WO2015072724A1 - 광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서 - Google Patents

광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서 Download PDF

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pad
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김민곤
정효암
오영경
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광주과학기술원
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    • G01N2333/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • G01N2333/805—Haemoglobins; Myoglobins

Definitions

  • Immunochromatography strip sensor for measurement of biomaterial concentrations over a wide range of concentrations
  • the present invention relates to an immunochromatographic strip sensor capable of measuring a concentration of a biomaterial in a wide range of concentrations and a method for measuring the concentration of a biomaterial in a wide range of concentrations using the sensor.
  • C-react ive protein is a well-known acute inflammatory biomarker that consists of five repeats in the form of pent raxin and is synthesized in the liver when stimulated by interleukin-1 and interleukin-6. .
  • CRP levels average 0.8 u g / mL, but when inflammation occurs, their levels increase above 100 mg / L.
  • FDA recommends the measurement of CRP in inflammation and the determination of high sens i t ivi ty CRP (hs-CRP), a reliable biomarker and potential predictor of cardiovascular disease, in the concentration range of 20-500 u g / mL.
  • concentration range required for its measurement is 1-10 y g / mL.
  • the DIAgam XS Cardio NanoGold C-reactive protein (CRP) method can be measured in the range of 0.42-265 ug / mL using reagents from the DIAgam laboratory (Li l le, France).
  • the DIAgam reagent measures the entire concentration range over a concentration range of 0.1-160 yg / mL using the step of diluting the sample and using the Olympus AU640 Biochemistry Analyzer.
  • These methods use automated analyzers to provide accurate measurements, but require expensive equipment and skilled personnel to perform the analytical process.
  • a method for detecting CRP with low cost, short analysis time and simple operation technique suitable for field display system has been proposed.
  • microcropizidic chips have been extensively studied as a tool for measuring CRP.
  • the microfluidic chip was able to detect CRP concentrations of 10 ng / mL for 3 minutes and CRP levels of 1 ng / mL or lower for 14 minutes.
  • the lateral flow polymer chip had a dynamic range of 102 and had a detection limit of 2.6 ng / mL.
  • LFA strip biosensors are one of the fastest, low cost and one step immunoassays (17).
  • Several types of LFA based CRP test strips Although commercially available, the sandwich immunoassay has the disadvantage of not covering the range of CRP concentrations in human serum due to the hook effect resulting in false negative results due to very high concentrations of the analyte (18-19). ). For this reason, most commercial LFA strip sensors are used for the diagnosis of high sensitivity CRP (hsCRP) or cardiac CRP (cCRP).
  • hsCRP high sensitivity CRP
  • cCRP cardiac CRP
  • “digital-style” or “barcode-style” assays using gold nanoparticles (AuNPs) as indicators can be used to count low concentrations of red lines in a test within 15 minutes.
  • CRP is detected to provide a semi-quantitative lateral flow assay that predicts initial CVD risk or bacterial and viral infections.
  • the LFA sensor used the multi-line measurement method to detect the same CRP, although the measurement objectives were different for each disease. There is a need for developing a one-stage immunosensor for CRP analysis that can cover a wide range of concentrations from 0 to 500 mg / L.
  • LFA biosensors have important factors for evaluating the quality of rapid diagnostic sensors or on-site inspections such as ease of use, commercial accessibility and manufacturing costs (21).
  • Triant VA Meigs JB, Gr inspoon SK. Journal of acquired immune deficiency syndromes 2009; 51: 268-73.
  • the present inventors have tried to develop a biosensor capable of accurate concentration measurement even for a biological material having a wide concentration range.
  • an antigen line (ant igen l ine) is added between the control line and the test line (in l) for a wide range of concentrations.
  • the present invention was completed by experimentally confirming that the concentration of antigen can be measured accurately and quickly.
  • Another object of the present invention is to provide a method for measuring the concentration of antigen in a wide range of concentrations using a lateral flow assay strip sensor.
  • the present invention is a lateral flow assay strip sensor for measuring the concentration of the antigen in a wide range of concentration
  • the lateral flow assay strip sensor is a sample pad, conjugate pad, membrane and absorbent pad in sequence A conjugated structure, wherein the conjugate pad includes a nanoparticle-detecting antibody conjugate to which nanoparticles and a detection antibody that binds the antigen are connected, and on the membrane, a test line from the conjugate pad toward the absorption pad.
  • the antigen lines and the control lines are sequentially formed, the capture antibody binding to the antigen is fixed to the test line, the antigen is fixed to the antigen line, and the control antibody binds to the detection antibody.
  • 2 car A lateral flow assay strip sensor is characterized in that the antibody is immobilized.
  • the Lateral Flow Assay (LFA) strip sensor of the present invention includes a structure in which a sample pad, a conjugate pad, a membrane, and an absorption pad are sequentially connected. .
  • the "sample pad” means a pad capable of diffusing flow by receiving a sample to be analyzed and is composed of a material having a porosity sufficient to contain and contain a sample to be analyzed.
  • porous materials include fibrous paper; Microporous membranes of cellulose material, cellulose derivatives such as cellulose, salose acetate, nitrocellulose, fiberglass, naturally occurring cotton, fabrics such as nylon, or porous gels
  • the present invention is not limited thereto.
  • the "conjugate pad” is a pad containing a “nanoparticle-detecting antibody conjugate", which receives a sample diffused and moved from the sample pad and is connected to a detection antibody that binds nanoparticles and antigens.
  • the conjugate pad like the sample pad, consists of a material capable of diffusion flow.
  • the nanoparticles of the "nanoparticle-detecting antibody conjugate” included in the conjugate pad refer to nanoparticles that act as detectable labels.
  • the nanoparticles are preferably nanoparticles of metal, for example gold (Au), silver (Ag), platinum (Pt), palladium (Pd), iridium (Ir), rhodium (Rh), Precious metals of ruthenium (Ru); Titanium (Ti), Zirconium (Zr), Hafnium (Hf), Vanadium (V), Niobium (Nb), Tantalum (Ta), Chromium (Cr), Molybdenum (Mo), Tungsten (W), Ruthenium (Ru), a transition metal of osmium (0s); Metals such as iron (Fe), nickel (Ni) and cobalt (Co); Metal oxides of magnesium oxide (MgO), titanium dioxide (Ti02), vanadium pentoxide (V205), zinc oxide (ZnO), and the like.
  • the detection antibody refers to an antibody that specifically binds to the antigen to be analyzed, and means to include a fragment of the antibody if it has binding specificity.
  • the detection antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, most preferably a monoclonal antibody.
  • the binding of the nanoparticles to the detection antibody includes, but is not limited to, for example, ionic bonds, covalent bonds, metal bonds, coordination bonds, hydrogen bonds, and van der Waals bonds.
  • the "membrane” in the sensor of the invention can be made of any of a variety of materials through which the sample material can pass.
  • natural, synthetic, or synthetically modified, naturally occurring materials such as polysaccharides (eg, cellulose materials such as cellulose materials, paper, cellulose acetate and cellulose derivatives such as nitrocellulose) ; Polyether sulfones; Polyethylene; nylon; Polyvinylidene fluoride (PVDF); Polyester; Polypropylene; Silica; Inorganic materials homogeneously dispersed in a porous polymer matrix with polymers such as vinyl chloride, vinyl chloride-propylene copolymer and vinyl chloride-vinyl acetate copolymer, for example inactivated alumina, diatomaceous earth, MgS04, or other inorganic finely divided material ; Naturally occurring (eg cotton) and synthetic (eg nylon or rayon) cloth; Porous gels such as silica gel, agarose, dextran and gelatin; Polymer films
  • the "hop pad” may be located adjacent to or near the end of the membrane.
  • Absorbent pads generally receive fluid samples that travel through the entire membrane. The absorbent pad can help to promote capillary action and diffusion flow of the fluid through the membrane.
  • the sensor of the present invention consists of the sample pad, the conjugate pad, the membrane and the hop pad being sequentially connected on the same support.
  • the support may be formed of any material as long as it can support and transport the sample pad, the conjugate pad, the membrane, and the absorbent pad, but in general, the fluid of the sample diffused through the membrane does not leak through the support. It is preferred to be liquid impermeable.
  • glass Polymeric materials such as, but not limited to, polystyrene, polypropylene, polyester, polybutadiene, polyvinylchloride, polyamide, polycarbonate, epoxide, methacrylate, polymelamine, and the like.
  • test line test l ine
  • antigen line antigen l ine
  • control line control l ine
  • a capture antibody that binds to the antigen is fixed to the "test line”.
  • the antigen is fixed to the "antigen line”.
  • the antigen immobilized on the antigen line is immobilized via a capture antibody immobilized on the membrane. Rather than immobilizing the antigen directly on the membrane in the antigen line, the antigen can be exposed in the proper direction to facilitate binding with the nanoparticle-detecting antibody. Can improve.
  • a secondary antibody that binds to the detection antibody is immobilized on the "contain line".
  • the secondary antibody in the control line binds to the nanoparticle-detecting antibody or nanoparticle-detecting antibody-antigen complex to generate a detection signal for it.
  • the term “antigen” refers to a substance to be analyzed for concentration or presence, and includes, for example, proteins, peptides, microorganisms, amino acids, nucleic acids, hormones, steroids, vitamins, drugs, bacteria, viral particles, and the like. One is not limited thereto.
