ES2380000T3 - Promotores múltiples y su uso para la expresión de genes - Google Patents

Abstract

Bacteria corineforme genéticamente modificada, transformada con al menos un vector que contiene al menos un casete de expresión, en cuyo caso el casete de expresión comprende en dirección 5' -3' un módulo de secuencia de la siguiente fórmula general II: 5' -P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3' (II) Donde n representa un valor de número entero de 0 a 10, Ax y Ay son iguales o diferentes y representan un enlace químico o una secuencia de ácido nucleico enlazante; P1, Px y Py codifican secuencias de promotores iguales o diferentes derivadas de bacterias corineformes iguales o diferentes, que comprenden al menos un segmento que enlaza polimerasa de ARN; y al menos Py comprende un segmento de secuencia terminal 3' que facilita el enlace ribosómico, G representa al menos una secuencia de ácido nucleico codificante que está enlazada funcionalmente con la secuencia regulatoria ubicada corriente arriba de 5'.

Description

Promotores múltiples y su uso para la expresión de genes

La presente invención se refiere a una bacteria corineforme genéticamente modificada, transformada con al menos un vector que contiene al menos un casete de expresión, en cuyo caso el casete de expresión en dirección 5’ - 3’ 5 comprende un módulo de secuencia de la siguiente fórmula general II:

5’ -P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3’ (II)

donde

n representa un valor de número entero de 0 a 10,

Ax y Ay son iguales o diferentes y representan un enlace químico o una secuencia de ácido nucleico – enlazadora;

10 P1, Px y Py representan secuencias promotoras iguales o diferentes derivadas de bacterias corineformes iguales o diferentes que comprenden al menos un segmento que enlaza polimerasa-ARN; y al menos Py comprende un segmento de secuencia 3’ –terminal, que interviene en el enlace de ribosoma,

G representa al menos una secuencia de ácido nucleico codificante que está conectada funcionalmente con la secuencia regulatoria situada 5’ - corriente arriba;

15 así como a procesos para la preparación de productos biosintéticos mediante el cultivo de la bacteria corineforme genéticamente modificada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Diferentes productos biosintéticos se preparan mediante procesos metabólicos naturales en las células y se usan en muchas ramas de la industria, incluida la industria de productos alimenticios, de forrajes y piensos, de cosméticos,

20 de comida para animales y alimento para humanos. Estas sustancias, que se denominan en conjunto como productos de la química fina / proteínas, comprenden, entre otros, ácidos orgánicos tanto aminoácidos proteinogénicos como también

no proteinogénicos, nucleótidos y nucleósidos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, así como proteínas y enzimas. Su producción se efectúa a gran escala de la

25 manera más conveniente por medio del cultivo de cepas de bacterias o de otros microorganismos que se desarrollaron para producir y secretar grandes cantidades de la sustancia deseada. Para este propósito organismos particularmente adecuados son bacterias corineformes, bacterias gram positivas no patógenas.

Es conocido que pueden producirse aminoácidos mediante fermentación de cepas de bacterias corineformes, principalmente Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia se trabaja permanentemente en el 30 mejoramiento de los métodos de producción. Los mejoramientos del método pueden referirse a medidas industriales de fermentación, como por ejemplo agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios de nutrición como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o el procesamiento para elaborar un producto, por ejemplo mediante cromatografía de intercambio iónico aunque también secamiento por pulverización,

o las propiedades de desempeño intrínsecas del microorganismo mismo.

35 Desde hace unos años se emplean igualmente métodos de la tecnología de ADN recombinante para el mejoramiento de cepas de Corynebacterium que producen productos de química fina/proteínas, amplificando genes individuales e investigando el efecto en la producción de productos de química fina / proteínas.

Otras formas para desarrollar un método para la producción de productos de química fina o proteínas o para elevar o mejorar la productividad de un método ya existente para la producción de productos de química fina o proteínas

40 comprenden el incremento o la modificación de la expresión de uno o varios genes y/o la influencia de la traducción de un ARNm mediante secuencias adecuadas de polinucleótidos. La influencia puede comprender en este contexto el incremento, la reducción o también otros parámetros de la expresión de los genes, como patrón temporal de expresión.

El experto en la materia conoce diferentes componentes de secuencias de regulación bacterianas. Se distinguen los

45 puntos de enlace de reguladores, llamados también operadores, los puntos de enlace de ARN-polimerasaholoenzimas, también llamadas regiones 35 y 10, y el sitio de enlace de ARN 16S ribosómico, también llamado sitio de enlace ribosómico (RBS) o llamado también secuencia Shine-Dalgarno.

En la bibliografía (E. coli y S. typhimurium, Neidhardt F.C. 1995 ASM Press) se describe que tanto la composición de la secuencia de polinucleótido de la secuencia Shine-Dalgarno, la sucesión de secuencia de las bases, pero también la distancia de una secuencia de polinucleótido que está contenida en la secuencia Shine-Dalgarno hasta el codón de inicio, tienen una influencia esencial en la velocidad de la traducción.

Las secuencias de ácido nucleico con actividad de promotor pueden influir de manera diferente la formación de ARNm. Los promotores cuyas actividades son independientes de la fase fisiológica de crecimiento del organismo se llaman constitutivos. Otros promotores a su vez reaccionan a estímulos externos químicos y físicos, como oxígeno, metabolitos, calor, pH, etc. A su vez, otros muestran en diferentes fases de crecimiento una fuerte dependencia de su actividad. Por ejemplo, en la bibliografía se describen promotores que muestran una actividad particularmente pronunciada durante la fase de crecimiento exponencial de los microorganismos, aunque también en la fase estacionaria del crecimiento microbiano. Ambas características de los promotores pueden tener una influencia favorable en la productividad para una producción de productos de química fina y proteínas, según la ruta metabólica.

En especies de Corynebacterium podían aislarse ya aquellas secuencias que pueden utilizarse para un incremento o un debilitamiento de la expresión génica. Estos promotores regulados pueden incrementar o reducir la velocidad con la que un gen se transcribe, independientemente de las condiciones internas y/o externas de la célula. La presencia de un factor determinado, conocido como inductor, puede estimular en parte la velocidad de la transcripción del promotor. Los inductores puede influenciar directa, pero también indirectamente, la transcripción del promotor. Otra clase de factores conocidos como supresores está en capacidad de reducir, pero también de inhibir, la transcripción, del promotor. Tal como los inductores también, los supresores también pueden actuar directa o indirectamente. Sin embargo, también se conocen promotores que se regulan mediante la temperatura. De esta manera el nivel de transcripción de tales promotores puede elevarse o atenuarse elevando la temperatura de crecimiento por encima de la temperatura normal de crecimiento de la célula.

Hasta el día de hoy se ha descrito una cantidad baja de promotores de C. Glutamicum. El promotor del gen de malato-sintasa de C. Glutamicum se describió en DE-A- 44 40 118. Este promotor se inserta corriente arriba de un gen estructural que codifica una proteína. Después de la transformación de una estructura así en una bacteria corineforme, se regula la expresión del gen estructural insertado corriente abajo del promotor. La expresión del gen estructural se induce tan pronto se adiciona al medio un inductor correspondiente.

Reinscheid et al., Microbiology 145:503 (1999) han descrito una fusión de transcripción entre el promotor pta-ack de

C. glutamicum y un gen reportero (cloramfenicol acetiltransferasa). Las células de C. Glutamicum que contienen una fusión de transcripción así, tienen una expresión elevada del gen reportero al crecer en medio que contiene acetato. Al compararse con éstas, las células transformadas que crecían en glucosa no mostraron expresión incrementada de este gen reportero.

En Patek et al., Microbiology 142:1297 (1996) se describieron algunas secuencias de ADN a partir de C. glutamicum, las cuales pueden reforzar la expresión de de un gen reportero en células de C. glutamicum. Estas secuencias se compararon entre sí para definir secuencias de consenso para promotores de C. Glutamicum.

Otras secuencias de ADN de C. glutamicum, las cuales pueden utilizarse para la regulación de la expresión génica se habían descrito en la WO 02/40679. Estos polinucleótidos aislados representan unidades de expresión de corynebacterium glutamicum, las cuales pueden utilizarse o bien para el incremento o, no obstante, para la reducción de una expresión de gen. Además, en este documento se describen plásmidos recombinantes en los que se asocian las unidades de expresión de corynebacterium glutamicum con genes heterólogos. Los métodos aquí descritos, la fusión de un promotor de corynebacterium glutamicum con un gen heterólogo, pueden emplearse, entre otras, para la regulación de los genes de la biosíntesis de aminoácidos.

De las solicitudes de patente más antiguas, no publicadas previamente, DE-A-103 59 594, DE-A-103 59 595, DE-A103 59 660 y DE-A-10 2004 035 065 se conocen promotores individuales especiales de C. glutamicum.

Descripción breve de la invención

El objetivo fundamental de la invención era suministrar más bacterias corineformes genéticamente modificadas que se transforman con un vector que contiene un casete de expresión. Estas bacterias corineformes genéticamente modificadas tienen propiedades ventajosas con respecto a la expresión de determinados genes. El objetivo se logró de acuerdo con la invención proporcionando una bacteria corineforme genéticamente modificada, transformada con al menos un vector que contienen al menos un casete de expresión, en cuyo caso el casete de expresión comprende un módulo de secuencia en dirección 5’ - 3’ de la siguiente fórmula general:

5’ -P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3’ (II)

donde n representa un valor de número entero de 0 a 10, Ax y Ay son iguales o diferentes y representan un enlace químico o una secuencia de enlazante-ácido nucleico; P1, Px y Py codifican secuencias de promotor iguales o diferentes derivadas de bacterias corineformes iguales o

diferentes, que comprenden al menos un segmento que enlaza ARN-polimerasa; y al menos Py comprende un

segmento de secuencia 3’-terminal, que interviene en el enlace de ribosoma, G representa al menos una secuencia de ácido nucleico codificante, la cual está unida funcionalmente con la secuencia regulatoria situada 5’ – corriente arriba.

Según una forma de realización, P1, Px y Py se derivan de bacterias corineformes iguales o diferentes.

Según una forma de realización preferida, P1, Px y Py se derivan respectivamente de una secuencia continua de 35 a 500 residuos de nucleótido, preferible 35 a 300 residuos de nucleótido, aún más preferible 35 a 210 residuos de nucleótido y muy particularmente preferible 35 a 100 residuos de nucleótidos, la cual se encuentra en el genoma del organismo 5’-corriente arriba de la secuencia codificante para una proteína, por ejemplo para una proteína que interviene en una vía de biosíntesis del organismo.

Según una forma preferida de realización, P1, Px y Py de la unidad de expresión se seleccionan independientemente entre sí entre secuencias de promotor para la secuencia codificante de una proteína con alta abundancia en una bacteria corineforme, como por ejemplo en una del género corynebacterium o brevibacterium, como por ejemplo de una especie o de una cepa según la lista en la tabla 3.

Adicionalmente, entre las secuencias del promotor pueden seleccionarse secuencias de promotor, individuales o todas ellas, para la secuencia codificante de una proteína listada en la tabla 1 y que participa en la biosíntesis de aminoácido de un microorganismo. Pero al menos uno de los promotores del casete de expresión debe tener en tal caso una alta abundancia, tal como aquí se define.

Según otra forma preferida de realización, P1, Px y Py del casete de expresión se seleccionan independientemente entre sí entre las secuencias de nucleótidos representadas en la figura 1, o como más tarde aún se explicará, se derivan de SEQ ID NO:1 (pGRO), SEQ ID NO:2 (pEFTs), SEQ ID NO:3 (pEFTu) y SEQ ID NO: 4 (pSOD).

Según otra forma de realización, P1, Px y Py del casete de expresión se seleccionan independientemente entre sí entre los promotores fuertes constitutivos o regulables.

La bacteria de la invención contiene un casete de expresión que comprende un módulo de secuencia en dirección 5’-3’ de la siguiente fórmula general II:

5’-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3’ (II)

donde

n, Ax, Ay, P1, Px y Py son tal como se definieron arriba y G representa al menos una secuencia de ácido nucleico codificante, la cual está unida funcional u operativamente con la secuencia regulatoria situada 5’-corriente arriba. Según una forma preferida de realización del casete de expresión G se selecciona entre a) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de aminoácidos proteinogénicos y no

proteinogénicos, b) ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de nucleótidos y nucleósidos, c) ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de ácidos orgánicos, d) ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de lípidos y ácidos grasos, e) ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de dioles, f) ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de carbohidratos,

g) ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de compuestos aromáticos,

h) ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de vitaminas,

i) ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de cofactores,

j) ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de enzimas, y

k) ácidos nucleicos que codifican una proteína del metabolismo central.

Según una forma particularmente preferida de realización del casete de expresión G se selecciona entre ácidos nucleicos que codifican proteínas a partir de la vía de biosíntesis de aminoácidos, seleccionados entre cinasa de aspartato, deshidrogenasa de semialdehído de aspartato, deshidrogenasa de diaminopimelato, descarboxilasa de diaminopimelato, sintetasa de dihidrodipicolinato, reductasa de dihidrodipicolinato, deshidrogenasa de glicerinaldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, cinasa de 3-fosfoglicerato, carboxilasa de piruvato, isomerasa de triosafosfato, regulador transcripcional LuxR, regulador transcripcional LysR1, regulador transcripcional LysR2, oxidoreductasa de malato-quinona, deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato, deshidrogenasa de 6-fosfogluconato, transcetolasa, transaldolasa, O-acetiltransferasa de homoserina, gamma-sintasa de cistationina, beta-liasa de cistationina, hidroximetiltransferasa de serina, sulfhidrilasa de O-acetilhomoserina, reductasa de metilentetrahidrofolato, aminotransferasa de fosfoserina, fosfatasa de fosfoserina, transferasa de serina-acetilo, deshidrogenasa de homoserina, cinasa de homoserina, sintasa de treonina, treonina-exportador-portador, deshidratasa de treonina, oxidasa de piruvato, exportador de lisina, ligasa de biotina, sintasal de cisteína, sintasa II de cisteína, sintasa de metionina dependiente de la coenzima B12, subunidades 1 y 2 de sulfatadeniltransferasa, reductasa de fosfosulfato fosfoadenosina, reductasa de ferredoxina-sulfito, reductasa ferredoxina NADP, deshidrogenasa de 3-fosfoglicerato, regulador RXA00655, regulador RXN2910, sintetasa de ARNt arginilo, carboxilasa de fosfoenolpiruvato, proteína de treonina Efflux, serinhidroximetiltransferasa, fructosa-1,6-bisfosfatasa, proteína de la reducción de sulfato RXA077, proteína de la reducción de sulfato RXA248, proteína de la reducción de sulfato RXA247, proteína OpcA, 1-fosfofructocinasa y 6-fosfofructocinasa, succinilasa de tetrahidropicolinato, aminotransferasa de succinil-aminocetopimelato, desuccinilasa de succinil-diaminopimelato, epimerasa de diaminopimelato, dehidrogenasa de 6-fosfogluconato, isomerasa de glucosafosfato, mutasa de fosfoglicerato, enolasa, cinasa de piruvato, transaminasa de aspartato, enzima de malato.

La bacteria de la invención se transforma con un vector que comprende al menos uno de los casetes de expresión previamente mencionados.

La presente invención se refiere a una bacteria corineforme genéticamente modificada que se transforma con al menos uno de los vectores mencionados previamente, o contiene al menos uno de los casetes de expresión previamente mencionados, preferiblemente en forma integrada.

Según otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la preparación de un producto biosintético, en cuyo caso se cultiva una de las bacterias corineformes genéticamente modificadas, previamente mencionadas y el producto deseado se aísla del cultivo.

Según una forma de realización del método el producto biosintético se selecciona entre ácidos orgánicos, proteínas, nucleótidos y nucleósidos, aminoácidos tanto proteinogénicos como también no proteinogénicos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, enzimas y proteínas. Productos de biosíntesis muy particularmente preferidos son lisina, metionina, treonina y trehalosa.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra secuencias específicas para cuatro promotores que se usan para la preparación de los promotores múltiples descritos en los ejemplos de realización. Se representan las secuencias de promotor para pEFTu (Figura 1A); para el promotor pGRO (Figura 1 B), para el promotor pEFTs (Figura 1 C) y para el promotor pSOD (figura 1D). Para cada promotor se indican dos secuencias, la más larga (secuencia superior) indica respectivamente la secuencia completa de promotor que incluye el sitio de enlace ribosómico (RBS), impreso en letra negrilla y cursiva. En el caso de una disposición 3’-terminal del promotor respectivo en el constructo de promotor múltiple se usa en cada caso respectivamente la secuencia de nucleótido más larga (incluido RBS). Las secuencias de promotor, 5’-corriente arriba hacia la unidad del promotor 3’-terminal no comprenden RBS y se usaron en la secuencia de ácido nucleico abreviada, indicada en la segunda posición respectivamente (sin RBS). Secuencias parciales 3’-terminales, indicadas en letras mayúsculas y negrillas, de las secuencias más cortas de promotor opcionalmente pueden faltar. "Regiones-10" potenciales se representan subrayadas.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones generales:

Por un "producto biosintético" en el sentido de la invención se entienden aquellos que se producen mediante procesos metabólicos naturales (vías de biosíntesis) en células. Se usan de múltiples maneras, principalmente en la industria de productos alimenticios, de forrajes y piensos, de cosméticos, de comida para animales y alimentos para humanos, y en la industria farmacéutica. Estas sustancias, que se denominan en conjunto productos de química fina / proteínas, comprenden entre otros ácidos orgánicos, aminoácidos tanto proteinogénicos como también no proteinogénicos, nucleótidos y nucleósidos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, así como proteínas y enzimas.

Por un "promotor", un "ácido nucleico con actividad de promotor" o una "secuencia de promotor" se entiende un ácido nucleico que regula la transcripción de este ácido nucleico al estar enlazado con un ácido nucleico a transcribir.

En tanto no se haga referencia expresa a "promotores individuales", el término "promotor" también abarca, según el contexto, la disposición secuencial de más de una secuencia de ácido nucleico (es decir "promotores múltiples"), cada uno de los cuales individualmente sería capaz de regular la transcripción de un ácido nucleico a transcribirse, al enlazarse funcionalmente con éste.

El término "promotor individual" se refiere de manera correspondiente a una única secuencia de ácido nucleico que es capaz de regular la transcripción de un ácido nucleico a transcribirse y que al enlazarse funcionalmente con una secuencia de ácido nucleico a transcribirse puede transcribirla.

En el caso de "promotores múltiples", al menos dos secuencias de ácido nucleico, iguales o diferentes, de las cuales cada una individualmente al enlazarse funcionalmente con un ácido nucleico a transcribir sería capaz de regular su transcripción (promotores individuales), se enlazan secuencialmente de tal manera que un inicio de transcripción de, opcionalmente, una de las secuencias de ácido nucleico podría producir un transcripto que contiene el ácido nucleico a transcribir. Entre dos promotores individuales respectivamente pueden insertarse más secuencias son función de promotor, por ejemplo un linker (enlazador) que tiene, por ejemplo, uno o más sitios de corte de restricción. Opcionalmente, dos promotores individuales pueden enlazarse entre sí respectivamente de manera directa. Preferiblemente los promotores múltiples contienen solamente un sitio de enlace ribosómico (RBS), principalmente en la región del extremo 3’-terminal del promotor.

Por secuencia de promotores para la secuencia codificante de una proteína con "alta abundancia" se entienden principalmente "promotores fuertes". Si se desea emplear promotores múltiples para reforzar genes, se combinan preferiblemente aquellos promotores fuertes de manera adecuada. Los promotores fuertes regulan la transcripción de genes de tal forma que la frecuencia de lectura por la polimerasa de ARN es mayor que en el caso de la mayoría de los genes del organismo. En la mayoría de los casos la presencia de un promotor fuerte resulta en que también se presenta una gran cantidad de transcripto en la célula. Si el transcripto adopta una participación porcentual mayor en relación con otros transcriptos celulares, se habla de un "transcripto abundante“. En bacterias, la cantidad de transcripto y de la proteína codificada correspondiente del mismo se correlacionan por lo regular; es decir, "transcriptos abundantes" conducen casi siempre a "proteínas abundantes". A continuación se describe, por ejemplo, un método que permite la identificación de "promotores fuertes" mediante la abundancia de proteínas. Detalles sobre el procedimiento metódico así como otras referencias pueden encontrarse, por ejemplo, en Proteomics in Practice -A Laboratory Manual of Proteome Analysis (autores: R. Westermeier, T. Naven; editorial: Wiley-VCH Verlag GmbH, 2002). Las células bacterianas se abren y las proteínas del extracto celular se dividen por medio de electroforesis de gel 2D. Las proteínas se tiñen entonces por métodos comunes tales como, por ejemplo, teñido con Coomassie, tinta fluorescente o plata. El sobreteñido de la proteína se evita aquí para posibilitar que las manchas de la proteína individual se cuantifiquen después. Subsecuentemente, el gel se explora y la imagen obtenida se evalúa con la ayuda de un programa de ordenador adecuado (por ejemplo, Melanie, de Amersham Biosciences). Para este propósito, primero se identifican todas las manchas detectables y se determina el volumen de la mancha. La suma de todos los volúmenes de las manchas corresponde, en una primera aproximación, a la proteína total. Con ayuda del programa de ordenador para análisis de imagen, pueden seleccionarse entonces las manchas con volúmenes de mancha particularmente grandes. Por ejemplo, las manchas con volúmenes que ocupan más del 0.1% del volumen de manchado total pueden denominarse abundantes. Subsecuentemente, las manchas que contienen proteínas particularmente abundantes se extraen del gel. Normalmente, la proteína presente en el gel se digiere entonces de manera proteolitica (por ejemplo, con tripsina) y se determina la masa molar de los péptidos resultantes, por ejemplo con la ayuda de MALDI-ToF MS (Matrix assisted laser desorption ionization - Time of Flight Mass Spectrometry o ionización de desorbción láser asistida por matriz espectrometría de masas de tiempo de vuelo). Con base en la masa molar de algunos de los péptidos trípticos de la proteína, se puede entonces identificar la proteína correspondiente en los registros de las bases de datos. Esto es posible en particular sí el genoma del organismo a estudiarse ha sido secuenciado, como es el caso de la C. glutamicum, E. coli, y muchas otras bacterias. La ORF (estructura de lectura abierta) que codifica dicha proteína puede entonces determinarse con base en la identidad de dicha proteína. En las bacterias, los promotores que regulan dicho gen están usualmente localizados inmediatamente corriente arriba del codón de inicio. Por lo tanto, los promotores "fuertes" también se encuentran frecuentemente en una región de aproximadamente 200 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio de proteínas "abundantes".

Promotores "artificiales" comprenden en particular aquellas secuencias que no tienen actividad transcripcional in situ y las cuales son transcripcionalmente activas en otro contexto de secuencia, tal como principalmente en el contexto de una unidad de expresión o casete de expresión de la invención.

Por "actividad del promotor" se entiende la cantidad de ARN formado por el promotor en un tiempo particular, es decir, la velocidad de transcripción.

Por actividad del promotor "especifica" se entiende la cantidad por cada promotor de ARN formado mediante el promotor en un tiempo determinado.

En una actividad del promotor "provocada", o una velocidad de transcripción con respecto a un gen, en comparación con el tipo silvestre, la formación de un ARN que no estaba presente en este tipo silvestre se provoca de esta manera en comparación con el tipo silvestre.

En una actividad del promotor "modificada" o una velocidad de transcripción con respecto a un gen, en comparación con el tipo silvestre, la cantidad formada de ARN se modifica de esta manera en comparación con el tipo silvestre en un tiempo determinado.

Por "modificada" se entiende este contexto preferiblemente incrementada o reducida.

Por un enlace "funcional" u "operativo" se entiende en este contexto, por ejemplo, la disposición secuencial de un ácido nucleico con actividad de promotor y de una secuencia de ácido nucleico a transcribirse y opcionalmente otros de elementos regulatorios como, por ejemplo, de una secuencia de ácido nucleico, los cuales garantizan la transcripción de ácidos nucleicos, así como por ejemplo, un terminador de tal modo que cada uno de los elementos regulatorios puede cumplir su función en la transcripción de la secuencia de ácido nucleico. Esto no requiere necesariamente un enlace directo en el sentido químico. Secuencias de control genéticas tales como, por ejemplo, secuencias reforzadoras también pueden ejercer su función en la secuencia objetivo desde posiciones más distantes

o aún desde otras moléculas de ADN. Se da preferencia a disposiciones en las que la secuencia del ácido nucleico a transcribirse se posiciona detrás (es decir, en el extremo 3’) de la secuencia del promotor, de manera que las dos secuencias están conectadas de manera covalente entre sí. La distancia entre la secuencia del promotor y la secuencia del ácido nucleico a expresarse de manera transgénica es aquí preferiblemente de menos de 200 pares de bases, particularmente preferible de menos de 100 pares de bases, muy particularmente preferible de menos de 50 pares de bases.

