CN113846066A - 分泌st2抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了能够分泌ST2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株分泌的ST2的抗体可以高效的用于双抗体夹心法对ST2进行检测，本发明的杂交瘤细胞株分泌的单抗，可用于制备双抗夹心ELISA检测ST2所需的配对单克隆抗体，在优选的实施方式中，用于血液中ST2蛋白的双抗夹心ELISA检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种产生/分泌ST2抗体的杂交瘤细 胞株以及其应用。
背景技术
ST2是白介素1受体家族的成员，也称为生长刺激表达基因2蛋白。ST2 有两个主要亚型：跨膜型或细胞型(ST2L)和可溶性型或循环型(sST2)。ST2 是白介素33(IL-33)的受体，IL-33被认为是一种核因子，通过结合心肌细胞 膜表面受体ST2L，启动下游信号传导通路，保护心肌，改善心肌功能，而ST2 与ST2L竞争结合IL-33，降低IL-33/ST2L系统保护心脏的功效。研究显示， 急性失代偿心衰患者ST2＞35ng/ml时，一年内患者死亡与心衰再住院风险显 著增高，一年内死亡率与ST2浓度呈正相关。ST2检测在临床应用中的价值受 到了越来越多的关注。
双抗体(原)夹心法，通常是结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其 免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。受 检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成 的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体，通过 反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分 析。酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高 的敏感度。
对于ST2的免疫学检测，获得高质量的ST2抗体至关重要，尤其是能用 于ST2的双抗体夹心法检测的抗体至关重要。
发明内容
本发明提供了能够分泌ST2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞 株分泌的ST2的抗体可以高效的用于双抗体夹心法对ST2进行检测。
本发明的杂交瘤细胞株分泌的单抗，可用于制备双抗夹心ELISA检测ST2 所需的配对单克隆抗体，在优选的实施方式中，用于血液中ST2蛋白的双抗夹 心ELISA检测。
本发明中，分泌2#、4#和6#单克隆抗体的杂交瘤细胞株分别为7G3、4C8 和11G5，相关杂交瘤细胞株已于2021年6月10日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，邮编：100101，电话：010-64807355；其中，杂交瘤细胞7G3 的保藏编号为CGMCC No.22353，杂交瘤细胞4C8的保藏编号为CGMCC No.22355，杂交瘤细胞11G5的保藏编号为CGMCC No.22354。
一方面，本发明提供了分泌ST2(生长刺激表达基因2蛋白)抗体的杂交 瘤细胞，所述杂交瘤细胞选自上述杂交瘤细胞株分别为7G3、4C8和11G5中 的一种或任意几种组合。
另一方面，本发明还提供了ST2的单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述杂 交瘤细胞分泌产生。
另一方面，本发明还提供了上述杂交瘤细胞在制备ST2的单克隆抗体中的 应用。
另一方面，本发明还提供了一种检测ST2的试剂盒，所述试剂盒包括上述 杂交瘤细胞或上述单克隆抗体。
另一方面，本发明还提供了上述杂交瘤细胞或上述单克隆抗体在检测ST2 中的应用，或者在制备检测ST2的试剂盒中的应用。
在优选的实施方式中，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒，更优选，采用 ELISA双抗体夹心法检测ST2蛋白。
在用于双抗体夹心法检测ST2蛋白时，所述杂交瘤细胞7G3分泌的抗体 可以作为“包被抗体”(或者，称之为“捕获抗体”)，所述杂交瘤细胞4C8或 杂交瘤细胞11G5分泌的抗体可以作为“结合抗体”(或者，称之为“检测抗体”)。
术语“包被抗体”(或者，称之为“捕获抗体”)是指包被于固相的酶标板 上的抗体。术语“结合抗体”(或者，称之为“检测抗体”)是指试剂盒中可与 待测抗原(ST2)及酶标记的抗抗体结合的特异性抗体。本领域技术人员能够 理解，“包被抗体”是能够首先特异性识别待测抗原的抗体，“结合抗体”是另 一种能够特异性识别待测抗原的抗体。
另一方面，本发明还提供了一种利用双抗体夹心法检测ST2的方法，所述 方法包括利用杂交瘤细胞7G3分泌的抗体作为捕获抗体，以及利用杂交瘤细胞 4C8或杂交瘤细胞11G5分泌的抗体作为检测抗体，对ST2进行检测的步骤； 优选的，用于检测受试者血清中的ST2。