  • the antigen is most preferably a C-react ive protein (CRP).
  • sample refers to a biological substance suspected of containing the antigen to be analyzed.
  • blood interstitial fluid, saliva, eyepiece fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites, mucus, nasal fluid (nasal fizid), hemoptysis, arterial blood, abdominal fluid, vaginal fluid, menstrual discharge, amniotic fluid, And semen, and may be derived from any biological source, such as a physiological fluid.
  • the present invention provides a method for measuring the concentration of antigen in a wide range of concentrations using a lateral flow assay strip sensor,
  • the lateral flow analysis strip sensor includes a structure in which a sample pad, a conjugate pad, a membrane, and an absorption pad are sequentially connected.
  • the conjugate pad includes a nanoparticle-detecting antibody conjugate to which a nanoparticle and a detection antibody that binds the antigen are connected.
  • Test lines, antigen lines and control lines are sequentially formed on the membrane from the conjugate pad toward the absorbent pad,
  • test line is fixed to the capture antibody that binds to the antigen
  • the antigen is fixed to the antigen line
  • a secondary antibody that binds to the detection antibody is immobilized, and the method includes the following steps:
  • step (c) performing steps (a) and (b) on samples containing antigens to be analyzed at different concentrations than in step (a);
  • step (f) measuring signals generated in the test line, antigen line and control line; And (g) calculating the concentration of the antigen of unknown concentration using the measured signal value and the calibration curve of step (d).
  • the present invention compares the signal value measured in the antigen line with the signal value measured in the control line, so that the signal value of the antigen line can Selecting a lower value among the calculated antigen concentration values when the signal value is larger than the signal value, and selecting a larger value among the calculated antigen concentration values when the signal value of the antigen line is smaller than the signal value of the line. It provides a method characterized in that.
  • the signal in the test line is obtained with a bell shaped signal intensity curve because of the hook effect.
  • the signal intensity of the test line increases as the concentration of the analyte antigen increases, and decreases again at a concentration higher than the threshold to form a bell-shaped curve.
  • the signal strength produced by one sample measurement may indicate two different concentration results (see panel B of FIG. 5).
  • the controls were compared for signal intensities of lines and antigen lines. Under optimal conditions, the signal intensity of the control line will be lower than that of the antigen line for samples with relatively low antigen concentrations. It shows a signal strength pattern that is lower than the strength. This phenomenon can be used to accurately measure the concentration of antigens in a wide range of concentrations in biological samples.
  • the concentration range of the antigen that can be analyzed in the method of the present invention is 1 ng / mL-500 y g / mL.
  • the present invention relates to an immunochromatographic strip sensor capable of measuring a concentration of a biomaterial in a wide range of concentrations and a method for measuring the concentration of a biomaterial in a wide range of concentrations using the sensor.
  • the detection method using the sensor of the present invention accurately measures the concentration of antigen in a wide range of concentrations. It can be measured and can be implemented at low cost, speed and simplicity, making it suitable for P0CT (point of care test) where rapid and sensitive sensitivity is required.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an LFA strip sensor into which an antigen is introduced.
  • Panel A shows the structure
  • panel B shows the detection principle
  • panel C shows the data processing process.
  • Figure 2 is a result of comparing the signal intensity measured l g / mL CRP between the direct binding of the CRP to the pre-treated antibody on the antigen line and PEG-CRP binding.
  • Panel A is an image and
  • Panel B is a graph. 3 shows the result of comparing the signal intensity of the antigen line by the type of pre-bound antibody.
  • Panel A of FIG. 5 is an image of measuring CRP of various concentrations.
  • Panel B is the result of plotting the signal intensity of three lines of a test line, an antigen line, and a control line in log unit.
  • Panel C is the measurement result after processing the data.
  • Figure 6 shows the results of testing 50 clinical samples 10 times dilution.
  • Panel A is an image and Panel B is a graph.
  • Serum (90R-100), surfactant 10G (95R-103), and bovine serum albumin (BSA) without CRP were purchased from Fitzerald Industries International (Acton, Mass., USA).
  • CRP was purchased from Wako Chemicals (309-51191; Osaka, Japan), and anti-CRP polyclonal antibodies and monoclonal antibodies were obtained from Abeam Inc. (Cambridge, MA, USA).
  • Nitrocellose membranes were purchased from Millipore (HFB02404; Billerica, Mass., USA). Sample pads (P / N BSP-133-20) and absorbent pads are available from Pall Co. (Port Washington, NY, USA). Interpad (Fusion5 8151-6621) was purchased from Whatman (Kent, UK).
  • Each gold colloidal solution is BB
  • PBS (1 mg / mL concentration) 10 with anti-CRP antibody was added to the mixture of 1 mL of 20 nm AuNP colloid and borate complete solution (0.1 M, H 8.5). After 30 minutes of incubation at silver phase, 0.1 mL of PBS containing 10 mg / mL of BSA was added to the solution to block the AuNP surface. After incubation at 4 ° C. for 60 minutes, the mixture was centrifuged for 15 minutes at 10 ° C. at 12,000 rpm using HANIL microcentr i fuge (micro 17TR; Quasar Instruments, Colorado Springs, Co., USA).
  • the LFA sensor consists of four components: sample pad, conjugate pad, nitrocell membrane and absorbent pad. Most components are fixed on a conventional backing card, which typically consists of an inert plastic such as polyester. Immobilize capture antibody and CRP or PEG-CRP or capture antibody, and contacts in different regions on NC membranes (0.25 cm x 30 cm) using a human dispenser (DCI100; Zeta Corporation, yunggi-do, South Korea) Antigen (1 mg / mL) in the antigen line was immobilized in the cell at an amount of 1 yL / cm to the rose membrane, followed by CRPCl mg / mL) antigens were immobilized thereon.
  • a human dispenser DCI100; Zeta Corporation, yunggi-do, South Korea
  • the loaded membrane was dried for 1 hour in a temperature & humid chamber at 28 ° C. After drying the NC membrane, the membrane was cut using a cutter into strips of 3.8-mm-width, concentrated 2X AuNP-
  • the antibody conjugate 12 is incubated on a conjugate pad (0.75 cm X 0.38 cm) and used at a Temperature '& humid chamber (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd, Korea) at 28 ° C. and 25% humidity. Sequentially dried An absorbent pad (1.5 cm ⁇ 0.38 cm) was attached to the top of the strip, and the sample pad (1.5 cm ⁇ 0.38 cm) was a sticky plastic backing (6) containing an NC membrane with immobilized antibody and absorbent pad. cm x 0.38 cm), assembled sequentially, each segment overlapping each other by 1.5 mm to facilitate solution migration during the analysis process.
  • Capture antibodies and myoglobin antigen controls in different regions on the NC membrane (0.25 cm ⁇ 30 cm) were immobilized using a dispenser (DCI100; Zeta Corporation, Kyunggi-do, South Korea).
  • the control line and the test line fixed each capture antibody (lmg / mL) to the cell membrane in an amount of 1 yL / cm, and fixed the antigen line between the two lines.
  • the capture antibody (1 mg / mL) was immobilized on the cell in the amount of 1 yL / cm to the membrane, followed by the myoglobin (0.5 mg / mL) antigen. bracket The interval between regions was about 3 mm.
  • the loaded membrane was dried at 37 ° C for 1 hour in a Temperature & humid chamber. After drying the NC membrane, the membrane was cut using a cutter into strips of 3.8-mm-width. Concentrated 3X AuNP-antibody conjugates were incubated on the conjugate pad (1 cm X 0.38 cm), using a Temperature & humid chamber (Hanyang Sci ent ific Equipment Co., Ltd, Korea) at 37 ° C and Stored after drying under 20% humidity. An absorbent pad (1.5 cm X 0.38 cm) is attached to the top of the strip, and the sample pad (1.5 cm X 0.38 cm) is a sticky plastic backing (6 cm X 0.38) containing an NC membrane with immobilized antibody and absorbent pad cm) were assembled sequentially. Each segment was overlapped with each other by 2 mm to facilitate solution migration during the analysis.
  • Myoglobin solutions with varying concentrations were prepared using human serum without myoglobin.
  • the prepared sample solution was incubated on the LFA sensor. Images were acquired using a ChemiDoc TM XRS + imaging system (Bio-Rad), followed by measurement of color intensity using Imagel ab TM 4.0 software (Bio-Rad).
  • Serum samples of 50 patients were obtained from Kyungpook National University Hospital. The patient was given a detailed explanation of the study protocol and then consented. Blood samples were taken using a venipuncture in a tube containing lithium heparin antihypertensives (S-Monovette, Numbrecht, Germany). Next, the blood sample Cells in blood were removed by centrifugation for 15 minutes with 100xg. The collected samples were measured at a concentration of HITACHI 7180 and then stored at -80 ° C until further analysis of the plasma portion. Samples were diluted 10-fold with serumol containing no CRP before measurement. Experimental Results and Discussion
  • the LFA strip sensor consists of a test line (test l ine), an antigen line (ant igen l ine) and a control line (control l ine), respectively, from the sample injection direction (Panel A of FIG. 1). Incubation of the serum sample onto the sample pad causes the solution to contact the sample pad and then wet the sample pad, the conjugation pad, and the NC membrane in the horizontal direction, respectively. Initially a sandwich reaction occurs between the antigen and the AuNP-monoclonal antibody conjugate complex in the antibody attached to the test line in the test line, and the AuNP-antibody conjugate, which is not reacted in the test line, is placed on the NC membrane in the antigen line. Bind to immobilized CRP antigen.
