KR101920727B1

KR101920727B1 - 당화혈색소 측정용 칩 및 이를 이용한 당화혈색소 측정 방법

Info

Publication number: KR101920727B1
Application number: KR1020120074693A
Authority: KR
Inventors: 김상규; 이우창; 이수석; 최윤석; 정재연; 한영기
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2012-07-09
Filing date: 2012-07-09
Publication date: 2018-11-21
Also published as: KR20140008609A

Abstract

혈액 시료 중 당화혈색소의 농도를 측정하는 방법 및 혈액 시료 중 당화혈색소의 농도를 측정하기 위한 칩에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 당화혈색소 농도 측정용 칩 및 당화혈색소 농도 측정 방법에 따르면, 혈액 시료 중의 당화혈색소를 효율적으로 검출할 수 있다.

Description

당화혈색소 측정용 칩 및 이를 이용한 당화혈색소 측정 방법{Chip for detecting glycated hemoglobin and detection method of glycated hemoglobin using the same}

일 구체예는 혈액 시료 중 당화혈색소의 농도를 측정하는 방법 및 혈액 시료 중 당화혈색소의 농도를 측정하기 위한 칩에 관한 것이다.

당화혈색소는 혈액속의 혈당 수치를 나타내는 중요한 수치로 혈액 속의 포도당이 헤모글로빈과 결합하여 당화된 헤모글로빈(glycated hemoglobin)을 의미한다. 당화혈색소는 환자의 지난 2~3달 동안의 평균 혈당 농도를 나타내기 때문에 몸 안의 혈당 수치를 나타내는 가장 좋은 지표이다. 기존의 포도당(glucose)을 측정하는 혈당 측정 방법은 측정 시 공복 혹은 식사 후인지에 따라 수치가 다르게 나타날 수 있으나, 당화혈색소를 기반으로 한 측정방법은 식사 여부 등 단기적인 편차에 영향을 받지 않는다는 장점이 있다.

종래 효소를 기반으로 하는 측정방법은 헤모글로빈 β-체인 말단에 결합된 포도당이 프로테아제에 아미노산이나 펩티드의 형태로 절단된 다음, 프룩토실 아미노산 옥시다아제(FAOD)와의 반응을 통해 발생하는 과산화수소를 퍼옥시다아제 및 발색 기질을 통해 측정하는 것이다.

또한, 종래의 흡광을 기반으로 한 당화혈색소 측정 방법은 Beer-Lamber 법칙에 의해 시료를 통과하는 빛의 경로 길이 즉, 광경로 길이(optical path length)와 농도, 그리고 흡광계수(extinction coefficient)에 따라 흡광도를 결정하는 것이다. 혈당과 같이 주기적인 측정이 필요한 질병의 경우 환자가 직접 사용하거나 이동성이 측정장비의 이동성이 용이하도록 장비의 소형화가 이루어지고 있다. 측정 장비의 소형화에 따라 샘플의 양과 이에 따라 광경로 길이 또한 짧아져, 약한 흡광도를 보인다. 따라서, 짧은 광경로에서도 높은 흡광도를 나타내어 소형화 장비를 개발하려는 노력을 계속하고 있다.

일 양상은 혈액 시료 중 당화혈색소의 농도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

다른 양상은 혈액 시료 중 당화혈색소의 농도를 측정하기 위한 칩을 제공하는 것이다.

일 양상은 하나 이상의 금속 나노입자의 존재 하에 금속 이온을 포함하는 용액 및 당화혈색소 및 프룩토실 아미노산 옥시다아제의 반응 결과로부터 발생하는 과산화수소를 반응시키는 단계; 및 상기 반응 결과물의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 혈액 시료 중 당화혈색소의 농도를 측정하는 방법을 제공한다.

"당화혈색소(glycated hemoglobin)"는 헤모글로빈 베타-체인 말단에 포도당이 결합된 형태로서, 장기간 동안의 혈중 포도당 농도를 알기 위해 사용하는 혈색소의 한 형태이다. 당화혈색소는 높은 혈중 포도당 상태에 혈색소가 노출되면서 형성되므로, 당화혈색소의 수치는 당뇨병 및 신장병증, 망막병증 등의 당뇨 합병증을 판단하는 지표가 될 수 있다.

