KR101016127B1 - 단백질 절단 방법 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

프로테아제(protease)에 의해 당화 단백(glycated protein)으로부터 아미노산이나 펩티드를 효율적으로 잘라내는 방법의 제공이다. R-X로 표시되는 화합물의 존재 하에서, 당화 단백질을 프로테아제 처리함으로써, 아미노산 또는 펩티드를 잘라낸다. 상기 R은 탄소수가 9 이상인 알킬 화합물이며, 바람직하게는, 탄소수 9~16의 직쇄 알킬 혹은 직쇄 아실, 탄소수 10~40이며 주쇄 탄소수가 9~16인 분지쇄 알킬 혹은 분지쇄 아실, 또는, 시클로알킬로 치환된 직쇄 알킬(시클로알킬의 탄소수가 3~8이며, 직쇄의 탄소수가 4~13)이며, 상기 X는 당 잔기이다. 또한, 당화 단백질은 예를 들면 당화 헤모글로빈으로서, 프로테아제 처리에 의해 β쇄 N말단 아미노산이나 β쇄 N말단 펩티드를 잘라내는 것이 바람직하다.

Description

단백질 절단 방법 및 그 용도{PROTEIN CLEAVAGE METHOD AND USE THEREOF}
본 발명은, 단백질 절단 방법 및 이를 이용한 단백질 당화율(糖化率)의 측정 방법에 관한 것이다.
생체 상태를 나타내는 지표로서, 각종 단백질의 당화율(糖化率)이 측정되고 있다. 그 중에서도, 혈구 중의 헤모글로빈(Hb)의 당화율, 특히 HbA1c는, 생체 내 혈당치의 과거의 이력을 반영하고 있으므로, 당뇨병의 진단이나 치료 등에 있어서의 중요한 지표가 되고 있다. HbA1c는, HbA(α2β2)의 β쇄 N말단 아미노산(발린(valine))에 글루코오스가 결합해 있고, 그 당화율(％)은, 총 Hb양에 대한 HbA1c양의 비율(％)로 표시된다.
HbA1c는, 일반적으로, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)법, 면역법, 효소법, 전기 영동법 등에 의해서 측정되고, 예를 들면, HbA1c의 레퍼런스(reference) 측정으로서, 프로테아제 Glu-C에 의해 Hb의 β쇄 N말단의 6 펩티드와 그 당화물인 당화 6 펩티드를 잘라내고, 이를 HPLC로 분리 정제한 후, 모세관(capillary) 전기 영동 또는 LC-MS로 정량을 행하는 방법이 개시되어 있다(비특허 문헌 1). 또한, 그 중에서도 효소법은, 예를 들면, 이하와 같은 측정 방법이다. 우선, 프룩토 실(fructosyl) 아미노산 옥시다아제(이하, 「FAOD」라고 한다)를 Hb의 당화 부분에 작용시켜, 과산화수소를 발생시킨다. 이 과산화수소량은, 상기 Hb의 당화량에 대응한다. 이 반응액에, 추가로 퍼옥시다아제 (이하, 「POD」라고 한다)와 산화에 의해 발색하는 발색 기질을 첨가하고, POD를 촉매로 하여 과산화수소와 발색 기질의 사이에서 산화 환원 반응시킨다. 그리고, 상기 발색 기질의 발색 정도를 측정하여 당화량을 구하고, 당화량과 총 Hb량으로부터 HbA1c(％)를 산출할 수 있다.
전술과 같이, HbA1c는,β쇄 N말단 발린의 당화가 특징이므로, FAOD가 N말단당화 발린에 효율적으로 작용하는 것이 요망되고 있다. 그러나, FAOD는 단백질에 직접 작용하기 어렵기 때문에, 통상, 프로테아제(protease) 처리에 의해서 Hb의 β쇄 N말단을 잘라내고, 이에 FAOD를 작용시키는 방법이 시도되고 있다. 구체적으로는, 엔도형 및 엑소형 프로테아제(특허 문헌 1), 세린 카르복시 펩티다아제(특허문헌 2), α-아미노기가 당화된 아미노산을 유리시키는 프로테아제(특허 문헌 3~5),α쇄 N말단보다 β쇄 N말단의 당화 아미노산 또는 당화 펩티드를 잘라내는 작용이 강한 프로테아제(특허 문헌 6) 등을 이용하는 방법이 보고되어 있다(특허 문헌 7~10). 또한, 요소를 첨가해 헤모글로빈을 끓여 변성시켜 프로테아제로 처리하는 방법도 보고되어 있다.
그러나, 이들 방법에 의해서는, 프로테아제 처리에 장시간을 필요로 하여, 검사를 신속히 행하는 것이 곤란하다. 전술의 모세관 전기 영동이나 LC-MS를 위한 프로테아제 처리에 있어서도, 37℃에서 18시간의 처리가 필요하다고 보고되어 있다. 또한, 프로테아제 처리의 단축화로서 예를 들면, pH 3의 산성 조건 하, 몰 신(Molsin)에 의해 1시간 정도 처리를 행하는 예가 개시되어 있지만(특허 문헌 11), 효소 반응을 행하기 위해서는 중성 부근이 바람직하고, 그러한 조건에서의 처리에 대해서는 개시되어 있지 않다. 또한, Hb의 β쇄 N말단 이외의 당화율을 측정하는 경우도, 전술의 HbA1c와 마찬가지로, 절단의 신속성에 문제가 있다.
비특허 문헌 1：우메모토 마사오, 「HbA1c의 국제 표준화를 목표로 하는 IFCC법」 임상 검사, Vo1.46, No.7, 2002년 7월
특허 문헌 1：국제 공개 제 1997／013872호 팜플렛
특허 문헌 2：일본국 특허공개 2001-57897호 공보
특허 문헌 3：국제 공개 제 2000／50579호 팜플렛
특허 문헌 4：국제 공개 제 2000／61732호 팜플렛
특허 문헌 5：일본국 특허공개 2002-315600호 공보
특허 문헌 6：일본국 특허공개 2004-344052호 공보
특허 문헌 7：일본국 특허공개 평 5-192193호 공보
특허 문헌 8：일본국 특허공개 평 10-33177호 공보
특허 문헌 9：일본국 특허공개 평 10-33180호 공보
특허 문헌 10：일본국 특허공개 2004-333452호 공보
특허 문헌 11：일본국 특허공개 2001-95598호 공보
<발명이 해결하려고 하는 과제>
따라서, 본 발명은, 프로테아제에 의해 단백질로부터 아미노산 또는 펩티드를 효율적으로 잘라내는 방법, 이를 이용한 단백질의 당화율(糖化率) 측정 방법, 및, 이에 이용하는 촉진제의 제공을 목적으로 한다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
본 발명은 프로테아제에 의해서 단백질로부터 아미노산 또는 펩티드를 절단 하는 방법으로서, 하기 식(Ⅰ)로 표시되는 화합물의 존재 하에서, 단백질을 프로테아제 처리하는 것을 특징으로 한다. 하기 식에 있어서, R은 탄소수가 9 이상인 알킬기 또는 치환 알킬기이며, X는 당 잔기이다.
R-X …(Ⅰ)
또한, 본 발명은, 단백질을 프로테아제로 절단하는 공정, 얻어진 단백질 절단물의 당화 부분에 FAOD를 작용시키는 공정, 및, 상기 당화 부분과 FAOD의 산화 환원 반응을 측정함으로써, 단백질의 당화율을 결정하는 공정을 포함하는 단백질의 당화율 측정 방법으로서, 상기 단백질의 절단을, 본 발명의 단백질 절단 방법에 의해 행하고, 얻어진 아미노산 또는 펩티드의 당화 부분에 상기 FAOD를 작용시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 촉진제는, 프로테아제에 의한 단백질로부터의 아미노산 또는 펩티드의 절단을 촉진하는 촉진제로서, 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
<발명의 효과>
본 발명의 단백질 절단 방법에 의하면, 메카니즘은 명백하지 않지만, 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 화합물(이하, 「촉진 화합물」이라고도 한다)의 존재 하, 단백질을 프로테아제 처리함으로써, 단시간에 아미노산 또는 펩티드를 잘라낼 수 있다. 또한, 당화율의 측정에 있어서, 각 단백질에 특징적인 부분을 종래법보다 더 신속하게 잘라낼 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 절단 방법에 의해 단백질을 처리하면, 프로테아제 처리의 단축화나, 각 당화 단백질에 특징적인 당화 아미노산이나 펩티드의 절단을 효율적으로 행할 수 있으므로, FAOD를 특징적인 당화 부분(예를 들면, Hb의 β쇄 N말단 발린, 또는 리신(lysine) 등의 당화 부분)에 작용시키기 쉽고, 당화율의 측정 정밀도도 향상된다. 따라서, 이러한 본 발명의 절단 방법 및 당화율 측정 방법은 예를 들면, 당뇨병의 진단이나 치료 등, 의료 분야에 있어서 매우 유용하다고 할 수 있다. 또한, 이와 같이 상기 화합물이 당화 단백질의 절단을 촉진하는 것은 본 발명자들이 처음으로 찾아낸 것이므로, 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 화합물을 포함하는 본 발명의 촉진제는, 전술과 같은 의료 분야에 있어서 매우 유용한 시약이 된다.
도 1은 본 발명의 실시예에 있어서의, 측정 HbA1c％와 표준 시료의 표시 HbA1c값의 상관 관계를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 있어서의 HPLC의 크로마토그램이며, (A)는, HbA1c％=44％의 시료를 사용한 결과, (B)는, HbA1c％=0％의 시료를 사용한 결과를 나타낸다.
1. 단백질의 절단 방법
이하에, 본 발명에서 사용하는 하기 식(Ⅰ)로 표시되는 촉진 화합물에 대해 설명한다.
