CN111781347B - 免疫层析试纸条及包括其的装置 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种免疫层析试纸条，包括：样品垫；标记物垫，其连接于所述样品垫；包被垫，其连接于所述标记物垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线；吸水垫，其连接于所述包被垫；其中，所述样品垫包括玻璃纤维垫，所述玻璃纤维垫上喷涂有RBC抗体复合物。本发明还提供了包括上述免疫层析试纸条的装置。本发明所述的免疫层析试纸条及包括其的装置，其RBC抗体复合物中的RBC抗体与红细胞发生免疫亲和反应，形成“红细胞‑RBC抗体复合物‑红细胞”的交联物质，由于RBC复合物相较于单独的RBC抗体，体积更大，红细胞结合位点更多，因此更容易与红细胞结合并被拦截到样品垫上。

Description

免疫层析试纸条及包括其的装置
技术领域
本发明涉及一种免疫层析试纸条及包括其的装置，属于免疫检测技术领域。
背景技术
免疫侧向层析法检测试剂具有使用方便、快捷的优点。不过，由于需要满足方便操作者使用的要求，使得在应用荧光免疫侧向层析法检测试剂时，其不能有比较繁琐的样本前处理过程。在检测血清、血浆等临床样本时，其能够很好地适用，但是检测全血样本，为了避免样本中血细胞的影响，其需要在反应前去除样本中的血细胞。
目前的免疫侧向层析法去除全血中血细胞的方法主要有两种：1.样品垫为全血过滤垫，由于其为柔软致密的微细玻璃纤维，可通过物理过滤的方式，过滤样本中的全血。由于一定体积的全血过滤垫只能过滤一定体积的全血样本，因此这种过滤方式存在过滤极限，太多的全血样本超出全血过滤垫的极限后就不能再起作用，导致血细胞溢出。另外，在处理比较粘稠的全血样本时，全血过滤垫的致密纤维很容易被血液中的粘稠物质堵塞，造成样本无法顺利过滤，液体层析无法进行的问题，进而导致出现错误的检测结果。2.样品垫为玻纤垫或聚酯垫，在该样品垫中添加抗红细胞抗体(RBC抗体)，通过红细胞与RBC抗体进行免疫反应，产生较大体积的交联聚合物，被样品垫以过滤的方式去除。这种方法由于全血样本加入样品垫后，血细胞与RBC抗体的反应时间很短，很难有效地与单个RBC抗体产生充分的反应而形成交联聚合物，因此，在这种情况下，尚未充分反应形成聚合物的血细胞很容易通过样品垫层析到NC膜(硝酸纤维素膜)上，使NC膜发生堵塞，阻碍了标记抗体与待测样本形成测复合物继续层析流动，影响反应。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种免疫层析试纸条及包括其的装置。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提供的一种免疫层析试纸条，包括：
样品垫；
标记物垫，其连接于所述样品垫；
包被垫，其连接于所述标记物垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线；
吸水垫，其连接于所述包被垫；
其中，所述样品垫包括玻璃纤维垫，所述玻璃纤维垫上喷涂有RBC抗体复合物。
本发明的目的及解决其技术问题还进一步采用以下技术方案来实现。
作为上述免疫层析试纸条的优选方案，其中所述RBC抗体复合物在玻璃纤维垫上的喷涂量为50-70μL/cm2，优选为60μL/cm2，这样优选后与其他参数协同有助于与红细胞发生免疫反应。
作为上述免疫层析试纸条的优选方案，其中以抗体浓度计所述RBC抗体复合物的浓度为15-25mg/L，优选为20mg/L，这样优选后与其他参数协同有助于与红细胞发生免疫反应。
该RBC抗体复合物中含有较多数量的抗红细胞抗体，更易于同时与较多数量的血细胞进行免疫反应，形成更大的血细胞交联体，更容易被玻璃纤维垫过滤。
