CN101484809B - 用于测定糖化血红蛋白百分比的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供在不需要单独测量血液样品中总血红蛋白含量的条件下,直接确定血液样品中总糖化血红蛋白百分比的方法。所述方法使用一种或两种不同类型的氧化剂,所述氧化剂选择性氧化血液样品中的低分子量还原物质和高分子量(主要是血红蛋白)还原物质,伴随由蛋白酶、果糖基氨基酸氧化酶、和过氧化物酶催化的酶促反应。本发明提供用于实施本发明方法的试剂盒。
Description
相关申请的交叉参考
本发明要求于2006年7月25日提交的美国临时申请系列号60/833,390和于2006年11月13日提交的美国临时申请系列号60/858,809的优先权权益,将其全部内容引入本文作为参考。
有关联邦政府资助的研究或开发的声明
不适用。
发明领域
发明提供用于确定血液样品中糖化血红蛋白百分比的直接酶促测定。
发明背景
糖化蛋白质是由构成蛋白质的氨基酸的氨基和还原糖,诸如醛糖的醛基的非-酶促和不可逆结合产生的物质。参见,例如,美国专利号6,127,138。这样的非-酶促和不可逆结合反应也叫做“阿马道里重排”,且因此上述糖化蛋白质在一些情形中也可以叫做“阿马道里化合物”。
蛋白质的非酶促糖化已经参与在某些疾病,例如糖尿病并发症和衰老过程中(Takahashi等,生物的化学杂志(J.Biol.Chem.),272(19):12505-7(1997);和Baynes和Monnier,临床生物学研究进展(Prog.Clin.Biol.Res.),304:1-410(1989))。该反应通过形成糖加合物和交联,导致靶分子的功能异常。相当多的兴趣集中于阿马道里产物,即在体外和体内非酶促糖化过程中最重要的“早期”修饰。
已知多种关于糖化蛋白质的测定。例如,美国专利号6,127,138公开了用蛋白酶XIV或来自曲霉属(Aspergillus genus)的蛋白酶处理包含糖化蛋白质的样品,其后(或在用上述蛋白酶处理样品的同时)引起FAOD(果糖基(fructosyl)氨基酸氧化酶)与该样品反应,从而测量由FAOD反应消耗的氧量或由此生成的反应产物量,由此测量糖化蛋白质。
在另一个实例中,美国专利号6,008,006公开了样品中糖化蛋白质的量能够通过使该样品首先与试剂,即蛋白酶和过氧化物酶组合物反应,并其次与酮胺氧化酶反应而得到量化。美国专利号6,008,006还公开了包含组合的过氧化物酶/蛋白酶酶试剂和还有酮胺氧化酶的试剂盒。美国公开号2005/0014935还公开了利用嵌合阿马道里酶(amadoriase)测量糖化蛋白质的量的方法。美国公开号2003/0162242和EP 1304385A1还公开了选择性确定糖化血红蛋白的方法。
先前描述的用于确定糖化血红蛋白Alc百分比的方法需要单独测量样品中的总血红蛋白。当使用化学分析器来确定糖化血红蛋白Alc百分比数值时,需要双通道形式。在该形式中,进行了两个分别的测定,从而确定样品中1)糖化血红蛋白Alc的浓度,和2)总血红蛋白浓度;并且随后计算糖化HbAlc与总血红蛋白的比,从而获得HbAlc的百分比。
将本文引用的所有专利、专利申请、和出版物作为整体引入本文作为参考。
发明概述
本发明提供在不需要单独测量血液样品中总血红蛋白的条件下,直接确定该样品中糖化血红蛋白百分比的方法。由于不需要单独测量总血红蛋白且不需要比率计算步骤,所以本方法能够是全自动化的,并能够与处于单通道形式的不同化学分析器一起使用。
在一个方面,本发明提供在不以单独的过程测量血液样品中总血红蛋白的条件下,直接测定该血液样品中总糖化血红蛋白百分比或糖化血红蛋白Alc百分比的方法,所述方法包括:a)使包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白质片段与果糖基氨基酸氧化酶相接触,从而产生过氧化氢(H2O2),其中所述蛋白质片段是通过使所述血液样品与下列各项相接触而产生的:1)从血液样品中的红细胞中释放血红蛋白的溶解缓冲剂;2)选择性氧化低分子量还原物质的第一氧化剂;3)选择性氧化高分子量还原物质的第二氧化剂,和4)将糖化血红蛋白消化为糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶;b)在过氧化物酶存在下,使在步骤a)中产生的H2O2与颜色形成物质相接触,从而产生可测量的信号;和c)在不单独测量所述血液样品中总血红蛋白的条件下,通过将步骤b)中产生的信号应用于校准曲线来确定所述样品中总糖化血红蛋白的百分比或糖化血红蛋白Alc的百分比。
在一些实施方案中,所述第一氧化剂是戴斯-马丁氧化剂(Dess-Martinperiodinane)或N-乙基马来酰亚胺,且其中所述第二氧化剂是四唑鎓盐。
在一些实施方案中,所述溶解缓冲剂含有所述第一氧化剂和/或所述第二氧化剂。在一些实施方案中,所述溶解缓冲剂含有所述第一氧化剂、所述第二氧化剂、和所述蛋白酶。在一些实施方案中,所述溶解缓冲剂含有所述蛋白酶。
在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述第一氧化剂和所述第二氧化剂。在一些实施方案中,在分别的组合物中配制所述第一氧化剂和所述第二氧化剂。在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述蛋白酶和所述第一氧化剂或所述第二氧化剂。在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述第一氧化剂、所述第二氧化剂、和所述蛋白酶。在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述果糖基氨基酸氧化酶、所述过氧化物酶、和所述颜色形成物质。
在另一方面,本发明提供在不以单独的过程测量血液样品中总血红蛋白的条件下,直接测定该血液样品中总糖化血红蛋白百分比或糖化血红蛋白Alc百分比的方法,所述方法包括:a)使包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白质片段与果糖基氨基酸氧化酶相接触,从而产生过氧化氢(H2O2),其中所述蛋白质片段是通过使所述血液样品与下列各项相接触而产生的:1)从血液样品中的红细胞中释放血红蛋白的溶解缓冲剂;2)氧化剂,即四唑鎓盐,和3)将糖化血红蛋白消化为糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶;b)在过氧化物酶存在下,使在步骤a)中产生的H2O2与颜色形成物质相接触,从而产生可测量的信号;和c)在不单独测量所述血液样品中总血红蛋白的条件下,通过将步骤b)中产生的信号应用于校准曲线来确定所述样品中总糖化血红蛋白的百分比或糖化血红蛋白Alc的百分比。
