CN103487586A

CN103487586A - 一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置

Info

Publication number: CN103487586A
Application number: CN201310397366.2A
Authority: CN
Inventors: 刘成山; 段志强; 吴萌
Original assignee: Huanshui River Shijiazhuang All Living Creatures' Thing Science And Technology Ltd
Current assignee: Huanshui River Shijiazhuang All Living Creatures' Thing Science And Technology Ltd
Priority date: 2013-09-04
Filing date: 2013-09-04
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-09-04
Also published as: CN103487586B

Abstract

本发明涉及一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置，其包括测试卡和免疫定量分析仪；所述的测试卡包括滤血垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、背衬垫和卡壳；所述的胶体金垫上固定有胶体金标记的抗人生长刺激表达蛋白2抗体；所述的硝酸纤维素膜上设置有抗人生长刺激表达蛋白2抗体包被的检测线和IgG抗体包被的质控线；所述的卡壳上设置有加样区和检测区；所述的检测区的位置与检测线和质控线的位置相对应；所述免疫定量分析仪检测所述测试卡检测区的光密度。本发明操作简便、床旁使用、扩大了检测范围，检测范围最高可达200ng/ml，加强了对不同程度心力衰竭的预后和严重程度评估。

Description

一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置

技术领域

本发明涉及一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置。

本发明还涉及一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的方法。

背景技术

心衰是一种复杂临床综合症，其发病率和死亡率均较高。临床上心衰时症状和体征特异性较差，难以辨别病人是否患心衰。超声心动图、X射线以及有创血流动力学等辅助检查有局限性，且受客观条件限制。因此我们需寻求一种客观可靠、便捷、价廉、便于随访以及适合动态观察的方法作为补充手段，心力衰竭标志物的检测可以满足以上需求。

目前心力衰竭标志物主要有三种：B型钠尿肽(BNP)、N端BNP前体(NT-proBNP)、可溶性生长刺激表达蛋白2（ST2）。可溶性ST2是由ST2基因编码，由过负荷的心肌细胞、心肌成纤维细胞分泌的一种血清蛋白。临床上Weinberg、Figal研究中均已证明由心力衰竭导致死亡者的血清中可溶性ST2水平明显高于生存者，可溶性ST2与心衰患者的一年后的死亡风险呈剂量依赖关系。经多因素分析，可溶性ST2预测一年的死亡率价值非常高。血清可溶性ST2水平升高伴有病死率的升高，是心衰预后差的标志，因此开展血清可溶性ST2免疫学检测技术研究具有重要的意义。目前BNP、NT-proBNP在国内外已经有成熟的检测产品，而可溶性生长刺激表达蛋白2国内目前没有相关检测产品。

当前国外采用酶联免疫吸附法来检测生长刺激表达蛋白2，检测速度慢，需要约4小时，不利用临床使用。CN201220401468的专利实质为定性检测产品，无法用于心衰的预后评估和严重程度评估。

