JP6188930B2 - 産l−アミノ酸の組換え菌およびその構築方法 - Google Patents
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Description
A)前記出発菌株染色体のpgi遺伝子を失活し、前記失活はノックアウトであることが好ましい、
B)前記出発菌株のpgi遺伝子の調節因子を低転写あるいは低発現活性の調節因子に置き換える。
C)前記出発菌株のzwf−opcA遺伝子のコピー数を増加する、
D)前記出発菌株染色体上のtkt−tal−zwf−opcA−devBオペロンのプロモーターを例えば、前記原始菌株染色体上のPeftuプロモーターのような強力なプロモーターに置き換える。
E)前記出発菌株のprsA遺伝子のコピー数を増加する、
F)前記出発菌株染色体上のprsA遺伝子のプロモーターを例えば前記原始菌株染色体上のPsodプロモーターのような強力なプロモーターに置き換える。
G)前記出発菌株のpurH遺伝子のコピー数を増加する、
H)前記出発菌株染色体上のpurH遺伝子のプロモーターを例えば前記原始菌株染色体上のPeftuプロモーターのような強力なプロモーターに置き換える。
上記方法では、前記出発菌株のグルコース−6−リン酸イソメラーゼの発現を低下させることは次の方式A)またはB)により実現する。
A)前記出発菌株染色体のpgi遺伝子を失活し、前記失活は具体的にノックアウトである、
B)前記出発菌株のpgi遺伝子の調節因子を低転写あるいは低発現活性の調節因子に置き換える。
C)前記出発菌株のzwf−opcA遺伝子とprsA遺伝子のコピー数を増加する、
D)前記出発菌株染色体上のtkt−tal−zwf−opcA−devBオペロンのプロモーターをPeftuプロモーターに置換え、かつ前記出発菌株染色体上のprsA遺伝子のプロモーターをPsodプロモーターに置き換える。
Iに示す方法は前記出発菌株染色体のpgi遺伝子をノックアウトし、かつ前記出発菌株のzwf−opcA遺伝子とprsA遺伝子のコピー数を増加して、組換え菌を得る。
前記prsA−hisGfbr断片のヌクレオチド配列は配列表の配列番号4である、
前記組換えベクターは前記zwf−opcA遺伝子と前記prsA−hisGfbr断片を発現ベクターに挿入して得られたベクターである、
前記Peftuプロモーターのヌクレオチド配列は配列表の配列番号12の5’末端から第635−834番目のヌクレオチドである、
前記Peftuプロモーターを含む断片のヌクレオチド配列は配列表の配列番号12である、
前記Psodプロモーターを含む断片のヌクレオチド配列は配列表の配列番号11である。
前記PglyAプロモーターのヌクレオチド配列は配列表に配列番号7の第863−1038番目のヌクレオチドまたは配列表に配列番号8の第752−927番目のヌクレオチドである、
前記点突然変異は前記細菌染色体のhisG遺伝子がコードするたんぱく質の第215番目のアスパラギンをリジンに変え、第231番目のロイシンをフェニルアラニンに変え、および第235番目のトレオニンをアラニンに変える。
(1)本発明に係る組換え菌は、pgi遺伝子をノックアウトして上流解糖経路をブロックするとともにzwf−opcA遺伝子を過剰発現してペントースリン酸経路の代謝能力を強化するという組み合わせ改変計画を採用することにより、エンジニアリング菌の成長とグルコース消費能力は野生型菌株に比べて明らかに弱まることがなく、同時にL−アミノ酸の生産量は著しく向上する。
(2)本発明に係る組換え菌は最少培地(振盪発酵実験用)で成長良好で、栄養要求株がなく、工業制御に便利する。
(3)本発明に係る組換え菌の発酵周期は短く、発酵タンクでの拡大培養で約45〜72時間に最大の蓄積量に達することができ(現在の報道の最高の生産量のL−ヒスチジンエンジニアリング菌の発酵時間は120時間である)(Mizukami,T.,Hamu,A.,Ikeda,M.,Oka,T.,Katsumata,R.,1994.Cloning of the ATP phosphoribosyl transferase gene of Corynebacterium glutamicum and application of the gene to L−histidine production.Biosci.Biotechnol.Biochem.58,635−638.)、プロセスやコストの制御に容易する。
(4)本発明は始めてpgi遺伝子を欠損させた上で、同時にグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼの発現を強くさせるという組み合わせ改変計画を提出して、pgi遺伝子欠損による菌株成長とグルコース代謝への制限が解除され、最大の程度で中心炭素代謝流をペントースリン酸経路にガイドするとともに、細菌の高い成長代謝とATPレベルを維持し、アミノ酸の生産量を著しく向上させて、実際に細菌発酵工業生産に使用することができる。
(5)また、本発明は始めてヒスチジン合成経路とヌクレオチド合成経路をカップリングする計画を提出して、ヒスチジン合成副産物AICARを利用してヒスチジンの前駆体ATPを合成し、L−ヒスチジン生産量を著しく向上させて、実際にL−ヒスチジンの細菌発酵工業生産に使用することができる。