Como secuencia de un "sitio de enlace ribosómico" o "sitio de enlace de ribosoma" (RBS) (o denominado secuencia Shine - Dalgarno) se entienden secuencias de polinucleótidos ricas en A/G que se encuentran hasta 30 bases corriente arriba del codón de inicio de la traducción.

Por "transcripción" se entiende el proceso por el cual a partir de una matriz de ADN se produce una molécula de ARN complementaria. En este proceso intervienen proteínas, como la polimerasa de ARN, los llamados factores sigma y las proteínas reguladoras transcripcionales. Entonces, el ARN sirve como matriz en el proceso de traducción que conduce luego a la proteína biosintéticamente activa.

Por una "región núcleo" de un promotor se entiende una secuencia de ácido nucleico contigua de aproximadamente 20 a 80, o 30 a 60, nucleótidos, que comprende al menos una llamada "región-10" potencial. Ejemplos de regiones – 10 potenciales se describen aquí para secuencias de promotor preferidas individuales; compárese principalmente la Figura 1. "regiones-10" también se denominan cajas TATA o secuencias Pribnow-Schaller. Cada promotor empleado debería contener al menos una de estas regiones-10 potenciales, como por ejemplo 1, 2, 3, 4 o 5. La región núcleo se localiza 5’ corriente arriba del RBS y puede estar a una distancia de ésta de 1 a 200 o 10 a 150 o 20 a 100 residuos de nucleótidos.

Por una "unidad de expresión" se entiende un ácido nucleico que tiene actividad de expresión, que comprende un promotor múltiple como se definió aquí y el cual, después de la unión funcional a un ácido nucleico o un gen a expresarse, regula la expresión, es decir, la transcripción o la traducción, de este ácido nucleico o de este gen. Por esto, en este contexto también se habla de una "secuencia de ácido nucleico reguladora". Además del constructo del promotor múltiple, pueden estar contenidos otros elementos reguladores tales como, reforzadores (enhancer), por ejemplo.

Por un "casete de expresión" se entiende una unidad de expresión que esta enlazada de manera funcional al ácido nucleico a expresarse o al gen a expresarse. En contraste a una unidad de expresión, un casete de expresión comprende de esta manera no solo secuencias de ácidos nucleicos que regulan la transcripción y traducción, sino también las secuencias de ácidos nucleicos las cuales deben expresarse como proteína como resultado de la transcripción y traducción.

Por "actividad de expresión" se entiende la cantidad de proteína formada por el casete de expresión o su unidad de expresión en un tiempo determinado; es decir, la velocidad de expresión.

Por "actividad de expresión especifica" se entiende la cantidad de proteína formada por el casete de expresión o su unidad de expresión en un tiempo determinado, por unidad de expresión.

En el caso de una "actividad de expresión provocada" o velocidad de expresión con respecto a un gen, en comparación con el tipo silvestre, se provoca de esta manera la formación de una proteína que no estaba presente en esta forma en el tipo silvestre, en comparación con el tipo silvestre.

En el caso de una "actividad de expresión modificada" o velocidad de expresión con respecto a un gen en comparación con el tipo silvestre, se altera de esta manera la cantidad de proteína formada en un tiempo determinado en comparación con el tipo nativo. En este contexto, por "modificada" se entiende incrementada o reducida, preferiblemente. Esto puede efectuarse, por ejemplo, incrementando o reduciendo la actividad específica de la unidad de expresión endógena, por ejemplo por mutación o por estimulación o inhibición. La actividad de expresión modificada, o velocidad de expresión, pueden lograrse además, por ejemplo, regulando la expresión de genes en el microorganismo por unidades de expresión de la invención, en cuyo caso los genes son heterólogos con respecto a las unidades de expresión.

La "velocidad de formación" a la cual se produce una proteína biosintéticamente activa es un producto de la velocidad de transcripción y la traducción. Ambas velocidades pueden ser influenciadas y de esta manera influenciar la velocidad de formación de los productos/productos de química fina en un microorganismo.

Por el término "tipo silvestre" se entiende el microorganismo de partido correspondiente y no debe corresponder obligatoriamente a un organismo de procedencia natural.

Según el contexto, por el término "microorganismo" pueden entenderse el microorganismo de partida (tipo silvestre)

o un microorganismo genéticamente modificado de la invención o ambos.

Preferiblemente y en particular en casos en los que no es posible clasificar el microorganismo o el tipo silvestre de manera unívoca, por "tipo silvestre" se entiende un "organismo de referencia" para modificar o provocar la actividad del promotor o la velocidad de trascripción, para modificar o provocar la actividad de expresión o la velocidad de expresión y para incrementar el contenido de producto biosintético, respectivamente. En una modalidad preferida, este "organismo de referencia" es Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 o un microorganismo que se deriva de ATCC 13032 por mutación dirigida o no dirigida.

Principalmente se usan "microorganismos de partida" que ya están en capacidad de producir el producto deseado (productos de química fina/ proteína).

Por una secuencia "derivada", por ejemplo una secuencia de promotor derivada, si no se hacen otras indicaciones, se entiende una secuencia que tiene una identidad con la secuencia de partida de al menos 80% o al menos 90%, principalmente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99%.

Por "identidad" entre dos ácidos nucleicos se entiende la identidad de los nucleótidos por toda la longitud del ácido nucleico, principalmente la identidad que se calcula con ayuda del programa de ordenador Vector NTI Suite 7.1 de la empresa Informax (USA) aplicando el método Clustal (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Ap;5(2):151-1) ajustando los siguientes parámetros:

Multiple alignment parameter: Gap opening penalty 10 Gap extension penalty 10 Gap separation penalty range 8 Gap separation penalty off % identity for alignment delay 40 Residue specific gaps off Hidrophilic residue gap off

Transition weighing 0

Pairwise alignment parameter: FAST algorithm on K-tuplesize 1 Gap penalty 3 Window size 5 Number of best diagonals 5

Por "hibridar" se entiende la capacidad de un poli- u oligonucleótido de enlazarse en condiciones severas a una secuencia casi complementaria, mientras que en estas condiciones no se forman enlaces no específicos entre partes no complementarias. Para este propósito, las secuencias deben ser complementarias preferiblemente 90100%. La propiedad de las secuencias complementarias de ser capaces de poder enlazarse de manera específica entre sí se aprovecha, por ejemplo en la técnica de Northern- o Southern-Blot o en la unión de cebador en PCR o RT-PCR.

La "hibridación" se efectúa en condiciones severas. Las condiciones de la hibridación de este tipo se describen, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., en: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-9.57 o en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por condiciones de hibridación severas se entienden principalmente: La incubación a 42°C por una noche en una solución que se compone de formamida 50 %, 5 x SSC (NaCl de 750 mM, citrato trisódico de 75 mM), fosfato de sodio de 50 mM (pH7,6), 5x solución de Denhardt, sulfato de dextrano de 10% y 20 g/ml de ADN de esperma de salmón cizallado, desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros con 0.1 x SSC a 65° C.

Por "esencialmente idéntica" se entiende una actividad del promotor especifica que tiene al menos 50%, como por ejemplo al menos 60%, 70%, 80%, 90%, o al menos 95% de la actividad del promotor específica de la secuencia de partida.

II. Unidades de expresión, casetes de expresión y sus componentes

a) Unidades de expresión

La invención se refiere a bacterias corineformes genéticamente modificadas que se transformaron con al menos un vector que contiene al menos un casete de expresión. Casetes de expresión contienen unidades de expresión que contienen promotores múltiples, unidos funcionalmente con una secuencia de ácido nucleico traducible.

Esta unidad de expresión que contiene un promotor múltiple, comprende un módulo de secuencia en dirección 5’-3’ de la siguiente fórmula general (I)

5’-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3’

donde

n representa un valor de números enteros de 0 a 10, como, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;

Ax y Ay son iguales o diferentes y representan un enlace químico, principalmente covalente, o una secuencia de ácido nucleico - enlazador químicamente integrada, en particular integrada de manera covalente;

P1, Px y Py codifican secuencias de promotor iguales o diferentes derivadas de bacterias corineformes iguales o diferentes, las cuales comprenden al menos una región que enlaza polimerasa de ARN, como por ejemplo una región de núcleo; y al menos, solo como por ejemplo, Py comprende un segmento de secuencia 3’-terminal que facilita el enlace de ribosoma.

Las secuencias de promotor P1, Px y Py pueden derivarse de genes de bacterias corineformes que codifican proteínas que intervienen en una vía de biosíntesis del organismo. Las secuencias de promotor se encuentran en tal caso en el genoma del organismo 20 a 500 residuos de nucleótidos, o 20 a 300 residuos de nucleótidos, por ejemplo 20 a 210 residuos de nucleótidos y principalmente 20 a 100 o 35 a 100 residuos de nucleótidos 5’-corriente arriba de la secuencia codificante de la proteína respectiva.

Ejemplos de secuencias de las cuales pueden derivarse las secuencias del promotor P1, Px y Py son los genes enlistados en la Tabla 1 más adelante.

Ejemplos no limitantes de secuencias del promotor especiales se derivan de las secuencias del ácido nucleico de acuerdo a la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, y la figura 1, aunque sin limitarse a las mismas.

En tal caso, la SEQ ID NO:1 corresponde a la secuencia situada corriente arriba de la región codificante del GroES Chaperonin (pGRO), la SEQ ID NO:2 corresponde a la secuencia que está situada corriente arriba de la región codificante del factor TS de elongación de la proteína (pEFTs), la SEQ ID NO: 3 corresponde a la secuencia situada corriente arriba de la región codificante del factor TU de elongación de la proteína (pEFTu) y la SEQ ID NO:4 corresponde a la secuencia situada corriente arriba de la región codificante de la dismutasa de superóxido (pSOD), en cada caso de Corynebacterium glutamicum. Las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 corresponden a las secuencias del promotor del tipo silvestre.

Por una secuencia "derivada" se entiende una secuencia que tiene una identidad con la secuencia de partida de al menos 80% o al menos 90%, tal como 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, y principalmente 99%. Este grado de identidad es válido principalmente para la "región núcleo" anteriormente definida del promotor respectivo. Fuera de la región núcleo respectiva, el grado de identidad en tal caso puede ser más bajo y estar en el intervalo de 0 a 80%, como por ejemplo 10 a 80%, 20 a 70% , 30 a 60% o 40 a 50%.

Regiones núcleo útiles se encuentran, por ejemplo, para pGRO en el intervalo de posición 50 a 80 de SEQ ID NO:1; para pEFTs en el intervalo de posición 130 a 170 de SEQ ID NO:2; para pEFTu en el intervalo de position 30 a 110 de SEQ ID NO:3; para pSOD en el intervalo de posición 50 a 100 de SEQ ID NO:4.

Las unidades de expresión contienen principalmente dos o más secuencias de ácido nucleico con actividad de promotor,

a) preferentemente derivadas de secuencias iguales o diferentes, seleccionadas entre SEQ. ID. NO. 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4; u otras secuencias de promotor para genes con abundancia comparable o superior;

b) en cuyo caso opcionalmente una o más de dichas secuencias representan una secuencia derivada por sustitución, inserción, inversión o deleción (eliminación) o adición de nucleótidos que tiene principalmente en la región núcleo una identidad de al menos 80% a nivel del ácido nucleico con una secuencia preferiblemente seleccionada de entre la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 u otras secuencias de promotor para genes con abundancia comparable o superior,

c) o en cuyo caso opcionalmente una o más de estas secuencias de ácido nucleico contenidas hibrida con una secuencia en condiciones severas que es complementaria a una de las secuencias de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 y/o a otras secuencias de promotor para genes con abundancia comparable o superior.

Otros promotores naturales que pueden utilizarse como un componente de un promotor múltiple de la invención pueden detectarse fácilmente, por ejemplo, a partir de diferentes bacterias corineformes cuya secuencia genómica es conocida, comparando las identidades de las secuencias de ácidos nucleicos de bases de datos con las secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 anteriormente descritas o de acuerdo a la Figura 1 u otras secuencias de promotor para genes con abundancia comparable o superior.

Otros promotores naturales adecuados pueden detectarse fácilmente a partir de las secuencias de ácido nucleico descritas previamente principalmente a partir de las secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 y/o de secuencias promotor para genes con abundancia comparable o superior de bacterias corineformes diferentes cuya secuencia genómica no se conoce, aplicando técnicas de hibridación de una manera conocida per se.

Otros promotores naturales adecuados también pueden aislarse por métodos conocidos por el experto en la materia, tal como se describen por ejemplo en Cadenas et al (1991) Gene 98, 117-121; Eikmanns et al, (1991) Gene 102, 9398.; Patek et al (1996) Microbiology 142, 1297-1309 o Santamaria et al (1987) Gene 56, 199-208. Para esto usualmente se usan vectores de "sonda promotora" en los que se insertan fragmentos genómicos del genoma en cuestión. La actividad de promotor de un fragmento individual puede entonces determinarse en el montaje (setup) experimental mencionado midiendo la actividad de un gen reportero corriente abajo, por ejemplo, la acetil transferasa de cloramfenicol.

La unidad de expresión que contiene promotores múltiples también comprende, por lo tanto, la combinación de tales promotores, los cuales no se encuentran enlistados aquí por el nombre. Esto también se refiere a la combinación de promotores individuales ya conocidos, como los descritos, por ejemplo, en (Patek et al (2003). J of Biotechnology 104, 311-323; Vasicova et al. (1999) J. Bacteriol 181, 6188-6191).

�?cidos nucleicos con actividad de promotor para incorporación a una unidad de expresión que contiene promotores múltiples, también comprenden los ácidos nucleicos con actividad de promotor que comprenden una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones severas con la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 o secuencias de promotor para genes con abundancia comparable o superior. Esta secuencia de ácido nucleico comprende al menos 10, preferible más de 12, 15, 30, 50 o más de 150 nucleótidos.

Secuencias promotoras artificiales para la incorporación a una unidad de expresión que comprende promotores múltiples pueden prepararse fácilmente a partir de la secuencia SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 o de acuerdo con la Figura 1 y/o las secuencias de promotor para genes con abundancia comparable o superior mediante variación artificial y mutación, por ejemplo mediante adición, sustitución, inserción, inversión o eliminación de uno o varios residuos de

5 nucleótidos individuales o contiguos. (Patek et al (2003). J of Biotechnology 104, 311-323; Vasicova et al. (1999) J. Bacteriol 181, 6188-6191) y las referencias mencionadas allí).

Segmentos adecuados de secuencia 3’-terminal, que facilitan el enlace de ribosomas, de una secuencia de promotor Py son, por ejemplo, el RBS de pGRO: GGAGGGA; el RBS de pEFTs: AGGAGGA; el RBS de pEFTu: AGGAGGA; así como el RBS de pSOD : GGAGGGA (compárese también la figura 1 adjunta). El RBS óptimo por teoría, es decir 10 la secuencia que es 100 % complementara para la secuencia anti-Shine-Dalgarno en el ARNr 16S de C. glutamicum es: 5’GAAAGGAGG3’. Otros segmentos de secuencia RBS adecuados pueden producirse por ejemplo mediante variación artificial y mutación, por ejemplo por sustitución, inserción, inversión, adición o eliminación de nucleótidos,

o detectarse por comparaciones de homología con secuencias de promotor en los bancos de datos.

Ejemplos no limitantes de unidades de expresión que contienen promotores múltiples se seleccionan entre:

15 e) Secuencias que codifican

PeftuPsod, de posición 18 a 390 en SEQ ID NO: 45;

PsodPeftu, de posición 18 a 395 en SEQ ID NO: 52;

PgroPsod, de posición 18 a 369 en SEQ ID NO: 55;

PgroPsodPefts, de posición 11 a 538 en SEQ ID NO: 59;

20 PeftuPsodPefts; de posición 11 a 559 en SEQ ID NO: 60;

o

f) Secuencias derivadas de secuencias según e) mediante sustitución, inserción, inversión, adición o eliminación de nucleótidos que en comparación con esta secuencia de partida tienen una identidad de al menos 80 % o al menos 90% a nivel de ácido nucleico; o

25 g) Secuencias de ácido nucleico, que hibridan con una secuencia complementaria a e) en condiciones severas;

Las unidades de expresión pueden comprender preferentemente uno o varios de los siguientes elementos genéticos: una región-10; un inicio de transcripción, una región de reforzador (enhancer); y una región de operador.

Estos elementos genéticos son específicos para las especies corinebacteria, especialmente para Corynebacterium glutamicum.

30 Los promotores bacterianos normalmente consisten de tres sitios de reconocimiento de la polimerasa de ARN, más precisamente la región -10, la región -35 y el elemento UP. Estos elementos promotores son altamente conservados en E.coli aunque no en C. glutamicum. Esto se refiere especialmente a la región -35. Con frecuencia este puede por lo tanto no derivarse de la secuencia, o puede derivarse solo de manera no confiable. La región -10 igualmente es menos fuertemente conservada que en organismos con genomas ricos en AT. Como secuencias de consenso aquí

35 se han prescrito TGNGNTA(C/T)AATGG o GNTANAATNG (Patek et al (2003), J. of Biotechnology 104, 311-323; Vasicova et al. (1999) J. Bacteriol 181, 6188-6191 ).

En general se conoce que en bacterias con un contenido de GC moderado o alto (como, por ejemplo, C. glutamicum) ocurre en general una alta variabilidad en las secuencias de consenso (Boum and Babb, 1995., Bashiam et al, 1996). Esto es válido particularmente para la región -35 que por lo tanto con frecuencia no puede

40 pronosticarse. Esto se describe, por ejemplo, en Patek et al (2003). J of Biotechnology 104, 325-334.

b) Casetes de expresión

Unidades de expresión que contienen promotores múltiples, funcionalmente unidas con una secuencia de ácido nucleico traducible, se denominan casetes de expresión.

Por un "enlace funcional" en este contexto se entiende, por ejemplo, la disposición secuencial de una de las 45 unidades de expresión y de una secuencia de ácido nucleico a expresarse de manera transgénica y opcionalmente de otros elementos reguladores tal como un terminador, por ejemplo, de tal modo que cada uno de los elementos reguladores pueda cumplir una función en la expresión transgénica de la secuencia del ácido nucleico. Para esto no se requiere obligatoriamente un enlace directo en el sentido químico. Las secuencias de control genético tales como, por ejemplo, secuencias reforzadoras (enhancer) también pueden ejercer su función en la secuencia objetivo desde posiciones más distantes o aún desde otras moléculas de DNA. Se prefieren disposiciones en las cuales la secuencia de ácido nucleico a expresarse de manera transgénica se posiciona detrás (es decir, en el extremo 3') de la secuencia de la unidad de expresión de la invención, de manera que ambas secuencias se enlazan de manera covalente entre sí. La distancia entre la secuencia de la unidad de expresión y la secuencia del ácido nucleico a expresarse de manera transgénica es aquí preferiblemente de menos de 200 pares de base, particularmente preferible de menos de 100 pares de base, muy particularmente preferible de menos de 50 pares de base.

Por medio de los casetes de expresión que contienen promotores múltiples se crea la posibilidad de lograr una actividad de expresión diferente, en comparación con la actividad de expresión original, y de esta manera efectuar una regulación fina de la expresión del gen deseado.

Preferentemente, la regulación de la expresión de genes en bacteria corineforme se logra mediante unidades de expresión

-

introduciendo una o más unidades de expresión, opcionalmente con actividad de expresión específica modificada al genoma de la bacteria corineforme de manera que la expresión de uno o más genes endógenos se efectúa bajo el control de las unidades de expresión introducidas de la invención; o

-

introduciendo a la bacteria corineforme uno o más constructos de ácidos nucleicos que contienen una unidad de expresión de la invención, opcionalmente con actividad de expresión específica modificada y enlazando de manera funcional, uno o más ácidos nucleicos a expresarse, es decir, un casete de expresión.

En los casetes de expresión de la invención, la posición física de la unidad de expresión con relación al gen a ser expresado se elige de modo que la unidad de expresión regule la transcripción y preferiblemente también la traducción del gen a expresarse y de esta manera posibilitar la formación de una o más proteínas. "Posibilitar la formación" aquí incluye incrementar de manera constitutiva dicha formación, atenuar o bloquear la formación en condiciones especificas y/o incrementar la formación en condiciones especificas. Las "condiciones" comprenden en tal caso:

(1) adición de un componente al medio de cultivo, (2) retiro de un componente del medio de cultivo, (3) reemplazo de un componente en el medio de cultivo por un segundo componente, (4) incremento de la temperatura del medio de cultivo, (5) reducir la temperatura del medio de cultivo y (6) regular las condiciones atmosféricas tales como, por ejemplo, la concentración de oxígeno o la concentración de nitrógeno, en la que se mantiene el medio de cultivo.

c) Indicaciones generales:

Todos los ácidos nucleicos anteriormente mencionados con actividad de promotor y unidades de expresión y casetes de expresión también pueden prepararse de una manera conocida per se, mediante síntesis química de las unidades estructurales de nucleótidos, por ejemplo mediante condensación de fragmentos de las unidades estructurales de ácidos nucleicos complementarios superpuestos individuales de la doble hélice. La síntesis química de los oligonucleótidos puede llevarse a cabo, por ejemplo, en una manera conocida per se, según el método de fosfoamidita. (Voet, Voet, 2. Edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). La adición de los oligonucleótidos sintéticos y el relleno de huecos con ayuda del fragmento Klenow de la polimerasa de ADN y reacciones de ligazón, así como métodos generales de clonación se describen en Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Para las presentes invenciones se utilizaron métodos y técnicas que son conocidas para el experto en la materia que esté ejercitado en las técnicas microbiológicas y de ADN recombinante. Los métodos y técnicas para el crecimiento de células bacterianas, la introducción de moléculas de ADN aisladas a la célula huésped y el aislamiento, clonación y secuenciación de moléculas de moléculas de ácidos nucleicos aisladas, etc., son ejemplos de tales técnicas y métodos. Estos métodos se describen en muchas referencias bibliográficas estándar: Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986); J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972); J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992); M. Singer and P. Berg, Genes Genomes, University Science Books, Mill Valley, Carlifornia (1991); J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); P.B. Kaufmann et al., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995); Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick and J.E. Thompson, eds., CRC Press, Boca Raton, Florida (1993); and P.F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989).

Todas las moléculas de ácidos nucleicos se presentan preferiblemente en la forma de una molécula de ácido nucleico aislada. Una molécula de ácido nucleico "aislada" se separa de otras moléculas de ácido nucleico presentes en la fuente natural del ácido nucleico y puede estar además esencialmente libre de otro material celular o medio de cultivo si se produce por técnicas recombinantes, o estar libre de precursores químicos u otros productos químicos, si se sintetiza químicamente.

Las secuencias de nucleótidos de la invención también permiten la generación de sondas y cebadores que pueden utilizarse para identificar y/o clonar secuencias homologas en otros tipos de células y microorganismos. Tales sondas o cebadores usualmente comprenden una región de la secuencia de nucleótido que, en condiciones severas, hibrida en al menos aproximadamente 12, preferiblemente al menos cerca de 25, como por ejemplo cerca de 40, 50 o 75, nucleótidos sucesivos de una cadena sense (sentido) de una secuencia de ácido nucleico de la invención o de una cadena antisense (antisentido) correspondiente.

III. Vectores de expresión

El experto en la materia conoce bien los vectores y éstos pueden encontrarse, por ejemplo, en "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., editores, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). Por vectores también se entienden, además de plásmidos, todos los otros vectores conocidos por el experto en la materia, como por ejemplo fagos, transposones, elementos IS, fásmidos, cósmidos, y ADN lineales o circulares. Estos vectores pueden replicarse de manera autónoma en el organismo huésped o cromosómicamente.