在一些实施方案中,所述溶解缓冲剂包含所述氧化剂。在一些实施方案中,所述溶解缓冲剂包含所蛋白酶。在一些实施方案中,在单一组合物中配制所氧化剂和所述蛋白酶。
在一些实施方案中,四唑鎓盐是2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓单钠盐或2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓单钠盐。
在一些实施方案中,所述颜色形成物质是N-羧甲基氨基羰基-4,4'-双(二甲氨基)-二苯胺钠盐(DA-64)、N,N,N'N',N",N"-六(3-磺基丙基)-4,4',4",-三氨基-三苯甲烷六钠盐(TPM-PS)、或10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-吩噻嗪钠盐(DA-67)。
在一些实施方案中,所述血液样品是全血或收集的血细胞。
在一些实施方案中,所述蛋白酶是内-型蛋白酶或外-型蛋白酶。在一些实施方案中,所述蛋白酶是选自由下列各项组成的组:蛋白酶K、链霉蛋白酶E、ananine、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和牛胰蛋白酶。在一些实施方案中,所述蛋白酶是曲霉属或杆菌属(Bacillus)来源的中性蛋白酶。在一些实施方案中,所述蛋白酶产生约2-约30个氨基酸残基的糖化肽。在一些实施方案中,所述蛋白酶产生糖化甘氨酸、糖化缬氨酸或糖化赖氨酸残基、或包括糖化甘氨酸、糖化缬氨酸或糖化赖氨酸残基的糖化肽。
在一些实施方案中,所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
在一些实施方案中,所述包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白质片段依次或同时与果糖基氨基酸氧化酶和过氧化物酶接触。
在一些实施方案中,所述在一些实施方案中,所述果糖基氨基酸氧化酶包括SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列:
(MGGSGDDDDLALAVTKSSSLLIVGAGTWGTSTALHLARRGYTNVTVLDPYPVPSAI
SAGNDVNKVISSGQYSNNKDEIEVNEILAEEAFNGWKNDPLFKPYYHDTGLLMSACS
QEGLDRLGVRVRPGEDPNLVELTRPEQFRKLAPEGVLQGDFPGWKGYFARSGAGW
AHARNALVAAAREAQRMGVKFVTGTPQGRVVTLIFENNDVKGAVTGDGKIWRAER
TFLCAGASAGQFLDFKNQLRPTAWTLVHLALKPEERALYKNIPVFNIERGFFFEPDEE
RGEIKICDEHPGYTNMVQSADGTMMSIPFEKTQIPKEAETRVRALLKETMPQLADRP
FSFARICWCADTANREFLIDRHPQYHSLVLGCGASGRGFKYLPSIGNLIVDAMEGKVP
QKIHELIKWNPDIAANRNWRDTLGRFGGPNRVMDFHDVKEWTNVQYRDISKLKGEL
EGLPIPNPLLRTGHHHHHH)。
在一些实施方案中,本方法用于疾病或病症的预后或治疗。在一些实施方案中,所述疾病或病症是糖尿病。
在另一方面,本发明提供在不需要单独测量血液样品中总血红蛋白含量的条件下,直接测定血液样品中总糖化血红蛋白百分比或糖化血红蛋白Alc百分比的试剂盒,所述试剂盒包括:a)溶解血细胞从而释放血红蛋白的溶解缓冲剂;b)选择性氧化低分子量还原物质的第一氧化剂;c)选择性氧化高分子量还原物质的第二氧化剂;d)将血红蛋白水解为包括糖化肽或糖化氨基酸的蛋白质片段的蛋白酶;e)与糖化肽和糖化氨基酸反应从而产生过氧化氢(H2O2)的果糖基氨基酸氧化酶;f)过氧化物酶和颜色形成物质;和g)具有已知糖化血红蛋白百分比或已知糖化血红蛋白Alc百分比、用于构建校准曲线的校准物。所述试剂盒还可以包括实施本文所述方法的操作指南。
在一些实施方案中,所述第一氧化剂和/或所第二氧化剂包含在溶解缓冲剂中。在一些实施方案中,所述第一氧化剂和/或所述第二氧化剂与所述蛋白酶包含在同一缓冲剂中。
在另一方面,本发明提供在不需要单独测量血液样品中总血红蛋白含量的条件下,直接测定血液样品中总糖化血红蛋白百分比或糖化血红蛋白Alc百分比的试剂盒,所述试剂盒包括:a)溶解血细胞从而释放血红蛋白的溶解缓冲剂;b)氧化剂,其中所述氧化剂是四唑鎓盐;c)将血红蛋白水解为包括糖化肽或糖化氨基酸的蛋白质片段的蛋白酶;d)与糖化肽和糖化氨基酸反应从而产生过氧化氢(H2O2)的果糖基氨基酸氧化酶;e)过氧化物酶和颜色形成物质;和f)具有已知糖化血红蛋白百分比或已知糖化血红蛋白Alc百分比、用于构建校准曲线的校准物。所述试剂盒还可以包括实施本文所述方法的操作指南。
在一些实施方案中,所述氧化剂包含在所述溶解缓冲剂中。在一些实施方案中,所述蛋白酶包含在所述溶解缓冲剂中。在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述氧化剂和所述蛋白酶。
附图简述
图1显示单通道HbAlc酶促测定程序的时间线。
图2显示酶HbAlc测定的校准曲线。X-轴显示对校准样品已知的糖化血红蛋白Alc百分比;和Y-轴显示加入试剂Rla和Rlb后8分钟和5分钟之间,在700nm处吸收数值的相应差别。
图3显示实施例1中所述的单通道酶促血红蛋白Alc测定和TosohHPLC方法之间的相关性。Y轴显示利用实施例1中所述的单通道酶促血红蛋白Alc测定对样品测量的HbAlc值;和X-轴显示利用Tosoh HPLC方法对相应样品测量的HbAlc值。
图4显示利用实施例2中所述的一种氧化剂进行酶促HbAlc测定的校准曲线。X-轴显示对校准样品已知的糖化血红蛋白百分比;和Y-轴显示加入试剂Rla和Rlb后8分钟和5分钟之间,在700nm处吸收数值的相应差别。
发明详述
本发明提供在不需要单独测量血液样品中总血红蛋白含量的条件下,直接确定血液样品中糖化血红蛋白百分比的酶方法。在一个方面中,本方法使用两种不同类型的氧化剂,所述氧化剂选择性氧化血液样品中的低分子量还原物质(主要是抗坏血酸和游离的含硫的分子)和高分子量还原物质(主要是血红蛋白),伴随由蛋白酶、果糖基氨基酸氧化酶、和过氧化物酶催化的酶反应。在另一方面,本方法使用一种类型的氧化剂,所述氧化剂选择性氧化血液样品中的高分子量还原物质,伴随由蛋白酶、果糖基氨基酸氧化酶、和过氧化物酶催化的酶反应。本发明还提供用于实施本发明方法的试剂盒。
A.定义
除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中普通技术人员的通常理解相同的含义。将本文提及的所有专利、申请、公布的申请和其他出版物作为整体引入本文作为参考。如果本部分中提出的定义与作为参考引入本文中的专利、申请、公布的申请和其他出版物中提出的定义相反或不一致,则本部分中提出的定义优于作为参考引入本文中的定义。