本文に挙げた「出発菌株(starting bacteria)」(または、ベース菌(base bacteria)とも呼ばれる)とは、本発明の遺伝子改変計画に用いる初期の菌株を指す。この菌株は天然に存在する菌株でもいいし、誘発突然変異または遺伝子工学による改変などの方式を通じて選択して育成した菌株であってもよい。あるL−アミノ酸(例えばL−ヒスチジン)を生産するためのエンジニアリング菌を構築するために、前記出発菌株はこのL−アミノ酸(例えばL−ヒスチジン)を蓄積できる菌株であることが好ましい。
本発明者の早期研究により、本実施例では野生型コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032に対してヒスチジン合成を増強するための改変を行い、本発明の上記多ターゲット改変を実施したベース菌を得る。まず、hisEGとhisDCB(2つのヒスチジンの合成遺伝子オペロン)のプロモーターをコリネバクテリウム・グルタミクム内在性の強力なプロモーターPglyA(配列番号7の5’末端から第863−1038番目のヌクレオチド配列に示す、又は配列番号8の5’末端から第752−927番目のヌクレオチド配列に示す)に置き換えるとともに(Zhang,Y.,Shang,X.,Lai,S.,Zhang,G.,Liang,Y.,Wen,T.,2012.Development and application of an arabinose−inducible expression aystem by facilitating inducer uptake in Corynebacterium glutamicum.Appl Environ Microbiol.78,5831−5838.)、hisEとhisD遺伝子のリボソーム結合部位(RBS)をコリネバクテリウム・グルタミクムの高発現遺伝子の保守RBS配列(AAAGGAGGA)(配列番号7の5’末端から第1039−1047番目のヌクレオチド配列に示す、又は配列番号8の5’末端から第928−936番目のヌクレオチド配列に示す)に置き換えることにより、この2つのヒスチジンの合成遺伝子オペロンの転写や翻訳の減衰調節を解除し、hisE遺伝子の開始コドンGTGをATG(配列番号7の5’末端から第1053−1055番目のヌクレオチド配列に示す)に置換えて、その発現を強くさせる。次に、ヒスチジン合成経路の鍵となる律速酵素であるATP−ホスホリボシルトランスフェラーゼ(HisG、配列番号6に示す)のコード遺伝子hisGを3つのアミノ酸部位突然変異を含むhisGfbr遺伝子に置換えて(配列番号4の5’末端から第1007−1852番目のヌクレオチド配列に示す)、ヒスチジンによる該酵素へのフィードバック阻害を解除し、該酵素の触媒活性を強める(Zhang,Y.,Shang,X.,Deng,A.,Chai,X.,Lai,S.,Zhang,G.,Wen,T.,2012.Genetic and biochemical characterization of Corynebacterium glutamicum ATP phosphoribosyltransferase and its three mutants resistant to feedback inhibition by histidine.Biochimie.94,829−838.)。
Genbankにおけるコリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032のhisEGオペロンおよびその上下流配列ならびにPglyAプロモーター配列により、それぞれプライマーを設計する。
P1:GCTCTAGAGTATCGGCGTGGAGTTGTC(XbaI)(配列番号21)
P2:TAGTGGAGTAGCTTTATTTTGCGACACCTGCC(配列番号22)
P3:GTCGCA AAATAAAGCTACTCCACTAGTGTGATCG(配列番号23)
P4:GGTTCCTCCTTTGCGTAAGACCTCACTCGC(配列番号24)
P5:GAGGTCTTACGCAAAGGAGGAACCGAATGAAGACATTTGA(配列番号25)
P6:CGCGGATCCCAGGATCTGCTGCTCTGG(BamHI)(配列番号26)
P7:CCCAAGCTTCGAGGAAACCGTTGAGGA(HindIII)(配列番号27)
P8:TAGTGGAGTAGCTATGGATTTCACCTCTGTGAATG(配列番号28)
P9:TCTCCACTTTAGGTAAGCTACTCCACTAGTGTGATCG(配列番号29)
P10:CGATCCTCCTTTGCGTAAGACCTCACTCGC(配列番号30)
P11:GAGGTCTTACGCAAAGGAGGATCGCCATGTTGAATGTC(配列番号31)
P12:CGCGGATCCGGCAGAGGCATCAGCAAG(BamHI)(配列番号32)
P13:ATGTGCTGCAAGGCGATTAA(配列番号33)
P14:TATGCTTCCGGCTCGTATGT(配列番号34)
P15:TTTTATATATGGGTATCGGCGGTCTATGCT(配列番号35)。