作为上述免疫层析试纸条的优选方案，其中所述包被垫为硝酸纤维素膜，所述包被垫上依次包被有分别作为检测线、质控线的检测抗体、质控抗体，两者之间的划膜浓度比为(0.5-3)：(0.5-3)。
作为上述免疫层析试纸条的优选方案，其中所述标记物垫较所述第一检测线更靠近所述样品垫；所述质控线较所述第二检测线更靠近所述吸水垫。
作为上述免疫层析试纸条的优选方案，其中所述标记抗体为一株可溶性生长刺激表达基因2蛋白特异性抗体；所述检测抗体为另一株可溶性生长刺激表达基因2蛋白特异性抗体；所述质控抗体为羊抗鼠IgG抗体。
作为上述免疫层析试纸条的优选方案，其中所述包被垫、样品垫、标记物垫和吸水垫均固定于所述底板上；所述吸水垫为吸水纸。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术方案来实现的。依据本发明提供的一种免疫层析试纸条的制备方法，包括：
1)在包被垫上包被检测线及质控线，将包被垫的两侧分别与样品垫、标记物垫和吸水垫粘接后并固定于底板，得到试纸条毛坯；
2)将步骤1)得到的试纸条毛坯裁切成所需尺寸即得所述的免疫层析试纸条。
作为上述免疫层析试纸条的制备方法的优选方案，其中所述样品垫通过以下步骤制得：
将抗红细胞抗体进行交联处理，形成抗红细胞抗体(RBC抗体)复合物溶液，将该抗红细胞抗体复合物溶液用缓冲液稀释至5mg/L-100mg/L(优选为20mg/L，若浓度过低，则需要的液体量偏高，超出玻纤垫的液体承载量；若浓度过高，则需要的液体量偏低，不易于在玻纤垫上均匀分布)，之后将其按30-100μL/cm2(优选为60μL/cm2，若液体量偏高，则超出玻纤垫的液体承载量；若液体量偏低，则不易于在玻纤垫上均匀分布)喷涂到玻璃纤维垫上，然后在37-40℃(优选为37℃，若温度过低，则需要的干燥时间过程；若温度过高，则会降低垫上抗体的活性)下干燥1-5小时(优选为3小时，若时间太短，则不能充分干燥；若时间太长，则容易降低垫上抗体的活性)。
作为上述免疫层析试纸条的制备方法的优选方案，其中所述交联处理为：将抗红细胞抗体与待标记物偶联，形成抗红细胞抗体复合物。
作为上述免疫层析试纸条的制备方法的优选方案，其中所述待标记物为乳胶微球、磁性微球、二氧化硅微球或者生物素-7-N-羟基琥珀酼亚胺-链霉亲和素；上述优选的待标记物能够通过简单的化学反应与RBC抗体进行偶联，形成RBC复合物，另外上述待标记物本身不会发出荧光，不会对检测系统(采用荧光微球进行检测)产生干扰。
作为上述免疫层析试纸条的制备方法的优选方案，其中所述乳胶微球为羧基白色乳胶微球。
作为上述免疫层析试纸条的制备方法的优选方案，其中当所述待标记物为羧基白色乳胶微球时，所述抗红细胞抗体复合物的制备具体包括：
A1、将羧基白色乳胶微球中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)进行活化；
B1、将活化后的羧基白色乳胶微球加入抗红细胞抗体进行偶联反应。
上述抗红细胞抗体通过与微球形成交联复合物，然后再包被到玻璃纤维膜上，易于与膜结合，更易于与红细胞形成复合物。
作为上述免疫层析试纸条的制备方法的优选方案，其中步骤A1中，所述乳胶微球与碳二亚胺的重量比例为1:0.1-1:5.0，优选为1:2.5；若降低碳二亚胺的用量，则活化效率减低；若提高碳二亚胺用量后，活化效率未发生明显提高。
作为上述免疫层析试纸条的制备方法的优选方案，其中步骤A1中，所述活化的pH值为5.0-7.0，优选为6.0(活化效率受到溶液pH值的影响较大，pH6.0的活化效率最高)；所述活化温度为4℃-37℃，优选为室温(活化效率及活化产物的稳定性同时受温度的影响，综合考虑两种影响因素，选择室温进行活化反应)；所述活化时间为10分钟-60分钟，优选为30分钟(活化效率及活化产物的稳定性同时受时间的影响，综合考虑两种影响因素，选择30分钟进行活化反应)。
作为上述免疫层析试纸条的制备方法的优选方案，其中步骤B1中，所述羧基白色乳胶微球与抗红细胞抗体的重量比例为10:1-100:1，优选为20:1，这样优选后与其他参数协同有助于偶联反应的进行。
