KR20150039050A - 시료 중의 당화단백질을 측정하는 카트리지, 시스템, 및 이를 이용한 당화단백질 측정 방법 - Google Patents

Abstract

넓은 측정 범위를 갖는 당화단백질의 농도를 측정하기 위한 카트리지, 당화단백질 측정 시스템, 및 당화단백질 측정 방법을 제공한다.

Description

시료 중의 당화단백질을 측정하는 카트리지, 시스템, 및 이를 이용한 당화단백질 측정 방법{Cartridge and system for detecting glycated protein in a sample and method for detecting the glycated protein using the same}

시료 중의 당화단백질을 효율적으로 측정하는 카트리지, 당화단백질 측정 시스템 및 이를 이용한 당화단백질 측정 방법에 관한 것이다.

당화혈색소는 헤모글로빈에 당이 결합되어 있는 것을 말한다. 헤모글로빈은 A 사슬에 당이 결합될 수 있다. 예를 들면, 당화혈색소는 A1a, A1b, A1c, 또는 이들의 조합이 있을 수 있다. A1a, A1b, 및 A1c 중 β-사슬의 N-말단의 발린 부위에 포도당이 결합된 형태인 헤모글로빈 A1c (HbA1c)가 약 60 내지 80%를 차지하는 것으로 알려져 있다.

당화혈색소는 환자의 지난 2~3달 동안의 평균 혈당 농도를 나타내기 때문에 몸 안의 혈당 수치를 나타내는 좋은 지표가 될 수 있다. 기존의 포도당을 측정하는 혈당 측정 방법은 측정 시 공복 혹은 식사 후인지에 따라 수치가 다르게 나타날 수 있으나, 당화혈색소를 기반으로 한 측정방법은 식사 여부 등 단기적인 편차에 영향을 받지 않을 수 있다.

시료 중의 당화단백질을 효율적으로 확인하는 방법 및/또는 당화단백질을 효율적으로 확인하기 위한 장치가 요구되고 있다.

일 양상은 당화단백질의 농도를 측정하기 위한 카트리지를 제공한다.

다른 양상은 당화당백질의 농도를 측정하는 시스템을 제공한다.

다른 양상은 상기 카트리지를 이용하여 시료 중의 당화단백질을 측정하는 방법을 제공한다.

일 양상은 제1 챔버 및 제2 챔버를 갖는 하나 이상의 챔버를 포함하고, 상기 챔버는 빛을 투과하는 상판, 하판 및 상기 상판과 상기 하판 사이에 위치한 스페이서를 포함하고, 상기 상판 또는 상기 하판의 표면에 당화혈색소 결합물질 및 버퍼를 포함하는 것인 당화단백질의 농도를 측정하기 위한 카트리지를 제공한다.

용어 "당화단백질"은 당화된 폴리펩티드 또는 당화된 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. "당화단백질"은 예를 들면, 당화혈색소 (glycated hemoglobin), 당화혈색소의 단편, 당화된 아미노산, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 당화혈색소는 A1a, A1b, A1c, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 카트리지에 있어서, 당화단백질 결합물질은 카트리지의 상판 및/또는 하판의 표면에 배치될 수 있다. 당화단백질 결합물질은 항체, 보론산, 콘카나발린, 또는 그의 조합일 수 있다. 상기 항체는 전체 항체, 항체 단편, 다기능성 항체 응집체 (polyfunctional antibody aggregate), 또는 그의 조합일 수 있다. 상기 항체는 항-혈색소 항체 또는 항-당화혈색소 항체일 수 있다.

상기 당화단백질 결합물질은 CHAPS 및/또는 소르비톨을 더 포함할 수 있다. 상기 CHAPS는 0.1 내지 0.5%, 0.1 내지 0.4%, 0.1 내지 0.3%, 0.1 내지 0.2%, 또는 0.15% 내지 0.2%일 수 있다. 상기 소르비톨은 1 내지 15%, 2 내지 14%, 3 내지 13%, 4 내지 12%, 5 내지 11%, 6 내지 10%, 또는 7 내지 9%일 수 있다.

또한, 상기 당화단백질 결합물질은 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 예를 들면 광 신호를 발생시키는 표지, 방사성 표지 또는 전기적 신호를 발생시키는 표지일 수 있다. 상기 표지는 예를 들면 형광 신호를 발생시키는 형광물질일 수 있다. 상기 형광물질은 Cal610, 플루오레세인 (fluorescein), 로다민 (rhodamine), Cy3 및 Cy5와 같은 시아닌 (cyanine), 또는 금속 포르피린 복합체일 수 있다. 상기 당화혈색소 결합물질은 건조된 것일 수 있다.

하나 이상의 챔버 중 각 챔버는 각각 다른 농도의 당화단백질을 측정하기 위해 구별된 챔버일 수 있다. 제1 챔버는 제2 챔버 대비 저농도의 당화단백질을 측정하는 챔버일 수 있다. 상기 챔버에 포함된 당화단백질 결합 물질 및 버퍼의 농도 차이는 각각의 챔버를 각각 다른 농도의 당화단백질을 측정하기 위한 챔버로 최적화하게 할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 제1 챔버 및 제2 챔버는 동일한 항체와 같은 당화단백질 결합 물질을 포함하고, 제1 챔버에 포함된 당화단백질 결합 물질은 제2 챔버에 포함된 당화단백질 결합물질 대비 저농도의 당화단백질 결합물질일 수 있다. 제1 챔버 및 제2 챔버는 동일한 버퍼를 포함하고, 제1 챔버에 포함된 버퍼는 제2 챔버에 포함된 버퍼 대비 고농도의 버퍼일 수 있다. 제1 챔버 및 제2 챔버는 동일한 당화단백질 결합물질 및 버퍼를 포함하고, 제1 챔버에 포함된 당화단백질 결합물질은 제2 챔버에 포함된 당화단백질 결합물질 대비 저농도의 당화단백질 결합물질이고, 제1 챔버에 포함된 버퍼는 제2 챔버에 포함된 버퍼 대비 고농도의 버퍼일 수 있다.

