in der Regel in der Lage ein Substrat in ein Produkt umzuwandeln bzw. diesen Umwandlunsgschritt zu katalysieren.
Dementsprechend wird unter der „Aktivität" eines Enzyms die in einer bestimmten Zeit durch das Enzym umgesetzte Menge Substrat bzw. gebildete Menge Produkt verstan¬ den.
Bei einer erhöhten Aktivität im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Enzym die umgesetzte Menge Substrat bzw. die gebildete Menge Produkt erhöht.
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der „Aktivität" bei allen vorstehend und nachste¬ hend beschriebenen Aktivitäten mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der „Aktivität des Wildtyps".
Bei einer reduzierten Aktivität im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Enzym die umgesetzte Menge Substrat bzw. die gebildete Menge Produkt reduziert.
Unter einer reduzierten Aktivität wird vorzugsweise die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbin¬ dung oder Blockierung der Funktionalität diese Enzyms in einem Mikroorganismus ver¬ standen. Eine Reduzierung der Aktivität umfasst eine mengenmäßige Verringerung eines En¬ zyms bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen des Enzyms (d.h. fehlen¬ de Nachweisbarkeit der entsprechenden Aktivität oder fehlende immunologische Nachweisbarkeit des Enzyms). Vorzugsweise wird diß Aktivität im Mikroorganismus im Vergleich zum Wildtyp um mindestens 5 %, weiter bevorzugt um mindestens 20 %, weiter bevorzugt um mindestens 50 %, weiter bevorzugt um 100 % reduziert. Insbe¬ sondere meint "Reduzierung" auch das vollständigen Fehlen der entsprechenden Akti¬ vität.
Die Aktivität bestimmter Enzyme in genetisch veränderten Mikroorganismen sowie im Wildtyp und damit die Erhöhung oder Reduzierung der Enzymaktivität lassen sich nach bekannten Verfahren, wie beispielsweise Enzymassays ermitteln. Beispielsweise wird unter eine Pyruvatcarboxylase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Pyruvat in Oxaloacetat umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter einer Pyruvatcarboxylase-Aktivität die in einer bestimm¬ ten Zeit durch das Protein Pyruvatcarboxylase umgesetzte Menge Pyruvat bzw. gebil¬ dete Menge Oxaloacetat verstanden.
Bei einer erhöhten Pyruvatcarboxyiase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Pyruvatcarboxylase die umgesetzte Menge Pyruvat bzw. die gebildete Menge Oxaloacetat erhöht.
Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Pyruvatcarboxylase-Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter min¬ destens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der Pyruvatcarboxylase -Aktivität des Wildtyps.
Weiterhin wir beispielsweise unter eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität die Enzymaktivität einer Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-verstanden.
Unter einer Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Oxaloacetat in Phosphoenolpyruvat umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Phosphoenolpyruvat umgesetzte Menge Oxaloace¬ tat bzw. gebildete Menge Phosphoenolpyruvat verstanden.
Bei einer reduzierten Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase die umgesetzte Menge Oxaloacetat bzw. die gebildete Menge Phosphoenolpyruvat reduziert.
Eine Reduzierung der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität umfasst eine men- genmäßige Verringerung einer Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (d.h. fehlende Nachweisbarkeit von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität oder feh¬ lende immunologische Nachweisbarkeit der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase). Vorzugsweise wird die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp um mindestens 5 %, weiter bevorzugt um mindestens 20 %, weiter bevorzugt um mindestens 50 %, weiter bevorzugt um 100 % reduziert. Insbesondere meint "Re¬ duzierung" auch das vollständigen Fehlen der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase - Aktivität.
Die zusätzliche Erhöhung von Aktivitäten kann durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen auf Expressions- und Proteinebene oder durch Erhöhung der Genexpression von Nuk¬ leinsäuren kodierend die vorstehend beschriebenen Proteine gegenüber dem Wildtyp.
Die Erhöhung der Genexpression der Nukleinsäuren kodierend die vorstehend be¬ schriebenen Proteine gegenüber dem Wildtyp kann ebenfalls durch verschiedene We¬ ge erfolgen, beispielsweise durch Induzierung des Gens durch Aktivatoren oder wie vorstehend beschrieben durch Erhöhung der Promotoraktivität oder Erhöhung der Ex¬ pressionsaktivität oder durch Einbringen von einer oder mehrerer Genkopien in den Mikroorganismus.
Unter Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend ein Protein wird er¬ findungsgemäß auch die Manipulation der Expression der Mikroorganismus eigenen, endogenen Proteine verstanden.
Dies kann beispielsweise, wie vorstehend beschrieben durch Veränderung der Promo¬ tor- und/oder Expressionseinheits-Sequenzen der Gene erreicht werden. Eine solche Veränderung, die eine erhöhte Expressionsrate des Gens zur Folge hat, kann bei¬ spielsweise durch Deletion oder Insertion von DNA Sequenzen erfolgen.
Es ist, wie vorstehend beschrieben, möglich, die Expression der endogenen Proteine durch die Applikation exogener Stimuli zu verändern. Dies kann durch besondere phy¬ siologische Bedingungen, also durch die Applikation von Fremdsubstanzen erfolgen.
Zur Erzielung einer Erhöhung der Genexpression kann der Fachmann weitere unter¬ schiedliche Maßnahmen einzeln oder in Kombination ergreifen. So kann beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expres¬ sion verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Biontechnolo- gy 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Mo- rinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift 0472869, im US Patent 4,601 ,893, bei Schwarzer und Pühler (Biotechnology 9, 84-87 (1991), bei Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994), bei LaBarre et al. (Journal of Bac- teriology 175, 1001 -1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Ma- lumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A- 10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58..191-195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60 : 512-538 (1996) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Weiterhin kann es für die Produktion von biosynthetischen Produkten, insbesondere L- Lysin, L-Methionin und L-Threonin, vorteilhaft sein, neben der Expression bzw. Ver¬ stärkung eines Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eines der vorstehend beschriebenen Proteine durch Einbrin¬ gen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend ein entsprechendes Protein in den Mikroorganismus. Das Einbringen der Nukleinsäure kann chromsomal oder extrachro¬ mosomal erfolgen, also durch Erhöhung der Kopienzahl auf dem Chromosom und oder eine Kopie des Gens auf einem sich replizierenden Plasmid in dem Wirtsmikroorga¬ nismus.