作为上述免疫层析试纸条的制备方法的优选方案，其中步骤B1中，所述偶联反应的pH值为5.0-7.0，优选为6.0；(偶联效率受到溶液pH值的影响较大，pH6.0的偶联效率最高)所述偶联反应的温度为4℃-37℃，优选为室温(偶联效率及偶联产物的稳定性同时受温度的影响，综合考虑两种影响因素，选择室温进行偶联反应)；所述偶联反应的时间为0.5-4小时，优选为2小时(偶联效率及偶联产物的稳定性同时受温度的影响，综合考虑两种影响因素，选择室温进行偶联反应)。
作为上述免疫层析试纸条的制备方法的优选方案，其中当所述待标记物为生物素-7-N-羟基琥珀酼亚胺时，所述抗红细胞抗体复合物的制备具体包括：
A2、将生物素-7-N-羟基琥珀酼亚胺中加入抗红细胞抗体进行偶联反应；
B2、将抗红细胞抗体-生物素复合物中加入链霉亲和素(SA)进行偶联反应。
上述抗红细胞抗体通过链霉亲和素-生物素体系形成交联复合物，然后再包被到玻璃纤维膜上，易于与膜结合，更易于与红细胞形成复合物。
作为上述免疫层析试纸条的制备方法的优选方案，其中步骤A2中，所述抗红细胞抗体与生物素-7-N-羟基琥珀酼亚胺的摩尔比为1:5-1:110，优选为1:10；生物素-7-N-羟基琥珀酼亚胺的用量与标记结束后每个RBC抗体上标记的生物素-7-N-羟基琥珀酼亚胺的数量有关，当选择1:10的比例时，每个抗体上标记的生物素-7-N-羟基琥珀酼亚胺数量约为10，RBC抗体能够达到较好的活性；若标记量太少，则不易与链霉亲和素形成复合物，若标记量过多，则影响RBC抗体的活性。
作为上述免疫层析试纸条的制备方法的优选方案，其中步骤B2中，所述抗红细胞抗体-生物素复合物与链霉亲和素的摩尔比为1:0.1-1:10，优选为1:2.5；链霉亲和素加入量与复合物的形成效率及复合物大小有关，加入量太少，不易形成复合物，加入量太多，形成的复合物粒径太小。
作为上述免疫层析试纸条的制备方法的优选方案，其中所述缓冲液的配方如下：50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，0.5wt％酪蛋白，0.5wt％牛血清白蛋白，0.1wt％吐温20，0.05wt％聚乙二醇，0.1wt％吐温80，0.05wt％聚乙烯吡咯烷酮，0.3wt％二水合柠檬酸酸钠，2wt％蔗糖。
本发明进一步提供了免疫层析检测装置，包括上述的试纸条以及包裹所述试纸条的卡壳，所述试纸条组装到所述卡壳内，所述卡壳在样品垫的上方设有加样孔，所述第一检测线距加样孔15-25mm。
作为上述免疫层析检测装置的优选方案，其中所述卡壳由上盖和底槽组成；
所述底槽包括：位于其内表面的对称分布的多个定位孔，多个所述定位孔之间设有多个用于限定试纸条横向移动的第一限定部以及用于限定试纸条纵向移动的第二限定部；对称设置的所述第一限定部与所述第二限定部围设成试纸条放置区域；
所述上盖包括与多个所述定位孔相配合的多个定位柱；所述上盖还包括用于限定试纸条的上下移动的第三限定部。
作为上述免疫层析检测装置的优选方案，其中所述包被垫的上方设有用于数据采集的观察窗，且所述观察窗开设于所述上盖上与试纸条放置区域的中部相对应的位置。
作为上述的免疫层析检测装置的优选方案，其中所述上盖在与所述样品垫相对应的位置处开设有加样孔。
本发明的免疫层析试纸条的工作原理为：
1、全血样本加入到试剂卡样本孔中后，红细胞与样品垫上的RBC抗体复合物发生免疫反应，形成红细胞-RBC抗体复合物，该复合物体积较大，因而被样品垫的网状结构所截留。
2、全血样本中的血浆样本继续层析，将结合物垫上的标记抗体溶解并与其发生免疫反应，形成待测物-标记抗体复合物，继续层析。
3、待测物-标记抗体复合物层析到包被垫上的检测线位置，与包被的抗体发生免疫反应，形成包被抗体-待测物-标记抗体复合物。