Como plásmidos son adecuados aquellos que se replican en bacterias corineformes. Numerosos vectores de plásmido conocidos, como por ejemplo pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) o pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) se basan en los plásmidos crípticos pHM1519, pBL1 o pGA1. Otros vectores de plásmido como, por ejemplo, pCLiK5MCS (véase ejemplo 11), o aquellos que se basan en pCG4 (US-A 4,489,160) o pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)) o pAG1 (US-A 5,158,891), pueden usarse de igual manera.

Además, también son adecuados aquellos vectores de plásmidos con la ayuda de los cuales puede aplicarse el método de amplificación del gen mediante integración al cromosoma, como se describió, por ejemplo, por Remscheid et al. (Applied and Enviromental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para la duplicación o amplificación del operon hom-thrB. En este método, se clona el gen completo en un vector de plásmido que puede replicarse en un huésped (típicamente E. coli) pero no en C. glutamicum. Como vectores se consideran, por ejemplo pSUP301 (Sirnon et al., Bio/Technology 1,784-791 (1983)), pK18mob o pK19mob (Schäfer et al., Gene 145,69-73 (1994)), Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510--4516) o pBGS8 (Spratt et as.,1986, Gene 41: 337-342). El vector de plásmido que contiene el gen a amplificarse se transfiere a continuación por transformación a la cepa de C. glutamicum deseada. Los métodos de transformación se describen, por ejemplo, en Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican y Shivnan (Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123,343-347 (1994)).

IV. Genes y proteínas codificadas por los mismos

La velocidad de transcripción y/o la velocidad de traducción de genes en bacterias corineformes, en comparación con el tipo silvestre, pueden alterarse o provocarse regulando la transcripción de genes en la bacteria corineforme mediante unidades de expresión de la invención, en cuyo caso los genes son heterólogos con respecto a las unidades de expresión.

Esto se logra preferiblemente

-

introduciendo uno o más ácidos nucleicos con actividad de promotor al genoma de la bacteria corineforme de manera que la transcripción de uno o más genes endógenos se efectúe bajo el control del ácido nucleico introducido con actividad de promotor, opcionalmente con actividad de promotor especifica modificada, o

-

introduciendo a la bacteria corineforme uno o varios constructos de ácidos nucleicos que contienen un ácido nucleico con tiene actividad de promotor y, enlazando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos exógenos o endógenos a transcribirse.

Sí uno o más genes se introducen al genoma de la bacteria corineforme de manera que uno o varios genes introducidos se transcriben bajo el control de los ácidos nucleicos de la invención, la inserción puede tener lugar para que el gen o los genes se integren a las regiones codificantes o no codificantes. La inserción preferiblemente tiene lugar a las regiones no codificantes.

La inserción de constructos de ácido nucleico puede efectuarse en tal caso de manera cromosómica o extracromosómica. Preferentemente, la inserción de los constructos de ácido nucleico se efectúa de manera cromosómica. Una integración "cromosómica" es la inserción de un fragmento de ADN al cromosoma de una célula huésped.

Por "endógeno" se entienden informaciones genéticas que ya están contenidas en el genoma de tipo silvestre (como se definió arriba).

Por "exógeno" se entienden informaciones genéticas como, por ejemplo, genes que no están contenidos en el genoma de tipo silvestre. Sí las informaciones genéticas exógenas, por ejemplo las unidades de expresión que contienen promotores múltiples, se introducen al genoma de una cepa de tipo silvestre, generando por medio de esto una cepa genéticamente modificada, entonces estas informaciones genéticas son endógenas en comparación de la cepa genética inicialmente generada con su descendencia, por lo contrario exógena una comparación con la cepa de tipo silvestre original la cual no contenía estas informaciones genéticas.

Por el término "genes" respecto de la regulación de la transcripción mediante ácidos nucleicos de la invención con actividad de promotor se entienden preferentemente ácidos nucleicos que contienen una región a transcribirse, es decir, por ejemplo, una región que regula la traducción, una región codificante, así como opcionalmente otros elementos de regulación como, por ejemplo, un terminador.

Por el término "genes" respecto de la regulación de la expresión mediante las unidades de expresión de la expresión se entienden preferentemente ácidos nucleicos que contienen una región codificantes, así como opcionalmente otros elementos de regulación, como por ejemplo un terminador.

Por una "región codificante" se entiende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína.

Por "heterólogo" respecto de ácidos nucleicos con actividad de promotor y genes se entiende que los genes usados en el tipo silvestre no se transcriben regulando los ácidos nucleicos con actividad de promotor, sino que surge un nuevo enlace funcional que no se presenta en el tipo silvestre y la combinación funcional de ácido nucleico con actividad de promotor y gen específico no se presenta en el tipo silvestre.

Por "heterólogo" respecto de unidades de expresión y genes se entiende que los genes usados no se expresan en el tipo silvestre regulando las unidades de expresión de la invención, sino que se produce un nuevo enlace funcional que no se presenta en el tipo silvestre, y la combinación funcional de la unidad de expresión de la invención y el gen especifico no ocurren en el tipo silvestre.

Los genes se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de productos de química fina, en cuyo caso los genes pueden contener opcionalmente otros elementos de regulación.

Los genes se seleccionan preferiblemente de: ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de nucleótidos y nucleósidos, ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de ácidos orgánicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de lípidos y ácidos grasos, ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de dioles, ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de carbohidratos, ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de compuesto aromático, ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de vitaminas, ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de cofactores y ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de enzimas, ácidos nucleicos que codifican una proteína del metabolismo central, en cuyo caso los genes opcionalmente pueden contener otros elementos de regulación.

Particularmente se prefieren las proteínas a partir de la vía de biosíntesis de aminoácidos seleccionados, a saber:

Aspartato cinasa, aspartato-semialdehído-deshidrogenasa, diaminopimelato-deshidrogenasa, diaminopimelatodecarboxilasa, dihidrodipicolinato-sintetasa, dihidrodipicolinato - reductasa, glicerinaldehído-3-fosfato-dehidrogenasa, 3-fosfoglicerato-cinasa, piruvato-carboxilasa, triosefosfato-isomerasa, regulador transcripcional LuxR, regulador transcripcional LysR1, regulador transcripcional LysR2, malato-quinona-oxidoreductasa, glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa, 6-fosfogluconato-deshidrognasa, transcetolasa, transaldolasa, homoserina-O-acetiltransferasa, cistahionina-gamma-sintasa, cistahionina-beta-liasa, serina-hidroximetiltransferasa, O-acetilhomoserina-sulfhidrilasa, metilen-tetrahidrofolato-reductasa, fosfoserina-aminotransferasa, fosfoserina-fosfatasa, serina-acetil-transferasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-cinasa, treonina-sintasa, treonina-exportador-portador, treoninadeshidratasa, piruvato-oxidasa, lisina-exportador, biotina-ligasa, cisteína-sintasal, cisteína-sintasa II, metioninasintasa dependiente de coenzima B12, actividad de metionina-sintasa dependiente de coenzima B12, sulfatadeniltransferasa subunidad 1 y 2, fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ferredoxin-sulfito-reductasa,

ferredoxin NADP reductasa, 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, regulador RXA00655, regulador de RXN2910, arginil-ARN-t sintetasa, fosfoenolpiruvato-carboxilasa, treonina Efflux-proteína, serinhidroximetiltransferasa, fructosa-1,6afosfatasa, proteína de la reducción de sulfato RXA077, proteína de la reducción de sulfato RXA248, proteína de la reducción de sulfato RXA247, proteína OpcA, 1-fosfofructocinasa, 6-fosfofructocinasa, tetrahidropicolinato5 succinilasa, succinilo-aminocetopimelato-aminotransferasa, succinil-diaminopimelato-desuccinilasa, diaminopimelato-epimerasa, 6-fosfogluconato-deshidrogenasa, glucosafosfato-isomerasa, fosfoglicerato-mutasa, enolasa, piruvato-cinasa, aspartato-transaminasa, malato-enzima.

Proteínas y ácidos nucleicos que codifican estas proteínas son secuencias de proteína o secuencias de ácido nucleico de origen microbiano, preferentemente de bacterias del género Corynebacterium o Brevibacterium,

10 preferiblemente de bacterias corineformes, particularmente preferible de Corynebacterium glutamicum.

Ejemplos de secuencias de proteínas particularmente preferidas y de secuencias de ácidos nucleicos correspondientes que codifican estas proteínas a partir de la vía de biosíntesis de aminoácidos, su documento de referencia y su denominación en el documento de la referencia se listan en la tabla 1:

Tabla 1 (continuación) (continuación)

Proteína

�?cido nucleico que codifica proteína Documento de referencia SEQ. ID. NO. en el documento de referencia

Aspartato de cinasa

ask o lysC EP1108790 ADN: 281 Proteína: 3781

Aspartato-semialdehídodeshidrogenasa

asd EP1108790 ADN:331 Proteína: 3831

Dihidrodipicolinato-Sintetasa

dapA WO 0100843 ADN: 55 Proteína: 56

Dihidrodipicolinato-Reductasa

dapB WO 0100843 ADN: 35 Proteína: 36

Meso-diaminopimelato-Ddeshidrogenasa

ddh EP1108790 DNA : 3494 Proteína : 6944

Diaminopicolinato-Decarboxilasa

lysA EP1108790 ADN:3451 Prot.:6951

Exportador de Lisina

lysE EP1108790 ADN: 3455 Prot.: 6955

Tetrahidropicolinato-Succinilasa

dapD EP1108790 DNA : 1229 Prot : 4729

Succiniloaminocetopimelato-Aminotransferasa

dapC WO 0100843 DNA : 327 Prot: 328

Succinilo-Diaminopimelato-Desuccinilasa

dapE WO 0100843 ADN: 31 Prot: 32

Diaminopimelato-Epimerasa

dapF EP1108790 ADN:2131 Prot: 5632

Arginilo-ARN-t Sintetasa

argS EP1108790 ADN: 3450 Prot.: 6950

Glucose-6-fosfat-Deshidrogenasa

zwf WO 0100844 ADN: 243 Prot.: 244

Transcetolasa

RXA2739 EP 1108790 ADN: 1740 Prot: 5240

Transaldolasa

RXA2738 WO 0100844 ADN: 245 Prot: 246

OPCA

opcA WO 0100804 ADN: 79 Prot: 80

6-Fosfogluconolactonasa

RXA2735 WO 0100844 ADN: 1 Prot.: 2

6-Fosfogluconato-Deshidrogenasa

EP1108790 ADN:1605 Prot: 5105

Glucosefosfato-Isomerasa

gpi WO 0100844 ADN: 41 Prot.: 42

Malato-Quinona-Oxodoreductasa

mqo WO 0100844 ADN: 569 Proteína: 570

Proteína

�?cido nucleico que codifica proteína Documento de referencia SEQ. ID. NO. en el documento de referencia

Glicerinaldehído-3-Fosfato-Deshidrogenasa

gap WO 0100844 ADN: 187 Prot.: 188

3-Fosfogliceratcinasa

pgk WO 0100844 ADN: 69 Prot.: 70

Triosefosfato-Isomerasa

tpi WO 0100844 ADN: 61 Prot.: 62

1-Fosfofructocinasa 1

pfk1 WO0100844 ADN: 55 Proteína: 56

1-Fosfofructocinasa 2

pfk2 WO0100844 ADN: 57 Proteína: 58

6-Fosfofructocinasa 1

6-pfk1 EP 1108790 ADN: 1383 Proteína: 4883

6-Fosfofructocinasa 2

6-pfk2 DE 10112992 ADN: 1 Proteína: 2

Fructose-1,6-bisfosfatasa 1

fbr1 EP1108790 ADN: 1136 Proteína: 4636

Piruvato Oxidasa

poxB WO 0100844 DNA : 85 Proteína: 86

Fosfoglicerato-mutasa

WO 0100844 ADN: 49 Prot.: 50

Enolasa

eno WO 0100844 ADN: 71 Prot.: 72

Piruvato-Cinasa

pykA WO 0100844 ADN: 75 Prot.: 76

Piruvato-Cinasa

pykA EP1108790 ADN: 3328 Prot.: 6828

Piruvato-Carboxilasa

pycA EP1108790 ADN: 765 Prot.: 4265

Aspartato-Transaminasa

EP1108790 ADN: 3226 Prot: 4726 ADN: 3134 Prot.: 6634 ADN: 2861 Prot.: 6361 ADN: 911 Prot.: 4411

PEP-Carboxilasa

pck EP1108790 ADN: 3470 Prot.: 6970

Malato-Enzima

malE EP1108790 ADN: 3328 Prot: 6828

Biotina-Ligasa

birA EP1108790 ADN: 786 Prot.: 4286

Homoserina Cinasa

thrB WO 0100843 ADN: 173 Prot.: 174

Treonina Sintasa

thrC WO 0100843 ADN: 175 Prot.: 176

Exportador portador de Treonina

thrE WO 0251231 ADN: 41 Prot.: 42

Treonina Efflux Proteína

RXA2390 WO 0100843 ADN: 7 Prot.: 8

Treonina Dehidratasa

ilva EP 1108790 ADN: 2328 Prot.: 5828

Homoserina-O-Acetiltransferasa

metA EP 1108790 ADN:727 Prot: 4227

Cistationina-gammasintasa

metB EP 1108790 ADN:3491 Prot: 6991

Cistationina-beta-Liasa

metC EP 1108790 ADN:2535 Prot: 6035

Proteína

�?cido nucleico que codifica proteína Documento de referencia SEQ. ID. NO. en el documento de referencia

Metionina-Sintasa dependiente de coenzima B12, -

metH EP 1108790 ADN:1663 Prot: 5163

O-Acetilhomoserina-Sulfhidrilasa

metY EP 1108790 ADN:726 Prot: 4226

Metilentetrahidrofolat-Reductasa

metF EP 1108790 ADN:2379 Prot: 5879

D-3-Fosfoglicerato-Deshidrogenasa

serA EP 1108790 ADN:1415 Prot: 4915

Fosfoserina-Fosfatasa 1

serB WO 0100843 ADN: 153 Prot.: 154

Fosfoserina-Fosfatasa 2

serB EP 1108790 ADN: 467 Prot: 3967

Fosfoserina-Fosfatasa 3

serB EP 1108790 ADN: 334 Prot.: 3834

Fosfoserina-Aminotransferasa

serC WO 0100843 ADN: 151 Prot.: 152

Serina Acetil-Transferasa

cysE WO 0100843 ADN: 243 Prot.: 244

Cisteína-Sintasa I

cysK EP 1108790 ADN: 2817 Prot.: 6317

Cisteína Sintasa II

CysM EP 1108790 ADN: 2338 Prot.: 5838

Homoserina-Deshidrogenasa

hom EP 1108790 ADN: 3452 Prot.: 6952

Metionina-Sintasa independiente de coenzima B12

metE WO 0100843 ADN:755 Prot.: 756

Serina-Hidroximetiltransferasa

glyA WO 0100843 ADN: 143 Prot.: 144

Proteína en reducción de sulfato

RXA247 EP 1108790 ADN: 3089 Prot.: 6589

Proteína en reducción de sulfato

RXA248 EP 1108790 ADN: 3090 Prot.: 6590

Sulfatadeniltransferasa Subunidad 1

CysN EP 1108790 ADN: 3092 Prot.: 6592

Sulfatadeniltransferasa Subunidad 2

CysD EP 1108790 ADN: 3093 Prot.: 6593

Fosfoadenosina Fosfosulfato Reductasa

CysH WO 02729029 ADN: 7 Prot.: 8

Ferredoxina-Sulfito-Reductasa

RXA073 WO 0100842 ADN: 329 Prot.: 330

Ferredoxina NADP Reductasa

RXA076 WO 0100843 ADN: 79 Prot.: 80

Regulador transcripcional LuxR

luxR WO 0100842 ADN: 297 Proteína: 298

Regulador transcripcional LysR1

lysR1 EP 1108790 ADN: 676 Proteína: 4176

Regulador transcripcional LysR2

lysR2 EP 1108790 ADN: 3228 Proteína: 6728

Regulador transcripcional LysR3

lysR3 EP 1108790 ADN: 2200 Proteína: 5700

Regulador RXA00655

RXA655 US2003162267.2 ADN: 1 Prot.: 2

Regulador RXN02910

RXN291 0 US2003162267.2 ADN: 5 Prot.: 6

De los genes listados arriba se selecciona preferiblemente el gen G objetivo a regular.

Otras secuencias de proteínas particularmente preferidas a partir de la vía de biosíntesis de aminoácidos tienen en cada caso la secuencia de aminoácido indicada en la tabla 1 para esta proteína, donde la proteína respectiva tiene, en al menos una de las posiciones del aminoácido indicadas en la tabla 2, columna 2 para esta secuencia del aminoácido, otro aminoácido proteinogénico, diferente del respectivo aminoácido indicado en la tabla 2, columna 3 5 en el mismo renglón. En otra modalidad preferida las proteínas tienen, en al menos una de las posiciones del aminoácido indicadas en la tabla 2, columna 2 para la secuencia del aminoácido, el aminoácido indicado en la tabla 2, columna 4 en el mismo renglón. Las proteínas indicadas en la tabla 2 son proteínas mutadas de la vía de biosíntesis de los aminoácidos, que tienen propiedades particularmente ventajosas y, por lo tanto, son particularmente adecuadas para expresar los ácidos nucleicos correspondientes a través de un constructo promotor

10 de la invención y para la producción de aminoácidos. Por ejemplo, la mutación T3111 conduce a desactivación de la inhibición-feedback (retroalimentación) de ask.

Los ácidos nucleicos correspondientes que codifican una proteína de la tabla 2, mutada, descrita previamente, puede prepararse por métodos usuales.

Como punto de partida para la preparación de las secuencias de ácido nucleico, que codifican una proteína mutada

15 es adecuado, por ejemplo, el genoma de una cepa de Corynebacterium glutamicum que puede obtenerse de la American Type Culture Collection bajo la denominación ATCC 13032 o las secuencias de ácido nucleico referidas en la tabla 1. Para la re-traducción de la secuencia de aminoácidos de las proteínas mutadas en las secuencias de ácido nucleico que codifican estas proteínas, es ventajoso utilizar el codon usage del organismo al cual se introducirá la secuencia del ácido nucleico o en el cual está presente la secuencia del ácido nucleico. Por ejemplo,

20 es ventajoso utilizar el codon usage de Corynebacterium glutamicum para Corynebacterium glutamicum. El codon usage del respectivo organismo puede comprobarse de una forma conocida per se a partir de bases de datos o de solicitudes de patente que describen al menos una proteína y un gen que codifica esta proteína a partir del organismo deseado.

Los datos en la tabla 2 han de entenderse de la siguiente manera:

25 En la columna 1 "Identificación" se expone una denominación unívoca para cada secuencia respecto de la tabla 1.

En la columna 2 "AS-POS" el número respectivo se refiere a la posición de aminoácido de la secuencia de polipéptido correspondiente de la Tabla 1. Un "26" en la columna "AS-POS" significa por consiguiente la posición de aminoácido 26 de la secuencia de polipéptido indicada de manera correspondiente. La numeración de la posición empieza en la terminal N en +1.

30 En la columna 3 "AS-tipo silvestre", la letra respectiva designa el aminoácido – representado en código de una letra en la posición indicada en la columna 2, en la cepa correspondiente de tipo silvestre de la secuencia de la Tabla 1.

En la columna 4 "AS-Mutante", la letra respectiva designa el aminoácido – representado en el código de una letra – en la posición indicado en la columna 2 en la cepa mutante correspondiente.

En la columna 5 "Función" se presenta la función fisiológica de la secuencia de polipéptido correspondiente.

35 Para una proteína mutada con una función determinada (columna 5) y una secuencia determinada de aminoácido de partida (Tabla 1), en las columnas 2, 3 y 4 se describe al menos una mutación, y también varias mutaciones se describen para algunas secuencias. Estas varias mutaciones se refieren siempre a la secuencia de aminoácido inicial más cercana anterior respectiva (tabla 1). El término "al menos una de las posiciones del aminoácido" de una secuencia del aminoácido determinada significa preferiblemente al menos una de las mutaciones descritas para esta

40 secuencia del aminoácido en las columnas 2, 3 y 4.

Código de una letra de los aminoácidos proteinogénicos:

A Alanina I Isoleucina Q Glutamina

C Cisteína K Lisina R Arginina

D Aspartato L Leucina S Serina

45 E Glutamato M Metionina T Treonina

F Fenilalanina N Asparagina V Valina

G Glicina P Prolina W Triptofano H Histidina Y Tirosina

Tabla 2

Columna 1

Columna 2 Columna 3 Columna 4 Columna 5

Identificación

AS Posición AS tipo silvestre AS Mutante Función

ask

317 S A Cinasa de aspartato

311

T I

279

A T

asd

66 D G Aspartato-Semialdehído-Deshidrogenasa

234

R H

272

D E

285

K E

20

L F

dapA

2 S A Dihidrodipicolinato Sintetasa

84

K N

85

L V

dapB

91 D A Dihidrodipicolinato-Reductasa

83

D N

ddh

174 D E Meso-Diaminopimelato-D-Dehidrogenasa

235

F L

237

S A

lysA

265 A D Diaminopicolinato-Decarboxilasa

320

D N

332

I V

argS

355 G D Arginilo-ARN-t-Sintetasa

156

A S

513

V A

540

H R

(continuación) (continuación)

Columna 1

Columna 2 Columna 3 Columna 4 Columna 5

Identificación

AS Posición AS tipo silvestre AS Mutante Función

zwf

8 S T Glucosa-6-Fosfato-Dehidrogenasa

150

T A

321

G S

gap

264 G S Glicerinaldehído-3-Fosfato-Deshidrogenasa

pycA

7 S L Piruvato-Carboxilasa

153

E D

182

A S

206

A S

227

H R

455

A G

458

P S

639

S T

1008

R H

1059

S P

1120

D E

pck

162 H Y PEP-Carboxilasa

241

G D

829

T R

thrB

103 S A Homoserina Cinasa

190

T A

133

A V

138

P S

thrC

69 G R Treonina Sintasa

478

T I

Columna 1

Columna 2 Columna 3 Columna 4 Columna 5

Identificación

AS Posición AS tipo silvestre AS Mutante Función

RXA330

85 I M Treonina-Efflux Proteína

161

F I

195

G D

hom

104 V I Homoserina-Deshidrogenasa

116

T I

148

G A

59

V A

270

T S

345

R P

268

K N

61

D H

72

E Q

lysR1

80 R H regulador transcripcional LysR1 1

lysR3

142 R W regulador transcripcional LysR3

179

A T

RXA2739

75 N D Transcetolasa

329

A T

332

A T

556

V I

RXA2738

242 K M Transaldolasa

opcA

107 Y H OpcA

219

K N

233

P S

261

Y H

312

S F

65

G R Aspartato-1-Decarboxilasa

33

G S 6- Fosfogluconolactonasa

Microorganismos modificados genéticamente

5 Los casetes de expresión anteriormente descritos se introducen en bacterias corineformes mediante métodos conocidos por el trabajador experto, tal como la conjugación o electroporación (como por ejemplo Liebl et al (1989) FEMS Microbiology Letters 53, 299-303).

La selección de casetes de expresión integrados se efectúa preferentemente mediante el método SacB. El método SacB es conocido por el experto en la materia y se describe, por ejemplo, en Schäfer A, Tauch A, Jäger W,

10 Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A.; Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and K19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene. 1994 Julio 22;145(1):69-73 y Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein BI.; Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101 replicon; Mol Microbiol. 1991 Jun;5(6): 1447-57.

15 De acuerdo con la invención, se prefiere usar como microorganismos de inicio aquellos que producen ya el producto valioso deseado (producto de química fina/proteína).

La invención por lo tanto también se refiere a una bacteria corineforme genéticamente modificada que contiene un casete de expresión o un vector que comprende el casete de expresión.

La presente invención se relaciona de manera particularmente preferible a bacterias corineformes genéticamente modificadas, en particular bacterias corineformes, las cuales contienen un vector, principalmente un vector transportador o vector de plásmido, que porta al menos un casete de expresión.

Bacterias corineformes son bacterias del género Corynebacterium, principalmente de las especies Corynebacterium

5 glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium melassecola y Corynebacterium efficiens o del género Brevibacterium, principalmente de las especies Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum y Brevibacterium divaricatum.

