CN113311173A - 一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条、制备方法和试剂盒 - Google Patents

一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条、制备方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测血液样本中ST2和Galectin‑3抗体的联检试纸条、制备方法和试剂盒，试纸条的结合垫上包被有量子点标记的ST2抗体和Galectin‑3抗体；包被膜上设置有两条检测线和两条质控线，两条检测线分别包被有一株ST2抗体和一株Galectin‑3抗体；两条质控线分别包被有ST2重组抗原和Galectin‑3重组抗原；所述制备方法包括如下步骤（1）活化；（2）反应；（3）透析；（4）析出、复溶，制得量子点标记抗体；所述试剂盒包括外壳与上述联检试纸条；本申请所制备的联检试纸条实现了快速、灵敏、精确地联检血液样本中ST2和Galectin‑3含量。

Description

一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条、制 备方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及ST2和Galectin-3的联合检测的技术领域，尤其是涉及一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条、制备方法和试剂盒。
背景技术
急性心肌梗死是一种对人体危害很大的疾病，是由于冠状动脉急性和持续性缺血缺氧导致的心肌坏死，病情严重的会导致心律失常、心力衰竭等情况。心力衰竭是急性心肌梗死的常见并发症，心衰的发生发展与正常心肌细胞的纤维化密切相关，既往研究表明，galectin 3（Gal-3）会促进心肌纤维化、参与心肌炎症和心室重构的过程。因此，Gal-3可以作为一种新的心衰指标用于心衰的诊断和预后评估。
ST-2是Toll样/白细胞介素1受体超家族的成员，目前发现4种ST-2基因表达的蛋白：ST-2L、ST-2V、sST-2和ST-2LV。在人体中，ST-2L和ST-2V以膜蛋白形式存在，sST-2和ST-2LV以可溶形式存在。ST-2的功能配体为白细胞介素-33（Interleukin-33，IL-33），IL-33同ST-2L结合后通过一系列信号传导，可产生抗心肌纤维化的生物学效应。sST-2竞争性结合IL-33，阻断了IL-33/ST-2L信号通路，从而促进了心肌纤维化，因此，ST-2被列为急性或慢性心力衰竭患者风险分层的附加指标。
Gal-3和ST-2作为检测心衰的两个关键指标，常规的检测方法主要采用酶联免疫法和胶体金法的试剂盒，酶联免疫法的操作步骤复杂，检测时间长达3~4个小时，患者需要等待半天或者隔天才能得到诊断报告，而且酶联免疫法灵敏度低、精确误差大，需要采用大型的仪器设备才能实现；胶体金法仅为定性产品，不能准确检测患者体内ST2和Galectin-3的含量。
发明内容
随着人们对心血管疾病的关注度不断增加，开发一种快速、灵敏、精确检测ST2和Galectin-3联检的产品迫在眉睫，本申请提供一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条、制备方法和试剂盒。
第一方面，本申请提供一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条，采用如下的技术方案：
一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条，包括底板、样品垫、结合垫、缓冲垫、包被膜和吸水纸组成，所述样品垫、结合垫、缓冲垫、包被膜和吸水纸按层析方向顺次搭接粘贴在底板上；
其中，所述结合垫上包被有量子点标记的鼠源ST2抗体和鼠源Galectin-3抗体；
所述包被膜上设置有两条检测线和两条质控线，两条检测线分别包被有一株ST2抗体和一株Galectin-3抗体；两条质控线分别包被有ST2重组抗原和Galectin-3重组抗原。