  • the antigen lines When analyzing low concentrations of antigen, the antigen lines show the highest signal intensity, whereas when analyzing high concentrations of antigens, the antigen lines show very low signal strength or have no signal strength at all.
  • the control line is used as a region to respond to the gold labeled monoclonal antibody.
  • the overall reaction is shown in panel B of FIG. 1.
  • the results measured at different antigen concentrations are shown by applying the data processing procedure (Panel C in FIG. 1).
  • the test line the first location where the sample meets the AuNP complex, shows a red signal when the AuNP-antibody conjugate-antigen complex bound to the CRP antigen binds to an anti-CRP polyclonal antibody immobilized on the NC membrane. .
  • an antigen line was introduced to use the correlation of the test line, the antigen line and the control line.
  • the antigen line produced signals of different aspects depending on the concentration of antigen in the sample.
  • the antigen line shows the highest signal value as opposed to the signal shown in the test line when the antigen concentration is zero.
  • the signal intensity of the antigen line tended to decrease gradually as the concentration of antigen increased.
  • the signal intensity of the test line increased gradually with the concentration. Indicated.
  • the two lines did not show a red signal at a concentration of 500 ug / mL (Panel A in FIG. 5).
  • the AuNP conjugate-antibody (Ab) -antigen (Ag) complex reacts with the capture antibody in the form of a sandwich assay, while the unreacted AuNP conjugate-antibody (Ab) is upwards along the NC membrane. Move and bind to the antigen in the antigen line. Binding affinity with CRP immobilized on the NC membrane was also reduced if excess antigen was first bound to capture antibodies in the test line before forming the AuNP conjugate -Ab ⁇ Ag complex. As a result, AuNP-conjugates in which the antigens contained high concentrations of antigens did not show the signal intensity of both the test and antigen lines because the immunoassay reaction was suppressed. It showed the highest signal because it binds to the gate-antigen complex.
  • the most important factor for the manufacture of strip sensors is the immobilization of CRP in the antigen line.
  • the inventors first immobilized the capture antibody in the antigen line to aid in the direction and stabilization of the CRP and then added the CRP thereto.
  • CRP was immobilized directly on the NC membrane, there was no reaction between the immobilized antigen and the AuNP conjugate antibody.
  • CRP was PEGylated using NHS-PEG to avoid this drawback in anticipation of CRP degradation.
  • antigen lines bound to PEGylated CRP showed no signal (FIG. 2).
  • the product was used.
  • a monoclonal antibody was used as the detection antibody in the AuNP-detecting antibody conjugate to increase the efficiency of competition reaction in the antigen line.
  • the detection antibody is used as a monoclonal antibody in the case of Detect i on ant i body graph, and in the case of Test ant i body l (Test l) and Test ant i body 2 (Test 2) It is the result when it uses for a polyclonal antibody.
  • the detection antibody was used as a polyclonal antibody, it was confirmed that a signal was not decreased and a constant signal was maintained according to the CRP concentration to be measured differently from when using a monoclotal antibody.
  • Panel C of FIG. 5 shows the results of measuring various concentrations of CRP through data processing.
  • the experimental results above show that the sensor of the present invention can also measure CRP concentration levels between 105 and 106.
  • a detection limit LOD, bl ank signal + 3 standard deviations
  • This value means that we can develop a sensor that can measure 1.07 (ng / mL CRP concentration) as the highest concentration. 4. Measurement of Clinical Samples
  • a method for measuring myoglobin which is one of myocardial infarction biomarkers, was used in the CRP to prove that it is applicable to all general antigens in addition to the measured CRP.
  • the measurement lines, antigen lines and controls in myoglobin showed the same tendency as those determined in the CRP lines, and the results were analyzed using the same method as the method performed in the CRP.
  • the result was a perfect linearity in the concentration range between 1 ng / mL and 500 ug / mL.
  • the myoglobin measurement results of FIGS. 7 and 8 confirmed that the measurement method claimed in the present invention can be applied to various antigens. conclusion
  • the present invention has developed a lateral flow immune sensor with multiple lines consisting of one strip capable of measuring a wide range of concentrations of CRP.
  • the LFA sensor of the present invention analyzes the CRP concentration in the range of 1 ng / mL-500 u / mL in 10 minutes. could finish.
  • the detectable concentration range was 0.67 ng / mL-1.02 mg / mL, which is the widest range that can be measured using the LFA strip sensor (approximately 106 times).
  • the structure of the sensor consists of membranes and pads which are relatively inexpensive and light in manufacturing and processing, multi-line LFA systems are particularly advantageous for the development of suitable field inspection devices.
  • the sensor of the present invention can be easily different and has a wide range of dynamic range, it is possible to detect CRP with high sensitivity and simple, as well as to accurately diagnose the degree of inflammation and the type of disease of the patient.
  • myoglobin measurement resulted in almost the same measurement results as CRP.
  • the antigens applicable to the present invention are not limited to CRP, but are capable of sandwich immunity and have two antibody pairs. It has been confirmed that it can be applied widely.

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Abstract

본 발명은 광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서 및 이 센서를 사용한 광범위한 농도범위의 생체물질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 센서를 이용하는 검출 방법은 광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 정확하게 측정할 수 있으며, 저비용, 신속성 및 간편성을 구현할 수 있으므로, 신속성 및 고민감도가 요구되는 POCT(point of care test, 현장검사)에 적합하다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서
【기술분야】
본 특허출원은 2013 년 11 월 12 일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2013-0136906 호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서 및 이 센서를 사용한 광범위한 농도범위의 생체물질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
【발명의 배경이 되는 기술】
CRP(C-react ive protein)는 잘 알려진 급성 염증의 바이오마커로서， 펜트라신 (pent raxin)의 형태로 5 개의 반복 구조로 이루어지며， 인터루킨 -1 및 인터루킨— 6 에 의해 자극되면 간에서 합성된다. 과거 수십년 동안， 혈장에서의 C P 의 수준을 측정함으로써 이를 심근경색， 암, 심혈관질환， 당뇨의 위험을 예측하는데 이용하거나 항생제 치료 지침에 사용하기 위한 연구가 진행되었다 ( 1-9) . 건강한 정상 성인에서 CRP의 수치는 평균적으로 0.8 u g/mL 이지만， 염증반웅이 발생하면 이의 수치는 100 mg/L 이상으로 증가한다. 통상적으로 가벼운 염증이나 바이러스 감염의 경우 10-50 μ g/mL 이며， 활성 염증 또는 박테리아의 감염의 경우 50-200 u g/mL 이고， 중증 염증 또는 손상의 경우 CRP 농도는 200 y g/mL 을 초과하게 된다. FDA 는 20-500 u g/mL 의 농도 범위의 경우 염증에서의 CRP 측정 및 심혈관질환의 신뢰성 있는 바이오 마커이며 잠재적 위험 예측자인 hs- CRP(high sens i t ivi ty CRP) 측정을 권고하고 있다. 이의 측정에서 요구되는 농도 범위는 1-10 y g/mL이다.
급성 염증 또는 1차 진료의 경우, 신속한 진단 또는 인체 체액내에서 CRP 수준의 연속적인 모니터링을 위해서는， 측정 범위의 층족, 신속성， 정확성， 간편성 및 저비용 정량 측정 둥이 요구된다 ( 10-11) . 통상적으로 신속한 정량적 CRP 분석으로서는 폴리스티렌 비드를 갖는 Immunoturbidimetr ic 방법 또는 Imunonephe 1 omet ry 방법， 금 나노입자 웅집 (agglomerat ion) 분석법 등이 자주 이용된다. 또한， 최근에 광범위한 농도 범위의 CRP 테스트를 도입함으로써 광범위한 농도를 측정할 수 있도록 확장하였다. 예를 들어 , DIAgam XS Cardio NanoGold C-react ive protein (CRP) 방법의 경우 DIAgam laboratory (Li l le , France)으로부터 제공되는 시약을 사용하여 0.42 - 265 u g/mL 의 범위 까지 측정이 가능하다. DIAgam 시약은 시료를 회석하는 단계와 Olympus AU640 생화학 분석기를 사용하여 0.1 - 160 y g/mL 의 농도범위에 걸친 전농도 범위를 측정한다. 이들 방법들은 자동화된 분석기를 사용하여 정확한 측정값을 제공하지만, 분석공정을 수행하기 위해 값비싼 장비와 숙련된 인력이 요구된다. 이러한 한계점을 극복하기 위한 방안으로서 현장 현시 시스템에 적합한 저비용， 짧은 분석 시간 및 간단한 조작 기술로 CRP 를 검출하는 방법이 제안되어 왔다. 신속하고 고민감도의 P0CT(point of care test , 현장검사) 기법 중의 하나로서， 미세유체역학칩 (mi crof luidic chip)이 CRP를 측정하기 위한 도구로 광범위하게 연구되어 왔다. Gervai s 등에 의한 연구에서 ( 12)， 미세유체역학칩은 3 분 동안 10 ng/mL 농도의 CRP 를 검출할 수 있었고， 14 분 동안은 1 ng/mL 이하 농도의 CRP 를 검출할 수 있었다. Jonsson 등이 수행한 연구에서 (13) , 측방 유동 폴리머 칩은 102 의 동적 범위를 가지며 2.6 ng/mL 의 검출 한계를 보유하였다. 또한， Gervai s 등에 의한 보고에 따르면 ( 12)， 0.01 - 1.0 y g/mL 범위에서 CRP 농도가 증가하면 CRP 농도에서 형광신호 강도가 감소하게 된다. 상기한 연구결과들에서 나타난 바와 같이, 미세유체역학칩은 매우 신속하며 저농도에서 측정이 가능하지만， 고농도의 CRP 측정， 대량생산 및 상대적인 비용의 면에서 한계를 가지고 있다 ( 14-15) . 이러한 한계점을 극복하기 위해서， CRP 분석을 위해 수짐 유동 분석법 (vert i cal f low assay, VFA)을 개발하였다 (16) . 이 연구에서는 1분 내에서 측방 유동 분석법 ( lateral f low assay, LFA) 스트립 바이오 센서 보다 더 넓은 동적 범위를 사용하였으나, 더 넓은 범위의 CRP를 커버하지는 못하였다.