染色体hisG遺伝子の特定部位の突然変異は二段階法を採用し、この遺伝子の3つの特定部位の突然変異を同時に実現することを希望し、まず、配列表に配列番号9に示すクロロマイセチン耐性遺伝子CmrおよびhisG遺伝子の突然変異断片の上下流ホモロジーアームを含む長い断片をCG158と相同組換えさせて、組換え菌WT−PglyA::PhisEG−Cmr::hisG−PglyA::PhisDCBを得、更に配列表に配列番号10に示す3つの点突然変異hisG遺伝子末端264bp断片及びその上下流ホモロジーアームを含む長い断片を組換え菌WT−PglyA::PhisEG−Cmr::hisG−PglyA::PhisDCBと相同組換えさせて、CG160を得る。
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032ゲノムDNAをテンプレートとして、P16とP17をプライマーとして、hisG遺伝子突然変異断片の上流ホモロジーアームをPCRで増幅し、P18とP19をプライマーとして、hisG遺伝子突然変異断片の下流ホモロジーアームを増幅し、P20とP21をプライマーとして、プラスミドpXMJ19(Biovector Science Lab,Incから購入、品番SMD1168H)をテンプレートとして、クロロマイセチン耐性遺伝子Cmrを増幅する。また、精製された上記PCR産物をテンプレートとして、P16とP21をプライマーとして、オーバーラップ伸長PCR技術(SOE)を採用して増幅し、1689bpのクロロマイセチン耐性遺伝子CmrおよびhisG突然変異断片の上下流ホモロジーアームを含む長い断片を得る(配列番号9)。
P16:CGCGGATCCATCTACGTTGCTGGTGGC(BamHI)(配列番号36)
P17:ACGGGCAACAGCTGCTGCTCTGGGGTGAC(配列番号37)
P18:CAGAGCAGCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGT(配列番号38)
P19:GGTAGTTAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACT(配列番号39)
P20:GCGGGGCGTAATTTTAACTACCCCCGAAAAT(配列番号40)
P21:CCGGAATTCCGAATGAAATCTGGGACG(EcoRI)(配列番号41)
P22:CGAAGCAGGATCTGCTGCTCTGGGGTGAC(配列番号42)
P23:CAGAGCAGCAGATCCTGCTTCGCCGCATCCA(配列番号43)
P24:GGTAGTTAAAACTAGATGCGGGCGATGCG(配列番号44)
P25:CCCGCATCTAGTTTTAACTACCCCCGAAAAT(配列番号45)
P26:TCCCAAACAAAGGCTCGC(配列番号46)
P27:CAGTCGGCGGTTTGCTAA(配列番号47)
P28:ATGTTGAAAATCGCTG(配列番号48)
P29:TTACTGCAGTGGCAGCGTCCAGGTTGTCGCGGTCGACCTTGTAATCCAGCAT(配列番号49)
P30:ACCTGGACGCTGCCACTGCAGTAACCCCAGGCTTCTCCGGCCCAGCGGTATC(配列番号50)
P31:CTAGATGCGGGCGATGCGG(配列番号51)。
本実施例では、実施例1で得た初級エンジニアリング菌を基に、さらにprsA遺伝子を過剰発現するとともに、hisGfbr遺伝子(配列番号4の第1007−1852番目のヌクレオチド配列)を過剰発現してから、pgi遺伝子(配列番号13)のノックアウトとzwf−opcA遺伝子(配列番号2)の過剰発現という改変を組み合わせて、高産量のエンジニアリング菌CG171を得る。
prsA遺伝子はPRPP合成酵素(PrsA、配列番号5に示すように、PRPPはヒスチジン合成の前駆体)をコードし、prsA遺伝子の発現を強くさせることにより、ヒスチジン合成前駆体PRPPの合成を増加し、ヒスチジン合成により多くの前駆体を提供する。
P32:GCTCTAGAAAAGGAGGATCCTCATGACTGCTCACTGG(XbaI)(配列番号52)
P33:TTGTCCTCCTTTTTAGGCCTCGCCCTCGAA(配列番号53)
P34:GGCGAGGCCTAAAAAGGAGGACAATCATGTTGAAAATCGCTG(配列番号54)
P35:TCCCCCGGGCTAGATGCGGGCGATGCGG(SmaI)(配列番号55)
P36:CAATTAATCATCGGCTCGTA(配列番号56)
P37:ACCGCTTCTGCGTTCTGATT(配列番号57)。
pgi遺伝子はホスホグルコイソメラーゼ(Pgi、配列番号14に示す)をコードする。以上に得たベース菌160を基に、pgi遺伝子(配列番号13)をノックアウトし、初級エンジニアリング菌CG161を得、CG161を基に、prsA遺伝子を過剰発現するとともにhisGfbr遺伝子を過剰発現し、pgi遺伝子をノックアウトしたエンジニアリング菌CG172を得る。
P38:CGCGGATCCGCTCTTTCGGAGTGACCT(BamHI)(配列番号58)
P39:TAAGCAAGCGAGAAAACTCCTTTATTGTCG(配列番号59)
P40:TAAAGGAGTTTTCTCGCTTGCTTATAGGGTC(配列番号60)
P41:CCGGAATTCTCGGGAAGCAGTTAGTGAAA(EcoRI)(配列番号61)
P42:TTGACGACGCAAGAGCCA(配列番号62)