在本申请中为了方便阐述，上述抗体与抗原均设置相应的代号，具体为：ST2抗体（Ab1）、Galectin-3抗体（Ab2）、检测线上包被的ST2抗体（Ab1’）和Galectin-3抗体（Ab2’），质控线上包被的ST2重组抗原（Ag1）和Galectin-3重组抗原（Ag2）；当血液样本中含有待检抗体时，ST2和Galectin-3与量子点标记的Ab1及Ab2结合形成抗体复合物人ST2-Ab1-Qds和Galectin-3-Ab2-Qds，由于层析作用，抗体复合物沿试纸条向前移动，经过检测线区域时与预包被的Ab1’和Ab2’进行反应，形成免疫夹心复合物Ab1’-ST2-Ab1-Qds和Ab2’-Galectin-3-Ab2-Qds而显现荧光条带；未与样本结合的Ab1-Qds和Ab2-Qds继续前移，依次通过两条质控线区域与ST2抗原及Galectin-3抗原结合形成复合物Ag1-Ab1-Qds和Ag2-Ab2-Qds并显现荧光条带。若样本中不含待检抗体，则仅质控线显现荧光条带；上述方法实现了快速、灵敏、精确地检测ST2和Galectin-3联检的试剂条。
优选的，所述量子点的粒径为2~10nm。
通过采用上述技术方案，将量子点的粒径限定为2~10nm，粒径越小，检测信号值相对越低，和50nm和100nm相比，均可以满足检测需求，但是从倍差角度来看，5nm量子点最好。
优选的，所述量子点的发射波长为525~655nm。
优选的，所述结合垫上量子点标记的鼠源ST2抗体和鼠源Galectin-3抗体的摩尔浓度为50~150nM。
通过采用上述技术方案，若量子点标记的鼠源ST2抗体（Ab1）和鼠源Galectin-3抗体（Ab2）摩尔浓度超过150nM时，浓度过高，会增加原料的投入成本；若量子点标记的鼠源ST2抗体（Ab1）和鼠源Galectin-3抗体（Ab2）摩尔浓度少于50nM时，则会存在与预包被的Ab1’和Ab2’反应不够充分，导致显色不明显的情况。
优选的，所述检测线包被的一株ST2抗体和一株Galectin-3抗体，浓度为0.8～1.5mg/mL，划膜量为1ul/cm；所述质控线包被的ST2重组抗原和Galectin-3重组抗原的浓度为0.5～1.2mg/mL，划膜量为1ul/cm。
通过采用上述技术方案，划线浓度在0.8～1.5mg/mL范围内，在检测信号值、灵敏度以及线性范围等方面，均有较明显的优势。
优选的，所述试纸条上，所述试纸条上，相邻反应线之间的距离为3~3.5mm。
通过采用上述技术方案，在荧光定量检测过程中，相邻反应线之间距离过小，会导致荧光信号值干扰，导致检测不准确；本申请相邻反应线之间的距离为3~3.5mm，可有效防止荧光信号值的干扰，使得检测结果更加准确。
优选的，所述样品垫、缓冲垫、结合垫为玻璃纤维素膜，所述包被膜为硝酸纤维素NC膜，所述底板为PVC胶板。
第二方面，本申请提供一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条的制备方法，采用如下的技术方案：
一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条的制备方法，所述方法包括如下步骤：
采用EDC偶联法分别标记ST2及Galectin-3抗体，得到量子点标记抗体；
将量子点标记抗体喷涂在玻璃纤维素膜上，干燥制得结合垫；
包被膜的制备：将一株ST2抗体（Ab1’）划线在一个检测线处；将一株Galectin-3抗体（Ab2’）划线在另一个检测线处；将ST2重组抗原（Ag1）划线在一个质控线处；将Galectin-3重组抗原（Ag2）划线在另一个质控线处，两条检测线与质控线的位置沿层析方向顺序为ST2检测线、Galectin-3检测线、ST2质控线、Galectin-3质控线，划线完毕后，制得包被膜；
在底板上按顺序依次搭接地粘贴样品垫、结合垫、缓冲垫、包被膜和吸水纸，进行大板组装并切割成所需宽度的试纸条。
通过采用上述技术方案，由于ST2和Galectin-3含有氨基和羧基，采用EDC偶联法进行标记；由于量子点的粒径较小，可以采用喷涂方式制备结合垫；由于本申请需要对ST2及Galectin-3抗体实现联检，有必要设置两条检测线和两条质控线，并且将两条检测线与两条质控线以合理的顺序进行排布。