Vorzugsweise erfolgt das Einbringen der Nukleinsäure, beispielsweise in Form einer Expressionskassete, enthaltend die Nukleinsäure, chromosomal, insbesondere durch die vorstehend beschriebene SacB-Methode.
Dazu kann prinzipiell jedes Gen, das eines der vorstehend beschriebenen Proteine kodiert verwendet werden.
Bei genomischen Nukleinsäure-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall das der Wirtsmikroorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Proteine zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.
Beispiele für die entsprechenden Gene sind in Tabelle 1 und 2 aufgelistet.
Vorzugsweise erfolgt die Reduzierung der vorstehend beschriebenen Aktivitäten in Mikroorganismen durch mindestens eines der nachfolgenden Verfahren:
• Einbringen mindestens einer sense-Ribonukleinsäuresequenz zur Induktion ei- ner Kosuppression oder einer deren Expression gewährleistenden Expressi¬ onskassette
• Einbringen mindestens eines DNA- oder Protein-bindenden Faktors gegen das entsprechede -Gen, -RNA oder -Protein oder einer dessen Expression gewähr- leistenden Expressionskassette
• Einbringen mindestens einer den RNA-Abbau bewirkenden viralen Nukleinsäu- resequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
• Einbringen mindestens eines Konstruktes zur Erzeugung eines Funktionsver¬ lustes, wie beispielsweise die Generierung von Stopp-Kodons oder eine Ver¬ schiebungen im Leseraster, an einem Gen beispielsweise durch Erzeugung ei¬ ner Insertion, Deletion, Inversion oder Mutation in einem Gen. Bevorzugt kön¬ nen Knockout-Mutanten mittels gezielter Insertion in das gewünschte Zielgen durch homologe Rekombination oder Einbringen von sequenzspezifischen
Nukleasen gegen das Zielgen generiert werden.
• Einbringen eines Promotors mit reduzierter Promotoraktivität oder einer Ex¬ pressionseinheit mit reduzierter Expressionsaktivität.
Dem Fachmann ist bekannt, dass auch weitere Verfahren im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Reduzierung seiner Aktivität oder Funktion eingesetzt werden können. Beispielsweise kann auch das Einbringen einer dominant-negativen Variante eines Proteins oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette vorteil- haft sein.
Dabei kann jedes einzelne dieser Verfahren eine Verminderung der Proteinmenge, mRNA-Menge und/oder Aktivität eines Proteins bewirken. Auch eine kombinierte An¬ wendung ist denkbar. Weitere Methoden sind dem Fachmann bekannt und können die Behinderung oder Unterbindung der Prozessierung des Proteins, des Transports des Proteins oder dessen mRNA, Hemmung der Ribosomenanlagerung, Hemmung des RNA-Spleißens, Induktion eines RNA abbauenden Enzyms und/oder Hemmung der Transiationselongation oder -termination umfassen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produkten wird vorzugsweise dem Kultivierungsschritt der genetisch veränderten Mikroorganismen ein Isolieren von biosynthetischen Produkten aus den Mikroorganismen oder/oder aus der Fermentationsbrühe angeschlossen. Diese Schritte können gleichzeitig und/oder vor- zugsweisie nach dem Kultivierungsschritt stattfinden.
Die erfindungsgemäßen genetisch veränderten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulauf¬ verfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zur Produk¬ tion von biosynthetischen Produkten, insbesondere L-Lysin, L-Methionin und L- Threonin, kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsme¬ thoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfah¬ renstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.
Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der je¬ weiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mik¬ roorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoff quellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spuren¬ elemente.
Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder CeI- lulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder an¬ dere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vor- teilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z. B. Sojaöl. Sonnenblumenöl. Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure. Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindun¬ gen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumch¬ lorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harn- stoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können ein¬ zeln oder als Mischung verwendet werden.
Anorganische Saizverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen
Als Schwefelquelle für die Herstellung von Feinchemikalien, insbesondere von Methio- nin, können anorganische Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikali- umhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen bei¬ spielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthogenat und Pyri- doxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Me- dienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Me¬ dienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbie¬ tern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und der¬ gleichen. Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1 ,5 bar und 1210C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zu¬ sammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder char- genweise hinzugegeben werden.
Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 150C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 400C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verän¬ dert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht läßt sich während der Anzucht durch Zu¬ gabe von basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefel¬ säure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabi- lität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 2O0C bis 45°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stun¬ den erreicht.
Die so erhaltenen Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-%.
Vorteilhaft ist außerdem auch, wenn die Fermentation zumindest am Ende, insbeson¬ dere jedoch über mindestens 30% der Fermentationsdauer zuckerlimitiert gefahren wird. Das heißt, dass während dieser Zeit die Konzentration an verwertbarem Zucker im Fermentationsmedium auf 0 bis 3 g/l gehalten, beziehungsweise abgesenkt wird.
Die Isolierung von biosynthetischen Produkten aus der Fermentationsbrühe und/oder den Mikroorganismen erfolgt in an sich bekannter Weise entsprechend den physika¬ lisch-chemischen Eigenschaften des biosynthetischen Wertprodukts und den biosyn¬ thetischen Nebenprodukten.
Die Fermentationsbrühe kann anschließend beispielsweise weiterverarbeitet werden. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmetho¬ den, wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Me¬ thoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. Anschließend kann die Fermentationsbrühe mit bekannten Methoden, wie z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, oder durch Nanofiltration, eingedickt beziehungsweise aufkon¬ zentriert werden. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Gefriertrocknung, Sprühtrocknung, Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfah¬ ren aufgearbeitet werden.
Es ist aber auch möglich die biosynthetischen Produkte, insbesonder L-Lysin, L- Methionin und L-Threonin, weiter aufzureinigen. Hierzu wird die produkthaltige Brühe nach dem Abtrennen der Biomasse einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Produkt oder die Verunreinigungen ganz oder teilweise auf dem Chromatographieharz zurückgehalten werden. Diese Chroma¬ tographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder ande¬ re Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiitration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.
Die biosynthetischen Produkte können in unterschiedlichen Formen anfallen, bei- spielsweise in Form ihrer Salze oder Ester.