发明内容

本发明目的在于提供一种操作简便、床旁使用、快速定量检测生长刺激表达蛋白2，满足临床准确评估心力衰竭需求的检测装置。

本发明目的还在于提供一种操作简便、床旁使用、快速定量检测生长刺激表达蛋白2，满足临床准确评估心力衰竭需求的检测方法。

本发明的技术方案包括：

本发明的检测装置包括测试卡和免疫定量分析仪；

所述的测试卡包括滤血垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、背衬垫和卡壳；

所述的胶体金垫上固定有胶体金标记的抗人生长刺激表达蛋白2抗体；

所述的硝酸纤维素膜上设置有抗人生长刺激表达蛋白2抗体包被的检测线和IgG抗体包被的质控线；

所述的卡壳上设置有加样区和检测区；

所述的检测区的位置与检测线和质控线的位置相对应；

所述免疫定量分析仪检测所述测试卡检测区的光密度。

进一步的，本发明的检测装置还包括储存有所述测试卡的标准曲线的测试芯片。

进一步的，本发明所述的抗人生长刺激表达蛋白2抗体为鼠抗人生长刺激表达蛋白2抗体或兔抗人生长刺激表达蛋白2抗体。

进一步的，本发明所述的IgG抗体为兔抗鼠IgG抗体、羊抗鼠IgG抗体或羊抗兔IgG抗体。

进一步的，本发明所述的抗人生长刺激表达蛋白2抗体为单克隆抗体，IgG抗体为多克隆抗体。

进一步的，本发明所述的检测线上包被的抗人生长刺激表达蛋白2抗体的量为0.2~0.4mg/mL。

进一步的，本发明所述的胶体金颗粒的粒径为20~50nm，由1％质量浓度的氯金酸溶液和1%质量浓度柠檬酸三钠溶液制备，氯金酸溶液与柠檬酸三钠溶液的体积比为2:3。

进一步的，本发明每ml胶体金溶液中加入4~5μg的单克隆抗体，用0.1mol/L的K₂CO₃调节pH。

本发明的定量检测方法包括下述步骤：

步骤一：获得标准曲线，使用免疫定量分析仪检测不同浓度的生长刺激表达蛋白2标准液，绘制标准曲线；

或步骤一：读取标准曲线，使用免疫定量分析仪读取所述测试芯片中的标准曲线信息；

步骤二：将检测样品置于所述测试条的加样区；

步骤三：使用免疫定量分析仪读取所述测试卡检测区的光密度，当ST2 < 35ng/ml时，表明心衰预后较好；当ST2 > 35ng/ml时，表明心衰预后较差。

进一步的，本发明的检测方法所述样品包括全血、血浆或血清，所述样品的加样量为100~300μL。

本发明的有益效果为：

本发明的试验装置包括测试卡和免疫定量分析仪，免疫定量分析仪检测所述测试卡检测区的光密度，可以实现对可溶性生长刺激表达蛋白2的定量检测，从而实现对心力衰竭预后的准确判断，当ST2 < 35ng/ml时，表明心衰预后较好；当ST2 > 35ng/ml时，表明心衰预后较差。

本发明的试验装置还包括储存有所述测试卡的标准曲线的测试芯片。通过免疫定量分析仪读取芯片中的标准曲线信息，可以节约临床上获取标准曲线的试验步骤，进一步节约试验时间，使试验时间进一步缩短至15分钟，提高了检测速率，减少了患者等待结果的时间。

本发明的试验装置包括两种鼠抗人ST2的单克隆抗体。第一个鼠抗人ST2的单抗被包被在胶金垫中，可与血液中ST2分子结合。第二个鼠抗人ST2的单抗的功能是作为捕获抗体结合第一个抗体与ST2的免疫结合物。提高了检测的灵敏度，仅需要100ul样品既可以满足测试需求，同时扩大了检测范围，检测范围最高可达200ng/ml，加强了对不同程度心力衰竭的预后和严重程度评估。

本发明的测试卡的胶体金颗粒的粒径为20~50nm，所标记抗体的效价为1：2×10⁵~2.63×10⁶，检测线上包被的鼠抗人ST2抗体的量为0.2~0.4mg/mL；在此工艺下，本发明的免疫定量分析仪可以实现准确的读数，试验数据的可靠度高。

本发明的试验方法操作步骤简单，不存在使用障碍。

本发明的试验方法使用全血、血浆或血清，样品的获取方便，可实现在患者的床旁检测。

附图说明

图1为胶体金制备原理图；

图2为实施例1胶体金溶液紫外扫描鉴定图；

图3为实施例1胶体金溶液电镜扫描图；

图4为实施例2制备的测试芯片的标准曲线；

图5为实施例3临床试验数据ROC曲线图。

具体实施方式

使用本发明时的样本采集：采集静脉全血样本加入EDTA或肝素抗凝管获得抗凝的全血或血浆样本，或者加入含促凝剂的试管离心获得血清。对于冷冻或冷藏的血浆和血清样本，检测前必须使其恢复至室温，并充分混匀。血浆样本检测前应轻轻反转几次以便混匀。