优选的，所述的量子点标记抗体采用如下步骤制备：
利用EDC溶液对量子点溶液进行活化，得混合液I；
向混合液I中加入过量待标记的ST2及Galectin-3抗体，避光反应1~1.5h，得反应液；
将避光反应结束的反应液进行至少两次透析，每次透析室温4~6小时，得透析液；
析出透析液中的标记抗体，采用缓冲溶液复溶至与混合液I同等体积量，制得量子点标记抗体。
通过采用上述技术方案，由于本申请所用的量子点粒径非常小，利用EDC溶液对量子点进行缓冲、活化，使得量子点均匀分散在EDC溶液中，然后加入过量待标记的ST2及Galectin-3抗体，采用透析方式析出标记抗体，而采用离心方式无法将量子点分离出来，提高了检测的准确性。
第三方面，本申请提供一种试剂盒，采用如下的技术方案：
一种试剂盒，包括外壳以及一种检测血液样本中ST2和 Galectin-3抗体的联检试纸条，所述联检试纸条安装在外壳内，所述外壳在与样品垫对应的上表面设有加样孔，所述外壳在与检测线、质控线对应的上表面设有观察窗。
综上所述，本申请至少包括以下一种有益效果：
1、本申请的试纸条只需采集25μl指尖血样本，操作极为简单，向试纸条上滴加样本即可，采用荧光免疫分析仪判读结果，实现准确、定量检测，并且整个检测时间只需8分钟，可实现临床即时检测；
2、本申请可针对ST2和Gal-3两个心衰指标进行联检，联检更有助于对心衰的严重程度进行诊断和评估，适用于心力衰竭和急性冠状脉综合症患者；
3、本申请在标记量子点时，由于量子点粒径非常小，采用透析方式析出标记抗体，而采用离心方式无法将量子点分离出来，提高了检测的准确性；
4、本申请的量子点粒径选择在2~10nm之间，从倍差角度来看，采用160ng/mL浓度的T/C值除以0.5ng/mL的T/C值的比值，这个值越接近320越好，检测不同人血浆得到的T/C算出来的浓度值越准确；
5、本申请的划线浓度为0.8～1.5mg/mL，在检测信号值、灵敏度以及线性范围等方面，均有较明显的优势；
6、抗坏血酸、脂肪乳剂、血红蛋白、胆红素、肝素钠、和类风湿因子对本试剂的干扰均很小；
7、在45℃温箱中放置57d后，仍可获得准确的测定结果，由此可推断，本申请制备的联检试纸条在室温环境下的储存期可长达18个月。
附图说明
图1是本申请联检试纸条的结构示意图。
图2是本申请试剂盒的结构示意图。
图3是本申请所拟合的ST2标准曲线图。
图4是本申请所拟合的Galectin-3标准曲线图。
图5是本申请中关于Galectin-3的相关性曲线图。
图6是本申请中关于ST2的相关性曲线图。
图中：1、底板；2、样品垫；3、结合垫；4、缓冲垫；5、包被膜；6、吸水纸；7、外壳；8、加样孔；9、观察窗。
具体实施方式
以下结合附图、实施例和对比例对本申请作进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是对本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；本实施例所涉及的%均为质量百分比；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过市售购买；其中，量子点溶液来源自购买的invitrogen量子点。本实施例所用的鼠源ST2抗体（Ab1）和鼠源Galectin-3抗体（Ab2）以及ST2抗体（Ab1’）、Galectin-3抗体（Ab2’）、ST2重组抗原（Ag1）和Galectin-3重组抗原（Ag2）均采用南京申基生物科技有限公司的产品。
实施例1：量子点粒径的选择
对HF患者的Galectin-3异常高值血浆（173ng/mL）用定值的0值血浆进行稀释，得到不同血浆浓度的Galectin-3进行检测，观察2nm、5nm、10nm、50nm、100nm五种不同粒径的量子点对T/C值的影响，实验结果见表1。
表1：不同粒径的量子点对检测结果的影响
Figure 328376DEST_PATH_IMAGE002
通过表1可知，粒径越小，检测信号值相对越低，但是均可以满足检测需求，从倍差角度来看，采用160ng/mL浓度的T/C值除以0.5ng/mL的T/C值的比值，这个值越接近320越好，因为倍差大了，检测不同人血浆得到的T/C算出来的浓度值越准确，也就是CV值越好，优选5nm量子点。
