KR20010112232A

KR20010112232A - 코리네박테리움 글루타미컴 유래의 피루베이트 카르복실라제

Info

Publication number: KR20010112232A
Application number: KR1020017007962A
Authority: KR
Inventors: 신스키앤소니제이.; 리자드필립에이.; 윌리스로라비.
Original assignee: 자밀라 제트. 허벡; 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1998-12-23
Publication date: 2001-12-20
Also published as: WO2000039305A1; JP2003503006A; AU2203399A; CN1336958A; BR9816106A; EP1147198A1; MXPA01006290A; CA2356446A1

Abstract

본 발명은 산업 발효에서 라이신 및 글루탐산 생성중에 소비된 옥살로아세테이트를 보충하는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)으로부터 유래된 보충 효소에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 피루베이트 카르복실라제 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 또한, 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드도 제공된다.

Description

코리네박테리움 글루타미컴 유래의 피루베이트 카르복실라제{PYRUVATE CARBOXYLASE FROM CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM}

피루베이트 카르복실라제는 성장 중의 생합성, 또는 발효 공업에서 라이신 및 글루탐산 생성을 위해 소요되는 옥살로아세테이트를 보충하는 중요한 보충 효소(anaplerotic enzyme)이다.

피루베이트 카르복실라제가 반응 촉매로 이용되는 2 단계 반응 기작은 다음과 같다:

(1)

MgATP + HCO₃ ^-+ ENZ-비오틴 -(Mg²⁺아세틸-CoA)→MgADP + Pi + ENZ-비오틴-CO₂

(2)

ENZ-비오틴-CO^- ₂+ 피루베이트 ------→ENZ-비오틴 + 옥살로아세테이트

반응 (1)에서, ATP-의존성 비오틴 카르복실라제 도메인은 비오틴-카르복실-담체 단백질(BCCP) 도메인의 특이성 라이신 잔기에 연결된 비오틴 보결 분자단을 카르복실화한다. 아세틸-CoA(아세틸-조효소 A)는 바이카르보네이트-의존성 ATP 분해 속도를 증가시킴으로써 반응 (1)을 활성화시킨다. 반응 (2)에서, BCCP 도메인은 트랜스카르복실라제 도메인이 촉매로 작용하는 반응에서 CO₂를 피루베이트에게 공여한다[참조: Attwood, P. V., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 27: 231-249 (1995)].

피루베이트 카르복실라제 유전자는 리조비움 에틀리(Rhizobium etli)[참조: Dunn, M. F. 등, J. Bactreiol. 178: 5960-5970 (1996)], 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)[참조: Kondo, H. 등, Gene 191: 47-50 (1997)], 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillus)(진뱅크 접속 번호 Z97025), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)(진뱅크 접속 번호 Z83018) 및 메타노박테리움 써모오토트로피컴(Methanobacterium thermoautotrophicum)[참조: Mukhopadhyay, B., J. Biol. Chem. 273: 5155-5166 (1988)]으로부터 클로닝되었으며, 그 서열도 결정되었다. 피루베이트 카르복실라제 활성은 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)[참조: Tosaka, O. 등, Agric. Biol. Chem. 43: 1513-1519 (1979)] 및 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium Glutamicum)[참조: Peters-Wendisch, P. G. 등, Microbiology 143: 1095-1103 (1997)]에서 이미 측정되었다.

이전의 연구로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 아스파테이트류 아미노산의 수율 및 생산성은 보충 경로를 통한 탄소 유입에 결정적으로 의존한다[참조: Vallino, J.J., & Stephanopoulos, G., Biotechnol. Bioeng. 41: 633-646 (1993)].대사산물의 균형에 기초하면, 라이신 생성 속도는 보충 경로에 의한 옥살로아세테이트 합성 속도보다 늦거나 동일함을 확인할 수 있다.

본 발명은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium Glutamicum) 피루베이트 카르복실라제 단백질 및 이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

도 1은 ATCC 기탁 번호 _______ 에 포함된 DNA 클론의 서열결정에 의해 결정된 완전한 피루베이트 카르복실라제 단백질의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1) 및 추론된 아미노산 서열(서열 번호 2)을 나타낸다. 상기 단백질은 약 1140 아미노산 잔기로 이루어진 서열을 보유하며, 추정 분자량은 약 123.6 kDa이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 클로닝된 코스미드의 서열결정에 의해 결정된 도 1에 나타낸 아미노산 서열(서열 번호 2)을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 단백질을 암호화하는 풀리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 피루베이트 카르복실라제 단백질은 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 및 인간 피루베이트 카르복실라제 단백질과 서열 상동성을 공유한다. 도 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)은 미국 버지니아 20110-2209 마나싸스 유니버시티 불바드 10801에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)에 _______에 기탁되어, 기탁 번호 _______를 부여받은 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 암호화하는 코스미드 III F10을 서열결정하여 얻은 것이다.

핵산 분자

달리 기재하지 않는 경우에는, 본 명세서의 DNA 분자의 서열결정에 의해 결정된 모든 뉴클레오티드 서열은 자동화 DNA 서열결정기(예, ABI 프리즘 377)를 이용하여 결정하였으며, 본 명세서에서 결정된 DNA 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 모든 아미노산 서열은 상기한 바와 같이 결정된 DNA 서열의 번역에 의하여 예측되었다. 따라서, 이러한 자동화 서열결정법에 의해 결정된 임의의 DNA 서열은 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 본 명세서에 결정된 임의의 뉴클레오티드 서열은 일부 에러를 포함할 수 있다. 자동화 서열 결정에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 서열 결정된 DNA 분자의 실제 뉴클레오티드 서열과 약 90% 이상, 더 전형적으로 약 95% 이상 내지 약 99.9% 이상 동일하다. 실제 서열은 당업계에 공지된 수작업에 의한 DNA 서열 결정법을 포함하는 다른 방법에 의해 더 정확하게 결정할 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 바와 같이, 실제 서열과 비교하여 결정된 뉴크레오티드 서열에서 단일 삽입 또는 결실은 뉴클레오티드 서열의 번역에서 격자 이동을 일으켜 결정된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열은 이러한 삽입이나 결실 지점에서부터 서열결정된 DNA 분자에 의해 실제로 암호화되는 아미노산 서열과는 완전히 상이할 것이다.

달리 언급하지 않으면, 본 명세서에서 사용한 각각의 "뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드(약어 A, G, C 및 T)로 이루어진 서열로서 제시된다. 그러나, 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 "뉴클레오티드 서열"은 DNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 경우에는 데옥시리보뉴클레오티드로 이루어진 서열을 의미하며,RNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 경우에는 리보뉴클레오티드(A, G, C 및 U)로 이루어진 상응하는 서열을 의미하는데, 이때 특정된 데옥시뉴클레오티드 서열 내의 각 티미딘 데옥시뉴클레오티드(T)는 리보뉴클레오티드 우리딘(U)으로 대체된다. 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 약어를 이용하여 기술한 서열 번호 1의 서열을 보유하는 RNA 분자는 서열 번호 1의 각 데옥시뉴클레오티드 A, G 또는 C는 상응하는 리보뉴클레오티드 A, G 또는 C로 대체되고, 각 데옥시뉴클레오티드 T는 리보뉴클레오티드 U로 대체된 서열을 보유하는 RNA 분자를 나타내려한 것이다.

본 명세서에 제공된 정보, 예를 들어 도 1의 뉴클레오티드 서열을 이용하면, 피루베이트 카르복실라제 폴레핍티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 출발 물질로서 mRNA를 이용하는 DNA 클로닝을 위한 방법과 같은 표준 클로닝 및 선별 과정을 이용하여 획득할 수 있다. 도 1에 나타낸 피루베이트 카르복실라제 단백질(서열 번호 2)은 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)의 피루베이트 카르복실라제 단백질과 약 63% 동일하며, 인간의 피루베이트 카르복실라제 단백질과 44% 동일하다. 당업자가 인정한 바와 같이, 상기한 서열 결정의 착오 가능성 및 공지된 상이한 단백질에서 리더 서열에 대한 절단 부위의 가변성으로 인해, 기탁된 코스미드에 의해 암호화된 실질적인 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드는 약 1140개의 아미노산을 포함하나, 1133개 내지 1147개 범위내에서 임의로 아미노산을 포함할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 RNA 형태, 예를 들어 mRNA 또는 DNA 형태, 예를 들어 클로닝에 의해 얻거나, 합성한 cDNA 및 게놈 DNA 일 수 있다. 상기 DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있다. 일본쇄 DNA 또는 RNA는 센스 스트랜드로 알려진 코딩 스트랜드 일 수 있거나, 또는 안티센스 스트랜드로 알려진 비코딩 스트랜드일 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어 "분리된" 핵산 분자(들)는 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미하며, 그의 천연 환경으로부터 분리된 것이다. 예를 들어, 벡터 내에 함유된 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적을 위해 분리된 핵산 분자이다. 분리된 DNA 분자의 또 다른 예로는 이종 숙주 세포 내에 유지된 재조합 DNA 분자 또는 용액 내의 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) DNA 분자를 들 수 있다. 분리된 RNA 분자로는 생체내 또는 시험관내의 본 발명의 DNA 분자의 RNA 전사체를 들 수 있다. 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자는 합성된 분자를 추가로 포함한다.

본 발명의 분리된 핵산 분자는 도 1에 도시한 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)의 199 내지 201 위치에 개시 코돈을 보유하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 DNA 분자; 도 1 및 서열 번호 2에 도시한 피루베이트 카르복실라제 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 DNA 분자; 및 상기한 DNA 분자와는 실질적으로 상이한 서열을 포함하나, 유전 암호의 축중성으로 인해 본 발명의 피루베이트 카르복실라제 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함한다. 물론, 유전 암호는 당해 기술 분야에 공지된 것이다. 따라서, 상기한 바와 같은 축중성 변이체를 생성하는 것은 당업자에게는 일반적인 일이다.

다른 관점에서, 본 발명은 ATCC 기탁 번호 _______로 기탁된 코스미드 클론에 의해 암호화된 아미노산 서열을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 상기 기탁된 클론에 의해 암호화된 폴리펩티드를 암호화하는 것이 바람직하다. 본 발명은 또한 도 1에 도시한 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1) 또는 상기한 기탁된 클론내에 함유된 피루베이트 카르복실라제 DNA의 뉴클레오티드 서열을 보유하는 분리된 핵산 분자, 또는 상기 서열중 하나에 상보적인 서열을 보유하는 핵산 분자를 제공한다.