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindung(en) kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Micro- biol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575- 581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biol¬ ogy, Bd. 17.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden nicht-limitierenden Beispiele näher be¬ schrieben: Beispiel 1. Konstruktion des Vektors pSKICat
Der Shuttle-Vektor pMTΪ (Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175: 4096-4103) wurde mit den Restriktionsenzymen Xhol und BamHI verdaut, anschließend mit den Klenow- Fragmenten behandelt und religiert. Das entstandene Plasmid wurde mit pMT1 -del bezeichnet. Der Vektor pMT1-del wurde mit den Restriktionsenzymen BgI Il und Xbal verdaut. Das 2,5 kb große Fragment enthält den pSR1 ori von Corynebacterium glu- tamicum und wurde in das ebenfalls mit BgIII und Xbal geschnitte 2 kb große Plaspo- son pTnMod-Okm (Dennis und Zylstra (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64: 2710-2715) ligiert. Der so erhaltenen Vektor wurde mit pSK1 bezeichnet. Das Fragment des Plasposon pTnMod-Okm trägt den pMB1 Replikationsorigin für Escherichia coli und einen Kanamycinresistenz Marker (Tn903). Das cat Gen ohne Promotor wurde mit Hilfe der Oligonukleotidprimer A (SEQ. ID. NO. 4) und B (SEQ. ID. NO. 5) mit dem Vektor pKK232-8 (SEQ. ID. NO. 3) als Template mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) nach Standardmethoden, wie in Innis et al. (1990) PCR Proto- kols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press beschrieben, ampiifiziert. Dieses PCR-Produkt wurde in den Vektor pSK1 ligiert, nachdem Vektor und Insert mit den Restriktionsenzymen BgIII und Kpnl verdaut worden waren. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pSKICat (Abbildung 1).
Oligonukleotidprimer A SEQ. ID. NO. 4 δ'-GGAAGATCTTTCAAGAATTCCCAGGCA-S' Oligonukleotidprimer B SEQ. ID. NO. 5 δ'-GGGGTACCTACCGTATCTGTGGGGGG-S'
Beispiel 2. Konstruktion des Plasmids pSK1 Ptac
Das Plasmid pKK223-3 SEQ. ID. NO. 6 enthält den tac Promotor (Pt30)- Dieser Promo- tor wurde über einen Verdau mit dem Restriktionsenzym BamHI isoliert und das Frag¬ ment in den mit BamHI linearisierten Vektor pSKICat SEQ ID kloniert. Der Plasmid erhielt die Bezeichnung pSK1 Ptac ( Abbildung 2).
Beispiel 3. Klonierung von P2.10 (SEQ. ID. NO. 1)
Die chromosomale DNA von Corynebacterium glutamicumAS019E12 wurden aus Zel¬ len der späten exponentiellen Phase nach der Methode von Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828 isoliert und anschließend partiell mit dem Restriktionsen- zym Sau3AI verdaut. Die resultierenden Fragmente mit einer Größe von 0,4 - 1 ,0 kb wurden in den mit dem Restriktionsenzym BamHI linearisierten Vektor pSKICat ligiert. Der Ligationsansatz wurde mit Elekroporation nach der Methode von Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175: 4096-4103 in Corynebacterium glutamicum AS019E12 trans¬ formiert. Die Zellen wurden auf Platten, die 5 //g/ml Chloramphenicol enthielten ausge- strichen. Plasmide von einzelnen Kolonien, die auf diesen Platten wuchsen, wurden isoliert und analysiert. Ein solches Plasmid war pSKICat P2-io, das den Promotor P2.i0 SEQ. ID. NO. 1 enthält. Dieser Promotor liegt im upstream-Bereich des Gens, das für eine Zuckerphosphat-Epimerase kodiert. Das Insert weist eine Größe von 208 bp auf.
4. Resistenz gegenüber Chloramphenicol in Corynebacterium glutamicum AS019E12
Zellen von Corynebacterium glutamicum, die nur das Plasmid pSK1 Cat (Abbildung 1 ) enthalten, sind nicht in der Lage auf MB- ( Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175: 4096- 4103) und MCGC- Ratten ( von der Osten et al. (1989) Biotechnol. Lett. 11: 11-16) mit einer Chloramphenicolkonzentraion von 5 //g/ml bei 300C zu wachsen. Das cat Gen wird nicht expremiert. Dagegen wachsen Zellen von Corynebacterium glutamicum, die das Plasmid pSK1CatPtac (Abbildung 2) enthalten, auf MB und MCGC-Platten mit einer Chloramphenicolkonzentration von 40 /yg/ml. Wachstum bei einer Chloramphenicol- konzentration größer als 40 //g/ml war entweder nur sehr schwach oder gar nicht zu beobachten. Zellen, die das Plasmid pSKICat P2-I0 enthalten, sind in der Lage, bei einer Chloramphenicolkonzentration von größer 40 μg auf MB- und MCGC-Platten zu wachsen.
5. Resistenz gegenüber Chloramphenicol in Escherichia coli
Zellen von Escherichia coli, die das Plasmid pSK1CatPtao (Abbildung 2) enthalten, wachsen auf LB-Platten (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning - A laboratory manual. CoId Spring Harbor Laboratory, 2πd ed., CoId Spring Harbor, N. Y.) mit einer Chloramphenicolkonzentration von 400 //g/ml. Wachstum bei einer Chloramphenicol¬ konzentration von 600 //g/ml war nicht zu beobachten. Zellen, die das Plasmid pSK1CatP2-io enthalten, sind in der Lage, bei einer Chloramphenicolkonzentration von 600 μg auf LB-Platten zu wachsen.
6. Bestimmung der Promotor-Stärke mit Hilfe der Chloramphenicol Transferase (CAT)- Aktivität
Die CAT-Aktivitäten von Corynebacterium glutamicum AS019E12 wurden bestimmt, um eine relative Stärke des Promotors P2-10 (SEQ. ID. NO. 1)zu bestimmen. Dafür wurden Rohextrakte nach der Methode von Jetten und Sinsky (1993) FEMS Microbiol. Lett. 111: 183-188 hergestellt. Die Aktivität der Chloramphenicol Acetytransferase (CAT) wurde nach der Methode von Shaw et al (1993) Methods Enzymol. 43: 737-755 bestimmt. Der Reaktionsansatz enthielt 100 mM Tris*HCI pH7,5, 1 mM DTNB, 0,1 mM Acetyl CoA, 0,25 mM Chloramphenicol und eine geeignete Menge an Enzym. Die Än¬ derungen der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 412 nm wurden gemessen. Die Proteinkonzentraion wurde mit der Bradford Methode (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254 analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
Abbildungen:
Figur 1 zeigt eine Plasmidkarte von pSKICat (A) und die Nukleotodsequenz der Bam- Hl Klonierungsstelle (B). Die unterstrichenen Sequenzen in B geben die Regionen wie- der, die für die Herstellung Sequenzierungsoligonukleotide genutzt wurden. Das Start Codon und die BamHI Klonierungsstelle sind gekennzeichnet.