实施例2：量子点标记抗体
标记终体积1mL的量子点抗体结合物，加1μM量子点7.5μL，10mg/mL EDC 52.5μL混合，常温避光活化，活化pH为6；然后加入过量待标记抗体，调整反应pH为8，避光反应1h；将反应结束的液体进行两次透析，每次透析室温4小时，吸出透析后的标记抗体，用含20mMTris、质量浓度为15%的蔗糖溶液、质量浓度为1%的BSA、pH为8的缓冲溶液复溶至原体积，即可制得量子点标记抗体。
实施例3：抗体加入量对试验结果的影响
将量子点溶液与EDC溶液混合活化后，加入不同的ST2抗体量和Galectin-3抗体量进行偶联，考察抗体加入量对线性和灵敏度的影响，结果见表2所示。
表2：不同抗体量对试验结果的影响
Figure 619680DEST_PATH_IMAGE004
通过表2可知，随着抗体量的增加，线性和灵敏度均有所提高，但不易加入过多的抗体量，灵敏度会有所下降，所以试验选用125μg的抗体量进行偶联。
实施例4：一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条的制备
参见图1，包括底板1和设置在底板1上的样品垫2、结合垫3、缓冲垫4、包被膜5和吸水纸6；其中，样品垫2、结合垫3、缓冲垫4、包被膜5和吸水纸6按层析方向顺次搭接粘贴在底板1上；相邻两个垫之间存在上下重叠部分，重叠部分为1mm，有助于减小待测样品在不同垫之间的流动阻力，进而能进一步提高试纸条的检测速度。
底板1为PVC胶板，底板1的尺寸可以根据需要进行调整，其宽度通常为7~9cm，长度通常为25~35cm，本实施例中具体以宽为8cm、长为30cm为例进行说明。样品垫2、缓冲垫4、结合垫3为玻璃纤维素膜，由于玻璃纤维素膜具有毛细纤维结构，相比于同等级其他纤维素，能吸附更多的水分，且流速快，可以快速吸收待测样品并输送至包被膜5中，包被膜5为硝酸纤维素NC膜，孔径为0.45μm，由于ST2和Galectin-3抗体中存在较大分子蛋白，优选0.45μm的NC膜，具有非常高的蛋白结合力，而且NC膜本身产生的背景非常低，膜特有的表面性质保证了优异的信噪比，在膜洗脱时不需要严格的洗脱条件。吸水纸6具有良好的吸水效果，能将多余的待测样品进行吸附，保证试纸条在检测过程中的整洁。具体地制备过程如下：
（1）量子点标记抗体：
量子点标记抗体的制备同实施例2；
（2）结合垫的制备：
将复溶后的量子点标记抗体用喷金划膜仪按6μl/cm喷涂在玻璃纤维素膜上，置于烘箱中37℃鼓风干燥1.5小时，制作结合垫3。
（3）包被膜的制备：
将一株ST2抗体（Ab1’）用pH为7.5的20mM PBS缓冲液调节至浓度为1.5mg/mL，1ul/cm划线在NC膜的ST2检测线T1处；将一株Galectin-3抗体（Ab2’）用pH为7.5的20mM PBS缓冲液调节至浓度为1.5mg/mL，1ul/cm划线在NC膜的Galectin-3检测线T2处；将ST2重组抗原用pH为7.5的20mM PBS缓冲液调节至浓度为1.0mg/mL，1ul/cm划线在NC膜的ST2质控线C1处；将Galectin-3重组抗原用pH为7.5的20mM PBS缓冲液调节至浓度为1.0mg/mL，1ul/cm划线在NC膜的Galectin-3质控线C2处；检测线及质控线每条线之间间隔距离为3mm，检测线在质控线的下方；划线完毕后置于烘箱中37℃鼓风干燥1小时，制作包被膜5。
（4）样品垫的制备：
将含有10mM Tris、1.5%的PEG20000、0.5%NaCl、0.8%Tween-20，pH为9.0的处理液均匀涂布在滤血膜上，置于空气湿度低于40%的条件下，室温自然晾干，制作样品垫2。
（5）大板组装：
在尺寸为80×300mm的底板1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、结合垫3、缓冲垫4、包被膜5和吸水纸6，样品垫2的尺寸为27×300mm，结合垫3的尺寸为10×300mm，缓冲垫4的尺寸为6×300mm，包被膜5的尺寸为25×300mm，吸水纸6的尺寸为17×300mm，利用专用切条机切割成4mm宽度的试纸条。