버퍼는 예를 들면 인산, 탄산, 유기산버퍼 또는 Good's 버퍼일 수 있다. 산은 버퍼를 포함하는 용액의 pH를 조절할 수 있으며, 예를 들면 염산, 초산과 같은 무기산 또는, 아세트산과 같은 유기산일 수 있다. 또한, 염기는 상기 버퍼를 포함하는 용액의 pH를 조절할 수 있으며, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화리튬, 또는 수산화암모늄일 수 있다. 또한 버퍼는 폴리옥시에틸렌글리콜기를 갖는 비이온 계면활성제(non-ion surfactant), 또는 양이온계, 음이온계의 계면활성제일 수 있다.

버퍼는 첨가물을 더 포함할 수 있고, 상기 첨가물은 소혈청 알부민 (bovine serum albumin, BSA), 폴리에틸렌글리콜 (poly ethyleneglycol, PEG), 카세인(casein) 또는 그 조합일 수 있다.

상기 카트리지에 있어서, 항-혈색소 항체 및 항-당화혈색소 항체와 같은 항체의 농도는 1 ㎍/ml 내지 1000 ㎍/ml일 수 있다. 상기 첨가물의 농도는 0.01 mg/ml 내지 1000 mg/ml 일 수 있다.상기 카트리지에 있어서, 상기 스페이서의 높이는 약 1 ㎛ 내지 약 1000 ㎛, 예를 들면 약 1 ㎛ 내지 약 1000 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 200 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 또는 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛일 수 있다. 상기 카트리지는 마이크로 단위로 제작되어 광경로 (optical path)가 짧은 소형화된 흡광 장치에서 사용활 수 있다.

상기 카트리지에 있어서, 상기 상판과 하판은 빛이 투과될 수 있는 기판일 수 있다. 또한 상기 상판과 하판은 필름 형태일 수 있다. 상기 상판과 하판은 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (polyethylene terephtalate, PET) 필름, 폴리에틸렌 필름, 폴리프로필렌 (PP) 필름, 폴리염화비닐 (PVC) 필름, 폴리비닐 알코올 (PVA) 필름, 또는 폴리스틸렌 (PS) 필름일 수 있다. 상기 필름은 생물학적 및 화학적으로 불활성이고 기계적 가공성이 있는 재질의 필름일 수 있다.

다른 양상은 제1 챔버 및 제2 챔버를 갖는 하나 이상의 챔버를 포함하고, 상기 챔버는 빛을 투과하는 상판, 하판 및 상기 상판과 상기 하판 사이에 위치한 스페이서를 포함하고, 상기 상판 또는 상기 하판의 표면에 당화혈색소 결합물질, 버퍼, 및 첨가물을 포함하는 것인 당화혈색소 측정 카트리지; 제1 챔버 및 제2 챔버에 포함된 반응시약에 대응하여 미리 수득된 보정 곡선 (calibration curve)의 수식을 각각 포함하는 저장부; 제1 챔버 및 제2 챔버의 당화혈색소의 신호를 측정하는 측정부; 및 제1 챔버에서 측정된 신호가 소정의 임계값 이하인 경우, 제1 챔버에서 수득된 보정 곡선의 수식을 이용하여 당화혈색소 농도를 측정하고, 제1 챔버에서 측정된 신호가 소정의 임계값을 초과하는 경우, 제2 챔버에서 수득된 보정 곡선의 수식을 이용하여 당화혈색소 농도를 측정하는 판단부를 포함하는 당화혈색소 측정 시스템을 제공한다.

제1 챔버 및 제2 챔버의 당화혈색소의 신호를 측정하는 측정부에 있어서, 신호의 측정은 광학적 신호, 전기적 신호, 기계적 신호 또는 이들의 조합을 측정하는 것일 수 있다. 신호의 측정은 예를 들면 당화혈색소에 특이적인 광학적 신호의 측정일 수 있다. 이는 당화혈색소에 특이적인 흡광도 예를 들면 400 nm 내지 700 nm에서의 흡광도 측정일 수 있다.

상기 저장부, 측정부, 및 판단부는 보정 곡선을 저장하고, 흡광도와 같은 신호를 측정하고, 소정의 시나리오를 통해 당화혈색소 농도를 측정하는 과정은 소프트웨어를 통해 처리된다.

보정곡선의 수식은 다양한 농도의 당화혈색소를 포함하고 있는 칼리브레이터 (calibrator)를 이용하여 얻을 수 있다. 각각 서로 다른 농도를 갖는 당화혈색소를 포함하는 칼리브레이터를 이용하여 신호를 측정하고 당화혈색소의 농도와 신호 사이의 직선 상관계수 (linear correlation coefficient, R)을 계산하여 보정곡선의 수식을 얻을 수 있다. 얻을 수 있는 보정곡선의 수식은 상기 보정곡선의 상관계수(R)값이 예를 들면 약 0.97 이상, 0.98 이상, 0.99 이상, 0.97 내지 1.0000, 0.98 내지 0.9990, 0.99 내지 0.9980, 0.99 내지 0.9970, 0.99 내지 0.9965, 0.99 내지 0.9960, 0.99 내지 0.9955, 0.99 내지 0.9950, 0.99 내지 0.9945, 0.99 내지 0.9940, 또는 0.99 내지 0.9930이 되는 농도구간에 해당하는 것일 수 있다.