当用于本文时,“一个”("a"或"an")意指“至少一个”或“一个或多个”。
当用于本文时,"果糖基氨基酸氧化酶"或(FAOD)指催化阿马道里产物的氧化去糖化以产生相应的氨基酸、葡糖醛酮、和H2O2的酶,如下列反应中所示:
R1-CO-CH2-NH-R2+O2+H2O—>R1-CO-CHO+R2-NH2+H2O2
其中R1表示还原糖的醛糖残基,和R2表示氨基酸、蛋白质或肽残基。阿马道里酶的其他同义词包括阿马道里酶、果糖基胺:氧氧化还原酶(FAOO)、和果糖基缬氨酸氧化酶(FVO)。为了本文的目的,尽管考虑了所有这样的化学同义词,但是在本文中使用了名称“果糖基氨基酸氧化酶”。“果糖基氨基酸氧化酶”还包括仍基本保持其酶活性的功能性片段或衍生物,所述酶活性催化阿马道里产物的氧化去糖化产生相应的氨基酸、葡糖醛酮、和H2O2。典型地,功能性片段或衍生物保持至少50%的它的阿马道里酶活性。优选地,功能性片段或衍生物保持至少60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的它的阿马道里酶活性。还预期了果糖基氨基酸氧化酶能够包括基本不改变其活性的保守氨基酸取代。合适的保守氨基酸取代是本领域技术人员已知的,并且可以在通常不改变由此生成的分子的生物学活性的条件下进行。本领域技术人员承认,通常多肽中非关键区域中的单氨基酸取代基本不改变生物学活性(见,例如Watson,等,基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene),第4版,1987,TheBenjamin/Cummings出版公司,第224页)。这样的示范性取代优选地是按照如下表1中所示的那些进行的:
表1
原始残基 保守取代
Ala(A) Gly;Ser
Arg(R) Lys
Asn(N) Gln;His
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala;Pro
His(H) Asn;Gln
Ile(I) Leu;Val
Leu(L) Ile;Val
Lys(K) Arg;Gln;Glu
Met(M) Leu;Tyr;Ile
Phe(F) Met;Leu;Tyr
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe
Val(V) Ile;Leu
其他取代也是允许的,并且可以以经验或按照已知保守取代来确定其他取代。
当用于本文时,"过氧化物酶"指催化许多这样的反应的酶,在所述反应中,过氧化氢是特异性氧化剂,且广泛范围的物质起电子供体的作用。其意欲包括具有基本不改变其活性的保守氨基酸取代的过氧化物酶。主要的可商购过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
当用于本文时,"组合物"指两种或多种产物或化合物的任意混合。它可以是溶液、混悬液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性、或它们的任意组合。
B.直接测定糖化血红蛋白百分比的方法
在一个方面中,本发明提供在不以单独的过程测量血液样品中总血红蛋白的条件下,直接测定血液样品中总糖化血红蛋白百分比或糖化血红蛋白Alc百分比的方法,所述方法包括:a)使包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白质片段与果糖基氨基酸氧化酶相接触,从而产生过氧化氢(H2O2),其中所述蛋白质片段是通过使所述血液样品与下列各项相接触而产生的:1)从血液样品中的红细胞中释放血红蛋白的溶解缓冲剂;2)选择性氧化低分子量还原物质的第一氧化剂;3)选择性氧化高分子量还原物质的第二氧化剂,和4)将糖化血红蛋白消化为糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶;b)在过氧化物酶存在下,使在步骤a)中产生的H2O2与颜色形成物质相接触,从而产生可测量的信号;和c)在不单独测量所述血液样品中总血红蛋白的条件下,通过将步骤b)中产生的信号应用于校准曲线来确定所述样品中总糖化血红蛋白的百分比或糖化血红蛋白Alc的百分比。
在另一方面,本发明涉及用于直接测定总糖化血红蛋白百分比或糖化血红蛋白Alc百分比的方法,所述方法包括:a)用溶解缓冲剂溶解血液样品中的红细胞,从而释放血红蛋白;b)用第一氧化剂氧化溶解产物,所述第一氧化剂选择性氧化低分子量还原物质;c)用第二氧化剂氧化溶解产物,所述第二氧化剂选择性氧化高分子量还原物质;d)使所述溶解产物与蛋白酶相接触,从而形成包含糖化肽和/或糖化氨基酸的蛋白质片段;e)使所述蛋白质片段与果糖基氨基酸氧化酶相接触,从而产生过氧化氢(H2O2);f)容许通过在Trinder反应下,在过氧化物酶存在下,步骤e)中生成的H2O2,和通过未反应的第二氧化剂氧化颜色形成物质,从而产生可测量的信号;和g)评估步骤f)中生成的信号;和h)在不单独测量所述血液样品中总血红蛋白的条件下,通过将所述信号与校准曲线进行比较,确定该样品中的总糖化血红蛋白的百分比或糖化血红蛋白Alc的百分比。
在另一方面,本发明提供在不单独测定血液样品中总血红蛋白的条件下,直接测定总糖化血红蛋白百分比或糖化血红蛋白Alc百分比的方法,所述方法包括:a)用溶解缓冲剂溶解血液培养中的红细胞,从而释放血红蛋白;b)用第一氧化剂氧化溶解产物,其中所述第一氧化剂是戴斯-马丁氧化剂和/或N-乙基马来酰亚胺;c)用第二氧化剂氧化溶解产物,其中所述第二氧化剂是四唑鎓盐;d)使溶解产物与蛋白酶相接触,从而形成包含糖化肽和/或糖化氨基酸的蛋白质片段;e)使所述蛋白质片段与果糖基氨基酸氧化酶相接触,从而产生过氧化氢(H2O2);f)容许通过在Trinder反应下,在过氧化物酶存在下,步骤e)中生成的H2O2氧化颜色形成物质,从而产生可测量的信号;和g)评估步骤f)中生成的信号;和h)在不单独测量所述血液样品中总血红蛋白的条件下,通过将所述信号与校准曲线进行比较,确定在该样品中总糖化血红蛋白的百分比或糖化血红蛋白Alc的百分比。