R-X …(Ⅰ)
상기 식(Ⅰ)에 있어서, R은 탄소수가 9 이상인 알킬기 또는 치환 알킬기이다. 구체적인 예로는, 탄소수 9~16의 직쇄 알킬기 혹은 직쇄 아실기, 탄소수 10~40이며 주쇄 탄소수가 9~16인 분지쇄 알킬기 혹은 분지쇄 아실기, 또는, 시클로알킬로 치환된 직쇄 알킬기(예를 들면, 시클로알킬의 탄소수가 3~8이며, 시클로알킬을 제외한 직쇄의 탄소수가 4~13) 등을 들 수 있다. 상기 시클로알킬은, 예를 들면, 시클로헥실, 시클로펜틸, 시클로부틸 등을 들 수 있다.
상기 식(Ⅰ)에 있어서, X는, 당 잔기이며, 예를 들면, 단당(單糖) 또는 이당(二糖)의 잔기인 것이 바람직하다. 상기 단당으로는, 예를 들면, 만노사이드(Mannoside), 글루코사이드, 티오글루코사이드 등, 이당으로는, 말토사이드(maltoside), 프룩토피라노실-글루코피라노사이드(Fructopyranosyl-glucopyranoside), 티오말토사이드 등을 들 수 있다. 이들 당의 구조는,α,β, D, L중 어떠한 것이어도 된다. 또한, 당의 환식 구조에 결합하는 수소나, OH기의 수소는, 예를 들면, Na, K, 할로겐 등으로 치환되어도 된다. 또한, 본 발명에 있어서, R과 당 잔기의 환식 구조의 결합을 통한 원자(예를 들면, -O-, -S- 등)는 당 잔기의 구성 요소로 한다.
본 발명에 있어서의 상기 촉진 화합물의 구체적인 예로는, 예를 들면, n-도데실-β-D-말토사이드(n-도데실-β-D-말토피라노사이드), 6-시클로헥실헥실-β-D- 말토사이드, 수크로오스 모노라우레이트(sucrose monolaurate)(β-D-프룩토피라노실-α-D-글루코피라노사이드 모노도데카노에이트), n-데실-β-D-말토사이드(n-데실-β-D-말토피라노사이드), n-노닐-β-D-티오말토사이드(n-노닐-β-D-티오말토사이드), 5-시클로헥실펜틸-β-D-말토사이드, 운데실-β-D-말토사이드, n-도데실-αβ-D-말토사이드, 헥사데실-β-D-말토사이드, 및, 3-옥사트리데실-α-D-만노사이드 등을 들 수 있다. 이들 화합물의 화학식을 이하에 나타낸다.
<화학식 1>
Figure 112007084922680-pct00001
이들 중에서도, 상기 식(Ⅰ)에 있어서의 R(알킬쇄)의 탄소수가 12이상인, n-도데실-β-D-말토사이드, 수크로오스 모노라우레이트, 헥사데실-β-D-말토사이드 등이 바람직하다. 또한, R의 탄소수가 동일한 경우(예를 들면, 탄소수가 같은 알 킬기와 아실기), 보다 바람직하게는 아실기이며, n-도데실-β-D-말토사이드(n-도데실-β-D-말토피라노사이드)가 바람직하다.
본 발명의 당화(糖化) 단백질의 절단 방법은, 전술과 같이, 프로테아제에 의해서 단백질로부터 아미노산 또는 펩티드를 절단하는 방법으로서, 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 촉진 화합물의 존재 하, 단백질을 프로테아제 처리하는 것을 특징으로 한다. 이와 같이, 프로테아제 처리를 상기 촉진 화합물의 존재 하에서 행함으로써, 비존재에서의 프로테아제 처리보다, 아미노산이나 펩티드의 절단을 효율적으로 행할 수 있다. 이 때문에, 예를 들면, 처리에 사용하는 프로테아제의 증량도 불필요해진다. 이와 같이 단백질로부터 아미노산 또는 펩티드를 효율적으로 절단할 수 있는 메카니즘은 명백하지 않지만, 상기 촉진 화합물을 공존시킴으로써, 단백질이 프로테아제로 처리되기 쉬운 구조로 변화한다고 추측된다. 또한, 본 발명에 있어서, 절단 대상을 「단백질」로 하고 있는데, 부분적으로 당화된 단백질도 포함하고, 본 발명의 절단 방법은, 후술하는 바와 같이 단백질의 당화율 측정에 적용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 절단 대상의 단백질은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 헤모글로빈(Hb)이 바람직하다. Hb로부터 프로테아제에 의해서 잘리는 아미노산이나 펩티드는, 특별히 제한되지 않고, 사용하는 프로테아제에 따라 적절히 결정할 수 있다. 후술하는 당화율의 측정을 전제로 한 경우, 상기 아미노산은, 통상, β쇄 N말단 발린, 리신 또는 이들의 당화물이다. β쇄 N말단의 당화 발린(프룩토실 발린)은 그 α-아미노기가 당화되어 있고, 당화 리신은 ε-아미노기가 당화되어 있다. 또한, 펩티드는, 통상, β쇄 N말단 발린을 포함하는 펩티드(이하, 「β쇄 N말단 펩티드」라고도 한다)나, 리신을 포함하는 펩티드(이하, 「리신펩티드」라고도 한다)이다. 잘려내어지는 펩티드의 길이는, 특별히 제한되지 않고, 단백질의 종류나 사용하는 프로테아제에 의해서 적절히 설정할 수 있는데, Hb의 경우, 아미노산 잔기 수가, 예를 들면, 2~6이고, 보다 바람직하게는 2~4이며, 구체적으로는, 프룩토실 Val-His, 프룩토실 Val-His-Leu, 프룩토실 Val-His-Leu-Thr 등이다.
본 발명은, 전술과 같이, 상기 촉진 화합물 존재 하에서의 프로테아제 처리에 의해서, 단백질로부터 아미노산이나 펩티드를 효율적으로 절단할 수 있는 것이 특징이며, 사용하는 프로테아제의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 즉, 절단 대상의 단백질이나 잘려내어지는 아미노산이나 펩티드의 종류에 따라, 프로테아제를 적절히 결정할 수 있다.
상기 프로테아제로는, 예를 들면, 메탈로프로테아제, 세린프로테아제, 세린카르복시펩티다아제, 프로테이나아제 K, 브로멜라인(bromelain), 파파인, 돼지 췌장 유래 트립신(trypsin), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis ) 유래 프로테아제, 아스퍼질러스 오리재(Aspegillus oryzae ) 유래 프로테아제 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 엔도프로테아제이다. 시판품으로는, 예를 들면, 메탈로프로테아제(아크레이사 제), 프로테아제 A 「아마노」G(아마노엔자임사 제), 프로테아제 M 「아마노」G(아마노엔자임사 제), 프로테아제 S 「아마노」G(아마노엔자임사 제), 펩티다아제 R(아마노엔자임사 제), 파파인 M-40(아마노엔자임사 제), 상품명 프로테아제 N(플커사 제), 상품명 프로테아제 N「아마노」(아마노세이야쿠사 제), Bacillus속 유래 메탈로프로테이나아제(토요보우사 제：상품명 토요팀), 엔도프로테이나아제 Glu-C(로슈사 제) 등을 들 수 있다.
특히, 단백질이 Hb이며,β쇄 N말단 펩티드를 잘라내는 경우에는, β쇄 N말단에 특이적으로 작용하여 N말단 펩티드의 절단을 촉매하는 프로테아제(예를 들면, 일본국 특허공개 2000-300294호 공보, 일본국 특허공개 2004-344052호 공보 등)가 바람직하다. 이 프로테아제를 상기 촉진 화합물의 존재 하에서 사용하면, 예를 들면, 단백질에 있어서 β쇄 N말단 발린 이외가 당화되어도(예를 들면, 측쇄기(ε-아미노기)가 당화된 리신이나 아르기닌 등), 매우 신속하고 또한 특이적으로 β쇄 N말단 펩티드의 절단을 행할 수 있다. 또한, β쇄 N말단 발린의 절단을 촉매하는 프로테아제로는, 예를 들면, 국제 공개 제 2000／50579호 팜플렛(일본국 특허 3668801), 국제 공개 제 2000／61732호 팜플렛, 일본국 특허공개 2002-315600호 공보 등에 개시되어 있는 프로테아제를 들 수 있다.
단백질이 Hb이며, 리신 혹은 리신을 포함하는 펩티드를 잘라내는 경우에는, 예를 들면, 국제 공개 제 2002／006519호 팜플렛에 기재된 프로테아제 등이 바람직하다. 이 프로테아제를 상기 촉진 화합물의 존재 하에서 사용하면, 매우 신속하고 또한 특이적으로 리신 혹은 리신을 포함하는 펩티드의 절단을 행할 수 있다.
또한, 단백질이 Hb이며, 프로테아제가, β쇄 N말단 아미노산 혹은 펩티드와, 리신 혹은 리신 펩티드의 양쪽 모두를 잘라내는 경우, 상기 촉진 화합물의 존재 하에서 프로테아제 처리하면, 모두 절단이 촉진되는데, 특히, 리신이나 리신 펩티드의 절단 촉진(예를 들면, 몇배)보다도, β쇄 N말단의 절단 촉진(몇배부터 몇십배) 을 현저하게 볼 수 있다. 이에 따라, 특히 β쇄 N말단의 절단물을 얻는 것이 가능해진다. 따라서, 상기 양자를 동일하게 잘라내는 프로테아제라도, 촉진 화합물의 병용에 의해서, 리신이나 리신펩티드보다도 많은 β쇄 N말단 절단물(예를 들면, 약 10배 이상)을 얻을 수 있으므로, 발린의 α위 아미노기의 당화에 대응하는 HbA1c를, 리신이나 리신펩티드의 영향을 억제해 측정하는 것이 가능해진다.
본 발명의 단백질의 절단 방법은, 예를 들면, 단백질을 포함하는 시료에, 상기 촉진 화합물과 프로테아제를 첨가함으로써 행할 수 있다. 또한, 상기 촉진 화합물과 프로테아제의 첨가 순서는 전혀 제한되지 않고, 동시여도 되고, 각각을 순서 없이 첨가할 수도 있다.
