CN106199002A - 一种用于检测st2的化学发光免疫分析试剂盒、制备方法及应用 - Google Patents

一种用于检测st2的化学发光免疫分析试剂盒、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体公开了一种用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒，同时还公开了其制备方法和应用。该试剂盒包括包被ST2抗体ab89728的微孔板、ALP标记抗ST2抗体ab196525、分析缓冲液、发光底物CSPD、洗涤液、质控标准品；质控标准品为重组ST2蛋白ab166883。本发明提供的用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒，采用双抗体夹心法来实现化学发光免疫分析ST2指标，方便快捷，具有高效、灵敏、高特异性的优点，重复性和可靠性良好，可以为心衰的预后和危险分级判断提供可靠的依据。

Description

一种用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒、制备方法及 应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒，同时还涉及其制备方法和应用。
背景技术
心力衰竭(heart failure)简称心衰，是指由于心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。心力衰竭并不是一个独立的疾病，而是心脏疾病发展的终末阶段。几乎所有的心血管疾病最终都会导致心力衰竭的发生，心肌梗死、心肌病、血流动力学负荷过重、炎症等任何原因引起的心肌损伤，均可造成心肌结构和功能的变化，最后导致心室泵血和(或)充盈功能低下。心衰患者5年的死亡率达50％，心衰是心血管领域最重要的公共卫生问题。根据心力衰竭发生的缓急，临床可分为急性心力衰竭和慢性心力衰竭。根据心力衰竭发生的部位可分为左心、右心和全心衰竭。此外，心力衰竭还有收缩性或舒张性心力衰竭之分。心衰的诊断方式有心电图、X线检查、超声心动图、动脉血气分析、血常规和血生化检查，如电解质、肾功能、血糖、白蛋白及高敏C反应蛋白。诊断心衰的标志物指标为B型利钠肽(BNP)和N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)，检测心肌受损的标示物是心肌肌钙蛋白T或I(CTnT或CTnI)等。其中B型利钠肽(BNP)是诊断心衰的最重要指标，但BNP作为心衰的标志物存在如下不足：BNP会随着年龄增长而增高，且女性高于男性；急性冠脉综合征、肺部疾病、慢性肾功能不全等其他疾病也能导致BNP升高；肥胖者比非肥胖者BNP低；还有其他广泛的生物学变异等等。人生长刺激表达基因2蛋白(growth Stimulation expressed gene 2),简称ST2，ST2蛋白也是白介素I受体家族的成员，分为可溶性和跨膜型两种。研究发现ST2蛋白有心脏组织表达，同时ST2蛋白的表达与损伤后的心脏纤维化反应直接关联。相对于其他心脏标志物，ST2具有稳定性高、生物变异度低的优点，ST2是最新一代的心衰标志物，反应心肌纤维化，在评估心衰预后和危险分级方面明显优于其他心衰生物标志物。因此，提供一种用于检测ST2的试剂盒及检测方法，为心衰的预后和危险分级判断提供可靠的依据，对心力衰竭的诊治将具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒，采用双抗体夹心法来实现化学发光免疫分析ST2指标，具有高效、灵敏、高特异性的优点，重复性和可靠性良好，可以为心衰的预后和危险分级判断提供可靠的依据。
本发明的目的还在于提供一种用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒的制备方法。
本发明的目的还在于提供一种用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒，包括：包被ST2抗体ab89728的微孔板、ALP标记抗ST2抗体ab196525、分析缓冲液、发光底物CSPD、洗涤液、质控标准品；
所述分析缓冲液为：在0.05M/L、pH值为8.0的Tris-Hcl溶液中添加BSA形成的混合溶液，混合溶液中BSA的质量百分比浓度为1％；
所述洗涤液为：在0.05M/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中添加吐温20形成的混合溶液，混合溶液中吐温20的质量百分比浓度为0.05％；
所述质控标准品为重组ST2蛋白ab166883。
一种用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，包括：
包被ST2抗体ab89728的微孔板通过以下步骤制备：把抗ST2抗体ab89728用包被缓冲液稀释至0.05～3微克/微升，制得抗体包被液，向微孔板的每孔中加入50微升的所述抗体包被液，然后置于37℃包被2小时，之后用生理盐水冲洗三次，然后再向所述微孔板的每孔中加入100微升的封板液，之后置于室温封闭2小时，再用生理盐水冲洗两次，制得包被ST2抗体ab89728的微孔板；