所述血液样品可以被所述第一氧化剂溶解、氧化,被所述第二氧化剂氧化,且所述溶解产物被所述蛋白酶同时或通过单独的步骤裂解。可以同时进行两个或更多步骤的任意组合。在一些实施方案中,包括下列各项的步骤同时进行:溶解样品中红细胞和通过第一氧化剂氧化,溶解红细胞和由第二氧化剂氧化,用第一氧化剂和第二氧化剂氧化,或溶解红细胞和用第一氧化剂和第二氧化剂氧化。在一些实施方案中,同时进行包括下列各项的步骤:溶解红细胞和由蛋白酶裂解溶解产物,用第一氧化剂氧化和由蛋白酶裂解溶解产物,用第二氧化剂氧化和由蛋白酶裂解溶解产物,或用第一氧化剂和第二氧化剂氧化和由蛋白酶裂解溶解产物。在一些实施方案中,同时进行包括溶解红细胞,用第一氧化剂和第二氧化剂氧化,和裂解溶解产物的步骤。在一些实施方案中,所述第一氧化剂和/或所述第二氧化剂包含在溶解缓冲剂中,或与加入所述溶解缓冲剂同时被加入到血液样品中。在一些实施方案中,所述蛋白酶也包含在具有第一和第二氧化剂的溶解缓冲剂中,或与加入溶解缓冲剂和第一和第二氧化剂的同时被加入到血液样品中。在一些实施方案中,所述第一和/或所述第二氧化剂在被加入到红细胞溶解产物中之前,与蛋白酶溶液处于同一溶液中。在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述第一氧化剂和溶解缓冲剂。在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述蛋白酶和所述第一氧化剂或所述第二氧化剂。在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述第一和所述第二氧化剂。在一些实施方案中,在分别的组合物中配制所述第一和所述第二氧化剂。在一些实施方案中,所述溶解缓冲剂含有蛋白酶,或所述蛋白酶在加入溶解缓冲剂的同时被加入到血液样品中。
所述第一氧化剂这样的氧化剂类型,其选择性氧化低分子量(M.W.<3000)还原物质。所述第一氧化剂针对低分子量还原物质具有比针对高分子量(M.W.>3000)还原物质更高的氧化能力。血液样品中低分子量物质的实例是抗坏血酸和游离的含硫的分子。第一氧化剂的实例是戴斯-马丁氧化剂和N-乙基马来酰亚胺。第一氧化剂的其他实例是碘乙酸钠、高碘酸钠、和氯胺-T。在一些实施方案中,使用多于一种的第一氧化剂(例如,戴斯-马丁氧化剂和N-乙基马来酰亚胺二者)。
所述第二氧化剂这样的氧化剂类型,其选择性氧化高分子量(M.W.>3000)还原物质。所述第二氧化剂针对高分子量还原物质具有比针对低分子量还原物质更高的氧化能力。血液样品中高分子量物质的实例是血红蛋白。第二氧化剂的实例是四唑鎓盐(例如,2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓单钠盐、或2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓单钠盐)。第二氧化剂的其他实例是十二烷基硫酸钠、铁氰化钾(III)、和碘酸钾。在一些实施方案中,使用多于一种的第二氧化剂。
在另一方面,本发明提供在不以单独的过程测量血液样品中总血红蛋白的条件下,直接测定血液样品中总糖化血红蛋白百分比或糖化血红蛋白Alc百分比的方法,所述方法包括:a)使包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白质片段与果糖基氨基酸氧化酶相接触,从而产生过氧化氢(H2O2),其中所述蛋白质片段是通过使所述血液样品与下列各项相接触而产生的:1)从血液样品中的红细胞中释放血红蛋白的溶解缓冲剂;2)氧化剂,即四唑鎓盐,和3)将糖化血红蛋白消化为糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶;b)在过氧化物酶存在下,使在步骤a)中产生的H2O2与颜色形成物质相接触,从而产生可测量的信号;和c)在不单独测量所述血液样品中总血红蛋白的条件下,通过将步骤b)中产生的信号应用于校准曲线来确定所述样品中总糖化血红蛋白的百分比或糖化血红蛋白Alc的百分比。可以使用本文中所述的任意四唑鎓盐。可以依次或同时进行步骤a)和b)。在一些实施方案中,所述溶解缓冲剂含有所述氧化剂。在一些实施方案中,所述溶解缓冲剂含有所述蛋白酶。在一些实施方案中,所述溶解缓冲剂含有所述氧化剂和所述蛋白酶。在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述氧化剂和所述蛋白酶。
能够利用本方法测定的血液样品包括全血或收集的血细胞。在溶解缓冲剂中溶解血液样品中的红细胞从而释放血红蛋白。能够使用能够溶解红细胞并释放血红蛋白的任何溶解缓冲剂(例如,在酸性或碱性pH范围内)。溶解缓冲剂通常含有去污剂,诸如Triton(例如,Triton X-100)、吐温(例如,吐温20)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)、聚氧乙烯十二烷基醚(POEs)5和乙基苯基聚乙二醇(NP-40)。
在本方法中能够使用任何合适的蛋白酶。能够使用内-型蛋白酶或外-型蛋白酶。示范性内-型蛋白酶包括胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、蛋白酶XVII、蛋白酶XXI、赖氨酰-内肽酶、prolether和菠萝蛋白酶F。示范性外-型蛋白酶包括氨肽酶或羧肽酶。在一个实例中,所述蛋白酶是蛋白酶K、链霉蛋白酶E、ananine、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或牛胰蛋白酶。还可以使用来自曲霉菌物种、脂环酸杆菌(Alicyclobacillus)物种、和杆菌物种的金属蛋白酶和中性蛋白酶。
使用所述蛋白酶能够产生任何适宜尺寸的糖化肽。例如,使用所述蛋白酶能够产生约2-约30个氨基酸残基的糖化肽。在另一个实例中,使用所述蛋白酶产生糖化甘氨酸、糖化缬氨酸或糖化赖氨酸残基,或包括糖化甘氨酸、糖化缬氨酸或糖化赖氨酸残基的糖化肽。
糖化肽和/或糖化氨基酸与果糖基氨基酸氧化酶相接触。能够使用任意果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)。果糖基氨基酸氧化酶可以是纯化的或重组产生的。可以使用任何天然存在的种类。在一个实例中,所有的FAOD是曲霉菌物种来源的(见,例如,Takahashi等.,生物的化学杂志(J.Biol.Chem.)272(6):3437-43,1997)。还能够使用其他果糖基氨基酸氧化酶,例如,GenBank登记号U82830中公开的(Takahashi等,生物的化学杂志(J.Biol.Chem.),272(19):12505-12507(1997)和美国专利号6,127,138公开的。还能够使用阿马道里酶的功能性片段或衍生物,所述功能性片段或衍生物仍基本保持其催化阿马道里产物的氧化去糖化产生相应的氨基酸、葡糖醛酮、和H2O2的酶活性。
通常,阿马道里酶的功能性片段或衍生物保持至少50%的它的酶活性。优选地,阿马道里酶功能性片段或衍生物保持至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的它的酶活性。
能够使用具有美国公开号2005/0014935中所述的FAOD酶活性的任何嵌合蛋白质。在一些实施方案中,所述果糖基氨基酸氧化酶从N-末端到C-末端包括:a)第一肽基片段,其包含约5-约30个氨基酸残基的细菌前导序列;和b)第二肽基片段,其包含FAOD。在一些实施方案中,所述FAOD包括下列氨基酸序列:
MGGSGDDDDLALAVTKSSSLLIVGAGTWGTSTALHLARRGYTNVTVLDPYPVPSAISAG
NDVNKVlSSGQYSNNKDEIEVNEILAEEAFNGWKNDPLFKPYYHDTGLLMSACSQEGLD
RLGVRVRPGEDPNLVELTRPEQFRKLAPEGVLQGDFPGWKGYFARSGAGWAHARNAL
VAAAREAQRMGVKFVTGTPQGRVVTLIFENNDVKGAVTGDGKIWRAERTFLCAGASA
GQFLDFKNQLRRPTAWTLVHIALKPEERALYKNIPVIFNIERGFFFEPDEERGEIKICDEHPG
YTNMVQSADGTMMSIPFEKTQIPKEAETRVRALLKETMPQLADRPFSFARICWCADTAN
REFLIDRHPQYHSLVLGCGASGRGFKYLPSIGNLIVDAMEGKVPQKIHELIKWNPDIAAN
RNWRDTLGRFGGPNRVMDFHDVKEWTNVQYRDISKLKGELEGLPIPNPLLRTGHHHHH
H(SEQ ID NO:1)。
嵌合蛋白质可以在细菌细胞,诸如大肠杆菌(E.coli)中产生。可以对生成的蛋白质进行纯化,并测定其酶活性。对FAOD酶活性的测定是本领域中已知的(见,例如,Takahashi等,生物的化学杂志(J.Biol.Chem.),272(6):3437-43(1997)和美国专利号6,127,138)。在Takahashi等,生物的化学杂志(J.Biol.Chem.),272(6):3437-43(1997)中公开了四种示范性阿马道里酶酶活性的测定。
通过Trinder反应评估在由果糖基氨基酸氧化酶催化的反应中产生的过氧化氢。将颜色形成物质和过氧化物酶加入到该反应中,所述颜色形成物质受到过氧化氢的氧化,形成颜色物质诸如醌亚胺或Bindschedler绿衍生物和H2O。生成的醌亚胺或Bindschedler绿产物的量能够通过测量约500nm-约800nm之间(诸如约700nm)的吸收得到确定。在不希望受到理论限制的条件下,未与血液溶解产物中高分子量物质反应的第二氧化剂还可以与颜色形成物质反应,从而形成有色产物,并且由此,测量的吸收反映出血液样品中总糖化血红蛋白的百分比和糖化血红蛋白Alc的百分比。颜色形成物质的实例是N-(羧甲基氨基羰基)-4,4'-双(二甲氨基)-二苯胺钠盐(DA-64)、N,N,N'N',N",N"-六(3-磺基丙基)-4,4',4",-三氨基-三苯甲烷六钠盐(TPM-PS)、和10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-吩噻嗪钠盐(DA-67)。过氧化物酶的实例是辣根过氧化物酶。
在一些实施方案中,所述糖化肽和/或糖化氨基酸依次或同时与果糖基氨基酸氧化酶和所述过氧化物酶相接触。在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述FAOD、所述过氧化物酶、和所述颜色形成物质。在一些实施方案中,在不同的组合物中配制所述FAOD、所述过氧化物酶、和所述颜色形成物质,并同时或不同时地将它们加入到所述反应中。
通过将所述吸收(例如在约700nm处的吸收)与校准曲线进行比较,确定血液样品中总糖化血红蛋白的百分比或糖化血红蛋白Alc的百分比。利用本方法,在不单独测量血液样品中总血红蛋白的条件下,确定该血液样品中总糖化血红蛋白的百分比或糖化血红蛋白Alc的百分比。校准曲线是利用校准物,即,具有已知的糖化血红蛋白百分比或已知的糖化血红蛋白Alc百分比的样品(包括,血液样品和人造校准物)建立的。参见,例如,实施例1。
在一些实施方案中,校准曲线是通过下列步骤制成的:通过在不单独测量总血红蛋白的条件下,执行与未知样品相同的步骤,确定校准样品的信号水平(例如,在约700nm处的吸收);和对校准样品的信号水平和校准样品中已知的糖化血红蛋白百分比或已知的糖化血红蛋白Alc百分比之间的相关性绘图。例如,能够使用这样的全血样品作为校准物,所述全血样品具有通过与合适的较高水平参考材料比较而分配的糖化血红蛋白Alc百分比数值。备选地,糖化血红蛋白Alc百分比可以通过另一种公认的方法,诸如HPLC得到确定。利用本文中所述的方法,以与未知样品相同的方式检验校准物。对针对校准物测量的吸收值对比预期的HbAlc绘图,从而建立校准曲线。
还可以使用除全血样品外的校准物建立校准曲线。能够使用处于适当缓冲的蛋白质基质溶液中的血液溶解产物(Hemolysate)样品(溶解的血液样品)、糖化肽、糖化氨基酸、和糖化氨基酸衍生物作为人造校准物,其具有通过与合适的较高水平参考材料比较而分配的糖化血红蛋白Alc百分比数值。例如,可以在磷酸盐缓冲液中配制校准样品,所述磷酸盐缓冲液具有10%BSA和对应于不同HbAlc百分比(例如,5%-12%)的合适量的合成果糖基丙胺(糖化氨基酸)。除了可以不使用细胞溶解步骤外,用与未知样品相同的方式检验人造校准物。对针对这些校准物测量的吸收值对比预期的HbAlc绘图,从而建立校准曲线。为了延长的保存期,可以对人造校准物进行冻干或稳定化。
本方法能够用于任何合适的目的。优选地,本方法用在疾病或病症,例如糖尿病的预后或诊断中。
C.测定糖化血红蛋白百分比的试剂盒
本发明还提供在不单独测量血液样品中总血红蛋白的条件下,测定总糖化血红蛋白百分比或糖化血红蛋白Alc百分比的试剂盒,所述试剂盒包括:a)溶解血细胞从而释放血红蛋白的溶解缓冲剂;b)选择性氧化低分子量还原物质的第一氧化剂;c)选择性氧化高分子量还原物质的第二氧化剂;d)将血红蛋白水解为包括糖化肽或糖化氨基酸的蛋白质片段的蛋白酶;e)与糖化肽和糖化氨基酸反应从而产生过氧化氢(H2O2)的果糖基氨基酸氧化酶;f)过氧化物酶和颜色形成物质;和g)用于构建校准曲线的糖化血红蛋白或糖化血红蛋白Alc校准物(即,具有已知糖化血红蛋白百分比或已知糖化血红蛋白Alc百分比的校准物)。
在一些实施方案中,所述第一氧化剂是戴斯-马丁氧化剂和/或N-乙基马来酰亚胺。在一些实施方案中,所述第二氧化剂是四唑鎓盐。
在一些实施方案中,所述溶解缓冲剂含有所述第一氧化剂和/或所述第二氧化剂。在一些实施方案中,所述溶解缓冲剂含有所述蛋白酶。在一些实施方案中,所述溶解缓冲剂含有所述第一氧化剂、所述第二氧化剂、和所述蛋白酶。在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述第一氧化剂和所述第二氧化剂。在一些实施方案中,在分别的组合物中配制所述第一氧化剂和所述第二氧化剂。在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述蛋白酶与所述第一氧化剂和/或所述第二氧化剂。