상기 시료는, 특별히 제한되지 않고, 목적의 단백질이 포함되는 시료를 들 수 있다. 그 중에서도, 후술하는 바와 같이 Hb의 당화율 측정에 적용하는 경우는, 예를 들면, 전혈 시료, 혈구 시료, 이들 용혈 시료 등을 들 수 있다. 전혈 시료나 혈구 시료의 용혈 방법은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 삼투압 차이를 이용하는 방법, 초음파에 의한 방법 등을 사용할 수 있다. 삼투압 차이를 이용하는 경우, 전혈(또는 혈구)에 대해서, 예를 들면, 2~100배 체적량의 정제수를 첨가해 용혈시키면 된다. 또, 계면 활성제를 시료에 첨가해 용혈할 수도 있다.
프로테아제 처리의 반응액에 있어서의 상기 촉진 화합물의 첨가 비율은, 예를 들면, 0.01~200mM의 범위이며, 바람직하게는 0.4~100mM이다. 상기 반응액 중의 단백질 농도(예를 들면, Hb농도)가 0.005mM인 경우, 상기 촉진 화합물의 첨가 비율은, 예를 들면, 0.4~100mM의 범위이며, 바람직하게는 1~100mM이다.
상기 반응액에 있어서의 프로테아제의 첨가 비율은, 예를 들면, 0.001~300,000KU／L의 범위이며, 바람직하게는 0.01~30,000KU／L이며, 특히 바람직하게는 0.1~1000KU／L이다. 상기 반응액 중의 단백질 농도(예를 들면, Hb)가 0.005mM인 경우, 프로테아제의 첨가 비율은, 예를 들면, 0.01~300,000KU／L의 범위이며, 바람직하게는 0.05~30,000KU／L이며, 특히 바람직하게는 0.1~10,000KU／L이다.
프로테아제 처리의 조건은 특별히 제한되지 않지만, 처리 온도는, 예를 들면, 10~40℃의 범위이며, 바람직하게는 25~37℃이다. 처리 시간은 제한되지 않고, 특별히 상한은 제한되지 않고, 예를 들면, 0.1~60분 정도로 프로테아제 처리를 행하는 것이 가능하다. 처리 시간은, 바람직하게는 0.1~45분, 보다 바람직하게는 0.2~20분이며, 특히 바람직하게는 0.2~5분이다. 본 발명은, 종래의 방법과 달리, 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 촉진 화합물 존재 하에서 프로테아제 처리를 실시함으로써 신속하게 아미노산이나 펩티드의 절단을 행할 수 있으므로, 전술과 같은 처리 시간이어도 충분히 절단 처리가 가능하다. 종래의 방법에 의하면, 예를 들면, Hb의 β쇄 N말단의 절단에, 통상, 2~24시간의 프로테아제 처리가 필요한 것으로부터도, 매우 신속히 절단할 수 있는 것을 알 수 있다.
상기 프로테아제 처리는, 예를 들면, 완충액 중에서 행하는 것이 바람직하고, 트리스염산 완충액, EPPS 완충액, PIPES 완충액, 인산 완충액, ADA 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액 등을 사용할 수 있다. 또한, 프로테아제 반응액의 pH는, 예를 들면, 4~10의 범위이며, 바람직하게는 6~9이고, 예를 들면, 전술과 같 은 완충액에 의해서 pH를 조정해도 된다.
또한, 본 발명의 단백질의 절단 방법에 있어서는, 상기 촉진 화합물 외에 니트로 화합물을 더 첨가한 조건 하에서 프로테아제 처리를 행해도 된다. 이 니트로 화합물로는, 예를 들면, 아질산이나 그 염을 들 수 있다. 아질산염으로는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 아질산칼륨, 아질산아밀, 아질산부틸, 니트로글리세린, 아질산나트륨, 파라니트로크롤벤젠, 트리니트로톨루엔, 니트로벤젠 등을 들 수 있다. 프로테아제 처리의 반응액에 있어서의 상기 니트로 화합물의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 반응액 중의 단백질 농도(예를 들면, Hb농도)가 0.005mM인 경우, 상기 니트로 화합물의 첨가 비율은, 예를 들면, 0.005mM이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05~2mM이다.
본 발명의 단백질의 절단 방법은, 이와 같이 단백질의 아미노산이나 펩티드를 효율적으로 잘라낼 수 있으므로, 전술과 같은 효소법에 의한 단백질 당화율의 측정 방법으로 유용하다. 또한, 효소법에는 한정되지 않고, 예를 들면, 잘라낸 당화 아미노산이나 당화 펩티드를 항원으로 하는 면역법에도 유용하고, 또한, HPLC법이나 전기 영동법에서의 분리를 향상시키는 것도 가능하다. 따라서, 단백질의 당화율의 각종 측정 방법에 있어서, 측정 시료의 처리 공정으로서 매우 유용하다. 또한, Hb는, 전술과 같이 β쇄 N말단 발린의 당화량으로부터 HbA1c값을 구할 수 있고, 또한, 리신의 당화량으로부터 Lys당화율(GHbLys값)을 구할 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 절단 방법에 의해서, 전술과 같이, Hb로부터 β쇄 N말단 발린이나 이를 포함하는 펩티드, 리신이나 이를 포함하는 펩티드를 잘라내면, Hb의 당화율을 더욱 좋은 정밀도로 측정할 수 있다.
2. 당화율의 측정 방법
본 발명의 단백질의 당화율 측정 방법은, 전술과 같이, 단백질을 프로테아제로 절단하는 공정, 얻어진 단백질 절단물의 당화 부분에 FAOD를 작용시키는 공정, 및, 상기 당화 부분과 FAOD의 산화 환원 반응을 측정함으로써, 단백질의 당화율을 결정하는 공정을 포함하는 단백질의 당화율 측정 방법으로서, 상기 단백질의 절단을, 본 발명의 단백질 절단 방법에 의해 행하고, 얻어진 아미노산 또는 펩티드의 당화 부분에 상기 FAOD를 작용시키는 것을 특징으로 한다.
(HbA1c의 측정 방법)
본 발명의 단백질의 당화율 측정 방법에 대해서, 당화 Hb의 HbA1c를 측정하는 예를 들어 설명한다.
당화 Hb의 HbA1c를 측정하는 경우, 프로테아제에 의한 Hb 절단물은, β쇄 N말단 당화 발린 또는 상기 당화 발린을 포함하는 펩티드로서, β쇄 N말단 발린의 당화 부분에 FAOD를 작용시키면 된다. 또한, 잘라내는 아미노산이나 펩티드는, 전술과 같이, 사용하는 프로테아제의 종류의 선택에 의해서 결정할 수 있다.
HbA1c의 측정 방법에 사용하는 FAOD는, 특별히 제한되지 않지만,α-아미노기가 당화된 아미노산 또는 펩티드에 작용하고, α-케토알데히드 및 과산화수소를 발생하는 반응을 촉매하는 효소(이하, 「FAOD-α」라고 한다)가 바람직하다. 이러한 촉매 반응은, 예를 들면, 하기 식(1)로 표시할 수 있다.
R1-CO-CH2-NH-R2 ＋ H2O ＋ 02 → R1-CO-CHO ＋ NH2-R2 ＋ H2O2 …(1)
상기 식(1)에 있어서, R1은 수산기 혹은 당화 반응 전의 당에 유래하는 잔기(당 잔기)를 의미한다. 상기 당 잔기(R1)는, 반응 전의 당이 알도오스(aldose)인 경우는 알도오스 잔기이며, 반응 전의 당이 케토오스(ketose)인 경우, 케토오스 잔기이다. 예를 들면, 반응 전의 당이 글루코오스인 경우는, 아마도리 전위(Amadori rearrangement)에 의해, 반응 후의 구조는 프룩토오스 구조를 취하는데, 이 경우, 당 잔기(R1)는, 글루코오스 잔기(알도오스 잔기)가 된다. 이 당 잔기(R1)는, 예를 들면,
-［CH(OH)］n-CH2OH
로 표시할 수 있고, n은 0~6의 정수이다.
상기 식(Ⅰ)에 있어서, R2는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 하기 식(2)로 표시하는 아미노산 잔기 또는 펩티드 잔기이다.
-CHR3-CO-R4 …(2)
상기 식(2)에 있어서, R3은 아미노산 측쇄기를 나타내고, R4는 수산기, 아미노산 잔기 또는 펩티드 잔기를 나타내며, 예를 들면, 하기 식(3)으로 표시할 수 있다. 하기 식(3)에 있어서, n은 0이상의 정수이며, R3은 전술과 마찬가지로, 아미노 산 측쇄기를 나타내고, 아미노산 측쇄기는 모두 동일해도 되고, 달라도 된다.
-(NH-CHR3-CO)n-0H …(3)
이러한 FAOD-α로는, 예를 들면, 상품명 FPOX-CE(키코망사 제), 상품명 FPOX-EE(키코망사 제), 국제 공개 제 2004／029251호 팜플렛에 기재된 프룩토실 아민 옥시다아제, 일본국 특허공개 2004-275013호 공보나 일본국 특허공개 2004-275063호 공보 기재의 프룩토실 아민 옥시다아제, 페니실리움속 유래의 FAOD(일본국 특허공개 평 8-336386호 공보) 등을 사용할 수 있다.
이러한 FAOD를 사용하면, 예를 들면, β쇄 N말단 발린 이외가 당화되어도, 발린의 당화 부분 이외에는 작용하기 어려우므로, 보다 높은 정밀도로 HbA1c의 측정이 가능해진다.
또한, FAOD는, 상기 (1) 이외의 기질 특이성을 더 가져도 된다. 이러한 FAOD로는, 예를 들면, 상기 당화 α-아미노기와 당화 아미노산 측쇄기의 양쪽 모두에 작용하는 FAOD(이하, 「FAOD-αS」라고 한다)를 들 수 있고, 예를 들면, 시판의 상품명 FOD(아사히카세이사 제), 지베렐라(Gibberella)속 유래 FAOD(일본국 특허공개 평 8-154672호 공보), 푸사리움(Fusarium)속 유래 FAOD(일본국 특허공개 평 7-289253호 공보), 아스퍼질러스(Aspergillus)속 유래 FAOD(WO99／20039) 등을 들 수 있다. 이러한 FAOD의 경우, 예를 들면, 프로테아제의 종류를 적절히 선택하고, β쇄 N말단의 아미노산이나 펩티드를 특이적으로 절단하는 프로테아제와 조합함으로써, 다른 당화 부위에의 작용을 억제하는 것이 가능하다.