Figur 2 zeigt ein Teil der Nukleotid Sequenz von pSK1Ptac. Der Promotor P130 ist kursiv dargestellt. Des weiteren sind die -35 und -10 Regionen, die RBS und das Start Co- don des cat-Gens gekennzeichnet.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer Nukleinsäure mit Promotoraktivität, enthaltend
A) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder
B) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nukleinsäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist oder C) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO.
1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder
D) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter A), B) oder C)
zur Transkription von Genen.
2. Verwendung einer Expressionseinheit, enthaltend eine Nukleinsäure mit Pro¬ motoraktivität gemäß Anspruch 1 und zusätzlich funktionell verknüpft eine Nukleinsäuresequenz, die die Translation von Ribonukleinsäuren gewährleis¬ tet, zur Expression von Genen.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionseinheit enthält:
E) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder F) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von
Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nukleinsäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist oder G) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO.
2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder H) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter E), F) oder G).
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionseinheit aus einer Nukleinsäure der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 besteht.
5. Nukleinsäure mit Promotoraktivität, enthaltend
A) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder
B) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 %
2 Fig. auf Nukleinsäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist oder C) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO.
1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder D) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter A), B) oder C),
mit der Maßgabe, dass die Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 ausgenommen ist.
6. Expressionseinheit, enthaltend eine Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß
Anspruch 5 und zusätzlich funktionell verknüpft eine Nukleinsäuresequenz, die die Translation von Ribonukleinsäuren gewährleistet.
7. Expressionseinheit nach Anspruch 6, enthaltend
E) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder
F) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nukleinsäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist oder G) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO.
2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder H) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter E), F) oder G),
mit der Maßgabe, dass die Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 ausgenommen ist.
8. Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der Transkriptionsrate von Ge¬ nen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp durch
a) Veränderung der spezifischen Promotoraktivität im Mikroorganismus von endogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , die die Transkription von endogenen Gene regulieren, im Vergleich zum Wildtyp oder
b) Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nuk¬ leinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 oder durch Nukleinsäu¬ ren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 mit veränderter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a), wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit Promo¬ toraktivität gemäß Anspruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 mit veränderter spezifischer Promotoraktivität gemäß Aus- führungsform a) dadurch erreicht wird, dass man
t>1) eine oder mehrere Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, in das Ge¬ nom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Nuklein¬ säure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit verän¬ derter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
b2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
b3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass man zur
Erhöhung oder Verursachung der Transkriptionsrate von Genen in Mikroorga¬ nismen im Vergleich zum Wildtyp
ah) die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus von endogenen Nuk- leinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , die die Transkription von endogenen Genen regulieren, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder
bh) die Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit erhöh- ter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) reguliert, wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit Promotor¬ aktivität gemäß Anspruch 1 mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) dadurch erreicht wird, dass man
bh1 ) eine oder mehrere Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch
1 , gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, in das Ge¬ nom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Nuk¬ leinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
bh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
bh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehre¬ re, zu transkribierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
12. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Reduzierung der Transkriptionsrate von Genen in Mikroorganismen im Ver- gleich zum Wildtyp
ar) die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus von endogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , die die Transkription der endogenen Gene regulieren, im Vergleich zum Wildtyp reduziert oder
br) Nukleinsäuren mit reduzierter spezifischer Promotoraktivität gemäß Aus¬ führungsform a) in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription endogene Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Nuk- leinsäure mit reduzierter Promotoraktivität erfolgt.
13. Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der Expressionsrate eines Gens in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp durch c) Veränderung der spezifischen Expressionsaktivität im Mikroorganismus von endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, die die Expression der endogenen Gene regulieren, im Vergleich zum Wildtyp o- der
d) Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expres¬ sionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit veränderter spezifischer Expressionsaktivi¬ tät gemäß Ausführungsform c), wobei die Gene im Bezug auf die Expres- sionseinheiten heterolog sind.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungs¬ form a) dadurch erreicht wird, dass man
d1) eine oder mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gege¬ benenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehre¬ rer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressions¬ einheiten erfolgt oder
d2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 o- der 3, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, er¬ folgt oder
d3) ein oder mehrere Nukieinsäurekonstrukte, enthaltend eine Expressions¬ einheit gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit veränderter spezifi¬ scher Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass man zur
Erhöhung oder Verursachung der Expressionsrate eines Gens in Mikroorga¬ nismen im Vergleich zum Wildtyp
ch) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, die die Expression der endogenen Gene regulieren, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder
dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinhei¬ ten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität gemäß
Ausführungsform a) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressi¬ onseinheiten heterolog sind.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungs¬ form a) dadurch erreicht wird, dass man
dh1 ) eine oder mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Ex- pressionsaktivität, erfolgt oder
dh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene un¬ ter der Kontrolle der endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Expressi¬ onseinheit gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter spe- zifischer Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder meh¬ rere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus ein¬ bringt.
17. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Reduzierung der Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp
er) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von endogenen, Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, die die Expression der endogenen Gene regulieren, im Vergleich zum Wildtyp reduziert oder
dr) Expressionseinheiten mit reduzierter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform er) in das Genom des Mikroorganismus ein- bringt, so dass die Expression endogener Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheiten mit reduzierter Expressionsaktivität erfolgt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend ein Prote¬ in aus den Biosyntheseweg von proteinogenen und nicht-proteinogenen Ami¬ nosäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Nukleotiden und Nukleosiden, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nukleinsäuren kodierend ein Prote- in aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nukleinsäuren kodie¬ rend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Diolen, Nukleinsäuren kodie¬ rend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Kohlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von aromatischen Verbindung, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzy¬ men, wobei die Gene gegebenenfalls weitere Regulationselemente enthalten können.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren ausgewählt sind aus der Gruppe Aspartatkinase, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Diaminopimelat- Dehydrogenase, Diaminopimelat-Decarboxylase, Dihydrodipicolinate- Synthetase, Dihydrodipicolinate-Reduktase, Glycerinaldehyd-3-Phosphat- Dehydrogenase, 3-Phosphoglycerat-Kinase, Pyruvat-Carboxylase, Trio- sephosphat-lsomerase, Transkriptioneller Regulator LuxR, Transkriptioneller Regulator LysR1 , Transkriptioneller Regulator LysR2, Malat-Quinon- Oxidoreduktase, Glucose-6-Phosphat-Deydrogenase, 6-Phosphogluconat- Dehydrognease, Transketolase, Transaldolase, Homoserin-O- Acetyltransferase, Cystahionin-gamma-Synthase, Cystahionin-beta-Lyase, Se- rin-Hydroxymethyltransferase, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase, Methylen- Tetrahydrofolat-Reduktase, Phosphoserin-Aminotransferase, Phosphoserin- Phosphatase, Serin-Acetyl-Transferase, Homoserin-Dehydrogenase, Homose- rin-Kinase, Threonin-Synthase, Threonin-Exporter-Carrier, Threonin- Dehydratase, Pyruvat-Oxidase, Lysin-Exporter, Biotin-Ligase, Cystein- Synthasel, Cystein-Synthase II, Coenzym B12-abhängige Methionin-Synthase, Coenzym B12-unabhängige Methionin-Synthase, Sulfatadenyltransferase Un¬ tereinheit 1 und 2, Phosphoadenosin Phosphosulfat Reduktase, Ferredoxin- sulfit-reductase, Ferredoxin NADP Reduktase, 3-Phosphoglycerat Dehydroge- nase, RXA00655 Regulator, RXN2910-Regulator, Arginyl-t-RNA-Synthetase,
Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Threonin Efflux-Protein, Serinhydroxy- methyltransferase, Fruktose-1 ,6-bisphosphatase, Protein der Sulfat-Reduktion RXA077, Protein der Sulfat-Reduktion RXA248, Protein der Sulfat-Reduktion RXA247, Protein OpcA, 1 -Phosphof ruktokinase und 6-Phosphof ruktokinase.
20. Expressionskassette, umfassend
a) mindestens eine Expressionseinheit gemäß Anspruch 2 oder 3 und
b) mindestens eine weitere, zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, und
c) gegebenenfalls weitere genetische Kontrollelemente,
wobei mindestens eine Expressionseinheit und eine weitere, zu exprimierende, Nukleinsäuresequenz funktionell miteinander verknüpft sind und die weitere, zu exprimierende, Nukleinsäuresequenz in Bezug auf die Expressionseinheit heterolog ist.
21. Expressionskassette nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere, zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist der Gruppe
Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von proteinoge¬ nen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Pro¬ tein aus dem Biosyntheseweg von Nukleotiden und Nukleosiden, Nukleinsäu¬ ren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosynthese¬ weg von Diolen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosynthese¬ weg von Konhlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Bio¬ syntheseweg von aromatischen Verbindung, Nukleinsäuren kodierend ein Pro- tein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäuren kodierend ein
Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodie¬ rend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzymen
22. Expressionskassette nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren ausgewählt sind aus der Gruppe Aspartatkinase, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Diaminopime- lat-Dehydrogenase, Diaminopimelat-Decarboxylase, Dihydrodipicolinate- Synthetase, Dihydrodipicolinate-Reduktase, Glycerinaldehyd-3-Phosphat-
Dehydrogenase, 3-Phosphoglycerat-Kinase, Pyruvat-Carboxylase, Trio- sephosphat-lsomerase, Transkriptioneller Regulator LuxR, Transkriptioneller Regulator LysR1 , Transkriptioneller Regulator LysR2, Malat-Quinon- Oxidoreduktase, Glucose-6-Phosphat-Deydrogenase, 6-Phosphogluconat- Dehydrognease, Transketolase, Transaldolase, Homoserin-O-
Acetyltransferase, Cystahionin-gamma-Synthase, Cystahionin-beta-Lyase, Se- rin-Hydroxymethyltransferase, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase, Methylen- Tetrahydrofolat-Reduktase, Phosphoserin-Aminotransferase, Phosphoserin- Phosphatase, Serin-Acetyl-Transferase, Homoserin-Dehydrogenase, Homose- rin-Kinase, Threonin-Synthase, Threonin-Exporter-Carrier, Threonin-
Dehydratase, Pyruvat-Oxidase, Lysin-Exporter, Biotin-Ligase, Cystein- Synthasel, Cystein-Synthase II, Coenzym B12-abhängige Methionin-Synthase, Coenzym B12-unabhängige Methionin-Synthase-Aktivität, Sulfatadenyltransfe- rase Untereinheit 1 und 2, Phosphoadenosin Phosphosulfat Reduktase, Ferre- doxin-sulfit-reductase, Ferredoxin NADP Reduktase, 3-Phosphoglycerat De¬ hydrogenase, RXA00655 Regulator, RXN2910-Regulator, Arginyl-t-RNA- Synthetase, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Threonin Efflux-Protein, Serin- hydroxymethyltransferase, Fruktose-1 ,6-bisphosphatase, Protein der Sulfat- Reduktion RXA077, Protein der Sulfat-Reduktion RXA248, Protein der Sulfat- Reduktion RXA247, Protein OpcA, 1 -Phosphof ruktokinase und 6-
Phosphofruktokinase
23. Expressionsvektor enthaltend eine Expressionskassette gemäss einem der Ansprüche 20 bis 22.
24. Genetisch veränderter Mikroorganismus, wobei die genetische Veränderung zu einer Veränderung oder Verursachung der Transkriptionsrate von mindes¬ tens einem Gen im Vergleich zum Wildtyp führt und bedingt ist durch
a) Veränderung der spezifischen Promotoraktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , die die Transkription mindestens eines endogenen Gens regu¬ liert oder b) Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nuk¬ leinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 oder durch Nukleinsäu¬ ren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 mit veränderter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a), wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.