다른 관점에서, 본 발명은 엄한 하이브리드화 조건하에서, 상기한 본 발명의 핵산 분자, 예를 들어 ATCC 기탁 번호 _______에 함유된 코스미드 클론 내의 일정 부분의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 상기 "엄한 하이브리드화 조건"은 50% 포름아미드, 5x SSC(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 삼나트륨), 50 mM 인산 나트륨(pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 황산 덱스트란 및 변성되고, 전단처리한 연어 정자 DNA 20 ㎍/㎖를 포함하는 용액내에서 하룻밤 동안 42℃에서 항온처리하고, 약 65℃의 0.1x SSC 내에서 상기 필터를 세척하는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드의 "부분"에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 참조용 폴리뉴클레오티드의 15개 이상의 뉴클레오티드(nt), 더 바람직하게는 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 약 30 내지 70개의 뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 의미한다. 이들은 진단용 프로브 및 프라이머로 유용하다.

물론, 상기 참조용 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 기탁된 코스미드 클론)의 더 큰 부분, 예를 들어 길이가 50 내지 750 뉴클레오티드인 부분 또는 전체 길이의 참조용 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따른 프로브로 유용하며, 이는 기탁된 DNA의 뉴클레오티드 서열 또는 도 1에 도시한 바와 같은 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)의 대부분(전부는 아님)에 상응하는 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들어, "길이가 20 이상인 뉴클레오티드"인 폴리뉴클레오티드의 일부분은 참조용 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 기탁된 DNA 또는 도 1에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1))로부터 유래한 20개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 의미한다. 상기한 바와 같이, 이러한 부분은 통상적인 DNA 하이브리드화 기법에 따른 프로브 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 표적 서열의 증폭을 위한 프라이머로서 진단적으로 유용하다[참조: Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T., in Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), 콜드 스프링 하버 레버러토리 출판사 (1989); 본원에 전적으로 참고 인용함].

피루베이트 카르복실라제 코스미드 클론은 기탁되어 있고, 그의 결정된 뉴클레오티드 서열은 도 1(서열 번호 1)에 제시되어 있기 때문에, 피루베이트 카르복실라제 DNA 분자의 일부분에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 생성하는 것은 당업자에게 일반적인 일이다. 예를 들어, 피루베이트 카르복실라제 코스미드 클론의 제한 엔도뉴클레아제 절단 또는 초음파 전단 처리를 이용하여 피루베이트 카르복실라제 DNA 분자의 일부분에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드인 다양한 크기의 DNA 부분을 용이하게 생성할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드는 공지된 기법으로 합성할 수도 있다.

이미 기술한 바와 같이, 피루베이트 카르복실라제 단백질 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 상기 폴리펩티드 자체의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열; 상기 폴리펩티드 및 추가 서열, 예를 들어 프리- 또는 프로- 또는프리프로-단백질 서열을 위한 코딩 서열; 상기한 추가 코딩 서열을 보유하거나 보유하지 않는, 상기 폴리펩티드의 코딩 서열과 함께 예를 들어 인트론 및 비코딩 5' 및 3' 서열, 예를 들어 전사, mRNA 처리(예를 들어 스플라이싱을 포함함) 및 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 리보좀 결합 및 mRNA의 안정성)에서 일정 역할을 수행하는 전사된 비번역 서열(이로 제한되는 것은 아님); 추가의 아미노산, 예를 들어 추가 기능을 제공하는 아미노산을 암호화하는 추가의 코딩 서열을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 따라서, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 마커 서열, 예를 들어 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게하는 펩티드를 암호화하는 서열에 융합시킬 수 있다. 본 발명의 상기 관점에 따른 특정 구체예에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예를 들어 pQE 벡터(퀴아젠, 인크.)에 제공된 태그 등이며, 많은 종류가 시판되고 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Gentz 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 821-824 (1989)]에 기술된 바와 같이, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 위해 제공된다. 상기 "HA" 태그는 인플루엔자 헤마그글루티닌 단백질로부터 유래한 에피토프에 상응하는 정제에 유용한 다른 펩티드이다[참조: Wilson 등, Cell 37: 767 (1984)].

또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자의 변이체에 관한 것인데, 이 변이체는 피루베이트 카르복실라제 단백질의 일부분, 유사체 또는 유도체를 암호화한다. 변이체는 천연 대립유전자 변이체와 같이 자연적으로 발생할 수도 있다. 상기 "대립유전자 변이체"는 유기체의 염색체 상에서 소정의 좌(locus)를 점유하는 유전자의 몇몇 대체 형태중 하나를 의미한다[참조: Lewin, Genes II]. 비천연적으로 발생하는 변이체는 공지된 돌연변이 유발 기법을 이용하여 제조할 수 있다.

이러한 변이체는 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 첨가에 의해 생성된 것을 포함한다. 상기 치환, 결실 또는 첨가에는 하나 이상의 뉴클레오티드가 연루될 수 있다. 상기 변이체는 코딩 영역 또는 비코딩 영역 또는 상기 영역 둘 다에서 변경될 수 있다. 코딩 영역에서의 변경은 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 일으킬 수 있다. 이들중 특히 바람직한 것은 피루베이트 카르복실라제 단백질 또는 이의 일부분의 특성이나 활성을 변경시키지 않는 침묵 치환, 첨가 및 결실이다. 또한, 이러한 관점에서 특히 바람직한 것은 보존적 치환이다. 도 1에 도시한 아미노산 서열(서열 번호 2)을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 가강 바람직하다.

또한, 피루베이트 카르복실라제가 씨. 글루타미컴(C. Glutamicum) 및 피드백 저해 돌연변이주 내에서의 발현되는 것 보다 2 내지 20배 이상 발현되는 돌연변이주 또는 변이주가 바람직하다.

본 발명의 또 다른 구체예는

(a) 서열 번호 2의 완전 아미노산 서열을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;

(b) ATCC 기탁 번호 _______에 함유된 코스미드 클론에 의해 암호화된 완전 아미노산 서열을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열; 또는

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열중 임의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.

피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 암호화하는 참조용 뉴클레오티드 서열과, 예를 들어 95% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조용 서열과 동일함을 의미하는데, 단 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 암호화하는 참조용 뉴클레오티드 서열의 각각의 100 뉴클레오티드당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있음은 제외되는 의미이다. 달리 표현하면, 참조용 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드를 얻기위해, 참조용 서열의 뉴클레오티드중 5% 이하는 결실되거나 다른 뉴클레오티드로 치환되거나, 또는 참조용 서열에서 전체 뉴클레오티드중 5% 이하의 뉴클레오티드가 참조용 서열에 삽입될 수 있음을 의미한다. 참조용 서열의 이들 돌연변이는 참조용 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 단부 위치 또는 참조용 서열 내의 뉴클레오티드 사이 또는 참조용 서열 내의 하나 이상의 인접한 군중 임의 위치에 개별적으로 점재된 이들 단부 위치 사이의 임의 위치에서 일어날 수 있다.

실질적인 문제로서, 임의의 특정 핵산 분자가 예를 들어, 도 1에 도시한 뉴클레오티드 서열 또는 기탁된 코스미드 클론의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한지 여부는 베스트핏 프로그램(Bestfit program; 위스콘신 서열 분석 팩키지, 버젼 8, 유닉스용, 미국위스콘신 53711 메디슨 사이언스 드라이브 575, 유니버시티 리서치 파크에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 통상 결정할 수 있다. 베스트핏은 스미스 및 워터맨의 국부 상동성 알고리즘[참조: Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)]을 이용하여 2개의 서열 사이의 최적 상동성 절편을 찾아낸다. 특정 서열이 예를 들어, 본 발명에 따른 참조용 서열과 95% 동일한지 여부를 확인하기 위해 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 배열 프로그램을 이용하는 경우, 변수들은 물론 동일성(%)이 참조용 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산되며, 참조용 서열에서 뉴클레오티드 총수의 5% 이하의 상동성 차이를 허용하도록 정해진다.

본 출원은 피루베이트 카르복실라제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는지 여부와는 관계없이, 도 1(서열 번호 1)에 나타낸 핵산 서열 또는 기탁된 DNA의 핵산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 분자에 관한 것이다. 이는, 특정 핵산 서열 분자가 피루베이트 카르복실라제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하지 않는 경우에도, 당업자에게는, 예를 들어 하이브리드화 프로브 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머 등으로 사용하는 것과 같이, 상기 핵산 분자를 어떻게 이용하는지 공지되어 있기 때문이다.

그러나, 실제로 피루베이트 카르복실라제 단백질 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는, 도 1(서열 번호 1)에 나타낸 핵산 서열 또는 기탁된 DNA의 핵산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 서열을 보유하는 핵산 분자가 바람직하다. 상기 "피루베이트 카르복실라제 활성을 보유하는폴리펩티드"는 특정 생물학적 분석법으로 측정된 바와 같이, 본 발명의 피루베이트 카르복실라제 단백질의 활성과 동일할 필요까지는 없는 유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다.

물론, 유전 암호의 축중성으로 인해, 당업자는 도 1(서열 번호 1)에 나타낸 핵산 서열 또는 기탁된 DNA의 핵산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 서열을 보유하는 다수의 핵산 분자가 "피루베이트 카르복실라제 활성을 보유하는" 폴리펩티드를 암호화할 것이라는 것을 바로 인식할 것이다. 실제로, 이들 뉴클레오티드 서열의 축중성 변이체 모두는 상기한 비교 분석을 수행하지 않고도 당업자게에게는 명백할 것이다. 또한, 변이체를 축퇴시키지 않는 이들 핵산 분자에 대해서는 이성적인 수의 핵산 분자만이 피루베이트 카르복실라제 단백질 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화할 것이라는 것을 인식할 것이다. 이는 당업자에게 단백질 기능에 현저한 영향을 덜 미치거나 미치지 않는 아미노산 치환(예를 들어, 제2 지방족 아미노산에 의한 제1 지방족 아미노산의 치환)이 충분히 알려져 있기 때문이다.

예를 들어, 표현형적으로 침묵인 아미노산 치환을 어떻게 생성시킬 수 있는가에 관한 지침은 문헌[참조: Bowie, J. U. 등, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, "Science 247 : 1306-1310 (1990)]에 제공되어 있는데, 여기서, 저자는 변화에 대한 아미노산 서열의 용인을 연구하기 위한 2가지 주요 방법을 제안하고 있다. 첫번째 방법은 진화 과정에 의존하는 방법으로, 돌연변이는 자연 선택에 의해 수용되거나 배제된다. 두번째 방법은 클론된 유전자의 특정 위치에 아미노산 변화를 도입하기 위한 유전자 조작 및 기능성을 유지시키는 서열을 동정하기 위한 선택법 또는 선별법을 이용한다. 저자가 밝힌 바와 같이, 이들 연구로 부터 확인할 수 있는 것은 놀랍게도 단백질이 아미노산 치환에 용인성이라는 것이다. 또한, 상기 저자는 상기 단백질의 특정 위치에서 어떤 아미노산 변화가 묵인될 것인가를 지적하고 있다. 예를 들어, 대부분의 내재된 아미노산 잔기는 비극성 측쇄를 필요로하는 반면, 표면 측쇄의 특징중 일반적으로 보존되는 것은 거의 없다. 기타 이러한 표현형적으로 침묵인 치환은 문헌[참조: Bowie, J. U. 등, 상기참조; 본원에 참고로 인용함]에 기재되어 있다.

벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 본 발명의 분리된 DNA 분자를 포함하는 벡터, 상기 재조합 벡터로 유전적으로 조작된 숙주 세포 및 이러한 재조합 기법에 의해 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 제조하는 방법에 관한 것이다.

재조합 구성물은 공지된 기법, 예를 들어 감염, 형질도입, 형질감염, 형질전염, 접합, 전기천공법 및 형질전환을 이용하여 숙주 세포내로 도입할 수 있다. 상기 벡터는, 예를 들어 파지, 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포내에서의 번식을 위해 선택성 마커를 함유하는 벡터 내에 연결할 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 예를 들어 칼슘 포스페이트 침전물로 도입하거나, 하전된 지질과의 착물로 도입한다. 상기 벡터가 바이러스인 경우, 이는 적합한 포장(packaging) 세포주를 이용하여 시험관 내에서 포장하고, 이어서 숙주 세포 내로 형질도입한다.

바람직한 벡터는 소정의 폴리뉴클레오티드에 대해 시스-작용성 조절 영역을 포함하는 벡터이다. 적합한 트랜스-작용성 인자는 숙주내로 도입시 숙주에 의해 공급되거나, 보충 벡터에 의해 공급되거나, 상기 벡터 자체에 의해 공급될 수 있다.

상기 관점의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 벡터는 유도성 및/또는 세포형 특이성일 수 있는 특이성 발현을 위해 제공된다. 이들 벡터 중에서 특히 바람직한 벡터는 조작이 용이한 환경 인자, 예를 들어 온도 또는 영양 첨가물에 의해 유도될 수 있는 것들이다.

본 발명에 유용한 발현 벡터로는 염색체 유도된 백터, 에피좀 유도된 벡터 및 바이러스 유도된 벡터, 예를 들어 박테리아 플라스미드 유도된 벡터, 박테리오파지, 효모 에피좀, 효모 염색체 요소, 배큘로바이러스, 파포바 바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 슈도라비에스 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스 유도된 벡터 및 이의 조합으로부터 유도된 벡더, 예를 들어 코스미드 및 파지미드를 들 수 있다.

상기 DNA 삽입물은 적합한 프로모터, 예를 들어 파지 람다 P_L 프로모터, 이. 콜리lac,trp및tac프로모터, SV 40 초기 및 후기 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 한다. 기타 적합한 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 상기 발현 구성물은 추가로 전사 개시 및 종결 부위 및 전사된 영역 내에 번역을 위한 리보좀 결합 부위를 함유할 것이다. 상기 구성물에 의해발현된 성숙 전사체의 코딩부는 번역될 폴리펩티드의 초기 위치에 번역 개시 코돈(AUG 또는 GUG)을 포함할 것이며, 번역될 폴리펩티드의 거의 단부에 위치한 종결 코돈을 포함할 것이다.

지적한 바와 같이, 상기 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 함유하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 마커들은 진핵 세포 배양을 위해서는 디하이드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성을 포함하며, 이. 콜리 및 기타 박테리아 내에서의 배양을 위해서는 테트라사이클린, 앰피실린, 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성을 포함한다. 적합한 숙주의 대표예로는 이. 콜리(E. coli), 씨. 글루타미컴(C. glutamicum), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 세포; 균주 세포, 예를 들어 효모 세포를 들 수 있다. 상기 숙주 세포를 위한 적합한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다.

벡터중 박테리아에서 사용하기에 적합한 벡터로는 pA2, pQE70, pQE60 및 pQE-9(모두 퀴아젠에서 시판됨); pBS 벡터, 파지스크립트 벡터, 블루스크립트 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(모두 스트라타진에서 시판됨); 및 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(모두 파마시아에서 시판됨)을 들 수 있다. 진핵세포에서 사용할 수 있는 바람직한 벡터로는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG(모두 스트라타진에서 시판된); 및 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(모두 파마시아에서 시판됨)을 들 수 있다. 기타 적합한 벡터는 당업자에게 명백할 것이다.

본 발명에 사용하기에 유용한 공지된 박테리아 프로모터로는 이. 콜리lacI 및lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 P_R및 P_L프로모터 및trp프로모터를 들 수 있다. 적합한 진핵세포용 프로모터로는 CMV 직접 초기 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV 40 프로모터, 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 예를 들어 라우스 사코마 바이러스(RSV) 및 메탈로티오네인 프로모토, 예를 들어 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터를 들 수 있다.

숙주 세포내로 상기 구성물의 도입은 칼슘 포스페이트 형질감염법, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 양이온성 지질-매개된 형질감염, 전기천공법, 형질도입, 감염 또는 기타 방법에 의해 수행할 수 있다. 이러한 방법들은 문헌[참조: Davis 등, "Basic Methods in Molecular Biology" (1986)]과 같은 다수의 표준 실험실 지침서에 기재되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 고등 진핵생물에 의한 전사는 상기 벡터 내에 인핸서 서열을 삽입하면 증가될 수 있다. 인핸서는 DNA의 시스 작용 요소로서, 통상 약 10 내지 300 bp로 이루어져 있으며, 주어진 숙주 세포형에서 프로모터의 전사 활성을 증가시키는 작용을 한다. 인핸서의 예로는 SV 40 인핸서(bp 100 내지 270에서 복제 원점의 후방에 위치함), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 후방에 위치하는 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 들 수 있다.

소포체의 루멘, 주변 세포질 공간 또는 세포내 환경 내로 번역된 단백질을 분비시키기 위해, 적합한 분비 신호를 발현된 폴리펩티드 내에 혼입시킬 수 있다. 이러한 신호는 상기 폴리펩티드에 대해 내인성이거나, 이종 신호일 수 있다.

상기 폴리펩티드는 변형된 형태, 예를 들어 융합 단백질의 형태로 발현될 수있으며, 분비 신호 뿐만 아니라 추가의 이종 기능성 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 추가의 아미노산, 특히 하전된 아미노산으로 이루어진 영역은 상기 폴리펩티드의 N-말단에 첨가되어 정제 또는 후속 처리 또는 저장 중에 숙주 세포내에서의 안정성 및 지속성을 개선시킬 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드에 펩티드 부분을 첨가하여 정제를 용이하게 할 수 있다.

상기 피루베이트 카르복실라제 단백질은 공지된 기법, 예를 들어 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파테이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 이용하여 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 정제하는 것이 가장 바람직한 방법이다.

본 발명의 폴리펩티드는 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 과정에 의해 제조된 생성물 및 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포, 예를 들어 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포로부터 재조합 기법에 의해 제조된 생성물을 포함한다. 재조합 제조 과정에서 사용한 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 당화 또는 비당화될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 몇몇 경우에 숙주-매개된 처리 과정의 결과로서 초기 변형된 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다.

피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드 및 펩티드

본 발명은 또한 기탁된 DNA에 의해 암호화된 아미노산 서열 또는 도 1에 나타낸 아미노산 서열(서열 번호 2), 또는 상기 폴리펩티드의 일부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 상기 용어 "펩티드" 및 "올리고펩티드"는 동의어이며(통상 그렇게 인식됨), 각각의 용어는 본 명세서에서 적어도 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산의 쇄를 나타내기 위해서 필요한 경우라면 혼용이 가능하다. 상기 용어 "폴리펩티드"는 10개 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 쇄에 대해 사용된다. 본 명세서에서 모든 올리고펩티드 및 폴리펩티드 구조 또는 서열은 좌에서 우로 기재하며, 그 방향은 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향이다.

당업계에서 이미 인식되고 있는 바와 같이, 본 발명의 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드의 몇몇 아미노산 서열은 상기 단백질의 구조 또는 기능에 현저한 영향을 미치지않는 변경이 가능하다. 서열내의 이러한 변화를 고려하면, 단백질의 활성을 결정하는 중요한 부위가 있음을 유념해야 할 것이다. 일반적으로, 유사 기능을 수행하는 잔기를 사용한다면, 3차 구조를 형성하는 잔기를 대체하는 것이 가능하다. 기타 경우에서, 단백질의 결정적이지 않은 영역에서 변경이 일어난다면, 잔기의 형태는 전혀 중요하지 않을 것이다.

따라서, 본 발명은 실질적인 활성을 나타내거나 후술하는 단백질 부분과 같은 피루베이트 카르복실라제 단백질의 영역을 포함하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드의 변형물을 포함한다. 이러한 돌연변이체로는 결실, 삽입, 역위, 반복 및 형태 치환(예를 들어, 한 친수성 잔기의 다른 친수성 잔기로의 치환, 그러나 규칙에 따라 강한 친수성 잔기를 강한 소수성 잔기로 치환하는 것은 금함)을 들 수 있다. 작은 변화 또는 이러한 "중성" 아미노산 치환은 일반적으로 활성에 대한 효과는 거의 없다.

통상적으로 확인되는 보존적 치환으로는 지방족 아미노산인 Ala, Val, Leu 및 Ile중에서 한 잔기의 다른 잔기로의 대체; 히드록실 잔기 Ser 및 Thr의 상호 교환, 산성 잔기 Asp 외 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn과 Gln 사이의 치환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환 및 방향족 잔기 Phe, Tyr 사이의 대체를 들 수 있다.

이미 상세히 지적한 바와 같이, 어떤 아미노산 변화가 표현형적으로 침묵일 것이냐(즉, 어떤 아미노산 변화가 기능에 유해한 영향을 미치지 않을 것이냐)하는 것에 관한 지침은 문헌[참조: Bowie, J. U. 등, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, "Science 247 : 1306-1310 (1990)]에 제공되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 분리된 형태로 제공되며, 실질적으로 정제된 형태로 제공되는 것이 더 바람직하다. 재조합 기법으로 제조된 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드는 문헌[참조: Smith 및 Johnson, Gene 67: 31-40 (1988)]에 기술된 1단계 방법에 의해 실질적으로 정제될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 기탁된 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드, 서열 번호 2의 폴리펩티드 및 상기 서열에 대해 90% 이상의 유사성, 더 바람직하게는 95% 이상의 유사성, 및 더욱 더 바람직하게는 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 유사성을 보유하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 기탁된 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드, 서열 번호 2의 폴리펩티드와 70% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상 또는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩티드를 포함하고, 30개 이상의 아미노산 및 더 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 보유하는 상기 폴리펩티드의 일부분을 포함한다.

