JP2001133456A

JP2001133456A - 感度の向上した免疫分析装置および免疫分析装置の感度を向上させる方法。

Info

Publication number: JP2001133456A
Application number: JP31584199A
Authority: JP
Inventors: Tomoaki Tanimoto; 朋陽谷本
Original assignee: Dainabot Co Ltd
Current assignee: Abbott Japan Co Ltd
Priority date: 1999-11-05
Filing date: 1999-11-05
Publication date: 2001-05-18

Abstract

(57)【要約】【課題】感度が改善されたクロマトグラフィストリッ
プを有する免疫分析装置を提供することを目的とする。【解決手段】少なくとも試料添加領域と検出領域を有
する免疫分析装置において、検出領域における発色反応
に関与する試薬中にスルホン酸基を有する高分子重合体
を添加することにより該免疫分析装置の検出感度が上昇
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明はクロマトグラフィ
ストリップを有する免疫分析装置および該免疫分析装置
を用いる検査方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】よく知られているように、クロマトグラ
フィストリップを有する免疫分析装置は、クロマトグラ
フィストリップの一端に設けられた被検試料液が添加さ
れる試料添加領域と、その下流に設けられた被検試料液
中の分析対象物を検出するための検出領域とを、少なく
とも有する。また、クロマトグラフィストリップは、そ
の中を、試料添加領域に添加された被検試料液が後記ト
レーサー等の分析試薬と被検試料液中の分析対象物と共
に毛細管流により移動できるように、設けられている。

【０００３】検出領域は、そこに到着した被検試料液中
の分析対象物の有無又は量に応じて発色するように設け
られている。従って、検出領域の発色程度に応じて被検
試料液中の分析対象物の有無又は量を検出又は測定する
ことができる。

【０００４】このような免疫分析用クロマトグラフィス
トリップは、特開昭６１−１４５４５９、特開昭６４−
３２１６９、特開平１−１１３６６２、特開平１−２４
４３７０、特開平１−６３８６５及び特表平１−５０３
１７４等に記載されており、これらの記載も、本明細書
の一部とする。

【０００５】このような免疫分析装置を用いる検査方法
は、短時間に検査ができ、またその操作も簡易であっ
た。しかし、感染症の診断等においては特に高い検出感
度が要求され、被検出物の検出感度を更に高める等の改
善の余地があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】この発明は、従って、
検出感度等が改善されたクロマトグラフィストリップを
有する免疫分析装置及びその製造法を提供することを目
的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、クロマト
グラフィストリップを用いた免疫分析装置において、検
出領域における発色反応の際にスルホン酸基を有する高
分子重合体を含ませることにより該免疫分析装置の検出
感度が上昇することを知った。

【０００８】即ち、この発明は、上述のクロマトグラフ
ィストリップを用いる免疫分析装置において、発色反応
が生じる検出領域または検出領域の上流側にスルホン酸
基を有する高分子重合体を含ませることにより、検出感
度が上昇した免疫分析装置である。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の免疫分析装置のクロマト
グラフィストリップは、知られているクロマトグラフィ
ストリップと異なるものではない。即ち、クロマトグラ
フィストリップは、分析対象物、トレーサー等の分析試
薬を、分析対象物を含む可能性がある被検試料液のクロ
マトグラフィストリップ中の毛細管流による移動によ
り、下流に移動させることができるものである。クロマ
トグラフィストリップは、試料添加領域および試料添加
領域の下流に配置された検出領域を少なくとも有する。
また、検出領域の下流に配置された対照領域を有してい
ても良いし、試料添加領域と検出領域との間に、トレー
サーが毛細管流により移動可能なように置かれている標
識領域を有していてもよい。さらに、クロマトグラフィ
ストリップの一端（最下流）に、吸収領域を有していて
もよい。

【００１０】クロマトグラフィ担体は、水性溶媒で溶質
を展開できるものであれば、どのようなものであっても
良い。該担体としては、例えば、網目構造をもつニトロ
セルロース膜、ナイロン膜若しくはセルロース膜、セル
ロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポ
リアクリレート、ガラス、アガロース、ポリウレタン等
またはこれらと無機粉末とを組合せたものを材料とした
不織布からなるものがある。クロマトグラフィ担体に必
要により適当な基材を貼り合わせる等してクロマトグラ
フィストリップが得られる。