P43:CACCATTACCGATGAGAAAC(配列番号63)。
zwf−opcA遺伝子はグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(Zwf−OpcA、配列番号3に示す、その5’末端から第1−514番目のアミノ酸はZwfサブユニットを構成し、第515−833番目のアミノ酸殘基はOpcAサブユニットを構成する)をコードする。pgi遺伝子のノックアウトとzwf−opcA遺伝子(配列番号2)の過剰発現の組み合わせ改変を実施し、高産量エンジニアリング菌CG171を得る。比較として、pgi遺伝子をノックアウトしていないがzwf−opcA遺伝子を過剰発現したエンジニアリング菌CG173を得る。
P45:GCTCTAGATTAGACGGTTTCCAGCTTG(XbaI)(配列番号65)
以上で得た高産量エンジニアリング菌CG171を基に、さらにAICARメチルトランスフェラーゼ/IMPシクロヒドロラーゼ(PurH、配列番号16に示す)をコードするpurH遺伝子を過剰発現して、ヒスチジン合成経路の強化のため多くなる副産物AICARをプリンヌクレオチド合成経路にガイドするために、組換えプラスミドpXMJ19−zwf−opcA−prsA−hisGfbr−purHを構築し、初級菌CG161に導入し、高産量エンジニアリング菌CG319を得る。
P46:TCCCCCGGGAAAGGAGGACCTTCATGAGCGATGATCGTAAG(SmaI)(配列番号66)
P47:CCGGAATTCTTAGTGAGCGAAGTGTCGCG(EcoR I)(配列番号67)
P48:GCTCTAGAAAAGGAGGACCATCATGAGCACAAACACGACCC(XbaI)(配列番号68)
P49:AGTCATGAGGATCCTCCTTTTTAGACGGTTTCCAGCTTG(配列番号69)
P50:TCAAGCTGGAAACCGTCTAAAAAGGAGGATCCTCATGACTGCTCACTG(配列番号70)
P51:TCCCCCGGGCTAGATGCGGGCGATGCGGATTTC(SmaI)(配列番号71)
P52:CAATTAATCATCGGCTCGTA(配列番号72)
P53:ACCGCTTCTGCGTTCTGATT(配列番号73)
以上に得たCG319を基に、リン酸リボースアミドトランスフェラーゼ(PurF、配列番号19)をコードするpurF遺伝子を弱化させ、ヒスチジン合成前駆体物質PRPPのヒスチジン合成経路への流入を増加させるために、初級エンジニアリング菌CG161でpurFのプロモーターをPhomに置換え、CG327を得てから、プラスミドpXMJ19−zwf−opcA−prsA−hisGfbr−purHを導入して、高産量エンジニアリング菌CG328を得る。
P54:CGCGGATCCTCCGCAGAAAGCACCTCA(BamHI)(配列番号74)
P55:TTTAGTTTTCAACGGCTAAAGTTTGACCACTGG(配列番号75)
P56:GTGGTCAAACTTTAGCCGTTGAAAACTAAAAAGC(配列番号76)
P57:TCCGGTCCTCCTTTTACTTTGTTTCGGCCACCC(配列番号77)
P58:GGCCGAAACAAAGTAAAAGGAGGACCGGAATGACCCAGGTAAACCAC(配列番号78)
P59:CCGGAATTCAACCTTTGCGGGTTGTCT(EcoRI)(配列番号79)
プラスミドを持つことはエンジニアリング菌の代謝負担を増加させるとともに、エンジニアリング菌の工業化の発酵制御と発酵製品の安全性に役立たない。そのため、本実施例では、プラスミドが持っている遺伝子を染色体で強く発現させて、プラスミドのないヒスチジンエンジニアリング菌を構築することにより、エンジニアリング菌の代謝負担を軽減して、発酵基質から産物への最大の転化を実現する。
P60:CCCAAGCTTTCCAGCAACCACCTGGAT(HindIII)(配列番号80)
P61:AATTGGCAGCTATTAGCCTTCCTGGTTGTG(配列番号81)
P62:CAGGAAGGCTAATAGCTGCCAATTATTCCG(配列番号82)
P63:TTGTCCTCCTTTGGGTAAAAAATCCTTTCG(配列番号83)
P64:GATTTTTTACCCAAAGGAGGACAACCATGACTGCTCACTGGAA(配列番号84)
P65:CGCGGATCCCGCCATTGGGGCATCGCC(BamHI)(配列番号85)
P66:CCCAAGCTTTCAACGATCACTGCCCAG(HindIII)(配列番号86)
P67:GGGTAACGGCCAGTGTGTCTTAGAAAATG(配列番号87)
P68:CTAAGACACACTGGCCGTTACCCTGCGAA(配列番号88)
P69:TTGTCCTCCTTTTGTATGTCCTCCTGGACT(配列番号89)
P70:GGAGGACATACAAAAGGAGGACAACCTTGACCACCTTGACGCTG(配列番号90)
P71:CGCGGATCCAAGCGATCTCAGTGTTGT(BamHI)(配列番号91)
P72:TGTGACCCGCTACCCGATAA(配列番号92)
P73:CGTTACCCTGCGAATGTC(配列番号93)