소정의 임계값 (threshold)은 제 1챔버에서 얻은 보정 곡선을 얻기 위해 사용한 당화혈색소의 농도 구간 중, 상기 보정 곡선 상에서 가장 높은 농도의 당화 혈색소, 예를 들면 칼리브레이터 중 당화 혈색소의 농도에 대응하는 신호일 수 있다. 상기 당화 혈색소의 농도에 대응하는 신호는 상기 신호의 오차 범위 ±0.001 내지 0.010, ±0.001 내지 0.009, ±0.001 내지 0.008, ±0.001 내지 0.007, ±0.001 내지 0.006, ±0.001 내지 0.005, ±0.001 내지 0.004, ±0.001 내지 0.003, 또는 ±0.001 내지 0.002의 신호를 내포할 수 있다.

상기 보정 곡선은 혈액 시료 중으로부터 측정된 당화혈색소의 신호를 당화혈색소의 농도로 전환하는 데 사용될 수 있다. 상기 보정 곡선은 예를 들면 로그형, 지수형, S-형, 직선형 그래프일 수 있다. 상기 로그형 그래프는 상기 전환시 낮은 농도의 당화단백질에 대하여 변별력이 높아 높은 정확도로 농도 전환이 가능한 반면, 높은 농도의 당화단백질에 대하여 변별력이 낮아 낮은 정확도의 농도 전환을 나타낸다. 또한 지수형 그래프는 상기 전환시 높은 농도의 당화단백질에 대하여 변별력이 높아 높은 정확도로 농도 전환이 가능한 반면, 낮은 농도의 당화단백질에 대하여 변별력이 낮아 낮은 정확도의 농도 전환을 나타낸다. 또한, S자형 (sigmoid) 그래프는 상기 전환시 중간 농도의 당화단백질에 대하여 변별력이 높아 높은 정확도로 농도 전환이 가능한 반면, 낮은 농도와 높은 농도의 당화단백질에 대하여 변별력이 낮아 낮은 정확도의 농도 전환을 나타낸다. 또한 직선형 그래프는 상기 전환시 모든 농도의 당화단백질에 대하여 변별력이 높아 높은 정확도로 농도 전환이 가능하다.

다른 양상은 제1 챔버 및 제2 챔버를 갖는 하나 이상의 챔버에 각각 복수 조건의 당화혈색소 결합물질 및 버퍼를 저장하는 단계; 상기 챔버에 혈액 샘플을 주입하여 각각의 챔버로부터 신호를 측정하여 복수의 보정 곡선을 수득하는 단계; 및 제1 챔버에서 측정된 신호가 소정의 임계값 이하인 경우, 제1 챔버에서 수득된 보정 곡선을 이용하여 당화혈색소 농도를 측정하고, 제1 챔버에서 측정된 신호가 소정의 임계값을 초과하는 경우, 제2 챔버에서 수득된 보정 곡선을 이용하여 당화혈색소 농도를 측정하는 단계를 포함하는; 당화혈색소 측정방법을 제공한다.

상기 혈액 샘플은 전혈 (whole blood cells), 수집된 혈액 (collected blood cell), 또는 혈액 용해물일 수 있다. 또한, 상기 샘플은 세포를 포함하는 샘플, 조직을 포함하는 샘플 또는 그의 조합일 수 있다.

상기 방법은 상기 반응시키는 단계 이전에 당화혈색소의 농도를 측정하고자 하는 혈액 시료를 용해시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 측정하고자 하는 혈색 시료 중에서 적혈구 내의 당화혈색소를 분리시키기 위해 용혈제를 사용할 수 있다. 상기 용혈제는 예를 들면 증류수 (deionized water, DW), 양성 이온성 계면활성제 (zwitterionic surfactant), 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 중성 계면활성제 또는 그의 조합일 수 있다. 용혈제 (lysing buffer)는 Triton X-100와 같은 Triton, Tween 20과 같은 Tween, 소듐 도데실 술페이트 (sodium dodecyl sulfate, SDS), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (cetyltrimethylammonium bromide, CTAB), 데트라데실트리메틸암모늄 브로마이드 (tetradecyltrimethylammonium bromide, TTAB), 폴리옥시에틸렌 아루릴 에테르 (polyoxyethylene lauryl ether, POE), 또는 노니네트 P-40 (Nonidet P-40, NP-40)과 같은 세제(detergent)일 수 있다.

상기 방법은 용혈된 혈액 시료에 불용성 담체 입자를 제공하는 단계를 제공할 수 있다. 상기 수용 영역은 입자를 포함할 수 있다. 상기 입자는 라텍스 (lartex) 입자, 금 나노입자, 아가로즈 (agarose) 입자, 세파로즈 (sepharose) 입자, 유리 입자, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 입자는 비드 (bead)일 수 있다. 상기 입자는 당화단백질에 물리적 및/또는 화학적 흡착을 통하여 비특이적으로 흡착될 수 있다.

불용성 담체 입자 (insoluble carrier particle)는 예를 들면 폴리스틸렌, 폴리염화비닐, 폴리프로필렌, (메타)아크릴수지, 폴리메틸메타크릴레이트와 같은 합성수지 (라텍스); 니트로셀루로오스, 셀루로오스, 메틸셀루로오스 등의 셀루로오스유도체; 금속, 세라믹, 유리, 실리콘 라버와 같은 무기물일 수 있다. 상기 라텍스의 표면이 소수성인 라텍스를 사용하는 경우 단백질 또는 펩티드의 흡착이 가능하다. 또한, 상기 라텍스는 카르복실산변성라텍스와 같은 변성라텍스, 자성입자를 내포시킨 라텍스를 포함할 수 있다. 불용성담체입자의 형상은 예를 들면 구 형상일 수 있다. 상기 구형상의 입자는 예를 들면 평균 직경이 0.03 내지 0.8 ㎛, 예를 들면 0.06 내지 0.2 ㎛일 수 있다.