使用本发明时的加样检测：将测试芯片放入免疫定量分析仪，获得本批次测试卡的标准曲线数据。打开测试卡的包装袋，在测试卡上标记患者的编号（或姓名）并录入配套仪器中；用两指挤压吸管顶部球囊，将吸头进入到患者样本中，松开两指；使整个吸管充满样本；将吸管中的样本全部加入测试卡上方加样区中；把测试卡放入配套免疫定量分析仪，按分析仪的使用手册进行操作，15分钟可获知定量结果。

本发明的实施例使用的免疫定量分析仪包括但不限于专利CN2013200892230公开的检测分析仪。

使用本发明时的结果解释：当ST2 < 35ng/ml时，表明心衰预后较好；当ST2 > 35ng/ml时，表明心衰预后较差。

实施例1：本发明测试卡的制备

步骤一：抗人ST2单克隆抗体的制备

首次基础免疫，用福氏完全佐剂与等体积可溶性ST2乳化后，对5只5～7周龄雌性BALB／c小鼠，颈背部多点注射。两周后第2次免疫，用福氏不完全佐剂与首次相同剂量抗原乳化后，颈背部多点注射。再两周后，酶联免疫吸附法（ELISA法）测小鼠血清效价；选取一只最佳免疫小鼠，融合前三天，腹腔注射抗原液l00μg，作加强免疫。取对数生长期的骨髓瘤细胞与免疫脾细胞，按常规方法用50％PEG进行融合。可溶性ST2包被酶标板，采用间接ELISA法筛选阳性培养孔。选择强阳性的克隆，再采用有限稀释法进行连续亚克隆，直到所有的克隆孔阳性率达100%。将稳定分泌高特异、高效价抗可溶性ST2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，扩增培养，同时置液氮中保存。预先注射石蜡油致敏的成年雌性BALB／c小鼠，再将制备的抗可溶性ST2杂交瘤细胞株分别接注射入小鼠腹腔内，7～10天后收集腹水。并使用辛酸-硫酸铵纯化腹水，得到纯化的单克隆抗体。

将50株杂交瘤细胞，分别注射到12周龄的BALB/c小鼠腹腔内诱发腹水，每只获取2—5mL的优质腹水。采用间接ELISA法测定其效价。50株腹水抗体从1:200开始，按2n(n=0,1,2…)倍、比稀释，测定结果是：50株腹水抗体效价均达在1:20万-1:263万之间。分别取50株的腹水各4mL进行纯化，获得抗体约 800μL-980μL，蛋白含量1.55mg/mL-6.3mg/mL，凝胶成像分析纯度达到97%以上。

将50株单克隆抗体分别标记胶体金及包被硝酸纤维素膜，两两组合检测标定为10ng/ml的可溶性ST2血清，结果显示2H9标记胶体金与3A8包被硝酸纤维素膜检测的从显色强度、均匀度等结果看效果最好。并且2H9和3A8抗体的效价为50株抗体中较高的，分别为1：2× 10⁶和1：1.5× 10⁶。

采用SIGMA抗体亚型试剂盒鉴定所得两株单克隆抗体的亚型均为IgG1。考马斯亮蓝法测定2H9抗体得得浓度为2.4mg/mL，3A8抗体的浓度为3.1mg/ml。

步骤二：胶体金的制备

胶体金制备的原理：如图1所示还原剂可以提供电子给溶液中带正电荷的金离子而产生金原子，金原子聚集后形成金颗粒。如下所示：

氯金酸＋还原剂＝胶体金

HAuCl4 + e– = Au0

在图1中，曲线的纵坐标代表在加入还原剂时金离子转变为金原子的进程。加入还原剂之后，溶液中金原子的含量立即出现急剧的上升，直到其达到过饱和。瞬间金原子经过核化发生凝集，形成晶核。