25. Genetisch veränderter Mikroorganismus nach Anspruch 24, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganis¬ mus durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 mit veränderter spezi¬ fischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) dadurch erreicht wird, dass man
b1) eine oder mehrere Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, in das Ge¬ nom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Nuklein¬ säure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit verän¬ derter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
b2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
b3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
26. Genetisch veränderter Mikroorganismus nach Anspruch 24 oder 25 mit erhöh¬ ter oder verursachter Transkriptionsrate von mindestens einem Gen im Ver¬ gleich zum Wildtyp, dadurch gekennzeichnet, dass
ah) die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus von endogenen Nuk¬ leinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , die die Transkription von endogenen Genen regulieren, im Vergleich zum Wildtyp erhöht ist o- der bh) die Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit erhöh¬ ter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform ah) reguliert wird, wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.
27. Genetisch veränderter Mikroorganismus nach Anspruch 26, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganis¬ mus durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 mit veränderter spezi¬ fischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) dadurch erreicht wird, dass man
bh1) eine oder mehrere Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, in das Ge¬ nom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Nuk¬ leinsäure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
bh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder
bh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehre- re, zu transkribierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
28. Genetisch veränderter Mikroorganismus nach Anspruch 24 oder 25 mit redu¬ zierter Transkriptionsrate von mindetstens einem Gen im Vergleich zum Wild¬ typ, dadurch gekennzeichnet dass,
ar) die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus von mindestens ei¬ ner endogenen Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 , die die Transkription von mindestens einem, endogenen Gen reguliert, im Vergleich zum Wildtyp reduziert ist oder br) eine oder mehrere Nukleinsäuren mit reduzierter Promotoraktivität ge- mäßAusführungsform a) in das Genom des Mikrorganismus eingebracht wurden, so dass die Transkription mindestens eines endogenen Gens un¬ ter der Kontrolle der eingebrachten Nukleinsäure mit reduzierter Promotor- aktivität erfolgt.
29. Genetisch veränderter Mikroorganismus, wobei die genetische Veränderung zu einer Veränderung oder Verursachung der Expressionsrate mindestens ei¬ nes Gens im Vergleich zum Wildtyp führt und bedingt ist durch
c) Veränderung der spezifischen Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, die die Expression mindestens eines endogenen Gens reguliert, im Vergleich zum Wildtyp oder
d) Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expres¬ sionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit veränderter spezifischer Expressionsaktivi¬ tät gemäß Ausführungsform a), wobei die Gene im Bezug auf die Expres- sionseinheiten heterolog sind.
30. Genetisch veränderter Mikroorganismus nach Anspruch 29, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressi- onseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit veränderter spezifischer Expressi¬ onsaktivität gemäß Ausführungsform a) dadurch erreicht wird, dass man
d1 ) eine oder mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gege¬ benenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehre¬ rer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressions¬ einheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit veränderter spezi¬ fischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
d2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 o- der 3, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, er¬ folgt oder d3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Expressions¬ einheit gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit veränderter spezifi¬ scher Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
31. Genetisch veränderter Mikroorganismus nach Anspruch 29 oder 30 mit erhöh¬ ter oder verursachter Expressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich zum Wildtyp, dadurch gekennzeichnet, dass man
ch) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, die die Expression der endogenen Gene reguliert, im Vergleich zum Wildtyp er¬ höht oder
dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinhei¬ ten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform a) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressi¬ onseinheiten heterolog sind.
32. Genetisch veränderter Mikroorganismus nach Anspruch 31 , dadurch gekenn¬ zeichnet, dass die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressi¬ onseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit erhöhter spezifischer Expressions- aktivität gemäß Ausführungsform a) dadurch erreicht wird, dass man
dh1 ) eine oder mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, ge¬ gebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder meh- rerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressi¬ onseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder
dh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, er¬ folgt oder dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Expressions¬ einheit gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter spezifi¬ scher Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.
33. Genetisch veränderter Mikroorganismus nach Anspruch 29 oder 30 mit redu¬ zierter Expressionsrate von mindetstens einem Gen im Vergleich zum Wildtyp, dadurch gekennzeichnet dass,
er) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen Expressionseinheit gemäß Anspruch 2 oder 3, die die Expression von mindestens einem edogenen Gen reguliert, im Vergleich zum Wildtyp reduziert ist oder
dr) eine oder mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit re¬ duzierter Expressionsaktivität in das Genom des Mikrorganismus einge¬ bracht wurden, so dass die Expression mindestens eines Gens unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheit gemäß Anspruch 2 oder 3 mit reduzierter Expressionsaktivität erfolgt.
34. Genetisch veränderter Mikroorganismus, enthaltend eine Expressionseinheit gemäß Anspruch 2 oder 3 und funktionell verknüpft ein zu eprimierendes Gen, wobei das Gen im Bezug auf die Expressionseinheit heterolog ist.
35. Genetisch veränderter Mikroorganismus nach Anspruch 34, enthaltend eine
Expressionskasette gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22.
36. Genetisch veränderter Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 24 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nuk- leinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Nukleotiden und Nukleosiden, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nuk¬ leinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Diolen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Konhlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosynthese¬ weg von aromatischen Verbindung, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzymen, wobei die Gene gegebenenfalls wei¬ tere Regulationselemente enthalten können.
37. Genetisch veränderter Mikroorganismus nach Anspruch 36, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Proteine aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren aus¬ gewählt sind aus der Gruppe Aspartatkinase, Aspartat-Semialdehyd- Dehydrogenase, Diaminopimelat-Dehydrogenase, Diaminopimelat- Decarboxylase, Dihydrodipicolinate-Synthetase, Dihydrodipicolinate- Reduktase, GIycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, 3-Phosphoglycerat- Kinase, Pyruvat-Carboxylase, Triosephosphat-Isomerase, Transkriptioneller
Regulator LuxR, Transkriptioneller Regulator LysR1 , Transkriptioneller Regula¬ tor LysR2, Malat-Quinon-Oxidoreduktase, Glucose-6-Phosphat-Deydrogenase, 6-Phosphogluconat-Dehydrognease, Transketolase, Transaldolase, Homose- rin-O-Acetyltransferase, Cystahionin-gamma-Synthase, Cystahionin-beta- Lyase, Serin-Hydroxymethyltransferase, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase,
Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase, Phosphoserin-Aminotransferase, Phosphoserin-Phosphatase, Serin-Acetyl-Transferase, Homoserin- Dehydrogenase, Homoserin-Kinase, Threonin-Synthase, Threonin-Exporter- Carrier, Threonin-Dehydratase, Pyruvat-Oxidase, Lysin-Exporter, Biotin- Ligase, Cystein-Synthasel, Cystein-Synthase II, Coenzym B12-abhängige
Methionin-Synthase, Coenzym B12-unabhängige Methionin-Synthase- Aktivität, Sulfatadenyltransferase Untereinheit 1 und 2, Phosphoadenosin Phosphosulfat Reduktase, Ferredoxin-sulfit-reductase, Ferredoxin NADP Re¬ duktase, 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase, RXA00655 Regulator, RXN2910- Regulator, Arginyl-t-RNA-Synthetase, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase,
Threonin Efflux-Protein, Serinhydroxymethyltransferase, Fruktose-1 ,6- bisphosphatase, Protein der Sulfat-Reduktion RXA077, Protein der Sulfat- Reduktion RXA248, Protein der Sulfat-Reduktion RXA248, Protein OpcA, 1- Phosphofruktokinase und 6-Phosphofruktokinase.
38. Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produkten durch Kultivierung von genetisch veränderten Mikroorganismen gemäß einem der Ansprüche 24 bis 37.
39. Verfahren zur Herstellung von Lysin durch Kultivierung von genetisch verän¬ derten Mikroorganismen gemäß einem der Ansprüche 24, 25, 31 oder 32, da¬ durch gekennzeichnet, dass die Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nuk¬ leinsäuren kodierend eine Aspartatkinase, Nukleinsäuren kodierend eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Diami- nopimelat- Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Diaminopimelat- Decarboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Dihydrodipicolinate-Synthetase, Nukleinsäuren kodierend eine Dihydridipicolinate-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine Θlycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine 3-Phosphoglycerat-Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Py- ruvat Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Triosephosphat-Isomerase,
Nukleinsäuren kodierend einen Transkriptionellen Regulator LuxR, Nuklein¬ säuren kodierend einen Transkriptionellen Regulator LysR1 , Nukleinsäuren kodierend einen Transkriptionellen Regulator LysR2, Nukleinsäuren kodierend eine Malat-Quinon-Oxodoreduktase, Nukleinsäuren kodierend eine Glucose-6- Phosphat-Deydrognease, Nukleinsäuren kodierend eine 6-Phosphogluconat-
Dehydrognease, Nukleinsäuren kodierend eine Transketolase, Nukleinsäuren kodierend eine Transaldolase, Nukleinsäuren kodierend einen Lysin Exporter, Nukleinsäuren kodierend eine Biotin-ügase, Nukleinsäuren kodierend eine Ar- ginyl-t-RNA-Synthetase, Nukleinsäuren kodierend eine Phosphoenolpyruvat- Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Fruktose-1 ,6-bisphosphatase,
Nukleinsäuren kodierend ein Protein OPCA, Nukleinsäuren kodierend eine 1 - Phosphofructokinase und Nukleinsäuren kodierend eine 6- Phosphofructokinase,
40. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine erhöh¬ te Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Aspartatkinase-Aktivität, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität, Dia- minopimelat- Dehydrogenase-Aktivität, Diaminopimelat-Decarboxylase- Aktivität, Dihydrodipicolinate-Synthetase-Aktivität, Dihydridipicolinate-
Reduktase-Aktivität, Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase-Aktivität, 3- Phosphoglycerat-Kinase-Aktivität, Pyruvat Carboxylase-Aktivität, Trio- sephosphat-lsomerase-Aktivität, Aktivität des Transkriptionellen Regulators LuxR, Aktivität des Transkriptionellen Regulators LysR1 , Aktivität des Transkriptionellen Regulators LysR2, Malat-Quinon-Oxodoreduktase-Aktivität,
Glucose-6-Phosphat-Deydrognease-Aktivität, 6-Phosphogluconat- Dehydrognease-Aktivität, Transketolase-Aktivität, Transaldolase-Aktivität, Ly- sin-Exporter-Aktivität, Arginyl-t-RNA-Synthetase-Aktivität, Phosphoenolpyru- vat-Carboxylase-Aktivität, Fruktose-1 ,6-bisphosphatase-Aktivität, Protein Op- cA-Aktivität, 1-Phosphofructokinase-Aktivität, 6-Phosphofructokinase-Aktivität und Biotin-Ligase-Aktivität aufweisen.
41. Verfahren nach Anspruch 39 oder 40, dadurch gekennzeichnet, dass die gene¬ tisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine reduzierte Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Threonin Dehydratase-Aktivität, Homoserin O-Acetyltransferase- Aktivität, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat- Carboxykinase-Aktivität, Pyruvat-Oxidase-Aktivität, Homoserine-Kinase- Aktivität, Homoserin-Dehydrogenase-Aktivität, Threonin-Exporter-Aktivität, Threonin-Efflux-Protein-Aktivität, Asparaginase-Aktivität, Aspartat-
Decarboxylase-Aktivität und Threonin-Synthase-Aktivität aufweisen.
42. Verfahren zur Herstellung von Methionin durch Kultivierung von genetisch ver¬ änderten Mikroorganismen gemäß einem der Ansprüche 24, 25, 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nuk¬ leinsäuren kodierend eine Aspartatkinase, Nukleinsäuren kodierend eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Homo¬ serin Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Glycerinaldehyd-3- Phosphat Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine 3-Phosphoglycerat Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Pyruvat Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Triosephosphat Isomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Ho¬ moserin O-Acetyltransferase, Nukleinsäuren kodierend eine Cystahionin- gamma-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Cystahionin-beta-Lyase, Nukleinsäuren kodierend eine Serin-Hydroxymethyltransferase, Nukleinsäuren kodierend eine O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase, Nukleinsäuren kodierend ei¬ ne Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine Phosphoserin-Aminotransferase, Nukleinsäuren kodierend eine Phosphoserin- Phosphatase, Nukleinsäuren kodierend eine Serine Acetyl- TransferaseNukleinsäuren kodierend eine Cystein-Synthase I, Nukleinsäuren kodierend eine Cystein-Synthase Il , Nukleinsäuren kodierend eine Coenzym
B12-abhängige Methionin-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Coenzym B12-unabhängige Methionin-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Sulfat- Adenylyltransferase, Nukleinsäuren kodierend eine Phosphoadenosin- Phosphosulfat-Reductase, Nukleinsäuren kodierend eine Ferredoxin-Sulfit- Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine Ferredoxin NADPH-Reduktase,
Nukleinsäuren kodierend eine Ferredoxin-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend ein Protein der Sulfat-Reduktion RXA077, Nukleinsäuren kodierend ein Protein der Sulfat-Reduktion RXA248, Nukleinsäuren kodierend ein Protein der Sulfat- Reduktion RXA247, Nukleinsäuren kodierend einen RXA0655 Regulator und Nukleinsäuren kodierend einen RXN2910 Regulator.