4、未发生反应的标记抗体继续层析到包被垫上的质控线位置，与包被的羊抗鼠抗体发生免疫反应，形成羊抗鼠-标记抗体复合物。
5、通过计算检测线和质控线处的信号值，计算待测物的浓度值。
本发明通过用RBC抗体处理样品垫以期达到截留全血样本中的血细胞的方法中，不再直接将RBC抗体喷涂在样品垫上，而是通过预先将RBC抗体与其他物质进行偶联形成交联复合物，然后再用其处理样品垫。与RBC抗体进行偶联形成交联复合物的方式还包括其他的可以形成类似结构、起到相同作用的聚合物。
本发明具有以下有益效果：
本发明所述的免疫层析试纸条及包括其的装置，其RBC抗体复合物中的RBC抗体与红细胞发生免疫亲和反应，形成“红细胞-RBC抗体复合物-红细胞”的交联物质，由于RBC复合物相较于单独的RBC抗体，体积更大，红细胞结合位点更多，因此更容易与红细胞结合并被拦截到样品垫上；由于血细胞更易被截留在玻璃纤维膜上，因此更少的血细胞流动到NC膜上，不会使NC膜发生堵塞，便于标记物通行，提高了检测灵敏度。由于血细胞更易被截留在玻璃纤维膜上，因此更少的血细胞流动到NC膜上，不会与NC膜上的检测抗体发生非特异性反应。由于血细胞更易被截留在玻璃纤维膜上，因此更少的血细胞流动到NC膜上，不会造成NC膜反应区的红色本底背景，影响信号检测。另外由于提高了红细胞的截留效率，可以降低RBC的使用量，降低试剂卡的生产成本。
附图说明
图1为本发明实施例1或实施例2中的一种免疫层析试纸条的结构示意图；
图2A为本发明实施例1或实施例2的免疫层析检测装置实施例中一种底盖的内部结构示意图；
图2B为本发明实施例1或实施例2免疫层析检测装置实施例中一种上盖的内部结构示意图。
其中，PVC板-1；样品垫-2；包被垫-3；包被垫-4；标记物垫-5；31-第一检测线；32-第二检测线；33-质控线；11-上盖，12-底槽，13-加样孔，14-观察窗，15-试纸条放置区域，16-定位柱，17-定位孔，18-第一限定部，19-第二限定部，20-第三限定部。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1用于检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)的免疫层析试纸条的制备
1.1标记抗体的制备
(1)取50μL羧基荧光乳胶微球溶液(20mg/mL)，加入450μL的磷酸盐缓冲液(10mM，pH6.0)混合均匀；
(2)取5μL，500mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亚胺(EDC)溶液，加入步骤(1)稀释的羧基荧光乳胶微球溶液中(所述羧基荧光乳胶微球与EDC的重量比例为1:2.5)，混合均匀，室温反应30分钟；
(3)将步骤(2)活化结束的羧基荧光乳胶微球溶液使用磷酸盐缓冲液(10mM，pH6.0)离心清洗，转速为14000rpm，时间为9min，舍弃上清液，重复两次。
(4)将步骤(3)活化离心所得的荧光羧基乳胶微球沉淀中加入500μL磷酸盐缓冲液(10mM，pH6.0)超声混匀(40kHz，6min)，得到2mg/mL的羧基荧光乳胶微球溶液。
(5)将步骤(4)活化离心所得的羧基荧光乳胶微球溶液中加入100μg一株可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)特异性抗体(所述可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)特异性抗体与羧基荧光乳胶微球的重量比例为1:20)，超声混匀(40kHz，6min)，放置于摇床上，37℃，100rpm震荡反应2小时。反应过程中每半小时超声混匀一次(40kHz，6min)，避免沉淀产生。