本実施例では、以上の実施例5を基に、強力なプロモーターPeftuでpurH遺伝子のプロモーターを置換えて、purHでコードする二元機能酵素AICARメチルトランスフェラーゼ/IMPシクロヒドロラーゼ(PurH、配列番号1配列番号16)の発現を向上させ、さらにCG352を構築し、そしてPhomプロモーターでpurF遺伝子プロモーターを置換え、ヌクレオチド合成経路の第一酵素であるリン酸リボースアミドトランスフェラーゼ(PurF、配列番号19)を弱化することにより、CG353を構築する。
P74:CTGGAGAGGCTAATGGCCGTTACCCTGCGAA(配列番号94)
P75:ATCATCGCTCATTGTATGTCCTCCTGGACT(配列番号95)
P76:GCTCTAGAATGATGGTTCCGAGGCCG(XbaI)(配列番号96)
P77:GGGTAACGGCCATTAGCCTCTCCAGTTGAG(配列番号97)
P78:GGAGGACATACAATGAGCGATGATCGTAAG(配列番号98)
P79:TCCCCCGGGTGGTGCCGATCCAACCTG(SmaI)(配列番号99)
CG353はさらにシークエンシング解析した結果、エンジニアリング菌CG352の染色体purF遺伝子プロモーターをPhomに置換え、CG353の構築に成功した。
1.プラスミドを含む高産量L−ヒスチジンの組換え菌の発酵
1、プラスミドを含む高産量L−ヒスチジンエンジニアリング菌の振盪発酵
振盪発酵に用いる発酵培地は具体的に次の通りである。グルコース40g/L、(NH4)2SO420g/L、KH2PO40.5g/L、K2HPO4・3H2O0.5g/L、MgSO4・7H2O0.25g/L、FeSO4・7H2O0.01g/L、MnSO4・H2O0.01g/L、ZnSO4・7H2Og/L0.001、CuSO40.0002g/L、NiCl2・6H2O0.00002g/L、ビオチン0.0002g/L、pH7.0−7.2、CaCO320g/Lである。グルコースは単独滅菌し、115℃で15分間高圧蒸気滅菌する。MgSO4・7H2Oおよび無機塩イオンは、単独滅菌し、121℃で20分間高圧蒸気滅菌する。ビタミンは0.22μmの無菌ろ過膜を採用してろ過除菌する。殘りの成分は121℃で20分間高圧蒸気滅菌する。
上述の実施例2で調製したエンジニアリング菌CG176、CG172、CG173とCG171をそれぞれ種培地に接種し、発酵液種の培養条件は培養温度32°Cで、振盪速度は220r/min、培養時間8hで、発酵液種を得、OD600は20である。
発酵液種を体積含有率が3%で最終濃度が10μg/mlであるクロロマイセチンを含む発酵培地(500mLバッフル付三角フラスコ液量は30mL)に接種し、32℃で、220r/min、72hで培養し、発酵培養6h時に最終濃度が1mmol/Lであるイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(IPTG)を加入して目的遺伝子の誘導発現を行う。濃アンモニア水を間欠的に追加して発酵液のpHは7.0〜7.2の間に制御し、残存糖の状況に応じて、濃度400g/Lのグルコース母液を追加し、発酵液において残存糖を5〜10g/Lに制御する。
高速液体クロマトグラフィーを採用して、具体的な方法は次の通りである(2,4−ジニトロフルオロベンゼンによるプレカラム誘導体化高速液体クロマトグラフィー)。上記上澄み液50μLを2mL遠心管に取り、200μLNaHCO3水溶液(0.5mol/L、pH9.0)と100μL1%の2、4ジニトロフルオロベンゼン−アセトニトリル溶液(体積比)を加入し、60℃水浴に陰で60min恒温加熱し、そして25℃まで冷却し、650μLKH2PO4水溶液(0.01mol/L、pH7.2±0.05、NaOH水溶液でpHを調整)を加入し、15min放置して、ろ過後に注射することができ、注射量は15μLである。
種培地は具体的には次の通りである。グルコース20g/L、硫酸アンモニウム5 g/L、K2HPO4・3H2O1g/L、MgSO4・7H2O 0.9g/L、ビオチン50gμ、ビタミンB11mg、エンジェル・イースト酵母粉(FM802)2g/L、エンジェル・イーストペプトン(FP318)2g/Lである。
エンジニアリング菌CG171、CG319とCG328を種培地中に接種し、発酵液種の培養条件は培養温度32°Cで、振盪速度は220r/min、培養時間8時間で、発酵液種を得、OD600は20である。
発酵液種を体積含有率が10%で、最終濃度が10μg/mlのクロロマイセチンを含む発酵培地に接種した。
上記1の3)の方法により、上澄み液中のL−ヒスチジン含有量を測定し、結果は下記の表の通りである。エンジニアリング菌CG171のL−ヒスチジンの最高の生産量は10.87g/Lで、生産能力は0.21g/L/hで、エンジニアリング菌CG319のL−ヒスチジン最高の生産量は14.15g/Lで、生産能力は0.30g/L/hで、エンジニアリング菌CG328のL−ヒスチジン最高の生産量は15.96g/Lで、生産能力は0.32g/L/hである。結果は下記の表3に示す。
発酵過程中でクロロマイセチンと誘導剤IPTGを加入する必要がない。その他に、エンジニアリング菌CG350、CG351、CG352とCG353の培養液種の取得や振盪発酵方法は上記の一の記載と同じである。L−ヒスチジン含有量の測定は本実施例の第一項の記載と同じである。野生型菌株C.glutamicumATCC13032を対照にする。