从发明人的实验经验来看，划线浓度在0.8～1.5mg/mL范围内，在检测信号值、灵敏度以及线性范围等方面，均有较明显的优势，优选1.5mg/mL；另外，当发明人选择相邻反应线的间距为2.8mm作为对比例时，试验结果出现异常，发明人认为这是因为荧光信号值的干扰所导致的。
实施例5：试剂盒的制备
参照图2，一种试剂盒，包括外壳7以及实施例4的联检试纸条，联检试纸条安装在外壳7内，外壳7在与样品垫2对应的表面上设有加样孔8，外壳7在与检测线、质控线对应的表面上设有观察窗9。
实施例6：ST2及Galectin-3的检测
分别配制ST2血浆浓度：200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、30ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、3ng/mL；Galectin-3血浆浓度：100ng/mL、60ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL的一系列不同浓度的待检溶液和空白溶液，取80μL，加入到实施例5制得的试剂盒上的加样孔内，立即插入荧光定量分析仪，反应8min，每个浓度测两遍取平均，通过对每个浓度T线及C线的荧光信号比值T/C对应浓度，曲线拟合采用MMFM o'del四参数增长算法做标准曲线（图3和图4），建立反应值-被测物浓度之间的数学模型，再将待检未知样品进行同样处理，从而得出ST2及Galectin-3的定量结果。
表3：ST2的浓度与反应值之间的关系
Figure 355555DEST_PATH_IMAGE006
表4：Gal-3的浓度与反应值之间的关系
Figure 820035DEST_PATH_IMAGE008
实施例7：抗干扰性试验
在正常人血浆（ST2:16.28ng/mL；Galectin-3:12.33ng/mL）中各自添加一定量的抗坏血酸、脂肪乳剂、血红蛋白、胆红素、肝素钠、类风湿因子，使其达到表3中所示的浓度，同时加入同等体积的去离子水作为无干扰物血浆，按照实施例6的方法同时测定这些标本的浓度，结果见表3。
表5：血浆ST2、Galectin-3量子点免疫层析试剂盒抗干扰检测
Figure 207022DEST_PATH_IMAGE010
通过表5可知，抗坏血酸、脂肪乳剂、血红蛋白、胆红素、肝素钠、和类风湿因子对本试剂的干扰很小。
实施例8：加速稳定性试验
取实施例4制备的ST2及Galectin-3抗体的联检试纸条放入45℃温箱中，分别在第0d、3d、7d、14d、30d、42d、57d取出，按照实施例6的方法测定ST2及Galectin-3的高低值质控品的含量，结果见表4所示。
表6：45℃加速稳定性试验结果
Figure 669228DEST_PATH_IMAGE012
通过表6可知，在45℃温箱中放置57d后，仍可获得准确的测定结果，由此可推断，本申请制备的联检试纸条在室温环境下的储存期可长达18个月。
实施例9：相关性实验
收集50例正常人血浆，50例HF患者血浆，分别用BG医学股份有限公司的Galectin-3 ELISA检测试剂盒和Critical Diagnostics 的ST2 ELISA试剂盒进行定值检测，再用本产品对血样中的Galectin-3和ST2进行定值，进行相关性比较。结果显示，传统ELISA试剂盒的Galectin-3和ST2的检测结果与本发明量子点免疫层析法联合检测的相关性（n=100，Galectin-3：r=0.998；ST2：r=0.997）良好，两种方法学对血浆中的Galectin-3和ST2的检测准确性相同（图5和图6）。
实施例10：正常参考值范围
选取100名年龄在19~52岁健康献血员标本用实施例6所述的方法进行血浆中ST2及Galectin-3测定，ST2的表观正常人群第90百分位数、第95百分位数、第97.5百分位数分别是33.91ng/mL、35.25ng/mL和36.33ng/mL；Galectin-3的表观正常人群第90百分位数、第95百分位数、第97.5百分位数分别是9.87ng/mL、9.96ng/mL和9.98ng/mL。

Claims (10)