【００１１】分析対象物は、通常、生体試料中等に含ま
れている抗原または抗体である。

【００１２】生体試料は、全血、血清、血漿、尿、唾
液、汗等が含まれる。

【００１３】よく知られているクロマトグラフィストリ
ップと同様に、試料添加領域は、クロマトグラフィスト
リップの一端（最上流）に設けられていて、被検試料液
が添加される領域である。試料は単独で添加しても良い
し、緩衝液または生理食塩水等で、適宜希釈して用いて
も良い。さらに、試料添加後に、一定量の緩衝液または
生理食塩水を添加しても良い。

【００１４】検出領域は、標識された抗原又は抗体等か
らなるトレーサーが、毛細管流により上流から移動して
きた試料液体中の被検出物質の有無または量に応じて蓄
積されるように設けられている。「被検出物質の有無ま
たは量に応じて」とは、サンドウィッチアッセイの場合
にはトレーサーの蓄積量が増加し、競合アッセイの場合
にはトレーサーの蓄積量が減少することを示す。すなわ
ち、検出領域には、被検出物質が特異的に、または被検
出物質及びトレーサーが競合して、必要によりある種の
架橋体を介して、結合する化合物が固相化されている。

【００１５】検出領域は分析対象物と特異的に結合する
抗原または抗体、すなわち、分析対象物が抗原である場
合には、その抗原と特異的に結合する、抗体またはその
抗体のフラグメントを含み、分析対象物が抗体である場
合には、その抗体と特異的に結合する、抗原、若しくは
その抗原の誘導体、または分析対象物の抗体により異種
動物を感作して得た抗体を含む。

【００１６】クロマトグラフィストリップが標識領域を
有しない場合には、トレーサーは、試料液体と共に試料
添加領域に添加される。クロマトグラフィストリップが
標識領域を有する場合には、トレーサーは、該標識領域
に滴下又は浸漬後乾燥などのよく知られた方法により添
加される。

【００１７】トレーサーは、サンドウィッチアッセイの
場合には、分析対象物と特異的に結合する化合物を着色
微粒子や酵素などの標識剤で標識したものであり、競合
アッセイの場合には、被検出物質または被検出物質類似
体を着色微粒子や酵素などの標識剤で標識したものであ
る。

【００１８】着色微粒子としては、セレニウムコロイド
等の非金属コロイド、金コロイド等の金属コロイド、着
色樹脂粒子、染料コロイド及び着色リポソーム等が知ら
れている。酵素標識トレーサーを使用するときは発色が
起こる基質が加えられる。該基質としては、通常の可視
部で発色が起こるもの、蛍光を発するもの又は紫外部で
発色が起こる物質も含まれる。

【００１９】上記標識された化合物は、よく知られてい
るように、サンドウィッチアッセイにおいては、分析対
象物が抗原である場合には、その抗原と特異的に結合す
る抗体またはその抗体のフラグメントである。分析対象
物が抗体である場合には、その抗体と特異的に結合す
る、抗原、若しくはその抗原の誘導体、または分析対象
物の抗体により異種動物を感作して得た抗体である。競
合アッセイにおいては、分析対象物が抗原である場合に
は、その抗原、またはその抗原の類似体である。分析対
象物が抗体である場合には、その抗体、またはその抗体
の類似体である。

【００２０】該化合物を着色微粒子または酵素等で標識
するには、知られている通常の方法が使用できる。

【００２１】対照領域は、トレーサーの反応性が維持さ
れていることを確認するための領域であり、必要があれ
ば、検出領域の下流に発色するように設けられている。
対照領域にはトレーサーと結合する物質、例えば被標識
化合物と抗原抗体反応等により結合する物質を固相化さ
せることもできる。

【００２２】試料添加領域、標識領域及び対照領域はク
ロマトグラフィ担体上に設けても良いし、またクロマト
グラフィ担体とは別に製造し、クロマトグラフィ担体と
組合せてクロマトグラフィストリップを製造しても良
い。