HbA1c 측정 방법에 있어서, 상기 당화 부분과 FAOD의 산화 환원 반응의 측정은, 예를 들면, 상기 반응에 의해 생기는 과산화수소량의 측정이나, 상기 반응에서 소비되는 산소량의 측정을 들 수 있다. 상기 과산화수소량은, 예를 들면, 퍼옥시다아제(POD)와 산화에 의해 발색하는 기질을 이용하고, 이들과 과산화수소의 반응에 의해 기질을 발색시켜, 이 발색 정도를 측정함으로써 행할 수 있다.
상기 산화에 의해 발색하는 기질(발색 기질)로는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, N, N, N’, N’, N″, N″-헥사(3-술포프로필)-4, 4’, 4″-트리아미노트리페닐메탄 헥사나트륨염(예를 들면, 상품명 TPM-PS, 도진카가쿠사 제), 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3, 7-비스(디메틸아미노)페노티아진 또는 그 염(예를 들면, 상품명 DA-67, 와코쥰야쿠사 제), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4, 4’-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨, 오르토페닐렌디아민(OPD), 트린더 시약(Trinder’s Reagent)과 4-아미노안티피린을 조합한 기질 등을 들 수 있다. 트린더 시약으로는, 예를 들면, 페놀, 페놀 유도체, 아닐린 유도체, 나프톨, 나프톨 유도체, 나프틸아민, 나프틸아민 유도체 등을 들 수 있다. 또한, 4-아미노안티피린 외에, 아미노안티피린 유도체, 바닐린디아민술폰산, 메틸벤즈티아졸리논히드라존(MBTH), 술폰화 메틸벤즈티아졸리논히드라존(SMBTH) 등도 사용할 수 있다.
이하에, HbA1c 측정 방법에 대해서 구체적인 예를 나타내는데, 이에 제한되지 않는다.
우선, 전술과 마찬가지로, 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 촉진 화합물의 존재 하에서, Hb 함유 시료를 프로테아제 처리한다.
그리고, 상기 프로테아제 처리에 의해 얻어진 β쇄 N말단 아미노산 또는 펩티드 단편을 FAOD로 처리한다. 상기 프로테아제 처리에 의해서, 예를 들면, Hb β쇄 N말단으로부터 프룩토실 Val-His가 잘려내어진 경우에는, 이 FAOD 처리에 의해서, Val의 α-아미노기에 결합한 당이 유리되고, α-케토알데히드(당 잔기), Val-His 및 과산화수소가 생성된다.
FAOD 처리는, 상기 프로테아제 처리와 마찬가지로 완충액 중에서 행하는 것이 바람직하고, 상기 완충액으로는, 특별히 제한되지 않고, 상기 프로테아제 처리와 같은 완충액을 사용할 수 있다. FAOD 처리 조건은, 특별히 제한되지 않지만, 반응액의 pH는, 예를 들면, 6~9이고, 처리 온도는, 예를 들면, 10~38℃의 범위이며, 바람직하게는 25~37℃이다. 처리 시간도 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 0.1~60분, 바람직하게는 0.1~5분이다.
FAOD 처리의 반응액에 있어서의 FAOD의 첨가 비율은, 예를 들면, 0.01~50KU／L의 범위이며, 바람직하게는 0.5~10KU／L이다.
다음에, 상기 FAOD 처리에 의해서 생긴 과산화수소의 양을, POD 및 상기 발색 기질을 이용해 측정한다. 또한, 과산화수소량은, POD 등을 이용한 효소적 수법 외에, 전기적 수법 등에 의해서 측정할 수도 있다.
POD 반응은, 상기 프로테아제 처리와 마찬가지로 완충액 중에서 행해지는 것이 바람직하고, 전술과 같은 완충액을 사용할 수 있다. POD 처리의 조건은, 특별히 제한되지 않지만, 반응액의 pH는, 예를 들면, 5~9이며, 처리 온도는, 예를 들면, 10~40℃의 범위이며, 바람직하게는 25~37℃이다. 처리 시간도 특별히 제한되 지 않고, 예를 들면, 0.1~5분이다.
POD 반응액에 있어서의 POD의 첨가 비율은, 예를 들면, 0.01~300KU／L의 범위이며, 바람직하게는 0.5~40KU／L이다. 또한, 상기 반응액에 있어서의 발색 기질의 첨가 비율은, 예를 들면, 0.001~10mM의 범위이며, 바람직하게는 0.005~2mM이다.
이와 같이 발색 기질을 이용한 경우, 예를 들면, 그 발색(예를 들면, 반응액의 흡광도)을 분광 광도계로 측정하면 된다. 과산화수소량은, Hb에 있어서의 β쇄 N말단 발린의 당화량(당화 농도：HbA1c 농도)에 대응하므로, 측정한 흡광도로부터 발린의 당화량을 산출할 수 있다. 그리고, 하기 식으로 나타내는 바와같이, 이 Hb의 β쇄 N말단 발린의 당화량과 시료 중의 전(全) Hb량(Hb 농도)의 비(100분율)를 산출함으로써, HbA1c(％)를 구할 수 있다. 또한, Hb량은, 종래 공지의 방법이나, 시판의 시약 키트에 의해서 측정할 수 있다.
HbA1c％=(β쇄 N말단 발린의 당화량／Hb량)×100
흡광도로부터의 Hb 당화량의 산출은, 예를 들면, Hb의 β쇄 N말단의 이미 알려진 당화량과 흡광도의 관계를 플롯(plot)한 검량선을 이용하여 행할 수 있다. 예를 들면, β쇄 N말단 당화량이 이미 알려진 Hb 표준액에 대해서, 전술과 동일하게 하여 흡광도 측정을 행하고, 이 표준액의 측정치와 이미 알려진 당화량의 관계를 나타내는 검량선을 작성해 둔다. 그리고, 이 검량선에 전술과 같이 측정한 흡광도를 대입하여, β쇄 N말단의 당화량을 산출할 수 있다.
또한, 이하와 같이 하면, 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 촉진 화합물로 처리한 동일한 시료를 이용해 Hb량을 보다 정확하게 측정하고, 또한, HbA1c값을 보다 정확하 게 구할 수 있다. 즉, 본 발명의 측정 방법에 있어서, 프로테아제에 의한 Hb의 절단에 앞서, 상기 Hb를 포함하는 시료에 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 촉진 화합물을 첨가하고, 상기 촉진 화합물을 첨가한 시료의 광학적 변화량을 측정하고, 이 광학적 변화량으로부터 상기 시료 중의 Hb량을 산출한다. 한편, 상기 화합물이 첨가된 시료 중의 Hb를 프로테아제에 의해서 절단한 후, 상기 당화 부분과 FAOD의 산화 환원 반응을 측정함으로써 Hb의 당화량을 측정한다. 그리고, 상기 Hb량과 상기 당화량으로부터 HbA1c값(HbA1c％)을 구하는 것이 바람직하다.
이 방법에서는, 프로테아제의 첨가에 앞서, Hb를 포함하는 시료에 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 촉진 화합물을 첨가하고, 예를 들면, 상기 시료의 흡광도 측정을 행한다. 그리고, 측정한 흡광도와 미리 준비한 검량선으로부터 Hb량을 구하면 된다. 이와 같이, 상기 화합물로 Hb를 처리해 두면, Hb의 양을 용이하고 또한 정확하게 구할 수 있다. 그 메카니즘은 명확하지 않지만, 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 촉진 화합물에 의해서, 헤모글로빈의 구조가 변화하고, 불안정한 Hb가 안정화되기 때문이라고 추측된다. 상기 검량선은, 예를 들면, 이미 알려진 Hb량(Hb 농도)인 복수의 Hb 함유 시료를 전술의 방법에 의해 측정하고, 이들 측정치와 이미 알려진 Hb량으로부터 작성할 수 있다. 또한, 흡광도의 측정 파장은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 400~660nm의 범위이며, 상기 화합물에 의한 시료의 처리 시간은, 예를 들면, 0.2~30분의 범위이다. 이 방법에 의해 Hb 측정을 행하는 경우, 상기 화합물의 첨가 후, 프로테아제의 첨가 전에 흡광도 측정을 행하는 이외는, 전술과 동일하게 하여 연속해 프로테아제 처리 등을 행하고, HbA1c 농도를 구할 수 있으므 로, 보다 간편한 측정 방법이 된다.
(GHbLys의 측정 방법)
본 발명의 당화율 측정 방법으로는, 이 외에도, 예를 들면, 당화 Hb의 GHbLys(Lys 당화율)의 측정을 들 수 있다. 전술의 HbA1c는, 혈당치의 움직임에 천천히 응답하므로, 몇시간 정도 고혈당이 지속하지 않으면 HbA1c의 상승은 확인되지 않는다. 이에 대해, GHbLys는, 몇십분 정도의 고혈당 상태에도 민감하게 반응한다. 이 때문에, GHbLys를 측정하면, 예를 들면, 혈당치가 높아지는 식후 1~2시간에 있어서의 고혈당을 검출할 수 있다. 따라서, GHLys는, 고혈당의 지표가 되고, 그 측정은 임상 분야에 있어 매우 유용하게 된다.
당화 Hb의 GHbLys를 측정하는 경우, 프로테아제에 의한 Hb 절단물은, ε-아미노기가 당화된 리신 또는 이를 포함하는 당화 펩티드로서, 리신의 당화 부분에 FAOD를 작용시키면 된다. 또한, 잘라내는 아미노산이나 펩티드는, 전술과 같이, 사용하는 프로테아제의 종류의 선택에 따라 결정할 수 있다.
GHbLys의 측정 방법에 사용하는 FAOD는, 특별히 제한되지 않지만, 적어도, 아미노산 측쇄의 아미노기(예를 들면,ε-아미노기)가 당화된 아미노산 또는 펩티드에 작용해 하기 식(1’)로 표시하는 반응을 촉매하는 효소(FAOD-S)가 바람직하다.