(6)反应结束后使用磷酸盐缓冲液(10mM，pH6.0)离心清洗，转速为14000rpm，时间为9min，舍弃上清液，重复两次；最后加入500μL保存液(50mM Tris，0.5wt％BSA，pH 7.8)，以溶解步骤(5)标记好的羧基荧光乳胶微球，使得最终羧基荧光乳胶微球的浓度为0.2mg/mL，超声混匀(40kHz，6min)，4℃保存。
1.2标记物垫的制备
将上述1.1保存的标记抗体按抗体的浓度稀释到0.05mg/mL后，按照5μL/cm的量喷涂在玻璃纤维膜上，37℃干燥箱内干燥3小时，得到标记物垫，2-30℃保存备用。
1.3包被垫的制备
将另一株可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)特异性抗体用包被缓冲液稀释成固定浓度(2.0mg/ml)，质控线抗体(羊抗鼠IgG)分别用包被缓冲液稀释成固定浓度(2.0mg/ml)，采用专门的包被设备(BIODOT公司的XYZ3060)依次包被(包被量为1μl/cm)到赛多利斯CN95(硝酸纤维素膜)上，制备检测线31和质控线32，得到包被垫3，37℃干燥箱干燥4小时，备用；其中所述包被缓冲液的组成为：0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)+3wt％的蔗糖(作为保护剂)。
1.4样品垫制备
RBC复合物制备
(1)取1mg抗红细胞抗体(RBC抗体)，用磷酸盐缓冲液(10mM，pH7.4)稀释到1.0mg/mL；
(2)取5mg生物素-7-N-羟基琥珀酼亚胺(Biotin-7-NHS)，用2.5mL二甲基亚砜(DMSO)溶解至2mg/mL；
(3)取15μL步骤(2)溶解好的Biotin-7-NHS，加入步骤(1)中稀释的RBC抗体中，混合均匀，室温反应2小时，形成RBC-Biotin复合物；
(4)将链霉亲和素(SA)用磷酸盐缓冲液(10mM，pH7.4)稀释到1.0mg/mL；之后取180μL，1.0mg/mL的链霉亲和素，加入步骤(3)得到的RBC-Biotin复合物中(所述SA与RBC的摩尔比为1:2.5)，混合均匀，室温反应15分钟，得到SA-Biotin-RBC抗体复合物溶液，所述SA-Biotin-RBC抗体复合物的终浓度为0.837mg/mL。
样品垫处理：
将上述SA-Biotin-RBC抗体复合物用喷垫缓冲液稀释到20mg/L(以抗体浓度计算)后，按照60μL/cm2(平方厘米)的量喷涂到玻璃纤维垫上，37℃干燥箱干燥3小时备用。其中，所述喷垫缓冲液的配方为：50mM Tris-Cl缓冲液，0.5wt％Casein，0.5wt％BSA，0.1wt％Tween-20，0.05wt％PEG，0.1wt％Tween-80，0.05wt％PVP，0.3wt％二水合柠檬酸酸钠，2wt％蔗糖。
缩写：BSA：牛血清白蛋白，Casein：酪蛋白，Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，PEG：聚乙二醇，Tween-20：吐温20，Tween-80：吐温80，PVP：聚乙烯吡咯烷酮。
1.5试纸条的组装
首先在PVC板1上粘接包被垫3，然后在靠近包被垫3上的质控线33的一端搭接吸水垫4，在靠近包被垫3的第一检测线31的一端搭接标记物垫5及样品垫2，用切条机切成4mm±0.1mm的试纸条(见图1，每个试纸条上样品垫中含有的RBC抗体理论量为0.8μg)，所述包被垫3上依次包被有检测线31及质控线32；将试纸条放入卡壳中制备成检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)的免疫层析检测卡。
所述卡壳选自现有技术，例如，所述卡壳(如图2A、图2B所示)可以包括：底槽12，其连接于所述PVC板1；上盖11，其连接于所述底槽12，所述上盖11上设置有用于向所述样品垫2上加样的加样孔13；观察窗14，其设置于上盖11上，用于检测线31和质控线32的数据采集。