本发明还提供在不需要单独测量血液样品中总血红蛋白含量的条件下,直接测定血液样品中总糖化血红蛋白百分比或糖化血红蛋白Alc百分比的试剂盒,所述试剂盒包括:a)溶解血细胞从而释放血红蛋白的溶解缓冲剂;b)氧化剂,其中所述氧化剂是四唑鎓盐;c)将血红蛋白水解为包括糖化肽或糖化氨基酸的蛋白质片段的蛋白酶;d)与糖化肽和糖化氨基酸反应从而产生过氧化氢(H2O2)的果糖基氨基酸氧化酶;e)过氧化物酶和颜色形成物质;和f)具有已知糖化血红蛋白百分比或已知糖化血红蛋白Alc百分比、用于构建校准曲线的校准物。在一些实施方案中,所述氧化剂包含在所述溶解缓冲剂中。在一些实施方案中,所述蛋白酶包含在所述溶解缓冲剂中。在一些实施方案中,所述氧化剂和所述蛋白酶包含在所述溶解缓冲剂中。在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述蛋白酶和氧化剂。
在一些实施方案中,在单一组合物中配制所述果糖基氨基酸氧化酶和所述过氧化物酶。在一些实施方案中,所述校准物是具有已知糖化血红蛋白Alc百分比的血液样品,其可以处于冻干形式或溶液中。
在一些实施方案中,所述试剂盒包括溶解缓冲剂、Rla试剂、Rlb试剂、和R2试剂。在一些实施方案中,所述溶解缓冲剂包括第一氧化剂(例如,N-乙基马来酰亚胺和/或戴斯-马丁氧化剂)。在一些实施方案中,所述Rla试剂包括蛋白酶和第一氧化剂(例如,N-乙基马来酰亚胺和/或戴斯-马丁氧化剂)。在一些实施方案中,所述Rlb试剂包括第一氧化剂(例如,N-乙基马来酰亚胺和/或戴斯-马丁氧化剂)和第二氧化剂(例如,四唑鎓盐)。在一些实施方案中,所述R2试剂包括果糖基氨基酸氧化酶、过氧化物酶(例如,辣根过氧化物酶)、和颜色形成物质(例如,DA-64)。例如,所述溶解缓冲剂可以含有0.1-10%Triton X-100(例如,约0.1%,约0.2%,约0.5%,约1%,约2.5%,约5%,约7.5%,约10%);5-100mM CHES(例如,约5mM,约10mM,约25mM,约50mM,约75mM,约100mM),pH约8.7;0.1-50mM N-乙基马来酰亚胺(例如,约0.1mM,约0.5mM,约1mM,约5mM,约10mM,约20mM,约30mM,约40mM,约50mM);0.1-5%SDS(例如,约0.15%,约0.25%,约0.35%,约0.45%,约0.55%,约0.75%,约1%,约2.5%,约5%);0.001-1KU/ml过氧化氢酶(例如,约1U/ml,约2U/ml,约3U/ml,约4U/ml,约5U/ml,约10U/ml,约50U/ml,约100U/ml,约500U/ml,约1KU/ml);0.001-1KU/ml抗坏血酸氧化酶(例如,约1U/ml,约2U/ml,约4U/ml,约5U/ml,约10U/ml,约50U/ml,约100U/ml,约1KU/ml)。所述Rla试剂可以含有0.1-10KU/ml杆菌物种蛋白酶(例如,约0.1KU/ml,约2KU/ml,约3.0KU/ml,约3.5KU/ml,约4.0KU/ml,约4.5KU/ml,约5KU/ml,约10KU/ml);1-100mM MES(例如,约1mM,约5mM,约10mM,约25mM,约50mM,约100mM),pH约7.0;1-10mM CaCl2(例如,约1mM,约2.5mM,约5mM,约7.5mM,约10mM);0.01-10mM戴斯马丁氧化剂(例如,约0.01mM,约0.015mM,约0.02mM,约0.05mM,约0.1mM,约5mM,约10mM);0.01-5mg/ml甲基4-羟基苯甲酸钠盐(例如,约0.01mg/ml,约0.05mg/ml,约0.1mg/ml,约1mg/ml,约5mg/ml);和0.001-1mg/ml遗传霉素(G418)(例如,约0.001mg/ml,约0.01mg/ml,约0.1mg/ml,约1mg/ml)。所述Rlb试剂可以含有0.1-50mM MES水合物(例如,约0.1mM,约0.5mM,约1.0mM,约10mM,约25mM,约50mM);0.1-50mM WST-3(2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓,单钠盐)(例如,约0.1mM,约0.5mM,约1mM,约2.5mM,约2.6mM,约2.7mM,约2.8mM,约2.9mM,约3.0mM,约5mM,约10mM,约25mM,约50mM);和0.01-10mM戴斯马丁氧化剂(例如,约0.01mM,约0.04mM,约0.05mM,约0.06mM,约0.07mM,约0.08mM,约0.09mM,约0.1mM,约1mM,约5mM,约10mM)。所述R2试剂可以含有0.01-10KU/ml果糖基缬氨酸氧化酶(例如,约0.01KU/ml,约0.012KU/ml,约0.013KU/ml,约0.0135KU/ml,约0.014KU/ml,约0.0145KU/ml,约0.015KU/ml,约0.0155KU/ml,约0.016KU/ml,约0.05KU/ml,约0.1KU/ml,约1KU/ml,约5KU/ml,约10KU/ml);1-50mM Tris-HCl(例如,约1mM,约5mM,约10mM,约15mM,约20mM,约50mM),pH约8.0;0.1-10%Triton X-100(例如,约0.1%,约0.2%,约0.5%,约1%,约2.5%,约5%,约7.5%,约10%);0.01-10KU/ml辣根过氧化物酶(HRP)(例如,约0.01KU/ml,约0.05KU/ml,约0.08KU/ml,约0.09KU/ml,约0.1KU/ml,约1.0KU/ml,约5KU/ml,约10KU/ml);0.01-10mM DA-64(例如,约0.01mM,约0.05mM,约0.075mM,约0.08mM,约0.085mM,约0.09mM,约0.1mM,约1mM,约5mM,约10mM);和0.01-10mg/ml遗传霉素(G418)(例如,约0.01mg/ml,0.05mg/ml,约0.1mg/ml,约5mg/ml,约10mg/ml)。所述试剂盒还可以包括用于实施本文中所述方法的操作指南。所述试剂盒可以以实施例1中的详细描述使用
本发明的试剂盒可以处于任何合适的包装中。合适的包装包括,但不仅限于,小瓶、瓶、罐、柔软包装、等。试剂盒还可以包括用于实施本文中所述的任何方法的操作指南。
实施例
实施例1:单通道HbAlc酶促测定
单通道HbAlc检测是这样的酶促测定,在其中溶解样品,并使其与试剂反应,从而消除低分子量或高分子量信号干扰物质。利用杆菌物种蛋白酶对溶解的全血样品进行广泛的蛋白酶消化作用。该过程从血红蛋白β链释放包含糖化缬氨酸的氨基酸。然后,将糖化缬氨酸用作在大肠杆菌中产生的特异性重组果糖基缬氨酸氧化酶(FVO)酶的底物。所述重组的FVO能够在选择性试剂的存在下,特异性裂解N-末端缬氨酸并产生过氧化氢。利用辣根过氧化物酶(POD)催化的反应和合适的产色团(chromagen),依次对其进行测量。通过使用合适的校准曲线,将HbAlc浓度直接表示为%HbAlc。
I.试剂组成.