상기 방법은 상기 반응 결과물의 신호를 측정하는 단계를 수행하게 된다. 상기 반응 결과물은 당화단백질 결합물질과 결합하여 크기가 증가된 당화단백질의 흡광도를 측정하게 되면, 흡수 파장이 변화하거나 흡광도의 증감을 유발하게 된다. 혈액 중 당화혈색소의 농도와 비례하여 당화혈색소의 크기가 증가되므로, 크기가 증가된 당화혈색소의 형성 정도를 측정하여 정량화함으로써, 혈액 시료 중 당화혈색소의 농도를 측정할 수 있다. 흡광도를 측정하는 단계는 약 400 nm 내지 약 700 nm 영역대의 흡광을 측정하는 것일 수 있다.

상기 방법은 제1 챔버 및 제2 챔버에 포함된 반응시약에 대응하여 미리 수득된 보정 곡선을 각각 저장하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 방법은 제1 챔버에서 측정된 신호가 소정의 임계값 이하인 경우, 제1 챔버에서 수득된 보정 곡선을 이용하여 당화단백질 농도를 측정하고, 제1 챔버에서 측정된 신호가 소정의 임계값을 초과하는 경우, 제2 챔버에서 수득된 보정 곡선을 이용하여 당화단백질 농도를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 소정의 임계값에 대하여는 전술한 바와 동일하다.

일 양상에 따른 카트리지에 의하면 당화단백질의 농도를 정확하게 측정할 수 있고 넓은 측정 범위를 갖는 당화혈색소의 측정을 가능하게 한다.

일 양상에 따른 당화혈색소 측정 시스템에 의하면 당화단백질을 넓은 측정 범위를 갖는 당화혈색소의 측정을 가능하게 한다.

일 양상에 따른 당화단백질을 측정하는 방법은 정확하게 측정할 수 있고 넓은 측정 범위를 갖는 당화혈색소의 측정을 가능하게 한다.

도 1은 일 구체예에 따른 당화단백질의 농도를 측정하기 위한 카트리지를 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 복수의 챔버를 포함하는 당화혈색소 농도를 측정하기 위한 카트리지를 나타낸 도면이다.
도 3은 일 구체예에 따른 당화혈색소 농도를 측정하기 위한 카트리지의 단면도이다.
도 4는 일 구체예에 따른 항체의 농도가 당화단백질 농도 측정에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 5는 일 구체예에 따른 버퍼의 농도가 당화단백질 농도 측정에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 6은 일 구체예에 따른 두 개의 보정 곡선으로부터 당화혈색소 농도를 측정하기 위한 시나리오를 나타내는 도면이다.
도 7은 단일 챔버를 구비한 카트리지를 이용하여 당화혈색소 농도를 측정한 경우 보정 곡선과 상기 보정 곡선을 이용하여 산출한 당화혈색소 농도의 정확도를 나타내는 도면이다.
도 8은 일 구체예에 의한 서로 다른 조건의 시약이 도포된 복수의 챔버를 구비한 카트리지를 이용하여 당화혈색소 농도를 측정한 경우의 두 개의 보정 곡선을 나타내는 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

도 1 내지 3은 일 구체예에 따른 카트리지의 구조를 나타낸 도면이다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 당화혈색소의 농도를 측정하기 위한 카트리지는 제1 챔버(11) 및 제2 챔버(12)를 포함하는 하나 이상의 챔버를 포함할 수 있다. 상기 챔버는 도 1에 도시된 바와 같은 패턴을 갖는 타원 모양 챔버일 수 있다. 상기 챔버는 상판(20), 하판(30) 및 상기 상판과 상기 하판 사이에 위치한 스페이서(40)를 포함할 수 있다. 상기 상판(20) 및 하판(30)은 빛이 투과될 수 있는 물질일 수 있다. 상기 상판(20) 및 하판(30)은 폴리에틸렌 테레트랄레이트 필름일 수 있다. 스페이서(40)는 셀룰로스 아세테이트 멤브레인일 수 있다. 상기 카트리지는 상판 및 스페이서에 주입구(50)가 배치될 수 있다. 상판, 하판 및 스페이서가 조립되어 주입구(50)를 통해 시료가 카트리지의 제1 챔버(11) 및 제2 챔버(12)에 도입될 수 있다. 상기 주입구(50)는 필터를 구비하지 않는 주입구일 수 있다. 주입구를 통해 도입된 혈액 샘플은 상기 카트리지의 상판 또는 하판에 위치한 건조된 시약을 녹여 확산에 의한 반응을 유도하므로, 상기 카트리지는 별도의 혼합 장치를 필요로 하지 않을 수 있다. 또한, 상기 스페이서의 두께는 약 1 내지 약 1000 um일 수 있다.

도 2는 일 구체예에 따른 복수의 챔버를 포함하는 당화혈색소 농도를 측정하기 위한 카트리지를 나타낸 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 카트리지는 복수의 챔버, 예를 들면 제1 챔버(11), 제2 챔버(12), 제3 챔버(13), 제4 챔버(14), 제5 챔버(15), 및 제6 챔버(16)를 포함하는 카트리지일 수 있다.