【００２３】また、吸収領域をクロマトグラフィストリ
ップの下流端に接触させて設けても良く、該領域はろ
紙、不織布またはそれらに高分子吸収体を混合したもの
等の吸水性のある材料でできている。

【００２４】スルホン酸基を有する高分子重合体は、上
述の発色反応が生じる検出領域または検出領域の上流に
含ませることができる。即ち、スルホン酸基を有する高
分子重合体は、試料添加領域に予め一定量添加されてい
ても、標識領域がクロマトグラフィストリップ上に設け
られている場合は、該領域に予め添加され、標識領域が
クロマトグラフィストリップ上に設けられていない場合
は、試料溶液と共に試料添加領域に添加されるトレーサ
ー中に含まれていても良い。また、検出領域に予め添加
しておいても良い。さらに、添加前の試料中に一定濃度
で添加して検査の際に試料と共に添加しても良い。勿
論、試料とは独立に添加しても良い。さらにまた、標識
領域と検出領域の間にスルホン酸基を有する高分子重合
体領域をクロマトグラフィストリップ上に設けても良
い。要は、固相化抗原または抗体、分析対象物およびト
レーサーの結合が生じる際に、一定濃度のスルホン酸基
を有する高分子重合体が存在していれば良い。

【００２５】予めクロマトグラフィストリップに含ませ
るスルホン酸基を有する高分子重合体、または検査の際
に、免疫分析装置に添加されるスルホン酸基を有する高
分子重合体の量は、免疫分析装置に添加される溶液の体
積に対して０．１重量％〜１０重量％、好ましくは０．
５重量％〜５重量％、さらに好ましくは１重量％〜３重
量％である。例えば、免疫分析装置の試料添加領域に５
０μｌの試料および/または緩衝液等の溶液が添加され
る場合は、５０μｇ〜５ｍｇ、好ましくは０．２５ｍｇ
〜２．５ｍｇ、さらに好ましくは０．５ｍｇ〜１．５ｍ
ｇのスルホン酸基を有する高分子重合体がクロマトグラ
フィストリップに含まれ、または添加される。

【００２６】スルホン酸基を有する高分子重合体には、
ビニルスルホン酸の重合体（PVSA）、スチレンスルホン
酸の重合体またはスチレンスルホン酸とマレイン酸の共
重合体等が含まれ、これらの塩(Poly(vinylsulfonic ac
id, sodium salt), Poly(sodium 4-styrenesulfonate),
Poly(styrenesulfonic acid-co-maleic acid), sodium
salt等)も含まれる。

【００２７】さらに、図面を用いて説明する。図１は標
識領域が配置されているクロマトグラフィストリップを
表し、クロマトグラフィストリップ１には、トレーサー
が水性溶媒にて展開可能なように配置されている標識領
域２がある。標識領域２の上流には試料添加領域３が配
置されている。標識領域２の下流には検出領域４および
対照領域５が配置され、さらにその下流には吸収領域６
が配置されている。

【００２８】以下、実施例により、さらに本発明を説明
する。

【００２９】

【実施例】実施例1 熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium fa
lciparum) HRP-2抗原(以下Pf HRP-2とする)の検出のた
めのイムノクロマトグラフィストリップの製造。

【００３０】Pf HRP-2抗体トレーサーを次のようにして
調製した。91 mMのL-アスコルビン酸ナトリウムと32 mM
の酸化セレニウムとを約4℃で15分、次いで約42℃で70時
間撹拌して、セレニウムコロイドを調製した。得られたセ
レニウムコロイドを一度精製水で洗浄し、550 nmにおけ
る吸光度が30になるように10 mM Bis-Tris緩衝液(pH 7.
0)で希釈した。この希釈液にPf HRP-2抗体を40 μg/mLに
なるように添加し、40℃で20分撹拌した。次いで牛血清ア
ルブミン(以下BSA)を1%になるように加えて40℃で25分
撹拌し、セレニウムコロイドをBSAで被覆し、次いで1% BS
Aを含む10 mM Bis-Tris緩衝液(pH 7.0)で洗浄した。