另一方面，本发明还提供了上述杂交瘤细胞株、上述抗体、上述试剂盒在 检测ST2中的应用；在优选的实施方式中，检测受试者血清或血浆中的ST2。
本发明中提供了以下技术方案：
一种能够分泌ST2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为杂交 瘤细胞7G3，所述杂交瘤细胞7G3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年6月10日，保藏单位地址：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，电话：010-64807355，保藏编 号为CGMCC No.22353。
一种组合使用的能够分泌ST2单克隆抗体的杂交瘤细胞株组合，所述杂交 瘤细胞株组合包括杂交瘤细胞7G3，所述杂交瘤细胞株组合还包括选自杂交瘤 细胞4C8和杂交瘤细胞11G5中的一种或两种；
所述杂交瘤细胞4C8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(CGMCC)，保藏日期为2021年6月10日，保藏单位地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，邮编：100101，电话：010-64807355，保藏编号为CGMCC No.22355；
所述杂交瘤细胞11G5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(CGMCC)，保藏日期为2021年6月10日，保藏单位地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，邮编：100101，电话：010-64807355，保藏编号为CGMCC No.22354。
一种结合ST2的单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株或上述 杂交瘤细胞株组合分泌产生。
本发明还提供了用于双抗夹心法检测ST2的单克隆抗体组合，所述单克隆 抗体组合由以下抗体组成：(1)由杂交瘤细胞7G3分泌的单克隆抗体；(2)由 杂交瘤细胞4C8或杂交瘤细胞11G5分泌的单克隆抗体。
本发明还提供了上述杂交瘤细胞株或杂交瘤细胞株组合在制备ST2的单 克隆抗体中的应用。
本发明还提供了一种检测ST2的试剂盒，所述试剂盒包括权上述杂交瘤细 胞株，或者杂交瘤细胞株组合，或者单克隆抗体，或者，单克隆抗体组合。
本发明还提供了上述杂交瘤细胞株，或者杂交瘤细胞株组合，或者单克隆 抗体，或者，单克隆抗体组合在检测ST2中的应用，或者在制备检测ST2的 试剂或试剂盒中的应用。优选的，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。优选的， 所述检测ST2为采用ELISA双抗体夹心法检测ST2蛋白。优选的，所述检测 ST2为检测受试者血清或血浆中的ST2。
本发明还提供了一种利用双抗体夹心法检测ST2的方法，所述方法包括利 用杂交瘤细胞7G3分泌的抗体作为捕获抗体，以及杂交瘤细胞4C8和/或杂交 瘤细胞11G5分泌的抗体作为检测抗体，对ST2进行检测的步骤。
附图说明
图1.目的蛋白His-ST2的纯化结果电泳图。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较 佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员 可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离 本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或 等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、实验动物及细胞的准备
选择8-10周龄BALB/c雌性小鼠寄养于中国科学院生物物理研究所实验动 物研究中心。小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0培养在IMDM(HyClone)中，添加10％胎 牛血清(GIBCO)和1％双抗(青链霉素)(Gibco)。所有细胞的细胞培养箱培养 条件为37℃，5％CO2。
实施例2、ST2蛋白的分离纯化
根据NCBI上公布的ST2序列(NM_003856.2)进行基因合成，N端加上 His标签(His-ST2)，克隆入pCDNA3.1载体，在293F细胞中表达。培养上清 过镍柱进行纯化，获得His-ST2蛋白。200g离心3分钟去掉细胞，然后10000g 离心10分钟去掉培养基中的杂质后用0.45μm的滤膜过滤。将过滤后的上清添 加到填有硫酸镍(NiSO4)的Sepharose High Performance(Amersham Bioscience) 的层析柱中，用含有12.5mM咪唑的磷酸盐缓冲液洗杂蛋白，之后用含有250 mM咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱目的蛋白，洗脱液用超滤管浓缩，获得目的蛋白。目的蛋白的纯化结果见图1。