Bacterias particularmente preferidas de los géneros Corynebacterium y Brevibacterium se seleccionan del grupo de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium 10 acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium efficiens DSM 44547, Corynebacterium efficiens DSM 44548. Corynebacterium efficiens DSM 44549, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Corynebacterium glutamicum KFCC10065 y Corynebacterium glutamicum ATCC 21608, así como cepas que se derivan de las mismas, por ejemplo mediante mutación y

15 selección clásica o mediante mutación dirigida.

La abreviatura KFCC significa Korean Federation of Culture Collection (Federación Coreana de Colección de Cultivos), la abreviatura ATCC significa American type strain culture collection (Colección de Cultivos Tipo Americano), y la abreviación DSM (o DSMZ) significa Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Deutsche Sammlung van Mikroorganismen and Zellkulturen).

20 Otras bacterias particularmente preferidas adicionales del género Corynebacterium y Brevibacterium se listan en la tabla 3:

Tabla 3 (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación)

Bacteria

Número de depósito

Género

especie ATCC FERM NRRL CEC T NCIMB CBS NCT C DSM Z

Brevibacterium

ammoniagenes 21054

Brevibacterium

ammoniagenes 19350

Brevibacterium

ammoniagenes 19351

Brevibacterium

ammoniagenes 19352

Brevibacterium

ammoniagenes 19353

Brevibacterium

ammoniagenes 19354

Brevibacterium

ammoniagenes 19355

Brevibacterium

ammoniagenes 19356

Brevibacterium

ammoniagenes 21055

Brevibacterium

ammoniagenes 21077

Brevibacterium

ammoniagenes 21553

Brevibacterium

ammoniagenes 21580

Brevibacterium

ammoniagenes 39101

Brevibacterium

butanicum 21196

Bacteria

Número de depósito

Género

especie ATCC FERM NRRL CEC T NCIMB CBS NCT C DSM Z

Brevibacterium

divaricatum 21792 P928

Brevibacterium

flavum 21474

Brevibacterium

flavum 21129

Brevibacterium

flavum 21518

Brevibacterium

flavum B11474

Brevibacterium

flavum B11472

Brevibacterium

flavum 21127

Brevibacterium

flavum 21128

Brevibacterium

flavum 21427

Brevibacterium

flavum 21475

Brevibacterium

flavum 21517

Brevibacterium

flavum 21528

Brevibacterium

flavum 21529

Brevibacterium

flavum B11477

Brevibacterium

flavum B11478

Brevibacterium

flavum 21127

Brevibacterium

flavum B11474

Brevibacterium

healii 15527

Brevibacterium

ketoglutamicum 21004

Brevibacterium

ketoglutamicum 21089

Brevibacterium

ketosoreductum 21914

Brevibacterium

lactofermentum 70

Brevibacterium

lactofermentum 74

Brevibacterium

lactofermentum 77

Brevibacterium

lactofermentum 21798

Brevibacterium

lactofermentum 21799

Bacteria

Número de depósito

Género

especie ATCC FERM NRRL CEC T NCIMB CBS NCT C DSM Z

Brevibacterium

lactofermentum 21800

Brevibacterium

lactofermentum 21801

Brevibacterium

lactofermentum B11470

Brevibacterium

lactofermentum B11471

Brevibacterium

lactofermentum 21086

Brevibacterium

lactofermentum 21420

Brevibacterium

lactofermentum 21086

Brevibacterium

lactofermentum 31269

Brevibacterium

linens 9174

Brevibacterium

linens 19391

Brevibacterium

linens 8377

Brevibacterium

paraffinolyticum 11160

Brevibacterium

spec. 717.73

Brevibacterium

spec. 717.73

Brevibacterium

spec. 14604

Brevibacterium

spec. 21860

Brevibacterium

spec. 21864

Brevibacterium

spec. 21865

Brevibacterium

spec. 21866

Brevibacterium

spec. 19240

Corynebacterium

acetoacidophilum 21476

Corynebacterium

acetoacidophilum 13870

Corynebacterium

acetoglutamicum B11473

Corynebacterium

acetoglutamicum B11475

Corynebacterium

acetoglutamicum 15806

Corynebacterium

acetoglutamicum 21491

Bacteria

Número de depósito

Género

especie ATCC FERM NRRL CEC T NCIMB CBS NCT C DSM Z

Corynebacterium

acetoglutamicum 31270

Corynebacterium

acetophilum B3671

Corynebacterium

ammoniagenes 6872 2399

Corynebacterium

ammoniagenes 15511

Corynebacterium

fujiokense 21496

Corynebacterium

glutamicum 14067

Corynebacterium

glutamicum 39137

Corynebacterium

glutamicum 21254

Corynebacterium

glutamicum 21255

Corynebacterium

glutamicum 31830

Corynebacterium

glutamicum 13032

Corynebacterium

glutamicum 14305

Corynebacterium

glutamicum 15455

Corynebacterium

glutamicum 13058

Corynebacterium

glutamicum 13059

Corynebacterium

glutamicum 13060

Corynebacterium

glutamicum 21492

Corynebacterium

glutamicum 21513

Corynebacterium

glutamicum 21526

Corynebacterium

glutamicum 21543

Corynebacterium

glutamicum 13287

Corynebacterium

glutamicum 21851

Corynebacterium

glutamicum 21253

Corynebacterium

glutamicum 21514

Corynebacterium

glutamicum 21516

Corynebacterium

glutamicum 21299

Bacteria

Número de depósito

Género

especie ATCC FERM NRRL CEC T NCIMB CBS NCT C DSM Z

Corynebacterium

glutamicum 21300

Corynebacterium

glutamicum 39684

Corynebacterium

glutamicum 21488

Corynebacterium

glutamicum 21649

Corynebacterium

glutamicum 21650

Corynebacterium

glutamicum 19223

Corynebacterium

glutamicum 13869

Corynebacterium

glutamicum 21157

Corynebacterium

glutamicum 21158

Corynebacterium

glutamicum 21159

Corynebacterium

glutamicum 21355

Corynebacterium

glutamicum 31808

Corynebacterium

glutamicum 21674

Corynebacterium

glutamicum 21562

Corynebacterium

glutamicum 21563

Corynebacterium

glutamicum 21564

Corynebacterium

glutamicum 21565

Corynebacterium

glutamicum 21566

Corynebacterium

glutamicum 21567

Corynebacterium

glutamicum 21568

Corynebacterium

glutamicum 21569

Corynebacterium

glutamicum 21570

Corynebacterium

glutamicum 21571

Corynebacterium

glutamicum 21572

Corynebacterium

glutamicum 21573

Corynebacterium

glutamicum 21579

Bacteria

Número de depósito

Género

especie ATCC FERM NRRL CEC T NCIMB CBS NCT C DSM Z

Corynebacterium

glutamicum 19049

Corynebacterium

glutamicum 19050

Corynebacterium

glutamicum 19051

Corynebacterium

glutamicum 19052

Corynebacterium

glutamicum 19053

Corynebacterium

glutamicum 19054

Corynebacterium

glutamicum 19055

Corynebacterium

glutamicum 19056

Corynebacterium

glutamicum 19057

Corynebacterium

glutamicum 19058

Corynebacterium

glutamicum 19059

Corynebacterium

glutamicum 19060

Corynebacterium

glutamicum 19185

Corynebacterium

glutamicum 13286

Corynebacterium

glutamicum 21515

Corynebacterium

glutamicum 21527

Corynebacterium

glutamicum 21544

Corynebacterium

glutamicum 21492

Corynebacterium

glutamicum B8183

Corynebacterium

glutamicum B8182

Corynebacterium

glutamicum B12416

Corynebacterium

glutamicum B12417

Corynebacterium

glutamicum B12418

Corynebacterium

glutamicum B11476

Corynebacterium

glutamicum 21608

Corynebacterium

lilium P973

Bacteria

Número de depósito

Género

especie ATCC FERM NRRL CEC T NCIMB CBS NCT C DSM Z

Corynebacterium

nitrilophilus 21419 11594

Corynebacterium

spec. P4445

Corynebacterium

spec. P4446

Corynebacterium

spec. 31088

Corynebacterium

spec. 31089

Corynebacterium

spec. 31090

Corynebacterium

spec. 31090

Corynebacterium

spec. 31090

Corynebacterium

spec. 15954 20145

Corynebacterium

spec. 21857

Corynebacterium

spec. 21862

Corynebacterium

spec. 21863

Las abreviaturas tienen el siguiente significado:

5 ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA FERM: Fermentation Research Institute, Chiba, Japón NRRL: ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, EUA CECT: Coleccion Española de Cultivos Tipo, Valencia, España NCIMB: National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, Reino Unido

10 CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, NL (Holanda) NCTC: National Collection of Type Cultures, London, UK (Reino Unido) DSMZ: Deutsche Sammlung de Mikroorganismen y Zellkulturen, Brunswick, Alemania Aquí se prefieren particularmente microorganismos de las bacterias del género Corynebacterium, principalmente

aquellas que ya son capaces de producir L-lisina, L-metionina y/o L-treonina. Estas son principalmente corine

15 bacterias en las que, por ejemplo, el gen que codifica una aspartato cinasa (gen ask) está desregulado o está eliminada o reducida la inhibición feedback (de retroalimentación). Por ejemplo, tales bacterias tienen una mutación en el gen ask, que conduce a una reducción o a una eliminación de la inhibición feedback (de retroalimentación) tal como, por ejemplo, la mutación T311I.

Las unidades de expresión permiten regular las vías metabólicas hacia productos biosintéticos específicos en las

20 bacterias corineformes genéticamente modificadas anteriormente descritas de acuerdo con la invención. Para este propósito, las vías metabólicas que conducen hacia un producto biosintético específico, por ejemplo, se refuerzan provocando o aumentando la velocidad de transcripción o la velocidad de expresión de los genes de esta

vía biosintética en la que la elevada cantidad de proteína conduce a una actividad total incrementada de estas proteínas de la vía biosintética deseada y, de esta manera, hacia un flujo metabólico reforzado hacia el producto biosintético deseado.

Además, las vías metabólicas que no conducen a un producto biosintético específico pueden atenuarse reduciendo la velocidad de transcripción o la velocidad de expresión de genes de esta vía biosintética divergente en la que la cantidad reducida de proteína conduce a una actividad total reducida de estas proteínas de la vía biosintética no deseada y, de esta manera, adicionalmente a un flujo metabólico reforzado hacia el producto biosintético deseado.

Las bacterias corineformes genéticamente modificadas de la invención son capaces, por ejemplo, de producir productos biosintéticos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón, celulosa o de glicerina y etanol.

La invención, por lo tanto, se refiere a un proceso para producir productos biosintéticos cultivando las bacterias corineformes genéticamente modificadas de la invención.

Dependiendo del producto biosintético deseado, la velocidad de transcripción o la velocidad de expresión de diferentes genes debe aumentarse o reducirse. Por lo regular es ventajoso modificar la velocidad de transcripción o la velocidad de expresión de varios genes; es decir, aumentar la velocidad de transcripción o la velocidad de expresión de una combinación de genes y/o reducir la velocidad de transcripción o la velocidad de expresión de una combinación de genes.

En las bacterias corineformes genéticamente modificadas de la invención, al menos una velocidad de transcripción o velocidad de expresión modificada, es decir incrementada o reducida, de un gen puede atribuirse a una unidad de expresión.

Otras velocidades de expresión modificadas adicionales, es decir adicionalmente aumentadas o adicionalmente reducidas, de otros genes en la bacteria corineforme genéticamente modificada pueden, aunque no tienen que, originarse en las unidades de expresión.

La invención, por lo tanto, se refiere además a un proceso para producir productos biosintéticos cultivando bacterias corineformes genéticamente modificadas de la invención.

V. Campos de aplicación de la invención

Los casetes de expresión y los vectores pueden (utilizarse), por ejemplo, de manera particularmente ventajosa en procesos mejorados para la producción por fermentación de productos biosintéticos, tal como se describe a continuación.

Los casetes de expresión que comprenden unidades de expresión, que contienen promotores múltiples, tienen principalmente la ventaja de permitir una modulación de la expresión del gen estructural enlazado funcionalmente.

Los casetes de expresión que comprenden unidades de expresión pueden utilizarse para modificar, es decir aumentar o reducir, o para provocar la velocidad de expresión de genes en microorganismos, en comparación con los de tipo silvestre. Esto proporciona la posibilidad, en el caso de un aumento en la velocidad de expresión, de maximizar la expresión del gene en cuestión. Eligiendo una unidad de expresión adecuada, sin embargo, la expresión también puede efectuarse a una intensidad que está por debajo del valor máximo que puede obtenerse mediante otra unidad de expresión, pero la cual al mismo tiempo libera el producto de expresión en una cantidad más compatible para el microorganismo que se está expresando. Esto es particularmente ventajoso si son tóxicas concentraciones demasiado altas del producto de expresión para el microorganismo que se está expresando. Las unidades de expresión de la invención permiten de esta manera, mediante selección entre unidades de expresión con intensidad de expresión respectivamente diferente, la regulación fina de la expresión a un valor óptimo, principalmente en el caso de expresión a largo plazo.

Además, los casetes de expresión que comprenden unidades de expresión pueden servir para regular y reforzar la formación de productos biosintéticos diferentes, como por ejemplo productos de química fina, proteínas, principalmente aminoácidos, en microorganismos, principalmente especies de Corynebacterium.

VI. Productos biosintéticos y métodos de producción preferidos

Los productos biosintéticos preparados de acuerdo con la invención son productos de química fina.

El término "producto de química fina" es corriente para el experto en la materia e incluye compuestos que se producen por un organismo y son utilizados en diversas ramas de la industria, tales como, por ejemplo, aunque sin restringirse a, la industria farmacéutica, agrícola, de cosméticos, de alimentos y comida para animales. Estos compuestos comprenden ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido láctico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido itacónico y ácido diaminopimélico y aminoácidos, tanto proteinogénicos como también no proteinogénicos, bases de purina y bases de pirimidina, nucleósidos y nucleótidos (como se describe por ejemplo en Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, páginas 561-612, en Biotechnology volumen 6, Rehm et al., editores VCH: Weinheim y las citas allí contenidas), lípidos, ácidos grasos saturados e insaturados (por ejemplo, ácido araquidónico), dioles (por ejemplo, propandiol y butandiol), carbohidratos (por ejemplo, ácido hialurónico y trehalosa), compuestos aromáticos (por ejemplo, aminas aromáticas, vanilina e índigo), vitaminas y cofactores (tal como se describen en Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, volumen A27, "Vitamins", páginas 443-613 (1996) VCH: Weinheim y las citas allí contenidas; y Ong, A.S., Niki, E. y Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, celebrada 1.-3. Sept. 1994 en Penang, Malasia, AOCS Press (1995)), Enzimas y todas los otros químicos descritos por Gutcho (1983) en Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 y las referencias bibliográficas allí indicadas.

Productos biosintéticos particularmente preferidos se seleccionan del grupo de ácidos orgánicos, proteínas, nucleótidos y nucleósidos, aminoácidos, tanto proteinogénicos como también no proteinogénicos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, enzimas y proteínas.

�?cidos orgánicos preferidos son ácido láctico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido itacónico y ácido diaminopimélico.

Nucleósidos y nucleótidos preferidos se describen preferiblemente en Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, páginas 561-612, en Biotechnology volumen 6, Rehm et al., editores VCH: Weinheim y las citas allí contenidas.

Los productos biosintéticos preferidos son, además, lípidos, ácidos grasos saturados y no saturados tal como, por ejemplo, el ácido araquidónico, dioles tales como, por ejemplo, propandiol y butandiol, carbohidratos tales como, por ejemplo, el ácido hialurónico y trehalosa, compuestos aromáticos tales como, por ejemplo, aminas aromáticas, vanilina e índigo vitaminas y cofactores como se describe, por ejemplo, en Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, volumen A27, "Vitamins", páginas 443-613 (1996) VCH: Weinheim y las citas allí contenidas; y Ong, A.S., Niki, E. y Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, celebrada en 1.-3. Sept. 1994 en Penang, Malasia, AOCS Press (1995)), enzimas policétidos (Cane et al. (1998) Science 282: 6368), y todos los otros productos químicos descritos por Gutcho (1983) en Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 y las referencias bibliográficas allí citadas.

Productos biosintéticos particularmente preferidos son aminoácidos, de manera particularmente preferida aminoácidos esenciales, principalmente L-glicina, L-alanina, L-leucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-triptófano, Llisina, L-glutamina, ácido L-glutámico, L-serina, L-prolina, L-valina, L-isoleucina, L-cisteína, L-tirosina, L-histidina, Larginina, L asparagina, ácido L-aspártico y L-treonina, L-homoserina, principalmente L-lisina, L-metionina y Ltreonina. En lo sucesivo, por un aminoácido como, por ejemplo, lisina, metionina y treonina se entiende aquí respectivamente la forma L y D del aminoácido, preferiblemente la forma L, es decir, por ejemplo L-lisina, Lmetionina y L-treonina.

En las secciones siguientes se describe más exactamente la producción de lisina, de metionina y de treonina, que se prefieren particularmente.

a) Producción de lisina

La invención se refiere principalmente a un proceso para producir lisina cultivando bacterias corineformes genéticamente modificadas con velocidad de expresión aumentada o provocada de al menos un gen en comparación con el de tipo silvestre, donde

-

la expresión de al menos un gen en la bacteria corineforme se causa o se modifica introduciendo a la bacteria corineforme un casete de expresión de la invención, el cual comprende el gen.

Los genes se seleccionan aquí en particular de entre ácidos nucleicos que codifican un aspartato cinasa, ácidos nucleicos que codifican un aspartato semialdehido dehidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un diaminopimelato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un diaminopimelato descarboxilasa, ácidos nucleicos que codifican un dihidrodipicolinato sintetasa, ácidos nucleicos que codifican un dihidrodipicolinato reductasa, ácidos nucleicos que codifican una gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican una 3-fosfoglicerato cinasa, ácidos nucleicos que codifican una piruvato carboxilasa, ácidos nucleicos que codifican una triosafosfato isomerasa, ácidos nucleicos que codifican un regulador transcripcional LuxR, ácidos nucleicos que codifican un regulador transcripcional LysR1, ácidos nucleicos que codifican un regulador transcripcional LysR2, ácidos nucleicos que codifican un malato quinona oxidoreductasa, ácidos nucleicos que codifican una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican 6-fosfogluconato-deshidrogenasa, ácidos nucleicos trancetolasa, ácidos nucleicos que codifican una transaldolasa, ácidos nucleicos que codifican un exportador de lisina, ácidos nucleicos que codifican una biotina ligasa, ácidos nucleicos que codifican un arginil-ARNt sintetasa, ácidos nucleicos que codifican una fosfoenolpiruvato carboxilasa, ácidos nucleicos que codifican una fructosa-1,6-bifosfatasa, ácidos nucleicos que codifican un proteína OpcA, ácidos nucleicos que codifican una 1fosfofructocinasa, ácidos nucleicos que codifican una 6-fosfofructocinasa, ácidos nucleicos que codifican una tetrahidropicolinato succinilasa, ácidos nucleicos que codifican una succinil aminocetopimelato aminotransferasa, ácidos nucleicos que codifican una succinil diaminopimelato desuccinilasa, ácidos nucleicos que codifican una diaminopimelato epimerasa, ácidos nucleicos que codifican una 6-fosfogluconato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican una glucosa fosfato isomerasa, ácidos nucleicos que codifican una fosfoglicerato mutasa, ácidos nucleicos que codifican una enolasa, ácidos nucleicos que codifican una piruvato-cinasa, ácidos nucleicos que codifican una aspartato-transaminasa y ácidos nucleicos que codifican una malato-enzima.

Otra forma de realización preferida del proceso descrito previamente para producir lisina se caracteriza porque las bacterias corineformes genéticamente modificadas en comparación con el tipo silvestre presenta una actividad elevada, al menos una de las actividades seleccionadas entre:

Actividad de aspartato-cinasa, actividad de aspartato-semialdehído-deshidrogenasa, actividad de diaminopimelatodeshidrogenasa, actividad de diaminopimelato-decarboxilasa, actividad de dihidrodipicolinato-sintetasa, actividad de dihidridipicolinato-reductasa, actividad de glicerinaldehído-3-fosfato deshidrogenasa, actividad de 3-fosfogliceratcinasa, actividad de piruvato carboxilasa, actividad de triosafosfato-isomerasa, actividad del Regulador transcripcional LuxR, actividad del regulador transcripcional LysR1, actividad del regulador transcripcional LysR2, actividad de malato-quinona-oxodoreductasa, actividad de glucosa-6-fosfato-deshidrogneasa, actividad de 6fosfogluconato-deshidrogneasa, actividad de transcetolasa, actividad de transaldolasa, actividad de exportador de lisina, actividad de arginilo-ARN-t-sintetasa, actividad de fosfoenolpiruvato-carboxilasa, actividad de fructosa 1,6bifosfatasa, actividad de la proteína OpcA, actividad de la 1-fosfofructocinasa, actividad de la 6- fosfofructocinasa, actividad de biotina ligasa, y actividad de tetrahidropicolinato succinilasa, actividad de succinil aminocetopimelato aminotransferasa, actividad de succinil diaminopimelato desuccinilasa, actividad de diaminopimelato epimerasa, actividad de 6-fosfogluconato deshidrogenasa, actividad de glucosa fosfato isomerasa, actividad de fosfoglicerato mutasa, actividad de enolasa, actividad de piruvato cinasa, actividad de aspartato transaminasa y actividad de enzima de malato.

Otra modalidad particularmente preferida del proceso descrito anteriormente para producir lisina se caracteriza porque las bacterias corineformes genéticamente modificadas que tienen, en comparación con el tipo silvestre, adicionalmente una actividad reducida, de al menos una de las actividades seleccionadas del grupo de actividad de treonina deshidratasa, actividad de homoserina O- acetiltransferasa, actividad de O-acetilhomoserina sulfhidrilasa, actividad de fosfoenolpiruvato carboxicinasa, actividad de piruvato oxidasa, actividad de homoserina cinasa, actividad de homoserina deshidrogenasa, actividad del exportador de treonina, actividad de proteína de effluxtreonina, actividad de asparaginasa, actividad de aspartato descarboxilasa y actividad de treonina sintasa.

b) Producción de metionina

La invención se refiere además a un proceso para producir metionina cultivando bacterias corineformes genéticamente modificadas con velocidad de expresión incrementada o provocada de al menos un gen en comparación con el tipo silvestre, en cuyo caso

-

la expresión de al menos un gen en la bacteria corineforme se provoca o se modifica introduciendo en las bacterias corineformes un casete de expresión que comprende el gen.

Los genes se seleccionan aquí principalmente entre ácidos nucleicos que codifican una aspartato cinasa, ácidos nucleicos que codifican un aspartato semialdehido deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un homoserina deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un glicerinaldehido-3-fosfato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un 3- fosfoglicerato cinasa, ácidos nucleicos que codifican un piruvato carboxilasa, ácidos nucleicos que codifican un triosafosfato isomerasa, ácidos nucleicos que codifican un homoserina O-acetiltransferasa, ácidos nucleicos que codifican una cistahionina gamma-sintasa, ácidos nucleicos que codifican una cistahionina beta liasa, ácidos nucleicos que codifican una serina hidroximetiltransferasa, ácidos nucleicos que codifican una Oacetilhomoserina sulfhidrilasa, ácidos nucleicos que codifican una metilenotetrahidrofolato reductasa, ácidos nucleicos que codifican una fosfoserina aminotransferasa, ácidos nucleicos que codifican una fosfoserina fosfatasa, ácidos nucleicos que codifican una serina acetil transferasa, ácidos nucleicos que codifican una actividad de cisteína cintasa I, ácidos nucleicos que codifican una actividad de cisteína sintasa II, ácidos nucleicos que codifican una actividad de metionina sintasa dependiente de la coenzima B 12, ácidos nucleicos que codifican una actividad de metionina sintasa independiente de la coenzima B-12, ácidos nucleicos que codifican una actividad de un sulfato adeniltransferasa, ácidos nucleicos que codifican una actividad de una fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ácidos nucleicos que codifican una actividad de una ferredoxin sulfito reductasa, ácidos nucleicos que codifican un actividad de ferredoxin NADPH reductasa, ácidos nucleicos que codifican un actividad de ferredoxin, ácidos nucleicos que codifican un proteína de reducción RXA077 de sulfato, ácidos nucleicos que codifican un proteína de reducción de sulfato RXA248, ácidos nucleicos que codifican un proteína de reducción de sulfato RXA247, ácidos nucleicos quecodifican un regulador RXA655 y ácidos nucleicos que codifican un regulador RXN2910. �?cidos nucleicos que codifican 6-fosfogluconato deshidrogenasa, glucosa fosfato isomerasa, fosfoglicerato mutasa, enolasa, piruvato cinasa, aspartato transaminasa o enzima de malato.