LFA 스트립 바이오센서는 신속하고， 저비용이며 1 단계 면역분석법 중의 하나이다 ( 17) . CRP 테스트 스트립에 기초한 수 종류 타입의 LFA 가 상업적으로도 구입이 가능하지만， 샌드위치 면역분석법에서 분석물의 매우 높은 농도에 기인한 위음성 결과가 나오는 후크 효과 (hook effect) 때문에 인간 혈청 내에서 CRP 농도 범위를 커버할 수 없는 단점을 갖는다 (18-19). 이러한 이유로， 대부분의 상업용 LFA 스트립 센서는 고민감도 CRP (hsCRP) 또는 심장 CRP (cCRP)의 진단에 사용된다. 그러나, Leung 등의 연구에서 (20)， 지시자로서 금나노입자 (AuNPs)를 사용한 "디지털-스타일" 분석법 또는 "바코드-스타일" 분석법은 15 분 내에 테스트에서 붉은색 라인의 수를 계수함으로써 저농도의 CRP를 검출하여 , 초기 CVD 위험도 또는 박테리아 및 바이러스 감염을 예측하는 반 -정량 (semi-quantitative) 측방 유동 분석법을 제공한다. 이 LFA 센서는 측정목적이 각 질병에 따라 상이하지만， 멀티 -라인 측정법을 사용하여 동일한 CRP 를 검출하였다. 광범위한 농도범위 0 - 500 mg/L를 커버할 수 있는 CRP 분석을 위한 1 단계 면역센서 개발이 요구된다. 또한, LFA 바이오센서는 사용편의성, 상업적 접근용이성 및 제조비용과 같은 신속한 진단 센서 또는 현장검사의 질을 평가하기 위한 중요한 요소를 갖는다 (21). 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【선행기술문헌】
【비특허문헌】
1. Triant VA, Meigs JB, Gr inspoon SK. Journal of acquired immune deficiency syndromes 2009 ;51 :268-73.
2. Patrick L, Uzick M. A Journal of clinical therapeutic 2001;6:248-71.
3. Ridker PM. Circulation 2003； 107 :363-9.
4. Kushner I, Broder ML, Karp D. The Journal of clinical investigation 1978;61:235-42. o o
Figure imgf000006_0001
E pwgyoa¾tare. ccuatn. CWdoolilli PMIil>. 5-- 【발명의 내용】
【해결하고자 하는 과제】
본 발명자들은 광범위한 농도 범위를 갖는 생체물질에 대해서도 정확한 농도의 측정이 가능한 바이오 센서를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과， 면역크로마토그래피 법을 기초로 한 측방 유동 분석 스트립 센서에서 콘트롤 라인 (control l ine)과 테스트 라인 (test l ine)의 사이에 항원 라인 (ant igen l ine)을 추가함으로써 광범위한 농도 범위의 항원의 농도를 정확하고 신속하게 측정할 수 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 측정하기 위한 측방 유동 분석 스트립 센서를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 측방 유동 분석 스트립 센서를 사용하여 광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 측정하기 위한 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 측정하기 위한 측방 유동 분석 스트립 센서로서， 상기 측방 유동 분석 스트립 센서는 샘플 패드， 컨쥬게이트 패드， 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 포함하고, 상기 컨쥬게이트 패드에는 나노입자와 상기 항원에 결합하는 검출항체가 연결된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트가 포함되어 있고, 상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트를 라인이 순차적으로 형성되어 있고， 상기 테스트 라인에는 상기 항원에 결합하는 포획항체가 고정되어 있고, 상기 항원 라인에는 상기 항원이 고정되어 있고, 상기 콘트롤 라인에는 상기 검출항체에 결합하는 2 차 항체가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 측방 유동 분석 스트립 센서를 제공한다.
본 발명의 측방 유동 분석 (Lateral Flow Assay, LFA) 스트립 센서는 샘플 패드 (sample pad), 컨쥬게이트 패드 (conjugate pad), 멤브레인 (membrane) 및 흡수 패드 (Absorption pad)가 순차적으로 연결된 구조를 포함한다.
본 발명의 센서에서 상기 "샘플 패드" 는 분석을 행할 샘플을 수용하여 확산 흐름이 가능한 패드를 의미하며， 분석을 행할 샘플을 수용하여 함유하기에 층분한 다공성을 갖는 물질로 구성된다. 이러한 다공성 물질로는 섬유성 종이; 셀를로오스 물질로 된 미세 기공 멤브레인， 셀롤로오스, 샐를로오스 아세테이트와 같은 셀를로오스 유도체， 니트로셀를로오스， 유리섬유, 천연발생의 면 (cotton), 나일론과 같은 직물 또는 다공성 겔 등이 있으나， 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 센서에서 상기 "컨쥬게이트 패드" 는 샘플 패드로부터 확산되어 이동되는 샘플을 수용하몌 동시에 나노입자와 항원에 결합하는 검출항체가 연결된 "나노입자-검출항체 컨쥬게이트" 가 포함되어 있는 패드이다. 컨쥬게이트 패드는 샘플 패드와 마찬가지로 확산 흐름이 가능한 물질로 구성된다.
상기 컨쥬게이트 패드에 포함된 "나노입자-검출항체 컨쥬게이트" 의 나노입자는 검출가능한 표지로서 작용하는 나노입자를 의미한다 . 상기 나노입자는 바람직하게는 금속의 나노입자이며， 상기 금속으로는 예를 들어 금 (Au), 은 (Ag), 백금 (Pt), 팔라듐 (Pd), 이리듐 (Ir), 로듐 (Rh), 루테늄 (Ru)의 귀금속; 티타늄 (Ti), 지르코늄 (Zr), 하프늄 (Hf), 바나듐 (V), 나이오븀 (Nb), 탄탈럼 (Ta), 크로뮴 (Cr), 몰리브데늄 (Mo), 텅스텐 (W), 루테늄 (Ru), 오스뮴 (0s)의 전이금속; 철 (Fe), 니켈 (Ni), 코발트 (Co)등의 금속; 산화마그네슘 (MgO), 이산화티타늄 (Ti02), 오산화바나듐 (V205), 산화아연 (ZnO)의 금속산화물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 나노입자는 가장 바람직하게는 금 (Au) 나노입자이다.
상기 검출항체는 분석하고자하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하몌 결합 특이성을 보유한다면 항체의 단편도 포함하는 의미이다. 상기 검출항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 사용할 수 있으며 , 가장 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용한다.
상기 나노입자와 검출항체의 결합은 예컨대 이온결합， 공유결합， 금속결합, 배위결합, 수소결합， 및 반데르발스 결합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 센서에서 상기 "멤브레인" 은 샘플 물질이 통과할 수 있는 어떠한 다양한 물질로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 천연, 합성, 또는 합성에 의해 변형된 천연 발생 물질， 예를 들어 폴리사카라이드 (예: 셀를로오스 물질， 종이， 셀를로오스 아세테이트 및 니트로셀를로오스와 같은 셀를로오스 유도체) ; 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) ; 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체 및 비닐 클로라이드- 비닐 아세테이트 공중합체와 같은 중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 무기 물질， 예를 들어 불활성화된 알루미나, 규조토， MgS04 , 또는 다른 무기 미분 물질 ; 자연 발생 (예 : 면) 및 합성 (예 : 나일론 또는 레이온) 천; 다공성 겔， 예를 들어 실리카겔， 아가로스， 덱스트란 및 젤라틴; 증합체 필름， 예를 들어 폴리아크릴아미드; 등의 물질로부터 형성될 수 있다. 바람직하게는 상기 멤브레인은 중합체 물질, 예를 들어 니트로셀롤로오스, 폴리에테르술폰， 폴리에틸렌， 나일론， 폴리비닐리덴 플루오라이드， 폴리에스테르 및 폴리프로필렌을 포함한다.