ALP标记抗ST2抗体ab196525通过以下步骤制备：取0.5～3毫克的ALP、1～4毫克的ab196525抗体，加入PBS缓冲液，在磁力搅拌下，再加入0.05毫升戊二醛，得到混合液，混合液的总体积控制为0.5毫升，所述混合液室温搅拌15分钟，之后避光反应4小时，然后向所述混合液中加入0.1M/L的乙醇胺，室温搅拌2小时，之后用PBS缓冲液在4℃下透析过夜，得到透析液，所述透析液与等质量的甘油混合，然后向透析液与甘油形成的混合物中加入质量百分比浓度为0.1％的NaN3溶液，制得ALP标记抗ST2抗体ab196525；
分析缓冲液配制方法：在0.05M/L、pH值为8.0的Tris-Hcl溶液中添加BSA形成混合溶液，混合溶液中BSA的质量百分比浓度为1％；
洗涤液配制方法：在0.05M/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中添加吐温20形成混合溶液，混合溶液中吐温20的质量百分比浓度为0.05％；
质控标准品采用重组ST2蛋白ab166883。
优选的，所述的包被缓冲液为0.05M/L、pH值为9.0的碳酸盐缓冲液。
优选的，所述的封板液配制方法为：向0.05M/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入BSA形成混合溶液，混合溶液中BSA的质量百分比浓度为1％。
一种权利要求1所述的用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒的应用，包括以下步骤：
S1：用含有BSA的质量百分比浓度为0.1％的PBS缓冲液作为稀释液，将质控标准品重组ST2蛋白ab166883稀释制成具有系列浓度梯度的标准品溶液；
S2：向包被ST2抗体ab89728的微孔板的孔中，分别加入具有系列浓度梯度的标准品溶液和待测样本溶液，具有系列浓度梯度的标准品溶液和待测样本溶液的加入量均为50微升，然后再向孔中加入50微升ALP标记抗ST2抗体ab196525工作溶液，震荡均匀之后在37℃温育1小时，然后用洗涤液冲洗5次，在吸水纸上控干，再加入底物工作液和分析缓冲液各50微升，室温避光反应10分钟后，在发光仪上测量发光强度；
S3：根据系列浓度梯度的标准品溶液的浓度和测得的发光强度值，绘制标准工作曲线，然后根据待测样本溶液的发光强度值，通过标准工作曲线计算得出待测样本溶液的浓度。
优选的，步骤S1中，所述稀释液中BSA的质量百分比浓度为1％。
优选的，步骤S2中，ALP标记抗ST2抗体ab196525工作溶液的配制方法为：将ALP标记抗ST2抗体ab196525与水按照体积比：ALP标记抗ST2抗体ab196525:水＝1:2000稀释制得。
优选的，步骤S2中，所述底物工作液的配制方法为：将500～800微升的二乙醇胺、100微升1M/L的NaOH溶液、100微升1M/L的MgCl2溶液及100微升质量百分比浓度为10％的NaN3溶液混匀，高压蒸汽灭菌，制得底物缓冲液；取所述底物缓冲液800微升，加入200微升的增强剂和50微升的发光底物CSPD，灭菌容器内混匀，制得底物工作液。
化学发光免疫分析技术(Chemiluminescence Immunoassay,CLIA)是将高灵敏度的化学发光测定技术和高选择性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、蛋白质、维生素、药物等的检测分析，是继酶免、放免、荧光、时间分辨荧光分析之后发展起来的一项免疫测定技术。化学发光技术早在19世纪八十年代就得到了证实，即在化学反应中以释放光子的形式释放能量，以标记化学反应发光剂为示踪物信号建立起来的非放射免疫分析技术，也是现在最先进的免疫分析技术。化学发光酶免疫分析(ChemiluminescentEnzyme Immunoassay,CLEIA)属于酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作步骤与酶免疫分析完全相同，以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，用发光信号测定仪进行发光测定。在酶促化学发光免疫分析中可供标记的酶很多，目前较为常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。
本发明的有益效果是：本发明提供的用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒，采用双抗体夹心法来实现化学发光免疫分析ST2指标，方便快捷，具有高效、灵敏、高特异性的优点，重复性和可靠性良好，可用于心脏衰竭患者的动态监测，通过检测患者ST2水平来监控患者对心衰治疗效果的反应，协助提供最适合的治疗方案，可以为心衰的预后和危险分级判断提供可靠的依据。
附图说明
图1是本发明实施例2中绘制的标准工作曲线，y＝1.108-1.029/[1+(x/11.4)0.9]。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒，包括：
包被ST2抗体ab89728的微孔板、ALP标记抗ST2抗体ab196525、分析缓冲液、发光底物CSPD、洗涤液、质控标准品；