1.一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条，包括底板(1)、样品垫(2)、结合垫(3)、缓冲垫(4)、包被膜(5)和吸水纸(6)组成，其特征在于：所述样品垫(2)、结合垫(3)、缓冲垫(4)、包被膜(5)和吸水纸(6)按层析方向顺次搭接粘贴在底板(1)上；
其中，所述结合垫(3)上包被有量子点标记的鼠源ST2抗体和鼠源Galectin-3抗体；
所述包被膜(5)上设置有两条检测线和两条质控线，两条检测线分别包被有一株ST2抗体和一株Galectin-3抗体；两条质控线分别包被有ST2重组抗原和Galectin-3重组抗原。
2.根据权利要求1所述的一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条，其特征在于：所述量子点的粒径为2~10nm。
3.根据权利要求1所述的一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条，其特征在于：所述量子点的发射波长为525~655nm。
4.根据权利要求1所述的一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条，其特征在于：所述结合垫上量子点标记的鼠源ST2抗体和鼠源Galectin-3抗体的摩尔浓度为50~150nM。
5.根据权利要求1所述的一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条，其特征在于：所述检测线包被的一株ST2抗体和一株Galectin-3抗体，浓度为0.8～1.5mg/mL，划膜量为1ul/cm；所述质控线包被的ST2重组抗原和Galectin-3重组抗原的浓度为0.5～1.2mg/mL，划膜量为1ul/cm。
6.根据权利要求1所述的一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条，其特征在于：所述试纸条上，相邻反应线之间的距离为3~3.5mm。
7.根据权利要求1所述的一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条，其特征在于：所述样品垫(2)、缓冲垫(4)、结合垫(3)为玻璃纤维素膜，所述包被膜(5)为硝酸纤维素NC膜，所述底板(1)为PVC胶板。
8.权利要求1~6任意一项所述的一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
采用EDC偶联法分别标记ST2及Galectin-3抗体，得到量子点标记抗体；
将量子点标记抗体喷涂在玻璃纤维素膜上，干燥制得结合垫；
包被膜的制备：将一株ST2抗体划线在一个检测线处；将一株Galectin-3抗体划线在另一个检测线处；将ST2重组抗原划线在一个质控线处；将Galectin-3重组抗原划线在另一个质控线处，两条检测线与质控线的位置沿层析方向顺序为ST2检测线、Galectin-3检测线、ST2质控线、Galectin-3质控线，划线完毕后，制得包被膜；
在底板(1)上按顺序依次搭接地粘贴样品垫、结合垫、缓冲垫、包被膜和吸水纸，进行大板组装并切割成所需宽度的试纸条。
9.根据权利要求8所述的一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条的制备方法，其特征在于所述的量子点标记抗体采用如下步骤制备：
利用EDC溶液对量子点溶液进行活化，得混合液I；
向混合液I中加入过量待标记的ST2及Galectin-3抗体，避光反应1~1.5h，得反应液；
将避光反应结束的反应液进行至少两次透析，每次透析室温4~6小时，得透析液；
析出透析液中的标记抗体，采用缓冲溶液复溶至与混合液I同等体积量，制得量子点标记抗体。
10.一种试剂盒，其特征在于：包括外壳(7)以及权利要求1~7任意一项所述的一种检测血液样本中ST2和Galectin-3抗体的联检试纸条，所述联检试纸条安装在外壳(7)内，所述外壳(7)在与样品垫对应的上表面设有加样孔(8)，所述外壳(7)在与检测线、质控线对应的上表面设有观察窗(9)。
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