如图2B所示，所述底槽12包括：位于其内表面的对称分布的多个定位孔17，多个所述定位孔17之间设有多个用于限定试纸条横向移动的第一限定部18以及用于限定试纸条纵向移动的第二限定部19；对称设置的所述第一限定部18与所述第二限定部19围设成试纸条放置区域15(虚线区域)，用于放置试纸条；
如图2A所示，所述上盖11包括：与多个所述定位孔17相配合的多个定位柱16，这样配合使用以将上盖11和底槽12固定在一起；所述上盖11还包括用于限定试纸条的上下移动的第三限定部20。
所述包被垫3的上方设有用于数据采集的观察窗14，以露出全部所述检测线31和质控线32，用于收集其检测结果；且所述观察窗14开设于所述上盖11上与试纸条放置区域15的中部相对应的位置。所述上盖11在与所述样品垫2相对应的位置处开设有加样孔，以用于样品垫2上滴加样本。所述检测线距离加样孔15-25mm。
1.6检测
用移液器吸取75μL全血样本，滴加到所述检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)的免疫层析检测卡的加样孔13(对应试纸条的样品垫2)中，室温静置15min进行免疫层析反应，然后将该免疫层析检测卡插入到荧光免疫分析仪进行检测，即时可获得检测结果，检测结果见表1。
表1
Figure BDA0002550294140000101
注：上述的“阴性样本”、“弱阳性样本”、“阳性样本”和“强阳性样本”分别指的是在正常人阴性全血样本中添加可溶性生长刺激表达基因2蛋白校准品(2000ng/mL的可溶性生长刺激表达基因2蛋白溶液)，使其浓度分别为0ng/mL(阴性样本)；10ng/mL(弱阳性样本)；30ng/mL(阳性样本)；100ng/mL(强阳性样本)。
从表1的结果可以看出，本发明实施例1所述的检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)的免疫层析检测卡，在测试全血样本时，血细胞过滤效果更好，本底信号值更低，灵敏度明显的提高。这是由于，由于所述免疫层析检测卡能够提高全血样本中血细胞的过滤效果，使更多的血细胞被截留在样品垫上，无法流动到NC膜上，不会对NC膜造成堵塞，也不会影响检测线，因此，和直接将上述RBC抗体喷涂到玻纤垫上的对照相比较，检测阴性样本具有更低的本底信号，而检测阳性样本具有更高的反应信号，因此能够显著提高检测灵敏度。
实施例2用于检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)的免疫层析试纸条的制备
2.1标记抗体的制备
同实施例1的1.1。
2.2标记物垫的制备
同实施例1的1.2。
2.3包被垫的制备
同实施例1的1.3。
2.4样品垫制备
RBC复合物制备
(1)取50μL白色羧基乳胶微球(20mg/mL)，加入450μL的磷酸盐缓冲液(10mM，pH6.0)混合均匀；
(2)取5μL，500mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亚胺(EDC)溶液，加入步骤(1)中稀释的白色羧基乳胶微球溶液中，混合均匀，室温反应30分钟；所述白色羧基乳胶微球与EDC的重量比例为1:2.5；
(3)将步骤(2)活化结束的白色羧基乳胶微球使用磷酸盐缓冲液(10mM，pH6.0)离心清洗，转速为14000rpm，时间为9min，舍弃上清液，重复两次；最后加入500μL磷酸盐缓冲液(10mM，pH6.0)溶解活化白色羧基乳胶微球；
(4)将步骤(3)溶解活化的白色羧基乳胶微球溶液中加入RBC抗体100μg(所述白色羧基乳胶微球与RBC抗体的重量比例为20:1)，混合均匀，室温反应2小时，形成RBC抗体复合物；
(5)反应结束后，使用磷酸盐缓冲液(10mM，pH6.0)离心清洗，转速为14000rpm，时间为9min，舍弃上清液，重复两次，最后加入500μL保存液溶解步骤(4)标记好的白色羧基乳胶微球，使得所述RBC抗体复合物的终浓度为0.2mg/mL。