Otra modalidad preferida del proceso descrito anteriormente para producir metionina se caracteriza porque las bacterias corineformes genéticamente modificadas, en comparación con el tipo silvestre, tienen adicionalmente una actividad incrementada de al menos una de las actividades seleccionadas del grupo de actividad de aspartato cinasa, actividad de aspartato-semialdehído-deshidrogenasa, actividad de homoserina deshidrogenasa, actividad de glicerinaldehído-3-fosfato deshidrogenasa, actividad de 3-fosfoglicerato cinasa, actividad de piruvato carboxilasa, actividad de triosafosfato isomerasa, actividad de homoserina O-acetiltransferasa, actividad de cistahionina gammasintasa, actividad de cistahionina beta-liasa, actividad de serina-hidroximetiltransferasa, actividad de Oacetilhomoserina-sulfhidrilasa, actividad de metilen-tetrahidrofolato-reductasa, actividad de fosfoserinaaminotransferasa, actividad de fosfoserina-fosfatasa, actividad de serina acetil-transferasa, actividad de cisteínasintasa, actividad de cisteína-sintasa II, actividad de de metionina-sintasa dependiente de coenzima B12, actividad de metionina-sintasa independiente de coenzima B12, actividad de sulfato-adenililtransferasa, actividad de fosfoadenosina-fosfosulfato-reductasa, actividad de ferredoxina-sulfito-reductasa, actividad de ferredoxina NADPHreductasa, actividad de ferredoxina, actividad de proteína de la reducción de sulfato RXA077, actividad de una proteína de la reducción de sulfato RXA248, actividad de una proteína de la reducción de sulfato RXA247, actividad de un regulador RXA655 y actividad de un regulador RXN2910, actividad de una 6-fosfogluconato-deshidrogenasa, actividad de una glucosafosfato-isomerasa, actividad de una fosfoglicerato-mutasa, actividad de una enolasa, actividad de una piruvato-cinasa, actividad de una aspartato-transaminasa y actividad de la malato-enzima.

Otra modalidad particularmente preferida del método descrito anteriormente para producir metionina se caracteriza porque las bacterias corineformes genéticamente modificadas tienen adicionalmente, en comparación con el tipo silvestre, una actividad reducida, de al menos una de las actividades seleccionadas del grupo de actividad de homoserina cinasa, actividad de treonina deshidratasa, actividad de treonina sintasa, actividad de mesodiaminopimelato D-deshidrogenasa, actividad de fosfoenolpiruvato carboxicinasa, actividad de piruvato oxidasa, actividad de dihidrodipicolinato sintasa, actividad de dihidropicolinato reductasa y actividad de diaminopicolinato descarboxilasa.

c) Producción de treonina

La invención se refiere además a un proceso para producir treonina cultivando bacterias corineformes genéticamente modificadas con velocidad de expresión incrementada o provocada de al menos un gen en comparación con el tipo silvestre, en cuyo caso

-

la expresión de al menos un gen en la bacteria corineforme se provoca o se modifica introduciendo a la bacteria corineforme un casete de expresión que comprende el gen.

Los genes se seleccionan aquí principalmente entre ácidos nucleicos que codifican un aspartato cinasa, ácidos nucleicos que codifican un aspartato semialdehido deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un 3- fosfoglicerato cinasa, ácidos nucleicos que codifican un piruvato carboxilasa, ácidos nucleicos que codifican una triosafosfato isomerasa, ácidos nucleicos que codifican una homoserina-cinasa, ácidos nucleicos que codifican una treonina sintasa, ácidos nucleicos que codifican un portador transportador de treonina, ácidos nucleicos que codifican una glucose-6-fosfatodeshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican una transaldolasa, ácidos nucleicos que codifican una transcetolasa, ácidos nucleicos que codifican una malato-quinona-oxidoreductasa, ácidos nucleicos que codifican una 6fosfogluconato-deshidrogenasa, ácidos nucleicos que codifican un exportador de lisina, ácidos nucleicos que codifican una biotina-ligasa, ácidos nucleicos que codifican una fosfoenolpiruvato-carboxilasa, ácidos nucleicos que codifican una proteína Efflux de treonina, ácidos nucleicos que codifican una fructosa-1,6-bisfosfatasa, ácidos nucleicos que codifican una proteína OpcA, ácidos nucleicos que codifican una 1-fosfofructocinasa, ácidos nucleicos que codifican una 6-fosfofructocinasa, y ácidos nucleicos que codifican una homoserina-deshidrogenasa y ácidos nucleicos que codifican una 6-fosfogluconato-deshidrogenasa, glucosafosfato-isomerasa, fosfoglicerato-mutasa, enolasa, piruvato-cinasa, aspartato-transaminasa y malato-enzima.

Otra modalidad preferida del método descrito previamente para producir treonina se caracteriza porque las bacterias corineformes genéticamente modificadas tienen adicionalmente, en comparación con el tipo silvestre, una actividad incrementada, de al menos una de las actividades seleccionadas del grupo:

actividad de aspartatocinasa, actividad de aspartato-semialdehído-deshidrogenasa, actividad de glicerinaldehído-3fosfato deshidrogenasa, actividad de 3-fosfoglicerat cinasa, actividad de piruvato carboxilasa, actividad de triosafosfato isomerasa, actividad de treonina sintasa, actividad de un portador transportador de treonina, actividad de transaldolasa, actividad de transcetolasa, actividad de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, actividad de malatoquinona-oxidoreductasa, actividad de homoserina-cinasa, actividad de biotina-ligasa, actividad de fosfoenolpiruvatocarboxilasa, actividad de proteína de efflux-treonina, actividad de proteína OpcA, actividad de 1-fosfofructocinasa, actividad de 6-fosfofructocinasa, actividad de fructosa 1,6-bisfosfatasa, actividad de 6-fosfogluconatodeshidrogenasa, actividad de homoserina-deshidrogenasa, actividad de una 6-fosfogluconato-deshidrogenasa, actividad de una glucosafosfato-isomerasa, actividad de una fosfoglicerato-mutasa, actividad de una enolasa, actividad de una piruvato-cinasa, actividad de una aspartato-transaminasa y actividad de la malato-enzima.

Otra modalidad particularmente preferida del proceso previamente descrito para producir treonina se caracteriza porque las bacterias corineformes genéticamente modificadas tienen adicionalmente, en comparación con el tipo silvestre, una actividad reducida, de al menos una de las actividades, seleccionadas del grupos de actividad de treonina – deshidratasa, actividad de homoserina O-acetiltransferasa, actividad de serina-hidroximetiltransferasa, actividad de O-acetilhomoserina-sulfhidrilasa, actividad de meso-diaminopimelato D-deshidrogenasa, actividad de fosfoenolpiruvato-carboxicinasa, actividad de piruvato-oxidasa, actividad de dihidrodipicolinato sintetasa, actividad de dihidrodipicolinato reductasa, actividad de asparaginasa, actividad de aspartato-descarboxilasa, actividad de exportador de lisina, actividad de acetolactato-sintasa, actividad de ácido cetol reductoisomerasa, actividad de aminotransferasa de cadena ramificada, actividad de metionina sintasa dependiente de la coenzima B-12, actividad de metionina sintasa independiente de la coenzima B-12, actividad de dihidroxi ácido dehidratasa y actividad de diaminopicolinato descarboxilasa.

d) Otros datos sobre la producción de bioproductos según la invención

Estas actividades incrementadas o reducidas adicionales de al menos una de las actividades descritas anteriormente pueden, aunque no necesariamente, provocarse por una unidad de expresión de la invención o por un casete de expresión de la invención. Actividades de al menos una de las actividades previamente descritas pueden, pero no tienen que, ocasionarse por uno o por un casete de expresión.

Por el término "actividad" de una proteína se entiende, en el caso de una enzima, la actividad enzimática de la proteína correspondiente; en el caso de otras proteínas, como por ejemplo proteínas de estructura o de transporte, la actividad fisiológica de las proteínas.

Las enzimas por lo regular están en capacidad de transformar un sustrato a un producto o de catalizar este paso de transformación. Por consiguiente, por "actividad" de una enzima se entiende la cantidad convertida del sustrato o la cantidad formada de producto por parte de la enzima en un tiempo determinado.

En el caos de una actividad incrementada en comparación con el tipo silvestre se incrementa de esta manera la cantidad transformada de sustrato o la cantidad formada de producto por parte de la enzima, en comparación con el tipo silvestre en un tiempo determinado.

A manera de ejemplo, este incremento de la "actividad", en el caso de todas las actividades descritas antes y después, es de al menos 1 a 5 %, como por ejemplo de al menos 20 %, de al menos 50 %, de al menos 100 %, de al menos 300 %, o de al menos 500%, o de al menos 600 % de la "actividad del tipo silvestre".

En el caso de una actividad reducida en comparación con el tipo silvestre, se reduce la cantidad convertida de sustrato o la cantidad de producto formado por parte de la enzima en un tiempo determinado.

Por una actividad reducida se entiende preferentemente la supresión o bloqueo parcial o esencialmente total, basado en diferentes mecanismos biológicos celulares, de la funcionalidad de estas enzimas en un microorganismo.

Una reducción de la actividad comprende una disminución cuantitativa de una enzimas hasta una ausencia esencialmente completa de la enzimas (es decir, falta de detectabilidad de la correspondiente actividad o falta de detectabilidad inmunológica de la enzima). La actividad en el microorganismo se reduce en comparación con el tipo silvestre en al menos 5 %, como al menos 20 %, al menos 50 %, o en aproximadamente 100 %. "Reducción" también significa principalmente la falta total de la actividad correspondiente.

La actividad de determinadas enzimas en microorganismos genéticamente modificados así como en el tipo silvestre y de esta manera el incremento o la reducción de la actividad enzimática pueden determinarse de acuerdo con métodos conocidos, como por ejemplo ensayos enzimáticos.

Un incremento adicional de actividades puede efectuarse de diferentes manera, por ejemplo desconectando mecanismos de regulación inhibitorios a nivel de expresión o de proteína o incrementando la expresión del gen de ácidos nucleicos que codifican las proteínas previamente descritas en comparación con el tipo silvestre.

El incremento de la expresión del gen de los ácidos nucleicos que codifican las proteínas descritas anteriormente frente al tipo nativo puede efectuarse igualmente de maneras diferentes, por ejemplo induciendo el gen mediante activadores o, como se describió anteriormente, incrementando la actividad de promotor o incrementando la actividad de expresión o introduciendo una o más copias del gen en el microorganismo.

Por aumento de la expresión del gen de un ácido nucleico que codifica una proteína también se entiende de acuerdo con la invención la manipulación de la expresión de las proteínas endógenas propias del microorganismo. Esto puede lograrse por ejemplo, como se describió anteriormente, modificando las secuencias de promotor de los genes, introduciendo una unidad de expresión para el control regulador de los genes y modificando las unidades de expresión introducidas. Una modificación tal, que tiene como consecuencia una velocidad de expresión incrementada del gen, puede efectuarse por ejemplo por eliminación o inserción de secuencias de ADN.

Es posible, tal como se describió previamente, modificar la expresión de las proteínas endógenas mediante la aplicación de estímulos exógenos. Esto puede efectuarse mediante condiciones fisiológicas particulares, es decir mediante la aplicación de sustancias externas.

Para lograr un incremento de la expresión del gen el experto en la materia puede adoptar otras medidas diferentes, de manera individual o en combinación. Así, por ejemplo, el número de copias de los genes correspondientes puede elevarse o la región de promotor y regulación, o el sitio de enlace ribosómico que se encuentra corriente arriba del gen estructural, puede mutarse. Adicionalmente es posible incrementar la expresión durante la producción fermentativa a través de promotores inducibles. Los procedimientos para prolongar el tiempo de vida del ARNm mejoran igualmente la expresión. Además, la actividad enzimática también se refuerza previniendo la degradación de la proteína de la enzima. Los genes o las constructos del gen pueden estar presentes en plásmidos con diferente número de copias o integrados y amplificados en el cromosoma. De manera alterna, también puede lograrse una sobreexpresión de los genes relevantes modificando la composición del medio y mediante el control del cultivo.

El experto en la materia encuentra instrucciones para esto, entre otras, en Martin et al. (Biotechnology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der EP-A-0472869, en US -A-4,601,893, en Schwarzer y Pühler (Biotechnology 9, 84-87 (1991), en Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), en la JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,.191-195 (1998)), en Makrides (Microbiological Reviews 60 : 512-538 (1996) y en textos de enseñanza conocidos de genética y biología molecular.

Adicionalmente puede ser ventajoso para la producción de productos biosintéticos, principalmente L-lisina, Lmetionina y L-treonina, junto con la expresión o intensificación de un gen, eliminar reacciones laterales no deseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en: Overproduction of Microbial Products, Krumfanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

En una modalidad preferida, el incremento de la expresión del gen de un ácido nucleico que codifica una de las proteínas descritas anteriormente, se efectúa introduciendo al microorganismo al menos un ácido nucleico que codifica una proteína correspondiente. La introducción del ácido nucleico puede efectuarse de manera cromosómica

o de manera extracromosómica, es decir, incrementando en el microorganismo huésped el número de copias en el cromosoma y/o una copia del gen sobre un plásmido que se replica.

La introducción del ácido nucleico, por ejemplo en la forma de un casete de expresión de la invención que comprende el ácido nucleico, preferiblemente se efectúa de manera cromosómica, principalmente por el método SacB descrito previamente. Es posible en principio usar para este propósito cualquier gen que codifica una de las proteínas descritas previamente.

En el caso de secuencias de ácidos nucleicos genómicos de fuentes eucariotas las cuales contienen intrones, si el microorganismo huésped es incapaz o no puede ser hecho capaz de expresar las proteínas correspondientes se prefiere usar secuencias de ácidos nucleicos las cuales ya han sido procesadas, tal como los ADNc correspondientes.

Ejemplos de genes correspondientes se listan en las tablas 1 y 2.

La reducción de las actividades descritas previamente en bacterias corineformes se efectúa preferentemente mediante al menos uno de los siguientes métodos:

•

la introducción de al menos una secuencia de ácido ribonucleico sense (sentido) para inducir una cosupresión o de un casete de expresión que garantiza su expresión

•

la introducción de al menos un factor de enlace de ADN o de proteína para un gen correspondiente, un ARN o una proteína o de un casete de expresión que garantiza su expresión

•

la introducción de al menos una secuencia de ácido nucleico viral la cual provoca degradación de ARN o de un casete de expresión que garantiza su expresión

•

la introducción de al menos un constructo para generar una pérdida de función, tal como, por ejemplo, la generación de stop-codones o desplazamientos en la estructura de lectura, de un gen, por ejemplo generando una inserción, eliminación, inversión o mutación en un gen. Preferiblemente pueden generarse mutantes knockout mediante inserción dirigida al gen objetivo deseado a través de la recombinación homóloga o de la introducción de nucleasas de secuencias especificas contra el gen objetivo.

•

la introducción de un promotor con actividad de promotor reducida o de una unidad de expresión con actividad de expresión reducida.

•

La introducción de un ARN antisense (de antisentido) que reduce la traslación del ARN sense (de sentido) (ARNm).

Para el experto en la materia es conocido que también pueden emplearse otros métodos en el contexto de la presente invención para reducir su actividad o función. Por ejemplo, también puede ser ventajosa la introducción de una variante negativa dominante de una proteína o de un casete de expresión que garantiza su expresión.

Además, cada uno de estos procesos individuales puede producir una reducción en la cantidad de proteína, la cantidad de ARNm y/o la actividad de una proteína. También es concebible una aplicación combinada. Otros métodos son conocidos por el experto en la materia y pueden comprender impedir o suprimir el procesamiento de la proteína, el transporte de la proteína o su ARNm, la inhibición de la adición del ribosoma, la inhibición de la unión del ARN, la inducción de una enzima que degrada el ARN y/o la inhibición o la terminación de la elongación de la traslación.

VII. Cultivo de bacterias corineformes y aislamiento de producto

En el proceso de la invención para producir productos biosintéticos, la etapa de cultivo de los microorganismos genéticamente modificados es preferiblemente seguida por un aislamiento los productos biosintéticos de los microorganismos y/o del caldo de fermentación. Estas etapas pueden tener lugar al mismo tiempo y/o preferiblemente después de la etapa de cultivo.

Las bacterias corineformes genéticamente modificados de la invención pueden cultivarse para producir productos biosintéticos, principalmente L-lisina, L-metionina, L-treonina, de manera continua o de manera discontinua en un proceso por lotes (cultivo por lote) o en procesos de alimentación por lotes o de alimentación por lotes repetidos. Un resumen de métodos de cultivo conocidos se encuentra en el libro de texto de Chemiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Tecnología de bioprocesos 1. Introducción a la tecnología de bioprocesos) (Editorial Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren y periphere Einrichtungen (Bioreactores y dispositivos periféricos) (editorial Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo a usarse debe satisfacer de una manera adecuada las exigencias de las cepas respectivas. Existen descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).

Estos medios que pueden emplearse de acuerdo a la invención usualmente comprenden una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/o microelementos.

Fuentes de carbono preferidas son los azúcares tales como los mono-, di- o polisacáridos. Ejemplos de fuentes de carbono muy buenas son la glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidón o celulosa. Los azucares pueden también ponerse en el medio a través de compuestos complejos tales como las melazas u otros subproductos de la refinación de azúcar. También puede ser ventajoso agregar mezclas de diversas fuentes de carbono. Otras posibles fuentes de carbono son los aceites y las grasas tales como, por ejemplo, aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico o ácido linoleico, alcoholes tales como, por ejemplo, glicerina, metanol o etanol y ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido láctico.

Las fuentes de nitrógeno son usualmente compuestos de nitrógeno orgánicos e inorgánicos o materiales que contienen estos compuestos. Ejemplos de fuentes de nitrógeno comprenden gas amoniaco o sales de amonio tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoácidos o fuentes de nitrógeno de complejas tales como agua de infusión de maíz, harina de soya, proteína de soya, extracto de levadura, extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrógeno pueden usarse de manera individual o como mezcla.

Los compuestos de sales inorgánicas los cuales pueden estar presentes en el medio comprenden las sales de cloruro, de fósforo, o sales sulfatos de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, cinc, cobre y hierro.

Como fuentes de azufre para producir productos de química fina, principalmente metionina, pueden usarse compuestos inorgánicos tales como, por ejemplo, sulfatos, sulfitos, ditionitos, tetrationatos, tiosulfatos, sulfuros, pero también compuestos de azufre orgánicos tales como mercaptanos y tioles.

Como fuente de fósforo puede usarse ácido fosfórico, dihidrofosfato de potasio o hidrofosfato de dipotasio o las sales correspondientes que contienen sodio.

Pueden agregarse agentes formadores de quelatos al medio para mantener los iones metálicos en solución. Agentes formadores de quelatos particularmente adecuados comprenden dihidroxifenoles tales como catecol o protocatecuate o ácidos orgánicos tal como el ácido cítrico.

Los medios de fermentación empleados de acuerdo con la invención usualmente también contienen otros factores de crecimiento tales como vitaminas o promotores de crecimiento, a los cuales pertenecen por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotinico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales frecuentemente provienen de componentes complejos del medio, tales como extracto de levadura, melazas, agua de infusión de maíz, y similares. También pueden agregarse precursores adecuados al medio de cultivo. La composición exacta de los compuestos en el medio depende en gran medida del experimento respectivo y se decide de manera individual para cada caso específico. Información sobre la optimización del medio se puede obtener del manual "Applied Microbiol. Phisiology, A Practical Approach" (editores P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) páginas 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Medios de cultivo también pueden comprarse de proveedores comerciales, como Standard 1 (Merck) o BHI (Brain heart infusion, DIFCO) y similares.

Todos los componentes del medio se esterilizan ya sea con calor (20 min a 1,5 bar y 121°C) o mediante esterilización por filtración. Los componentes pueden esterilizarse ya sea juntos o sí es necesario de manera separada. Todos los componentes del medio pueden estar presentes al inicio del cultivo u opcionalmente pueden agregarse de manera continua o a manera de lotes.

La temperatura del cultivo está normalmente entre 15°C y 45°C, preferiblemente a 25°C hasta 40°C y puede mantenerse constante o modificarse durante el experimento. El pH del medio debe estar en el rango de 5 a 8,5, preferiblemente alrededor de 7,0. El pH para el cultivo puede controlarse durante el cultivo agregando compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o amoniaco acuoso o compuestos ácidos tales como ácido fosforito o ácido sulfúrico. El desarrollo de espuma puede controlarse empleando antiespumantes tales como, por ejemplo, esteres de poliglicol de ácido graso. La estabilidad de los plásmidos puede mantenerse agregando sustancias adecuadas al medio con una acción selectiva, tal como, por ejemplo, antibióticos. Las condiciones aeróbicas se mantienen introduciendo al cultivo oxígeno o mezclas de gas que contienen oxígeno, como por ejemplo aire de ambiente. La temperatura del cultivo es normalmente 20°C a 45°C. El cultivo se continúa hasta que la formación del producto deseado se encuentra al máximo. Este objetivo normalmente se alcanza dentro de 10 horas a 160 horas.

El contenido de materia seca de los caldos de fermentación obtenidos de esta manera es normalmente de 7,5 a 25% en peso.

Adicionalmente también es ventajoso realizar la fermentación con límite de azúcar al menos al final, pero en particular en al menos 30% del tiempo de fermentación. Esto quiere decir que la concentración de azúcar utilizable en el medio de fermentación se mantiene en 0 a 3 g/l, o se reduce, durante este tiempo.

Los productos biosintéticos se aíslan del caldo de fermentación y/o de los microorganismos de una manera conocida per se de acuerdo con las propiedades físicas/químicas del producto biosintético requerido y de los subproductos biosintéticos.

El caldo de fermentación puede procesarse a continuación, por ejemplo. Dependiendo del requerimiento, la biomasa puede retirarse totalmente o parcialmente del caldo de fermentación por métodos de separación tales como, por ejemplo, centrifugación, filtración, decantación o una combinación de estos métodos, o dejarse completamente en este.

A continuación, el caldo de fermentación puede espesarse o concentrarse por métodos conocidos tales como, por ejemplo, con la ayuda de un evaporador rotatorio, evaporador de película delgada, evaporador de película de caída, por osmosis inversa o por nanofiltración. A continuación, este caldo de fermentación concentrado puede procesarse por secado por congelamiento, secado por pulverización, granulación por pulverización o por otros métodos.

Sin embargo, también es posible seguir purificando los productos biosintéticos, especialmente la L-lisina, Lmetionina y la L-treonina. Para este propósito, el caldo que contiene el producto se somete, después de la eliminación de la biomasa, a una cromatografía usando una resina adecuada, en cuyo caso el producto deseado o las impurezas se retienen total o parcialmente en la resina cromatográfica. Estas etapas cromatograficas pueden repetirse sí se requiere, en cuyo caso se usan resinas de cromatografía iguales o diferentes. El experto en la materia es hábil en la selección de resinas de cromatografía adecuadas y sus usos más efectivos. El producto purificado puede concentrarse por filtración o ultrafiltración y almacenarse a una temperatura a la cual la estabilidad del producto es máxima.

Los productos biosintéticos pueden resultar en diversas formas, por ejemplo en forma de sus sales o ésteres.

La identidad y pureza del (de los) compuesto (s) aislado(s) puede determinarse por técnicas del estado de la técnica. Estas comprenden cromatografía líquida a alta presión (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de teñido, cromatografía de capa delgada, NIRS, ensayos de enzima o ensayos microbiológicos. Estos métodos analíticos se resumen en: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 2732; y Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) volumen A27, VCH: Weinheim, páginas 89-90, páginas 521-540, páginas 540-547, páginas 559-566, 575-581 y páginas 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, volumen 17.

La invención se describe ahora en más detalle por medio de los siguientes ejemplos no limitantes:

Ejemplo 1:

Preparación del vector pCLiK5MCS

Primero la resistencia a la ampicilina y el origen de replicación del vector pBR322 se amplificaron con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores oligonucleótidos de SEQ NO:5 y SEQ ID: 6.