R1-CO-CH2-NH-R2 ＋ H2O ＋ 02 → R1-CO-CHO ＋ NH2-R2 ＋ H2O2 …(1’)
상기 식(1’)은, R2 이외는, 상기 식(1)과 같다. 상기 식(1’)에 있어서, R2는 하기 식(4’)로 표시할 수 있다. 하기 식(4’)에 있어서 「-(CH2)4-」는 리신의 측쇄기 중, 당화된 아미노기 이외의 부분을 나타낸다.
-(CH2)4-CH(NH-R6)-CO-R7 …(4’)
또한, 상기 식(4’)에 있어서, R6은 수소, 아미노산 잔기 또는 펩티드 잔기이며, 예를 들면, 하기 식(5’)로 표시할 수 있다. 또한, 하기 식(5’)에 있어서, n은 0 이상의 정수이며, R3은 전술과 마찬가지로 아미노산 측쇄기를 나타내고, 아미노산 측쇄기는 모두 동일해도 되고, 달라도 된다.
-(CO-CR3H-NH)n-H …(5’)
또한, 상기 식(4’)에 있어서, R7은 수산기, 아미노산 잔기 또는 펩티드 잔기이며, 예를 들면, 하기 식(4’)로 표시할 수 있다. 또한, 하기 식(6’)에 있어서, n은 0 이상의 정수이며, R3은 전술과 마찬가지로 아미노산 측쇄기를 나타내고, 아미노산 측쇄기는 모두 동일해도 되고, 달라도 된다.
-(NH-CHR3-CO)n-0H …(6’)
상기 당화된 아미노산 측쇄에 특이적으로 작용하는 FAOD-S로는, 예를 들면, 푸사리움 속 유래 FAOD(일본생물공학회대회 헤이세이 12년도 「Fusarium oxysporum 유래 아미노산 옥시다아제의 기질 특이성의 변환；후지와라 마키 외」) 등을 들 수 있다.
또한, FAOD는, 상기 (1’) 이외의 기질 특이성을 더 가지고 있어도 된다. 이러한 FAOD로는, 전술과 같은 FAOD-αS를 들 수 있다. 이러한 FAOD의 경우, 예를 들면, 국제 공개 제 2002／006519호 팜플렛에 기재된 프로테아제 등과 같이, N말단의 α위 아미노기가 당화된 당화 아미노산을 생성하지 않는 프로테아제(예를 들면, 리신이나 리신을 포함하는 펩티드를 특이적으로 절단하는 프로테아제)를 선택하고, 이와 조합함으로써, 다른 당화 부위에의 작용을 억제하는 것이 가능하다.
GHbLys의 측정은, 우선, 상기 촉진 화합물의 존재 하에서 시료의 프로테아제 처리를 행하여, 리신 또는 리신을 포함하는 펩티드를 잘라내고, 이를 전술의 FAOD로 처리한다. 그리고, 전술과 같은 방법에 의해 Hb의 리신의 당화량을 구하고, 하기 식에 나타내는 바와 같이, 이 Hb의 리신 당화량과 시료 중의 전(全) Hb량의 비(100분율)를 산출함으로써, GHbLys(％)를 구할 수 있다.
GHbLys％=(Lys 당화량/Hb량)×100
흡광도로부터의 Lys 당화량의 산출은, 예를 들면, Hb의 리신의 이미 알려진 당화량과 흡광도의 관계를 플롯한 검량선을 이용함으로써 행할 수 있다. 예를 들면, Lys 당화량이 이미 알려진 Hb 표준액에 대해서, 전술과 동일하게 하여 흡광도 측정을 행하고, 이 표준액의 측정치와 이미 알려진 당화량의 관계를 나타내는 검량선을 작성해 둔다. 그리고, 이 검량선에 전술과 같이 측정한 흡광도를 대입함으로써, Lys당화량을 산출할 수 있다.
(HbA1c와 GHbLys의 측정)
전술과 같은 Hb의 2종류의 당화율(HbA1c 및 GHbLys)은, FAOD의 기질 특이성을 이용함으로써, 동일한 시료를 이용해 연속적으로 측정하는 것도 가능하다. 즉, Hb를 포함하는 시료에 상기 촉진 화합물의 존재 하에서 프로테아제 처리를 행하고, β쇄 N말단 발린 혹은 β쇄 N말단 펩티드와, 리신 혹은 리신을 포함하는 펩티드를 잘라낸다. 그리고, 우선,α-아미노기의 당화 부분(예를 들면, 발린의 당화 부분)에 특이적으로 작용하고 또한 아미노산 측쇄의 당화 부분에는 작용하기 어려운 FAOD-α로 처리함으로써, HbA1c를 측정한다. 그 후, 또한, 아미노산 측쇄의 당화 부분(리신 측쇄의 당화 부분)에 특이적으로 작용하고 또한 α-아미노기의 당화 부분에는 작용하기 어려운 FAOD-S로 처리함으로써, GHbLys를 측정하면 된다. 또한, FAOD의 처리 순서는, 이에는 제한되지 않고, 예를 들면, FAOD-S로 처리함으로써 GHbLys를 측정한 후, FAOD-α로 처리함으로써 HbA1c를 측정해도 된다.
HbA1c나 GHbLys와 같은 혈구 내 단백질의 당화율을, 전혈 시료를 이용해 측정하는 경우, 전술과 같이 상기 촉진 화합물을 사용함으로써, 또한 이하와 같은 효과를 얻는 것도 가능하다. 혈구 내 단백질의 당화율 측정에 있어, 전혈 시료는 용혈 처리를 실시해 용혈 시료로서 사용된다. 이 때, 용혈 시료 중에는 혈청 중의 당화 단백질(예를 들면, 당화 알부민)이 공존하는데, 상기 촉진 화합물의 존재 하에서 프로테아제 처리를 행하면, 메카니즘은 명확하지 않지만, 전술과 같은 당화 Hb의 절단은 촉진되면서, 당화 알부민의 절단은 억제된다. 이 때문에, 예를 들면, 당화 알부민 등이 혼재하고, 그 당화 부위에도 FAOD가 작용한다고 하는 문제도 회피할 수 있다. 또한, 이러한 문제는, 예를 들면, 프로테아제가 Hb과 알부민 모두 에 작용하고, 또한, 후에 첨가하는 FAOD가 모든 단백질 절단물에 작용하는 경우에 생기는 것이다. 따라서, 이 문제는, 전술과 같이 목적 단백질의 목적 부위(FAOD가 작용하는 당화 아미노산이나 당화 펩티드)를 선택적으로 잘라내는 프로테아제를 선택함으로써 해소할 수 있다.
이상과 같은 본 발명의 당화율의 측정에 있어서, 각 처리 공정은 전술과 같이 따로 따로 행해도 되지만, 예를 들면, 이하에 나타내는 조합으로 각 처리를 동시에 행해도 된다. 또한, 프로테아제, FAOD, POD, 발색 기질의 첨가 순서도 특별히 제한되지 않는다.
1：용혈 처리＋프로테아제 처리
2：프로테아제 처리＋FAOD 처리
3：FAOD 처리＋POD 처리
4：프로테아제 처리＋FAOD 처리＋POD 처리
다음에, 본 발명의 단백질 절단 촉진제는, 전술과 같이, 프로테아제에 의한 단백질로부터의 아미노산 또는 펩티드의 절단을 촉진하는 촉진제이며, 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 촉진 화합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 단백질 절단 촉진제는, 상기 화합물을 포함하고 있으면 되고, 이것만으로도 되고, β쇄 N말단 펩티드 등의 절단에 영향을 주지 않는 것이면 다른 물질을 포함해도 된다. 다른 물질로는, 예를 들면, 아질산과 같은 니트로 화합물을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 촉진제에 있어서의 상기 화합물의 농도는 특별히 제한되지 않고, 시료에 첨가했을 때에 전술과 같은 농도가 되는 농도이면 된다.
이하, 실시예 및 비교예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
상기 식(Ⅰ)로 표시되는 다양한 화합물 존재 하에서 Hb의 절단을 행하고, 효소법에 의해 HbA1c를 측정했다. 측정에 이용한 시료, 시약 및 측정 방법을 이하에 나타낸다. 또한, 하기 제1 시약(R1-1)에 있어서의 화합물로는, 하기 No. 1-9의 화합물을 사용하고, No.10은 화합물 미첨가(정제수)로 했다.
<표 1>
Figure 112007084922680-pct00002
(시료)
(1)HbAO 시료
건강한 정상인의 Hb를 강한 양이온 교환 칼럼(상품명 POROS-HS50：어플라이드바이오시스템즈사 제)에 제공하고, 정법(定法)에 따라 잘라낸 HbAO을 정제 회수했다. 이 시료는, HbA1c％가 0％, 헤모글로빈 농도가 2g／L이었다.
(2) 저 HbA1c 시료
당뇨병 환자의 혈구에 등량의 정제수를 첨가해 혈구를 용혈시켜, 원심 분리에 의해 혈구막을 제거한 것을 시료로 했다. 이 시료는, HbA1c％가 12％, 헤모글로빈 농도가 2g／L이었다.
(3) 고 HbA1c 시료
건강한 정상인의 Hb를 강한 양이온 교환 칼럼(상품명 POROS-HS50：어플라이드 바이오 시스템즈사 제)에 제공하고, 잘라낸 HbA1c를 정제 회수했다. 이 시료는, HbA1c％가 30％, 헤모글로빈 농도가 2g／L이었다.
또한, 상기 각 시료의 HbA1c％는, 측정 장치(상품명 HA-8160：아크레이사 제)로 측정하고, 헤모글로빈 농도는, 상법(常法)인 알칼리 헤마틴법으로 측정했다.
(방법)
상기 각 시료 15μL와 각 제1 시약(R1-1) 76μL를 혼합하여 37℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 다시 제2 시약(R2-1) 26μL를 첨가하여 37℃에서 프로테아제 처리 및 발색 반응을 행했다. 그리고, 제2 시약 첨가 직전의 반응액에 있어서의 파 장 571nm의 흡광도(A0)와, 제2 시약의 첨가 1.5분 후의 반응액에 있어서의 파장 571nm의 흡광도(A1.5)를, 생화학 자동 분석 장치(상품명 JCA-BM8：니폰덴시사 제, 이하 동일)에 의해 측정하고, 그 차(A1.5-A0)를 구했다. 이들 결과를 하기 표 2에 나타낸다.