【００３１】標識領域を次のように調製した。トレーサ
ー希釈液として、2%ショ糖、4%アルカリ処理カゼイン(米
国 Abbott Laboratories調製品)、20% 牛胎児血清、0.5%
HBR (米国Scantibody社製)を含む100 mM Tris緩衝液(pH
8.5)を調製した。上記Pf HRP-2抗体トレーサーをOD 15
になるようにトレーサー希釈液に添加した。この液にガ
ラス線維不織布(米国Ahlstrom社製 8980)を浸しこの液
を十分しみ込ませた後、ガラス繊維不織布を乾燥させ、標
識領域とした。

【００３２】検出領域を次のように調製した。 Pf HRP-2
抗体を2 mg/mLになるように10%ショ糖を含む100 mM Tri
s緩衝液(pH 8.5)で希釈した。一方、クロマトグラフィー
担体として、0.4 x 3.2 cmの長方形の孔径5 μmのニトロ
セルロース膜(米国Millipore社製)を0.4 x 6.5 cmの長
方形のストリップ支持体(王子タック社製、 PETフィルム
に粘着剤が塗布されたもの)に、長い辺を縦としたときに
上端から1.2 cmの間隔を開けて貼付した。ストリップ支
持体に貼付したニトロセルロース膜の下端から約1 cmの
ところに線状にこの溶液を滴下した後、十分に乾燥させ、
Pf HRP-2抗体をニトロセルロース上に固定した。

【００３３】試料添加領域を次のように調製した。0.2%
Triton X-100、2.4% PVSA［Poly(vinylsulfonic acid)、
米国Aldrich社製］、0.3 mg/mL HBRを含む10 mM Tris緩
衝液(pH 8.0)にガラス線維不織布(米国Ahlstrom社製 89
80)を浸しこの液を十分しみ込ませた後、ガラス繊維不織
布を乾燥させ、試料添加領域とした。

【００３４】クロマトグラフィストリップを次のように
調製した。Pf HRP-2抗体を固定したニトロセルロースの
下側のストリップ支持体上に、0.4 x 0.4 cmの正方形に
切断した上記標識領域をニトロセルロースとわずかに接
するように貼付した。標識領域下端のストリップ支持体
上に0.4 x 1.7 cmの長方形に切断した試料添加領域を標
識領域とわずかに接するように貼付した。吸収領域とし
て0.4 x 1.6 cmの長方形に切断した濾紙(アドバンテッ
ク東洋製)をニトロセルロースの上側に0.4 cmオーバー
ラップして貼付した。さらに、0.4 x 5.6 cmの長方形の保
護フィルム(王子タック社製、 PETフィルムに粘着剤が
塗布されたもの)を長い辺を縦としたときに上端が揃う
ように貼付し、これをクロマトグラフィーストリップと
した。

【００３５】対照クロマトグラフィストリップを試料添
加領域を上記クロマトグラフィストリップと次のように
変えて調製した。即ち、 Pf HRP-2抗体を固定したニトロ
セルロースの下側のストリップ支持体上に、0.4 x 0.4 c
mの正方形に切断した上記標識領域をニトロセルロース
とわずかに接するように貼付した。0.2% Triton X-100、
0.3 mg/mL HBRを含む10 mM Tris緩衝液(pH 8.0)にガラ
ス線維不織布(米国Ahlstrom社製 8980)を浸しこの液を
十分しみ込ませた後、ガラス繊維不織布を乾燥させるこ
とにより調製した試料添加領域を0.4 x 1.7 cmの長方形
に切断し、標識領域下端のストリップ支持体上に、標識領
域とわずかに接するように貼付した。吸収領域として0.4
x 1.6 cmの長方形に切断した濾紙(アドバンテック東洋
製)をニトロセルロースの上側に0.4 cmオーバーラップ
して貼付した。さらに、0.4 x 5.6 cmの長方形の保護フィ
ルム(王子タック社製、 PETフィルムに粘着剤が塗布され
たもの)を長い辺を縦としたときに上端が揃うように貼
付した。

【００３６】実施例2 Pf HRP-2の検出実施例1で製造したクロマトグラフィストリップおよび
対照クロマトグラフィストリップを用いて以下のように
Pf HRP-2の検出を行った。