상기 방법은 먼저, 하나 이상의 금속 나노입자의 존재 하에 금속 이온을 포함하는 용액 및 당화혈색소 및 프룩토실 아미노산 옥시다아제의 반응 결과로부터 발생하는 과산화수소를 반응시키는 단계를 수행한다.

일 구체예에 따르면, 상기 당화혈색소는 프로테아제에 의해 절단된 다수의 폴리펩티드 단편으로서, 상기 다수의 폴리펩티드 단편 중 일부는 하나 이상의 포도당이 결합되어 있는 것일 수 있다.

당화혈색소는 헤모글로빈 베타-체인 말단에 포도당이 결합되어 있으므로, 이를 프로테아제로 절단할 경우, 포도당이 결합되어 있는 폴리펩티드 단편을 포함하게 된다. 상기 포도당이 결합되어 있는 폴리펩티드 단편과 프룩토실 아미노산 옥시다아제(fructosyl amino acid oxidase)가 반응하게 되면, 과산화수소가 발생하게 되는데, 상기 과산화수소가 금속 이온과 반응하여 금속 이온이 환원되면 상기 환원된 금속 이온이 금속 나노입자를 형성하거나, 또는 이미 존재하는 금속 나노입자의 표면에 결합하게 되어 금속 나노입자의 크기가 증가하게 된다.

일 구체예에 따르면, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자 및 백금 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 일 구체예에 따르면, 상기 금속 이온은 금 이온, 은 이온 및 백금 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 예를 들어, 상기 금속 나노입자 및 금속 이온의 금속은 금일 수 있으며, 도 1에 일 구체예에 따른 당화혈색소 농도 측정의 원리를 나타내었다.

일 구체예에 따르면, 상기 하나 이상의 금속 나노입자는 고체 기판 상에 적층된 것일 수 있다.

상기 당화혈색소의 농도를 측정하는 방법은 예를 들어, 하나 이상의 챔버를 포함하는 고체 기판 상에서 이루어질 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 금속 나노입자는 예를 들어, 1 nm 내지 500 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 방법은 상기 반응시키는 단계 이전에 당화혈색소의 농도를 측정하고자 하는 혈액 시료를 용해(lysis)시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 즉, 측정하고자 하는 혈액 시료 중에서 적혈구 내의 당화혈색소를 분리시키기 위해 용혈제(lysis agent)를 사용할 수 있으며, 상기 용혈제는 예를 들어. 양성이온성 계면활성제(zwitterionic surfactant), 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 중성 계면활성제 및 그의 조합일 수 있다.

이후, 상기 방법은 상기 반응 결과물의 흡광도를 측정하는 단계를 수행하게 된다.

상기 반응 결과물은 이전 단계에서 과산화수소와 금속 이온과 반응하여 환원되어 형성된 금속 나노입자 또는 이미 존재하는 금속 나노입자의 표면에 결합하여 크기가 증가된 금속 나노입자를 의미하는 것으로서, 이와 같이 새롭게 생성되거나, 크기가 증가된 금속 나노입자의 흡광도를 측정하게 되면, 흡수 파장이 변화하거나, 흡광도의 증감을 유발하게 된다. 즉, 과산화수소의 발생 정도는 측정하고자 하는 혈액 중 당화혈색소의 농도와 비례하게 되므로, 상기 금속 나노입자의 형성 정도를 측정하여 정량화함으로써, 혈액 시료 중 당화혈색소의 농도를 측정할 수 있게 된다. 일 구체예에 따르면, 상기 흡광도를 측정하는 단계는 400 nm 내지 700 nm 영역대의 흡광을 측정하는 것일 수 있다.