Aparte de las secuencias complementarias para el pBR322, el cebador de oligonucleótido de SEQ ID NO: 5 comprende, en la dirección 5’-3’, los sitios de corte para la endonucleasa de restricción Smal, BarnHL, Nhel, y Ascl, y el cebador de oligonucleótido de SEQ ID NO: 6 comprende, en la dirección 5’-3’, los sitios de corte para las endonucleasas de restricción Xbal, Xhol, Notl y Dral. La reacción PCR se lleva a cabo mediante un método estándar tal como el Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) con PfuTurbo Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA). El fragmento de ADN obtenido, cuyo tamaño es aproximadamente de 2.1 kb, se purifica usando el Kit de Purificación de PCR, ADN, GFX™ y Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del proveedor. Los extremos romos del fragmento de ADN se ligan entre sí usando el Rapid DNA Ligation Kit (Rache Diagnostics, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transforma según los métodos estándar tal como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1 Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección sobre células que portan plásmido colocando en placas con sobre agar LB que contiene ampicilina (50 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

El ADN plásmido de un clon individual se aisló usando el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) según las indicaciones del fabricante y se verificó por digestión de restricción. El plásmido obtenido de esta forma recibe el nombre de pCLiK1.

A partir del plásmido pWLTl (Liebl et al., 1992) como plantilla para una reacción PCR, se amplificó un casete de resistencia a kanamicina usando los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID N:7 y SEQ ID NO:8.

SEQ ID NO:7:

5’-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3‘

SEQ ID NO:8

5’-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3’

Aparte de las secuencias complementarias para pWLT1, el cebador de oligonucleótido SEQ ID NO:7 contiene, en la dirección 5’-3’, los sitios de corte para las endonuclesas de restricción Xbal, BamHI, Nhel, y el cebador de oligonucleótido de SEQ ID NO: 8 contiene, en la dirección 5’-3’, los sitios de corte para las endonucleasas de restricción Ascl y Nhel. La reacción PCR se realiza según el método estándar tal como Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) usando polimerasa PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, EUA). El fragmento de ADN obtenido, cuyo tamaño es aproximadamente de 1,3 kb, se purificó usando el GFX™PCR y Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. El fragmento de ADN se cortó mediante las endonucleasas de restricción Xbal y AscI (New England Biolabs, Beverly, EUA) y nuevamente se purificó a continuación usando GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit, (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. El vector pCLiK1 se cortó igualmente con las nucleasas de restricción Xbal y AscI y se desfosforiló con fosfatasa alcalina (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) según indicaciones del fabricante. Después de electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% se aisló el vector linealizado (cerca de 2,1kb) con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. Este fragmento de vector se ligó con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante con el fragmento PCR cortado y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB Agar que contiene ampicilina (50 !g/ml) y kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

El ADN plásmido de un clon individual se aisló usando el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) según indicaciones del fabricante y se verificó por digestión de restricción. El plásmido obtenido de esta manera recibe el nombre de pCLiK2.

El vector pCLiK2 se cortó con la endonucleasa de restricción Dral (New England Biolabs, Beverly, EUA). Después de electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% se aisló un fragmento de vector con un tamaño de cerca de 2,3 kb con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. Este fragmento de vector se re-ligó con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón según métodos estándar tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

El ADN de plásmido de un clon individual se aisló con el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) según indicaciones del fabricante y se verificó por digestión de restricción. El plásmido obtenido obtiene el nombre de pCLiK3.

A partir de plásmido pWLQ2 (Liebl et al., 1992) como planilla para una reacción PCR se amplificó el origen de replicación pHM1519 con cebadores de oligonucleótidos SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:9:

5’-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3’

SEQ ID NO:10:

5’-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3’

Junto a las secuencias complementarias a pWLQ2, los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10 contienen sitios de corte para la nucleasa de restricción Notl. La reacción PCR se realizó según método estándar como Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) con PfuTurbo Polymerase (Stratagene, La Jolla, EUA). El fragmento de ADN obtenido con un tamaño de 5 aproximadamente 2,7 kb se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. El fragmento de ADN se cortó con la endonucleasa de restricción Notl (New England Biolabs, Beverly, EUA) y a continuación a esto nuevamente se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. El vector pCLiK3 se cortó igualmente con la endonucleasa de restricción Notl y se desfosforiló con fosfatasa alcalina (I (Roche 10 Diagnostics, Mannheim)) según indicaciones del fabricante. Después de electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% se aisló el vector linealizado (cerca de 2,3kb) con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. Este fragmento de vector se ligó con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante con el fragmento de PCR cortado y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar, como los descritos en Sambrook et al. (Molecular

15 Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido mediante cultivo en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

El ADN de plásmido de un clon individual se aisló con el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) según indicaciones del fabricante y se verificó por digestión de restricción. El plásmido obtenido de esta manera obtiene el

20 nombre de pCLiK5.

Para la ampliación de pCLiK5 en un "multiple cloning site" (MCS) ambos oligonucleótidos sintéticos, en gran medida complementarios, de SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12, que contienen sitios de corte para las nucleasas de restricción Swal, Xhol, Aatl, Apal, Asp718, MluI, NdeI, SpeI, EcoRV, SalI, ClaI, BamHI, Xbal y Smal, se fusionan mediante calentamiento conjunto a 95°C y enfriamiento lento para producir un fragmento de ADN bicatenario.

El vector pCLiK5 se cortó con las endonucleasas de restricción XhoI y BamHI (New England Biolabs, Beverly, EUA) y se desfosforiló con fosfatasa alcalina (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) según indicaciones del fabricante. Después de electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% se aisló el vector linealizado (cerca de 5,0 kb) con el 30 GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. Este fragmento de vector se ligó con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante con el fragmento de ADN sintético y la mezcla de ligazón se transformó, según métodos estándar como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1Blue competente (Stratagene, La Jolla, EUA). Se logró una selección en células que portan

35 plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

El ADN de plásmido de un clon individual se aisló con el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) según indicaciones del fabricante y se verificó por digestión de restricción. El plásmido obtenido de esta manera recibe el nombre de pCLiK5MCS.

40 Las reacciones de secuenciación se realizaron según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciación se fraccionaron y se evaluaron por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

El plásmido resultante pCLiK5MCS se lista como SEQ ID NO:13.

Ejemplo 2:

Preparación del plásmido PmetA metA

ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 se preparó según Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Con el cebador de oligonucleótido SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15, el ADN cromosómico como plantilla y Pfu Turbo Polymerase (de la empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) según métodos estándar, tal como se describe en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, se amplificó el gen metA que incluye la región 5’ no codificante.

SEQ ID NO: 14

5‘-GCGCGGTACCTAGACTCACCCCAGTGCT -3’

y

SEQ ID NO: 15

5’-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT -3’

El fragmento de ADN obtenido de aproximadamente 1,3 kb de tamaño se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. A continuación, se escindió con las enzimas de restricción Asp718 y Spel (Roche Diagnostics, Mannheim) y el fragmento de ADN se purificó con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

El vector pClik5MCS SEQ ID NO: 13 se cortó con las enzimas de restricción Asp718 y SpeI y se aisló un fragmento con un tamaño de 5 kb, después de la separación electroforética con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

El fragmento de vector se ligó junto con el con el fragmento de PCR con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar, tal como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1 Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

La preparación del plásmido de ADN se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Se realizaron Reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciación se separaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

El plásmido resultante pCLiK5MCS PmetA metA se lista como SEQ ID NO 16.

Ejemplo 3:

Preparación del plásmido pCLiK5MCS Psod metA

ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 se preparó según Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Con el cebador de oligonucleótido SEQ ID NO 17 y SEQ ID NO 18, del ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), según métodos estándar como Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pares de bases de la región 5’ no codificante (región de la unidad de expresión) de la dismutasa de superóxido (Psod).

SEQ ID NO: 17

5’-GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG-3’

y

SEQ ID NO: 18 5’-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGGGTAAAAAATCCTTTCG -3’

El fragmento de ADN obtenido se purifición con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante.

A partir del plásmido PmetA metA SEQ ID NO: 16 como plantilla para una reacción PCR, con los cebadores de 5 oligonucleótidos SEQ ID NO: 19: y SEQ ID NO: 20: se amplificó una parte de metA.

SEQ ID NO: 19

5’-CCCACCCTCGCGCCTTCAG -3’

y

SEQ ID NO: 20

10 5’-CTGGGTACATTGCGGCCC -3’

El fragmento de ADN obtenido de aproximadamente 470 pares de bases se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit según indicaciones del fabricante.

En otra reacción PCR se emplearon como plantilla ambos fragmentos obtenidos arriba. En el transcurso de la reacción PCR, mediante las secuencias homólogas a metA introducidas con el cebador de oligonucleótido SEQ ID

15 NO: 18, se produce una adición de ambos fragmentos entre sí y un alargamiento para producir una cadena de ADN continua por la polimerasa empleada. El método estándar se modificó en el sentido que los cebadores de oligonucleótidos usados SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 20 solo se adicionan a la mezcla de reacción al inicio del segundo ciclo.

El fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 675 pares de bases se purificó con el GFX™PCR, DNA and

20 Gel Band Purification Kit según indicaciones del fabricante. A continuación se escindió con las enzimas de restricción Xhol y Ncol (Roche Diagnostics, Mannheim) y se separó mediante electroforesis en gel. Después se purificó de la agarosa con GFX™CR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) el fragmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 620 pares de bases.

El plásmido PmetA metA SEQ ID NO 16: se escindió con las enzimas de restricción NcoI y SpeI (Roche Diagnostics,

25 Mannheim). Después de separación electroforética en gel, un fragmento de metA de aproximadamente 0,7 kb de grande se purificó de agarosa con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

El vector pClik5MCS SEQ ID NO:13 se cortó con las enzimas de restricción Xhol y SpeI (Roche Diagnostics, Mannheim) y se aisló un fragmento de 5 kb de grande después de separación electroforética con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

30 El fragmento de vector se ligó junto con el fragmento de PCR y el fragmento de metA con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar, tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1 Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contienen kanamicina (20 !g/ml)

35 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

La preparación del plásmido de ADN se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Se realizaron reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciador se separaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

40 El plásmido resultante pCLiK5MCS PSODmetA se lista como SEQ ID NO: 21:.

Ejemplo 4:

Preparación del plásmido pCLiK5MCS P EF-TU metA

ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 se preparó según Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Con el cebador de oligonucleótido SEQ ID NO 22 y SEQ ID NO 45 23, el ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en

cadena de polimerasa (PCR), según métodos estándar como Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pares de bases de la región 5’ no codificante (región de promotor) de la dismutasa de superóxido (Psod).

SEQ ID NO: 22

5’-GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG -3’

y

SEQ ID NO: 23

5’-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGAC -3’

El fragmento de ADN obtenido se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante.

A partir del plásmido PmetA metA SEQ ID NO: 16 como plantilla para una reacción PCR una parte de metA se amplificó con los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25.

SEQ ID NO: 24

5’-CCCACCCTCGCGCCTTCAG -3’

y

SEQ ID NO: 25

5’-CTGGGTACATTGCGGCCC -3’

El fragmento de ADN obtenido, de aproximadamente 470 pares de bases, se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit según indicaciones del fabricante.

En otra reacción PCR como plantilla se emplearon conjuntamente ambos fragmentos obtenidos arriba. Mediante las secuencias homólogas a metA introducidas con el cebador de oligonucléotido SEQ ID NO: 18, en el transcurso de la reacción PCR se produce una adición de ambos fragmentos entre sí y un alargamiento hacia una cadena de ADN continua mediante la polimerasa empleada. El método estándar se modifico en tal sentido que los cebadores de oligonucleótido usados SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 25 se agregan solamente con el inicio del segundo ciclo.

El fragmento de ADN amplificado, de aproximadamente 675 pares de bases, se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit según indicaciones del fabricante. Después de esto, se escindió con las enzimas de restricción Xhol y Ncol (Roche Diagnostics, Mannheim) y se separó mediante electroforesis en gel. A continuación, el fragmento de ADN de un tamaño aproximado de 620 pares de base se purificó de agarosa con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg).

El plásmido PmetA metA SEQ ID NO: 16 se escindió con las enzimas de restricción Ncol y SpeI (Roche Diagnostics, Mannheim). Después de separación electroforética en gel, un fragmento de metA, con un tamaño aproximado de 0,7 kb, se purificó de agarosa con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

El vector pClik5MCS SEQ ID NO: 13 se cortó con las enzimas de restricción Xhol y SpeI (Roche Diagnostics, Mannheim) y se aisló un fragmento de 5 kb de grande después de separación electroforética en gel con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

El fragmento de vector se ligó junto con el fragmento de PCR y el fragmento de metA con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar, tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1 Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

La preparación del plásmido de ADN se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Se realizaron reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciador se separaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

El plásmido resultante pCLiK5MCS P_EFTUmetA se lista como SEQ ID NO: 26.

Ejemplo 5:

Preparación del plásmido pCLiK5MCS Pgro metA

ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 se preparó según Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Con los cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO 27 y SEQ ID NO 28, el ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), según métodos estándar como Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pares de bases de la región 5’ no codificante (región de la unidad de expresión) del gen GroES (Pgro).

SEQ ID NO: 27

5’-GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC -3’

SEQ ID NO :28

5’-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGATGAATCCCTCCATGAG -3’

El fragmento de ADN obtenido se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. A partir del plásmido PmetA metA como plantilla, para una reacción PCR, se amplificó con los cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO: 30 una parte de metA.

SEQ ID NO: 29

5’-CCCACCCTCGCGCCTTCAG -3’

SEQ ID NO: 30

5’-CTGGGTACATTGCGGCCC -3’

El fragmento de ADN obtenido, de aproximadamente 470 pares de bases, se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit según indicaciones del fabricante.

En otra reacción PCR ambos fragmentos obtenidos arriba se emplearon conjuntamente como plantilla. Mediante las secuencias homólogas a metA introducidas con el cebador de oligonucleótido SEQ ID NO: 28, en el transcurso de la reacción PCR se produjo una adición de ambos fragmentos entre sí y un alargamiento hacia una cadena de ADEN continua mediante la polimerasa empleada. El método estándar se modifico en tal sentido que los cebadores de oligonucleótido usados SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 30 solo se adicionaron a la mezcla de reacción con el inicio del segundo ciclo.

El fragmento de ADN amplificado, de aproximadamente 675 pares de bases, se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit según indicaciones del fabricante. Después de esto se escindió con las enzimas de restricción Xhol y Ncol (Roche Diagnostics, Mannheim) y se separó mediante electroforesis en gel. Después, el fragmento de ADN con un tamaño aproximado de 620 pares de bases se purificó de agarosa con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg).

El plásmido PmetA metA SEQ ID NO: 16 se escindió con las enzimas de restricción Ncol y SpeI (Roche Diagnostics, Mannheim). Después de separación electroforética en gel, un fragmento metA de aproximadamente 0,7 kb de grande se purificó de agarosa con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

El vector pClik5MCS SEQ ID NO: 13 se cortó con las enzimas de restricción Xhol y SpeI (Roche Diagnostics, Mannheim) y se aisló un fragmento de 5 kb de grande después de separación electroforética en gel con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

El fragmento de vector se ligó junto con el fragmento de PCR y el fragmento de metA, con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar, tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró un selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

La preparación del plásmido de ADN se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Se realizaron reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciador se separaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

El plásmido resultante pCLiK5MCS Pgro metA se lista como SEQ ID NO: 31.

Ejemplo 6:

Preparación del plásmido P EF-TS metA ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 se preparó según Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Con los cebadores de oligonucleótidos BK 1849 (SEQ ID NO: 32) y BK 1862 (SEQ ID NO: 33), el ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (Empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) según métodos estándar, tal como se describe Innis et al.

(1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, se amplificó el gen metA, que codifica la homoserina-O-acetiltransferasa. BK 1849 (SEQ ID NO: 32) 5’- GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG -3’ y BK 1862 (SEQ ID NO: 33) 5’-ATGCCCACCCTCGCGCC -3’ El fragmento de ADN obtenido, de un tamaño aproximado de 1134 bp, se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel

Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. Con los cebadores de oligonucleótido Haf 26 (SEQ ID NO: 34) y Haf 27 (SEQ ID NO: 35), el ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (Empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), según métodos estándar, como se describe en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and

Applications, Academic Press, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pares de bases de la región 5’ no codificante (región de la unidad de expresión) del gen que codifica el factor de elongación TS. Haf 26 (SEQ ID NO: 34) 5’-GAGAGGATCCCCCCCACGACAATGGAAC-3‘ y Haf 27 (SEQ ID NO: 35) 5’-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTACGGGGCGATCCTCCTTATG -3’ El fragmento de ADN obtenido, de aproximadamente 195 bp de grande se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel

Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. Los cebadores Haf 27 y BK 1862 contienen una secuencia que se solapa y son homólogos entre sí en su extremo 5’. Los productos PCR obtenidos arriba se emplearon como plantilla para otra PCR en la que se utilizan los cebadores

BK 1849 (SEQ ID NO: 32) y Haf 26 (SEQ ID NO: 34).

Con esta mezcla pudo amplificarse un fragmento de ADN que correspondía al tamaño esperado de 1329 bp. Esta fusión P EF-TS/metA se clonó luego por los sitios de corte de restricción BamHI y SalI en el vector pClik 5a MCS (SEQ ID NO: 13).

El fragmento de vector se ligó junto con el fragmento de PCR con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó, según métodos estándar como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1 Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

La preparación del plásmido de ADN se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Se realizaron reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciador se separaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

El plásmido resultante se designó con pClik 5a MCS P EF-TS metA (SEQ ID NO: 36).

Ejemplo 7:

Preparación del plásmido P EF-Tu pSOD metA (H473)

ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 se preparó según Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Con los cebadores de oligonucleótido BK 1753 (SEQ ID NO: 37) y BK 1754 (SEQ ID NO: 38), el ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) según métodos estándar, como en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, se amplificó el terminador GroEL.

BK 1753 (SEQ ID NO: 37)

GGATCTAGAGTTCTGTGAAAAACACCGTG

BK 1754 (SEQ ID NO: 38)

GCGACTAGTGCCCCACAAATAAAAAACAC

El fragmento de ADN obtenido, de un tamaño aproximado de 77 bp, se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante, se cortó con las enzimas de restricción XbaI y Bcu I y se purificó una vez más.

El vector pClik5MCS (SEQ ID NO: 13) se linealizó con la enzima de restricción Xbal y se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante.

El vector linealizado se ligó junto con el fragmento de PCR con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar, tal como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

La preparación del plásmido de ADN se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Se realizaron reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciador se separaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

El plásmido resultante se designó con H247 (SEQ ID NO: 39).

Este plásmido se trató con las enzimas de restricción Bcul y SalI y se purificó con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante.

Una PCR se realizó con los oligonucleótidos BK 1848 (SEQ ID NO: 40) y BK 1849 (SEQ ID NO: 41), el plásmido pClik5MCS Psod metA (SEQ ID NO: 21) como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene) según métodos estándar, tal como se describen en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. El fragmento amplificado tenía una longitud esperada de cerca de 1350 bp y se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante, se cortó con las enzimas de restricción Bcul y SalI y se purificó una vez más.

Este fragmento se ligó con el plásmido H247 (sitios de corte Bcul y Sall) con ayuda del Rapid DNA Ligation Kits (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar, como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1 Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

La preparación del plásmido de ADN se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Se realizaron reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciador se separaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

El plásmido resultante se denominó pG A4 (H344) y se listó bajo SEQ ID NO: 42.

SEQ ID NO: 40 (BK 1848)

GAGAACTAGTAGCTGCCAATTATTCCGGG

SEQ ID NO: 41 (BK 1849)

GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG

El plásmido pG A4 (SEQ ID NO: 42) se cortó con las enzimas de restricción Xhol y Bcul y se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante.

Construcción de H473:

ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 se preparó según Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Con los cebadores de oligonucleótido BK 1695 (SEQ ID NO: 43) y Haf16 (SEQ ID NO: 44), el ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (Empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), según métodos estándar, tal como se describen en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 182 pares de bases de la región 5’ no codificante (región de la unidad de expresión) del gen EF Tu (Peftu).

SEQ ID NO: 43 (BK1695)

GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG

SEQ ID NO: 44 (Haf16)

GAGAACTAGTGTGGCTACGACTTTCGCAGC

El fragmento de ADN obtenido, de un tamaño aproximado de 200 bp, Gse purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante, se cortó con las enzimas de restricción Xho I y Bcu I y se purificó una vez más.

Este fragmento se ligó con el plásmido pG A4 (H344) (sitios de corte Xhol y Bcul) con ayuda del Rapid DNA Ligation Kits (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar, tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1 Blue competente (Stratagene, La Jolla, EUA). Se logró una selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

El plásmido obtenido se llamó pClik5MCS PeftuPsod metA (H473). Se lista bajo SEQ ID NO: 45. Contiene (de 5’ a 3’) un promotor Peftu, un unidad de expresión Psod y directamente a continuación el metA open reading frame.

Ejemplo 8:

Preparación del plásmido PsodPeftu metA (H505)

ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 se preparó según Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Con los cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 46 (Haf64) y SEQ ID NO: 47 (Haf65), el ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), según métodos estándar, tal como se describen en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 200 de la región 5’ no codificante (región de la unidad de expresión) del gen EF Tu (Peftu).

SEQ ID NO: 46 (Haf64)

GAGAACTAGTGGCCGTTACCCTGCGAATG

SEQ ID NO: 47 (Haf65)

GCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGACTTC

El fragmento de ADN obtenido, de aproximadamente 200 bp de tamaño, se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante.

En una segunda PCR con los cebadores de oligonucleótidos BK1862 (SEQ ID NO: 48) y BK1849 (SEQ ID NO: 49) y el plásmido H344 (SEQ ID NO: 42) como plantilla, se amplificó el metA open reading frame, según métodos estándar, como se describe en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. El fragmento obtenido de aproximadamente 1140 bp de longitud se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante.

SEQ ID NO: 48 (BK1862)

ATGCCCACCCTCGCGCC

SEQ ID NO: 49 (BK1849)

GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG

En otra reacción PCR se emplearon conjuntamente ambos fragmentos obtenidos arriba como plantilla. Mediante secuencias homólogas a metA, introducidas con el cebador de oligonucleótido Haf 65 SEQ ID NO: 47, en el transcurso de la reacción PCR se produjo una adición de ambos fragmentos y un alargamiento hacia una cadena de ADN continua mediante la polimerasa empleada. El método estándar se modifico en tal sentido que los cebadores de oligonucleótidos usados Haf 64 y BK 1849 SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 49 solo se adicionaron a la mezcla de reacción con el inicio del segundo ciclo.

El fragmento de ADN amplificado, de aproximadamente 1350 pares de bases, se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit según indicaciones del fabricante. A continuación, se escindió con las enzimas de restricción Bcul y SalI (Roche Diagnostics, Mannheim) y se separó mediante electroforesis en gel. A continuación el fragmento de ADN de un tamaño aproximado de 1340 pares de bases se purificó de agarosa con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg). Este fragmento contiene la unidad de expresión Peftu fusionada con el metA ORF (= fragmento de Peftu-metA).

Con los cebadores de oligonucleótidos BK 1697 (SEQ ID NO: 50) y Haf17 (SEQ ID NO:51), el ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) según métodos estándar como se describen en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, se amplificó un fragmento de ADN (longitud total: 193 bp, de estos 173 de pSOD) de la región 5’ no codificante (región de la unidad de expresión) del gen SOD (Psod).

SEQ ID NO: 50 (BK 1697)

GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG

SEQ ID NO: 51 (Haf 17)

GAGAACTAGTTAGGTTTCCGCACCGAGC El fragmento de ADN amplificado se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit según indicaciones del fabricante. Después de esto se escindió con las enzimas de restricción Xhol y Bcul (Roche Diagnostics, Mannheim) y se separó mediante electroforesis en gel. A continuación el fragmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 180 pares de bases se purificó de agarosa con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) (= fragmento Psod).

El plásmido (H344) pG A4 SEQ ID NO: 42 se escindió con las enzimas de restricción Xhol y Sall (Roche Diagnostics, Mannheim) y se separó mediante electroforesis en gel. A continuación el vector linealizado se purificó de agarosa con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg).