【００３７】熱帯熱マラリア原虫を含む血液を適宜に血
液で希釈し、1 μLの血液に400, 200, 100, 50, 25匹の
熱帯熱マラリア原虫を含む血液を調製し、これらと熱帯
熱マラリア原虫を含まない血液を検体液とした。実施例1
で製造したクロマトグラフィストリップおよび対照クロ
マトグラフィストリップの試料添加領域にこれらの検体
液を2 μLずつ添加し、その直後に同領域に10 mM Tris緩
衝液(pH 8.8)を50 μL添加した。検体液添加30分後に検
出領域においてセレニウムコロイド由来の”赤さ”が肉
眼で読みとれた場合に「陽性」とし、読みとれなかった場
合に「陰性」とした。陽性と判定された最小熱帯熱マラリ
ア原虫濃度をもって感度とした。

【００３８】結果を表1に示す。表1に示されるように、対
照クロマトグラフィストリップでは400匹/μLの感度で
あったのに対して、本願発明に係るクロマトグラフィス
トリップでは50匹/μLの感度を示した。

【００３９】

【表１】

【００４０】

【発明の効果】以上述べたように、免疫分析装置におい
て、検出領域または検出領域の上流にスルホン酸基を有
する高分子重合体を含ませることにより検出感度に優れ
た免疫分析装置が得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】標識領域が配置されているクロマトグラフィス
トリップを表す。

【符号の説明】

１クロマトグラフィストリップ２標識領域３試料添加領域４検出領域５対照領域６吸収領域

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも試料添加領域と検出領域を含
むクロマトグラフィストリップを有する免疫分析装置で
あって、検出領域または検出領域の上流にスルホン酸基
を有する高分子重合体を含むことを特徴とするクロマト
グラフィストリップを有する免疫分析装置。
【請求項２】スルホン酸基を有する高分子重合体が免
疫分析装置に添加される溶液の体積に対して０．１重量
％〜１０重量％含まれる請求項１に記載のクロマトグラ
フィストリップを有する免疫分析装置。
【請求項３】スルホン酸基を有する高分子重合体が免
疫分析装置に添加される溶液の体積に対して０．５重量
％〜５重量％含まれる請求項１に記載のクロマトグラフ
ィストリップを有する免疫分析装置。
【請求項４】スルホン酸基を有する高分子重合体が免
疫分析装置に添加される溶液の体積に対して１重量％〜
３重量％含まれる請求項１に記載のクロマトグラフィス
トリップを有する免疫分析装置。
【請求項５】スルホン酸基を有する高分子重合体がビ
ニルスルホン酸の重合体、スチレンスルホン酸の重合体
またはスチレンスルホン酸とマレイン酸の共重合体から
なる群から選択される請求項１〜４のいずれか１項に記
載のクロマトグラフィストリップを有する免疫分析装
置。
【請求項６】少なくとも試料添加領域と検出領域を含
むクロマトグラフィストリップを有し、検出領域または
検出領域の上流に予めスルホン酸基を有する高分子重合
体を含んでいるか、または検査時にスルホン酸基を有す
る高分子重合体をクロマトグラフィストリップに添加す
る免疫分析装置を用いる検査方法。
【請求項７】スルホン酸基を有する高分子重合体が免
疫分析装置に添加される溶液の体積に対して０．１重量
％〜１０重量％予め含まれるか、または検査時に添加さ
れる請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】スルホン酸基を有する高分子重合体が免
疫分析装置に添加される溶液の体積に対して０．５重量
％〜５重量％予め含まれるか、または検査時に添加され
る請求項６に記載の検査方法。
【請求項９】スルホン酸基を有する高分子重合体が免
疫分析装置に添加される溶液の体積に対して１重量％〜
３重量％予め含まれるか、または検査時に添加される請
求項６に記載の検査方法。
【請求項１０】スルホン酸基を有する高分子重合体が
ビニルスルホン酸の重合体、スチレンスルホン酸の重合
体またはスチレンスルホン酸とマレイン酸の共重合体か
らなる群から選択される請求項６〜１０のいずれか１項
に記載の検査方法。