두 폴리펩티드의 "유사성(%)"은 베스트핏 프로그램(Bestfit program; 위스콘신 서열 분석 팩키지, 버젼 8, 유닉스용, 미국 위스콘신 53711 메디슨 사이언스 드라이브 575, 유니버시티 리서치 파크에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹) 및 유사성 결정을 위한 디폴트 셋팅을 이용하여 두 폴리펩티드의 아미노산 서열을 비교함으로써 결정된 유사성 수치를 의미한다. 베스트핏은 스미스 및 워터맨의 국부 상동성 알고리즘[참조: Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)]을 이용하여 2개의 서열 사이의 최적 상동성 절편을 찾아낸다.

피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드의 참조용 아미노산 서열과, 예를 들어 95% 이상 "동일한" 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열이 참조용 서열과 동일함을 의미하는데, 단 상기 폴리펩티드 서열은 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드의 참조용 아미노산 서열의 각각의 100 아미노산당 5개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있음은 제외되는 의미이다. 달리 표현하면, 참조용 아미노산 서열에 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 얻기위해, 참조용 서열의 아미노산 잔기중 5% 이하는 결실되거나 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 참조용 서열에서 전체 아미노산중 5% 이하의 아미노산은 참조용 서열에 삽입될 수 있음을 의미한다. 참조용 서열의 이들 변경은 참조용 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 단부 위치 또는 참조용 서열 내의 아미노산 사이 또는 참조용 서열 내의 하나 이상의 인접한 군중 임의 위치에 개별적으로 점재된 이들 단부 위치 사이의 임의 위치에서 일어날 수 있다.

실질적인 문제로서, 임의의 특정 폴리펩티드가 예를 들어, 도 1에 도시한 아미노산 서열(서열 번호 2) 또는 기탁된 코스미드 클론에 의해 암호화된 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한지 여부는 베스트핏 프로그램(Bestfit program; 위스콘신 서열 분석 팩키지, 버젼 8, 유닉스용, 미국 위스콘신 53711 메디슨 사이언스 드라이브 575, 유니버시티 리서치 파크에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 통상 결정할 수 있다. 특정 서열이 예를 들어, 본 발명에 따른 참조용 서열과 95% 동일한지 여부를 확인하기 위해 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 배열 프로그램을 이용하는 경우, 변수들은 물론 동일성(%)이 참조용 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산되며, 참조용 서열에서 아미노산 총수의 5% 이하의 상동성 차이를 허용하도록 정해진다.

코리네박테리움을 조작하기 위한 유전적 도구

코리네박테리움에서의 대사 공학을 위해 필요한 유전적 변화를 야기시키기 위해, 연구자들은 표적 경로에 관여하는 유전자를 동정하고, 클로닝할 필요가 있다. 또한, 연구자들은 이들 유전자를 변형하여 이들이 암호화하는 효소의 조절 또는 발현 수준에 영향을 미치게하는 방법이 필요하고, 코리네박테리움 내로 상기 변형된 유전자를 재도입하고, 아미노산 생합성에 대한 그들의 영향을 모니터링할 방법 또한 필요하다. 따라서, 대사공학자들은 코리네박테리움 및 기타 용이하게 조작된 숙주, 예를 들어 이. 콜리 둘 다 내에서 복제할 수 있는 플라스미드의 배열을 보유하고 있어야만 한다. 또한, 예를 들어 항생제 내성을 암호화하는 선택성 마커의 수집, 변형된 유전자의 조절이 가능한 잘 특정화된 전사 프로모터 및 상기 플라스미드를 표적 코리네박테리움 균주 내로 삽입할 효과적인 형질전환 또는 접합 시스템이 필요하다.

플라스미드

몇몇 상이한 플라스미드를 도입을 위해 분리하고, 개발하여 코리네박테리움 내에서 유전자 발현시켰다[참조: Sonnen, H. 등, Gene 107: 69-74 (1991)]. 이들중 대다수는 씨. 글루타미컴(C. glutamicum), 씨. 칼루내(C. callunae) 및 씨. 락토퍼멘텀(C. lactofermentum)으로부터 동정된, 작은(3-5 kbp) 숨은 플라스미드이다. 이들은 플라스미드 pCC1, pBL1, pHM1519 및 pGA1로 예시되는 4개의 양립하는 군에 속한다. 코리네박테리움과 이. 콜리 모두에서 복제할 수 있는 플라스미드인 셔틀 벡터는 공지된 이. 콜리 플라스미드(특히, pBR322 또는 pUC18로부터 유래한 ColE1 복제 원점)로부터 유래한 요소와 항생제 내성 마커를 혼입시켜 이들 숨은 플라스미드로부터 개발하였다. 코리네박테리움을 조작하는데 매우 유용한 제5 부류의 플라스미드는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)로부터 최초 분리된 플라스미드인 pNG2에 기초한다[참조: Serwold-Davis, T.M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4964-4968 (1987)]. 상기 플라스미드 및 그의 유도체는 다수의 코리네박테리움 종 및 이. 콜리에서 효율적으로 복제된다. pNG2내의 유일한 복제 원점(단지 1.8 kbp로 이루어진 요소)은 그람 양성 및 그람 음성 숙주 모두에서 기능하기 때문에, 상기 플라스미드에 추가의 ColE1형 요소를 첨가할 필요가 없게된다. 결과적으로, pNG2 유도체(예를 들어, pEP2)는 기타 코리네박테리움 셔틀 벡터보다 크기가 훨씬 작으며, 따라서 용이하게 조작할 수 있다.

선택성 마커

항생제 내성을 부여하는 몇몇 유전자는 플라스미드 선택 및 코리네박테리아에서의 기타 재조합 DNA 작업에 유용한 것으로 확인되었다. 이들은 Tn903 유래의 카나마이신 내성 결정기, 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus)로부터 분리된 하이그로마이신 내성 마커, 스트렙토코커스 파에칼리스(Streptococcus faecalis)로부터 유래한 테트라사이클린 내성 유전자, Tn5로부터 유래한 블레오마이신 내성 유전자 및 스트렙토마이세스 아크리미시니(Streptomyces acrimycini)로부터 유래한 클로람페니콜 내성 마커를 포함한다. pBR322와 같은 다수의 이. 콜리 플라스미드에서 사용되는 베타-락타마아제 유전자는 코리네박테리움에서 앰피실린 내성을 부여하지 않는다.

형질전환 시스템.

외래 DNA를 코리네박테리움내로 도입하기 위한 몇몇 방법이 고안되었다. 일반적으로 사용된 초기 방법은 DNA 및 폴리에틸렌글리콜의 존재하에서 스페로플라스트의 항온처리를 포함하는 기타 그람 양성 종에게 성공적이었던 프로토콜에 기초하였다[참조: Yoshihama, M. 등, J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985)]. 상기 방법은 유용하지만, 종종 DNA 1 mg 당 10⁵이하의 형질전환체를 산출하여 일반적으로 비효율적이다. 코리네박테리움 스페로플라스트의 전기천공법은 더욱 효과적이고 신뢰할 만한 형질전환 방법으로 확인되었다. 스페로플라스트는 글리신 및/또는 저농도의세포벽 생합성 억제제, 예를 들어 이소니코틴산 하이드라지드(이소니아지드), 앰피실린, 페니실린 G, 또는 트윈-80을 함유하는 풍부한 배지에서 세포를 성장시켜 생성한다. 이어서, 상기 스페로플라스트는 글리세롤을 함유하는 저염 완충액으로 세척하고, 농축시켜, DNA와 혼합한 후, 전기천공법을 수행한다. 상기 방법의 효율은 플라스미드 DNA 1 ㎍당 10⁷정도의 형질전환체로 보고되어 있다.

코리네박테리아 내로 DNA를 전이시키기 위한 세번째 방법은 접합에 의한 형질전환이다(형질접합: transconjugation). 이 방법의 장점은 플라스미드 RP4의 유도체를 보유하는 이. 콜리 균주의 난교이다. 이. 콜리에서, RP4는 숙주 균주로부터 이. 콜리의 기타 수용성 균주 또는 기타 종으로 플라스미드의 접합성 전이를 매개하는 여러 기능을 암호화한다. 이들 "tra기능"은 섬모 형성 및 플라스미드 전이를 매개한다. 또한, RP4는 전이 원점인oriT, 섬모를 통해 수용 균주내로 플라스미드를 전이시키는 전이 장치에 의해 인지되는 시스 작용 요소를 보유한다. 상기 시스템으로부터, Simon 등[참조: Bio/Technology 1: 784-791 (1985)]은 이. 콜리로부터 코리네박테리움으로 플라스미드를 전이시킬 수 있는 유용한 형질접합 수단을 개발하였다. 이들은 S17-1 이라 칭하는 균주 내에서 RP4로부터 이. 콜리 염색체 내로tra기능을 재위치시킨다. RP4oriT를 보유하는 플라스미드는 S17-1로부터 기타 수용체로 매우 효율적으로 이동할 수 있다. 이 방법은 복제 플라스미드를 코리네박테리움 내로 도입하기에는 유용한 것으로 확인되었지만, 유전자 붕괴를 일으키는데 훨씬 더 유용한 것으로 확인되었다. 이는, 붕괴의 표적이 되는 코리네박테리움 유전자의 클론 내로 선택성 마커를 도입함으로써 수행된다. 이어서, 이 구성물을 RP4oriT는 보유하나, 코리네박테리움 내에서의 복제를 지원할 원점은 결핍된 이. 콜리 플라스미드내로 연결시킨다. 이어서, 이 플라스미드를 보유하는 S17-1은 수용 균주와 함께 항온처리하고, 혼합물은 선택성 배지내로 이전한다. 도입된 플라스미드는 코리네박테리아 내에서 복제할 수 없기 때문에, 선택성 마커를 발현하는 형질접합체는 게놈 DNA 내에서 교차 재조합을 수행하는 것으로 보인다.