实施例3、ST2单克隆抗体的制备
10周龄雌性BABL/c小鼠2只用作免疫动物。纯化的His-ST2蛋白加弗氏 完全佐剂乳化后免疫小鼠，皮下四肢六点注射，每只小鼠60μg蛋白量。两周 后弗氏不完全佐剂乳化蛋白，每只小鼠皮下注射30μg蛋白量，此过程重复一 次。在第三次免疫一周后眼角内侧取血，测血清效价，评估是否可以进行杂交 瘤融合制备单抗。取效价最高小鼠100μg蛋白腹腔注射，72小时内进行融合。 杂交瘤制备基本步骤：免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞以2：1的比例使 用聚乙二醇(PEG)1500(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)在 37℃水浴中进行融合，融合后细胞重悬于HAT(次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷) IMDM(Hyclone)选择性培养基，每孔200μl接种到96孔板，37℃，5％CO2培养箱中培养7天后取100μl上清用于阳性克隆的ELISA筛选，获得了278株 阳性克隆株。挑选阳性克隆，进一步使用梯度稀释法进行亚克隆，最终获得17 株单克隆细胞株。
实施例4、腹水生产小鼠单抗
11周龄雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射1mL石蜡油，一周后腹腔 注射0.5mL总量为3.0x106个杂交瘤细胞。细胞要用无血清培养基洗三次。 一周后观察小鼠腹围，约3.5cm时可抽取小鼠腹水并用Protein G Column(生 工)进行纯化，获得17个单克隆抗体蛋白。
实施例5、单抗配对效果检测
对纯化的单克隆抗体蛋白进行HRP标记，两两配对，进行双抗夹心ELISA 检测，检测抗原采用重组ST2蛋白。实验方案如下：
溶液配制：1.包板液：15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH 9.6；2.洗液： PBS+0.05％Tw20；3.封闭液：PBS+3％BSA；4.稀释液：PBS+1％BSA+0.1％ Tw20；
操作步骤：1.抗体包板，20μg/mL，4度过夜；2.洗板2次，封闭，250μL/ 孔，37度2小时；3.洗板2次，加抗原(用稀释液配制)100μL/孔，37度1 小时；4洗板3次，加HRP酶标抗体(1:500稀释)，100μL/孔，37度1小 时；5洗板3次，TMB显色；最终采用酶标仪检测OD450的吸光度；结果 如表1和表2所示。
表1.不同抗体配对检测结果
表1中，不同的抗体使用时，表格中所列的是捕获抗体-检测抗体的顺序， 例如，“2#-4#”，其中的2#作为捕获抗体，4#作为检测抗体。
表2.不同抗体配对检测结果
由表1-2可知，在所测试的不同的单抗配对检测结果中，2#单抗在与其他 抗体配对时，包括在自身配对时，与其他抗体配对结果相比，都有更高的检测 信号，这提示2#单抗与其他抗体配对效果比较好，在后续的工作中，我们重点 关注了2#抗体和其他抗体的实际应用效果。
实施例6、利用2#单抗作为捕获抗体(包被抗体)与其他抗体配对效果检 测
采用与实施例5相同的方法(此次实施例改用Biotin标记抗体)，以2#单 抗为捕获抗体，与其他不同的单抗进行配对检测。
表3. 2#单抗与不同抗体配对检测结果
如表3所示，我们用重组ST2蛋白和正常人血样，对16对抗体对进行了 测试，只有2#-6#抗体对和2#-4#抗体对重组ST2蛋白和正常人血样均与阴性 对照有明显区别，所以，选择2#-6#抗体对和2#-4#抗体对进行检测效果的验证。
产生2#、4#和6#抗体的杂交瘤细胞株分别为7G3、4C8和11G5，相关杂 交瘤细胞株已于2021年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 邮编：100101，电话：010-64807355；其中，杂交瘤细胞7G3的保藏编号为 CGMCC No.22353，杂交瘤细胞4C8的保藏编号为CGMCCNo.22355，杂交瘤 细胞11G5的保藏编号为CGMCC No.22354。
实施例7、利用2#-6#和2#-4#双抗夹心法进行检测
以2#-6#和2#-4#配对的抗体进行双抗检测，其中，2#为捕获抗体，4#或6# 为检测抗体。
采用如下方法进行测试：
溶液配制：1.包板液：15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH 9.6，2.洗液： PBS+0.05％Tw20，3.封闭液：PBS+3％BSA，4.稀释液：PBS+1％BSA+0.1％ Tw20；