El vector linealizado se ligó con ambos fragmentos (fragmento Peftu-metA y fragmento Psod) con ayuda del Rapid DNA Ligation Kits (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar, tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

La preparación del plásmido de ADN se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Se realizaron reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciador se separaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

El plásmido resultante pClik5MCS PsodPeftu metA se listó como SEQ ID NO: 52.

Ejemplo 9:

Preparación del plásmido pClik5MCS Pgro Psod metA (H472)

ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 se preparó según Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Con los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID NO: 53 (BK1701) y SEQ ID NO: 54 (Haf18), el ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), según métodos estándar, como se describen en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 175 Nt. Contiene 155 pares de bases de la región 5’ no codificante (región de la unidad de expresión) del gen GRO EL (Pgro) y de a un sitio de corte de restricción en extremos 5’ y 3’ (Xhol o Bcul).

SEQ ID NO: 53 (BK1701)

GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC

SEQ ID NO: 54 (Haf018)

GAGAACTAGTATTTTGTGTGTGCCGGTTGTG

El fragmento de ADN obtenido, de un tamaño aproximado de 175 bp, se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. Después de esto se escindió con las enzimas de restricción Xhol y Bcul (Roche Diagnostics, Mannheim) y se purificó el fragmento de ADN con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

El plásmido H344 (SEQ ID NO: 42) se cortó con las enzimas de restricción Xhol y Bcul y un fragmento con un tamaño de aproximadamente 6.4 kb después de la separación electroforética en gel se aisló con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

El producto de PCR y el plásmido cortado H344 se ligaron con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar, tal como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1 Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido preparando en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

La preparación del plásmido de ADN se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Se realizaron reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467.

• Las reacciones de secuenciador se separaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

El plásmido resultante contiene un promotor Pgro directamente seguido de una unidad de expresión Psod y el metA ORF. pCLiK5MCS PgroPsod metA (H472) se lista como SEQ ID NO: 55.

Ejemplo 10:

Preparación del plásmido PgroPsod Pefts metA (H501)

Con los cebadores de oligonucleótidos BK1782 (SEQ ID NO: 56) y Haf63 (SEQ ID NO: 57) y el plásmido pClik5MCS Pgro Psod metA (SEQ ID NO: 55 (H472)) como plantilla se realizó una PCR según métodos estándar, como se describen en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. El fragmento amplificado comprende aproximadamente 474 pares de bases y contiene un casete Pgro-Psod con un sitio de corte Acc651 en el extremo 3’. El fragmento de ADN obtenido se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. A continuación, se escindió con las enzimas de restricción Xhol y Acc65I y el fragmento de ADN (333 pares de base) se purificó con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

SEQ ID NO: 56 (BK1782)

TCGAGAGATTGGATTCTTAC

SEQ ID NO: 57 (Haf 63)

TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATATACATC

El plásmido H479 (SEQ ID NO: 58) contiene la unidad de expresión Pefts fusionada con el metA ORF. Se cortó con las enzimas de restricción Xhol y Acc651 (upstream directamente de Pefts) y un fragmento de aproximadamente 6.4 kb de grande se aisló después de separación electroforética en gel con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

A continuación, se ligó con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante con el fragmento de PCR (casete Pgro-Psod) y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar, como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido preparando en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

La preparación del plásmido de ADN se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Se realizaron reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciador se separaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

El plásmido resultante contiene los 3 promotores Pgro Psod y P EF-Ts fusionados con el metA ORF. pCLiK5MCS Pgro Psod Pefts metA (H501) se listó como SEQ ID NO: 59.

Ejemplo 11:

Preparación del plásmido Peftu Psod Pefts metA (H502)

Con los cebadores de oligonucleótidos BK1782 (SEQ ID NO: 56) y Haf63 (SEQ ID NO: 57) y el plásmido pClik5MCS Peftu Psod (SEQ ID NO: 45 (H473)) como plantilla, se realizó una PCR según métodos estándar, como se describen en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. El fragmento amplificado comprende aproximadamente 495 pares de bases y contiene un casete Peftu-Psod con un sitio de corte Acc65I en el extremo 3’. El fragmento de ADN obtenido se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. A continuación se escindió con las enzimas de restricción Xhol y Acc651 y el fragmento de ADN (354 pares de bases) se purificó con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit.

SEQ ID NO: 56 (BK1782)

TCGAGAGATTGGATTCTTAC SEQ ID NO: 57 (Haf 63)

TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATATACATC

El plásmido H479 (SEQ ID NO: 58) contiene la unidad de expresión Pefts fusionada con el metA ORF. Se cortó con las enzimas de restricción Xhol y Acc65I (upstream directamente de Pefts) y un fragmento de aproximadamente 6.4 5 kb de tamaño se aisló con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit después de separación electroforética en gel.

A continuación se ligó con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante con el fragmento de PCR (casete Peftu-Psod) y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar, como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,

10 (1989)), en E.coli XL-1Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido preparando en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

La preparación del plásmido de ADN se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Se realizaron reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciador se separaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377

15 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

El plásmido resultante contiene las 3 secuencias regulatorias Peftu Psod y P EF -Ts fusionadas con el metA ORF. pCLiK5MCS Peftu Psod Pefts metA (H501) se listó como SEQ ID NO: 60.

Ejemplo 12:

Medición de las actividades de metA

20 La cepa Corynebacterium glutamicum ATCC13032 se transformó con los plásmidos pClik5 MCS, pClik MCS Psod metA, pClik MCS Peftu metA, pClik5 MCS Pefts metA, pClik5 MCS Peftu Psod metA, pClik5 MCS Psod Peftu metA, pClik5 MCS Pgro Psod meta, pClik5 MCS Pgro Psod Pefts metA, pClik5 MCS Peftu Psod Pefts metA de acuerdo con el método descrito (Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303). La mezcla de transformación se preparó en placas de CM que contenían adicionalmente 20 mg/l de kanamicina para lograr una selección en células

25 que contienen plásmido. Los clones resistentes a Kan se escogen y se aíslan.

Cepas de C. glutamicum, que contenían uno de estos constructos de plásmido se cultivaron en medio MMA ((40 g/l de sacarosa, 20 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 1 g/l de K2HPO4, 0,25g/l de MgSO4 x 7H2O, 54 g de Aces, 1 ml de CaCl2 (10 g/l), 1 ml de protocatecoato (300 mg/10 ml), 1 ml de solución de microelementos (10 g/l de FeSO4 x /H2O, 10 g/l de MnSO4 x H2O, 2 g/l ZnSO4 x 7 H2O, 0,2 g/l de CuSO4, 0,02 g/l de NiCl2 x 6 H2O),100 !g/l de vitamina B12, 30 0,3 mg/l de tiamina, 1mM de leucina, 1 mg/l de piridoxal HCl, 1 ml de biotina (100 mg/l), pH 7,0) a 30°C por una noche. Las células se centrifugaron a 4°C y se lavaron dos veces con búfer Tris-HCl frío (0,1%, pH 8,0). Después de centrifugación renovada las células se recogen en búfer de Tris-HCl frío ( 0,1%, pH 8,0) y se ajustó una OD600 de

160. Para la ruptura de células se transfirió 1 ml de esta suspensión de células a tubos de Ribolyser de 2 ml de la empresa Hibaid y se lisó tres veces por 30 s respectivamente en un Ribolyser de la empresa Hibaid a un ajuste de

35 rotación de 6,0. El lisado se clarificó mediante centrifugación por 30 minutos a 15.000 rpm a 4°C en una centrífuga Eppendorf y el sobrenadante se transfirió a una nueva copa Eppendorf. El contenido de proteína se determinó según Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72:248-254.

La actividad enzimática de MetA se realizó como sigue. Las mezclas de reacción de 1 ml contenía 100 mM de búfer de fosfato de potasio (pH 7,5), 5mM de MgCl2, 100 !M de acetil CoA, 5mM de L-homoserina, 500 !M de DTNB

40 (reactivo de Ellmans) y extracto celular. El ensayo inició adicionando el lisado respectivo de proteína y se incubó a temperatura ambiente. Luego se registró una cinética a 412 nm por 10 min.

Los resultados se muestran en la Tabla 1a.

Tabla 1a (continuación)

Cepa

Designación de constructo interna Actividad específica [nMol/mg/min]

ATCC 13032 pClik5MCS

H356 (metZ) 3,1

Cepa

Designación de constructo interna Actividad específica [nMol/mg/min]

ATCC 13032 pCLiK5MCS Psod metA

H144 1308,7

ATCC 13032 pCLiK5MCS Peftu metA

H146 1233,0

ATCC 13032 pCLiK5MCS Pefts metA

H479 2339,0

ATCC 13032 pCLiK5MCS Peftu Psod metA

H473 2308,1

ATCC 13032 pCLiK5MCS Psod Peftu metA

H505 2061,9

ATCC 13032 pCLiK5MCS Pgro Psod metA

H472 1501,6

ATCC 13032 pCLiK5MCS Pgro Psod Pefts metA

H501 1773,4

ATCC 13032 pCLiK5MCS Peftu Psod Pefts metA

H502 2262,2

La actividad de MetA pudo modularse usando las diversas combinaciones de promotores/unidades de expresión.

5 Ejemplo 13:

Construcción de plásmido pCIS lysC

Para generar una cepa que produce lisina se realizó un intercambio alélico del gen lysC de tipo silvestre en Corynebacterium glutamicum ATCC13032. En tal caso se realizó un intercambio de nucleótido en el gen lysC, de modo que en la proteína resultante el aminoácido Thr se intercambió en la posición 311 por un Ile. A partir del ADN

10 cromosómico de ATCC13032 como plantilla para una reacción PCR, lysC se amplificó con los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID NO:61 y SEQ ID NO:62 con ayuda del Pfu-Turbo PCR Systems (Stratagene USA) según indicaciones del fabricante.

SEQ ID NO:61

5’-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3’

15 SEQ ID NO:62

5‘-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3’

Se preparó ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 según Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. El fragmento amplificado se flanquea en su extremo 5’ por un corte de restricción Sall y en su extremo 3’ se flanquea por un corte de restricción Mlul. Antes de la clonación el

20 fragmento amplificado se digirió mediante estas dos enzimas de restricción y se purificó con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg).

El polinucleótido obtenido se clonó por los cortes de restricción Sall y Mlul en pCLIK5 MCS integrativ SacB, llamado en lo sucesivo pCIS (SEQ ID NO: 63) y se transformó en E.coli XL-1 blue. Se logró una selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 !g/ml) (Lennox, 1955, 25 Virology, 1: 190). El plásmido se aisló y se confirmó la secuencia de nucleótido mediante secuenciación. La preparación del plásmido de ADN se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Se realizaron reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA

74:5463-5467. Las reacciones de secuenciador se separaron y se evaluaron por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt). El plásmido pCIS lysC obtenido se lista como SEQ ID NO:64.

Ejemplo 14:

Mutagénesis del gen lysC de C. glutamicum

La mutagénesis dirigida del gen lysC de C. glutamicum se realizó con el QuickChange Kit (empresa Stratagene/USA) según indicaciones del fabricante. La mutagénesis se realizó en el plásmido pCIS lysC, SEQ ID NO:64. Para el intercambio de thr 311 a 311 ile con ayuda del método Quickchange (Stratagene) se sintetizaron los siguientes cebadores de oligonucleótidos:

SEQ ID NO:65

5’-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG -3’

SEQ ID NO:66

5’-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG -3’

El empleo de estos cebadores en la reacción Quickchange conduce en el gen lysC SEQ ID NO:67 a un intercambio del nucleótido en posición 932 (de C a T). El intercambio de aminoácido resultante Thr311Ile en el gen lysC se confirmó después de la transformación en E.coli XL1-blue y la preparación de plásmido se confirmó por reacciones de secuenciación. El plásmido obtuvo la denominación pCIS lysC thr311ile y se lista como SEQ ID NO:68.

El plásmido pCIS lysC thr311ile se transformó en C. glutamicum ATCC13032 mediante electroporación, tal como se describe en Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303. Se describen modificaciones del protocolo en DE 10046870. La disposición cromosómica del locus lysC de transformantes individuales se verificaron con métodos estándar mediante southern blot e hibridación tal como se describe en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor. De esta manera se aseguró que los transformantes fueran aquellos que tienen integrado el plásmido transformado mediante recombinación homóloga en el lysC-Lokus. Después del crecimiento de tales colonias por una noche en medios que no contienen antibiótico, las células se ponen en placas en un medio de sacarosa-CM-agar (10% de sacarosa, 10 g/l de glucosa; 2,5 g/l de NaCl; 2 g/l de urea, 10 g/l de Bacto Peptone (empresa Difco); 10 g/l de extracto de levadura, 22,0 g/L de agar (Difco)) y se incuban a 30°C por 24 horas.

Puesto que la sacarosa que contiene el gen sacB en el vector pCIS lysC thr311ile se convierte en un producto tóxico, solo pueden crecer aquellas colonias que han eliminado el gen sacB mediante un segundo paso de recombinación homólogo entre el gen lysC de tipo silvestre y el gen mutado lysC thr311ile. Durante la recombinación homóloga puede eliminarse o bien el gen de tipo silvestre, o bien el gen mutado junto con el gen sacB. Si el gen sacB se retira junto con el gen de tipo silvestre, resulta un transformante mutado.

Las colonias que iban creciendo se recogieron y se investigaron para un fenotipo sensible a kanamicina. Los clones con el gen sacB eliminado deben, al mismo tiempo, presentar comportamiento de crecimiento sensible a la kanamicina. Tales clones sensibles a la Kan se prueban en un frasco agitador para su productividad de lisina. (véase ejemplo 19). Para comparación se cultivó ATCC13032 del C. glutamicum no tratado. Se seleccionaron los clones con una producción de lisina incrementada frente al control, se produjo ADN cromosómico y se amplificó y se secuenció la región correspondiente del gen lysC mediante una reacción PCR. Un clon así, con la propiedad de biosíntesis de lisina incrementada y mutación detectada en lysC en el sitio 932 se designó con ATCC13032 lysCfor.

Ejemplo 15:

Preparación del plásmido pCIS Peftu ddh

Se preparó ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 según Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Con los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID NO: 69 (Old38) y SEQ ID NO: 70 (Old 39), el ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) según métodos estándar, como se describen en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 200 de la región 5’ no codificante (región de la unidad de expresión) del gen EF Tu (Peftu).

SEQ ID NO: 69 (OId38) ACATCCATGGTGGCCGTTACCCTGCGAAT

SEQ ID NO: 70 (Old 39)

TGTATGTCCTCCTGGACTTC

El fragmento de ADN obtenido de tamaño aproximado de 200 bp se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band 5 Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante.

En una segunda PCR con los cebadores de oligonucleótidos Old40 (SEQ ID NO: 71) y SEQ ID NO: 72 (Old 37) y ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 como plantilla, se amplificó el ddh open reading frame según métodos estándar, como se describen en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press. El fragmento obtenido, de aproximadamente 1017 bp de longitud, se purificó con el GFX™PCR,

10 DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante.

OId40 (SEQ ID NO: 71)

GAAGTCCAGGAGGACATACAATGACCAACATCCGCGTAGC

Old 37 (SEQ ID NO: 72)

GAAACCACACTGTTTCCTTGC

15 En otra reacción PCR los dos fragmentos obtenidos arriba se emplearon conjuntamente como plantilla. Mediante las secuencias homólogas a Peftu introducidas con el cebador de oligonucleótido OId40 SEQ ID NO: 71, en el transcurso de la reacción PCR se produce una adición de ambos fragmentos entre sí y un alargamiento para producir una cadena de AD continua mediante la polimerasa empleada. El método estándar se modificó en tal sentido que los cebadores de oligonucleótidos usados OId37 y Old 38 (SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 69) solo se

20 adicionaron a la mezcla de reacción con el principio del segundo ciclo.

El fragmento de ADN amplificado, de aproximadamente 1207 pares de bases, se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit según indicaciones del fabricante. A continuación se escindió con las enzimas de restricción Ncol y Xhol (Roche Diagnostics, Mannheim) y se separó mediante electroforesis en gel. Después el fragmento de ADN de aproximadamente 1174 pares de bases de tamaño se purificó de la agarosa con GFX™PCR,

25 DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg). Este fragmento contiene la unidad de expresión Peftu fusionada con el ddh ORF (= fragmento Peftu-ddh).

Con los cebadores de oligonucleótido Old 32 (SEQ ID NO: 73) y Old 33 (SEQ ID NO: 74), el ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) según métodos estándar como se describen en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and

30 Applications, Academic Press, se amplificó un fragmento de ADN de la región 5’ no codificante del gen ddh.

SEQ ID 73 (OId32)

ATCAACGCGTCGACACCACATCATCAATCAC

SEQ ID 74 (OId33)

ATCACCATGGGTTCTTGTAATCCTCCAAAATTG

35 El fragmento de ADN amplificado se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit según indicaciones del fabricante. A continuación se escindió con las enzimas de restricción Mlul y NcoI (Roche Diagnostics, Mannheim) y se separó mediante electroforesis en gel. A continuación el fragmento de ADN de aproximadamente 720 pares de bases de tamaño se purifico de la agarosa con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) (= fragmento 5’ ddh).

40 El plásmido pCIS (SEQ ID NO: 63) se escindió con las enzimas de restricción MluI y Xhol (Roche Diagnostics, Mannheim) y se separó mediante electroforesis en gel. A continuación se purificó de la agarosa el vector linealizado con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg).

El vector linealizado se ligó con ambos fragmentos (fragmento Peftu-ddh y fragmento 5’ ddh) con ayuda del Rapid DNA Ligation Kits (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se 45 transformó según métodos estándar, como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL-1Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 mg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

La preparación del plásmido de ADN se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Se realizaron reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciador se separaron y se evaluaron por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

El plásmido resultante pCIS Peftu ddh se lista como SEQ ID NO: 75.

Ejemplo 16:

Preparación de pCIS PeftuPsod ddh

Se preparó ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 según Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Con los cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 77, el ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) según métodos estándar como se describen en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 677 pares de bases de la región 5’ del gen ddh (fragmento 5’ddh).

SEQ ID NO: 76 (CK461)

CCTGACGTCGCAATATAGGCAGCTGAATC

SEQ ID NO : 77 (CK466)

GCCCAATTGGTTCTTGTAATCCTCCAAAA

El fragmento de ADN obtenido se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. A continuación se separó con las enzimas de restricción Aatll y MunI (Roche Diagnostics, Mannheim) y se separó mediante electroforesis en gel. A continuación el fragmento de ADN de aproximadamente 661 pares de bases de tamaño se purificó de la agarosa con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg). El fragmento resultante contiene la región 5’ del ddh-ORF.

A partir del plásmido P EF-Tu pSOD metA (H473) (SEQ ID 45) como plantilla para una reacción PCR, con los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID NO:-78 y SEQ ID NO: 79 se amplificó un casete PeftuPsod.

SEQ ID NO: 78 (CK426)

CGCCAATTGTCGAGGGCCGTTACCCT

SEQ ID NO: 79 (CK463)

GCTACGCGGATGTTGGTCATGGGTAAA,4AATCCTTTCGTA

El fragmento de ADN obtenido, de aproximadamente 378 pares de bases, se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit según indicaciones del fabricante.

En una PCR siguiente se amplificó el ddh ORF. Para esto se preparó ADN cromosómico de C. Glutamicum ATCC 13032 según Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Con los cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 80 (CK464) y SEQ ID NO: 81 (CK467=, el ADN cromosómico como plantilla y polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene), con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) según métodos estándar como se describen en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 992 pares de bases (ddh-ORF) (fragmento ddh). El fragmento de ADN amplificado se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit según indicaciones del fabricante.

SEQ ID NO: 80 (CK464)

TACGAAAGGATTTTTTACCCATGACCAACATCCGCGTAGC SEQ ID NO: 81 (CK467)

AGACCCGGGTTAGACGTCGCGTGCGATCA

En otra reacción PCR ambos fragmentos obtenidos arriba (casete PeftuPsod y ddh-ORF) se emplearon conjuntamente como plantilla. Mediante las secuencias homólogas a Psod, introducidas con el cebador de oligonucleótido SEQ ID NO: 80 (CK464), en el transcurso de la reacción PCR se produce una adición de ambos fragmentos entre sí y un alargamiento para producir una cadena de ADN continua mediante la polimerasa empleada. El método estándar se modificó en tal sentido que los cebadores de oligonucleótidos usados SEQ ID NO: 79 (CK426) y SEQ ID NO: 81 (CK467) se adicionan a la mezcla de reacción solo con el inicio del segundo ciclo. El fragmento de ADN amplificado, de aproximadamente 1359 pares de bases, se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit según indicaciones del fabricante.

A continuación se escindió con las enzimas de restricción MunI y Smal (Roche Diagnostics, Mannheim) y se separó mediante electroforesis en gel. A continuación el fragmento de ADN de aproximadamente 1349 pares de bases de tamaño se purificó de la agarosa con GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg). El fragmento resultante contiene (de 5’ a 3’) un promotor Peftu, una unidad de expresión Psod y directamente a continuación el ddh open reading frame (PeftuPsod ddh).

El vector pCIS se cortó con las endonucleasas de restricción AatlI y Smal y se desfosforiló con fosfatasa alcalina (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante. Después de electroforesis en un gel de agar al 0,8%, el vector linealizado (aproximadamente 4.2 kb) se aisló con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según indicaciones del fabricante. Este fragmento de vector se ligó con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim), según indicaciones del fabricante, con ambos fragmentos PCR cortados (5’ddh y PeftuPsod ddh) y la mezcla de ligazón se transformó según métodos estándar, como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), en E.coli XL1Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA). Se logró una selección en células que portan plásmido mediante preparación en placas de LB agar que contiene kanamicina (20 mg/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

El ADN de plásmido de clones individuales se aisló con el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) según indicaciones del fabricante y se verificó por digestión de restricción. Se secuenciaron 2 plásmidos correctos. Se realizaron reacciones de secuenciación según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467. Las reacciones de secuenciador se separaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt). El plásmido resultante pClik Peftu Psod ddh es adecuado para integrar con ayuda de 2 sucesos de recombinación sucesivas el casete PeftuPsod antes de ddh-ORF cromosómico. El plásmido pCIS PeftuPsod ddh se lista como SEQ ID NO: 82.

Ejemplo 17:

Generación de las cepas ATCC13032 lysCfor Peftu ddh y ATCC13032 lysCfor PeftuPsod ddh

Se transformaron células de la cepa E. coli Mn522 (empresa Stratagene, Amsterdam, Holanda) con uno de los plásmidos pCIS Peftu ddh y pCIS PeftuPsod ddh así como con el plásmido pTc15AcgIM según Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303. El plásmido pTc15AcgIM hace posible la metilación de DNA según el patrón de metilación de Corynebacterium glutamicum (DE 10046870). Mediante esta metilación se incrementa la estabilidad de los plásmidos pCIS Peftu ddh y pCIS PeftuPsod ddh en células de C. glutamicum. El ADN de plásmido se aisló a continuación de las células Mn522 según métodos estándar y con ayuda de electroporación se introdujo la cepa arriba descrita de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ask (fbr). De esta electroporación y de la selección subsiguiente en placas de CM con kanamicina (25 !g/ml) se obtuvieron varios transconjugantes. Para la selección en el segundo suceso de recombinación que debe conducir a la escisión del vector, se cultivaron estos transconjugantes en medio de CM por una noche sin kanamicina y a continuación para la selección se cultivó en placas de CM 10% de sacarosa. El gen sacB presente en el vector pCIS codifica la enzima Laevansucrase y al crecer en sacarosa conduce a la síntesis de laevan. Puesto que laevan es tóxico para C. glutamicum solo las células de C. glutamicum que han perdido el plásmido de integración por el segundo paso de recombinación pueden crecer en el medio que contiene sacarosa (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174 (1992) 5462-5466). 100 clones resistentes a sacarosa se probaron en su sensibilidad a kanamicina. Para varios de los clones ensayados, además de la resistencia frente a sacarosa, también pudo detectarse una sensibilidad frente a kanamicina, lo cual se espera en la escisión deseada de las secuencias del vector. Por medio de reacción en cadena de polimerasa (PCR) también se verificó si se había realizado la integración deseada de la unidad de expresión Peftu o PeftuPsod. Para esto, de la placa de agar se retiraron los clones respectivos con un palillo y se suspendieron en 100 !l de H2O e hirvieron por 10 min a 95°C. Se emplearon 10 !l respectivamente de la solución obtenida como plantilla en la PCR. Como cebadores se usaron oligonucleótidos que son homólogos a la unidad de expresión a introducir y al gen ddh. Las condiciones de PCR se seleccionaron como sigue: desnaturalización previa: 5 min a 95°C; desnaturaliación: 30 s a 95°C; hibridación 30 s a 55°C; amplificación 2 min a 72°C; 30 ciclos; extensión final 5 min a 72°C. En la mezcla

con el ADN de la cepa de partida no pudo generarse un producto de PCR mediante elección de los oligonucleótidos. Solo , se esperaba una banda en caso de clones que han realizado mediante la segunda recombinación la integración de las unidades de expresión Peftu o PeftuPsod directamente en 5’ del gen ddh. La integración exitosa de los clones aquí ensayados positivamente se confirmó además mediante análisis de Southern blot (según 5 métodos estándar, como se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)). Para cada una de las cepas a generarse se realizaron en tal caso 2 hidrólisis diferentes con enzimas de restricción que permiten una diferenciación unívoca de la cepa de partida (ATCC13032 ask (fbr)) y la cepa deseada. Además, con ayuda de una sonda que es homóloga al gen de resistencia a kanamicina se confirmó que las cepas obtenidas no tienen genes-kanamicina en el cromosoma. De esta manera pudieron

10 generarse las siguientes cepas:

ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh

ATCC13032 lysCfbr PeftuPsod ddh

Todas estas cepas contienen ungen ask feedback-desregulado y producen, por lo tanto, lisina. Se diferencian exclusivamente por la unidad de regulación que controla la transcripción del gen ddh.