<표 2>
Figure 112007084922680-pct00003
상기 표 2에 나타내는 바와 같이, 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 화합물(No.1∼5)을 이용하면, 각 시료에 있어서의 HbA1c％의 증가에 따라서 흡광도가 증가했다. 이는 HbA1c의 특징인 β쇄 N말단 펩티드가, 단시간(5분)에 잘려, FAOD가 작용한 것을 의미한다. 이에 대해서, 상기 식(Ⅰ)에 있어서의 R(직쇄 알킬)의 탄소수가 9 미만인 화합물(No.6 및 7), 담즙산(No.8), 당 잔기를 가지지 않는 일반적인 계면 활성제(No.9)를 사용한 경우, 또한, 상기(Ⅰ)로 표시되는 화합물의 비존재 하(No.10)에서는, 각 시료에 있어서의 HbA1c％의 증가에 수반하는 흡광도 증가는 볼 수 없었다. 즉, 단시간에 N말단 펩티드의 절단을 효율적으로 행하는 것은 불가능했다.
실시예 2
실시예 1에 있어서의 제1 시약(R1-1)에, 다시 NaNO2를 첨가한 제1 시약(R1-2)을 조제하고, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 흡광도의 측정을 행했다. 이 결과를 하기 표 4에 나타낸다. 또한, 제1 시약(R1-1)을 사용한 실시예 1의 결과도, 하기 표 4에 맞추어 나타낸다.
<표 3>
Figure 112007084922680-pct00004
<표 4>
Figure 112007084922680-pct00005
상기 표 4에 나타내는 바와 같이, 아질산을 더 첨가함으로써, 한층 더한 흡광도의 증가를 볼 수 있다. 이 결과로부터, 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 화합물에 더하여 아질산을 병존시킴으로써, β쇄 N말단 펩티드의 절단을 보다 한층 촉진할 수 있는 것을 알 수 있다.
실시예 3
HbA1c의 표준 물질을 이용해, 본 발명의 HbA1c 측정 방법의 측정 정밀도를 확인했다.
(시료)
표준 물질로서, HbA1c 측정용 실시료(實試料) 표준 물질(JDS HbA1c Lot2：복지·의료 기술진흥회 제), 인증 HbA1c 캘리브레이터(HbA1c 표준화 IFCC 워킹그룹 제), 및, 인증 HbA1c 컨트롤(HbA1c 표준화 IFCC 워킹그룹 제)을 사용하고, 이들을 정제수로 25배 희석한 것을 표준 시료로 했다.
(방법)
상기 각 표준 시료 13μL와 제1 시약(R1-3) 78μL를 혼합하여 37℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 다시, 상기 실시예 1과 동일한 제2 시약(R2-1) 26μL를 첨가하여 37℃에서 프로테아제 처리 및 발색 반응을 행했다. 그리고, 제2 시약 첨가 직전의 반응액에 있어서의 파장 571nm의 흡광도(A0)와, 제2 시약의 첨가 1.5분 후의 반응액에 있어서의 파장 571nm의 흡광도(A1.5)를, 상기 생화학 자동 분석 장치에 의해서 측정하고, 그 차(A1.5-A0)를 구했다. 그리고, 이 흡광도 차로부터 이하와 같이 하여 HbA1c％를 산출하고, 이 산출 결과와, 상기 표준 시료의 HbA1c％ 표시값과의 상관관계를 확인했다. 상기 흡광도 차로부터 구한 HbA1c％와 표시값의 결과를, 하기 표 6과 도 1의 그래프에 나타낸다.
(HbA1c％의 산출 방법)
표준 시료의 Hb농도의 표시값에, HbA1c％의 표시값을 곱함으로써, HbA1c 농도를 산출했다. 이 값을 HbA1c 농도의 표시값으로 한다. 이 표준 시료의 HbA1c 농도 표시값과 표준 시료의 흡광도 차로부터 1차 상관식을 구하고, 이를 검량선으로 했다. 그리고, 이 검량선을 이용해 흡광도 차(A1.5-A0)로부터 HbA1c 농도를 산출하고, 이 HbA1c 농도 산출값을 Hb 농도로 나누어 100배 함으로써 HbA1c％를 구했다. 또한, Hb 농도는, 다음과 같이 하여 산출했다. 우선, 제2 시약 첨가 직전의 반응액에 있어서의 파장 571nm의 흡광도(A0)를 이용해, Hb 농도의 표시값과의 일차 상관식을 구하고, 검량선을 작성했다. 그리고, 이 검량선을 이용해, A0로부터 Hb 농도를 산출했다.
<표 5>
Figure 112007084922680-pct00006
<표 6>
Figure 112007084922680-pct00007
동 도면에 도시하는 바와같이, 흡광도로부터의 산출값과 표준 시료의 표시값의 상관 계수는 0.995로 높고, 매우 뛰어난 상관 관계를 나타냈다. 이 결과로부터, 본 발명의 측정 방법에 의하면, HbA1c％를 정확하게 측정할 수 있다고 할 수 있다.
실시예 4
n-도데실-β-D-말토사이드의 존재 하에서 Hb를 프로테아제 처리하고, N말단 디펩티드(프룩토실-Val-His)가 절단되어 있는지 여부를 확인했다.
<표 7>
Figure 112007084922680-pct00008
(시료)
상품명 Hemoglobin A1c P186-4(HbA1c％=44％, SCIPAC사 제)와 상품명 Hemoglobin(HbA1c이 본질적으로 없음) P2111-3(HbA1c％=0％, SCIPAC사 제)을 사용했다.
(HPLC)
HPLC 칼럼은, 상품명 YMC PACK ODS-AM 250×6.0(YMC사 제)을 사용하고, 용리액은, A액(체적비 KH2PO4：메탄올=100：2) 및 B액(체적비 KH2PO4 : 메탄올=100：100)을 각각 사용했다. 샘플량은 100μL, 검출 파장은 215nm, 용리액의 유속은 유속 1mL／분으로 하고, 용리 개시부터 2분까지 A액(100％)을 사용하고, 이로부터 10분에 걸쳐 B액의 체적 비율을 100％로 상승시키고, 다시 15분간 B액(100％)을 사용했다. HPLC의 표준 시료로는, Val-His(Bachem사 제), 및, 상기 Val-His와 글루코오스로부터 상법(常法)에 의해 조제한 프룩토실-Val-His를 사용했다. 또한, Val-His의 체류 시간(retention time)은 약 6.4분이며, 프룩토실 Val-His의 체류 시간은 약 10.3분이다.
상기 각 시료 520μL와 제1 시약(R1-4) 1560μL를 혼합하여 37℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 다시 상기 제2 시약(R2-4) 520μL를 첨가하여 37℃에서 1분간 프로테아제 처리를 행했다. 이 반응액을 울트라프리 4필터 유닛(분자량 5000：밀리포어사 제)으로 옮겨 원심 여과(4℃, 3000rpm, 20분)하여, 얻어진 여과액을 샘플로서 HPLC에 제공했다. 이 결과를 도 2에 나타낸다. 동 도면은, 샘플의 크로마토그 램이며, 동 도면(A)는 HbA1c％=44％의 시료를 사용한 결과, 동 도면(B)는, HbA1c％=0％의 시료를 사용한 결과를 나타낸다.
HbA1c=44％의 시료의 결과를 나타내는 동 도면(A)는, HbA1c％=0％의 시료의 결과를 나타내는 동 도면(B)와 비교하면, Val-His(VH)의 피크보다 프룩토실-Val-His(F-VH)의 피크가 높게 검출되었다. 이로부터, HbA1c의 N말단보다, 당화된 Val-His(프룩토실-Val-His)가 매우 단시간(1분간)에 효율적으로 절단되는 것을 알 수 있다.
실시예 5
화합물로서 도데실말토사이드류의 검토를 행했다. 또한, 하기 제1 시약(R1-5)에 있어서의 화합물로는, 하기 표에 나타내는 것(No.1~6)을 사용했다.
<표 8>
Figure 112007084922680-pct00009
(시료)
건강한 정상인으로부터 채혈한 전혈과, 당뇨병 환자로부터 채혈한 전혈로부터 각각 혈구를 회수하고, 등량의 정제수를 첨가해 혈구를 용혈시키고, 원심 분리에 의해 혈구막을 제거한 것을 시료로 했다. 건강한 정상인 유래의 시료는, HbA1c％=3.5％이며, 당뇨병 환자 유래의 시료는, HbA1c％=8.5％였다.
(방법)
상기 각 시료 13μL와 각 제1 시약(R1-5) 78μL를 혼합하여 37℃에서 5분간 배양한 후, 다시 제2 시약(R2-5) 26μL를 첨가하여 37℃에서 4분간, 프로테아제 처리를 행했다. 다시 제3 시약(R3-5) 15μL를 첨가하여 발색 반응을 행했다. 제3 시약 첨가 직전의 반응액에 있어서의 파장 571nm의 흡광도(A0)와, 제3 시약의 첨가 1.5분후의 반응액에 있어서의 파장 571nm의 흡광도(A1.5)를, 상기 생화학 자동 분석 장치에 의해 측정하고, 그 차(A1.5-A0)를 구했다. 이들 결과를 하기 표 9에 나타낸다.
<표 9>
Figure 112007084922680-pct00010
상기 표 9에 나타내는 바와 같이, 직쇄 알킬의 탄소수가 9 미만인 화합물(No.1)을 사용한 경우, 건강한 정상인 시료와 당뇨병 환자 시료는 HbA1c값이 다름에도 불구하고, 동일한 정도의 흡광도 밖에 얻을 수 없었다. 이는 β쇄 N말단 펩티드가 효율적으로 잘려져 있지 않은 것을 나타낸다. 이에 대해서, 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 화합물(No.2~6)을 사용한 경우, 양 시료간에서 흡광도에 차이를 볼 수 있어, β쇄 N말단이 효율적으로 잘려진 것을 알 수 있다.
실시예 6
n-도데실-β-D-말토사이드와 조합하는 프로테아제의 종류에 대해 검토했다.