Claims (24)
- 産L−アミノ酸の組換え菌であって、前記組換え菌は出発菌株に比べて、低下のグルコース−6−リン酸イソメラーゼPgiの発現と上昇のグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼZwf−OpcAの発現を有し、前記出発菌株が目的アミノ酸を蓄積できる菌株であり、前記目的アミノ酸はL−ヒスチジンであり、
原始菌株に比べてその出発菌株は強化されたL−ヒスチジン合成オペロンhisEG遺伝子とhisDCB遺伝子の発現を有することを特徴とする組換え菌。 - 組換え菌の染色体上のpgi遺伝子は既に失活しまたはノックアウトされる、あるいはpgi遺伝子の調節因子が既に低転写または低発現活性の調節因子に置き換えられるとともに、前記組換え菌には2つ以上のコピーのzwf−opcA遺伝子があり、または強力なプロモーターで前記出発菌株染色体上のtkt−tal−zwf−opcA−devBオペロンのプロモーターを置換えたものであることを特徴とする請求項1に記載の組換え菌。
- 前記強力なプロモーターは原始菌株のPeftuプロモーターであることを特徴とする請求項2に記載の組換え菌。
- 強力なプロモーターで前記のhisEG遺伝子とhisDCB遺伝子のプロモーターを置換え、
前記原始菌株染色体上のPglyAプロモーターで、それぞれhisEG遺伝子とhisDCB遺伝子のプロモーターを置換えたものであることを特徴とする請求項1に記載の組換え菌。 - 原始菌株に比べて前記出発菌株は強化されたPRPP合成酵素PrsAの発現を有し、前記出発菌株には2つ以上のコピーのprsA遺伝子があり、あるいは強力なプロモーターでprsA遺伝子プロモーターを置換えたものであることを特徴とする請求項4に記載の組換え菌。
- 前記強力なプロモーターは前記原始菌株のPsodプロモーターであることを特徴とする請求項5に記載の組換え菌。
- 前記出発菌株に比べて前記組換え菌は強化されたAICARメチルトランスフェラーゼ/IMPシクロヒドロラーゼPurHの発現を有し、
前記組換え菌には2つ以上のコピーのpurH遺伝子があり、あるいは強力なプロモーターでpurH遺伝子のプロモーターを置換えたものであることを特徴とする請求項1に記載の組換え菌。 - 前記強力なプロモーターは前記原始菌株のPeftuプロモーターであることを特徴とする請求項7に記載の組換え菌。
- 前記出発菌株に比べて前記組換え菌は弱化されたリン酸リボースアミドトランスフェラーゼpurFの発現を有し、
弱いプロモーターでpurF遺伝子のプロモーターを置換え、前記弱いプロモーターは前記原始菌株のPhomプロモーターであることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の組換え菌。 - 前記原始菌株はコリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属のうちから選ばれる1株の細菌であり、
前記コリネバクテリウム属の細菌はコリネバクテリウム・グルタミクムCorynebacterium glutamicum、コリネバクテリウム・北京Corynebacterium pekinense、コリネバクテリウム・エフィシエンスCorynebacterium efficiens、コリネバクテリウム・クレナツムCorynebacterium crenatum、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスCorynebacterium thermoaminogenes、コリネバクテリウム・アミノゼンCorynebacterium aminogenes、コリネバクテリウム・リリウムCorynebacterium lilium、コリネバクテリウム・カルーナCorynebacterium callunaeおよびコリネバクテリウム・ハーキュリスCorynebacterium herculisのうちから選ばれる1株の細菌であり、
前記ミクロバクテリウム属の細菌はミクロバクテリウム・アンモニアフィラムMicrobacterium ammoniaphilumのうちから選ばれる1株の細菌であり、および、
前記ブレビバクテリウム属の細菌はブレビバクテリウム・フラバムBrevibacteriaceae flvum、Brevibacteriaceae lactofermentumブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびブレビバクテリウム・アンモニアゲネスBrevibacteriaceae ammoniagenesのうちから選ばれる1株の細菌であることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項に記載の組換え菌。 - 前記原始菌株は野生型コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032であることを特徴とする請求項10に記載の組換え菌。