15 Ejemplo 18:

Efecto del refuerzo de ddh mediante promotor doble en la producción de lisina

Para investigar el efecto del gen ddh con ayuda de un promotor doble se investigaron las siguientes cepas para la producción de lisina:

ATCC13032 lysCfbr

20 ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh

ATCC13032 lysCfbr Peftu Psod ddh

Para este propósito se cultivaron por 2 días a 30°C las cepas en placas de CM (10,0 g/L de D-glucosa, 2,5 g/L de NaCl, 2,0 g/L de urea, 10,0 g/L de Bacto Pepton (Difco), 5,0 g/L de Yeast Extract (Difco), 5,0 g/L de Beef Extract (Difco), 22,0 g/L de agar (Difco), se autoclavó (20 min. 121°C)). A continuación, se rasparon las células de la placa y

25 se resuspendieron en solución salina. Para el cultivo principal se inocularon 10 ml de medio I y 0,5 g de CaCO3 autoclavado (Riedel de Haen) en un matraz Erlenmeyer de 100 ml con la suspensión de las células hasta una OD600 de 1,5 y se incubó por 40h en uno de tipo Infors AJ118 (empresa Infors, Bottmingen, Suiza) a 220 rpm. A continuación se determinó la concentración de la lisina secretada en el medio.

Medio I:

30 40g/l Sacarosa

60g/l Melaza (calculada respecto del 100% de contenido de azúcar)

10g/l (NH4)2SO4

0.4g/l MgSO4*7H2O

0.6g/l KH2PO4

35 0.3mg/l Tiamina*HCl

1mg/l Biotina (de una solución madre esterilizada por filtración cuyo pH se ajustó a 8,0 con NH4OH)

2mg/l FeSO4

2mg/l MnSO4

Se ajustó con NH4OH a pH 7,8, se autoclavó (121 °C, 20 min).

Adicionalmente se agregó vitamina B12 (hidroxicobalamina, Sigma Chemicals) de una solución madre (200 !g/ml, esterilizada por filtración) hasta una concentración final de 100 !g/l

La determinación de la concentración de aminoácido se efectuó mediante cromatografía líquida de alta presión según Agilent en un sistema HPLC LC de Agilent 1100 Series. Una derivatización de las pre-columnas con ortoftalaldehído permite la cuantificación de los aminoácidos formados, la separación de la mezcla de aminoácidos tiene lugar en una columna Hypersil AA (Agilent). El resultado de la investigación se representa en la siguiente tabla.

Cepa

Concentración de lisina relativa (%)

ATCC13032 lysCfbr

100

ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh

102,9

ATCC13032 lysCfbr PeftuPsod ddh

106,9

LISTADO DE SENCUENCIAS

<110> BASF AG 10 <120> Promotores múltiples

<130> M/45256

<160> 84

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1 15 <211> 177

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> características_misceláneas 20 <223> pGRO

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1)..(177)

<223> secuencia de promotor si no se presenta promotor adicional corriente abajo 25 <220>

<221> características_misceláneas

<222> (1)..(155)

<223> secuencia de promotor si se une un promotor adicional corriente abajo

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (70)..(75)

<223> region 10 putativa

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (165)..(172)

<223> secuencia putativa de enlazamiento de ribosoma

<400> 1

10 <210> 2

<211> 195

<212> DNA

<213> corynebacterium glutamicum

<220> 15 <221> características_misceláneas

<223> pEFTS

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1)..(195) 20 <223> secuencia de promotor si no se presenta promotor adicional corriente abajo

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1)..(178)

<223> secuencia de promotor si se une un promotor adicional corriente abajo 25 <220>

<221> características_misceláneas

<222> (147)..(152)

<223> región 10 putativa

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (162)..(167)

<223> región 10 putativa

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (179)..(185)

<223> secuencia putativa de enlazamiento de ribosoma

<400> 2

10 <210> 3

<211> 199

<212> DNA

<213> corynebacterium glutamicum

<220> 15 <221> características_misceláneas

<223> pEFTU

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1)..(199) 20 <223> secuencia de promotor si no se presenta promotor adicional corriente abajo

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1)..(176)

<223>

secuencia de promotor si se une un promotor adicional corriente abajo 25 <220>

<221> características_misceláneas

<222> (36)..(41)

<223> región 10 putativa

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (63)..(68)

<223>

región 10 putativa 5 <220>

<221> características_misceláneas

<222> (92)..(97)

<223> región 10 putativa

<220> 10 <221> características_misceláneas

<222> (187)..(193)

<223> secuencia putativa de enlazamiento de ribosoma

<400> 3

15 <210> 4

<211> 191

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<220> 20 <221> características_misceláneas

<223> pSOD

<220>

<221> características_misceláneas

<222>

(1)..(191) 25 <223> secuencia de promotor si no se presenta promotor adicional corriente abajo

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1)..(173)

<223> secuencia de promotor si se une un promotor adicional corriente abajo

<220>

<221> características_misceláneas

<222>

(65)..(70) 5 <223> región 10 putativa

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (86)..(92)

<223> región 10 putativa 10 <220>

<221> características_misceláneas

<222> (175)..(181)

<223> secuencia putativa de enlazamiento de ribosoma

<400> 4

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial 20 <220>

<223> Cebador

<400> 5 cccgggatcc gctagcggcg cgccggccgg cccggtgtga aataccgcac ag 52

<210> 6 25 <211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 6 tctagactcg agcggccgcg gccggccttt aaattgaaga cgaaagggcc tcg 53

<210> 7

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 7 gagatctaga cccggggatc cgctagcggg ctgctaaagg aagcgga 47

<210> 8

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 8 gagaggcgcg ccgctagcgt gggcgaagaa ctccagca 38

<210> 9

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 9 gagagggcgg ccgcgcaaag tcccgcttcg tgaa 34

<210> 10

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 10

gagagggcgg ccgctcaagt cggtcaagcc acgc 34 5 <210> 11

<211> 140

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> oligonucleótido

<400> 11

<210> 12 15 <211> 140

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 20 <400> 12

<210> 13

<211> 4323

<212> ADN 25 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas

<223> Plásmido pCLiK5MCS

<220> 5 <221> características_misceláneas

<222> (457)..(1248)

<223> KanR

<220>

<221> características_misceláneas 10 <222> (3840)..(4302)

<223> PsacB (complementario)

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (2418)..(3839) 15 <223> SacB (complementario)

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1515)..(2375)

<223> Ori-EC (pMB) (complementario) 20 <400> 13

<210> 14

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 14 gcgcggtacc tagactcacc ccagtgct 28

<210> 15

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 15 ctctactagt ttagatgtag aactcgatgt 30

<210> 16

<211> 6349

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas

<223> pCLiK5MCS PmetA metA

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1727)..(2518)

<223> KanR

<220>

<221> características_misceláneas 5 <222> (4799)..(5920)

<223> Proteína Rep

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (3791)..(4465) 10 <223> Ori-Ec (pMB) (komplementär)

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (2785)..(3645)

<223> orf1 15 <220>

<221> características_misceláneas

<222> (42)..(177)

<223> PmetA

<220> 20 <221> características_misceláneas

<222> (178)..(1311)

<223> metA

<400> 16

<210> 17

<211> 29

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 17

gagactcgag agctgccaat tattccggg 29 10 <210> 18

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Cebador

<400> 18 cctgaaggcg cgagggtggg catgggtaaa aaatcctttc g 41

<210> 19

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 19 cccaccctcg cgccttcag 19

<210> 20

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 20 ctgggtacat tgcggccc 18

<210> 21

<211> 6386

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas

<223> pCLiK5MCS PSODmetA

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1752)..(2543)

<223> KanR

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (4824)..(5945)

<223> Proteína Rep <220>

<221> características_misceláneas

<222> (2810)..(3670)

<223> Ori-Ec (pMB) (complementario) 5 <220>

<221> características_misceláneas

<222> (3816)..(4490)

<223> orf1

<220> 10 <221> características_misceláneas

<222> (6)..(196)

<223> Psod

<220>

<221> características_misceláneas 15 <222> (197)..(1330)

<223> metA

<400> 21

<210> 22

<211> 29

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 22

gagactcgag ggccgttacc ctgcgaatg 29 10 <210> 23

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Cebador

<400> 23 cctgaaggcg cgagggtggg cattgtatgt cctcctggac 40

<210> 24

<211> 19 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 24 cccaccctcg cgccttcag 19

<210> 25

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 25 ctgggtacat tgcggccc 18

<210> 26

<211> 6394

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas

<223> pCLiK5MCS P EFTUmetA

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1772)..(2563)

<223> KanR

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (4844)..(6965)

<223> Proteína Rep

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (2830)..(3690)

<223> Ori-Ec (pMB) (complementario)

<220> <221> características_misceláneas

<222> (3836)..(4510)

<223> orf1

<220> 5 <221> características_misceláneas

<222> (18)..(216)

<223> Peftu

<220>

<221>

características_misceláneas 10 <222> (217)..(1350)

<223> metA

<400> 26

<210> 27

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 27 gagactcgag cggcttaaag tttggctgcc 30

<210> 28

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 28 cctgaaggcg cgagggtggg catgatgaat ccctccatga g 41

<210> 29

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 29 cccaccctcg cgccttcag 19

<210> 30

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 30 ctgggtacat tgcggccc 18

<210> 31

<211> 6372

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas

<223> pCLiK5MCS PGroESmetA

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1735)..(2526)

<223> KanR

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (4807)..(5928)

<223> Proteína Rep

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (2793)..(3653)

<223> Ori-EC (pMB) (complementario)

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (3799)..(4473)

<223> orf1

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (3)..(179)

<223> Pgro

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (180)..(1313)

<223> metA

<400> 31

<210> 32

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: BK 1849

<400> 32 gtgtgtcgac ttagatgtag aactcgatgt ag 32

<210> 33

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: BK 1862

<400> 33 atgcccaccc tcgcgcc 17

<210> 34

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: Haf 26

<400> 34

gagaggatcc cccccacgac aatggaac 28

<210> 35

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: Haf 27)

<400> 35 cctgaaggcg cgagggtggg cattacgggg cgatcctcct tatg 44

<210> 36

<211> 6389

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas

<223> pCLiK5MCS P EF-TS metA

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1767)..(2558)

<223> KanR

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (4839)..(5960)

<223> Proteína Rep

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (2825)..(3685)

<223> Ori-Ec (pMB) (complementario)

<220>

<221>

características_misceláneas 5 <222> (3831)-..(4505)

<223> Orf1

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1217)..(1411) 10 <223> P EF-TS (complementario)

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (83)..(1216)

<223> metA (complementario) 15 <400> 36

<210> 37

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: BK 1753

<400> 37 ggatctagag ttctgtgaaa aacaccgtg 29

<210> 38

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: BK 1754

<400> 38 gcgactagtg ccccacaaat aaaaaacac 29

<210> 39

<211> 5156

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas

<223> H247

<400> 39

<210> 40

<211> 29

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas 10 <223> designación interna: BK 1848

<400> 40 gagaactagt agctgccaat tattccggg 29

<210> 41

<211> 32 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220> 20 <221> características_misceláneas <223> designación interna: BK 1849

<400> 41 gtgtgtcgac ttagatgtag aactcgatgt ag 32

<210> 42 5 <211> 6464

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido 10 <220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: pG A4 (H344)

<400> 42

<210> 43

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: BK 1695

<400> 43 gagactcgag ggccgttacc ctgcgaatg 29

<210> 44

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: Haf16

<400> 44 gagaactagt gtggctacga ctttcgcagc 30

<210> 45

<211> 6604

<212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: pCliK5MCS PeftuPsod metA (H473)

<400> 45

<210> 46

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: Haf64

<400> 46 gagaactagt ggccgttacc ctgcgaatg 29

<210> 47

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: Haf65

<400> 47 gcgcgagggt gggcattgta tgtcctcctg gacttc 36

<210> 48

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: BK1862)

<400> 48 atgcccaccc tcgcgcc 17

<210> 49

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: BK1849)

<400> 49 gtgtgtcgac ttagatgtag aactcgatgt ag 32

<210> 50

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: BK 1697

<400> 50 gagactcgag agctgccaat tattccggg 29

<210> 51

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas 5 <223> designación interna: Haf17)

<400> 51 gagaactagt taggtttccg caccgagc 28

<210> 52

<211> 6609 10 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220> 15 <221> características_misceláneas

<223> designación interna: pCLiK5MCS Psod Peft metA (H505)

<400> 52

<210> 53

<211> 30

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas 10 <223> designación interna: BK1701

<400> 53 gagactcgag cggcttaaag tttggctgcc 30

<210> 54

<211> 31 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220> 20 <221> características_misceláneas

<223> designación interna: Haf018

<400> 54 gagaactagt attttgtgtg tgccggttgt g 31

<210> 55

<211> 6583

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas , 10 <223> designación interna: pCLiK5MCS PgroPsod metA (H472)

<400> 55

<210> 56

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: BK1782

<400> 56 tcgagagatt ggattcttac 20

<210> 57

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: Haf63

<400> 57 tctcggtacc ccgcaccgag catatacatc 30

<210> 58

<211> 6450

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: H479 (pCliK5MCS PEF-TS metA)

<400> 58

<210> 59

<211> 6759

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5 <220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: H501 (pCliK5MCS Pgro Psod Pefts metA) 10 <400> 59

<210> 60

<211> 6780

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas 10 <223> designación interna: H502 (pCliK5MCS Peftu Psod Pefts metA)

<400> 60

<210> 61

<211> 35

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 61

gagagagaga cgcgtcccag tggctgagac gcatc 35 10 <210> 62

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Cebador

<400> 62

ctctctctgt cgacgaattc aatcttacgg cctg 34

<210> 63

<211> 4323

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: pCLiK5 MCS integrante SacB (también denominado pcIS)

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (457)..(1248)

<223> KanR

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (3840)..(4302)

<223> PsacB (complementario)

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (2418)..(3839)

<223> SacB (complementario)

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1515)..(2375)

<223> Ori-Ec (pMB) (complementario)

<400> 63

<210> 64

<211> 5860

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (155)..(1420)

<223> lysC

<220>

<221> características_misceláneas 5 <222> (3935)..(5356)

<223> sacB (Bacillus subtilis)

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (5357)..(5819) 10 <223> Promotor sacB complemento

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1974)..(2765)

<223> kanR 15 <220>

<221> características_misceláneas

<222> (3032)..(3892)

<223> Ori-EC complemento

<220> 20 <221> características_misceláneas

<222> (3913)..(3934)

<223> sacB región corriente abajo (complemento)

<400> 64

<210> 65

<211> 38

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 65

cggcaccacc gacatcatct tcacctgccc tcgttccg 38 10 <210> 66

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Cebador

<400> 66 cggaacgagg gcaggtgaag atgatgtcgg tggtgccg 38

<210> 67

<211> 1263 20 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> características_misceláneas

<223> lysc gen

<400> 67

<210> 68 5 <211> 5860

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido 10 <220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: pCIS sysc thr311ile

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (155)..(1420)

<223> lysC

<220> 5 <221> características_misceláneas

<222> (3935)..(5356)

<223> sacB (Bacillus subtilis) complemento

<220>

<221> características_misceláneas 10 <222> (5357).’.(5819)

<223> Promotor sacB complement

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (1974)..(2765) 15 <223> kanR

<220>

<221> características_misceláneas

<222> (3032)..(3892)

<223> ori-EC complemento 20 <400> 68

<210> 69

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: Old38

<400> 69 acatccatgg tggccgttac cctgcgaat 29

<210> 70

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: Old 39

<400> 70 tgtatgtcct cctggacttc 20

<210> 71

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: old40

<400> 71

gaagtccagg aggacataca atgaccaaca tccgcgtagc 40

<210> 72

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: old 37

<400> 72 gaaaccacac tgtttccttg c 21

<210> 73

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: old 32

<400> 73 atcaacgcgt cgacaccaca tcatcaatca c 31

<210> 74

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220> <221> características_misceláneas

<223> designación interna: old33

<400> 74

atcaccatgg gttcttgtaa tcctccaaaa ttg 33 5 <210> 75

<211> 6187

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: pCIS Peftu ddh (pCLiK int sacB Peftu ddh)

<400> 75

<210> 76

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: CK461

<400> 76 cctgacgtcg caatataggc agctgaatc 29

<210> 77

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: CK466

<400> 77 gcccaattgg ttcttgtaat cctccaaaa 29

<210> 78

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: CK426

<400> 78 cgccaattgt cgagggccgt taccct 26

<210> 79

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: Eck463

<400> 79 gctacgcgga tgttggtcat gggtaaaaaa tcctttcgta 40

<210> 80

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: CK464

<400> 80 tacgaaagga ttttttaccc atgaccaaca tccgcgtagc 40

<210> 81

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador

<220>

<221> características_misceláneas

<223> designación interna: CK467 5 <400> 81 agacccgggt tagacgtcgc gtgcgatca 29

<210> 82

<211> 6233

<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido

<220>

<221> características_misceláneas 15 <223> designación interna: pCIS PeftuPsod ddh = pclik int sacB PeftuPs od ddh

<400> 82

<210> 83

<211> 7

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> características_misceláneas

<223> secuencia de enlazamiento de ribosoma

<400> 83 10 aggagga

<210> 84

<211> 1365

<212> ADN

<213> corynebacterium glutamicum 15 <220>

<221> características_misceláneas

<223> RAX077

<400> 84

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Bacteria corineforme genéticamente modificada, transformada con al menos un vector que contiene al menos un casete de expresión, en cuyo caso el casete de expresión comprende en dirección 5’ -3’ un módulo de secuencia de la siguiente fórmula general II:

   5’ -P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3’ (II)

   Donde n representa un valor de número entero de 0 a 10, Ax y Ay son iguales o diferentes y representan un enlace químico o una secuencia de ácido nucleico enlazante; P1, Px y Py codifican secuencias de promotores iguales o diferentes derivadas de bacterias corineformes iguales o

   diferentes, que comprenden al menos un segmento que enlaza polimerasa de ARN; y al menos Py comprende un segmento de secuencia terminal 3’ que facilita el enlace ribosómico,

   G representa al menos una secuencia de ácido nucleico codificante que está enlazada funcionalmente con la secuencia regulatoria ubicada corriente arriba de 5’.

2. 2.

   Bacteria corineforme genéticamente modificada según la reivindicación 1, en cuyo caso las bacterias corineformes son bacterias del género corynebacterium o brevibacterium.

3. 3.

   Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 o 2, que contiene al menos un casete de expresión en forma integrada.

4. 4.

   Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 a 3, en cuyo caso P1, Px y Py presentan una identidad hacia la secuencia de partida de al menos 80% o son secuencias de promotores artificiales.

5. 5.

   Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 a 4, en cuyo caso P1, Px y Py se derivan respectivamente de una secuencia continua de 35 a 500 residuos de nucleótido, la cual se encuentra en el genoma del organismos corriente arriba de 5’ de la secuencia que codifica una proteína y presenta una identidad de al menos 80% con la secuencia de partida.

6. 6.

   Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 a 5, en cuyo caso P1, Px y Py se seleccionan independientemente entre sí entre las secuencias de promotores para la secuencia codificante de una proteína con alta abundancia en un organismo.

7. 7.

   Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 a 6, en cuyo caso P1, Px y Py independientemente entre sí se selecciona entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.

8. 8.

   Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 a 7, en cuyo caso los promotores se seleccionan entre promotores fuertes, constitutivos o regulables.

9. 9.

   Bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1-8, en cuyo caso G se selecciona entre

   a.

   ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía biosintética aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos,

   b.

   ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de nucleótidos y nucleósidos,

   c.

   ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de ácidos orgánicos,

   d.

   ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de lípidos y ácidos grasos,

   e.

   ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de dioles,

   f.

   ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de carbohidratos,

   g.

   ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de compuestos aromáticos,

   h.

   ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de vitaminas,

   i.

   ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de cofactores y

   j.

   ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir de la vía de biosíntesis de enzimas.

   k.

   ácidos nucleicos que codifican una proteína a partir del metabolismo central.

10. 10.

    Bacteria corineforme genéticamente modificada, según la reivindicación 9a) en cuyo caso los ácidos nucleicos que codifican proteínas de la vía biosintética, seleccionadas entre cinasa de aspartato, aspartato-semialdehídodeshidrogenasa, diaminopimelato-deshidrogenasa, diaminopimelato-descarboxilasa, dihidrodipicolinato-sintetasa, dihidrodipicolinatos-reductasa, glicerinaldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, 3-fosfoglicerato-cinasa, piruvatocarboxilasa, triosafosfato-isomerasa, regulador transcripcional LuxR, regulador transcripcional LysR1, regulador transcripcional LysR2, malato-quinona-oxidoreductasa, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, 6-fosfogluconato deshidrogenasa, transcetolasa, transaldolasa, homoserina-O-acetiltransferasa, cistahionina-gamma-sintasa, cistahionina-beta-liasa, serina-hidroximetiltransferasa, O-acetilhomoserina-sulfhidrilasa, metilen-tetrahidrofolatoreductasa, fosfoserina-aminotransferasa, fosfoserina-fosfatasa, serina-acetil-transferasa, homoserinadeshidrogenasa, homoserina-cinasa, treonina-sintasa, exportador-portador de treonina, treonina-deshidratasa, piruvato-oxidasa, exportador de lisina, biotina-ligasa, cisteína-sintasa l, cisteína-sintasa II, metionina – sintasa dependiente de coenzima B12, actividad de metionina-sintasa independiente de coenzima B12, sulfatadeniltransferasa subunidad 1 y 2, fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ferredoxina-sulfito-reductasa, ferredoxina NADP reductasa, 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, regulador RXA00655, regulador RXN2910-R, arginilARN-t-sintetasa, fosfoenolpiruvato-carboxilasa, proteína treonina Efflux, serinahidroximetiltransferasa, fructosa-1,6afosfatasa, proteína de la reducción de sulfato RXA077, proteína de la reducción de sulfato RXA248, proteína de la reducción de sulfato RXA247, proteína OpcA, 1-fosfofructocinasa, 6-fosfofrutocinasa, tetrahidropicolinatosuccinilasa, succinilo-aminocetopimelato-aminotransferasa, succinil-diaminopimelato-desuccinilasa, diaminopimelato-epimerasa, 6-fosfogluconato-deshidrogenasa, glucosafosfato-isomerasa, fosfoglicerato-mutasa, enolasa, piruvato-cinasa, aspartato-transaminasa, y malato-enzima.

11. 11.

    Método para producir un producto biosintético, en cuyo caso se cultiva una bacteria corineforme genéticamente modificada según una de las reivindicaciones 1 a 10 y se aísla del cultivo el producto deseado.

12. 12.

    Método según la reivindicación 11, en cuyo caso el producto biosintético se selecciona entre ácidos orgánicos, proteínas, nucleótidos y nucleósidos, aminoácidos tanto proteinogénicos como también no proteinogénicos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, enzimas y proteínas.

    Figura 1