<표 10>
Figure 112007084922680-pct00011
상기 제2 시약(R2-6)에 있어서의 프로테아제로는, 이하의 것(No.1-6)을 사용했다.
No.1 메탈로프로테아제(아크레이사 제) 1300KU／L
No.2 프로테아제 A 「아마노」G(아마노엔자임사 제) 0.1g／L
No.3 프로테아제 M 「아마노」G(아마노엔자임사 제) 0.1g／L
No.4 프로테아제 S 「아마노」G(아마노엔자임사 제) 0.1g／L
No.5 펩티다아제 R(아마노엔자임사 제) 0.1g／L
No.6 파파인 M-40(아마노엔자임사 제) 0.1g／L
(시료)
(1)HbAO 시료
상품명 Hemoglobin(HbA1c가 본질적으로 없음) P2111-3(HbA1c％=0％, SCIPAC 사 제)를 정제수로 25배 희석(체적)한 것을 시료로 했다. 이 시료는, HbA1c％가 0％였다.
(2) 저 HbA1c 시료
당뇨병 환자의 혈구에 정제수를 25배 체적량 첨가하여 용혈시킨 것을 시료로 했다. 이 시료는, HbA1c％가 8.5％였다.
(3)고 HbA1c 시료
상품명 Hemoglobin A1c P186-4(HbA1c％=44％, SCIPAC사 제)를 정제수로 25배 희석(체적)한 것을 시료로 했다. 이 시료는, HbA1c％가 44％였다.
(방법)
상기 각 시료 13μL와 제1 시약(R1-6) 78μL를 혼합하여 37℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 제2 시약(R2-6) 26μL를 첨가하여 37℃에서 프로테아제 처리 및 발색 반응을 행했다. 그리고, 제2 시약 첨가 직전의 반응액에 있어서의 파장 571nm의 흡광도(A0)와, 제2 시약의 첨가 10분후의 반응액에 있어서의 파장 571nm의 흡광도(A10)를, 상기 생화학 자동 분석 장치에 의해서 측정하고, 그 차(A10-A0)를 구했다. 이들 결과를 하기 표 11에 나타낸다.
<표 11>
Figure 112007084922680-pct00012
상기 표 11에 나타내는 바와 같이, 각 시료의 HbA1c％의 증가에 따라서 흡광도가 증가한 것으로부터, 각종 프로테아제가 사용 가능하다는 것을 알 수 있다.
실시예 7
도데실-β-D-말토사이드의 존재 하에서 Hb의 프로테아제 처리를 행하고, 얻어진 단편을 이용해 면역법에 의해 HbA1c를 측정했다.
<표 12>
Figure 112007084922680-pct00013
라텍스 시약：상품명 코바스 시약 HbA1c, R2(로슈사 제)
응집 시약：상품명 코바스 시약 HbA1c, R3(로슈사 제)
용혈 시약：상품명 HbA1c 용혈 시약 「롯슈」(로슈사 제)
(표준 시료·혈구 시료)
Hb의 β쇄 N말단의 펩티드 배열(6잔기：Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu)로서, Val의 α-아미노기를 정법(定法)에 의해 당화시킨 것을 표준 물질로 하고, 이를 6μmol／L가 되도록 용혈 시약에 용해하여 표준 시료를 조제했다. 또한, 혈구 시료로는, 당뇨병 환자의 혈구(HbA1c％=11.6％, HbA1c 농도 5.10μmol／L, Hb농도=2.2mmol／L)를 사용했다.
시료(표준 시료, 혈구 시료) 10μL와 프로테아제 시약(시약 A(-), 시약 B(＋)) 500μL를 혼합해 용혈 시료를 조제하고, 이를 37℃에서 소정 시간(10분, 150분, 270분) 처리했다. 처리 후의 용혈 시료 30μL에 정제수 120μL를 첨가하여 희석액을 조제하고, 상기 희석액 2μL에 상기 라텍스 시약 80μL를 첨가해 37℃에서 5분간 처리하고, 다시 응집 시약 16μL를 첨가했다. 그리고, 이 반응액에 대해서, 상기 응집 시약을 첨가 후 30초~60초간의 흡광도 변화(파장 545nm)를 측정했다. 그리고, 시약 키트(코바스 시약 HbA1c)의 사용 설명서에 따라서, 흡광도로부터 HbA1c 농도를 산출했다. 또한, 컨트롤로서 시료에 대신해 정제수를 사용하고, 동일하게 하여 흡광도 측정을 행했다. 이들 결과를 하기 표 13에 나타낸다. 하기 표에 있어서 (＋)는 도데실-β-D-말토사이드 첨가, (－)는 도데실-β-D-말토사이드 무첨가를 나타낸다.
<표 13>
Figure 112007084922680-pct00014
상기 표 13(B)에 나타내는 바와 같이, 도데실-β-D-말토사이드를 첨가한 시 약 B(＋)를 사용한 경우, 혈구 시료와 정제수에 있어서의 흡광도의 차는, 프로테아제 처리 시간의 증가에 수반해 증가했다. 또한, 상기 표 13(A)에 나타내는 표준 시료의 결과(흡광도 차)를 이용해, 270분 처리한 경우의 흡광도 차로부터 환산한 HbA1c 농도는, 5.07μmol／L이며, 미리 구한 당뇨병 환자 시료의 HbA1c 농도(5.1μmol／L)와 거의 일치하므로, 270분의 처리에 의해서 완전하게 β쇄 N말단 펩티드를 잘라낸 것을 알 수 있다. 이에 대해서, 도데실-β-D-말토사이드 무첨가 시약 A(－)를 사용한 경우 , 프로테아제 처리 시간의 증가에 의해 완만한 흡광도 상승을 볼 수 있었지만, 270분의 프로테아제 처리를 행한 경우의 HbA1c 농도 환산값은 0.96μmol／L이며, 미리 구한 당뇨병 환자 시료의 HbA1c 농도의 약 1／5 정도에 머물러 있다. 이 결과로부터, 본 발명의 Hb 절단 방법에 의하면,β쇄 N말단을 효율적으로 잘라낼 수 있고, 또한, 면역법에 의한 HbA1c 측정에도 유효하다고 할 수 있다.
실시예 8
출원인들이 별도 출원하고 있는 테트라졸륨 화합물을 이용해 프로테아제에 의한 절단을 촉진하는 방법(WO O2/027012)과, 본 발명에 있어서의 촉진 화합물을 이용한 방법에 관해서, HbA1c 측정에 있어서의 효과를 비교했다. 상기 테트라졸륨 화합물로는, 2-(4-요오드페닐)-3-(2, 4-디니트로페닐)-5-(2, 4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨 모노나트륨염(상품명 WST-3, 도진카가쿠겐큐쇼사 제)을 사용했다.
또한, 하기 제1 시약(R1-8)에 있어서의 화합물로는, 실시예로서 n-도데실-β-D-말토사이드(화합물 No.1), 참고예로서 WST-3(화합물 No.2)를 사용했다. 또한, 화합물을 첨가하지 않은 것(No.3：정제수)을 비교예로 했다.
<표 14>
Figure 112007084922680-pct00015
(시료)
건강한 정상인의 전혈을 정제수로 31배 희석한 것, 및, 하기 상품을 정제수로 31배 희석한 것을 시료로 했다. 시료의 컨트롤로서 정제수를 사용했다.
IFCC control Barcelona, Low HbA1c, Normal Hemoglobin(HbA1c％=3.2％)
IFCC control Barcelona, Medium HbA1c, Medium Hemoglobin(HbA1c％=5.1％)
IFCC control Barcelona, High HbA1c, Normal Hemoglobin(HbA1c％=7.5％)
(방법)
상기 각 시료 6.5μL와 정제수 6.5μL를 혼합하고, 다시 각 제1 시약(R1-8) 78μL를 혼합했다. 이 혼합액을 37℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 제2 시약(R2-8) 19.5μL를 첨가하여 37℃에서 프로테아제 처리 및 발색 반응을 행했다. 그리고, 제2 시약 첨가 직전의 반응액에 있어서의 파장 658nm의 흡광도(A0)와, 제2 시약의 첨가 5분후의 반응액에 있어서의 파장 658nm의 흡광도(A5)를, 생화학 자동 분석 장치(상품명 JCA-BM8：니폰덴시사 제)에 의해 측정하고, 그 차(A5-A0)를 구했다. 이들 결과를 하기 표 15에 나타낸다. 하기 표 15에 있어서, 괄호 내의 수치는, 시료 컨트롤 (정제수)의 결과와의 차이를 나타낸다.
<표 15>
Figure 112007084922680-pct00016
상기 표 15에 나타내는 바와 같이, 촉진 화합물을 첨가하지 않은 비교예(No.3)에서는 흡광도의 증가를 볼 수 없는데 반해, n-도데실-β-D-말토사이드를 이용한 실시예(No.1)에 의하면, 각 시료에 있어서의 HbA1c％의 증가에 따라서 흡광도가 증가했다. 이는 HbA1c의 특징인 β쇄 N말단 펩티드가, 단시간(5분)에 잘려지고, FA0D가 작용한 것을 의미한다. 또한, WST-3을 첨가한 참고예(No.2)에서는, 5분이라고 하는 매우 단시간의 처리에서는 HbA1c％의 증가에 수반하는 흡광도 증가를 볼 수 없었다. 이상의 결과로부터, n-도데실-β-D-말토사이드에 의하면, 절단 에 요하는 시간을, 종래 기술보다 현격히 단축화할 수 있는 것을 알 수 있다.
실시예 9
n-도데실-β-D-말토사이드의 존재 하에서 Hb의 절단을 행하고, 효소법에 의해서, HbA1c와 GHbLys를 연속적으로 측정했다. 또한, FAOD는, α위가 당화된 펩티드(β쇄 N말단 펩티드)에 특이적으로 작용하는 FPOX-CE(상품명；키코망사 제)와, ε위가 당화된 펩티드(리신펩티드)에 특이적으로 작용하는 FAODL(상품명；아크레이 사 제)를 조합하여 사용했다.