43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine erhöh¬ te Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Aspartatkinase-Aktivität, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität, Ho- moserin Dehydrogenase-Aktivität, Glycerinaidehyd-3-Phosphat Dehydrogena- se-Aktivität, 3-Phosphoglycerat Kinase-Aktivität, Pyruvat Carboxylase-Aktivität, Triosephosphat Isomerase-Aktivität, Homoserin O-Acetyltransferase-Aktivität, Cystahionin-gamma-Synthase-Aktivität, Cystahionin-beta-Lyase-Aktivität Se- rin-Hydroxymethyltransferase-Aktivität, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase-
Aktivität, Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-Aktivität, Phosphoserin- Aminotransferase-Aktivität, Phosphoserin-Phosphatase-Aktivität, Serin Acetyl- Transferase-Aktivität, Cystein-Synthase Aktivität I-Aktivität, Cystein-Synthase Aktivität II, Coenzym B12-abhängige Methionin-Synthase-Aktivität, Coenzym B12-unabhängige Methionin-Synthase-Aktivität, Sulfat-Adenylyltransferase-
Aktivität, Phosphoadenosin-Phosphosulfat-Reductase-Aktivität, Ferredoxin- Sulfit-Reduktase-Aktivität, Ferredoxin NADPH-Reduktase Aktivität, Ferredoxin- Aktivität, Aktivität Proteins der Sulfat-Reduktion RXA077, Aktivität eines Prote¬ ins der Sulfat-Reduktion RXA248, Aktivität eines Proteins der Sulfat-Reduktion RXA247, Aktivität eines RXA655-Regulators und Aktivität eines RXN2910-
Regulators aufweisen.
44. Verfahren nach Anspruch 42 oder 43, dadurch gekennzeichnet, dass die gene¬ tisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine reduzierte Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der
Gruppe Homoserine-Kinase-Aktivität, Threonin-Dehydratase-Aktivität, Threo- nin Synthase-Aktivität, Meso-Diaminopimelat D-Dehydrogenase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität, Pyruvat-Oxidase-Aktivität, Di- hydrodipicolinat Synthase-Aktivität, Dihydrodipicolinat Reduktase-Aktivität und Diaminopicolinat Decarboxylase-Aktivität aufweisen.
45. Verfahren zur Herstellung von Threonin durch Kultivierung von genetisch ver¬ änderten Mikroorganismen gemäß einem der Ansprüche 24, 25, 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nuk- leinsäuren kodierend eine Aspartatkinase, Nukleinsäuren kodierend eine
Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Glyceri- naldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine 3- Phosphoglycerat Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Pyruvat Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Triosephosphat Isomerase, Nukleinsäuren ko- dierend eine Homoserin-Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Threonin
Synthase, Nukleinsäuren kodierend einen Threonin Exporter Carrier, Nuklein¬ säuren kodierend eine Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Transaldolase, Nukleinsäuren kodierend eine Transketolase, , Nukleinsäuren kodierend einer Malat-Quinon-Oxidoreductase, Nukleinsäuren kodierend eine 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend einen Lysin-Exporter, Nukleinsäuren kodierend eine Biotin-Ligase, , Nuklein¬ säuren kodierend eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Nukleinsäuren ko¬ dierend ein Threonin Efflux-Protein, Nukleinsäuren kodierend eine Fruktose- 1 ,6-bisphosphatase, Nukleinsäuren kodierend ein OpcA Protein, Nukleinsäu- ren kodierend eine 1-Phosphofructokinase, Nukleinsäuren kodierend eine 6-
Phosphofructokinase, und Nukleinsäuren kodierend eine Homoserin- Dehydrogenase
46. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine erhöh¬ te Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Aspartatkinase-Aktivität, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität, GIy- cerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase-Aktivität, 3-Phosphoglycerat Kinase- Aktivität, Pyruvat Carboxylase-Aktivität, Triosephosphat Isomerase-Aktivität, Threonin Synthase-Aktivität, Aktivität eines Threonin Export-Carriers, Transal- dolase-Aktivität, Transketolase-Aktivität, Glucose-6-Phosphat-dehydrogenase- Aktivität, Malat-Qinon-Oxidoreductase-Aktivität, Homoserin-Kinase-Aktivität, Biotin-Ligase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität, Threonin- Efflux-Protein-Aktivität, Protein OpcA-Aktivität, 1 -Phosphof ructokinase- Aktivität, 6-Phosphofructokinase-Aktivität, Fruktose 1 ,6 bisphosphatase-
Aktivität, 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase und Homoserin-Dehydrogenase- Aktivität aufweisen.
47. Verfahren nach Anspruch 45 oder 46, dadurch gekennzeichnet, dass die gene- tisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine reduzierte Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Threonin Dehydratase-Aktivität, Homoserin O-Acetyltransferase- Aktivität, Serin-Hydroxymethyltransferase-Aktivität, O-Acetylhomoserin- Sulfhydrylase-Aktivität, Meso-Diaminopimelat D-Dehydrogenase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität, Pyruvat-Oxidase-Aktivität, Di- hydrodipicolinat Synthetase-Aktivität, Dihydrodipicolinat Reduktase-Aktivität, Asparaginase-Aktivität, Aspartat-Decarboxylase-Aktivität, Lysin-Exporter- Aktivität, Acetolactat-Synthase-Aktivität , Ketol-Aid-Reductoisomerase- Aktivi¬ tät, Branched chain aminotransferase- Aktivität, Coenzym B12-abhängige Methionin Synthase- Aktivität, Coenzym B12-unabhängige Methion Synthase-
Aktivität, Dihydroxy-acid Dehydratase- Aktivität und Diaminopicolinat Decarbo- xylase-Aktivität aufweisen.
48. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 bis 47, dadurch gekennzeichnet, dass die biosynthetischen Produkte nach und/oder während des Kultivierungs- Schrittes aus dem Kultivierungsmedium isoliert und gegebenenfalls aufgerei¬ nigt werden.
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