溶解缓冲剂:50mM CHES pH 9.4,2%Triton X-100,3mM戴斯-马丁氧化剂,和2.5mM N-乙基马来酰亚胺。
试剂Rla:25mM MES缓冲剂pH6.5,5mM CaCl2,1000U/ml中性蛋白酶(Toyobo有限公司),2mM N-乙基马来酰亚胺。
试剂Rlb:25mM MES pH 6.5,150mM氯化钠,5mM戴斯-马丁氧化剂,2mM WST3(2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓,单钠盐(由Dojindo实验室制造))。
试剂R2:25mM Tris,pH 8.2,5U/ml具有SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶,50U/ml辣根过氧化物酶,和0.5mM产色团(N-(羧甲基氨基羰基)-4,4'-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(产品名称DA-64,由Wako制造)。
II.测定程序
将溶解缓冲剂(500μL)分配在合适的容器,诸如样品杯或微量离心管中。检验前,通过温和的反转混合全血样品,从而混悬沉淀的红细胞。利用合适的吸移管,在不形成泡沫的条件下,使完全混悬的全血样品(40μL)与溶解缓冲剂温和地混合。然后,将混合物在室温下温育5-10分钟。当该混合物变为没有任何颗粒物质的澄清红色溶液时,观察到完全的细胞溶解。
使用前,以70:30的体积比混合试剂Rla和Rlb。将试剂Rlb倒入Rla中,并通过反转温和地混合所述试剂,从而形成试剂Rlab。
将试剂Rlab(170μL)和溶解产物(20μL)加入到杯中,并混合。将该杯在37℃温育5分钟。该反应也可以在室温下进行。温育后,将50μL试剂R2加入到该杯中。监测700nm处的吸收3分钟。通过从A1处的O.D.数值(加入R2后即刻的吸收)减去A2处的O.D.数值(加入R2后3分钟时的吸收),即ΔA700=(A2-A1),计算校准物、对照和样品的吸收数值。该反应的时间线显示在图1中。通过利用例如,在图2中所示的校准曲线,确定未知样品的数值,所述图2直接以HbAlc%单位表示。
利用这样的数据制成校准曲线(图2),所述数据由在上述程序后测量三份具有已知糖化血红蛋白Alc百分比(6.25%、10.00%、和15.00%)的标准样品的ΔA700获得。通过利用HPLC方法对合适的全血材料的HbAlc数值进行检验,而制备校准物。为了延长保存期,能够冻干或稳定化用于校准的全血材料。
如表2中所示,利用上述方法获得的糖化血红蛋白Alc的百分比数值(在“获得的数值”下的栏)与样品中预期的数值相关。对样品预期的数值获自HPLC。预期数值的范围表示可接受的数值范围。
表2
III.单通道酶促血红蛋白Alc测定的精确性
用重复16次的两种不同%HbAlc水平的新鲜全血样品(样品ID10810285低HbAlc和样品ID 10810244高HbAlc)评估组内(within-run)的精确性。该评估是利用日立(Hitachi)917自动-分析器设备和本实施例中所述的单通道酶促血红蛋白Alc测定进行的。该研究中包括正常对照和病理正常对照。
用于本研究的、具有确定%HbAlc值的全血样品获自合格的商业来源ProMedDx,LLC(10Commerce Way,Norton,MA02766),并且与之一起获得了IRB证明,即用于收集样品的方案、已告知的同意是IRB认证的。
下表3显示单通道酶促血红蛋白Alc测定的精确性。
表3
ID 10810285(%HbAlc) | ID 10810244(%HbAlc) | |
平均值 | 4.8% | 8.2% |
组内(Intra run)SD | 0.07 | 0.05 |
组内(Intra run)CV% | 1.4% | 0.6% |
IV.单通道酶促血红蛋白Alc测定的准确性
为了说明准确性,将单通道酶促血红蛋白Alc测定用于个体的全血样品(如下所述的ID系列),并将其与目前市场上的HbAlc装置,即Tosoh’sHbAlc HPLC测定(Tosoh G7:HbAlc变量分析模式)进行比较。该准确性研究检验是在日立(Hitachi)917自动-分析器设备上进行的。
用于本研究的、具有确定HbAlc值的全血样品获自合格的商业来源ProMedDx,LLC,并且与之一起获得了IRB证明,即用于收集样品的方案、已告知的同意是IRB认证的。
该比较研究包括30份检验样品,并且将获得的结果显示在下表4中。"Tosoh%HbAlc"表示利用Tosoh’s HbAlc HPLC方法对样品获得的数值。"DZ%HbAlc"表示利用本实施例中所述的单通道酶促血红蛋白Alc测定获得的相应数值。
表4
新鲜的全血样品ID | Tosoh%HbAlc | DZ%HbAlc | |
1 | 10810257 | 4.9 | 5.1 |
2 | 10897226 | 5.1 | 5.4 |
3 | 10897227 | 5.1 | 5.1 |
4 | 10897229 | 5.2 | 5.4 |
5 | 10897230 | 5.3 | 5.2 |
6 | 10845039 | 8.7 | 8.4 |
7 | 10845043 | 8.5 | 8.7 |
8 | 10845044 | 7.1 | 6.8 |
9 | 10845045 | 7.8 | 7.5 |
10 | 10845059 | 6.9 | 6.8 |
11 | 10810281 | 10.9 | 11.7 |
12 | 10897261 | 9.6 | 10.0 |
13 | 10897272 | 10.1 | 10.9 |
14 | 10897278 | 14.4 | 15.6 |
15 | 10897231 | 5.6 | 5.6 |
16 | 10897234 | 5.7 | 5.8 |
17 | 10897238 | 5.4 | 5.4 |
18 | 10897239 | 5.7 | 5.9 |
19 | 10897241 | 5.4 | 5.3 |
20 | 10845060 | 7.6 | 7.4 |
21 | 10845063 | 8.1 | 7.3 |
22 | 10845065 | 6.4 | 6.4 |
23 | 10845066 | 6.5 | 6.6 |
24 | 10845068 | 6.7 | 6.3 |
25 | 10897285 | 10.8 | 9.7 |
26 | 10897286 | 9.9 | 10.4 |
27 | 10897290 | 9.7 | 8.7 |
28 | 10897295 | 9.6 | 9.8 |
29 | DZ Cti L1 Lot CON100405B-1 | 5.3 | 5.4 |
30 | DZ Cti L2 Lot CON200405B-1 | 10.9 | 10.9 |
图3显示利用本实施例中所述的单通道酶促血红蛋白Alc测定获得的HbAlc数值(%)对比用Tosoh HPLC方法获得的结果绘图。如图3中所示,斜率是1.05;两种方法间的相关系数是0.96;且y截距是-0.367。
实施例2:利用一种氧化剂进行单通道HbAlc酶促测定
本实施例中的单通道HbAlc检验的程序与实施例1中所述的程序类似,其区别在于仅使用一种氧化剂来氧化血液样品中的还原物质。
I.试剂组成
溶解缓冲剂:50mM CHES pH 9.4,和2%Triton X-100。
试剂Rla:25mM MES缓冲剂pH 6.5,5mM CaCl2,1000U/ml中性蛋白酶(Toyobo有限公司)。
试剂Rlb:25mM MES pH 6.5,150mM氯化钠,和2mM WST3(2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(254-二磺基苯基)-2H-四唑鎓,单钠盐(由Dojindo实验室制造))。
试剂R2:25mM Tris,pH 8.2,5U/ml具有SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶,50U/ml辣根过氧化物酶,和0.5mM产色团(N-(羧甲基氨羰基)-4,4'-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(产品名称DA-64,由Wako制造)。
II.测定程序
将溶解缓冲剂(500μL)分配在合适的容器,诸如样品杯或微量离心管中。检验前,通过温和的反转混合全血样品,从而混悬沉淀的红细胞。利用合适的吸移管,在不形成泡沫的条件下,使完全混悬的全血样品(40μL)与溶解缓冲剂温和地混合。然后,将混合物在室温下温育5-10分钟。当该混合物变为没有任何颗粒物质的澄清红色溶液时,观察到完全的细胞溶解。