样品垫处理：
将上述RBC抗体复合物用喷垫缓冲液稀释到20mg/L后，按照60μL/cm2(平方厘米)的量喷涂到样品垫上，37℃干燥箱干燥3小时备用。其中，所述喷垫缓冲液的配方为：50mMTris-Cl缓冲液，0.5wt％Casein，0.5wt％BSA，0.1wt％Tween-20，0.05wt％PEG，0.1wt％Tween-80，0.05wt％PVP，0.3wt％二水合柠檬酸酸钠，2wt％蔗糖。
缩写：BSA：牛血清白蛋白，Casein：酪蛋白，Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，PEG：聚乙二醇，Tween-20：吐温20，Tween-80：吐温80，PVP：聚乙烯吡咯烷酮。
2.5试纸条的组装
同实施例1的1.5。
2.6检测
用移液器吸取75μL全血样本，滴加到所述检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)的免疫层析检测卡的加样孔13(对应试纸条的样品垫2)中，室温静置15min进行免疫层析反应，然后将该免疫层析检测卡插入到荧光免疫分析仪进行检测，即时可获得检测结果，检测结果见表2。
表2
Figure BDA0002550294140000121
注：上述的“阴性样本”、“弱阳性样本”、“阳性样本”和“强阳性样本”分别指的是在正常人阴性全血样本中添加可溶性生长刺激表达基因2蛋白校准品(2000ng/mL的可溶性生长刺激表达基因2蛋白溶液)，使其浓度分别为0ng/mL(阴性样本)；10ng/mL(弱阳性样本)；30ng/mL(阳性样本)；100ng/mL(强阳性样本)。
从表2的结果可以看出，本发明实施例2所述的检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)的免疫层析检测卡，在测试全血样本时，血细胞过滤效果更好，本底信号值更低，灵敏度明显的提高。这是由于，由于所述免疫层析检测卡能够提高全血样本中血细胞的过滤效果，使更多的血细胞被截留在样品垫上，无法流动到NC膜上，不会对NC膜造成堵塞，也不会影响检测线，因此，和直接将上述RBC抗体喷涂到玻纤垫上的对照相比较，检测阴性样本具有更低的本底信号，而检测阳性样本具有更高的反应信号，因此能够显著提高检测灵敏度。
本发明的说明书中，说明了大量具体细节。然而，能够理解，本发明的实施例可以在没有这些具体细节的情况下实践。在一些实施例中，并未详细示出公知的方法、结构和技术，以便不模糊对本说明书的理解。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种免疫层析试纸条，其特征在于，包括：
样品垫；
标记物垫，其连接于所述样品垫；
包被垫，其连接于所述标记物垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线；
吸水垫，其连接于所述包被垫；
其中，所述样品垫包括玻璃纤维垫，所述玻璃纤维垫上喷涂有RBC抗体复合物；
所述样品垫通过以下步骤制得：
将抗红细胞抗体进行交联处理，形成抗红细胞抗体复合物溶液，将该抗红细胞抗体复合物溶液用缓冲液稀释至5mg/L-100mg/L，之后将其按30-100μL/cm2喷涂到玻璃纤维垫上，然后在37-40℃下干燥1-5小时；
所述交联处理为：将抗红细胞抗体与待标记物偶联，形成抗红细胞抗体复合物；所述待标记物为乳胶微球、磁性微球、二氧化硅微球或者生物素-7-N-羟基琥珀酼亚胺-链霉亲和素。