双抗夹心ELISA步骤：1.2#抗体包板，20μg/mL，4度过夜，2.洗板2次， 封闭，250μL/孔，37度2小时，3.洗板2次，加抗原(用稀释液配制)100μL/ 孔，37度1小时，4.洗板3次，加Biotion标记抗体，0.25μg/mL(用稀释液配 制)，100μL/孔，37度1小时，5.洗板3次，加HRP酶标抗体(购于Jackson)， 1:10000稀释(用稀释液配制)，100μL/孔，37度0.5小时，6.洗板5次，TMB 显色。
表4. 2#-6#和2#-4#双抗对不同抗原检测结果
如表4所示，采用2#-6#和2#-4#双抗对与ST2结构相似的蛋白IL-1R1、 IL-1alpha和IL-1beta进行检测；结果显示，2#-6#和2#-4#双抗与这三个蛋白 (IL-1R1、IL-1alpha和IL-1beta)均无非特异性识别，即使浓度高达1000ng/mL， 2#-6#和2#-4#双抗对其测试的结果也是阴性；反观His-ST2，即使是10ng/mL His-ST2，2#-6#和2#-4#双抗就已经有很强的信号。
另外，针对上述双抗的稳定性进行测试，结果显示，在37摄氏度放置10 天，上述双抗与抗原的结合信号没有明显改变。
用2#-6#抗体对、2#-4#抗体对检测50例血样中ST2水平，检测结果显示， 2#-6#抗体对、2#-4#抗体对的检测结果与通过其他方法检测的相关性超过95％， 完全满足商业化的需求。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技 术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技 术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所 作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (10)
1.一种能够分泌ST2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞7G3，所述杂交瘤细胞7G3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年6月10日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，电话：010-64807355，保藏编号为CGMCC No.22353。
2.一种组合使用的能够分泌ST2单克隆抗体的杂交瘤细胞株组合，所述杂交瘤细胞株组合包括权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株组合还包括选自杂交瘤细胞4C8和杂交瘤细胞11G5中的一种或两种；
所述杂交瘤细胞4C8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年6月10日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，电话：010-64807355，保藏编号为CGMCC No.22355；
所述杂交瘤细胞11G5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年6月10日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，电话：010-64807355，保藏编号为CGMCC No.22354。
3.一种结合ST2的单克隆抗体，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述杂交瘤细胞株组合分泌产生。
4.用于双抗夹心法检测ST2的单克隆抗体组合，所述单克隆抗体组合由以下抗体组成：
(1)由权利要求2中的杂交瘤细胞7G3分泌的单克隆抗体；
(2)由权利要求2中的杂交瘤细胞4C8或杂交瘤细胞11G5分泌的单克隆抗体。
5.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述杂交瘤细胞株组合在制备ST2的单克隆抗体中的应用。
6.一种检测ST2的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的杂交瘤细胞株，或者权利要求2所述杂交瘤细胞株组合，或者权利要求3所述的单克隆抗体，或者权利要求4中的单克隆抗体组合。
7.权利要求1所述的杂交瘤细胞株，或权利要求2所述杂交瘤细胞株组合，或权利要求3所述的单克隆抗体，或权利要求4中的单克隆抗体组合在检测ST2中的应用，或者在制备检测ST2的试剂或试剂盒中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测ST2为检测受试者血清或血浆中的ST2。
10.一种利用双抗体夹心法检测ST2的方法，所述方法包括利用权利要求2中的杂交瘤细胞7G3分泌的抗体作为捕获抗体，以及利用权利要求2中的杂交瘤细胞4C8和/或杂交瘤细胞11G5分泌的抗体作为检测抗体，对ST2进行检测的步骤。
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