본 발명의 센서에서 상기 "홉수패드" 는 상기 멤브레인의 말단에 또는 그 가까이에 인접해서 위치할 수 있다. 흡수 패드는 일반적으로 전체 멤브레인을 통해 이동하는 유체 샘플을 받아들인다. 흡수 패드는 멤브레인을 통한 모세관 작용 및 유체의 확산 유동을 촉진하는 데 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 센서는 상기한 샘플 패드， 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 홉수 패드가 동일한 지지체상에 순차적으로 연결되어 구성된다.
상기 지지체는 상기한 샘플 패드， 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드를 지지 및 운반할 수 있다면 어떠한 물질로도 형성될 수 있으나， 일반적으로 상기 멤브레인을 통해 확산하는 샘플의 유체가 지지체를 통해 누출되지 않도록 액체 불투과성인 것이 바람직하다. 예컨대， 유리 ; 중합체물질 예를 들어 폴리스티렌， 폴리프로필렌， 폴리에스테르， 폴리부타디엔， 폴리비닐클로라이드， 폴리아미드， 폴리카르보네이트， 에폭시드， 메타크릴레이트 및 폴리멜라민 등을 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 센서에서 상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 라인 (test l ine) , 항원 라인 (ant igen l ine) 및 콘트를 라인 (control l ine)이 순차적으로 형성되어 있다.
본 발명의 센서에서 상기 "테스트 라인" 에는 상기 항원에 결합하는 포획항체가 고정되어 있다.
본 발명의 센서에서 상기 "항원 라인" 에는 상기 항원이 고정되어 있다.
바람직하게는 상기 항원 라인에 고정된 항원은 멤브레인상에 고정된 포획항체를 매개로 하여 고정된다. 상기 항원 라인에서 항원을 멤브레인상에 직접 고정시키기 보다는 포획항체상에 결합시켜 고정시키게 되면 나노입자-검출항체와의 결합이 용이하게 되도록 항원을 적절한 방향으로 노출시킬 수 있어 결과적으로 센서의 항원 검출 성능을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 센서에서 상기 "콘트를 라인" 에는 상기 검출항체에 결합하는 2 차 항체가 고정되어 있다. 콘트를 라인의 2 차 항체는 나노입자―검출항제 또는 나노입자-검출항체 -항원 복합체에 결합하여 이에 대한 검출 신호를 발생시킨다.
본 명세서에서 용어 "항원" 은 농도 또는 존재 여부를 분석하고자 하는 대상물질을 지칭하는 의미이며， 예컨대 단백질, 펩타이드， 미생물， 아미노산， 핵산, 호르몬， 스테로이드, 비타민， 약물， 박테리아， 바이러스 입자 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 항원은 가장 바람직하게는 CRP(C-react ive protein)이다.
본 명세서에서 용어 "샘플" 은 상기 분석하고자 하는 항원을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 물질을 의미한다. 예컨대, 혈액， 간질액, 타액， 접안 렌즈 유체， 뇌척수액, 땀, 소변， 젖， 복수， 점액， 비강유체 (nasal f luid) , 객혈， 관절혈액， 복강액, 질액, 월경분비물, 양수， 및 정액을 포함하며, 생리적 유체와 같은 어떠한 생물학적 공급원으로부터도 유래될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 측방 유동 분석 스트립 센서를 사용하여 광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 측정하기 위한 방법으로서,
상기 측방 유동 분석 스트립 센서는 샘플 패드， 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 포함하고,
상기 컨쥬게이트 패드에는 나노입자와 상기 항원에 결합하는 검출항체가 연결된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트가 포함되어 있고，
상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인이 순차적으로 형성되어 있고,
상기 테스트 라인에는 상기 항원에 결합하는 포획항체가 고정되어 있고，
상기 항원 라인에는 상기 항원이 고정되어 있고，
상기 콘트롤 라인에는 상기 검출항체에 결합하는 2 차 항체가 고정되어 있으며， 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다:
(a) 분석하고자 하는 항원을 기지의 농도로 포함하는 샘플을 상기 샘플 패드에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 테스트 라인， 항원 라인 및 콘트를 라인에서 생성되는 신호를 측정하는 단계;
(c) 분석하고자 하는 항원을 상기 단계 (a)에서와 다른 기지의 농도로 포함하는 샘플들에 대하여 상기 단계 (a) 및 (b)를 행하는 단계;
(d) 상기 단계 (a) 내지 (c)를 통해 측정한 신호 값들을 처리하여 검량선을 산출하는 단계 ;
(e) 분석하고자 하는 항원이 미지의 농도로 포함된 샘플을 상기 샘플 패드에 접촉시키는 단계;
( f ) 상기 테스트 라인， 항원 라인 및 콘트롤 라인에서 생성되는 신호를 측정하는 단계 ; 및 (g) 측정된 신호값과 상기 단계 (d)의 검량선을 사용하여 미지의 농도의 항원의 농도를 산출하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 단계 (g)에서, 상기 항원 라인에서 측정된 신호값과 상기 콘트롤 라인에서 측정된 신호값을 비교하여， 항원 라인의 신호값이 콘트를 라인의 신호값 보다 큰 경우 산출된 항원의 농도값 중에서 보다 낮은 값을 선택하고, 항원 라인의 신호값이 콘트를 라인의 신호값 보다 작은 경우 산출된 항원의 농도값 중에서 보다 큰 값을 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 센서를 사용하여 광범위한 농도범위의 항원의 농도를 측정하고자 하는 경우, 후크 효과 (hook ef fect ) 때문에 테스트 라인에서의 신호는 종 (bel l ) 모양의 신호 강도 곡선이 얻어진다. 즉， 테스트 라인의 신호 강도는 분석 항원의 농도가 증가할수록 증가하며， 임계점 보다 높은 농도에서 다시 감소하여 종 모양의 곡선을 형성한다. 따라서， 하나의 샘플 측정에 의해 생성되는 신호 강도는 2 가지의 상이한 농도 결과를 지시할 수 있다 (도 5의 패널 B 참조) . 실제의 농도 값을 결정하기 위해서 콘트를 라인 및 항원 라인의 신호 강도를 비교하였다. 최적의 조건하에서， 항원의 농도가 비교적 낮은 샘플의 경우 콘트롤 라인의 신호 강도가 항원 라인의 신호 강도 보다 낮게 되며， 반대로 항원의 농도가 높은 샘플에서는 이와 반대로 항원 라인의 신호 강도가 콘트를 라인의 신호 강도보다 낮게 되는 신호 강도 패턴을 보여준다. 이러한 현상을 이용하여， 생물학적 샘플에서 광범위한 농도 범위를 갖는 항원의 농도를 정확하게 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면， 본 발명의 방법에서 분석 가능한 상기 항원의 농도범위는 1 ng/mL - 500 y g/mL이다.
【발명의 효과】
본 발명은 광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서 및 이 센서를 사용한 광범위한 농도범위의 생체물질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 센서를 이용하는 검출 방법은 광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 정확하게 측정할 수 있으며, 저비용, 신속성 및 간편성을 구현할 수 있으므로， 신속성 및 고민감도가 요구되는 P0CT(point of care test , 현장검사)에 적합하다. 【도면의 간단한 설명】
도 1 은 항원이 도입된 LFA 스트립 센서의 모식도이다. 패널 A 는 구조를， 패널 B 는 검출 원리를， 패널 C 는 데이터 프로세싱 과정을 보여준다.
도 2 는 항원 라인상의 전-처리한 항체에 CRP 를 직접 결합시킨 경우와 PEG-CRP 를 결합시킨 경우 사이에서 l y g/mL CRP 를 측정한 신호 강도를 비교한 결과이다. 패널 A를 이미지이고, 패널 B는 그래프이다. 도 3 은 전-결합시킨 항체의 타입에 의한 항원 라인의 신호 강도를 비교한 결과이다.
도 4는 데이터 프로세싱의 전체의 과정을 보여준다.
도 5 의 패널 A 는 다양한 농도의 CRP 를 측정한 이미지이다. 패널
B 는 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인의 3 가지 라인의 신호 강도를 로그 단위로 플로팅한 결과이다. 패널 C는 데이터를 프로세싱한 후의 측정 결과이다.
도 6은 10배 회석한 50개의 임상 샘플을 테스트한 결과이다.
도 7은 농도에 따른 혈청 내 미오글로빈 측정 결과이다. 패널 A 는 이미지이고, 패널 B는 그래프이다.
도 8 은 데이터 프로세싱이 완료된 후 로그 단위 미오글로빈 농도에 따른 분석 결과이다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 실험 재료 및 방법
1. 실험재료
CRP 가 포함되지 않은 혈청 (90R-100), surfactant 10G (95R-103), 및 우혈청알부민 (BSA)은 Fitzerald Industries International (Acton, MA, USA)으로부터 구입하였다. CRP 는 Wako Chemicals (309-51191； Osaka, Japan)으로부터 구입하였고， 항 -CRP 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체는 Abeam Inc. (Cambridge, MA, USA)으로부터 구입하였다. 니트로셀를로오스 멤브레인은 Millipore (HFB02404; Billerica, MA, USA)으로부터 구입하였다. 셈플 패드 (P/N BSP- 133-20) 및 흡수 패드는 Pall Co. (Port Washington, NY, USA)으로부터 구입하였다. 인터 패드 (Fusion5 8151-6621)는 Whatman (Kent, UK)으로부터 구입하였다. 각각의 금 콜로이드 용액은 BB
International (EM.GC10, 15, 20, 40; Cardiff, UK)으로부터 구입하였다. 폴리비닐피를리돈 (PVP10), 수크로오스 (S7903), 소디엄 아지드 (S8032) 및 다른 화합물들은 Sigma— Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 모든 완충액과 시약 용액들은 Milli-Q 정수시스템을 사용하여 만들어진 정제수로 제조하였다. 라미네이트된 카드는 Millipore
(HF000MC100)로부터 얻었다.