其中分析缓冲液为：在0.05M/L、pH值为8.0的Tris-Hcl溶液中添加BSA形成的混合溶液，混合溶液中BSA的质量百分比浓度为1％；
洗涤液为：在0.05M/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中添加吐温20形成的混合溶液，混合溶液中吐温20的质量百分比浓度为0.05％；
质控标准品为重组ST2蛋白ab166883。
ST2抗体ab89728、抗ST2抗体ab196525、质控标准品重组ST2蛋白ab166883均购自Abcam公司。
该用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒通过以下制备方法进行构建，具体为：
包被ST2抗体ab89728的微孔板通过以下步骤制备：把抗ST2抗体ab89728用包被缓冲液稀释至0.05～3微克/微升，制得抗体包被液，向微孔板的每孔中加入50微升的抗体包被液，然后置于37℃包被2小时，之后用生理盐水冲洗三次，然后再向微孔板的每孔中加入100微升的封板液，之后置于室温封闭2小时，再用生理盐水冲洗两次，制得包被ST2抗体ab89728的微孔板，冷冻干燥，密封于铝箔袋中，4℃保存备用；
ALP标记抗ST2抗体ab196525通过以下步骤制备：取0.5～3毫克的ALP、1～4毫克的ab196525抗体，加入PBS缓冲液，在磁力搅拌下，再加入0.05毫升戊二醛，得到混合液，混合液的总体积控制为0.5毫升，所述混合液室温搅拌15分钟，之后避光反应4小时，然后向混合液中加入0.1M/L的乙醇胺，室温搅拌2小时，之后用PBS缓冲液在4℃下透析过夜，得到透析液，透析液与等质量的甘油混合，然后向透析液与甘油形成的混合物中加入质量百分比浓度为0.1％的NaN3溶液，制得ALP标记抗ST2抗体ab196525，4℃保存备用；
分析缓冲液配制方法：在0.05M/L、pH值为8.0的Tris-Hcl溶液中添加BSA形成混合溶液，混合溶液中BSA的质量百分比浓度为1％；
洗涤液配制方法：在0.05M/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中添加吐温20形成混合溶液，混合溶液中吐温20的质量百分比浓度为0.05％；
质控标准品采用重组ST2蛋白ab166883。
其中，包被缓冲液为0.05M/L、pH值为9.0的碳酸盐缓冲液。
封板液配制方法为：向0.05M/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入BSA形成混合溶液，混合溶液中BSA的质量百分比浓度为1％。
各缓冲液均用0.2％的NaN3溶液防腐。
实施例2
本发明实施例1提供的用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒的应用，包括以下步骤：
S1：用含有BSA的质量百分比浓度为0.1％的PBS缓冲液作为稀释液，将质控标准品重组ST2蛋白ab166883稀释制成具有系列浓度梯度的标准品溶液，例如标准品溶液浓度为0.1纳克/毫升、10纳克/毫升……2000纳克/毫升；
S2：向包被ST2抗体ab89728的微孔板的孔中，分别加入具有系列浓度梯度的各标准品溶液和待测样本溶液，具有系列浓度梯度的各标准品溶液和待测样本溶液的加入量均为50微升，然后再向孔中加入50微升ALP标记抗ST2抗体ab196525工作溶液，震荡均匀之后在37℃温育1小时，然后用洗涤液冲洗5次，在吸水纸上控干，再加入底物工作液和分析缓冲液各50微升，室温避光反应10分钟后，在发光仪上测量发光强度；
S3：根据系列浓度梯度的标准品溶液的浓度和测得的发光强度值，绘制标准工作曲线，见图1，然后根据待测样本溶液的发光强度值，通过标准工作曲线计算得出待测样本溶液的浓度。
其中，步骤S1中，稀释液中BSA的质量百分比浓度为1％。
步骤S2中，ALP标记抗ST2抗体ab196525工作溶液的配制方法为：将ALP标记抗ST2抗体ab196525与水按照体积比：ALP标记抗ST2抗体ab196525:水＝1:2000稀释制得。
步骤S2中，底物工作液的配制方法为：将600微升的二乙醇胺、100微升1M/L的NaOH溶液、100微升1M/L的MgCl2溶液及100微升质量百分比浓度为10％的NaN3溶液混匀，高压蒸汽灭菌，制得底物缓冲液；取底物缓冲液800微升，加入200微升的增强剂(购自BIO-RAD公司)和50微升的发光底物CSPD，灭菌容器内混匀，制得底物工作液。
该试剂盒的线性范围和检测限。测得的标准工作曲线见图1，由标准工作曲线可以看出试剂盒有着非常好的线性范围，10纳克/毫升～900纳克/毫升。检测限为0.1纳克/毫升。试剂盒批间差＜14％，批内差＜7％。阳性参考值＞35纳克/毫升。
具体的，用本发明实施例1提供的试剂盒分别对取自河南省郑大一附院的急性、慢性心衰样本各20例进行ST2蛋白的测定，检测结果分别见表1和表2。
表1急性心衰样本实测病例
表2慢性心衰样本实测病例
样品编号 ST2蛋白测定结果(纳克/毫升)
1 98
2 39
3 76
4 43
5 54
6 61
7 48
8 66
9 69
10 54
11 87
12 119
13 135
14 92
15 75
16 43
17 36