2.如权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述RBC抗体复合物在玻璃纤维垫上的喷涂量为50-70μL/cm2；以抗体浓度计，所述RBC抗体复合物的浓度为15-25mg/L；所述包被垫为硝酸纤维素膜，所述包被垫上依次包被有分别作为检测线、质控线的检测抗体、质控抗体，两者之间的划膜浓度比为（0.5-3）：（0.5-3）；所述标记抗体为一株可溶性生长刺激表达基因2蛋白特异性抗体；所述检测抗体为另一株可溶性生长刺激表达基因2蛋白特异性抗体；所述质控抗体为羊抗鼠IgG抗体；所述包被垫、样品垫、标记物垫和吸水垫均固定于所述底板上；所述吸水垫为吸水纸。
3.一种权利要求1或2所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括：
1）在包被垫上包被检测线及质控线，将包被垫的两侧分别与样品垫、标记物垫和吸水垫粘接后并固定于底板，得到试纸条毛坯；
2）将步骤1）得到的试纸条毛坯裁切成所需尺寸即得所述的免疫层析试纸条。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述样品垫通过以下步骤制得：
将抗红细胞抗体进行交联处理，形成抗红细胞抗体复合物溶液，将该抗红细胞抗体复合物溶液用缓冲液稀释至5mg/L-100mg/L，之后将其按30-100μL/cm2喷涂到玻璃纤维垫上，然后在37-40℃下干燥1-5小时。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述交联处理为：将抗红细胞抗体与待标记物偶联，形成抗红细胞抗体复合物；所述待标记物为乳胶微球、磁性微球、二氧化硅微球或者生物素-7-N-羟基琥珀酼亚胺-链霉亲和素。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述乳胶微球为羧基白色乳胶微球；当所述待标记物为羧基白色乳胶微球时，所述抗红细胞抗体复合物的制备具体包括：
A1、将羧基白色乳胶微球中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺进行活化；
B1、将活化后的羧基白色乳胶微球加入抗红细胞抗体进行偶联反应。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤A1中，所述乳胶微球与碳二亚胺的重量比例为1:0.1-1:5.0；所述活化的pH值为5.0-7.0；所述活化温度为4℃-37℃；所述活化时间为10分钟-60分钟；步骤B1中，所述羧基白色乳胶微球与抗红细胞抗体的重量比例为10:1-100:1；所述偶联反应的pH值为5.0-7.0；所述偶联反应的温度为4℃-37℃；所述偶联反应的时间为0.5-4小时。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，当所述待标记物为生物素-7-N-羟基琥珀酼亚胺时，所述抗红细胞抗体复合物的制备具体包括：
A2、将生物素-7-N-羟基琥珀酼亚胺中加入抗红细胞抗体进行偶联反应；
B2、将抗红细胞抗体-生物素复合物中加入链霉亲和素进行偶联反应。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤A2中，所述抗红细胞抗体与生物素-7-N-羟基琥珀酼亚胺的摩尔比为1:5-1:110，优选为1:10；步骤B2中，所述链霉亲和素与抗红细胞抗体-生物素复合物的摩尔比为1:0.1-1:10。
10.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液的配方如下：50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，0.5wt%酪蛋白，0.5wt%牛血清白蛋白，0.1wt%吐温20，0.05wt%聚乙二醇，0.1wt%吐温80，0.05wt% 聚乙烯吡咯烷酮，0.3wt%二水合柠檬酸酸钠，2wt%蔗糖。
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