제한-결손 균주

사용된 형질전환 시스템과는 무관하게, 코리네박테리아가 이. 콜리 유도된 DNA를 외래로 인식할 수 있고, 왕왕 그것을 분해시킬 수 있다는 명백한 선례가 문헌상에 존재한다. 이러한 능력은 코리네박테리움 제한 시스템 및 변경 시스템에 기여한다. 이러한 시스템을 극복하기 위해, 몇몇 형질전환 및 형질접합 프로토콜은 형질전환 이전에 수용 균주를 간단히 가열할 것을 요구한다. 상기 가열 처리는 제한 시스템에서 일정 역할을 담당하는 효소를 불활성화시켜 상기 효소가 회복되기 전에 도입된 DNA를 확립하는 것이 가능해 진다. DNA 전달 효율을 개선하기 위한 다른 방법은 제한 시스템이 결손된 코리네박테리움 돌연변이주를 분리하는 것이다. 이들 균주는 코리네박테리움에서 증식하는 플라스미드와 거의 동일한 효율로 이. 콜리 내에서 증식하는 플라스미드를 혼입시킬 것이다. 코리네박테리움 내에서 제한 시스템을 우회하기 위해 사용되는 다른 방법에서, Leblon 및 동역자들[참조: Reyes, O. 등, Gene 107: 61-68 (1991)]은 유전자 붕괴를 위한 "인테그론(integron)" 시스템을 개발하였다. 인테그론은 표적 숙주의 DNA와 동일한제한/변경 특성을 보유하는 DNA 분자이고, 숙주 게놈의 일부분(즉, 붕괴되는 게놈의 영역)과 상동성인 DNA를 보유하며, 숙주 세포 내에서 복제할 수 없다. 코리네박테리움으로부터 클로닝된 유전자는 일차로 임의의 코리네박테리움 균주에서 증식하는 플라스미드내의 선택성 마커에 의해 저지된다. 이어서, 이 구성물은 코리네박테리아 플라스미드로부터 절단되고, 자가 연결되어 비복제성 환상 분자를 형성한다. 다음, 이 "인테그론"은 전기천공법에 의해 제한 숙주내로 도입된다. 상기 DNA의 변경은 인테그론이 숙주 제한 시스템을 회피할 수 있도록 해주며, 숙주 게놈으로의 재조합은 선택성 마커의 발현을 허용하게 된다.

프로모터

신뢰할만한 전사 프로모터는 코리네박테리움 내에서 외래 유전자의 효율적인 발현을 위해 필요하다. 특정 실험에서, 특정 배양 조건하에서 활성이 유도될 수 있는 조절된 프로모터를 요구하기도 한다. 코리네박테리움 유전자로부터 유도된fda,thrC및hom프로모터와 같은 프로모터는 이종 유전자 발현을 위해 유용한 것으로 확인되었다. 이. 콜리의 유도성 프로모터, 예를 들어 P _lac 및 P _trc 는lac리프레서(lacI)가 존재하는 경우에는 이소프로필티오갈락토피라노시드(IPTG)에 의해 유도되며; P_trp는trp리프레서(trpR)가 존재하는 경우에는 인돌 아크릴산에 반응하며; 람다 P _L 은 온도 민감성 람다 리프레서(cI857)의 존재하에서 억제되며, 상기 모두는 코리네박테리움 내에서 유전자 발현을 조절하기 위해 사용된다.

유전자 동정

적소에 기타 모든 유전적 수단을 이용하여, 코리네박테리움으로부터 관련 유전자를 동정하기 위한 시도가 계속되어 왔다. 이. 콜리에서, 유전자를 분리하기 위해 사용된 공급원중 몇몇은 형질도입 파지, 전위성 요소, 형질도입 및 형질접합 실험에서 얻은 이. 콜리 염색체의 유전 지도 및 더 최근에는 상기 염색체의 완전한 물리적 지도 및 서열 지도이다. 지금까지, 코리네박테리움으로부터 유전자를 동정하고 회복시키기위한 가장 성공적인 방법은 이. 콜리의 공지된 영양요구체를 보충하기 위해 코리네박테리움 게놈 DNA를 이용하는 것이다. 이 실험에서, 코리네박테리움 게놈의 단편을 보유하는 플라스미드의 라이브러리는 특정 효소 또는 기능이 결핍된 이. 콜리 균주내로 도입된다. 더 이상 영양요구성(예를 들어, 호모세린 결핍성)을 나타내지 않는 형질전환체는 코리네박테리움으로부터 유래한 보충 유전자를 보유하는 것으로 보인다. 이 방법은 아스파르테이트 유도된 및 방향족 아미노산의 생합성, 중간 대사 및 기타 세포성 과정에서 일익을 담당하는 경로로부터 유래한 유전자를 포함하는 다수의 코리네박테리움 유전자의 분리를 유도한다. 상기 방법의 한가지 제한은 코리네박테리움으로부터 유래한 모든 유전자가 그러한 것은 아니지만, 이. 콜리 숙주 내에서 발현된다는 점이다. 따라서, 임의의 유전자가 플라스미드 라이브러리 내에 나타날 수 있음에도 불구하고, 이. 콜리 돌연변이를 보충할 수 없으며, 따라서, 선택 중에 회수되지 못할 수도 있다. 이러한 제한점의 극복은, 야생형 코리네박테리움으로부터 유래한 플라스미드 라이브러리를 이용하여 다른 코리네박테리움 균주 내에서 돌연변이를 직접적으로 보충하는 유사한 방법을 이용하여 더 적은 수의 유전자를 동정하는 것이다. 이러한 방법은 영양요구성 숙주내에서 불충분한 유전자 발현을 고려하는 것을 피할 수 있음에도 불구하고, 그의 유용성은 영양요구체 내에 불량한 플라스미드-형질전환 효율에 의해 제한된다. 여전히 기타 유전자는 기타 종으로부터 유래한 상동성 유전자에 기초한 핵산 프로브를 이용하는 하이브리드화, 및 폴리머라제 연쇄 반응과 축중성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 유전자의 직접적인 증폭에 의해 동정되었다.

전위성 요소

전위성 요소는 유전자 동정에서 매우 강력한 수단인데, 그 이유는 이들이 돌연변이 유발과 유전자 회수를 연결시키기 때문이다. 유전자 내에서 점 돌연변이 또는 작은 결실을 생성시키는 고전적인 돌연변이 유발 기법과는 달리, 전위성 요소가 유전자 내에 삽입되는 경우, 이들은 큰 붕괴를 야기함으로써 용이한 동정을 위해 변경된 유전자를 "표시(tagging)"한다. 다수의 전위성 요소가 코리네박테리움 내에서 전위하는 것으로 확인되었다. 씨. 제로시스(C. xerosis)의 플라스미드 pTP10 및 씨. 디프테리아(C. diphtheriae)의 플라스미드 pNG2에서 발견된 트랜스포존은 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 내에서 전위하여 에리트로마이신에 대한 내성을 부여하는 것으로 확인되었다. 일본의 미쯔비시 케미칼 컴퍼니는 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 내에서 발견된 삽입 서열 IS31831로부터 일련의 인공 트랜스포존을 개발하였다[참조: Vertes, A. A. 등, Mol. Gen. Genet. 245: 397-405 (1994)]. IS31831의 역위 반복부 사이에 선택성 마커를 삽입한 후, 이들 연구원들은 생성된 트랜스포존을 이. 콜리 플라스미드 상에서(코리네박테리움 내에서 복제할 수 없음) 전기천공법에 의해 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 내로 도입할 수 있었다. 그들은선택성 마커가 약 4 x 10⁴돌연변이체/㎍ DNA의 빈도로 표적 세포의 게놈에 삽입됨을 확인하였다. 코리네박테리움 영양요구체를 생성하기 위한 상기 트랜스포존의 용도는 코리네박테리아에서 아미노산 생합성 및 기타 기능에 일익을 담당하는 몇몇 유전자의 분리를 유도하였다.

형질도입 파지

형질도입 파지는 유전자 좌 지도화 및 유전자 분리를 위한 기타 시스템에 사용되었다. 1976년에, 일본의 아지노모토 컴퍼니의 연구원들은 특성이 규명되거나 규명되지 않은 150개의 글루탐산 생성 코리네형 박테리아를 조사하여 형질도입에 유용할 수 있는 파지를 동정하였다[참조: Mornose, H. 등, J. Gen. Appl. Microbiol. Rev. 16: 243-252 (1995)]. 상기 선별작업으로부터 회수한 24개의 상이한 파지 분리체 중에서 단지 3개만이trp ⁺공여체로부터trp ^-수용체로trp마커를 임의의 적합한 빈도로(상기 효율이 단지 10^-7미만임에도 불구하고) 형질도입시킬 수 있었다. 상기 연구원들은 4 mM 환상 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 또는 1.2 M 염화 마그네슘을 포함시킴으로써 형질도입 효율을 약간 개선시킬 수 있었다. 몇몇 다른 연구원들은 오염된 산업용 발효물, 토양 및 동물 분뇨와 같은 공급원으로부터 코리네파지를 분리함으로써 신뢰할 만한 형질도입 방법을 개발하려고 노력하였다. 많은 파지가 분리되고, 그 특성이 규명되었지만, 형질도입과 관련된 것은 거의 없었으며, 일반적으로 글루탐산을 생성하는 박테리아와 병용할 수 있는 신뢰할 수 있고, 효율이 높은 형질도입 시스템의 개발 기회는 여전히 존재한다.

본 발명은 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 서열 또는 ATCC 기탁번호 ______로 박테리아 숙주내에 기탁된 코스미드 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 도 1(서열 번호 1)에 도시한 서열, 즉 기탁된 피루베이트 카르복실라제 코스미드 클론을 서열결정하여 얻은 뉴클레오티드 서열은 추론된 분자량이 약 123.6 kDa인 1140 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. 예상된 피루베이트 카르복실라제 단백질의 1140 아미노산 서열은 도 1 및 서열 번호 2에 나타냈다.

따라서, 본 발명의 한 관점은

(a) 서열 번호 2의 완전한 아미노산 서열을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;

(b) ATCC 기탁번호 _______에 포함된 코스미드 클론에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 임의의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열

로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 상기 (a), (b) 또는 (c)의 임의의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 (a), (b) 또는 (c)의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드에 엄한 하이브리드화 조건하에서 하이브리드되는 폴리뉴크레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 엄한 하이브리드하 조건하에서 A 잔기만으로 또는 T 잔기만으로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드에는 하이브리드되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포, 및 이러한 벡터와 숙주 세포를 제조하는 방법 및 재조합 기법을 이용하여 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드 또는 펩티드를 제조하기 위해 이들을 이용하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은

(a) 도 1에 나타낸 아미노산 서열(서열 번호 2)을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드의 아미노산 서열; 및

(b) ATCC 기탁 번호 _______에 포함된 코스미드 클론에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드의 아미노산 서열

로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 보유하는 분리된 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 아미노산 서열과 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상 유사한 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드 및 상기한 서열들과 70% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 포함한다.

하기 방법 및 자세한 실험 내용은 본 실시예에 참고로 기재한 것이다.

박테리아 균주 및 플라스미드

씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 21253(hom ^-, 라이신 과다생산주)를 이용하여 염색체 DNA를 제조하였다. 이. 콜리 DH5α(hsdR ^-,recA ^-)[참조: Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166: 557-580 (1983)]은 형질전환에 이용하였다. 플라스미드 pCR2.1TOPO(인비트로겐)을 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 생성물을 클로닝하였다. 상기 연구에서 플라스미드 pRR850을 구성하였으며, pCR2.1 TOPO 플라스미드 내에서 클로닝된 850-bp PCR 단편을 포함시켰다.