도 3은 일 구체예에 따른 당화혈색소 농도를 측정하기 위한 카트리지의 단면도이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 상판(20), 하판(30) 및 스페이서(40)의 조립에 의해 형성된 챔버(10) 내에 항체와 같은 당화단백질 결합물질, 버퍼, 및 첨가물이 포함될 수 있다. 상기 상판(20) 및/또는 하판(30)의 챔버를 바라보는 표면에 상기 당화단백질 결합물질, 버퍼, 및 첨가물(51, 52)이 도포될 수 있으며, 또한 건조된 상태로 저장될 수 있다. 상기 상판(20) 및 하판(30) 중 챔버(10)에 대응하지 않는 영역은 불투명하게 코팅될 수 있다. 상기 영역은 스크린 프린팅 방법에 의해 코팅될 수 있다. 상기 영역에 차광 잉크가 코팅될 수 있다. 이는 외부의 빛으로부터 챔버 내의 물질을 보호하거나 당화혈색소의 신호 측정, 예를 들면 광학적 신호 측정시의 오류를 방지할 수 있다.

도 6은 일 구체예에 따른 두 개의 보정 곡선으로부터 당화혈색소 농도를 측정하기 위한 시나리오를 나타내는 도면이다. 제1 챔버에 항체의 농도가 낮고 버퍼의 농도가 높은 조건의 반응시약을 저장하여 저농도의 당화혈색소를 정확하게 측정할 수 있다. 또한, 제2 챔버에 항체의 농도가 높고 버퍼의 농도가 낮은 조건의 반응시약을 저장하여 고농도의 당화혈색소를 정확하게 측정할 수 있다. 각각의 조건에 대해서 보정 곡선을 수득할 수 있다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 카트리지에 혈색 샘플을 도입한 후, 제1 챔버 내 흡광도(OD1) 및 제2 챔버 내 흡광도(OD2)를 측정할 수 있다. OD1과 소정의 임계값을 비교하여, 상기 OD1이 소정의 임계값 이하인 경우, 제1 챔버에서 수득된 보정 곡선(Cal.1)을 이용하여 당화혈색소 농도를 측정한다.

소정의 임계값은 제1 챔버에서 얻은 보정곡선의 상관계수 R이 0.99 이상인 구간에서 가장 높은 농도의 당화 혈색소, 예를 들면 칼리브레이터 중 당화 혈색소의 농도에 대응하는 흡광도일 수 있다. 상기 당화 혈색소의 농도에 대응하는 흡광도는 상기 흡광도의 오차 범위 ±0.001 내지 0.010, ±0.001 내지 0.009, ±0.001 내지 0.008, ±0.001 내지 0.007, ±0.001 내지 0.006, ±0.001 내지 0.005, ±0.001 내지 0.004, ±0.001 내지 0.003, 또는 ±0.001 내지 0.002의 흡광도를 내포할 수 있다 일 수 있다. 반면에, 상기 OD1이 소정의 임계값을 초과하는 경우, 제2 챔버에서 수득된 보정 곡선 (Cal.2)을 이용하여 당화혈색소 농도를 측정한다. 이와 같이 미리 설정해 놓은 시나리오를 통해, 최적화된 보정 곡선을 선정하여 당화혈색소의 정확한 농도를 측정할 수 있다. 또한, 항체, 버퍼 및 첨가물의 농도를 조절하여 저농도에서 변별력이 좋은 조건, 고농도에서 변별력이 좋은 조건, 또는 그 이상의 조합을 통해 넓은 측정 범위를 갖도록 구성할 수 있다. 복수의 챔버를 포함하는 카트리지에 복수 조건의 시약을 각각 저장하여 넓은 측정범위를 갖는 당화혈색소 측정 카트리지를 구성할 수 있다.

실시예 1: 당화혈색소 측정용 카트리지 준비

카트리지의 상판 및 하판은 각각 패터닝된 폴리에틸렌 테레프탈레이트 필름을 사용하였다. 상기 상판 및 하판 사이에 배치되는 스페이서는 패터닝된 셀룰로스 아세테이트 멤브레인을 사용하였다. 상기 멤브레인은 발수처리가 되어 유체는　유로를 따라 흐르고 공기는 멤브레인을 통해 빠진다. 카트리지의 상판 필름에 항체를 포함한 당화혈색소 결합물질을 함유한 용액 (R2 용액이라 지칭)을 도포하였다. R2 용액을 두 가지 조건으로 농축하여 챔버 1에는 조건 1을 챔버 2에는 조건 2의 항체가 포함된 R2 용액을 0.25 ul 도포했다. 상기 조건 1은 0.3x PBS버퍼에 anti HbA1c 120 ng/ml, anti IgG 40 ng/ml, CHAPS 0.2%, 소르비톨(Sorbitol) 8%를 포함하는 R2 용액이었다. 조건 2는 0.1x PBS버퍼에 anti HbA1c 160 ng/ml, anti IgG 50 ng/ml, CHAPS 0.2%, 소르비톨 8%를 포함하는 R2 용액이었다. 시약이 도포된 칩을 1% 습도 조건에서 하룻밤 동안 건조한 뒤 상판과, 하판, 스페이서를 조립하여 사용했다.

실시예 2: 항체 또는 버퍼의 농도가 다른 경우 당화혈색소의 보정 곡선 ( calibration curve) 수득

(2.1) 항체의 농도가 다른 경우 당화혈색소의 보정 곡선

실시예 1에서 제조한 카트리지의 복수의 챔버에 서로 다른 조건 1, 조건 2, 및 조건 3의 농도의 항체를 도포하여 건조된 상태로 저장하였다. 단일클론 항-HbA1c 항체를 사용하였다. 서로 다른 4개의 농도를 갖는 칼리브레이터 (Cliniqa, US)를 용혈과 동시에 비드를 포함하는 용액 (R1 용액이라 지칭)와 반응시킨 후, 상기 카트리지의 주입구를 통하여 도입하여 3개의 당화혈색소의 보정 곡선을 얻었다. 상기 비드는 라텍스 비드를 사용하였다. 상기 라텍스 비드는 HbA1c kit R1 용액 (Fujirebio 社) 을 약 4배 농축하여 사용하였다.