2. AuNP-항체 컨쥬게이트 용액의 제조
AuNP 컨쥬게이트를 제조하기 위해, 항 -CRP 항체를 포함한 PBS(1 mg/mL 농도) 10 를 1 mL의 20 nm AuNP콜로이드와 보레이트 완층액 (0.1 M, H 8.5)의 흔합물에 첨가하였다. 상은에서 30 분간 인큐베이션한 후에 10 mg/mL 의 BSA 를 포함하는 PBS 0.1 mL 를 AuNP 표면을 블로킹하기 위해 용액에 첨가하엿다. 4°C에서 60 분간 인큐베이션한 후에 흔합물을 HANIL microcentr i fuge(micro 17TR; Quasar Instruments, Colorado Springs, CO, USA)를 사용하여 12,000 rpm 으로 10°C에서 15 분간 원심분리를 행하였다. 상등액을 버리고, 10 mM Tris-HCl 완층액 (pH 7.4)를 AuNP 컨쥬게이트에 가하여 재현탁하였다. 원심분리 및 현탁 과정을 2 회 반복하여 최종 현택용액으로서， 0.1% BSA, 0.05% NaN3, 1% 수크로오스를 포함하는 10 mM Tris-HCl 완충액을 제조하였다. 3. LFA(Lateral Flow Immunoassay) 센서의 제조 -1
LFA 센서는 4 가지의 구성요소， 즉 샘플 패드， 컨쥬게이트 패드, 니트로셀를로오스 멤브레인 및 흡수 패드로 이루어진다. 대부분의 구성요소들은 전형적으로는 불활성 플라스틱 예컨대 폴리에스테르로 구성되는 통상적인 백킹 카드 (backing card) 상에 고정된다. NC 멤브레인 (0.25 cm X 30 cm) 상의 각각 다른 영역에 포획 항체 및 CRP 또는 PEG-CRP 또는 포획 항체， 콘트를 항체들을 디스펜서 (DCI100; Zeta Corporation, yunggi-do, South Korea)를 人 1"용하여 고정시켰다 . 항원 라인에서 항체 (1 mg/mL)를 셀를로오스 멤브레인에 1 yL/cm 양으로 고정시킨 후, 순차적으로 CRPCl mg/mL) 항원을 그 위에 고정시켰다. 각 영역사이의 간격은 약 3 隱 로 하였다. 로딩이 완료된 멤브레인은 Temperature & humid 챔버에서 28°C으로 1 시간 동안 건조시켰다. NC 멤브레인을 건조한 후에 멤브레인을 3.8-隱-너비의 스트립으로 커터를 사용하여 잘랐다. 농축한 2X AuNP-항체 컨쥬게이트 (12)를 컨쥬게이트 패드 (0.75 cm X 0.38 cm)상에 인큐베이션하고， Temperature' & humid 챔버 (Hanyang Scientific Equipment Co. , Ltd, Korea)를 사용하여 28°C 온도 및 25% 습도하에서 순차적으로 건조시킨 후에 보관하였다. 흡수 패드 (1.5 cm X 0.38 cm)를 스트립의 상단부에 부착하고， 샘플 패드 (1.5 cm x 0.38 cm)는 고정된 항체 및 흡수 패드를 갖는 NC 멤브레인을 포함하는 점착성의 플라스틱 백킹 (6 cm X 0.38 cm) 상에 순차적으로 조립히 ^였다. 각 세그먼트들은 분석 과정 동안의 용액 이동을 촉진하기 위해 1.5 mm 정도로 서로 오버랩핑시켰다.
4. LFA(Lateral Flow I瞧 unoassay) 센서의 제조 -2
NC 멤브레인 (0.25 cm x 30 cm) 상의 각각 다른 영역에 포획 항체 및 myoglobin 항원 콘트를 항체들을 디스펜서 (DCI100; Zeta Corporation, Kyunggi-do, South Korea)를 사용하여 고정시켰다. 컨트를 라인과 테스트 라인은 각 포획항체 (lmg/mL)를 셀를로오스 멤브레인에 1 yL/cm 양으로 고정시켰으몌 두 라인 사이에 항원라인을 고정시켰다. 항원 라인에서는 포획항체 (1 mg/mL)를 셀를로오스 멤브레인에 1 yL/cm 양으로 고정시킨 후， 순차적으로 myoglobin (0.5 mg/mL) 항원을 그 위에 고정시켰다. 각 영역사이의 간격은 약 3 mm 로 하였다. 로딩이 완료된 멤브레인은 Temperature & humid 챔버에서 37°C으로 1 시간 동안 건조시켰다. NC 멤브레인을 건조한 후에 멤브레인을 3.8-隱-너비의 스트립으로 커터를 사용하여 잘랐다. 농축한 3X AuNP-항체 컨쥬게이트를 컨쥬게이트 패드 ( 1 cm X 0.38 cm)상에 인큐베이션하고, Temperature & humid 챔버 (Hanyang Sc i ent i f i c Equipment Co . , Ltd , Korea)를 사용하여 37°C 온도 및 20% 습도하에 건조시킨 후에 보관하였다. 흡수 패드 ( 1.5 cm X 0.38 cm)를 스트립의 상단부에 부착하고, 샘플 패드 ( 1.5 cm X 0.38 cm)는 고정된 항체 및 흡수 패드를 갖는 NC 멤브레인을 포함하는 점착성의 플라스릭 백킹 (6 cm X 0.38 cm) 상에 순차적으로 조립하였다. 각 세그먼트들은 분석 과정 동안의 용액 이동을 촉진하기 위해 2 mm 정도로 서로 오버랩핑시켰다.
5. CRP의 분석
CRP 가 포함되지 않은 인간 혈청을 사용하여 다양한 농도를 갖는 CRP 용액을 제조하였다. 제조한 샘플 용액을 LFA 센서상에 인큐베이션하였다. Chemi Doc TM XRS+ imaging system (Bio-Rad)를 사용하여 이미지를 얻고, 이어서 Image lab TM 4.0 소프트웨어 (Bi o-Rad)를 사용하여 색깔 강도를 측정하였다. 6. 미오글로빈의 분석
미오글로빈이 포함되지 않은 인간 혈청을 사용하여 다양한 농도를 갖는 미오글로빈 용액을 제조하였다. 제조한 샘플 용액을 LFA 센서상에 인큐베이션하였다. ChemiDoc TM XRS+ imaging system(Bi o— Rad)를 사용하여 이미지를 얻고， 이어서 Imagel ab TM 4.0 소프트웨어 (Bio-Rad)를 사용하여 색깔 강도를 측정하였다.