- 前記出発菌株の染色体は前記コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032染色体上それぞれのL−ヒスチジン合成オペロンhisEGとhisDCBのプロモーターが、配列番号7の5’末端から第863−1038番目のヌクレオチド配列に示すP glyA プロモーターで置き換えられており、
前記出発菌株が突然変異したATP−ホスホリボシルトランスフェラーゼを発現することができ、前記突然変異したATP−ホスホリボシルトランスフェラーゼは配列番号6に示すATP−ホスホリボシルトランスフェラーゼの第215番目のアスパラギンがリジンに突然変異し、第231番目のロイシンがフェニルアラニンに突然変異し、および第235番目のトレオニンがアラニンに突然変異した酵素であり、前記出発菌株の染色体は前記コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032染色体上のhisG遺伝子が、配列番号4の第1007−1852番目のヌクレオチド配列に示すhisG fbr 遺伝子で置き換えられていることを特徴とする請求項11に記載の組換え菌。 - 前記出発菌株の染色体は前記コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032染色体上のprsA遺伝子のプロモーターが、配列番号11の5’末端から第656−847番目のヌクレオチド配列に示すP sod プロモーターで置き換えられており、または、
前記出発菌株は2つ以上のコピーのprsA遺伝子とhisGfbr遺伝子を有し、
前記prsA遺伝子は、配列番号5に示すPrsAをコードする遺伝子、または配列番号4に示す第15−992番目のヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項12に記載の組換え菌。 - 前記pgi遺伝子は、配列表に配列番号14に示すPgiをコードする遺伝子または配列番号13に示すヌクレオチド配列であり、
前記zwf−opcA遺伝子は、配列表に配列番号3に示すZwf−OpcAをコードする遺伝子または配列番号2に示すヌクレオチド配列であり、
前記Peftuプロモーターは配列番号12に示す5’末端から第635−834番目のヌクレオチド配列であり、
前記purH遺伝子は、配列表に配列番号16に示すpurHをコードする遺伝子または配列表に配列番号15に示すヌクレオチド配列であり、
前記Phomプロモーターは配列番号18に示す5’末端から第736−865番目のヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項1、7、8または9に記載の組換え菌。 - 産L−アミノ酸の組換え菌を構築する方法であって、出発菌株のグルコース−6−リン酸イソメラーゼPgiの発現を低下させ、かつ前記出発菌株のグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼZwf−OpcAの発現を向上させて、前記組換え菌を得るステップを含み、
前記出発菌株は目的アミノ酸を蓄積できる菌株であり、前記目的アミノ酸はL−ヒスチジンであり、
前記出発菌株を得ることは、原始菌株染色体上のL−ヒスチジン合成オペロンhisEGとhisDCBのプロモーターをそれぞれ強力なプロモーターに置き換えるステップを含み、前記強力なプロモーターが前記原始菌株染色体上のP glyA プロモーターであることを特徴とする方法。 - 前記出発菌株のPgi発現を低下させることは次の方式A)またはB)により実現し、
A)前記出発菌株染色体のpgi遺伝子を失活し、前記失活はノックアウトであること、
B)前記出発菌株のpgi遺伝子の調節因子を低転写あるいは低発現活性の調節因子に置き換えること、
前記出発菌株のZwf−OpcAの発現を向上させることは次の方式C)またはD)により実現し、
C)前記出発菌株のzwf−opcA遺伝子のコピー数を増加すること、
D)前記出発菌株染色体上のtkt−tal−zwf−opcA−devBオペロンのプロモーターを強力なプロモーターに置換え、前記強力なプロモーターが前記原始菌株染色体上のPeftuプロモーターであることを特徴とする請求項15に記載の方法。 - 前記出発菌株を得ることは、前記出発菌株のPRPP合成酵素PrsAの発現を向上させるステップをさらに含み、
前記出発菌株のPrsAの発現を向上させることは次の方式E)またはF)により実現し、
E)前記出発菌株のprsA遺伝子のコピー数を増加すること、
F)前記出発菌株染色体上のprsA遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換え、前記強力なプロモーターが前記原始菌株染色体上のPsodプロモーターであることを特徴とする請求項16に記載の方法。 - 前記方法は、前記組換え菌のAICARメチルトランスフェラーゼ/IMPシクロヒドロラーゼPurHの発現を向上させるステップをさらに含み、
前記組換え菌のPurHの発現を向上させることが次の方式G)またはH)により実現し、
G)前記出発菌株のpurH遺伝子のコピー数を増加すること、
H)前記出発菌株染色体上のpurH遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換え、前記強力なプロモーターが前記原始菌株染色体上のPeftuプロモーターであることを特徴とする請求項17に記載の方法。 - 前記方法は前記組換え菌のリン酸リボースアミドトランスフェラーゼPurFの発現を弱くさせるステップをさらに含み、