배지 및 배양 조건

이. 콜리 균주는 37℃의 루리아-베르타니(LB) 배지 내에서 성장시켰다[참조: Sambrook, J. 등, Molecular cloning: a laboratory manual(2판), 콜드 스프링 하버 실험실, 뉴욕 콜드 스프링 하버 (1989)]. 씨. 글루타미컴(C. glutamicum)은 30℃의 LB 배지에서 성장시켰다. 지적한 장소에서 앰피실린은 다음 농도로 사용하였다: 100 ㎍/㎖(평판 배양) 및 50 ㎍/㎖(액체 배양).

DNA 조작

게놈 DNA는 문헌[참조: Tomioka, N. 등, Mol. Gen. Genet. 184: 359-363 (1981)]에 기술된 바와 같이 씨. 글루타미컴(C. glutamicum)으로부터 분리하였다.PCR 단편는 제조자의 지시에 따라 pCR2.1 TOPO 벡터 내로 클로닝하였다. 코스미드 및 플라스미드 DNA는 퀴아프렙 스핀 컬럼에서 제조하고, DNA는 퀴아엑스 키트(퀴아젠)를 이용하여 아가로즈 겔로부터 추출하였다. 서열결정을 위한 대규모의 고순도 코스미드 DNA를 제조하기 위해, 프로메가 위자드 키드(프로메가)를 사용하였다. 표준 기법을 이용하여 이. 콜리를 형질전환하고, 아가로즈 겔 전기영동을 수행하였다[참조: Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T., in Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), 콜드 스프링 하버 레버러토리, 뉴욕 콜드 스프링 하버 (1989)]. 제한 효소는 뵈링거 만하임 또는 뉴 잉글랜드 바이오랩스로부터 구입하였다.

코스미드 라이브러리

사용된 코스미드 라이브러리는 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) DNA를 슈퍼코스 벡터(스트라타진) 내로 클로닝함으로써 구성하였다.

폴리머라제 연쇄 반응(PCR)

PCR은 제조자의 지시에 따라 뵈링거 만하임 PCR 코어 키트를 이용하여 수행하였다. 코리네박테리움 염색체 DNA에 대해 PCR을 수행하는 경우, 매 반응마다 약 1 ㎍의 DNA를 사용하였다. PCR 반응을 위해 사용된 전방향 프라이머는 5' GTCTTCATCGAGATGAATCCGCG 3'이었으며, PCR 반응을 위해 사용된 역방향 프라미어는 5' CGCAGCGCCACATCGTAAGTCGC 3' 였다.

도트-블롯 분석

본 연구에서 동정된 코스미드로부터 유래한 DNA를 함유하는 도트 블롯 및 양성 대조군으로서의 프로브는 S&S(슐라이허 운트 슐) 미니폴드 장치를 이용하여 제조하였다. 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 피루베이트 카르복실라제 유전자의 일부분을 암호화하는 850-bp 단편을 프로브로 이용하였다. 상기 프로브는 제조자에 의해 기술된 바와 같이, 무작위 프라이밍된 DNA-표지 반응에서 디옥시게닌-11dUTP(뵈링거 만하임)으로 표지하였다. 상기 도트-블롯의 하이브리드화, 세척 및 열량검출은 필터 하이브리드화를 위한 사용자 지침내의 프로토콜에 따라 뵈링거 만하임의 지니어스 시스템을 이용하여 수행하였다. 291 코스미드를 이용하는 초기 하이브리드화는 65℃에서 하룻밤 동안 수행하였으며, 세척은 상기 하이브리드화 온도에서 수행하였다. 두번째 선별에서 사용된 17 코스미드에서, 하이브리드화는 65℃에서 수행하였으나, 8 시간 동안만 수행하였으며, 필름에 대한 노출 시간은 감소시켰다.

웨스턴 블로팅에 의한 비오틴-함유 단백질의 검출

씨. 글루타미컴(C. glutamicum)의 세포 추출물은 문헌[참조: Jetten, M.S.M., & Sinskey, A. J., FEMS Microbiol. Lett. 111: 183-188 (1993)]에 기술된 바에 따라 제조하였다. 세포 추출물 내의 단백질은 바이오라드 미니겔 장치내의 나트륨 도데실 설페이트(SDS)/7.5% 폴리아크릴아미드 겔 내에서 분리하고, 바이오라드 미니 트랜스블롯 장치를 이용하여 니트로-셀룰로즈 상에 전기블로팅하였다[참조: Towbin, H. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354 (1979)]. 비오티닐화된 단백질은 바이오라드로부터 구입한 아비딘-접합된 알칼린 포스파타제 및 슐레이허 운트 슐로부터 구입한 5-브로모-4-클로로-3-인도일포스페이트-p-톨루딘 염/니트로블루 테트라졸륨 클로라이드를 이용하여 검출하였다.

DNA 서열결정

자동화된 DNA 서열결정은 ABI 프리즘 377 DNA 서열결정기를 사용하는 MIT 바이오폴리머 설비로 수행하였다.

서열 분석

프로그램 DNA 스트라이더 버젼 1.0(인스티튜트 드 르쉐르쉐 폰다멘탈레 프랑스)을 이용하여 상기 DNA 서열을 역위하고, 보충하고, 해석하였으며, 상기 서열내의 오픈 리딩 프레임을 확인하였다. 생물공학 국립 정보 센터(the National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 BLAST 프로그램[참조: Altschul, S.F. 등, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]을 이용하여 단백질 및 DNA 서열을 비교하였다. 단백질의 상동성 연구는 MACAW 소프트웨어(NCBI)를 이용하여 수행하였다. PCR 프라이머는 바이오소프트 인터내셔날의 프라이머 프리미어 소프트웨어를 이용하여 구성하였다. ExPasy 분자생물학 서버(제네바 대학)상에서 컴퓨트 pI/MW 도구를 이용하여 추정된 아미노산 서열의 분자량과 pI를 예측하였다.

실시예 1

비오티닐화된 효소를 검출하는 웨스턴 블로팅

피루베이트 카르복실산은 비오틴을 함유하고 있는 것으로 공지되어 있기 때문에, 웨스턴 블로팅을 이용하여 씨. 글루타미컴(C. glutamicum)에 의해 비오티닐화된 단백질 생성 여부를 검출하였다. 2개의 비오티닐화된 단백질이 LB 배지에서 성장한 세포로부터 제조한 추출물 내에서 검출되었으며(데이타는 도시하지 않음), 이는 이전의 보고와 일치하는 것이었다. 한편, 약 80 kDa에 위치하는 밴드는 아세틸-CoA 카르복실라제의 비오틴-카르복실-담체 도메인(BCCP)으로 확인되었다[참조: Jager, W 등, Arch. Microbiol. 166: 76-82 (1996)]. 120 kDa에 위치하는 두번째 밴드는 피루베이트 카르복실라제 효소로 생각되었는데, 그 이유는 이들 단백질이 113 내지 130 kDa 범위내에 있기 때문이다[참조: Attwood, P.V., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 27: 231-249 (1995)].

실시예 2

PCR 및 클로닝

씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 피루베이트 카르복실라제 유전자는 이미 클로닝된 유전자의 매우 보존된 영역의 상동성에 기초하여 클로닝하였다. 13개 유기체로부터 유래한 피루베이트 카르복실라제 유전자를 조사하였으며, 피루베이트 카르복실라제내에 보존된 ATP-결합 서브모티프에 상응하는 프라이머 및 피루베이트-결합 모티프에 인접한 영역(표 1)을 고안하였다. 아미노산이 상이한 경우, 상기 프라이머는 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)에 기초하여 고안하였는데, 그 이유는 엠. 투베르쿨로시스가 씨. 글루타미컴(C. glutamicum)과 밀접한 관련이 있기 때문이다. 850-bp 단편은 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 게놈 DNA로부터 PCR을 이용하여 증폭하였으며, 인비트로겐의 pCR2.1 TOPO 벡터 내로 클로닝하여 플라스미드 pRR850을 구성하였다. 또한, 프라이머는 보존된 비오틴 결합 부위 및 피루베이트-결합 부위(도시하지 않음)에 기초하여 고안하였다.

실시예 3

씨. 글루타미컴( C. glutamicum ) 피루베이트 카르복실라제 유전자를 함유하는 코스미드의 분리

씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 피루베이트 카르복실라제 유전자의 일부분을 함유하는 850-bp 단편을 이용하여 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 게놈 라이브러리를 탐침하였다. 제1 단계 선별에서, 도트 블롯내 291개의 코스미드중 17개만이 양성으로 나타났다. 제2 단계 선별은 이들 17개의 코스미드를 대상으로 동일한 프로브를 이용하여 수행하였으나, 더 엄한 하이브리드화 조건하에서 수행하였다. 그 결과, 4개의 코스미드가 양성 신호를 나타냈다. 이들 코스미드가 실제로 피루베이트 카르복실라제 유전자를 함유하고 있는지 여부를 확인하기 위해, 4개의 양성 코스미드를 주형으로 이용하고, 상기 프로브를 제조하기 위해 동일한 프라이머를 이용하는 PCR을 수행하였다. 850-bp 단편은 모두 4개의 양성 코스미드로부터 증폭되었으며, 각각 IIIF10, IIE9, IIIG7 및 IIIB7이라 명명하였다.

13 유기체로부터 유래한 피루베이트 카르복실라제 서열(진뱅크에서 입수함)은 MACAW 소프트웨어를 이용하여 배열하였다. 2개의 매우 보존된 영역을 선택하였으며, 올리고뉴크레오티드 프라이머는 이들 영역에 상응하는 미코박테리움 투베르쿨로시스 DNA 서열에 기초하여 구성하였다. 전방향 프라이머는 보존된 영역 A에 상응하는 DNA 서열에 기초하여 구성하였으며, 역방향 프라이머는 보존된 영역 B에 상응하는 DNA 서열에 기초하여 구성하였다.