7. 환자 샘플의 제조
경북대학교 병원에서 50 명 환자의 혈청 샘플을 얻었다. 환자에게 연구 프로토콜을 상세하게 설명한 후 동의를 받았다. 혈액 샘플은 정맥 천자를 사용하여 리튬 헤파린 항웅고제 (S-Monovette , Numbrecht , Germany)를 포함하는 튜브안에 채취하였다. 이어서， 혈액 샘플 류브를 lOOOxg 으로 15 분간 원심분리를 행하여 혈액내 세포를 제거하였다. 채취된 시료는 HITACHI 7180 장비로 농도를 측정한 후， 혈장 부분을 추가 분석을 행할 때 까지 -80°C에서 보관하였다. 샘플은 측정하기 전에 CRP를 포함하지 않는 혈청올 사용하여 10배 회석하였다. 실험결과 및 고찰
1. 스트립 센서의 분석 원리
LFA 스트립 센서는 샘플 주입 방향으로부터 각각 테스트 라인 ( test l ine) , 항원 라인 (ant igen l ine) 및 콘트롤 라인 (control l ine)의 순서로 구성되어 있다 (도 1 의 패널 A) . 혈청 샘플을 샘플 패드상에 인큐베이션 하면 용액이 샘플 패드와 접촉한 후 수평방향으로 샘플 패드， 컨주게이션 패드, NC 멤브레인에 각각 습윤된다. 최초에는 테스트 라인에서 테스트 라인에 부착된 항체에 항원과 AuNP-모노클로날 항체 컨쥬게이트 복합체 사이에 샌드위치 반웅이 발생하고， 테스트 라인에서 반웅하지 않은 AuNP- 항체 컨쥬게이트는 항원 라인에서 NC 멤브레인상에 고정화된 CRP 항원에 결합하게 된다. 낮은 농도의 항원을 분석하는 경우에는 항원 라인이 가장 높은 신호 강도를 나타내는 반면， 높은 농도의 항원을 분석하는 경우에는 항원 라인은 매우 낮은 신호 강도를 나타내거나 신호 강도가 전혀 없게 된다. 또한, 콘트롤 라인은 금 표지된 모노클로날 항체에 반웅하는 영역으로서 사용된다. 전체 반웅은 도 1 의 패널 B 에 나타내었다. 각기 다른 항원 농도에서 측정한 결과는 데이터 프로세싱 과정을 적용하여 나타내었다 (도 1 의 패널 C) . 샘플을 주입한 후 AuNP 복합체와 만나는 첫 번째 위치인 테스트 라인은， CRP 항원과 결합한 AuNP-항체 컨쥬게이트—항원 복합체가 NC 멤브레인상에 고정된 항 -CRP 폴리클로날 항체에 결합하면 붉은 신호를 나타낸다. 실험결과 테스트 라인에서 신호 강도는 0-1 u g/mL 의 항원 농도 범위에서는 증가하였으나， 항원이 고농도인 경우에는 감소하였다 (도 5 패널 A 및 B) . 이러한 현상은 대부분의 고농도의 항원 분석시에 나타나는 후크 효과 (hook ef fect )인 것으로 추정된다. 항원이 일정한 농도 이상으로 존재하는 경우 컨쥬게이트 패드내에서 AuNP 와 결합하지 않은 항원은 NC 멤브레인을 따라 빠르게 이동하여 테스트 라인에 존재하는 포획항체에 먼저 결합하게 되는데， 이는 비교적 큰 크기의 느린 이동 속도를 갖는 AuNP 항체 컨쥬게이트 복합체가 테스트 라인에 존재하는 포획항체와 결합할 수 있는 기회를 잃게 된 결과 때문이다. 이러한 후크 효과 때문에 테스트 라인의 신호 강도 값은 고농도의 항원을 측정하는 경우 실제로 요구되는 광범위한 항원 농도범위에 대해서는 한계를 가지게 된다. 따라서, 이러한 현상을 극복하기 위해， 항원 라인을 도입하여 테스트 라인， 항원 라인 및 콘트를 라인의 상관관계를 이용하였다. 샘플을 주입한 후， 항원 라인은 샘플내의 항원의 농도에 따라 다른 양태의 신호를 만들어 내었다. 예를 들어, 항원 라인은 항원의 농도가 0 인 경우 테스트 라인에서 나타내는 신호와 정반대로 가장 높은 신호값을 나타내는 결과를 보여준다. 반대로， 항원 라인의 신호 강도는 항원의 농도가 증가함에 따라 점차 감소하는 경향을 보였으며, 테스트 라인은 농도에 따라 신호강도가 점차 증가되다가， 1 y g/mL 이상의 항원 농도에서는 신호강도가 감소하는 경향을 나타내었다. 마지막으로， 2 개의 라인은 500 u g/mL 의 농도에서는 붉은 신호를 나타내지 않았다 (도 5 의 패널 A) . 테스트 라인에서， AuNP 컨쥬게이트 -항체 (Ab)-항원 (Ag) 복합체는 포획항체와 샌드위치 분석의 형태로 반응하는 반면， 반웅하지 않은 AuNP 컨쥬게이트- 항체 (Ab)는 NC 멤브레인을 따라 상부방향으로 이동하여 항원 라인의 항원에 결합한다. 과량의 항원이 AuNP 컨쥬게이트 -Abᅳ Ag 복합체를 형성하기 전에 테스트 라인의 포획 항체에 먼저 결합하게 되면ᅳ NC 멤브레인상에 고정화된 CRP 와의 결합 친화도도 감소하였다. 결과적으로, 항원이 고농도로 존재하는 분석에서는 면역분석 반웅이 억제되기 때문에 테스트 라인과 항원 라인 양쪽 라인의 신호 강도가 나타나지 않았고， 항-마우스 IgG 항체가 고정된 콘트를 라인은 반웅하지 않은 AuNP-컨쥬게이트 -항원 복합체와 결합하기 때문에 가장 높은 신호를 나타내었다.
2. 항원 라인의 최적화
스트립 센서의 제조를 위해서 가장 중요한 요소는 항원 라인에서 CRP 를 고정화하는 것이다. 본 발명자들은 CRP 의 방향과 안정화를 돕기 위해 항원 라인에서 먼저 포획 항체를 고정화시키고 이어서 여기에 CRP 를 가하였다. CRP를 NC 멤브레인에 직접 고정시킬 경우， 고정된 항원과 AuNP 컨쥬게이트 항체 사이에 반응이 나타나지 않았다. 건조 공정 동안에 CRP 가 분해될 것으로 예상하여 이러한 단점을 회피하기 위해 NHS-PEG 를 사용하여 CRP 를 페길레이션하였다. 그러나， 페길레이션된 CRP 가 결합된 항원 라인은 신호를 나타내지 않았다 (도 2) . 항원라인에서 CRP 항원과 AuNP-검출항체 컨쥬게이트와의 결합 친화도를 유지시키기 위해, 포획 항체를 미리 결합시킨 후 여기에 항원을 부착시켜 사용하는 새로운 고정화 방법을 시도하였다. 먼저， NC 멤브레인의 항원라인에 포획항체를 로딩한 후에， 여기에 CRP 를 가하여 CRP 가 포획항체에 부착하도록 하여 스트립 센서를 제조하였으며， 이렇게 제조한 스트립 센서는 CRP 결합 친화도에 관한 문제가 발생하지 않았다. 따라서， AuNP-검출항체 컨쥬게이트와의 물리적 공간과 CRP 의 방향에 따라 친화도가 감소한 것으로 추정하였으며， 건조 공정 중에 단백질의 분해에 영향을 미치지는 않는 것으로 판단하였다. 또한， CRP 라인과 페길레이션 -CRP 라인 사이에서는 유사한 신호 강도가 관찰되었다. 이러한 현상은 미리 결합시키는 항체로서 포획항체가 아닌 다른 항체를 사용한 경우에는 나타나지 않았다. 본 발명자들은 2 가지 종류의 다른 항체를 사용하여 실험을 수행하였는데， 하나는 농도의 변화 없이 균일한 신호 강도를 나타내었고， 다른 하나는 일정의 농도 까지 신호 강도가 감소하거나 또는 일정 농도 보다 더 높은 농도에서 일정한 신호를 유지함을 보여주었다 (도 3) . 항원 라인 및 테스트 라인에서 사용한 항체는 폴리클로날 항체를 사용하였으며， 각 라인의 제조의 편의성 및 항원 라인에 항원의 고정을 용이하게 하기 위해 테스트 라인 및 항원 라인에서의 폴리클로날 항체는 동일 회사의 제품을 사용하였다. 또한， 항원 라인에서 경쟁 반웅의 효율을 증가시키기 위해 AuNP-검출항체 컨쥬게이트에서의 검출항체는 모노클로날 항체를 사용하였다. 도 3에서 Det ect i on ant i body 그래프의 경우 검출항체를 모노클로날 항체로 사용한 경우이며， Test ant i body l(Test l ) 및 Test ant i body 2(Test 2)의 경우는 검출항체를 폴리클로날 항체로 사용한 경우의 결과이다. 검출항체를 폴리클로날 항체로 사용한 경우 모노클로탈 항체를 사용한 경우와는 다르게 측정하고자 하는 CRP 농도에 따라 신호감소가 나타나지 않고 일정한 신호가 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
3. 광범위한 농도범위의 CRP수준의 측정 및 데이터 프로세성 광범위한 농도 범위의 CRP 를 측정하기 위해， 테스트 라인에서 1 U g/mL 농도 이상에서는 신호 강도가 감소하는 후크 효과와， 항원 라인에서 항원의 농도 증가에 따라 감소하는 신호를 사용하여 항원 농도 결정 과정을 수행하였다. 이론적으로 1 단계 샌드위치 면역분석에서 신호 강도 곡선의 모양은 검출 및 포획 항체 농도에 의존한다 ( 18) . 한편， 본 발명의 시스템에서 로그 단위의 검량선은 2차 방정식에 매우 근접하게 매칭되었다. 따라서， 이러한 이유로, 2 차 방정식의 형태로 검량선을 얻기 위해 항체 농도 또는 항체 스크리닝 테스트의 최적화 과정은 수행하지 않았다. 측정을 완료한 후에 검량선으로무터 2 차 방정식을 사용하여 2 개의 상이한 농도 결과를 얻을 수 있었고 이어서 항원 라인과 콘트를 라인 사이의 신호 강도를 비교하여 실제 값을 결정하였다. 즉, 항원 라인 신호 값이 콘트롤 라인의 값 보다 높다면， 보다 낮은 값을 선택하고， 그 반대의 경우라면 높은 값을 선택하였다.
데이터의 프로세싱 과정을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다. 각 스트립을 Chemiᅳ Doc MP 장비를 이용하여 각각의 라인의 신호강도를 구하여 신호강도와 시료의 농도를 각각 로그로 전환하여 액샐을 이용하여 2 차 방정식 보정 곡선을 얻었다. 액셀 프로그램을 통하여 얻은 보정곡선은 y=ax2+bx+c 의 형태로 나타나고, 측정된 보정곡선에서 각각 a , b , c 코드값을 얻을 수 있었다. 미지의 시료를 측정하여 위와 동일한 방법으로 로그형태의 신호강도를 측정하고 위에서 얻은 보정곡선의 y 값에 도입하고 a , b , c 값을 이용하여 2 개의 서로 다른 X 값을 구할 수 있다. 이렇게 얻어진 두개의 X 값 중, 항원라인과 컨트를라인의 상관관계를 분석하여 하나의 값을 선택하고, 실제값은 10의 제곱근으로 하여 얻어진다. 데이터 프로세싱의 전체의 과정은 도 4에 나타내었다.