<표 16>
Figure 112007084922680-pct00017
(시료)
건강한 정상인의 전혈을 하기 희석액으로 31배 희석한 것, 및, 하기 상품을 하기 희석액으로 31배 희석한 것을 시료로 했다. 시료의 컨트롤로서 정제수를 사용했다.
IFCC control Barcelona, Low HbA1c, Normal Hemoglobin(HbA1c％=3.2％)
IFCC control Barcelona, Medium HbA1c, Medium Hemoglobin(HbA1c％=5.1％)
IFCC control Barcelona, High HbA1c, Normal Hemoglob㎞(HbA1c％=7.5％)
(희석액)
PIPES 30mmol／L(pH7)
n-도데실-β-D-말토사이드 0.5g／L
KNO2 3mM
(방법)
상기 각 시료 6.5μL와 정제수 6.5μL를 혼합하고, 다시 각 제1 시약(R1-9) 78μL를 혼합했다. 이 혼합액을 37℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 제2 시약(R2-8) 19.5μL를 첨가하여 37℃에서 4분간 프로테아제 처리 및 제1 단계째의 발색 반응을 행했다. 이 반응 후, 다시, 제3 시약(R3-9) 19.5μL를 첨가하고, 제2 단계째의 발색 반응(37℃, 6분간)을 행했다. 그리고, 제2 시약 첨가 직전의 반응액에 있어서의 파장 658nm의 흡광도(A0)와, 제2 시약의 첨가 4분 후(제3 시약 첨가 직전)의 반응액에 있어서의 파장 658nm의 흡광도(A4), 및, 제3 시약의 첨가 6분 후의 반응액에 있어서의 파장 658nm의 흡광도(A10)를, 생화학 자동 분석 장치(상품명 JCA-BM8：니폰덴시사 제)에 의해 측정하고, 그 차(A4-A0) 및 (A10-A4)을 구했다.
이들 결과를 하기 표 17에 나타낸다. 표 17에 있어서, (A4-A0)의 흡광도는, HbA1c에 대응하고, (A10-A4)의 흡광도는 GHbLys에 대응한다. 괄호 내의 수치는, 시료 컨트롤(정제수)의 결과와의 차를 나타낸다.
<표 17>
Figure 112007084922680-pct00018
전술과 같이, FPOX-CE는, β쇄 N말단 펩티드에 반응하고, FAODL는, ε위 당화 리신펩티드에 반응하는데, β쇄 N말단 펩티드에 반응하지 않는 것이 알려져 있다. 이 때문에, n-도데실-β-D-말토사이드의 존재 하에서의 프로테아제 처리에 의해, Hb로부터 β쇄 N말단 펩티드와 ε위 당화 리신펩티드가 잘려지는데, 기질 특이성이 다른 2종류의 FAOD를 사용함으로써, 이들을 연속적으로 측정하는 것이 가능하다. 여기서, 표 17의 결과를 보면, 각 FAOD 처리 후의 흡광도가, 각 시료의 HbA1c％의 증가에 따라서 증가하는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 실시예의 방법에 의해, 2종류의 당화율이 연속적으로 측정 가능하다고 할 수 있다.
이상과 같이, 본 발명의 단백질의 절단 방법에 의하면, 예를 들면, HbA1c의 특징 부분인 β쇄 N말단 펩티드 등을 신속하게 잘라낼 수 있으므로, 좋은 정밀도로 단백질의 당화량(糖化率)을 결정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 절단 방법 이나 당화량 측정 방법은, 임상 검사의 분야 등에 있어서 매우 유용하다.

Claims (25)

  1. 프로테아제에 의해서 헤모글로빈으로부터 아미노산 또는 펩티드를 절단하는 방법으로서,
    하기 식(Ⅰ)로 표시되는 화합물의 존재 하에서, 헤모글로빈을 프로테아제 처리하는 것을 특징으로 하는 단백질 절단 방법.
    R-X …(Ⅰ)
    상기 식(Ⅰ)에 있어서,
    R은, 탄소수 9~16의 직쇄 알킬 혹은 직쇄 아실, 탄소수 10~40이며 주쇄 탄소수가 9~16인 분지쇄 알킬 혹은 분지쇄 아실, 또는, 탄소수 3~8의 시클로알킬로 치환된 직쇄 탄소수가 4~13인 직쇄 알킬이고,
    X는 당 잔기이다.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 식(Ⅰ)에서, X는, 단당(單糖) 또는 이당(二糖)의 당 잔기인, 단백질 절단 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 식(Ⅰ)에서, X는, 만노사이드, 말토사이드, 프룩토피라노실-글루코피라노사이드 및 티오말토사이드로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1개의 당 잔기인, 단백질 절단 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 화합물이, 6-시클로헥실헥실-β-D-말토사이드, 수크로오스 모노라우레이트, n-데실-β-D-말토사이드, n-도데실-β-D-말토사이드, n-노닐-β-D-티오말토사이드, 헥사데실-β-D-말토사이드, 5-시클로헥실펜틸-β-D-말토사이드, 운데실-β-D-말토사이드, 3-옥사트리데실-α-D-만노사이드, 및, 도데실-αβ-D-말토사이드로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1개의 화합물인, 단백질 절단 방법.
  6. 삭제
  7. 청구항 1에 있어서,
    헤모글로빈으로부터 절단되는 아미노산이, β쇄 N말단 발린(valine), 리신(lysine) 및 이들의 당화(糖化)물로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나이며, 헤모글로빈으로부터 절단되는 펩티드가, β쇄 N말단 발린을 포함하는 펩티드, β쇄 N말단 당화 발린을 포함하는 펩티드, 리신을 포함하는 펩티드 및 당화 리신을 포함하는 펩티드로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1개인, 단백질 절단 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    단백질로부터 절단되는 펩티드가, 아미노산 잔기 수 2~6의 펩티드인, 단백질 절단 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 헤모글로빈을 프로테아제로 절단하는 공정, 얻어진 헤모글로빈 절단물의 당화 부분에 프룩토실 아미노산 옥시다아제를 작용시키는 공정, 및, 상기 당화 부분과 프룩토실 아미노산 옥시다아제와의 산화 환원 반응을 측정함으로써, 헤모글로빈의 당화율(糖化率)을 결정하는 공정을 포함하는 헤모글로빈의 당화율 측정 방법으로서,
    상기 헤모글로빈의 절단을, 청구항 1 기재의 헤모글로빈 절단 방법에 의해 행하고, 상기 절단 공정에 의해 얻어진 아미노산 또는 펩티드의 당화 부분에 상기 프룩토실 아미노산 옥시다아제를 작용시키는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈의 당화율 측정 방법.
  12. 삭제
  13. 청구항 11에 있어서,
    헤모글로빈의 당화율이, HbA1c값인, 헤모글로빈의 당화율 측정 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 단백질 절단물이, β쇄 N말단 발린 또는 β쇄 N말단 발린을 포함하는 펩티드로서, β쇄 N말단 발린의 당화 부분에 프룩토실 아미노산 옥시다아제를 작용시키는, 헤모글로빈의 당화율 측정 방법.
  15. 청구항 11에 있어서,
    헤모글로빈의 당화율이, 리신 당화율인, 헤모글로빈의 당화율 측정 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 헤모글로빈 절단물이, 리신 또는 리신을 포함하는 펩티드로서, 리신의 당화 부분에 프룩토실 아미노산 옥시다아제를 작용시키는, 헤모글로빈의 당화율 측정 방법.
  17. 청구항 11 에 있어서,
    시료 중에 포함되는 헤모글로빈의 당화율을 측정하는 방법으로서, 상기 시료가, 전혈 시료, 혈구 시료, 또는, 이들의 용혈 시료인, 헤모글로빈의 당화율 측정 방법.
  18. 청구항 11에 있어서,
    프로테아제에 의한 헤모글로빈의 절단에 앞서, 헤모글로빈을 포함하는 시료에 상기 식(Ⅰ)로 표시되는 화합물을 첨가하고,
    상기 화합물을 첨가한 시료의 광학적 변화량을 측정하여 이 광학적 변화량으로부터 상기 시료 중의 헤모글로빈 양을 산출하고,
    한편, 상기 화합물이 첨가된 시료 중의 헤모글로빈을 프로테아제에 의해서 절단한 후, 상기 절단물의 당화 부분과 프룩토실 아미노산 옥시다아제의 산화 환원 반응을 측정함으로써 헤모글로빈의 당화량을 측정하고,
    상기 헤모글로빈 양과 상기 당화량으로부터 Hb의 당화율을 구하는, 헤모글로빈의 당화율 측정 방법.
  19. 프로테아제에 의한 헤모글로빈으로부터의 아미노산 또는 펩티드의 절단을 촉진하는 촉진제로서,
    하기 식(Ⅰ)로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 촉진제.
    R-X …(Ⅰ)
    상기 식(Ⅰ)에 있어서,
    R은, 탄소수 9~16인 직쇄 알킬 혹은 직쇄 아실, 탄소수 10~40이며 주쇄 탄소수가 9~16인 분지쇄 알킬 혹은 분지쇄 아실, 또는, 탄소수 3~8의 시클로알킬로 치환된 직쇄 탄소수가 4~13인 직쇄 알킬이고,
    X는 당 잔기이다.
  20. 삭제
  21. 청구항 19에 있어서,
    상기 식(Ⅰ)에서, X는, 단당 또는 이당의 당 잔기인, 촉진제.
  22. 청구항 19에 있어서,
    상기 식(Ⅰ)에서, X는, 만노사이드, 말토사이드, 프룩토피라노실-글루코피라노사이드 및 티오말토사이드로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1개의 당 잔기인, 촉진제.
  23. 청구항 19에 있어서,
    상기 화합물이, 6-시클로헥실헥실-β-D-말토사이드, 수크로오스 모노라우레이트, n-데실-β-D-말토사이드, n-도데실-β-D-말토사이드, n-노닐-β-D-티오말토사이드, 헥사데실-β-D-말토사이드, 5-시클로헥실펜틸-β-D-말토사이드, 운데실-β-D-말토사이드, 3-옥사트리데실-α-D-만노사이드, 및, 도데실-αβ-D-말토사이드로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1개의 화합물인, 촉진제.
  24. 삭제
  25. 삭제
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