前記組換え菌のPurFの発現を弱くさせることは、弱いプロモーターでpurF遺伝子のプロモーターを置き換えることにより実現し、前記出発菌株染色体上のpurF遺伝子のプロモーターを前記原始菌株染色体上のPhomプロモーターに置き換えることを特徴とする請求項17または18に記載の方法。 - 前記出発菌株を得るための原始菌株はコリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属のうちから選ばれる1株の細菌であり、
前記コリネバクテリウム属の細菌はコリネバクテリウム・グルタミクムCorynebacterium glutamicum、コリネバクテリウム・北京Corynebacterium pekinense、コリネバクテリウム・エフィシエンスCorynebacterium efficiens、コリネバクテリウム・クレナツムCorynebacterium crenatum、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスCorynebacterium thermoaminogenes、コリネバクテリウム・アミノゼンCorynebacterium aminogenes、コリネバクテリウム・リリウムCorynebacterium lilium、コリネバクテリウム・カルーナCorynebacterium callunaeおよびコリネバクテリウム・ハーキュリスCorynebacterium herculisのうちから選ばれる1株の細菌であり、
前記ミクロバクテリウム属の細菌はミクロバクテリウム・アンモニアフィラムMicrobacterium ammoniaphilumのうちから選ばれる1株の細菌であり、および、
前記ブレビバクテリウム属の細菌はブレビバクテリウム・フラバムBrevibacteriaceae flvum、Brevibacteriaceae lactofermentumブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびブレビバクテリウム・アンモニアゲネスBrevibacteriaceae ammoniagenesのうちから選ばれる1株の細菌であることを特徴とする請求項15〜19のいずれか1項に記載の方法。 - 前記原始菌株は野生型コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032であることを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 前記出発菌株を得ることは、
前記コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032染色体上のL−ヒスチジン合成オペロンhisEGとhisDCBのプロモーターをそれぞれ配列番号7の5’末端から第863−1038番目のヌクレオチド配列に示すPglyAプロモーターに置換え、および、
前記コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032が発現した配列番号6に示すATP−ホスホリボシルトランスフェラーゼの第215番目のアスパラギンをリジンに突然変異し、第231番目のロイシンをフェニルアラニンに突然変異し、および第235番目のトレオニンをアラニンに突然変異し、上記突然変異を行うための遺伝子は配列番号4の第1007−1852番目のヌクレオチド配列に示すhisGfbr遺伝子であるステップを含むことを特徴とする請求項21に記載の方法。 - 前記出発菌株を得ることは、
前記コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032染色体上のprsA遺伝子のプロモーターを配列番号11の5’末端から第656−847番目のヌクレオチド配列に示すPsodプロモーターに置き換えるステップをさらに含み、または、
前記コリネバクテリウム・グルタミクムAATCC13032のprsA遺伝子のコピー数を増加し、および
前記コリネバクテリウム・グルタミクムAATCC13032のhisGfbr遺伝子のコピー数を増加するステップをさらに含み、
前記prsA遺伝子は、配列番号5に示すPrsAをコードする遺伝子または配列番号4に示す第15−992番目のヌクレオチドであることを特徴とする請求項22に記載の方法。 - 前記pgi遺伝子は、配列表に配列番号14に示すPgiをコードする遺伝子または配列番号13に示すヌクレオチド配列であり、
前記zwf−opcA遺伝子は、配列表に配列番号3に示すZwf−OpcAをコードする遺伝子または配列番号2に示すヌクレオチド配列であり、
前記Peftuプロモーターは配列番号12に示す5’末端から第635−834番目のヌクレオチド配列であり、
前記purH遺伝子は、配列表に配列番号16に示すpurHをコードする遺伝子または配列番号15に示すヌクレオチド配列であり、
前記Phomプロモーターは配列番号18に示す5’末端から第736−865番目のヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項23に記載の方法。
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