도 5의 패널 C는 데이터 프로세싱 과정을 통해 다양한 농도의 CRP를 측정한 결과를 보여준다. 상기의 실험 결과들은 본 발명의 센서가 105 - 106 사이의 CRP 농도 수준도 측정할 수 있다는 것을 보여준다. 또한, 0.649 ng/mL 의 검출한계 (LOD , bl ank signal + 3 standard devi at ions)를 얻었다. 이 값은 가장 높은 농도로서 1.07 (ng/mL CRP 농도를 측정할 수 있는 센서를 개발할 수 있다는 것을 의미한다. 4. 임상 샘플의 측정
실제적인 응용과 상업화 가능성을 확인하기 위해 50 개의 임상 샘플을 평가하였다. 임상 샘플은 매트릭스 간섭을 피하기 위해 CRP 를 포함하지 않는 혈청으로 10 배 회석한 후 개발한 스트립 센서를 사용하여 측정하였다. 시험 결과， 0.4 - 84.7 u /mL 의 범위 내에서 테스트한 샘플 사이의 선형의 상관관계를 얻었다 (도 6) . 실제 샘플 측정에서 전체 범위의 CRP 농도 ( 1 ng/mL - 500 y g/mL)를 평가하지는 않았지만， 본 발명의 센서를 통해 인간 혈청에서 CRP 수준을 광범위한 농도범위에서도 정량적 측정이 가능하다는 것을 확인하였으며， 항원 라인 및 본 발명의 분석 방법이 실제 샘플 측정에서도 적용될 수 있다는 점을 확인하였다.
5. 미오글로빈 항원의 측정
본 발명에서 주장된 광범위한 농도범위를 측정하는 방법에 있어서, 상기 측정된 CRP 이외에 범용적인 모든 항원에 대한 적용이 가능함을 증명하기 위하여 심근경색 바이오마커 중의 하나인 미오글로빈을 상기 CRP 에서 사용된 측정방법을 그대로 도입하여 분석하였다. 도 7 에서 보는 바와 같이 미오글로빈에서도 측정라인, 항원라인 및 컨트를 라인이 CRP에서 측정된 결고와 동일한 경향성을 보였으며, 이 결과를 이용하여 CRP 에서 수행된 방법과 동일한 방법으로 분석한 결과 도 8 에서 보는 바와 같이 1 ng/mL 에서 500 u g/mL 사이의 농도범위에서 완벽한 선형성을 갖는 결과를 도출 할 수 있었다. 도 7 및 도 8 의 미오글로빈 측정결과를 통하여 본 발명에서 주장된 측정 방법이 다양한 항원에 대하여 적용되는 것이 가능하다는 것을 확인하였다. 결론
본 발명에서는 광범위한 농도범위의 CRP 를 측정할 수 있는 하나의 스트립으로 구성된 다중 라인을 갖는 측방 유동 면역 센서를 개발하였다. 구별되는 방식으로 작동하는 3 개의 면역학적 활성 라인으로부터의 신호들을 프로세싱하고 조합함으로써 고농도의 항원을 검출하는 경우에 통상적인 센서에서 공통적으로 발견되는 후크 효과를 회피할 수 있었다. 본 발명의 LFA 센서는 1 ng/mL - 500 u /mL 의 범위의 CRP 농도를 10 분안에 분석을 완료할 수 있었다. 검출 가능한 농도범위는 0.67 ng/mL - 1 .02 mg/mL 이었으몌 이러한 범위는 LFA 스트립 센서를 사용하여 측정할 수 있는 가장 넓은 측정범위이다 (약 106 배) . 센서의 구조가 제조 및 공정에 있어서 비교적 싸고 가벼운 멤브레인과 패드로 구성되어 있기 때문에， 다중 라인 LFA 시스템은 알맞은 현장 검사 디바이스로의 개발에 특히 유리하다. 또한， 본 발명의 센서는 손쉽게 다를 수 있으며 광범위한 동적 영역을 가짐으로써， 간편하고 감도 높게 CRP를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 염증의 정도와 환자의 질환의 종류를 정확하게 진단할 수 있다. 또한 CRP 이외에 미오글로빈 측정에서도 CRP 와 거의 동일한 수준의 측정 결과를 얻을 수 있었으며 이러한 결과를 통하여 본 발명에서 적용할 수 있는 항원은 CRP 에 국한된 것이 아니라 샌드위치 면역반웅이 가능하며 두 종의 항체 쌍을 갖는 항원에 대하여 광범위 하게 적용될 수 있다는 것을 확인 하였다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 측정하기 위한 측방 유동 분석 스트립 센서로서，
상기 측방 유동 분석 스트립 센서는 샘플 패드， 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 포함하고，
상기 컨쥬게이트 패드에는 나노입자와 상기 항원에 결합하는 검출항체가 연결된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트가 포함되어 있고，
상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 라인， 항원 라인 및 콘트를 라인이 순차적으로 형성되어 있고,
상기 테스트 라인에는 상기 항원에 결합하는 포획항체가 고정되어 있고,
상기 항원 라인에는 상기 항원이 고정되어 있고，
상기 콘트롤 라인에는 상기 검출항체에 결합하는 2 차 항체가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 측방 유동 분석 스트립 센서.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 항원 라인에 고정된 항원은 멤브레인상에 고정된 포획항체를 매개로 하여 고정된 것을 특징으로 하는 측방 유동 분석 스트립 센서 .
【청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 나노입자―검출항체 컨쥬게이트에서의 검출항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 측방 유동 분석 스트립 센서.
【청구항 4]
제 1 항에 있어서， 상기 나노입자는 금 나노입자인 것을 특징으로 하는 측방 유동 분석 스트립 센서 .
【청구항 5】
제 1 항에 있어서， 상기 멤브레인은 니트로셀를로오스， 폴리에테르술폰， 폴리에틸렌， 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드， 폴리에스테르 또는 폴리프로필렌으로 제조된 멤브레인인 것을 특징으로 하는 측방 유동 분석 스트립 센서 .
【청구항 6】
제 1 항에 있어서, 상기 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드， 멤브레인 및 흡수 패드가 지지체상에 순차적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 측방 유동 분석 스트립 센서 .
【청구항 7】
제 1 항에 있어서, 상기 항원은 CRP(C-react ive protein) 또는 미오글로빈 (myogl obin)인 것을 특징으로 하는 측방 유동 분석 스트립 센서 .
【청구항 8】
측방 유동 분석 스트립 센서를 사용하여 광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 측정하기 위한 방법으로서，
상기 측방 유동 분석 스트립 센서는 샘플 패드， 컨쥬게이트 패드， 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 포함하고，
상기 컨쥬게이트 패드에는 나노입자와 상기 항원에 결합하는 검출항체가 연결된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트가 포함되어 있고，
상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인이 순차적으로 형성되어 고，
상기 테스트 라인에는 상기 항원에 결합하는 포획항체가 고정되어 있고,
상기 항원 라인에는 상기 항원이 고정되어 있고,
상기 콘트롤 라인에는 상기 검출항체에 결합하는 2 차 항체가 고정되어 있으며,
다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: (a) 분석하고자 하는 항원을 기지의 농도로 포함하는 샘플을 상기 샘플 패드에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트를 라인에서 생성되는 신호를 측정하는 단계 ;
(c) 분석하고자 하는 항원을 상기 단계 (a)에서와 다른 기지의 농도로 포함하는 샘플들에 대하여 상기 단계 (a) 및 (b)를 행하는 단계;
(d) 상기 단계 (a) 내지 (c )를 통해 측정한 신호 값들을 처리하여 검량선을 산출하는 단계 ;
(Θ) 분석하고자 하는 항원이 미지의 농도로 포함된 셈플을 상기 샘플' 패드에 접촉시키는 단계;
( f ) 상기 테스트 라인， 항원 라인 및 콘트를 라인에서 생성되는 신호를 측정하는 단계; 및
(g) 측정된 신호값과 상기 단계 (d)의 검량선을 사용하여 미지의 농도의 항원의 농도를 산출하는 단계.
【청구항 9]
제 8 항에 있어서， 상기 단계 (g)에서， 상기 항원 라인에서 측정된 신호값과 상기 콘트를 라인에서 측정된 신호값을 비교하여, 항원 라인의 신호값이 콘트를 라인의 신호값 보다 큰 경우 산출된 항원의 농도값 중에서 보다 낮은 값을 선택하고, 항원 라인의 신호값이 콘트를 라인의 신호값 보다 작은 경우 산출된 항원의 농도값 중에서 보다 큰 값을 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 10]
제 8 항에 있어서， 분석 가능한 상기 항원의 농도범위는 1 ng/mL -
500 y g/niL인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 111
제 8 항에 있어서， 상기 측방 유동 분석 스트립 센서의 항원 라인에 고정된 항원은 멤브레인상에 고정된 포획항체를 매개로 하여 고정된 것을 특징으로 하는 방법 . [청구항 12】
제 8 항에 있어서, 상기 측방 유동 분석 스트립 센서의 나노입자- 검출항체 컨쥬게이트에서의 검출항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 방법 .
PCT/KR2014/010810 2013-11-12 2014-11-11 광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서 WO2015072724A1 (ko)

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