도 4는 일 구체예에 따른 항체의 농도가 당화단백질 농도 측정에 미치는 영향을 나타내는 도면이고, 항체의 농도는 80 ㎍/ml (조건 1), 120 ㎍/ml (조건 2), 및 160 ㎍/ml (조건 3)으로, 조건 1이 가장 낮고 조건 3이 가장 높았다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 흡착된 비드를 포함한 혈액 샘플에 대해 항체의 농도가 높을수록 넓은 측정 범위를 갖는 반면 HbA1c 농도에 따른 신호 변별력이 줄어든다. 반대로 항체 농도가 낮을수록 좁은 측정 범위를 갖는 반면, 저농도 구간에서 높은 신호 변별력을 나타낸다.

(2.2) 버퍼의 농도가 다른 경우 당화혈색소의 보정 곡선

실시예 1에서 제조한 카트리지의 복수의 챔버 중 제1 챔버 및 제2 챔버에 서로 다른 조건의 농도의 버퍼를 도포하여 건조된 상태로 저장하였다. 이 경우 항체의 농도는 동일하였다. 실시예 2.1과 동일하게 서로 다른 4개의 농도를 갖는 칼리브레이터 (Cliniqa, US)를 용혈과 동시에 비드와 반응시킨 후, 상기 카트리지의 주입구를 통하여 도입하여 2개의 당화혈색소의 보정 곡선을 얻었다. 도 5는 일 구체예에 따른 버퍼의 농도가 당화단백질 농도 측정에 미치는 영향을 나타내는 도면이고, 버퍼의 농도는 제1 챔버의 버퍼 농도가 제2 챔버의 버퍼 농도보다 높다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 버퍼의 농도가 높을수록 낮은 당화혈색소 농도에서 변별력이 좋아지고 버퍼의 농도가 낮을수록 높은 당화혈색소 농도에서 변별력이 좋아진다.

실시예 3: 라텍스 응집 반응을 이용한 HbA1c 측정

서로 다른 4개의 농도를 갖는 칼리브레이터 (Cliniqa, US), 용혈액 (증류수, 칼리브레이터 1 ㎕와 증류수 200 ㎕를 혼합하여 용혈하여 제조), 및 실시예 1에 기재된 R1 용액을 반응시킨 후 실시예 1에서 제조한 카트리지에 도입하여 상기 카트리지에 도포된 R2 시약과 반응시켜 LABGEO PT10 (삼성전자)를 이용하여 응집반응에 따른 흡광도 변화를 관찰하였다.

상기 카트리지에 도입된 4개의 칼리브레이터에 대하여 Tosoh G8를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도로부터 산출된 HbA1c의 농도는 각각 5.3%, 8.1%, 11.2% 및 15.1%이었다.

(1) 단일 챔버를 구비한 카트리지를 이용한 당화혈색소 농도의 측정

단일 챔버를 구비한 카트리지에 4개의 칼리브레이터를 도입한 후 당화혈색소 농도를 측정하였다. 도 7은 단일 챔버를 구비한 카트리지를 이용하여 조건 1의 시약 (0.3x PBS버퍼에 anti HbA1c 120 ㎍/ml, anti IgG 40 ng/ml, CHAPS 0.2%, 소르비톨(Sorbitol) 8%를 포함하는 R2 용액으로 총 0.25 ul의 상기 용액을 이용하여 당화혈색소 농도를 측정한 경우 보정 곡선을 나타내는 도면이다.

단일 챔버에서 측정된 신호를 가지고 신호처리 소프트웨어인 MasterPlex(Hitachi Solutions 社)를 이용하여 최적 적합 모드(best fit mode)로 단일 보정 곡선을 얻었다. 도 7에 나타낸 보정 곡선은 칼리브레이터 농도를 indepedenct value로 하고, 흡광도를 response value로 하여 상기 MasterPlex (Hitachi Solutions)를 이용하여 나타낸 것이다. 얻어진 보정 곡선은 Four parameter logitics이고, R 은 0.988666, RMSE는 0.00380, a는 0.16028, b는 6.29760, c는 8.11355, 및 d는 0.22767이었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 조건 1의 시약이 도포된 단일 챔버에서 측정된 신호는 S-형 보정 곡선을 나타내었다.

표 1은 단일 챔버를 구비한 카트리지를 이용하여 얻은 당화혈색소 농도 측정의 정확도를 나타낸 표이다. 표 1에 나타낸 바와 같이 당화혈색소의 농도가 낮은 샘플인 Lv1의 CV는 9.2% 이고, 당화혈색소의 농도가 높은 샘플인 Lv4의 CV는 4.9%로 높은 CV를 나타내었다.

또한, 도 7에 표시되지 않았지만 Lv1 및 Lv4의 칼리브레이터에서는 환산이 되지 않는 샘플도 다수 존재하였다. 또한 Lv3 및 Lv4의 칼리브레이터에서 당화혈색소의 농도를 측정하는 신호가 서로 겹쳐 도 7에 나타난 보정 곡선을 통해 얻은 농도는 왜곡된 정보를 제공할 수 있었다.