유기체	보존된영역 A	보존된영역 B
카에노라브디티스 엘레간스(Caenorhabdtis elegans)	YFIEVNAR	ATFDVSM
아에데스 아에깁티(Aedes aegypti)	YFIEVNAR	ATFDVAL
미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)	YFIEMNPR	ATYDVAL
바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)	YFIEVNPR	ATFDVAY
피치아 파스토리스(Pichia pastoris)	YFIEINPR	ATFDVSM
무스 머스쿨러스(Mus musculus)	YFIEVNSR	ATFDVAM
라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)	YFIEVNSR	ATFDVAM
사카로마이세스 세레비제 1(Saccharomyces cerevisiae 1)	YFIEINPR	ATFDVAM
사카로마이세스 세레비제 2(Saccharomyces cerevisiae 2)	YFIEINPR	ATFDVAM
리자비움 에틀리(Rhizabium etli)	YFIEVNPR	ATFDVSM
호모 사피엔스(Homo sapiencs)	YFIEVNSR	ATFDVAM
스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)	YFIEINPR	ATFDVSM

실시예 4

서열결정방법

플라스미드 pRR850의 850-bp 삽입물은 M13 전방향 프라이머 및 M13 역방향 프라이머를 이용하여 서열결정하였다. 이들 서열에 기초하여, 프라이머 Begrev1 및 Endfor1을 구성하였으며, 피루베이트 카르복실라제 유전자의 850-bp의 개시부 및 말단부로부터 외측의 서열를 결정하는데 사용하였다. 코스미드 IIIF10은 서열결정주형으로 이용하였다. 새로운 프라이머(표 2)를 구성하고, 상기 유전자를 가로질러 "워킹(walking)"함으로써 서열결정을 계속하였다.

실시예 5

서열 분석

코스미드 IIIF10의 3637 bp의 서열을 결정하였다. 3420-bp 오픈 리딩 프레임을 동정하였으며, 이는 1140개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하는 것으로 생각되었다. 추정된 단백질은 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 피루베이트 카르복실라제와 63% 동일하였으며, 인간 피루베이트 카르복실라제와 44% 동일하였으며, 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 유전자pc는 이 상동성에 기초하여 명명하였다. 추정된 단백질의 pI는 5.4 였으며, 분자량은 123.6 kDa이었고, SDS/폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 확인된 분자량 120 kDa의 서브유닛과 유사하였다. 출발 메티오닌의 상류에서는 공통서열 리보좀 결합 부위 AAGGAA가 나타났다. 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 서열에 대한 상동성에 기초하여 예상된 번역 출발 부위는 GTG 코돈이었으며, 이는 기타 박테리아 서열에서 확인되는 바와 동일하다[참조: Stryer, L., Biochemistry(3판), Freeman, NY (1988); Keilhauer, C. 등, J. Bacteriol. 175: 5595-5603 (1993)]. 상기 DNA 서열은 진뱅크에 제출되었으며, 접속번호 AF038548을 부여받았다.

씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 피루베이트 카르복실라제의 아미노-말단 절편은 헥사펩티드 GGGGRG를 함유하였으며, 이는 모든 비오틴-결합 단백질 내에서 발견된 GGGG(R/K)G 서열에 부합하고, ATP-결합 부위라고 생각된다[참조: Fry, D.C.등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 907-911 (1986); Post, L.E. 등, J. Biol. Chem. 265: 7742-7747 (1990)]. ATP 결합에 관련되는 것으로 제안된 두번째 영역은 비오틴-의존성 카르복실라제 내에 존재하였으며, 카르바밀포스페이트 신테타아제[참조: Lim, F. 등, J. Biol. Chem. 263: 11493-11497 (1988)]는 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 서열 내에 보존되었다. 또한, 예상된 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 피루베이트 카르복실라제 단백질은 추정적인 피루베이트-결합 모티프 FLFEDPWDR를 함유하는데, 이는 미코박테리움, 리조비움 및 인간 피루베이트 카르복실라제의 트랜스카르복실라제 도메인 내에 보존된다[참조: Dunn, M. F. 등, J. Bacteriol. 178: 5960-5970 (1996)]. 트랜스카르복실라제를 이용하는 트립토판 형광 연구를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 모티프 내에 존재하는 Trp 잔기는 피루베이트 결합에 관여한다[참조: Kumer, G.K. 등, Biochemistry 27: 5978-5983 (1988)]. 상기 효소의 카르복시-말단 절편은 추정적인 비오틴-결합 부위, AMKM을 함유하는데, 이는 다른 피루베이트 카르복실라제 및 다른 비오틴-의존성 효소의 비오틴-카르복실-담체 단백질(BCCP) 도메인에서 발견되는 것과 동일하다.

코스미드 IIIF10 내에서 피루베이트 카르복실라제 유전자의 서열을 얻기위해 사용된 프라이머의 DNA 서열.

프라이머 명칭	프라이머 서열(5' - 3')
Begrev1	TTCACCAGGTCCACCTGG
Endfor1	CGTCGCAAAGCTGACTCC
Begrev2	GATGCTTCTGTTGCTAATTTGC
Endfor2	GGCCATTAAGGATATGGCTG
Begrev3	GCGGTGGAATGATCCCCGA
Endfor3	ACCGCACTGGGCCTTGCG
Endfor4	TCGCCGCTTCGGCAACAC

이전 연구로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 포스포에노/피루베이트 카르복실라제(ppc)는 씨. 글루타미컴(C. glutamicum)을 위한 주 보충 효소는 아니다. 그 이유는 그의 부재가 라이신 생성에 영향을 미치지않기 때문이다[참조: Gubler, M. 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 857-863 (1994); Peters-Wendisch, P. G. 등, Microbiol. Lett. 112: 269-274 (1993)]. 또한,¹³C-표지 실험 및 NMR 및 GC-MS 분석[참조: Park, S.M. 등, Applied Microbiol. Biotechnol. 47: 430-440 (1997b); Peters-Wendisch, P. G. 등, Arch. Microbiol. 165: 387-396 (1996)] 또는 무세포 추출물을 이용하는 효소 분석[참조: Tosaka, O., Agric. Biol. Chem. 43: 1513 - 1519 (1979)] 및 투과성 세포[참조: Peters-Wendisch, P. G. 등, Microbiol. 143: 1095 - 1103 (1997)]를 이용하는 많은 연구를 통해 피루베이트-카르복실화 효소의 존재를 확인하였다. 매우 낮은 피루베이트 카르복실화 활성은 무세포 추출물에서 확인되었으나, 이 활성은 매우 높은 ATP 바탕치로부터 분리되지 않았다. 측정된 활성은 가역성 당합성 효소, 예를 들어 옥살로아세테이트 카르복실라제 및 말산 효소가 원인일 가망성이 매우 크다. 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 내의 피루베이트 카르복실라제의 존재는 상기 당합성 효소가 상기 균주의 보충 요구를 충족시킬 수 있는 가망성은 거의 없다.

씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 피루베이트 카르복실라제 유전자의 추론된 아미노산 서열은 다양한 군의 유기체로부터 유래한 피루베이트 카르복실라제 서열과 상당히 유사하다. 상기 아미노산 서열은 그의 N-말단 영역 내에 비오틴 카르복실라제 도메인을 함유하며, 그의 C-말단 영역에 BCCP 도메인을 함유하며, 그의 중앙 영역 내에 피루베이트에 특이적인 결합 부위를 보유하는 트랜스카르복실라제 도메인을 함유한다. 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 피루베이트 카르복실라제 단백질은 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 및 인간 피루베이트 카르복실라제에 강한 상동성을 나타낸다[참조: Wexler, I.D. 등, Biochem. Biophys. Acta 1227: 46 - 52 (1994)].

씨. 글루타미컴(C. glutamicum)이 옥살로아세테이트를 재생하는 보충 작용을 수행하기 위한 하나 이상의 효소를 함유하는 지 확인하기 위한 방법이 존재한다. 슈도모나스 시트로넬로리스(Pseudomonas citronellolis), 슈도모나스 플루오르센스(Pseudomonas fluorscens), 아조토박터 비넬란디(Azotobacter vinelandii) 및 티오바실러스 노벨루스(Thiobacillus novellus)는ppc및 피루베이트 카르복실라제 모두를 함유한다[참조: O'Brien, R.W. 등, J. Biol. Chem. 252: 1257-1263 (1977); Scrutton, M.C. 및 Taylor, B.L., Arch. Biochem. Biophys. 164: 641-654 (1974); Milrad de Forchetti, S.R. & Cazullo, J.J., J. Gen. Microbiol. 93: 75-81 (1976); Charles, A.M. & Willer, D.W., Can. J. Microbiol. 30: 532-539 (1984)]. 제아 메이스(Zea mays)는ppc의 3개의 이소자임을 함유하며[참조: Toh, H. 등, Plant Cell Environ. 17: 31-43 (1994)], 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae)는 피루베이트 카르복실라제의 2개의 이소자임을 함유하며[참조: Brewster, N.K. 등, Arch. Biochem. Biophys. 311: 62-71 (1994)], 이들 각각은 차등 조절된다. 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 내의 피루베이트 카르복실라제 유전자의 존재에 대한 본 발견에 따라, 상기 균주 내에서 포스포에놀피루베이트(PEP), 옥살로아세테이트 및 피루베이트를 상호전환시킬 수 있는 효소의 수는 6개로 증가하였다. 한 유기체 내에 상기 6개 효소의 존재는 이전에 보고된 바 없다. 피. 시트로넬로리스(P. citronellolis)는 옥살로아세테이트, PEP 및 피루베이트를 상호전환시킬 수 있는 5개로 이루어진 효소 세트, 즉 피루베이트 키나제, PEP 신테타아제, PEP 카르복실라제, 옥살로아세테이트 디카르복실라제 및 피루베이트 카르복실라제를 함유한다[참조: O'Brien, R.W. 등, J. Biol. Chem. 252: 1257-1263 (1997)]. 아조토박터는 PEP 신테타아제를 제외하고 상기 효소 모두를 함유한다[참조: Scrutton, M.C. & Taylor, B.L., Arch. Biochem. Biophys. 164: 641-654 (1974)].

씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 내의 대사적으로 관련된 6개 효소의 존재는 효과기를 통한 이들 효소의 조절이 중요함을 의미한다. 상기 6개 효소 모두의 기타 하류 활성과 함께 생화학적 및 유전학적 연구를 통해 상기 상업적으로 중요한 유기체에 의한 1차 대사산물의 생산을 최대화하기 위해 필요한 정확한 절차를 규명할 수 있다.

실시예 6

피루베이트 카르복실라제 돌연변이체의 구성

피루베이트 카르복실라제 DNA의 뉴클레오티드 180으로부터 뉴클레오티드 3630까지의 전체 리딩 프레임은 PCR을 이용하여 증폭시켰다. 상기 PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 침묵 돌연변이에 의해 코딩 서열 내에SalI 부위를제거하고, 상기 오픈 리딩 프레임의 상류와 하류 각각에 EcoRV 및 SalI 부위를 도입하도록 구성하였다. 상기 PCR 생성물은EcoRV 및SalI로 분해하고, 벡터 p블루스크립트 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 pPC블루스크립트였다.pyc의 플라스미드계 붕괴를 획득하기 위해,pyc유전자의 중앙부가 결실되고, 항생체 티오스트렙톤에 대한 내성을 암호화하는tsr유전자로 대체된 pPC블루스크립트의 유도체를 구성하였다. 이어서, RP4mob요소를 상기 플라스미드에 삽입하여 pAL240을 생성하였다. 상기 플라스미드는 접합에 의해 코리네박테리움 내로 이전할 수 있으나, 단지 ColE1 복제 원점만을 보유하기 때문에, 코리네박테리움 내에서 복제할 수 없다. pAL240은 형질접합에 의해 이. 콜리 S17-1로부터 씨. 글루타미컴(C. glutamicum)으로 이전하였으며, 형질접합체는 티오스트렙톤 및 날리딕스산을 함유하는 배지 상에서 선택하였다.