다른 양상은 하나 이상의 챔버를 포함하는 것으로, 상기 챔버는 빛이 투과될 수 있는 상부 고체 기판, 하부 고체 기판 및 스페이서로 이루어지며, 상기 상부 고체 기판의 하부에는 금속 이온을 포함하는 용액이 도포되어 있고, 상기 하부 고체 기판은 금속 나노입자가 적층되어 있는 것인 당화혈색소 농도 측정용 칩을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 스페이서의 높이는 1 ㎛ 내지 1000 ㎛일 수 있다. 따라서, 상기 칩은 마이크로 단위로 제작되어 광경로(optical path)가 짧은 소형화된 흡광 장치에서 사용할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 고체 기판은 빛이 투과될 수 있는 기판이면 어떤 것이든 가능하며, 예를 들어, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 필름(polyethylene terephtalate film)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

일 구체예에 따르면, 상기 금속 나노입자는 1 nm 내지 500 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자 및 백금 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않으며, 상기 금속 이온은 금 이온, 은 이온 및 백금 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

일 구체예에 따른 당화혈색소 농도 측정용 칩 및 당화혈색소 농도 측정 방법에 따르면, 혈액 시료 중의 당화혈색소를 효율적으로 검출할 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 혈액 시료 중 당화혈색소의 농도를 측정하는 방법의 원리를 나타낸 것이다.
도 2는 일 구체예에 따른 혈액 시료 중 당화혈색소의 농도를 측정하는 방법에 의해 측정된 당화혈색소의 농도에 따른 흡광도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 당화혈색소 농도 측정용 칩의 평면도이다.
도 4는 일 구체예에 따른 당화혈색소 농도 측정용 칩의 단면도이다.
도 5는 일 구체예에 따른 당화혈색소 농도 측정용 칩을 사용하여 측정한 당화혈색소의 농도에 따른 흡광도의 변화를 나타낸 그래프이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 당화혈색소 측정을 위한 웰-플레이트 어세이

당화혈색소 농도가 다른 전혈(whole blood)(3.1, 4, 8.4 및 15%)(Bio-rad)을 용혈제(hemolysis buffer)를 이용하여 10분 동안 용해시킨 후, 상기 용해물(lysate) 12.5 ul와 Bacillus sp. 프로테아제(Diazyme)가 포함된 용액 80 ul를 96-웰 플레이트에서 5분 동안 반응시켰다. 여기에 0.35 nM의 BSA(bovine serum albumin)으로 표면 코팅된 30 nm 금 나노입자 25 ul와 20 mM HAuCl4 25 ul를 넣고 기포가 발생하지 않도록 혼합 후, 530 nm에서 흡광도(A1)를 측정하였다. 이후, 106.4 U/ml FAOD(fructosyl amino acid oxidase)(Diazyme) 5 ul를 혼합하고, 6분 동안 반응시킨 후, 530 nm에서 흡광도(A2)를 측정하였다. FAOD에 의한 흡광도 변화값 A2 - A1을 구하여 그래프로 나타낸 결과, 당화혈색소 농도별로 흡광도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 2).

본 실시예에서 사용된 용혈제는 양성이온성 계면활성제(zwitterionic surfactant) 또는 소듐 도데실 설페이트(SDS)등과 같은 음이온성 계면활성제, 또는 세실트리메틸 암모늄브로마이드(CTAB) 등과 같은 양이온성 계면활성제 또는 Triton X-100 등과 같은 중성 계면활성제를 각각 사용하거나 혼합하여 사용할 수 있다.

실시예 2: 드라이 케미스트리(dry chemistry)용 칩 제작

도 3은 일 구체예에 따른 당화혈색소 농도 측정용 칩의 평면도이며, 도 4는 일 구체예에 따른 당화혈색소 농도 측정용 칩의 단면도이다. 도 3과 같은 패턴을 갖는 타원 모양 챔버(10)를 갖도록 폴리에틸렌 테레프탈레이트 필름(polyethylene terephtalate film)을 준비하고, 상부 고체 기판(20) 및 하부 고체 기판(30) 위에 1% 솔비톨과 1% CHAPS가 혼합된 용액 0.7 ul를 떨어뜨려 건조시킨 뒤, 상부 고체 기판(20)에는 0.7 ul의 2 mM HAuCl₄(1% 솔비톨, 1% CHAPS 버퍼)(50)을, 하부 고체 기판(30)에는 BSA가 코팅된 1.75 nM의 30 nm 금 나노입자(60) 0.7 ul를 떨어뜨려 건조시켰다. 여기서 솔비톨과 CHAPS는 시약이 균일하게 도포되는 것을 도와주며, 건조된 시약이 용혈과 만나 고르게 분산이 되도록 도와주는 역할을 한다. 스페이서(40) 역할을 하는 셀룰로스 아세테이트 멤브레인을 상부 고체 기판(20) 및 하부 고체 기판(30) 사이에 위치하도록 도 4와 같이 조립하였다.