还原剂越多产生的晶核越多从而产生的金颗粒也越多。显而易见，在一个含既定数目氯化金的溶液中，形成的核化位点的数目越多，最终形成的每个金颗粒的尺寸就越小。

本项目采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。柠檬酸三钠的加入量不同，所制备的胶体金颗粒直径大小也不一样。金溶胶颗粒的直径大小与制备时加入柠檬酸三钠的量是密切相关的，其他条件不变，改变柠檬酸三钠的加入量，可制得不同粒径的金溶胶。而金溶胶的光散射性与金溶胶颗粒的大小密切相关，当颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的颜色变化。所以柠檬酸三钠加入量不同，制备的胶体金颗粒会产生粒径大小和颜色的变化。但是所制备的胶体金颗粒的粒径越小，越容易引起粒径的不均匀，而粒径不均匀会直接影响胶体金吸附抗体的量，引起假阳性或假阴性判定。相对应的是，粒径越大，检测时分析灵敏度越高，可以检测到更低浓度水平的待测物，但是粒径越大胶体稳定性越差。本发明摸索了不同质量分数的柠檬酸三钠与胶体金粒大小的关系，如表1所示，并发现在100mL体系中加入1%氯金酸1ml和加入1%柠檬酸三钠1.5ml，所制备的胶体金颗粒粒径约为20-40nm，且粒径分布均匀，如图2和3所示。主峰宽度越小，说明胶体金溶液的粒径分布越均匀。

表1 不同质量分数的柠檬酸三钠与胶体金粒大小的关系表

Figure 2013103973662100002DEST_PATH_IMAGE001

步骤三：胶体金标记可溶性ST2抗体

如果pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物；如果pH大于蛋白质的等电点时，蛋白质带负电荷，与胶体金颗粒的负电荷相互排斥而不能相互结合。盐离子的存在会影响胶体金对蛋白的吸附作用，使得溶胶聚沉，因此将待标记的单抗溶液用四蒸水在4℃下透析，更换3-4次透析液，除去盐离子，并用0.22μm微孔滤膜进行过滤，除去细小微粒等杂质。

取同等体积的胶体金溶液，由于pH值大小较难控制，本发明采用控制所加入K₂CO₃的量来改变pH值大小。各组分的添加量如表2所示。

表2 pH的确定

Figure 2013103973662100002DEST_PATH_IMAGE002

观察每管胶体金的颜色变化。溶液的颜色没有变化的即为胶体金标记抗体的最适pH值。当0.1mol/L的K₂CO₃加入量12ul/ml金时，颜色与对照组基本相同，未出现颜色变化和聚沉现象，为最佳pH。

胶体金是一种带负电的疏水性颗粒，未加单抗或当加入的单抗量不足以吸附完胶体金时，加入NaCL后由于盐离子效应，会改变胶体的性质，出现由红变蓝的聚沉现象；加入蛋白质量达到或超过稳定量，则胶体金保持红色不变。使红色保持不变的最低的蛋白质的量，就是胶体金标记蛋白质最低稳定量。在此基础上增加20%即为胶体初步判断金标记最适蛋白用量，从而确定能使胶体金溶液保持稳定红色的最低蛋白量。第1-3管有不同程度的变蓝聚沉现象，第4管的颜色与第8管（对照）基本相同，说明胶体金与单抗较好的吸附。在第4管4μg基础上再加上20%，即稳定1mL胶体金最佳蛋白量为4×(1+20%)=4.8μg。

步骤四：胶体金检测线浓度的确定

本实施例的质控线（C线）用兔抗小鼠IgG包被，检测线（T线）为3A8抗体包被。如下表所示，固定C线浓度，改变T线浓度，以T线深浅、灵敏度等为考察参数，选出最佳T线划线浓度，如表3所示。确定C线的浓度，改变T线的浓度，检测样品为3ng/ml的可溶性ST2时，T线浓度为0.2mg/mL时，显色很浅，仪器不容易判断；T线浓度为0.4mg/mL时，显色很深，造成浪费抗体；T线浓度为0.3mg/mL时较0.4mg/ml显色稍浅，T线显色适中，因此T线最佳划线浓度为0.25~0.35mg/mL。