	Lv1	Lv1	Lv1	Lv1
CV	9.2%	2.4%	6.4%	4.9%

(2) 일 구체예에 의한 서로 다른 조건의 시약이 도포된 복수의 챔버를 구비한 카트리지를 이용한 당화혈색소 농도의 측정

서로 다른 조건 1의 시약과 조건 2의 시약이 도포된 두 개의 챔버를 이용하여 실시예 3에서 사용한 바와 같은 4개의 칼리브레이터를 도입한 후 당화혈색소 농도를 측정하여 두 개의 보정 곡선을 얻었다. 조건 1의 시약은 0.3x PBS버퍼에 anti HbA1c 120 ㎍/ml, anti IgG 40 ng/ml, CHAPS 0.2%, 소르비톨(Sorbitol) 8%를 포함하는 R2 용액으로 0.25 ul이고, 조건 2의 시약은 0.1x PBS버퍼에 anti HbA1c 160 ㎍/ml, anti IgG 50 ng/ml, CHAPS 0.2%, 소르비톨 8%를 포함하는 R2 용액으로 총 0.25 ul 이었다.

도 8은 일 구체예에 의한 서로 다른 조건의 시약이 도포된 복수의 챔버를 구비한 카트리지를 이용하여 당화혈색소 농도를 측정한 경우, 측정된 당화혈색소 농도로부터 얻은 두 개의 보정 곡선을 나타내는 도면이다. 각각의 챔버 중 당화혈색소 농도를 흡광도 측정을 통하여 도 8에 나타내었다. 제1 챔버에서 측정된 신호에서 측정된 신호와 당화혈색소의 농도 사이의 직선 상관계수(R)을 계산하여 보정 곡선의 수식을 얻었다. 얻어진 보정 곡선의 수식에서 상기 상관계수 값이 약 0.99 이상이 되는 농도 구간을 알아본 결과, 제1 챔버로부터 얻은 보정 곡선은 Lv1~Lv3의 칼리브레이터의 당화혈색소의 농도 구간에서 얻었고 보정 곡선 1(Cal.1)이라고 명명하였다. 보정곡선 1에서 사용된 칼리브레이터 중 당화혈색소의 가장 높은 농도인 Lv3에서의 흡광도 값인 약 0.22이었다.

이와 동일하게, 제2 챔버에서 측정된 신호에서 측정된 신호와 당화혈색소의 농도 사이의 직선 상관계수(R)을 계산하여 보정 곡선의 수식을 얻었다. 얻어진 보정 곡선의 수식에서 상기 상관계수 값이 약 0.99 이상이 되는 농도 구간을 알아본 결과, 제2 챔버로부터 얻은 보정 곡선은 Lv2~Lv4의 칼리브레이터의 당화혈색소의 농도 구간에서 얻었고, 보정 곡선 2(Cal.2)이라고 명명하였다.

얻어진 보정 곡선 1은 흡광도(Abs)와 HbA1c(%)의 상관관계가 y=0.0734x+0.0416 (y는 Abs, x는 HbA1c(%))이고, 상관계수 R²는 0.998 (R은 0.9989)이었다. 보정 곡선 2는 Abs와 HbA1c(%)의 상관관계가 y=0.0051x+0.1038 (y는 Abs, x는 HbA1c(%))이고, 상관계수 R²는 0.9975 (R은 0.9987)이었다. Cal.1은 로그형 곡선으로 낮은 농도에서 높은 변별력을 보이고, 직선형 곡선인 Cal.2는 Lv2~Lv4 구간에서 양호한 변별력을 보여 두 개의 보정 곡선을 조합하여, 칼리브레이터 중 당화혈색소의 농도를 산출하였다.

실시예 4에서 사용한 칼리브레이터 중 당화혈색소의 농도 중에서 Lv1~Lv3의 칼리브레이터의 당화혈색소 농도는 Cal.1을 이용하여 환산하고, Lv4의 칼리브레이터의 당화혈색소 농도는 Cal.2를 이용하여 산출하였다. 사용한 칼리브레이터 중 당화혈색소의 농도는 이미 알고 있으므로, Cal.1 및 Cal.2의 두 보정 곡선을 이용한 당화혈색소의 농도 산출 방법과 실제 당화혈색소 농도를 비교하였다.

표 2는 두 개의 보정 곡선을 조합하여 얻은 당화혈색소 농도 측정의 정확도를 나타낸 표이다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 두 개의 보정 곡선의 조합을 통해 산출된 당화혈색소 농도의 정확도는 단일 보정 곡선을 이용한 경우에 비해 개선된 정확도를 얻을 수 있었다.

	Cal1			Cal2
	Lv 1	Lv 2	Lv 3	Lv 4
CV	3.4%	3.3%	4.4%	2.9%

10, 11, 12, 13, 14, 15,1 16: 챔버
20: 상판
30: 하판
40: 스페이서
50: 주입구
51, 52: 당화단백질 결합물질, 버퍼, 및 첨가물

Claims (19)