각각의 형질접합체의 약제 내성 표현형을 확인하기 위해, 상기 형질접합체는 상이한 탄소원에서 성장할 수 있는 그들의 능력에 대해 시험하였다. pAL240은 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 내에서 복제할 수 없기때문에, 단지 생존하는 세포들만이 상기 플라스미드에 의해 재조합이 수행된 게놈을 보유하는 것이다. 몇몇 후보는 적합한 표현형 세트로 동정하였으며; 이들은 티오스트렙톤 및 날리딕스산에 대한 내성이 있었으며, 유일한 탄소원으로서 클루코즈 또는 아세테이트를 함유하는 최소 평판에서는 잘 자라고, 유일한 탄소원으로서 락테이트를 함유하는 최소 평판 상에서 거의 또는 전혀 성장하지 않았다. 서던 하이브리드화 및 PCR 기초한 분석법을 이용하여 게놈내에 피루베이트 카르복실라제 유전자의 단 1개의 사본이 존재하는지여부 및 그것이 티오스트렙톤 내성 마커에 의해 붕괴되는지 여부를 확인하였다. 상기 균주에 의한 라이신 생산 및 비오티닐화된 단백질의 생산을 조사하였으며, 상기 활성 분석에서 △pyc균주는 음성 대조군으로 사용하였으며, 보충 시험에서는 숙주 균주로 사용하였다.

실시에 7

과발현 균주의 개발

피루베이트 카르복실라제의 증가된 수준이 라이신의 생성을 증가시킨다는 가설을 시험하기 위해서는 피루베이트 카르복실라제 유전자의 발현이 유도성 프로모터의 조절하에 있는 균주를 구성할 필요가 있다.

IPTG-조절된trc프로모터의 하류에 NG2 복제 원점 및 다중 클로닝 부위를 보유하는 벡터 pAPE12를 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 내에서의 발현 벡터로 이용하였다. pAPE12 유도체는 Ptrc의 하류에 피루베이트 카르복실라제 유전자를 함유하도록 구성하였다. 상기pyc유전자는SalI 및XbaI를 이용하여 pPC블루스크립트로부터 절단하였으며, 동일한 효소로 절단한 pAPE12 내로 연결하여 pLW305를 형성하였다. pPC블루스크립트(이하, pLW305) 내에 존재하는 피루베이트 카르복실라제 유전자는 야생형 GTG 개시 코돈을 보유하며, 야생형 유전자의 5' 단부 근처에 존재하는SalI 제한 부위는 피루베이트 카르복실라제 유전자의 증폭중에 한 염기의 침묵 돌연변이의 도입으로 제거하였다.

pLW305 및 pAPE12는 몇몇 기타 코리네박테리움 유전적 백그라운드내로 전기천공법으로 이전하였다.

pLW305 내의 피루베이트 카르복실라제 유전자는 GTG 개시 코돈을 보유하며, trc 프로모터와 상기 개시 코돈 사이에 몇몇 개재 DNA를 보유하기 때문에, 결점이 없는 피루베이트 카르복실라제 과발현 플라스미드 pKL1을 구성하였다. 상기 유전자의 5' 단부는 GTG 개시 코돈을 ATG로 변경시키는 동시에,NcoI과 양립하는 BspLU11-I 제한 부위를 도입하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 pLW305 로부터 증폭하였다. 이어서, 상기 PCR 생성물은 BspLU11-I 및AfeI로 절단하고, NcoI를 이용한 pLW305의 부분 분해 및 이어서,AfeI를 이용한 완전 분해에 의해 획득한 7.5 kb 백본 내로 연결하였다. 2개의 개별적인 연결물 및 형질전환물은 추정적인 pXL1 클론을 생성하였다.

실시예 8

발효 결과

피루베이트 카르복실라제 활성 수준은, 상기 유전자가 그의 천연 씨. 글루타미컴(C. glutamicum) 프로모터로부터 발현되는 경우, 사용된 탄소원에 따라 크게 변화되는 것이 확인되었다. 따라서, 이들 탄소원에서 성장한 균주에서의 피루베이트 카르복실라제의 생성을 조사하였다.

균주 NRRL B-11474, NRRL B-11474(pLW305) 및 NRRL B-11474△pyc#35는 2개의 상이한 탄소원으로 글루코즈 또는 락테이트를 보유하는 NRRL B-11474를 위한 최소 배지 상의 플라스크 내에서 배양하였다. 성장 및 아미노산 생성에 대한 결과는 하기 표 3에 나타냈다.

	글루코즈	락테이트
	바이오매스(g/l)	라이신(g/l)	Ylys/glc(g/g)	바이오매스(g/l)	라이신(g/l)	Ylys/glc(g/g)
NRRL B-11474	6.7±0.2	5.0±0.7	0.21	3	1.7	0.12
NRRL B-11474(pLW305)	7.3±0.2	5.3±0.2	0.22	4	2.5	0.15
△pyc#35	1.1	0	0	0	0	0

NRRL B-11474 및 pLW305는 글루코즈에서 동일한 양상을 나타냈다. 상기 균주 모두는 동일한 양의 바이오매스와 라이신을 생성하였다. 상기 균주들은 또한 락테이트를 이용한 경우에도 유사한 라이신 수득량을 나타냈다. NRRL B-11474(pLW305)는 배지내의 모든 락테이트(17 g/l)를 소비한 반면, 야생형 NRRL B-11474는 동일한 기간중에 40% 미만의 락테이트를 소비하였다. 상기 NRRL B-11474는 0.37 g 락테이트/시간의 비율로 락테이트를 소비하는 것으로 계산된 반면, 상기 NRRL B-11474(pLW305) 균주는 0.65 g 락테이트/시간의 비율로 상기 기질을 소비하였다.

상기 NRRL B-11474△pyc는 락테이트에서 성장하지 않았는데, 이는 예상된 표현형과 일치하는 것이었다. 글루코즈에서의 그의 성장은 매우 낮았으며, 상기 균주는 라이신을 생성하지 않았다. 키네틱 연구를 수행하여 이들 균주의 양상을 특정화하였다.

실시예 9

비오티닐화된 단백질의 시각화

피루베이트 카르복실라제는 비오틴을 함유한다. 따라서, 세포 내에서 비오티닐화된 특이성 생성물의 출현을 모니터링함으로써 상기 효소의 축적을 검출하는 것이 가능하다.

실시예 10

전기영동 겔

전기영동 겔 내에서 비오티닐화된 단백질을 검출하기 위해, 알칼린 포스파타제에 결합된 스트렙타비딘(시판됨)을 이용하였다. pAPE12 또는 pLW305를 보유하는 이. 콜리 DH5α또는 NRRL B-11474의 유도된 및 유도되지 않은 배양물로부터 미정제 단백질 용해물을 분리하고, 두쌍의 7.5% 폴리아크릴아미드 변성 전기영동 겔 내에서 단백질 분리하였다. 각각의 쌍중 한 겔은 쿠마지 브릴란트 블루로 염색하여 모든 단백질을 시각화하고, 동일한 레벨의 단백질이 각각의 레인에 로딩되도록 하였다. 다른 겔은 비오티닐화된 단백질에 결합하는 스트렙타비딘-알칼린 포스파타제 시약으로 처리하였다. 이어서, 이들 단백질의 위치는 열량측정 기질인 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP)와 함께 알칼린 포스파타제를 제공하여 시각화할 수 있다. 이미 보고된 바와 같이, 2개의 주 비오티닐화된 단백질이 검출되었다. 더 큰 분자량 종(약 120 kDa)은 피루베이트 카르복실라제로 확인되었으며, 더 적은 분자량 종(약 60 kDa)은 아세틸-CoA 카르복실라제의 비오티닐화된 서브유닛이었다.

상기 인용한 모든 문헌은 본 명세서에 참고로 인용한 것이다.

상기한 바와 같이 본 발명은 명확성과 이해를 위해 일부 상세히 기술하였지만, 이는 당업자에게는 명백한 것이며, 본 발명의 실질적인 범위 및 첨부한 특허청구의 범위를 벗어나지 않은 범위내에서 다양한 변형이 가능할 것이다.

Claims

(a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;

(b) ATCC 기탁 번호 _______에 함유된 코스미드 클론에 의해 암호화되는 완전 아미노산 서열을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열중 임의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열

로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 1의 완전 뉴클레오티드 서열을 보유하는 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 암호화하는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 보유하는 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 ATCC 기탁 번호 _______에 함유된코스미드 클론에 의해 암호화되는 완전 아미노산 서열을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 핵산 분자.
엄한 하이브리드화 조건하에서 제1항의 (a), (b) 또는 (c)의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자로서, 상기 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 엄한 하이브리드화 조건하에서 단지 A 잔기 만으로 또는 T 잔기 만으로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하지 않는 분리된 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA인 분리된 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 RNA인 분리된 핵산 분자.
제1항의 분리된 핵산 분자를 벡터내에 삽입하는 단계를 포함하는 재조합 벡터의 제조 방법.
제8항의 방법으로 제조된 재조합 벡터.
제9항의 재조합 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 재조합 숙주 세포의 제조 방법.
제10항의 방법으로 제조된 재조합 숙주 세포.
피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드가 발현되는 조건 하에서 제11항의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

상기 폴리펩티드를 회수하는 단계

를 포함하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드를 제조하는 재조합 방법.
제12항에 있어서, 상기 피루베이트 카르복실라제가 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 내에서의 그의 발현 보다 2 내지 20배 더 많이 발현되는 방법.
(a) 서열 번호 2의 완전 아미노산 서열을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드의 아미노산 서열;

(b) ATCC 기탁 번호 _______에 함유된 코스미드 클론에 의해 암호화되는 완전 아미노산 서열을 보유하는 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드의 아미노산 서열

로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 보유하는 분리된 피루베이트 카르복실라제 폴리펩티드.
제1항의 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계; 및

상기 아미노산을 회수하는 단계

를 포함하는 아미노산 제조 방법.
제15항에 있어서, 상기 아미노산이 라이신인 방법.
제15항에 있어서, 상기 피루베이트 카르복실라제가 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 내에서의 그의 발현 보다 2 내지 20배 더 많이 발현되는 방법.