18 63
19 81
20 101
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，包括：包被ST2抗体ab89728的微孔板、ALP标记抗ST2抗体ab196525、分析缓冲液、发光底物CSPD、洗涤液、质控标准品；
所述分析缓冲液为：在0.05M/L、pH值为8.0的Tris-Hcl溶液中添加BSA形成的混合溶液，混合溶液中BSA的质量百分比浓度为1％；
所述洗涤液为：在0.05M/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中添加吐温20形成的混合溶液，混合溶液中吐温20的质量百分比浓度为0.05％；
所述质控标准品为重组ST2蛋白ab166883。
2.一种权利要求1所述的用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
包被ST2抗体ab89728的微孔板通过以下步骤制备：把抗ST2抗体ab89728用包被缓冲液稀释至0.05～3微克/微升，制得抗体包被液，向微孔板的每孔中加入50微升的所述抗体包被液，然后置于37℃包被2小时，之后用生理盐水冲洗三次，然后再向所述微孔板的每孔中加入100微升的封板液，之后置于室温封闭2小时，再用生理盐水冲洗两次，制得包被ST2抗体ab89728的微孔板；
ALP标记抗ST2抗体ab196525通过以下步骤制备：取0.5～3毫克的ALP、1～4毫克的ab196525抗体，加入PBS缓冲液，在磁力搅拌下，再加入0.05毫升戊二醛，得到混合液，混合液的总体积控制为0.5毫升，所述混合液室温搅拌15分钟，之后避光反应4小时，然后向所述混合液中加入0.1M/L的乙醇胺，室温搅拌2小时，之后用PBS缓冲液在4℃下透析过夜，得到透析液，所述透析液与等质量的甘油混合，然后向透析液与甘油形成的混合物中加入质量百分比浓度为0.1％的NaN3溶液，制得ALP标记抗ST2抗体ab196525；
分析缓冲液配制方法：在0.05M/L、pH值为8.0的Tris-Hcl溶液中添加BSA形成混合溶液，混合溶液中BSA的质量百分比浓度为1％；
洗涤液配制方法：在0.05M/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中添加吐温20形成混合溶液，混合溶液中吐温20的质量百分比浓度为0.05％；
质控标准品采用重组ST2蛋白ab166883。
3.根据权利要求2所述的用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的包被缓冲液为0.05M/L、pH值为9.0的碳酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的封板液配制方法为：向0.05M/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入BSA形成混合溶液，混合溶液中BSA的质量百分比浓度为1％。
5.一种权利要求1所述的用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1：用含有BSA的质量百分比浓度为0.1％的PBS缓冲液作为稀释液，将质控标准品重组ST2蛋白ab166883稀释制成具有系列浓度梯度的标准品溶液；
S2：向包被ST2抗体ab89728的微孔板的孔中，分别加入具有系列浓度梯度的标准品溶液和待测样本溶液，具有系列浓度梯度的标准品溶液和待测样本溶液的加入量均为50微升，然后再向孔中加入50微升ALP标记抗ST2抗体ab196525工作溶液，震荡均匀之后在37℃温育1小时，然后用洗涤液冲洗5次，在吸水纸上控干，再加入底物工作液和分析缓冲液各50微升，室温避光反应10分钟后，在发光仪上测量发光强度；
S3：根据系列浓度梯度的标准品溶液的浓度和测得的发光强度值，绘制标准工作曲线，然后根据待测样本溶液的发光强度值，通过标准工作曲线计算得出待测样本溶液的浓度。
6.根据权利要求5所述的用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒的应用，其特征在于，步骤S1中，所述稀释液中BSA的质量百分比浓度为1％。
7.根据权利要求6所述的用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒的应用，其特征在于，步骤S2中，ALP标记抗ST2抗体ab196525工作溶液的配制方法为：将ALP标记抗ST2抗体ab196525与水按照体积比：ALP标记抗ST2抗体ab196525:水＝1:2000稀释制得。
8.根据权利要求7所述的用于检测ST2的化学发光免疫分析试剂盒的应用，其特征在于，步骤S2中，所述底物工作液的配制方法为：将500～800微升的二乙醇胺、100微升1M/L的NaOH溶液、100微升1M/L的MgCl2溶液及100微升质量百分比浓度为10％的NaN3溶液混匀，高压蒸汽灭菌，制得底物缓冲液；取所述底物缓冲液800微升，加入200微升的增强剂和50微升的发光底物CSPD，灭菌容器内混匀，制得底物工作液。
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