1. 제1 챔버 및 제2 챔버를 갖는 하나 이상의 챔버를 포함하고, 상기 챔버는 빛을 투과하는 상판, 하판 및 상기 상판과 상기 하판 사이에 위치한 스페이서를 포함하고, 상기 상판 또는 상기 하판의 표면에 당화단백질 결합물질 및 버퍼를 포함하는 것인 당화단백질의 농도를 측정하기 위한 카트리지.
2. 청구항 1에 있어서, 제1 챔버는 제2 챔버 대비 저농도의 당화단백질을 측정하는 챔버이고, 제1 챔버 및 제2 챔버는 동일한 당화단백질 결합물질을 포함하고, 제1 챔버에 포함된 항체는 제2 챔버에 포함된 당화단백질 결합물질 대비 저농도의 항체인 것인 카트리지.
3. 청구항 1에 있어서, 제1 챔버는 제2 챔버 대비 저농도의 당화단백질을 측정하는 챔버이고, 제1 챔버 및 제2 챔버는 동일한 버퍼를 포함하고, 제1 챔버에 포함된 버퍼는 제2 챔버에 포함된 버퍼 대비 고농도의 버퍼인 것인 카트리지.
4. 청구항 1에 있어서, 제1 챔버는 제2 챔버 대비 저농도의 당화단백질을 측정하는 챔버이고, 제1 챔버 및 제2 챔버는 동일한 당화단백질 결합물질 및 버퍼를 포함하고, 제1 챔버에 포함된 당화단백질 결합물질은 제2 챔버에 포함된 당화단백질 결합물질 대비 저농도의 당화단백질 결합물질이고, 제1 챔버에 포함된 버퍼는 제2 챔버에 포함된 버퍼 대비 고농도의 버퍼인 것인 카트리지.
5. 청구항 2에 있어서, 상기 당화단백질 결합물질은 항체, 보론산, 콘카나발린, 또는 그의 조합인 것인 카트리지.
6. 청구항 2에 있어서, 상기 당화단백질 결합물질은 CHAPS 또는 소르비톨 (sorbitol)을 더 포함하는 것인 카트리지.
7. 청구항 3에 있어서, 상기 버퍼는 첨가물을 더 포함하고, 상기 첨가물은 소혈청 알부민 (bovine serum albumin, BSA), 폴리에틸렌글리콜 (poly ethyleneglycol, PEG), casein 또는 그 조합인 것인 카트리지.
8. 청구항 5에 있어서, 상기 항체의 농도는 1 ㎍/ml 내지 1000 ㎍/ml인 것인 카트리지.
9. 청구항 7에 있어서, 상기 첨가물의 농도는 0.01 mg/ml 내지 1000 mg/ml 인 것인 카트리지.
10. 청구항 1에 있어서, 상기 당화혈색소 결합물질 및 버퍼는 건조된 것인 카트리지.
11. 청구항 1에 있어서, 상기 스페이서의 높이는 1 ㎛ 내지 1000 ㎛인 것인 카트리지.
12. 제1 챔버 및 제2 챔버를 갖는 하나 이상의 챔버를 포함하고, 상기 챔버는 빛을 투과하는 상판, 하판 및 상기 상판과 상기 하판 사이에 위치한 스페이서를 포함하고, 상기 상판 또는 상기 하판의 표면에 당화단백질 결합물질 및 버퍼를 포함하는 것인 당화단백질 측정 카트리지;
    제1 챔버 및 제2 챔버에 포함된 반응시약에 대응하여 미리 수득된 보정 곡선을 각각 포함하는 저장부; 제1 챔버 및 제2 챔버의 당화단백질의 신호를 측정하는 측정부; 및 제1 챔버에서 측정된 신호가 소정의 임계값 이하인 경우, 제1 챔버에서 수득된 보정 곡선을 이용하여 당화단백질 농도를 측정하고, 제1 챔버에서 측정된 신호가 소정의 임계값을 초과하는 경우, 제2 챔버에서 수득된 보정 곡선을 이용하여 당화단백질 농도를 측정하는 판단부를 포함하는 당화혈색소 측정 시스템.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 소정의 임계값은 제1 챔버에서 얻은 보정 곡선을 얻기 위해 사용한 당화혈색소의 농도 구간 중, 가장 높은 농도의 당화혈색소에 대응하는 신호인 것인 시스템.
14. 제1 챔버 및 제2 챔버를 갖는 하나 이상의 챔버에 각각 복수 조건의 당화혈색소 결합물질 및 버퍼를 저장하는 단계;
    상기 챔버에 혈액 샘플을 주입하고 상기 챔버로부터 신호를 측정하여 복수의 보정 곡선 (calibration curve)을 수득하는 단계; 및
    제1 챔버에서 측정된 신호가 소정의 임계값 이하인 경우, 제1 챔버에서 수득된 보정 곡선을 이용하여 당화혈색소 농도를 측정하고, 제1 챔버에서 측정된 신호가 소정의 임계값을 초과하는 경우, 제2 챔버에서 수득된 보정 곡선을 이용하여 당화혈색소 농도를 측정하는 단계를 포함하는; 당화혈색소 측정방법.
15. 청구항 14에 있어서, 제1 챔버는 제2 챔버 대비 저농도의 당화혈색소를 측정하는 챔버이고, 제1 챔버 및 제2 챔버는 동일한 항체를 포함하고, 제1 챔버에 포함된 항체는 제2 챔버에 포함된 항체 대비 저농도의 항체인 것인 방법.
16. 청구항 14에 있어서, 제1 챔버는 제2 챔버 대비 저농도의 당화혈색소를 측정하는 챔버이고, 제1 챔버 및 제2 챔버는 동일한 버퍼를 포함하고, 제1 챔버에 포함된 버퍼는 제2 챔버에 포함된 버퍼 대비 고농도의 버퍼인 것인 방법.
17. 청구항 14에 있어서, 제1 챔버는 제2 챔버 대비 저농도의 당화혈색소를 측정하는 챔버이고, 제1 챔버 및 제2 챔버는 동일한 항체 및 버퍼를 포함하고, 제1 챔버에 포함된 항체는 제2 챔버에 포함된 항체 대비 저농도의 항체이고, 제1 챔버에 포함된 버퍼는 제2 챔버에 포함된 버퍼 대비 고농도의 버퍼인 것인 방법.
18. 청구항 14에 있어서, 혈액 샘플에 용혈제 및 불용성 담체 입자를 처리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
19. 청구항 18에 있어서, 상기 불용성 담체 입자 (insoluble carrier particle)는 라텍스(lartex) 입자, 금 나노 입자, 아가로즈 (agarose) 입자, 세파로즈 (sepharose) 입자, 유리 입자, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.

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