表3 检测线（T线）不同划线浓度

实施例2：测试芯片的制备

将可溶性ST2配置成3.12 ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml等系列标准溶液。用实施例1制备的测试卡检测，每个浓度重复3次，用CN2013200892230公开的免疫定量分析仪读数，从而可以获得ST2光密度与浓度的标准曲线。由于不同仪器选择检测线的读数区域不同，是否过滤背景不同，计算光密度的方法不同，可能读数也就不同。每批的测试卡由于存在实际制作和组分的差异，需要使用该批次测试卡来分析获知标准曲线。

将可溶性ST2配置成3ng/ml标准溶液，选择实施例1的测试卡进行测定，做14个重复，观察试纸条在批内重复性。

最终确定的测试芯片的标准曲线如图4所示。实施例1制备的测试卡的检测灵敏度达0.2ng/ml, 在0.2-300ng/ml的范围内线性为R=0.994。

用3ng/ml的标准ST2进行检测，检测值如表4所示，批内的CV=8.7%。

表4 不同测试卡的重复性测试数据

实施例3 心衰预后患者使用本实施例1和2所检测的ST2值及定量分析。

使用根据上述方法所研制的生长刺激表达蛋白2测试卡，共检测疑似心衰患者标本220例，女性占64.5%，男性占35.5%，平均年龄65±16.3岁，生长刺激表达蛋白2检测试剂盒的诊断结果的曲线下面积为0.919（如图5所示），表明生长刺激表达蛋白2测试卡在临床上有很高的诊断价值，有助于对心衰病人进行诊断和预后评估。而定性的测试卡不能给出数据用于心衰严重程度评估，在临界值附近由于存在灰色区域难以准确判断，更无法在经过治疗后评估患者是否得到改善。通过使用生长刺激表达蛋白2定量测试卡，则可以准确评估患者心衰严重程度，也可以更好地监测治疗效果。

Claims

1.一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置，其特征在于其包括测试卡和免疫定量分析仪；

所述的卡壳上设置有加样区和检测区；

所述的检测区的位置与检测线和质控线的位置相对应；

所述免疫定量分析仪检测所述测试卡检测区的光密度。

2.根据权利要求1所述的一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置，其特征在于其还包括储存有所述测试卡的标准曲线的测试芯片。

3.根据权利要求1所述的一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置，其特征在于所述的抗人生长刺激表达蛋白2抗体为鼠抗人生长刺激表达蛋白2抗体或兔抗人生长刺激表达蛋白2抗体。

4.根据权利要求1所述的一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置，其特征在于所述的IgG抗体为兔抗鼠IgG抗体、羊抗鼠IgG抗体或羊抗兔IgG抗体。

5.根据权利要求3或4所述的一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置，其特征在于所述的抗人生长刺激表达蛋白2抗体为单克隆抗体，IgG抗体为多克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置，其特征在于所述的检测线上包被的抗人生长刺激表达蛋白2抗体的量为0.2~0.4mg/mL。

7.根据权利要求5所述的一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置，其特征在于胶体金颗粒的粒径为20~50nm，由1％质量浓度的氯金酸溶液和1%质量浓度柠檬酸三钠溶液制备，氯金酸溶液与柠檬酸三钠溶液的体积比为2:3。

8.根据权利要求5所述的一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置，其特征在于每ml胶体金溶液中加入4~5μg的单克隆抗体，用0.1mol/L的K₂CO₃调节pH。

9.一种根据权利要求1或2所述的试验装置定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的方法，其特征在于包括下述步骤：

步骤二：将检测样品置于所述测试条的加样区；

10.根据权利要求6所述的定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的方法，其特征在于所述样品包括全血、血浆或血清，所述样品的加样量为100~300μL。