使用前,以70:30的体积比混合试剂Rla和Rlb。将试剂Rlb倒入Rla中,并通过反转温和地混合所述试剂,从而形成试剂Rlab。
将试剂Rlab(170μL)和溶解产物(20μL)加入到杯中,并混合。将该杯在37℃温育5分钟。温育后,将50μL试剂R2加入到该杯中。监测700nm处的吸收3分钟。通过从A1处的O.D.数值(加入R2后即刻的吸收)减去A2处的O.D.数值(加入R2后3分钟时的吸收),即ΔA700=(A2-A1),计算校准物、对照和样品的吸收数值。该反应的时间线显示在图1中。
图4显示由按照上述程序测量样品的ΔA700(Y-轴)获得的数据对比已知的糖化血红蛋白Alc百分比绘图。图4显示利用具有单氧化剂四唑鎓的试剂系统,在不单独测量总血红蛋白的条件下,也能够直接确定糖化血红蛋白Alc的百分比,尽管该结果(准确性和相关性)不如实施例1中所述的利用具有双氧化剂的试剂系统获得的那些好。
尽管为了清楚和理解的目的,通过举例说明和实施例的方式详细描述了前述发明,但是可以进行某些改变和改进,这对于本领域技术人员而言应该是明显的。因此,不应该将描述和实施例解释为限制由所附权利要求所叙述的本发明的范围。
Claims (33)
1.第一氧化剂、第二氧化剂、蛋白酶、果糖基氨基酸氧化酶、过氧化物酶和颜色形成物质在制备用于在不以单独的过程测量血液样品中总血红蛋白的条件下,直接测定该血液样品中总糖化血红蛋白百分比或糖化血红蛋白A1c百分比的试剂盒中的用途,其中所述测定方法包括:
a)使包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白质片段与所述果糖基氨基酸氧化酶相接触,从而产生过氧化氢(H2O2),其中所述蛋白质片段是通过使所述血液样品与下列各项相接触而产生的:1)溶解缓冲剂,其从血液样品中的红细胞中释放血红蛋白;2)所述第一氧化剂,其选择性氧化低分子量还原物质;3)所述第二氧化剂,其选择性氧化高分子量还原物质,和4)所述蛋白酶,其将糖化血红蛋白消化为糖化肽或糖化氨基酸;其中所述第一氧化剂选自由戴斯-马丁氧化剂,N-乙基马来酰亚胺,碘乙酸钠,高碘酸钠和氯胺-T组成的组,所述第二氧化剂选自由四唑鎓盐,十二烷基硫酸钠,铁氰化钾(III)和碘酸钾组成的组;
b)在所述过氧化物酶存在下,使在步骤a)中产生的H2O2与所述颜色形成物质相接触,从而产生可测量的信号;和
c)在不单独测量所述血液样品中的总血红蛋白的条件下,通过将步骤b)中产生的信号应用于校准曲线来确定所述样品中总糖化血红蛋白的百分比或糖化血红蛋白A1c的百分比。
2.权利要求1的用途,其中所述第一氧化剂是戴斯-马丁氧化剂或N-乙基马来酰亚胺,和其中所述第二氧化剂是四唑鎓盐。
3.权利要求1的用途,其中所述溶解缓冲剂含有所述第一氧化剂或所述第二氧化剂。
4.权利要求1的用途,其中所述溶解缓冲剂含有所述第一氧化剂和所述第二氧化剂。
5.权利要求1的用途,其中所述溶解缓冲剂含有所述第一氧化剂、所述第二氧化剂、和所述蛋白酶。
6.权利要求1的用途,其中所述溶解缓冲剂含有所述蛋白酶。
7.权利要求1的用途,其中在单一组合物中配制所述第一氧化剂和所述第二氧化剂。
8.权利要求1的用途,其中在分别的组合物中配制所述第一氧化剂和所述第二氧化剂。
9.权利要求1的用途,其中在单一组合物中配制所述蛋白酶与所述第一氧化剂或所述第二氧化剂。
10.权利要求1的用途,其中在单一组合物中配制所述第一氧化剂、所述第二氧化剂、和所述蛋白酶。
11.权利要求1的用途,其中在单一组合物中配制所述果糖基氨基酸氧化酶、所述过氧化物酶、和所述颜色形成物质。
12.权利要求2的用途,其中四唑鎓盐是2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓单钠盐或2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓单钠盐。
13.权利要求1的用途,其中所述颜色形成物质是N-(羧甲基氨基羰基)-4,4'-双(二甲氨基)-二苯胺钠盐、N,N,N'N',N",N"-六(3-磺基丙基)-4,4',4",-三氨基-三苯甲烷六钠盐、或10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-吩噻嗪钠盐。
14.权利要求1的用途,其中所述血液样品是全血或收集的血细胞。
15.权利要求1的用途,其中所述蛋白酶是内-型蛋白酶或外-型蛋白酶。
16.权利要求1的用途,其中所述蛋白酶是选自由下列各项组成的组:蛋白酶K、链霉蛋白酶E、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和牛胰蛋白酶。
17.权利要求1的用途,其中所述蛋白酶是曲霉属(Aspergillus)或杆菌属(Bacillus)来源的中性蛋白酶。
18.权利要求2用途,其中所述蛋白酶产生2-30个氨基酸残基的糖化肽。
19.权利要求1的用途,其中所述蛋白酶产生糖化甘氨酸、糖化缬氨酸或糖化赖氨酸残基或者包含糖化甘氨酸、糖化缬氨酸或糖化赖氨酸残基的糖化肽。
20.权利要求1的用途,其中所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
21.权利要求1的用途,其中所述含有糖化肽或糖化氨基酸的蛋白质片段依次或同时与所述果糖基氨基酸氧化酶和所述过氧化物酶相接触。
22.权利要求1的用途,其中所述果糖基氨基酸氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
23.氧化剂、蛋白酶、果糖基氨基酸氧化酶、过氧化物酶和颜色形成物质在制备用于在不以单独的过程测量血液样品中总血红蛋白的条件下,直接测定该血液样品中总糖化血红蛋白百分比或糖化血红蛋白A1c百分比的试剂盒中的用途,其中所述测定方法包括:
a)使包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白质片段与所述果糖基氨基酸氧化酶相接触,从而产生过氧化氢(H2O2),其中所述蛋白质片段是通过使所述血液样品与下列各项相接触而产生的:1)从血液样品中的红细胞中释放血红蛋白的溶解缓冲剂;2)所述氧化剂,即四唑鎓盐,和3)所述蛋白酶,其将糖化血红蛋白消化为糖化肽或糖化氨基酸;
b)在过氧化物酶存在下,使在步骤a)中产生的H2O2与颜色形成物质相接触,从而产生可测量的信号;和
c)在不单独测量所述血液样品中总血红蛋白的条件下,通过将步骤b)中产生的信号应用于校准曲线来确定所述样品中总糖化血红蛋白的百分比或糖化血红蛋白A1c的百分比。
24.权利要求23的用途,其中所述溶解缓冲剂含有所述氧化剂。
25.权利要求23或24的用途,其中所述溶解缓冲剂含有所述蛋白酶。
26.权利要求23的用途,其中在单一组合物中配制所述氧化剂和所述蛋白酶。
27.权利要求23的用途,其中所述果糖基氨基酸氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
28.权利要求23的用途,其中四唑鎓盐是2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓单钠盐或2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓单钠盐。
29.权利要求23的用途,其中所述颜色形成物质是N-(羧甲基氨基羰基)-4,4'-双(二甲氨基)-二苯胺钠盐、N,N,N'N',N",N"-六(3-磺基丙基)-4,4',4",-三氨基-三苯甲烷六钠盐、或10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-吩噻嗪钠盐。
30.权利要求23的用途,其中所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
31.权利要求23的用途,其中所述蛋白酶是内-型蛋白酶或外-型蛋白酶。
32.权利要求23的用途,其中所述蛋白酶是选自由下列各项组成的组:蛋白酶K、链霉蛋白酶E、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和牛胰蛋白酶。
33.权利要求23的用途,其中所述蛋白酶是曲霉属(Aspergillus)或杆菌属(Bacillus)来源的中性蛋白酶。
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