실시예 3: 드라이 케미스트리용 칩을 이용한 당화혈색소 측정

상기 실시예 2에서 제작한 칩을 이용하여 당화혈색소 농도를 측정하였다. 당화혈색소 농도가 다른 전혈(3.1, 4, 8.4 및 15%)(Bio-rad)을 실시예 1와 동일한 용혈제를 이용하여 10분 동안 용해시켰다. 용해물 5 ul와 프로테아제가 포함된 용액 32 ul를 혼합하고, 5분 동안 반응시켜 단백질을 분해시켰다. 이후, 100 U/ml의 FAOD 2 ul를 혼합하고, 35 ul를 피펫팅하여 칩의 주입구에 넣은 다음, 플런저(plunger)를 이용하여 시약이 도포된 챔버에 상기 샘플을 이동시켰다. 챔버에서 일어나는 변화를 530 nm 파장에서 10분 동안 측정하여 OD 값을 구하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었으며, HbA1c의 농도에 따라 OD 값이 증가하는 패턴을 나타내었다.

상기 실험 결과로 보아, 상기 당화혈색소 측정 방법을 이용하면, 매우 큰 흡광계수를 가진 금 나노입자를 이용하여 짧은 광경로에서도 높은 흡광도를 나타낼 수 있으므로, 현재까지 액상 반응 키트에 국한되었던 효소법 활용 범위를 소형화 분석 장치로 확장할 수 있다.

10: 챔버
20: 상부 고체 기판
30: 하부 고체 기판
40: 스페이서
50: 금속 이온을 포함하는 용액
60: 금속 나노입자
70: 샘플 주입구

Claims

하나 이상의 금속 나노입자의 존재 하에 금속 이온을 포함하는 용액을 당화혈색소 및 프룩토실 아미노산 옥시다아제의 반응 결과로부터 발생하는 과산화수소와 반응시키는 단계; 및
상기 반응으로부터 얻은 반응 결과물의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 혈액 시료 중 당화혈색소의 농도를 측정하는 방법으로서,
상기 반응 결과물은 상기 과산화수소가 상기 금속 이온과 반응하여 상기 금속 이온이 환원되어 형성된 금속 나노입자이거나, 또는 상기 존재하는 금속 나노입자의 표면에 상기 금속 이온이 환원되어 결합하여 크기가 증가된 금속 나노입자인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 상기 당화혈색소는 프로테아제에 의해 절단된 다수의 폴리펩티드 단편으로서, 상기 다수의 폴리펩티드 단편 중 일부는 하나 이상의 포도당이 결합되어 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 반응시키는 단계 이전에 당화혈색소의 농도를 측정하고자 하는 혈액 시료를 용해시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 금속 나노입자는 고체 기판 상에 적층된 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 1 nm 내지 500 nm의 직경을 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자 및 백금 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 금속 이온은 금 이온, 은 이온 및 백금 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 흡광도를 측정하는 단계는 400 nm 내지 700 nm 영역대의 흡광을 측정하는 것인 방법.
하나 이상의 챔버를 포함하는 것으로, 상기 챔버는 빛이 투과될 수 있는 상부 고체 기판, 하부 고체 기판 및 스페이서로 이루어지며, 상기 상부 고체 기판의 하부에는 금속 이온을 포함하는 용액이 도포되어 있고, 상기 하부 고체 기판은 금속 나노입자가 적층되어 있는 것인 당화혈색소 농도 측정용 칩.
제9항에 있어서, 상기 스페이서의 높이는 1 ㎛ 내지 1000 ㎛인 것인 당화혈색소 농도 측정용 칩.
제9항에 있어서, 상기 고체 기판은 폴리에틸렌 테레프탈레이트 필름인 것인 당화혈색소 농도 측정용 칩.
제9항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 1 nm 내지 500 nm의 직경을 갖는 것인 당화혈색소 농도 측정용 칩.
제9항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자 및 백금 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 당화혈색소 농도 측정용 칩.
제9항에 있어서, 상기 금속 이온은 금 이온, 은 이온 및 백금 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 당화혈색소 농도 측정용 칩.